CN109161600B

CN109161600B - 与猪脂肪沉积相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109161600B
Application number: CN201811115860.4A
Authority: CN
Inventors: 张�浩; 王力圆; 王志秀; 付玉; 张雅文; 张莹
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109161600A

Abstract

本发明涉及一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于猪IRX3基因启动子区转录起始位点上游143bp处，记为g.‑143G>A。本发明将IRX3基因作为影响猪脂肪沉积性状的候选基因，采用PCR测序技术获得不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，在品种间和品种内鉴定SNP位点与猪脂肪沉积能力的相关性，获得了影响猪脂肪沉积性状的SNP位点及基因型。

Description

与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的，涉及一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

养猪业是我国畜牧业生产的主体组成部分，随着生活水平的提高，人们对猪肉食品的质量需求不断提高，而猪肉品质与肌内脂肪含量呈正相关。如何培育出高瘦肉率、高肌内脂肪沉积的猪品种是当前猪育种工作的研究热点。

我国丰富的猪品质资源为猪育种工作提供了良好的素材，也为研究猪重要经济性状的基因和分子标记提供了良好的材料。藏猪是我国特有的高原型猪种，脂肪沉积和代谢能力强，体小皮薄、肉嫩味美，风味浓郁，肉质细腻、风味独特，素有“高原之珍”的美誉^[1]。滇南小耳猪是云南省西双版纳州小型猪地方品种，具有适应雨林区高温潮湿的生态环境，早熟易肥、皮薄骨细、脂肪含量高、肉质鲜嫩、营养丰富等优点^[2]。从国外引进的大白猪、长白猪等是世界上分布最广的主要瘦肉型猪种之一，生长速度快，瘦肉率高，但肌内脂肪含量不高。

易魁洛蛋白家族成员3(Iroquois-class homeodomain protein， IRX3)，参与调节包括早期胚胎的神经发育等多种生物学过程。脂肪量及肥胖相关蛋白(Fat mass andobesity-associated protein，FTO) 被认为是导致人类肥胖效应最大的基因，又称“肥胖基因”^[3]。Smemo 等于2014年在Nature杂志发表文章指出FTO基因内含子中的一个位点发挥调控元件作用，可增加IRX3表达，促进脂肪的形成，而 FTO基因自身并没有在这一相互影响中发挥作用^[4]。在小鼠上通过基因敲除技术也证实了IRX3基因敲除后对脂肪的沉积具有明显的抑制作用^[4]。IRX3基因对脂肪形成的促进作用在斑马鱼、小鼠、大鼠、人类等中都广泛性存在^[5，6]。

因此有必要对IRX3进行深入的研究，获得不同类型猪群体间 IRX3基因差异的SNP位点，在生产数据的帮助下鉴定脂肪沉积的分子遗传标记位点，并开发分子标记快速检测方法，为进一步研究和了解猪脂肪沉积性状提供帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的另一目的在于提供检测所述SNP分子标记的PCR扩增引物和内酶切反应试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供鉴定猪脂肪沉积性状的方法。

本发明通过对不同类型猪群体基因型进行研究，提供了一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于猪IRX3 基因启动子区转录起始位点上游143bp处，记为g.-143G>A。

所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第455bp，碱基为G/A。

进一步地，本发明提供了用于检测所述SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：

正向引物F：5′-GCCAGTGGGAGTTCATTC-3′

反向引物R：5′-TCAGGACAGTGGAGCCTA-3′。

需要说明的是，含有本发明所述引物对的试剂和内酶切反应试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明进一步提供了一种检测所述SNP分子标记的方法，所述方法包括：以猪基因组DNA为模板利用前述引物对进行PCR扩增获得PCR产物；对所述PCR产物进行测序。

本发明进一步提供了所述SNP分子标记在鉴定猪脂肪沉积基因型中的应用。

可选地，所述应用为一种鉴定猪脂肪沉积性状的方法，包括以下步骤：

步骤一：以猪基因组DNA为模板利用前述引物对进行PCR扩增获得PCR产物；

步骤二：将所述PCR产物用NciI内切酶酶切，将酶切产物在琼脂糖凝胶中电泳，染色观察条带，依据条带分布判断猪脂肪沉积基因型。

判断基因型的方法具体为：当扩增片段的455处碱基均为G时， Nci I内切酶可识别该位点，可将PCR扩增片段切成两个个片段，长度分别为455bp和176bp，该基因型记为GG型；当455bp处的碱基都为A时，PCR扩增片段不会被切割，只有631bp一条条带，该基因型记为AA型；当455bp处既含有G碱基又含有A碱基时，即凝胶电泳中含有三条条带，长度分别为631bp，455bp和176bp，该基因型记为杂合型GA型。

