CN113061659A - 一种鼠源性成分lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种鼠源性成分lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠源性成分LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，涉及分子生物学检测技术领域。引物组包括一组大鼠检测引物和一组小鼠检测引物，所述大鼠检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，检测试剂盒中还设有DNA聚合酶、LAMP反应液、大鼠阳性对照和小鼠阳性对照以及阴性对照。具备快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性等优点。

Description

一种鼠源性成分LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体为一种鼠源性成分LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
肉类掺假的历史非常悠久，自古代起就有“挂羊头卖狗肉”的说法。时至今日，从欧洲马肉事件到近期报道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒伪劣的牛肉等等事件，“肉类掺假”不停地冲击着食品安全体系，给社会带来了巨大的负面影响。其中最值得关注的是羊肉制品的鼠肉掺假事件，虽然我国的食品监察管理部门针对鼠肉掺假等一系列问题进行严格的筛查，但是我国在鉴别肉类掺假方面尚未有完善的检测标准和监察体系，尤其像鼠肉这种特殊的肉源性成分，且由于肉类产品具有产品流通量大和常温下贮藏保质期短等特点，在实验室条件下常用的定量和定性检测方法很难满足实时的、快捷的、大批量的产品检测需求，因此亟需开发出快速、简易、准确、便捷的肉源性成分快速检测技术及产品。
目前，对肉类制品中的种属鉴定主要包括高效液相色谱、等电聚焦电泳(IEF)和酶联免疫测定(ELISA)等客观仪器分析技术检测方法，但都因为其检测方法灵敏度低、操作周期长、操作要求高等劣势而未被基层广泛推广使用。以DNA为目标的动物种属鉴定是当前普遍使用的肉类掺假分子生物学检测方法，实时荧光定量PCR(real-time polymerase chainreaction,RT-PCR)和微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)等PCR检测方法凭借其特异性强、灵敏度高等特点，且由于其具有高时效性和高准确性，已经逐渐取代了常规PCR检测技术，成为肉类种属鉴定的主要检测方法。但是实时荧光PCR和微滴式数字PCR需使用昂贵的仪器设备作为实验支撑，检测成本相对较高，且反应过程需要升降温，导致该检测技术不能很好的应用于广大基层单位。因此，亟待研究开发一种快速准确、性价比高、恒温且易于广大基层单位操作的分子检测方法，为广大基层单位肉制品掺假诊断提供新的选择。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作为近几年来的新型核酸扩增技术，克服了传统PCR、实时荧光定量PCR和微滴式数字PCR等PCR检测方法反复升降温且检测周期相对较长的缺点，利用BstDNA聚合酶和根据特定靶序列设计的三对特殊的内、外、环引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，可实现恒温条件下的连续快速扩增。因其具有恒温、特异性强、灵敏度高、性价比高和操作简易等特点，本发明基于环介导等温扩增检测技术开发出大鼠、小鼠鼠源性检测试剂盒，实现快速准确、易于操作的检测目的，从而向广大基层用户推广使用，实现对掺假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的检测，为肉制品质量控制提供了有效的技术手段。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种鼠源性成分LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，具备快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性等优点，解决了很难满足实时的、快捷的、大批量的产品检测需求的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鼠源性成分LAMP检测引物组，包括一组大鼠检测引物和一组小鼠检测引物，所述大鼠检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
COX-F3：CCGATACGGAATAATCCTGTT
COX-B3：CCTTCTATTAGGCTGTGATGG
COX-FIP：CAGCAACCGCCTAGGTCGAGTATTCTTCTTTGCCGGATTT
COX-BIP：CCCCAACAGGAATTACCCCTTTCTGATGCTAAGAGGACTGATG
COX-FLP：GGTAGGAACTAGGCTGGAATG
COX-BLP：TCCCCTAGAAGTACCCCTTC；
所述小鼠检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
16S-F3：CTTGGTGATAGCTGGTTACC
16S-B3：GTGTTGGGTTAACAGAGAAGT
16S-FIP：TTATGTTGAGCTTGAACGCTGACAGCTCTTCTGGAACG
16S-BIP：TCCAATTCTCCAGGCATACGCTGTGATTATTGCCTATAGTCTG
16S-FLP：TTCTTTATTGGTGGCTGCTTT
16S-BLP：AACAACTCGGATAACCATTGTT。
一种鼠源性成分LAMP检测试剂盒，包括权利要求1所述的大鼠检测引物组和小鼠检测引物组，所述大鼠检测引物组及小鼠引物组中，外引物、内引物、环引物之间的摩尔比为：1-2：4-8：2-4，大鼠和小鼠引物组比例为1：1，所述检测试剂盒中还设有DNA聚合酶、LAMP反应液、大鼠阳性对照和小鼠阳性对照以及阴性对照。
