CN114196760B - 一种鉴定或辅助鉴定猪生长性状的方法及其相关snp标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定猪生长性状的方法及其相关SNP标记，基于猪10.2版参考基因组，检测待测猪的第10号染色体735574位基因型是CC/TC/TT中的哪一种。CC基因型猪是该位点为碱基C的纯合子；TT基因型猪是该位点为碱基T的纯合子；TC基因型猪是杂合子。在三种基因型猪中，TC基因型猪达100kg体重日龄显著小于TT型和CC型。同时，TC基因型猪眼肌面积显著大于TT型和CC型。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定猪生长性状的方法及其相关SNP标记。
背景技术
猪的生产性能是评价生猪养殖效率的重要因素之一，生产性能可细分为瘦肉率、脂肪含量、肉的品质和饲料利用率等多项指标。其中瘦肉率是一类非常重要的生产指标，与之相关的活体测量指标包括背膘厚度、眼肌面积和达100kg体重日龄等。对这些性状背后遗传机制的研究具有非常重要的经济价值和研究意义。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)是一种广泛应用的生物学分子标记，常见于群体进化分析及全基因组关联分析，能够在单碱基精度上研究性状与位点变异的关系。对于不同遗传背景的猪，相同生长周期内影响体重的主要是自身遗传因素，但是，目前猪遗传育种领域多以肉质性状、繁殖性状和抗病性状为主要研究对象，缺少对生长性状关联基因和位点的研究，本专利发现的SNP位点可以填充这方面的空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，如何提供一种鉴别或者辅助鉴别生长性状好的猪的方法。
本发明涉及检测SNP标记735574的多态性或基因型的物质在如下A1-A3中的应用；所述SNP标记735574为位于10.2版猪参考基因组的第10号染色体735574位核苷酸，其为C或T：
A1，在鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄中的应用；
A2，在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积中的应用；
A3，在猪育种中的应用。
所述A3中的猪育种为培育猪达100kg体重日龄小和/或猪眼肌面积大的猪品种。
所述检测SNP标记735574的多态性或基因型的物质如下B1)或B2)或B3)：
B1)用于扩增含有SNP标记735574的DNA片段的成套引物；
B2)含有A1)的PCR试剂；
B3)含有A1)或A2)的试剂盒。
所述成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明还要求保护一种产品，所述产品为检测SNP标记735574的多态性或基因型的物质，具体为如下：下B1)或B2)或B3)：
B1)用于扩增含有SNP标记735574的DNA片段的成套引物；
B2)含有A1)的PCR试剂；
B3)含有A1)或A2)的试剂盒。
所述B1)中成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积大小的方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中所述SNP标记735574的基因型，其中，CC基因型与TT基因型的猪的猪眼肌面积小于CT基因型的猪的猪眼肌面积，CC基因型与TT基因型的猪的猪眼肌面积差异不显著；
所述纯合CC基因型的猪为SNP标记735574位点均为C的猪；
所述杂合CT基因型的猪为SNP标记735574位点为C和T的猪；
所述纯合TT基因型的猪为SNP标记735574位点均为T的猪；
所述SNP标记735574为位于10.2版猪参考基因组的第10号染色体735574位核苷酸，其为C或T；
所述于10.2版猪参考基因组为GenBank中更新日为2011年09月07日的猪参考基因组序列。
一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄大小的方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中所述SNP标记735574的基因型，其中，CC基因型与TT基因型的猪的达100kg体重日龄小于CT基因型的猪的达100kg体重日龄，CC基因型与TT基因型的猪的达100kg体重日龄差异不显著；
所述纯合CC基因型的猪为SNP标记735574位点均为C的猪；
所述杂合CT基因型的猪为SNP标记735574位点为C和T的猪；
所述纯合TT基因型的猪为SNP标记735574位点均为T的猪；
所述SNP标记735574为位于10.2版猪参考基因组的第10号染色体735574位核苷酸，其为C或T；
所述于10.2版猪参考基因组为GenBank中更新日2011年09月07日的猪参考基因组序列。
一种达100kg体重日龄小的猪的育种方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中所述SNP标记735574的基因型，选择纯合CC基因型的猪与纯合TT基因型的猪进行交配育种。
一种眼肌面积大的猪的育种方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中所述SNP标记735574的基因型，选择纯合CC基因型的猪与纯合TT基因型的猪进行交配育种。
上述产品或上述方法在猪育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明旨在提供与猪生长性状相关SNP标记的开发和利用方法，原理是基于猪10.2版参考基因组，检测待测猪的第10号染色体735574位基因型是CC/TC/TT中的哪一种。CC基因型猪是该位点为碱基C的纯合子；TT基因型猪是该位点为碱基T的纯合子；TC基因型猪是杂合子。在三种基因型猪中，TC基因型猪达100kg体重日龄显著小于TT型和CC型。同时，TC基因型猪眼肌面积显著大于TT型和CC型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
下述实施例中的杜洛克猪、长白猪和大白猪，河北衡水原种猪场；
下述实施例中的猪10.2版参考基因组均是指GenBank中更新日为2011年09月07日的猪参考基因组序列。
