CN116004845B - 一种改良民猪肉质的acsl1分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记及其应用，它涉及分子遗传学领域，本发明发现民猪ACSL1基因5′调控区存在着两个突变位点，其中－517位点存在着G到T的突变，通过荧光素酶报告基因检测系统发现，将－517位点G突变成T导致ACSL1启动子活性显著降低，与肉质差的猪只ACSL1基因mRNA表达量水平低相一致。可见通过检测猪基因组中ACSL1调控区该位点的基因型可以作为与民猪肉质相关的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

Description

一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记及其应用，通过判断猪ACSL1基因5′调控区突变位点的多态性来进行选种，并人为地应用该突变位点实现民猪肉质改良。

背景技术

我国是养猪大国，年均猪肉产量和消费量均达到世界总量的50％以上，在我国居民的肉食结构中，猪肉约占肉类消费总量的50～60％。随着生活水平的提高，人们对肉质的要求越来越高，风味、嫩度、多汁性等感官品质逐渐成为影响消费者购买猪肉的主要因素。为了满足新时期的消费者需求，猪肉品质改良在猪育种目标中所占的比重不断提高，培育肉质优良的新品种(品系)猪是当前广大养猪生产者和科研工作者的主要任务之一。

肉质是复杂的经济性状，总体遗传力较低，并且和生长速度、瘦肉率等性状存在着一定程度的负相关，通过传统手段选育难以达到理想效果，分子遗传学和基因工程技术的发展，为通过分子标记辅助选择提高猪肉质提供了有力工具。肌内脂肪含量与肉的嫩度、多汁性和风味呈正相关，直接决定着肉质优劣。民猪是我国优良的地方品种资源，具有肉质鲜美、抗寒、抗逆、耐粗饲等优良特性，遗传多样性丰富，是研究肉质形成机制的良好素材。明确民猪肉质优良的形成机制，选择理想基因型的民猪个体作为亲本培育具有民猪血缘的杂交后代，可以有效提高猪肉品质。但是目前缺乏民猪的猪肉品质(尤其是肌内脂肪含量)改良育种方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记及其应用和育种方法，本发明通过筛选出民猪ACSL1基因分子标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为民猪肉质遗传改良提供基因标记和技术方法。

本发明的一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记，所述的ACSL1分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述的ACSL1分子标记的第－517位核苷酸存在G/T多态性位点。

基于所述的ACSL1分子标记开发的检测方法为PCR产物直接测序法。

一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记在改良猪肉质的育种中的应用。

本发明的一种应用所述的改良民猪肉质的ACSL1分子标记选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法，具体方法如下：

一、获得待检测猪的基因组DNA；

二、以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，获得含有－517位点的ACSL1基因的5′调控区片段；

引物ACSL1_F：5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′；

三、通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；

四、对PCR产物进行测序分析；

五、选择ACSL1基因的5′调控区内－517位点的基因为G的猪，即为筛选出的目标；

六、对筛选出的目标猪进行育种，即完成所述的选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法。

用于检测所述的ACSL1分子标记的引物对，所述的引物序列如下所示：

引物ACSL1_F：5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′。

本发明的一种用于检测所述的ACSL1分子标记的试剂盒，包括所述的引物对。

本发明利用高通量测序技术分析了民猪肉质优良的遗传基础，发现在民猪和大白猪背最长肌、民猪背最长肌和腿肌这两组肉质差异明显的样品中，长链脂酰辅酶A合成酶1(Long-chain acyl-Co A synthetase 1,ACSL1)基因的表达量存在着显著差异，提示ACSL1基因在肉质形成中发挥着重要作用。

本发明通过进一步的实验发现民猪ACSL1基因5′调控区－517位点的G到T突变在体外试验中改变了ACSL1启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。通过对民猪ACSL1基因5′调控区的PCR扩增结果进行分析，发现民猪ACSL1基因5′调控区存在着两处SNP位点。