作为本发明的一种优选技术方案，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述LAMP反应液中含有8mmol/L MgSO4、1.0mol/L甜菜碱、10×ThermoPol缓冲液、1.6mmol/L dNTPs和10UBst DNA聚合酶，所述大鼠阳性对照为含大鼠COX基因片段的T载体克隆，所述小鼠阳性对照为含小鼠16S基因片段的T载体克隆，所述阴性对照为超纯水。
一种鼠源性成分LAMP检测方法，包括如下步骤：
S1、提取待检样品DNA；
S2、利用权利要求1中的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温PCR扩增；
S3、结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据样品扩增曲线进行判断：
阳性对照出现“S”型扩增曲线，同时阴性对照为无“S”型扩增曲线，表明本次结果可靠，否则需要重新检测；
待测样品出现“S”型扩增曲线，检测结果为阳性，含有鼠源性成分；
待测样品无“S”型扩增曲线，检测结果为阴性，不含有鼠源性成分。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中，LAMP恒温PCR扩增的25μL LAMP体系成分如下：8mmol/L MgSO4、1.0mol/L甜菜碱、内引物FIP和BIP各1.8μmol/L、外引物F3和B3各0.4μmol/L、环引物FLP和BLP各0.8μmol/L、10×ThermoPol缓冲液、1.6mmol/LdNTPs、10UBst DNA聚合酶，用超纯水补足至25μL。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中，LAMP恒温PCR扩增的程序为63～65℃反应45min。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种鼠源性成分LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，具备以下有益效果：
(1)快速高效：整个扩增只用45min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
(2)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性：本发明根据大鼠COX基因以及小鼠16S基因各设计了六条特异性引物，应用上述每套引物，对应每个扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度：大鼠的最低检测限可达到0.1％，小鼠的最低检测限可达到0.5％；
(5)鉴定简便：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明
图1为本发明的实施例三中大鼠的检测灵敏度示意图；
图2为本发明的实施例三中小鼠的检测灵敏度示意图；
图3为本发明的实施例四中检测特异性示意图；
图4为本发明的实施例五中大鼠的检测重复性示意图；
图5为本发明的实施例五中小鼠的检测重复性示意图；
图6为本发明的实施例六中实际样品检测示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一，鼠源性成分的恒温检测试剂盒的建立：
鼠源性成分的恒温检测试剂盒，包括检测大鼠检测引物组、小鼠检测引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶、大鼠和小鼠阳性对照、阴性对照；
大鼠检测引物组：以大鼠COX基因为靶基因，进行LAMP引物的设计，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
COX-F3：CCGATACGGAATAATCCTGTT(SEQ ID NO:1)
COX-B3：CCTTCTATTAGGCTGTGATGG(SEQ ID NO:2)
COX-FIP：CAGCAACCGCCTAGGTCGAGTATTCTTCTTTGCCGGATTT(SEQ ID NO:3)
COX-BIP：CCCCAACAGGAATTACCCCTTTCTGATGCTAAGAGGACTGATGSEQ ID NO:4)
COX-FLP：GGTAGGAACTAGGCTGGAATG(SEQ ID NO:5)
COX-BLP：TCCCCTAGAAGTACCCCTTC(SEQ ID NO:6)；
小鼠检测引物组：以小鼠16S基因为靶基因，进行LAMP引物的设计，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
16S-F3：CTTGGTGATAGCTGGTTACC(SEQ ID NO:7)
16S-B3：GTGTTGGGTTAACAGAGAAGT(SEQ ID NO:8)
16S-FIP：TTATGTTGAGCTTGAACGCTGACAGCTCTTCTGGAACG(SEQ ID NO:9)
16S-BIP：TCCAATTCTCCAGGCATACGCTGTGATTATTGCCTATAGTCTG(SEQ ID NO:10)
16S-FLP：TTCTTTATTGGTGGCTGCTTT(SEQ ID NO:11)
16S-BLP：AACAACTCGGATAACCATTGTT(SEQ ID NO:12)；
LAMP反应液：8mmol/L MgSO4，1.0mol/L甜菜碱，10×ThermoPol缓冲液，1.6mmol/LdNTPs，10U Bst DNA聚合酶；
大鼠阳性对照为含有大鼠COX基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以大鼠的组织DNA为模板，利用的大鼠COX外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)进行扩增，所得扩增片段序列如SEQ ID NO:13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为大鼠阳性对照；
小鼠阳性对照为含有小鼠16S基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：小鼠的组织DNA为模板，利用小鼠16S外引物(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)进行扩增，所得扩增片段序列如SEQ ID NO:14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为大鼠阳性对照；