下述实施例中的DNA提取试剂盒选用北京百泰克生物技术有限公司产品DP1902型号细胞/组织基因DNA提取试剂盒；蛋白酶K选用promega公司产品。
实施例1
一、猪735574位点多态性的确定
发明人发现了与猪100kg体重日龄和眼肌面积生长性状显著相关的SNP标记735574，SNP标记735574是猪基因组的一个SNP位点，SNP标记735574位于猪10.2版参考基因组的第10号染色体735574位的核苷酸，其为C或T，对应于序列表中序列1的第300位核苷酸，序列表序列1中y为c或t。
所述SNP标记735574的基因型是CC(简称为CC基因型)、TT(简称为TT基因型)或CT(简称为CT基因型)。其中，所述CC基因型是猪基因组中所述SNP标记735574为C的纯合型，TT基因型是猪基因组中所述SNP标记735574为T的纯合型，CT基因型是猪基因组中所述SNP标记735574为C和T的杂合型。
发现猪10号染色体第735,574位点T/C SNP(SNP标记735574)与100kg体重日龄和眼肌面积生长性状显著相关，SNP标记735574为TC基因型的猪达100kg体重日龄最少；SNP标记735574为TT基因型的猪达100kg体重日龄高于SNP标记735574为TC基因型的猪达100kg体重日龄；SNP标记735574为CC基因型的猪达100kg体重日龄最长。SNP标记735574为TC基因型的猪的眼肌面积最大；SNP标记735574为TT基因型的猪的眼肌面积小于SNP标记735574为TC基因型的猪的眼肌面积；SNP标记735574为CC基因型的猪的眼肌面积最小。
实施例2
SNP标记735574与猪生长性状指标的关联性
所述生长性状指标为达100kg体重日龄及眼肌面积。
一、实验动物
选取杜洛克猪、长白猪和大白猪共计1150只进行SNP标记735574与猪生长性状指标的关联性试验。
二、SNP的检测
按照下述方法分别对步骤1中的1150只猪进行基因组DNA的提取，将提取好的基因组DNA使用Neogen公司的Neogen_POR80K芯片进行SNP基因分型，除去检测失败的样本(即基因型包含N)。检测结果见表1所示。
其中基因组DNA的提取步骤为：取少量猪耳组织，剪碎后加入组织裂解液和蛋白酶K消化处理；将裂解的耳组织放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解；用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次；加入200μl结合液CB和100μl异丙醇，剧烈颠倒并轻摇至充分混匀得到混合物；将混合物13,000rpm离心5分钟，将上清液加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液；加入700μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；将吸附柱AC放回空收集管中，放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，得到基因组DNA。
表1、SNP标记735574T/C在群体中等位基因频率和基因型频率分布。
三、获取生长性状(达100kg体重日龄和眼肌面积)表型信息
挑选上述1150头已知基因型的猪，分别测定每头猪的达100kg体重日龄和眼肌面积，并记录，考虑篇幅原因将其中的部分数据摘录在表2中。
其中，达100kg体重日龄的获取方法为：在测定达100kg体重日龄时，挑选体重在80～105kg范围的后备公、母猪进行空腹测定，使用带有单栏的电子秤，测定同时进行记录，纪律的数据包括个体编号、性别、测定日期、体重、测定人员等，并按河北省地方标准(DB 13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，转换成达100kg体重的日龄：
校正日龄＝测定日龄-[(实测体重-100)/CF]
其中：公猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040
母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615
其中，眼肌面积的获取方法为：待目标猪群在体重85-105kg范围内，称重前禁食12小时再进行测定，记录测定日龄和测定的体重和眼肌面积。采用B超扫描测定倒数第1-2肋骨间背最长肌的横断面面积，以平方厘米(cm2)为单位，利用河北省地方标准(DB 13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正：
校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]
表2，1150头测试猪中的部分基因型与生长性状数据统计
四、表型数据和基因型数据的质量控制
a、表型数据的质量控制标准：清除表型值缺失的个体；清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
b、SNP芯片分型的过滤标准：清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率小于(MinimumAllele Frequency，MAF)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(Hardy–Weinberg Equilibrium，HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。
五、全基因组关联分析
本采用华盛顿大学张志武老师实验室研发的分析软件包为R语言包GAPITVersion 3进行全基因关联分析，此软件包的统计模型为压缩混合线性模型(http://www.zzlab.net/GAPIT/，在文献GAPIT Version 2:An Enhanced Integrated Tool forGenomic Association and Prediction.The Plant Genome 2016,9(2)1-9.中公开)。GAPIT的设计目的是在大数据集上准确地执行GWAS和基因组预测。混合线性模型(MixedLiner Model，MLM)包括固定和随机效应，模型将种群结构作为固定效应，同时将个体纳入随机效应进行个体亲缘关系矩阵的构建。其统计分析模型为：
