KR20160019534A - 탐지용 대두 유전자변형 이벤트 mon87751 및 이의 이용 방법 - Google Patents

탐지용 대두 유전자변형 이벤트 mon87751 및 이의 이용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160019534A
KR20160019534A KR1020167000825A KR20167000825A KR20160019534A KR 20160019534 A KR20160019534 A KR 20160019534A KR 1020167000825 A KR1020167000825 A KR 1020167000825A KR 20167000825 A KR20167000825 A KR 20167000825A KR 20160019534 A KR20160019534 A KR 20160019534A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
soybean
dna
event
event mon87751
Prior art date
Application number
KR1020167000825A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102180294B1 (ko
Inventor
킴 에이. 비즐리
웬 씨. 번즈
로버트 에이치. 2세 콜
테드 씨. 마크래
존 에이. 미클로스
리사 쥐. 루쉬케
카이롱 티안
리핑 웨이
쿤쉥 우
Original Assignee
몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 filed Critical 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Publication of KR20160019534A publication Critical patent/KR20160019534A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102180294B1 publication Critical patent/KR102180294B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C20/00—Cheese substitutes
    • A23C20/02—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates
    • A23C20/025—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates mainly containing proteins from pulses or oilseeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • A23K1/00—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

본 발명은 유전자변형 Glycine max 이벤트 MON87751, 이벤트 MON87751을 포함하는 식물, 식물 세포들, 종자, 식물 일부분, 후대 식물, 및 상품 생산물을 제공한다. 본 발명은 이벤트 MON87751에 특이적인 폴리뉴클레오티드, 이벤트 MON87751의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포들, 종자, 식물 일부분, 및 상품 생산물을 또한 제공한다. 본 발명은 이벤트 MON87751에 관련된 방법들을 또한 제공한다.