阴性对照为超纯水。
实施例二，鼠源性成分的LAMP检测：
利用实施例实施例一中的鼠源性成分的LAMP检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：
S1、提取待检样品DNA；
S2、利用LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温扩增：8mmol/L MgSO4，1.0mol/L甜菜碱、内引物FIP和BIP各1.8μmol/L、外引物F3和B3各0.5μmol/L、环引物FLP和BLP各0.8μmol/L、10×ThermoPol缓冲液、1.6mmol/L dNTPs、10U Bst DNA聚合酶，用超纯水补足至25μL，LAMP恒温扩增的程序为63～65℃反应45min。
根据样品扩增曲线进行判断：
阳性对照出现“S”型扩增曲线，同时阴性对照为无“S”型扩增曲线，表明本次结果可靠，否则需要重新检测；
待测样品出现“S”型扩增曲线，检测结果为阳性，含有鼠源性成分；
待测样品无“S”型扩增曲线，检测结果为阴性，不含有鼠源性成分。
实施例三，灵敏度实验：
以羊肉为基底肉，分别制备大鼠不同质量比例混合模拟样品(50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％)，提取各浓度模拟样品的DNA，按照实施例二中LAMP反应体系进行扩增，以确定该恒温检测方法对大鼠的检测灵敏度为0.1％(如图1所示)；
以羊肉为基底肉，分别制备小鼠不同质量比例混合模拟样品(50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％)，提取各浓度模拟样品的DNA，按照实施例二LAMP反应体系进行扩增，以确定该恒温检测方法对小鼠的检测灵敏度(如图2所示)。
实施例四，特异性实验：
用实施例二的LAMP反应体系进行特异性实验，以猪、黄牛、水牛、鸡、水鸭、番鸭、鹅、家兔、田鸡、狗、马、驴的DNA为特异性实验模板，其它肉类样品DNA均未发生扩增，仅对大鼠、小鼠样品DNA出现了S型扩增曲线(如图3所示)。
实施例五，重复性实验：
以实施例三中大鼠、小鼠的最低检出限浓度模拟样品进行10个平行实验，按实施例二的LAMP反应体系条件进行环介导等温扩增检测，以确定该恒温检测方法的稳定性，结果表明，该检测方法具有良好的稳定性(如图4、5所示)。
实施例六，实际样品检测：
用实施例二建立的LAMP检测方法对市售羊肉制品进行检测，结果发现有1份样品呈阳性(如图6所示)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种鼠源性成分LAMP检测引物组，其特征在于：包括一组大鼠检测引物和一组小鼠检测引物，所述大鼠检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
COX-F3：CCGATACGGAATAATCCTGTT
COX-B3：CCTTCTATTAGGCTGTGATGG
COX-FIP：CAGCAACCGCCTAGGTCGAGTATTCTTCTTTGCCGGATTT
COX-BIP：CCCCAACAGGAATTACCCCTTTCTGATGCTAAGAGGACTGATG
COX-FLP：GGTAGGAACTAGGCTGGAATG
COX-BLP：TCCCCTAGAAGTACCCCTTC；
所述小鼠检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
16S-F3：CTTGGTGATAGCTGGTTACC
16S-B3：GTGTTGGGTTAACAGAGAAGT
16S-FIP：TTATGTTGAGCTTGAACGCTGACAGCTCTTCTGGAACG
16S-BIP：TCCAATTCTCCAGGCATACGCTGTGATTATTGCCTATAGTCTG
16S-FLP：TTCTTTATTGGTGGCTGCTTT
16S-BLP：AACAACTCGGATAACCATTGTT。
2.一种鼠源性成分LAMP检测试剂盒，包括权利要求1所述的大鼠检测引物组和小鼠检测引物组，其特征在于：所述大鼠检测引物组及小鼠引物组中，外引物、内引物、环引物之间的摩尔比为：1-2：4-8：2-4，大鼠和小鼠引物组比例为1：1，所述检测试剂盒中还设有DNA聚合酶、LAMP反应液、大鼠阳性对照和小鼠阳性对照以及阴性对照。
3.根据权利要求2所述的一种鼠源性成分LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述LAMP反应液中含有8mmol/L MgSO4、1.0mol/L甜菜碱、10×ThermoPol缓冲液、1.6mmol/L dNTPs和10U Bst DNA聚合酶，所述大鼠阳性对照为含大鼠COX基因片段的T载体克隆，所述小鼠阳性对照为含小鼠16S基因片段的T载体克隆，所述阴性对照为超纯水。
4.一种鼠源性成分LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待检样品DNA；
S2、利用权利要求1中的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温PCR扩增；
S3、结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据样品扩增曲线进行判断：
阳性对照出现“S”型扩增曲线，同时阴性对照为无“S”型扩增曲线，表明本次结果可靠，否则需要重新检测；
待测样品出现“S”型扩增曲线，检测结果为阳性，含有鼠源性成分；
待测样品无“S”型扩增曲线，检测结果为阴性，不含有鼠源性成分。
5.根据权利要求4所述的一种鼠源性成分LAMP检测方法，其特征在于：所述S2中，LAMP恒温PCR扩增的25μL LAMP体系成分如下：8mmol/L MgSO4、1.0mol/L甜菜碱、内引物FIP和BIP各1.8μmol/L、外引物F3和B3各0.4μmol/L、环引物FLP和BLP各0.8μmol/L、10×ThermoPol缓冲液、1.6mmol/L dNTPs、10U Bst DNA聚合酶，用超纯水补足至25μL。
6.根据权利要求4所述的一种鼠源性成分LAMP检测方法，其特征在于：所述S2中，LAMP恒温PCR扩增的程序为63～65℃反应45min。
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