y＝Xβ+Zμ+e
其中Y是观察到的表型值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
利用GAPIT的混合线性模型(MLM)在包含三个品种的群体中，针对步骤三中1150头的SNP位点与两种生长性状(达100kg体重日龄和眼肌面积)的数据进行全基因组关联分析，若P-value＜0.05则表明关联显著，结果如表3所示。
表3各生长性状与不同基因型的关联结果
表3结果显示，该位点与猪达100kg体重日龄和眼肌面具均呈显著相关，SNP标记735574为TC基因型的猪达100kg体重日龄最少；SNP标记735574为TT基因型的猪达100kg体重日龄高于SNP标记735574为TC基因型的猪达100kg体重日龄；SNP标记735574为CC基因型的猪达100kg体重日龄最长。SNP标记735574为TC基因型的猪的眼肌面积最大；SNP标记735574为TT基因型的猪的眼肌面积小于SNP标记735574为TC基因型的猪的眼肌面积；SNP标记735574为CC基因型的猪的眼肌面积最小。其中TC基因型猪具有更优秀的生长性能，拥有更少的100kg体重日龄和更大的眼肌面积。在实际育种过程中，可以利用该位点进行标记辅助选择，培育生长性能优异的猪品系。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种鉴定或辅助鉴定猪生长性状的方法及其相关SNP标记
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatatatatt attttggtaa tagtttatag gcttctataa taattacaaa aattcatgtc 60
agaaatatta attttataat atgctaaaga tacactaaat attatgctaa ctaaaatgtc 120
agttaataaa cattgattta tgatcaacag tcaacttctt agtattttag caccctatga 180
cacttatcag catcatatta tttactattt attgattgtg cattttattt tctaagcttg 240
tgaactagaa tggccttttt ctttagggag tttaatttca attatctgag tggctgatcy 300
accagaaaat atctctagtc aactttgaca ttcaaaatac atttgaaatt ttctagaagg 360
gtagttacat tatggaatgg tcaaatttct atttagacac catttccctt gcatctgaaa 420
taaactagta caaggccaga aaggatgctt ttatgttatt ctccaccagc taatatccag 480
catccaaatc tctgtaattt actattaagc atgtttacaa ctaatcaatt caatcacttt 540
gcagacattg atattgctga ctaaacccca gaaaacaaaa caaatcaatg ctggcttagt 600
Claims (8)
1.检测SNP标记735574的多态性或基因型的试剂和/或试剂盒在如下A1-A3中的应用；所述SNP标记735574为位于10.2版猪参考基因组的第10号染色体735574位核苷酸，其为C或T：
A1，在鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄中的应用；
A2，在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积中的应用；
A3，在猪育种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述A3中的猪育种为培育猪达100kg体重日龄小和/或猪眼肌面积大的猪品种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测SNP标记735574的多态性或基因型的试剂和/或试剂盒为如下B1)或B2)或B3)：
B1)用于扩增含有SNP标记735574的DNA片段的成套引物；
B2)含有A1)的PCR试剂；
B3)含有A1)或A2)的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测SNP标记735574的多态性或基因型的试剂盒为SNP芯片。
5.一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积大小的方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记735574的基因型，其中，CC基因型与TT基因型的猪的猪眼肌面积小于CT基因型的猪的猪眼肌面积，CC基因型的猪的猪眼肌面积小于TT基因型的猪的猪眼肌面积；所述CC基因型为SNP标记735574为C的纯合型；所述CT基因型为SNP标记735574为C和T的杂合型；所述TT基因型为SNP标记735574为T的纯合型。
6.一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄大小的方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记735574的基因型，其中，CC基因型与TT基因型的猪的达100kg体重日龄小于CT基因型的猪的达100kg体重日龄，CC基因型的猪的达100kg体重日龄大于TT基因型的猪的达100kg体重日龄；
所述CC基因型的猪为SNP标记735574位点均为C的猪；
所述CT基因型的猪为SNP标记735574位点为C和T的猪；
所述TT基因型的猪为SNP标记735574位点均为T的猪。
7.一种猪的育种方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记735574的基因型，选择纯合CC基因型的猪与纯合TT基因型的猪进行交配育种。
8.权利要求5-7任一所述方法在猪育种中的应用。
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2020
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