进一步地，酶切反应体系为：10×Buffer 1μL，Nci I内切酶0.25μL (浓度为10U/μL)，PCR产物4μL，加dd H₂O至10μL；

进一步地，在37℃环境中酶切4-8h。

本发明还提供了所述SNP分子标记在猪育种中的应用，依据前述方法鉴定猪脂肪沉积基因型或鉴定猪脂肪沉积性状，筛选具有优势性状的个体进行育种工作。

本发明将IRX3基因作为影响猪脂肪沉积性状的候选基因，采用 PCR测序技术获得不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，在品种间和品种内鉴定SNP位点与猪脂肪沉积能力的相关性，获得了影响猪脂肪沉积性状的SNP位点及基因型。

附图说明

图1为IRX3基因在不同品种猪之间背最长肌和背部皮下脂肪组织中表达情况；其中，TP：藏猪，DNS：滇南小耳猪，YY：大白猪， LL：长白猪；柱状图上的不同字母表示差异显著，p<0.01。

图2为过表达IRX3基因对脂肪形成相关基因影响；其中：C: Control，对照组，T：Test，过表达组。

图3为过表达IRX3基因对脂肪形成的影响；其中，A:油红O染色研究在3T3-L1细胞中过表达IRX3对脂肪滴形成的影响；B:脂肪定量分析过表达IRX3对脂肪形成的影响；图中：Control为对照组，Test 为过表达组。

图4为猪IRX3启动子区g.-143G>A位置测序图。

图5为g.-143G>A位点突变前后相对荧光活性值；其中， Homozygote:GG等位基因型；Mutation：AA等位基因型。

图6为猪IRX3基因PCR-Nci I-RFLP检测，琼脂糖浓度为1.5％，图中Marker为DM2000Plus。泳道1、2、3为阴性对照图，4、5、6、7、 8为AA基因型；泳道9、10、11为GG基因型；泳道12、13、14为GA 基因型。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中：

若未特别指明，实施例中所使用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试剂：pcDNA3.1(+)载体购自Invitrogen生物公司；3T3-L1细胞购自中科院上海细胞库；引物由北京华大基因合成。

实施例1IRX3基因表达及其功能分析

采集中国地方品种“藏猪”(采自西藏大学农牧学院教学实习牧场)，“滇南小耳猪”(采自云南省西双版纳州滇南小耳猪资源保护场) 和引进品种“大约克猪”，“长白猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司) 背部皮下脂肪组织，液氮冻存后，Trizol法提取背最长肌和背部皮下脂肪组织总RNA(Trizol来自Invitrogen)，用天根反转录试剂盒反转录总RNA后得到cDNA，以该cDNA为底物，猪GAPDH (NM_001206359.1)基因为内参基因，进行实时荧光定量PCR分析，每个样品重复做三次。根据猪IRX3基因序列设计定量引物，该引物在基因组上跨内含子区，因此可以特异扩增IRX3基因mRNA序列，能够有效的对IRX3基因的表达进行定量分析。

正向引物F：5′-GCTGTAGTGCCTTGGAAGTG-3′；(SEQ ID NO.2)

反向引物R：5′–AGGAGAGAGCCGATAAGACC-3′；(SEQ ID NO.3)

20μL定量扩增体系按照天根SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)试剂盒说明书，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，正反向引物(10μM)各0.6μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH₂O 7.8 μL。扩增条件为：94℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 20s，共40个循环；最后72℃ 5min。

在藏猪和滇南小耳猪的背最长肌和皮下脂肪组织中IRX3 mRNA 定量表达显著高于长白猪和大约克猪(图1)。藏猪和滇南小耳猪具有较高的脂肪沉积能力，因此IRX3基因表达可能促进脂肪沉积，增加脂肪含量。

实施例2过表达猪IRX3基因的体外功能验证

扩增猪IRX3基因CDS区全长，并分别在5’端和3’端添加HindIII和 KpnI酶切位点保护碱基，得到如下引物：

正向引物F：5′-CCCAAGCTTATGTCCTTCCCCCAGCTCGG-3′； (SEQ ID NO.4)

反向引物R：5′-CGGGGTACCTTAAGATGAGGAGAGAGCCG- 3′；(SEQ ID NO.5)