本发明对－517位点的G>T多态性进行了群体遗传学分析，发现民猪该位点的突变频率较高，G和T等位基因频率分别为0.5625和0.4375。本发明对－517位点的G>T多态性的遗传效应进行了深入分析。研究表明突变ACSL1基因－517位点(G突变为T)后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示该点突变有抑制ACSL1基因转录的功能；ACSL1基因－517位点为GG基因型个体，ACSL1基因表达量显著高于TT基因型个体；进一步分析确定了ACSL1具有促进脂肪生成的作用，ACSL1基因表达量高的猪只肉质好。因此通过分子标记选择ACSL1基因－517位点为G基因的民猪组建基础群进行育种，对于改良猪群体的肉质具有重要的育种意义。

本发明通过实验发现民猪ACSL1基因5′调控区－517位点G到T的突变在体外试验中显著降低了ACSL1启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

附图说明

图1为PCR扩增民猪ACSL1基因5′调控区的电泳图；图中，1和2为目的条带，3为DL2000标记(marker)；

图2为荧光素酶检测猪ACSL1基因的启动子不同长度片段的活性图；

图3为突变载体F2*鉴定结果示意图；

图4为突变－517位点后荧光素酶报告系统检测载体表达变化图；

图5为PCR扩增民猪ACSL1基因5′调控区多态性片段的电泳图，图中，1为DL 2000标记(marker)，2和3为目的条带；

图6为实时PCR(real-time PCR)检测过表达载体在民猪前脂肪细胞中过表达ACSL1基因的效果图，**表示差异极显著，p<0.01；

图7为实时PCR(real-time PCR)检测RNAi序列在民猪前脂肪细胞中敲低ACSL1基因的效果图，**表示差异极显著，p<0.01；

图8为油红O染色分析ACSL1基因对民猪脂肪生成的影响照片；其中，图A为油红O染色分析过表达对ACSL1基因对脂滴生成的影响图；图B为油红O染色分析敲低对ACSL1对脂滴生成的影响图；

图9为定量分析过表达ACSL1对脂肪生成的影响图；其中，图A为定量分析过表达ACSL1对脂滴生成的影响图；图B为定量分析敲低ACSL1对脂滴生成的影响图；**表示差异极显著，p<0.01。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

具体实施方式一：本实施方式的所述的ACSL1分子标记的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示，所述的ACSL1分子标记的第－517位核苷酸存在G/T多态性位点。

所述的ACSL1分子标记的核苷酸序列如下所示：

具体实施方式二：基于实施方式一所述的ACSL1分子标记开发的检测方法为PCR产物直接测序法。

具体实施方式三：如实施方式一所述的一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记在改良民猪肉质的育种中的应用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述的改良民猪肉质为改良民猪肌内脂肪含量。其他与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三不同的是：改良民猪肉质的ACSL1分子标记用于猪的早期选种。其他与具体实施方式三相同。

具体实施方式六：本实施方式的一种改良民猪肉质的ACSL1分子标记选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法，其特征在于，具体方法如下：

一、获得待检测猪的基因组DNA；

二、以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，获得含有－517位点的ACSL1基因的5′调控区片段；

引物ACSL1_F：5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′；

三、通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；

四、对PCR产物进行测序分析；

五、选择ACSL1基因的5′调控区内－517位点的基因为G的猪，即为筛选出的目标；

六、对筛选出的目标猪进行育种，即完成所述的选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述的含有－517位点的ACSL1基因的5′调控区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其他与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是：PCR扩增体系为：基因组DNA 25ng，10×缓冲溶液2.5μL，2.5mM的dNTP混合液2μL，上下游引物各10pmol，高保真DNA聚合酶1U，ddH₂O补齐至25μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。其他与具体实施方式六相同。

具体实施方式九：本实施方式用于检测实施方式一所述的ACSL1分子标记的引物对，所述的引物序列如下所示：

引物ACSL1_F：5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′。

具体实施方式十：本实施方式一种用于检测实施方式一所述的ACSL1分子标记的试剂盒，包括如实施方式九所述的引物对。

通过以下实施例验证本发明有益效果：

实施例1

PCR方法分析民猪ACSL1基因的5′调控区

1.基因组提取：取猪耳组织，用常规酚-氯仿法进行基因组DNA提取。

2.引物设计：利用克隆得到的ACSL1 cDNA序列(GenBank登录号：NM_001167629.2)做探针，对UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)进行blat分析，截取起始密码子上游2000bp核苷酸序列进行引物设计ACSL1_F0和ACSL1_R0，并在其5’末端分别引入XhoI和HindIII酶切位点，引物序列如下：

