CN106636445A - 耐除草剂大豆shzd32‑1及其衍生品种的实时荧光定性pcr检测方法 - Google Patents

耐除草剂大豆shzd32‑1及其衍生品种的实时荧光定性pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，属于耐除草剂大豆的定性检测领域。本发明首先公开了用于检测耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测引物对和探针。在此基础上，本发明进一步建立了一种耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，该检测方法的特异性高、检出限低。本发明还公开了一种耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测试剂盒。本发明耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法或试剂盒能够用于耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的定性检测。

Description

耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检 测方法
技术领域
本发明涉及耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，尤其涉及耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，属于耐除草剂大豆的定性检测领域。
背景技术
随着基因工程技术的飞速发展，转基因作物种植面积和转基因作物品种都大量增加，同时转基因植物及其产品安全性也引起全球范围内的关注和担忧。为了有效监管转基因植物及其产品，保障消费者的合法权益，目前，包括中国在内的全世界50多个国家颁布并实施了转基因生物安全标识制度和配套的管理规定。中国的基因工程育种技术发展迅速，近年来育成了一系列的转基因品种作物，因此制定相关的转基因生物安全评价方法显得尤其重要。
在转基因作物及其产品安全检测方法中，PCR技术以其灵敏度高、稳定性好、准确性强、操作简便成为国际上转基因植物及其产品检测的主要方法，中国近年来颁布的转基因生物及其产品安全评价方法也是以PCR检测方法为主。根据检测目的基因的不同，PCR检测方法分为筛查、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测；其中，转化体特异性检测方法的特异性最高，筛查检测和转化体特异性检测方法是实际检测中应用最广泛的方法。筛查检测方法主要用于初步检测样品中是否含有转基因成分，转化体特异性检测方法可以准确确定转基因植物的身份。
转基因耐草甘膦大豆SHZD32-1由上海交通大学研发，利用农杆菌介导法将密码子经优化的耐草甘膦基因G10-EPSPS导入了栽培大豆品种“中豆32”获得转G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆SHZD32-1。G10是一个新的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。温室试验和中间试验表明，转G10基因耐草甘膦大豆的耐草甘膦性能良好，能够达到耐除草剂的运用水平，已经获批进行环境试验。到目前为止，中国尚未发布专门针对耐草甘膦大豆SHZD32-1及其衍生品种检测的方法。因此，迫切需要尽快制定相关检测方法，为中国转基因生物安全管理部门实施各项安全管理制度提供科学方法和技术支撑。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测引物对和探针；
本发明所要解决的第二个技术问题是建立一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明根据耐除草剂大豆SHZD32-1的两端侧翼序列，分别在两端设计了引物和探针。本发明所设计的实时荧光定性PCR检测引物对和探针的核苷酸序列如下：
右侧的引物为由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物组成的引物对1；所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的探针1；
左侧的引物为由核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的正向引物和SEQ ID No.5所示的反向引物组成的引物对2；所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的探针2。
本发明进一步分别利用这两端的引物和探针扩增SHZD32-1大豆基因组DNA，对两侧设计得到的引物做标准曲线验证引物工作效率，筛选最佳的引物和探针组合。扩增结果证明，右侧的引物与探针明显优于左侧的引物和探针。本发明将右侧的引物与探针分别命名为SHZD32-1QF(SEQ ID No.1所示)、SHZD32-1QR(SEQ ID No.2所示)、SHZD32-1P(SEQ IDNo.3所示)。
本发明所述的实时荧光定性PCR检测引物对和探针能够应用于检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种。
本发明进一步公开了一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述的实时荧光定性PCR检测引物对和探针建立PCR扩增体系并进行实时荧光PCR扩增；(3)如果发生特异性扩增(即从待检测样品中扩增获得典型的扩增曲线)，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果未发生特异性扩增(即从待检测样品中未能扩增出典型的扩增曲线)，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。
进一步优选的，一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以所述的引物对1和探针1建立PCR扩增体系并进行实时荧光PCR扩增；(3)如果发生特异性扩增(即从待检测样品中扩增获得典型的扩增曲线)，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果未发生特异性扩增(即从待检测样品中未能扩增出典型的扩增曲线)，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。
本发明所述的实时荧光定性PCR检测方法中，所述PCR扩增体系包括：反应体系总体积为25.0μL；其中，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L氯化镁溶液2.5μL，dNTPs混合溶液2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，10μmol/L探针0.5μL，终浓度为0.025U/μL的Taq DNA聚合酶，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。所述实时荧光PCR扩增的程序包括：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，循环数40；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。
本发明还公开了一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测引物对，探针，Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，所述检测引物对、探针为本发明所设计的实时荧光定性PCR检测引物对和探针；优选的，所述检测引物对为引物对1，所述探针为探针1。
特异性检测结果表明，应用本发明耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，除在1％SHZD32-1的基因组DNA中得到扩增曲线，在其他转基因混合物中均未得到特异的扩增曲线。证明本发明方法具有高度的特异性。