对扩增产物和pcDNA3.1(+)载体同时进行HindIII和KpnI酶的双酶切后，回收酶切产物，连接转化入感受态细胞DH5α，经摇菌扩繁后，提取质粒进行测序及酶切分析，确定正确连入pcDNA3.1(+)的单克隆菌斑，去内毒素提取质粒后在3T3-L1细胞中转染该pcDNA3.1-IRX3质粒，48小时后对3T3-L1细胞进行成脂肪诱导分化，并按照转染后第0天(d0)，第三天(d3)，第六天(d6)，第九天(d9) 分别提取对照组(Control，简称C组)和过表达组(Test，简称T组) 细胞mRNA，以猪βactin基因内参基因，检测猪IRX3基因，并对包括成脂早期分化标记基因DLK，LPL，PLIN2，成脂晚期分化标记基因 PPAR，FABP4，SREBP，脂肪降解标记基因ATGL，HSL，Perlipin 进行定量分析，引物信息见表1。

表1.脂肪代谢相关基因定量引物

如图2所示，IRX3基因在过表达组(T组)的表达，比在对照组 (C组)的表达明显更高，尤其是在分化的第3-6天，说明过表达IRX3 组的细胞确实显著提高了IRX3基因表达。脂肪早期分化和晚期分化标记基因(DLK，LPL，PLIN2和PPARγ，FABP4，SREBP)在IRX3 过表达后均呈现上调趋势，由此可以说明，IRX3基因具有促进脂肪细胞分化的作用。脂肪降解基因(ATGL，HSL，Perlipin)在IRX3过表达后，则呈现下调趋势，说明IRX3基因也具有抑制脂肪降解的作用。由此得出结论：猪IRX3基因的表达对脂肪的形成有着重要的促进作用。

按照本领域常规的油红O染色的方法对在3T3-L1细胞系中过表达IRX3后诱导形成的脂滴进行染色分析，结果如图3-A所示，过表达 IRX3后(T组)脂肪滴的形成显著高于对照组(C组)，图3-B是对形成的脂滴进行再溶解后，分别测定溶解后的脂肪在510nm处的吸光度值与剩余细胞在210nm处的DNA吸光度值，两者相比即脂肪滴形成的相对定量值，由图可见，过表达组形成的脂滴显著高于对照组，说明，过表达IRX3后，对脂肪的形成有着明显的促进作用。

实施例3猪IRX3基因启动子区一个SNP的鉴定

采集中国地方品种“藏猪”(采自西藏大学农牧学院教学实习牧场)，“滇南小耳猪”(采自云南省西双版纳州滇南小耳猪资源保护场) 和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)耳组织样，通过酚-氯仿抽提法从中提取基因组DNA，方法参照《分子克隆实验指南》(第二版)。

从NCBI网站上下载猪IRX3基因序列(登录号：NC_010448.4)，利用软件PrimerPremier 5.0，对从NCBI上下载的IRX3基因的DNA序列，设计以下引物见表2(如序列表SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示)：

表2·扩增启动子区上游599bp至编码区32bp使用引物

用上述引物在藏猪、滇南小耳猪、大约克猪基因组DNA进行PCR 扩增，PCR反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP mix 2.0μL，5pmol/μL的正反向引物各1μL，Taq DNA聚合酶 (5U/μL)0.5μL，DNA模板1μL(DNA约100ng)，加dd H₂O至25μL。 PCR反应条件为第1步95℃变性5min；第2步95℃变性30s；第3步56℃复性30s；第4步72℃延伸40s；重复第2至第4步36个循环，之后再72℃延伸7min，最后降温至4℃保存。

对上述3个猪种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自北京天根生物技术公司，按照说明书操作)纯化。每个猪种随机选择10 个个体进行PCR扩增，每个体的PCR产物各取8μL，混池成一个样本进行测序(上海生工生物工程公司)。扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

三个猪种的测序结果经Chromas和DNAMAN软件比对，该段启动子序列存在1个SNP，即在如序列表SEQ ID NO.1所示的序列中第 455bp处存在一个G碱基到A碱基的突变(见图4)，该位点位于IRX3 基因启动子区转录起始位点上游143bp处，标记为g.-143G>A。