注：ACSL1_F0下划线表示XhoI酶切位点；ACSL1_R0下划线表示HindIII酶切位点。

3.PCR扩增：本实施例使用的是常规PCR扩增民猪ACSL1基因5′调控区－1649～+62片段(该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示)，扩增程序和体系如下：

扩增体系为：基因组DNA 25ng，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，上下游引物各10pmol，LA Taq酶1U，ddH₂O补齐至25μL。

按如下程序进行PCR扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测结果见图1。

4.PCR产物克隆：

(1)扩增产物与loading buffer混合上样至1％的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳30分钟置于紫外线切胶回收，按诺唯赞公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒说明书操作得到纯化产物。

(2)连接反应：将纯化PCR产物与pMDl8-T Vector连接，严格按照大连宝生物工程有限公司的载体试剂盒说明书进行操作。

(3)感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4000g离心10min一次，用4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

(4)转化：在灭菌的1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μL，用移液枪吸打均匀，冰浴30min；将离心管置于42℃的循环水浴中(勿震动)，热激90s后迅速冰浴2min；再往离心管中加入400μL LB培养液，在37℃摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min；离心，去除部分上清液，取100μL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37℃培养14-16小时，观察有无菌落长出。

(5)阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取转化好的菌斑接入含1mL LB的1.5mL离心管中并于37℃振摇培养约8h左右。收集菌液，提取质粒，进行双酶切鉴定，选取含有阳性质粒的菌液送去测序，序列测定由华大基因科技服务有限公司完成。测序结果见序列表SEQ ID NO:2，具体序列如下：

5.多态位点鉴定：民猪和大白猪各随机选取2个个体，利用ACSL1_F/R引物扩增猪基因组DNA后，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送华大基因科技服务有限公司测序，测序上、下游引物分别为ACSL1_F和ACSL1_R，引物序列如下：

引物ACSL1_F：5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′；

利用DNAMAN软件比对分析不同个体的测序结果，并分析测序峰图，查找多态位点，判断基因型。在该区域共检测到2个SNPs位点，分别为－517G>T和-311T>G。

实施例2

构建ACSL1启动子载体及5′末端截短载体，荧光素酶报告系统检测其活性

1.启动子克隆载体构建：利用ACSL1_F0/R0引物扩增民猪基因组DNA 5′调控区-1649～+62片段，并以pMD18-T为骨架，构建ACSL1基因启动子克隆载体，具体方法见实施例1。

2.引物设计：设计引物ACSL1_F1-F3，分别与ACSL1_R0配对使用，以ACSL1_F0/R0片段的克隆载体为模板，分别扩增ACSL1基因启动子区-1649～+62、-1135～+62、-704～+62、-404～+62片段。各引物的5′末端均引入XhoI酶切位点，引物序列如下：

注：下划线分别表示XhoI酶切位点。

PCR扩增体系为：含有-1649～+62片段的克隆载体DNA 25ng，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上下游引物各10pmol，Ex Taq酶1U，ddH₂O补齐至25μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

3.截短型启动子克隆载体构建：将各片段分别插入到pMD18-T载体中，构建ACSL1基因截短型启动子片段克隆载体。

4.荧光素酶报告基因构建：利用引物上引入的限制性内切酶识别位点(XhoI和HindIII)，将各种长度的ACSL1基因启动子片段从pMD-18T载体中切下来。

酶切体系：Xho I，0.5μL；HindIII，0.5μL；10×M Buffer，1.0μL；Plasmid，4.0μL；ddH2O，4.0μL。

反应条件：37℃水浴，2小时。

酶切后经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用诺唯赞公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒按照说明书对目的片段进行纯化，连接入pGL3-basic载体中，利用大连宝生物工程公司的T4DNA连接酶进行连接，连接体系和反应条件严格按照说明书进行。

5.感受态细胞制备、连接产物转化、阳性克隆子的鉴定及测序验证：具体步骤见实施例1。获得的阳性重组子按其长度分别命名为F0(-1649～+62片段)、F1(-1135～+62)、F2(-704～+62片段)和F3(-404～+62片段)。