线性区间测试表明，将SHZD32-1大豆的基因组DNA分别稀释至50ng-0.016ng进行实时荧光PCR测试，结果标准曲线的相关系数和扩增效率符合要求，表明本发明建立的实时荧光PCR方法在此区间有较好的线性关系。
检出限测试结果表明，0.025ng的样品60个平行均能获得典型的扩增曲线。因此，本发明实时荧光PCR方法的检出限达到0.05％(以PCR检测反应体系中加入50ng DNA模板确定)。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明根据耐除草剂大豆SHZD32-1的两端侧翼序列，设计并筛选获得一对实时荧光定性PCR检测引物对和探针。本发明进一步利用所述实时荧光定性PCR检测引物对和探针建立了一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，该方法的特异性高，检出限达到0.05％，能够用于耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性检测。
附图说明
图1为耐除草剂大豆SHZD32-1的载体图(A)与整合示意图(B)；
图2为左右两侧引物与探针的扩增效果；
图3为实时荧光PCR方法引物与探针浓度测试；
图4为扩增靶标序列；其中，双下划线部分为实时荧光PCR方法SHZD32-1QF和SHZD32-1QR引物序列，方框内部分为实时荧光PCR方法SHZD32-1P探针序列；1～108bp为外源插入片段部分序列，109～234bp为大豆基因组部分序列；
图5为实时荧光PCR方法的特异性测试；
图6为实时荧光PCR方法的线性区间测试；
图7为实时荧光PCR方法的LOD测试。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR方法--实时荧光PCR方法的建立
1、耐除草剂大豆SHZD32-1分子特征
耐除草剂大豆SHZD32-1的表达载体为P1300(图1)，表达框内含有CaMV35S启动子、新型EPSPS基因及CaMV35S-polyA作为终止子，研发者Southern杂交表明，耐除草剂大豆SHZD32-1基因组中整合了单一拷贝的表达框。5′端分离到序列长度为517bp的侧翼序列，0-299bp比对到载体上，251-517bp比对到大豆基因组参考序列上，比对到参考序列上的坐标为Gm15:15989180-15989446bp；3′端分离到序列长度为456bp的侧翼序列，0-456bp比对到参考序列上，比对到参考序列上的坐标为Gm15:15990978-15991438bp，450-502bp比对到载体上。
2、主要技术参数确定原则
2.1引物筛选
实时荧光PCR方法，利用引物探针设计软件进行引物和探针的设计，选择一条最优的探针及相应的正反向引物，根据荧光曲线的线形、扩增效率、相对Ct值等，确定引物和探针组合。
2.2反应退火温度和引物浓度的宽容度测试
实时荧光PCR方法，反应体系和反应条件一般参照使用的试剂(盒)建议的条件进行，对引物和探针浓度进行测试，根据荧光曲线的线型、相对Ct值等，确定引物和探针的浓度。
2.3检测方法特异性测试
选用不同作物及其主要的商业化转化体进行测试，验收标准是仅在阳性样品中获得预期的扩增。
2.4检测方法的检出限
转基因的检出限(Limit of detection,LOD)一般是指不低于95％的检出情况下的转基因含量，严格的测试实验是在60次平行中至少检出59次阳性。
3、主要技术参数确定过程
3.1引物探针设计与筛选
根据耐除草剂大豆SHZD32-1的两端侧翼序列，利用Primer press软件分别在两端设计了引物和探针，左右两端挑选最佳的引物和探针组合(表1)。
表1 两端引物与探针
分别利用这两端的引物和探针扩增SHZD32-1大豆基因组DNA，扩增模板浓度为：50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng，对两侧设计得到的引物做标准曲线验证引物工作效率。结果见图2。
根据标准曲线的斜率计算扩增效率：E＝(10-1/斜率-1)×100，要求标准曲线的斜率：-3.6≤斜率≤-3.1，即扩增效率达到90－110％。同时相关性系数(R2)≥0.98。根据扩增的表现，右侧的引物与探针要优于左侧的引物和探针。本发明将右侧的引物与探针名称修改为SHZD32-1QF、SHZD32-1QR、SHZD32-1P。
3.2实时荧光PCR方法引物与探针浓度测试
分别设置引物浓度：0.32μM、0.4μM、0.48μM、0.56μM；探针浓度：0.16μM、0.2μM、0.24μM、0.28μM，做正交实验进行PCR体系优化，结果见图3，各个浓度的Ct值都在23附近。根据平台期的信号强度，及扩增的效率、稳定性，选择引物浓度0.4μM，探针浓度0.2μM作为本发明的引物及探针浓度。PCR扩增体系见表2，扩增靶标序列见图4。
PCR扩增程序：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，循环数40；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。
表2 扩增体系
3.3实时荧光PCR方法特异性测试
转基因混合物材料：
(1)其他转基因大豆混合物：SHZD32-5、SHZD32-9、356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12，每种转化体含量各1％。
(2)转基因水稻混合物：TT51-1、KF-6、KF-2、KMD-1、M12、KF-8，每种转化体含量各1％。
(3)转基因玉米混合物：Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460，每种转化体含量各1％。
(4)转基因油菜混合物：MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2，每种转化体含量1％。
(5)转基因棉花混合物(MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913，每种转化体含量1％。
选取转基因混合物材料，进行实时荧光PCR试验的种间特异性测试，以1％的转基因大豆SHZD32-1作为阳性对照，并设置阴性和空白对照进行PCR扩增，除在1％SHZD32-1的基因组DNA中得到扩增曲线，在其他转基因混合物中均未得到特异的扩增曲线，扩增结果如图5。
3.4实时荧光PCR方法线性区间测试
将SHZD32-1大豆的基因组DNA分别稀释至50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng，进行实时荧光PCR测试，绘制标准曲线(图6)。结果标准曲线的相关系数和扩增效率符合要求，表明本发明建立的方法在此区间有较好的线性关系。
3.5实时荧光PCR方法检出限
如果实时荧光PCR方法的检出限达到0.05％(以PCR检测反应体系中加入50ng DNA模板确定)，则实时荧光PCR方法能检测到0.025ng SHZD32-1大豆的基因组DNA。0.025ng的样品60个平行均能获得典型的扩增曲线(图7)。因此，本发明实时荧光PCR方法的检出限达到0.05％(以PCR检测反应体系中加入50ng DNA模板确定)。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法
<130> ZJ-2001-170113A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 1
tcgtttcccg ccataagg 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 2
catcaaccaa gagcaacagc at 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 3
tccgaccacc acgagaccgt agtaca 26
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 4
ccttccccct tcgctgtt 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 5
tccagatccc ccgaattaat t 21
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 6
aactcattgc acaaagaccc cctaaccg 28