实施例4 g.-143G>A位点定点启动子活性检验

为了检测g.-143G>A位点突变前后对启动子区活性的影响，我们首先以表2(如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)中序列为引物扩增实施例3中从启动子区上游599bp到基因编码区32bp共631bp 片段，构建了连有启动子区上游599bp的pGL3-599bp-Basic载体(载体骨架pGL3-Basic购自Promega公司)然后按照天根快速定点突变试剂盒(KM101)的说明书要求设计该位点的定点突变引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，以构建好的pGL3-599bp-Basic载体为模版，依次进行退火、Fast-Alteration DNA Polymerase酶扩增、DpnI酶消化、凝胶回收、转化测序验证等步骤构建g.-143G>A突变的荧光素酶报告载体。细胞培养及转染用293T细胞系购自中科院上海细胞库。细胞按照常规方法复苏、培养及传代(10％FBS的DMEM培养基，Gbico)。转染前一天向24孔细胞培养板接种(0.5-2)×10⁵个细胞，每孔加500 μL不含抗生素的上述培养基，细胞长至80-90％融合时为转染最佳时机。转染前2h换用不含血清的选择培养基opti-MEM进行饥饿处理。对需要转染的质粒pGL3-599bp-Basic-Homozygote和 pGL3-599bp-Basic-Mutation按如下步骤配制DNA-脂质体复合物：取50μL opti-MEM培养基稀释1μg质粒DNA，缓慢混匀共孵育5min。同时用50μL opti-MEM培养基孵育1μL Lipofectin2000 5min。之后将共孵育的DNA和脂质体混匀，室温下共孵育20min。孵育完成后，向24 孔板中每孔添加100μL复合物，前后摇动24孔板混匀，5％CO₂，37℃培养。转染后6小时更换成含15％FBS的完全培养基继续培养细胞。转染细胞后48h检测荧光素酶活性，具体方法如下：48h后弃去培养基，用磷酸缓冲液(PBS，Gbico)洗涤细胞两次。每孔中加入100μL 细胞裂解液，用细胞刮刮下贴壁细胞，室温下裂解20min，6000r/min 离心后将裂解产物转移至一新的离心管中备用。严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明书进行操作，吸取10μL细胞裂解物，加入荧光素酶分析缓冲液40μL，于酶标板中混匀，然后置于酶标仪中，检测其荧光活性，该荧光活性为萤火虫荧光素酶活性值，测量后，向酶标板中各孔分别加入40μL Stop&Glo试剂，混匀后继续测量荧光活性，该荧光活性为萤火虫荧光素酶淬灭后的海参荧光素酶活性。将萤火虫荧光强度值比海参荧光活性值即表示荧光素酶的相对表达活力，每组均设置有3组重复。

所得结果如图5所示，g.-143G>A位点发生突变后，AA等位基因型(Mutation组)相对荧光活性显著高于GG等位基因型(Homozygote 组)，进而促进了IRX3基因的表达，影响脂肪的沉积。

实施例5猪IRX3基因启动子区g.-143G>A位点基因型快速检测方法的建立

为了快速方便的检测猪IRX3基因启动子区g.-143G>A位点，经序列限制性内切酶分析，发现该位点突变可以被Nci I内切酶(CCGGG) 识别。针对IRX3基因启动子区g.-143G>A突变位点，以序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物对藏猪、滇南小耳猪、大约克猪等基因组 DNA进行PCR扩增，PCR反应体系及程序同实施例3。

PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增效果，可见到片段大小为631bp的清晰条带(见图6条带1，2，3)。该PCR产物用NciI内切酶酶切，反应体系为：10×Buffer 1μL，Nci I内切酶0.25μL(浓度为10U/μL)，PCR产物4μL，加dd H2O至10μL。37℃环境中酶切4-8h。然后，将得到的酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察(见图6)，判断基因型。当扩增片段的455处碱基均为G时，Nci I 内切酶可识别该位点，可将PCR扩增片段切成两个个片段，长度分别为455bp和176bp，该基因型记为GG型；当455bp处的碱基都为A时， PCR扩增片段不会被切割，只有631bp一条条带，该基因型记为AA型；当455bp处既含有G碱基又含有A碱基时，即凝胶电泳中含有三条条带，长度分别为631bp，455bp和176bp，该基因型记为杂合型GA型。

实施例6本发明筛选的遗传标记在不同猪群中的多态性检测

采集藏猪(西藏林芝工布江达县)、滇南小耳猪(云南西双版纳)、大约克猪(安徽科鑫养猪育种有限公司)耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取猪个体基因组DNA样品。采用实施例5中建立的PCR-RFLP 技术，测定猪个体IRX3基因启动子区上游g.-143G>A的PCR-Nci I-RFLP基因型，检测结果如表3所示。

表3.猪IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点多态性分布统计

藏猪、滇南小耳猪均属中国地方猪品种，皮下和肌内脂肪含量均显著高于引进猪种。表3中可见这些中国地方猪种IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点优势基因型为AA，等位基因频率与大白猪差别很大。低脂肪沉积速度的大白猪在该位点均为GG基因型；而在藏猪和滇南小耳猪的优势基因型为AA。由此初步判断启动子区上游g. -143G>A位点AA型为高脂肪沉积性状相关位点。结果表明该基因位点的基因型和等位基因分布在不同生长性能的猪群间差异明显，可能与脂肪沉积性能相关。