6.去内毒素质粒提取：将测序正确的、含有荧光素酶报告基因的菌液按照1:500的比例接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，200rpm剧烈摇换16h。4℃6000rpm收集菌体，利用天根公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒，具体操作严格按照说明书进行，利用紫外分光光度计测量质粒浓度。

7.细胞培养：PK-15细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的完全培养基进行培养，在5％ CO₂培养箱、37℃生长至80～90％融合。

8.转染：利用(Invitrogen(赛默飞世尔)公司)公司的lipofectamine 2000转染试剂盒，将构建的6种载体分别与海肾荧光素酶报告基因载体(pRL-TK)共转染PK-15细胞，转染操作严格按照试剂盒说明书进行，转染后24h，收获细胞。每组转染3次，每次3个重复。

9.荧光素酶活性检测：利用Promega(普洛麦格)公司的双荧光素酶检测试剂盒测量萤火虫和海肾荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶活性用海肾荧光素酶活性校正后即为相对荧光素酶活性。测定结果如图3，从图3可以看出，相对于pGL3-basic对照，ACSL1基因5′端-1649～+62片段没有活性，而-1135～+62片段具有启动子活性显著上升，说明-1649～-1135区段具有抑制转录的顺式调控元件存在；相较于-1135～+62片段，-704～+62片段的启动子活性变化不大，说明-1135～-704区域缺少重要的功能元件，当继续截短至－404bp时，启动子活性有所下降，但仍具有很强的转录活性，说明该区域内存在着促进转录的作用元件，核心启动子位于-404～+62区域。

实施例3

猪ACSL1基因5′调控区－517位点定点突变及荧光素酶活性检测

1.根据实施例2中截短实验的结果，以F2载体为模板，通过重叠延伸PCR方法对－517位点进行定点突变，构建该位点基因型为T的突变型载体F2*。

引物序列为

方框表示突变碱基。

2.定点突变的方法为重叠延伸PCR法，包括两轮反应，第一轮反应利用ACSL1_F2/ACSL1_MR和ACSL1_MF/ACSL1_R0引物对分别以F2质粒为模板，扩增得到两个末端含有点突变且相互重叠的片段，第二轮反应以上述两个反应的PCR产物适当稀释物为模板，ACSL1_F2/ACSL1_R0为引物进行PCR扩增，将点突变引入到PCR产物的内部。

第一轮PCR扩增体系为：F2质粒DNA 25ng，10×Buffer 2.5μL，dNTP mix 2μL，上、下游引物各10pmol，高保真pfu DNA聚合酶1U，ddH₂O补齐至25μL。

第二轮PCR扩增体系为：第一轮反应的两种PCR产物稀释物各1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP mix 2μL，上下游引物各10pmol，Ex Taq DNA聚合酶1U，ddH₂O补齐至25μL。

两轮PCR扩增程序均为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接入pMD18-T载体，再转接pGL3-basic载体，构建的载体质粒经XhoI和HindIII限制性内切酶进行双酶切鉴定后，送华大基因科技服务有限公司测序，确定了ACSL1基因－517位点的G突变为T，鉴定结果如图4所示。荧光素酶报告系统检测突变对启动子活性的影响，结果如图5所示，突变该位点后，其启动活性显著降低(P<0.05)。说明该点突变对ACSL1的表达产生影响。

实施例4

构建ACSL1基因的过表达载体和RNA干扰序列，分析ACSL1对民猪脂肪生成的影响

1.过表达载体构建

(1)引物设计：根据ACSL1基因cDNA序列(NM_001167629.2)，利用Premier 5.0软件设计引物克隆全长编码区，并在5′末端引入EcoRI、XhoI酶切位点，序列如下：

注：下划线为酶切位点

(2)RT-PCR分析：利用逆转录(Reverse transcription,RT)-PCR方法对编码区进行扩增。利用Trizol(总RNA抽提试剂)(Invitrogen(赛默飞世尔)公司)提取脂肪组织总RNA，利用Vazyme(诺唯赞)公司的反转录试剂盒HiScript III 1st strand cDNAsynthesis kit说明书进行逆转录反应，合成cDNA。