Claims (8)

1.用于检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测引物对和探针，其特征在于：
所述引物对为由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物组成的引物对1；所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的探针1；或者，
所述引物对为由核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的正向引物和SEQ ID No.5所示的反向引物组成的引物对2；所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的探针2。
2.权利要求1所述的实时荧光定性PCR检测引物对和探针在检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种中的应用。
3.一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的实时荧光定性PCR检测引物对和探针建立PCR扩增体系并进行实时荧光PCR扩增；(3)如果发生特异性扩增，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果未发生特异性扩增，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。
4.一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的引物对1和探针1建立PCR扩增体系并进行实时荧光PCR扩增；(3)如果发生特异性扩增，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果未发生特异性扩增，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。
5.按照权利要求3或4所述的实时荧光定性PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：反应体系总体积为25.0μL，其中，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L氯化镁溶液2.5μL，dNTPs混合溶液2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，10μmol/L探针0.5μL，终浓度为0.025U/μL的Taq DNA聚合酶，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。
6.按照权利要求3或4所述的实时荧光定性PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的程序包括：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，循环数40。
7.一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的实时荧光定性PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测引物对，探针，Taq DNA聚合酶和双蒸水；其特征在于：所述检测引物对、探针为权利要求1所述的实时荧光定性PCR检测引物对和探针。
8.按照权利要求7所述的实时荧光定性PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测引物对为权利要求1所述的引物对1，所述探针为权利要求1所述的探针1。
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