实施例7淮猪新品系IRX3基因型与校正背膘厚的关联分析

对淮猪新品系(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)II系202个个体测定到达90kg体重时的校正背膘厚。采集该202头猪耳组织样品，其个体间无亲缘关系，采用实施例5中建立的PCR-RFLP技术测定202头淮猪新品系的IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点的基因型，结果见表4。淮猪新品系群体中IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点出现的3种基因型中GG型频率29.70％，GA型频率为0.5842.6％，AA型频率11.88％。

表4.淮猪新品系IRX3基因启动子区Nci I酶切基因型分布

对淮猪新品系群体中IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点基因型与90kg体重校正背膘厚性状使用SAS9.2GLM相关性分析，结果见表5。GG型淮猪90kg校正背膘低于GA型和AA型，而且与AA型相比差异显著(p<0.05)。GG型猪比GA型猪90kg校正背膘小近0.2cm，而比AA型猪小近0.4cm，因此，等位基因A是高背膘厚的分子标记，可以用于猪分子标记辅助育种。

表5.淮猪新品系IRX3基因启动子区上游g.-143G>A位点不同基因型对90kg 校正背膘的效应分析

注：表中数值表示为平均数±标准误，不同字母表示差异显著(p<0.05)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1].刘轩等,藏猪繁殖性状多基因效应分析.遗传,2010(05):第480-485页.

[2].马俊松等,原生态养殖版纳小耳猪肥育性能、胴体及肉质测定.养猪,2009(02):第37-38页.

[3].Chmurzynska,A.and M.A.Mlodzik,Genetics of fat intake in thedetermination of body mass. Nutr Res Rev,2017.30(1):p.106-117.

[4].Smemo,S.,et al.,Obesity-associated variants within FTO form long-range functional connections with IRX3.Nature,2014.507(7492):p.371-5.

[5].Ragvin,A.,et al.,Long-range gene regulation links genomic type 2diabetes and obesity risk regions to HHEX,SOX4,and IRX3.Proc Natl Acad Sci US A,2010.107(2):p.775-80.

[6].Claussnitzer,M.,et al.,FTO Obesity Variant Circuitry andAdipocyte Browning in Humans.N Engl J Med,2015.373(10):p.895-907。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用

<141> 2018-09-13

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 631

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

gccagtggga gttcattccg gaacgcagct ccccagagct gctgagaccg gagataagtc 60

aggaacaagg ctttccaagc cctccactct ggtggaattc ggcttcgatt cctctatcaa 120

tcagcgctca gcgggccagt ttccgcctct tagccggggc tggcaactcc taggcagtct 180

acgccccggt gttgttcccg gagcgttccc gctgcaggcc tggcctctgc gtcgtcggtc 240

gccgtggcgg cctaaagcgt ttagcccgga gccgcggcaa taccgggaat ttcaatcccg 300

cactccccaa gccgtgaagg tgggcgcccg gatacgggga tttcaggttt gatgtaggga 360

atatcccact gtaaaactac aaggcttgcc tcccatcccc acccaagcgg gtgggaggat 420

cctcgccgca agaaaacagg tcggtctgga gaccggggag cagaagaagg ggtagtgtcg 480

aaacgaagaa tctctacgga ccgaaaattc caatatacaa agttctccaa gcgctctcca 540

aaagttcctg gggcctcagc cacccagctc cctgctccgc ccccacccca cccaccccag 600

ctttgggcgc ccgtaggctc cactgtcctg a 631

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgtagtgc cttggaagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagagagc cgataagacc 20

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagctta tgtccttccc ccagctcgg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtacct taagatgagg agagagccg 29

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccagtggga gttcattc 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaggacagt ggagccta 18

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcggtctgga gaccggagag cagaaga 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccggtctcc agaccgacct gttttct 27

Claims

1.SNP分子标记在鉴定猪脂肪沉积能力中的应用，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第455位，碱基为G/A。

2.一种鉴定猪脂肪沉积性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：以猪基因组DNA为模板利用引物对进行PCR扩增获得PCR产物，所述引物对的核苷酸序列为：

正向引物F：5'- GCCAGTGGGAGTTCATTC -3'，

反向引物R：5'- TCAGGACAGTGGAGCCTA -3'；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酶切反应体系为：10×Buffer 1µL，浓度为10U/µL 的Nci I内切酶 0.25 µL，PCR产物4 µL，加dd H₂O至10µL。

4.SNP分子标记在猪脂肪沉积性状育种中的应用，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第455位，碱基为G/A。