PCR反应体系为：cDNA 1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上下游引物各10pmol，Ex Taq酶1U，ddH₂O补齐至25μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

(3)PCR产物克隆：具体方法见实施例1。

(4)过表达载体构建：利用引物上引入的限制性内切酶识别位点(EcoRI和XhoI)，将ACSL1基因的全长编码区片段从pMD-18T载体中切下来。

酶切体系：EcoRI，0.5μL；Xho I，0.5μL；10×M Buffer，1.0μL；Plasmid，4.0μL；ddH2O，4.0μL。

反应条件：37℃水浴，2小时。

酶切后经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用诺唯赞公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒按照说明书对目的片段进行纯化，连接入pCMV-HA载体中，利用大连宝生物工程公司的T4DNA连接酶进行连接，连接体系和反应条件严格按照说明书进行。

(5)过表达效果监测：将构建好的过表达载体转染猪前脂肪细胞，转染方法见实施例2。利用Trizol(总RNA抽提试剂)(Invitrogen(赛默飞世尔)公司)提取猪前脂肪细胞总RNA，利用Vazyme(诺唯赞)公司的反转录试剂盒HiScript II Q Select RT SuperMix forqPCR进行反转录反应，利用Vazyme(诺唯赞)公司的AceQ Universal SYBR qPCR MasterMix试剂盒进行real-time PCR检测，确定所构建载体的过表达效果，发现过表达载体能够显著提高ACSL1在前脂肪细胞中的mRNA水平，结果见图6。

2.siRNA序列筛选

(1)siRNA序列设计：根据Genbank数据库提供的ACSL1基因(gene ID：448982)序列，设计合成3条不同序列的siRNA与一条阴性对照(NC)，具体序列如下：

(2)干扰效果检测：将siRNA序列转染猪前脂肪细胞，转染方法见实施例2。利用Trizol(总RNA抽提试剂)(Invitrogen(赛默飞世尔)公司)提取猪前脂肪细胞总RNA，利用Vazyme(诺唯赞)公司的反转录试剂盒HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR进行反转录反应，利用vazyme(诺唯赞)公司的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行real-time PCR检测，确定RNAi效果，3条序列的干扰效果均在50％以上，其中ACSL1-siRNA-2031组的干扰效果最好。因此选择ACSL1-siRNA-2031进行后续试验。结果见图7。

3.前脂肪细胞培养

本实验采用消化法获取民猪前脂肪细胞，具体操作如下：

(1)采用前肢动脉放血法猝死仔猪，经75％无水乙醇消毒后取背部皮下脂肪。

(2)用手术刀去除掉多余的结缔组织、血液等杂质，并转移到含有10×双抗的PBS中。

(3)将冲洗干净的脂肪组织放入60mm培养皿中，加如I型胶原酶，用小剪子将脂肪组织剪成糜状，剪好的组织块转移至50mL离心管中(借助枪头，必要时可用消化液冲洗平皿)加入足量的组织消化液，封口膜封口，置37℃摇床中，150rpm震荡消化40-50min，期间每10-15min检查一次组织消化情况。

(4)待组织样消化完全后，加入等体积的培养基(含双抗、10％ FBS)终止消化反应。

(5)消化后，用40μm细胞筛过滤组织消化产物，将滤液转移至干净的15mL离心管中，1000r转速离心10min。

(6)弃上清，将细胞沉淀用4mL培养液重悬，1000r转速离心10min(重复2次)。

(7)弃上清，将细胞沉淀用10mL培养基重悬，并接种至10cm培养皿中。

(8)第二天观察细胞密度与污染情况，如无污染，用完全培养基继续培养，在细胞密度达到80％时传代。

4.前脂肪细胞诱导分化

当细胞密度达到80％以上时进行传代，用完全培养基培养20h，待细胞密度达到90％更换为成脂分化培养基，并将当日记为0d(0day)。成脂分化培养基是在完全培养基的基础上添加成脂诱导物，各成分及浓度如下表。成脂分化培养基培养2d后，更换为只含胰岛素、T3和罗格列酮的完全培养基，再培养2d，然后更换为完全培养基，继续培养4-6d，每隔2d换液，继续培养用于后续研究。

5.转染

利用(Invitrogen(赛默飞世尔)公司)的lipofectamine 2000转染试剂盒，将ACSL1过表达载体、siRNA序列分别前脂肪细胞，转染操作严格按照试剂盒说明书进行，转染后24h，进行诱导分化，共进行3次独立重复，每次3个平行。

6.油红O染色

本实验使用的油红O染液配制方法为：改良油红O染色液A1与A2按3：2比例配制混匀，于室温下避光静置10min。具体操作步骤如下：

(1)弃培养皿中的完全培养基，PBS清洗3次。

(2)加入1mL 10％的甲醛固定溶液固定10min。

(3)弃甲醛固定溶液并用PBS充分洗涤2-3遍。

(4)加入1mL 60％异丙醇浸润30s。

(5)弃废液，加入1mL油红O染液染色，室温孵育15min。

(6)弃废液，加入1mL 60％异丙醇浸润30s。

(7)弃60％异丙醇，用PBS清洗3次。

(8)将培养皿置于倒置显微镜下观察前脂肪细胞染色效果，并拍照记录。

(9)加入1mL异丙醇，室温萃取10min，在510nm测定吸光度进行定量分析。

通过油红O染色实验确定了ACSL1抑制前脂肪细胞分化，脂滴生成减少，即ACSL1抑制脂肪生成。结果见图8和图9。

实施例5

群体检测－517位点的多态性及标记辅助育种

1.根据克隆得到的猪ACSL1基因5′调控区序列设计引物ACSL1_F和ACSL1_R，通过PCR手段检测ACSL1基因－517位点在民猪群体中的分布情况，引物序列如下：

2.PCR扩增体系为：基因组DNA 25ng，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(2.5mM)2μL，上下游引物各10pmol，高保真pfu DNA聚合酶1U，ddH₂O补齐至25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

PCR产物直接测序，利用DNAMAN软件比对分析不同个体的测序结果，并通过肉眼分析测序峰图，确定－517位点的等位基因和基因型。发现不同等位基因在两品种猪中的分布存在着极显著的差异，民猪两种等位基因出现的频率相似，其中G等位基因的频率略高于T等位基因，大白猪只检测到G等位基因。

将－517位点G等位基因作为肉质性状分子标记，携带有G等位基因的序列如SeqIDNo：1所示，其中第188碱基为多态位点，基因型为GG；将携带该分子标记的猪进行配种繁殖，产下仔猪后，鉴定该标记，从中筛选出肉质好的猪，即可改良群体肉质性状。

Claims (5)

1.一种改良民猪肌内脂肪含量的ACSL1分子标记，其特征在于：所述的ACSL1分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列表SEQ ID NO:1在第188碱基为多态位点，基因型为GG。

2.如权利要求1所述的一种改良民猪肌内脂肪含量的ACSL1分子标记在改良民猪肌内脂肪含量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：改良民猪肌内脂肪含量的ACSL1分子标记用于猪的早期选种。

4.一种应用权利要求1所述的改良民猪肌内脂肪含量的ACSL1分子标记选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法，其特征在于，具体方法如下：

一、获得待检测猪的基因组DNA；

二、以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，获得含有ACSL1基因的5′调控区内－517位点的片段；所述ACSL1基因的5′调控区内－517位点对应于SEQ ID NO:1第188位；

引物ACSL1_F： 5′-TAGCCCTCAAAACCGCACC-3′；

引物ACSL1_R：5′-AGCACTCACCTCCTCCGCAG-3′；

三、通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；

四、对PCR产物进行测序分析；

五、选择ACSL1基因的5′调控区内－517位点的基因为G的猪，即为筛选出的目标；

六、对筛选出的目标猪进行育种，即完成所述的选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法。

5.根据权利要求4所述的选育/辅助选育猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法，其特征在于：PCR扩增体系为：基因组DNA 25 ng，10×缓冲溶液 2.5 µL，2.5 mM 的dNTP 混合液2 µL，上下游引物各10 pmol，高保真DNA聚合酶1 U，ddH₂O补齐至25 µL；

PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，30个循环；72 ℃终延伸5 min；4 ℃保存。