Description

탐지용 대두 유전자변형 이벤트 MON87751 및 이의 이용 방법{Soybean Transgenic Event MON87751 And Methods For Detection And Use Thereof}
관련 출원들에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 6월 14일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/834,899를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
서열 목록의 통합
파일명 MONS357WO_ST25.txt로 포함된 서열 목록-크기 43 킬로바이트 (Microsoft Windows®에 의해 측정된 크기임)-은 2014년 6월 12일자로 만들어졌으며, 전자 제출 방식에 의해 본 출원과 함께 제출되며, 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 MON87751로 명명된 유전자변형(transgenic) Glycine max (대두) 이벤트에 관계한다. 상기 이벤트는 대두 식물에서 기존에 이용할 수 없었던 살충 독소 단백질들의 독특한 조합을 제공함으로써, 대두의 인시목곤충(lepidopteran) 감염으로부터 2가지 상이한 방식의 저항 작용을 제공한다. 이들 살충 독소 단백질들의 조합은 대두 식물에 특징적인 인시목곤충 종 감염의 제어에 매우 효과적이다. 본 발명은 이벤트 MON87751 관련된 대두 식물, 식물 일부분, 식물 종자, 식물 세포들, 후대 식물, 농업 생산물, 그리고 방법들에 또한 관련되며, 그리고 Glycine max (대두) 세포의 게놈 안으로 유전자변형 DNA의 삽입이 관련되어 만들어지고, 대두 핵산이 포함된 생물학적 시료들 안에 상기 이벤트의 존재를 탐지하는데 유용한, 상기 이벤트에 독특한 뉴클레오티드 분자들을 제공한다.
발명의 배경
대두 (Glycine max)는 세계 많은 지역에서 중요한 농작물이며, 원하는 형질을 가진 대두 변종(varieties)을 생산하기 위하여 이 작물에 생명공학이 응용되어 왔었다. 이러한 바람직한 형질 중 하나가 곤충 저항성이다. 식물에서 곤충 저항성 이식유전자(transgene)의 발현으로 해당 식물에게 곤충 저항성의 원하는 형질을 부여할 수 있지만, 상기 이식유전자의 발현은 많은 상이한 인자들에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이러한 인자들의 예로는 상기 식물 염색체로 이전되는 개별 유전자의 발현을 구동시키는 카세트의 방향 및 조성, 염색체 위치, 그리고 상기 이식유전자 삽입된 게놈 결과들이 포함된다. 예를 들면, 상기 이식유전자의 염색체 삽입 부위가 상이하나, 그 외에는 동일한 개별 이벤트에서 이식유전자 발현 수준 및 패턴에서 편차(variation)가 있다는 것이 관찰되었다. 이벤트들 간에 바람직하지 않는 및/또는 바람직한 표현형 또는 작물(agronomic) 차이들이 또한 있다. 따라서, 상업적 성공에 적합한 바람직한 형질과 최적의 표현형 및 농업적 특징을 보유하는 이벤트를 선택하기 위하여, 다수의 개별 식물 세포 형질변환 이벤트를 생산하고, 분석하는 것이 대개 필수적이다. 선호되는 유전자변형 이벤트의 선택에는 방대한 분자 특징화, 뿐만 아니라 다양한 지역 및 다양한 조건들 하에서 수년간에 걸쳐 많은 이벤트를 이용한 온실 및 야외 실험이 요구된다. 엄청난 양의 효과, 표현형, 및 분자 데이터가 수집되고, 그 다음 하나 또는 그 이상의 상업적으로 적합한 이벤트들의 선별을 목적으로 과학자 및 농학자들로 구성된 팀에 의해 생성된 데이터 및 관찰이 분석된다. 일단 선별된 이러한 이벤트는 상기 바람직한 유전자변형 형질을 식물 번식(breeding) 방법을 이용하여 다른 유전적 배경으로 유전자이입(introgression)에 이용되고, 따라서 상기 바람직한 형질을 포함하고, 특정 지역 작물 조건에 적합하도록 개작된 다수의 상이한 작물 변종이 만들어진다.
곤충 감염의 살충 조절을 위하여 단일 독소의 발현에 의존하는 유전자변형 대두는 이들 해충에 의해 상기 독소에 저항성 발달 가능성이 증가되기 때문에 내구성이 제한될 위험에 처할 수 있다. 유사하게, 다중적 독특한 작용 방식을 제공하지 않는 독소 물질이 포함된 유전자변형 대두 또한 제한된 내구성의 위험에 처할 수 있다. 인시목곤충에 독성인 단백질을 생산하는데 이용가능한 최초 대두는 단일 독소 단백질, Cry1Ac을 포함한다. 최근 대두 유전자변형 이벤트는 Cry1Ac 및 Cry1F 독소 단백질들을 포함하는 것으로 개시되었다. Cry1Ac에 대한 저항성이 일어난다면, 상기 Cry1Ac 및 Cry1F 유전자변형 이벤트는 이의 효과 원천으로써 오직 Cry1F 독소만을 가지게 될 것이다. 따라서, Cry1Ac에 의해 제어가능한 해충을 조절하는 2개 또는 그 이상의 독성 물질을 보유하는 대두 식물을 제공할 필요가 있으며, 이때 표적 곤충의 중장(midgut)에서 Cry1Ac가 결합하는 동일한 또는 실질적으로 동일한 수용체들에 결합하는 독성물질은 없다. 본 명세서에서 설명된 발명은 해충 인시목곤충 종에 독성인 2개 또는 그 이상의 물질을 제공함으로써, 선행기술에서 설명된 대두 유전자변형 이벤트에 대해 상기 설명된 내구성 문제가 해결된 유전자변형 대두 이벤트 MON87751을 제공하며, 이들 독성 물질들은 대두의 인시목 해충 제어를 위한 목적으로 임의의 대두 식물에 포함된 적이 없다.
단일 형질변환 이벤트가 포함된 유전자변형 식물을 만들기 위하여, 재조합 DNA 구조체의 일부분은 대두 세포의 게놈 안으로 이전되며, 상기 대두 세포는 후속적으로 식물로 성장한다. 상기 이벤트가 초기에 전이된 대두 세포는 R0 세대를 생산하기 위하여 재생된다. 상기 R0 식물과 R0 식물로부터의 후대 식물은 임의의 원하는 형질(들)에 대하여 테스트될 수 있지만, 상기 이벤트의 효과는 상기 형질변환 이벤트의 통합 부위에 대하여 cis 및/또는 trans 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 상기 이벤트에 의해 부여되는 표현형은 상기 DNA 구조체의 크기 및 디자인에 의해 영향을 받을 수 있는데, 발현 카세트 내 유전자 요소들, 이식유전자들의 수, 발현 카세트들의 수, 그리고 이러한 요소들 및 이러한 카세트들의 배열의 조합에 의해 변화될 수 있다. 바람직한 형질들을 가진 이벤트의 식별은 식물 발달, 이식유전자 발현의 일주(diurnal), 시간적(temporal) 또는 공간적 패턴과 같은 인자들; 또는 외인적 인자(extrinsic factors), 가령, 환경적인 식물 성장 조건, 물 이용성, 질소 이용성, 열, 또는 스트레스에 의해 더 복잡해질 수 있다. 따라서, 표현형 형질의 바람직한 세트를 부여하는 이벤트를 획득하는 능력은 용이하게 예측가능한 것이 못된다.
발명의 요약
본 발명은 기존 유전자변형 대두 식물 및 나란하게 구축된 새로운 이벤트와 비교하여 우수한 성질 및 수행을 나타내는 MON87751 이벤트를 포함하는 유전자변형 대두 식물을 제공한다. 대두 이벤트 MON87751은 대두 게놈내 단일 삽입 위치에서 인시목 해충에 대하여 저항성 형질을 독립적으로 부여하는 2개의 링크된 발현 카세트를 포함한다. 대두 이벤트 MON87751에서 복합된 2개의 링크된 발현 카세트는 크리소데이식스( Chrysodeixis ) spp ., 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp., 헬리코베르파 ( Helicoverpa ) spp., 크로시도세마( Crocidosema ) spp., 라취플루시아 ( Rachiplusia ) spp., 안티카르시아 ( Anticarsia ) spp., 엘라스모팔푸스( Elasmopalpus ) spp., 및 플라티페나 ( Plathypena ) spp가 포함된, 목(order) 인시목(Lepidoptera)내 해충 종에 대항하여 2가지 작용 방식을 제공한다. 이중 작용 방식은 해충 인시목곤충 종에 대항하여 중복적인 살충 조절을 제공하며, 그리고 해충 제어 형질에 대한 저항성 발달 가능성을 상당히 감소시킨다.
이벤트 MON87751은 시료 안에 상기 이벤트의 존재를 탐지하는데 유용한 특이적인 독특한 DNA 세그먼트(segments)를 특징으로 한다. 시료는 실질적으로 순수 대두 DNA 조성물 또는 대두 DNA가 포함된 조성물을 지칭한다. 어느 경우든 간에, 상기 시료는 생물학적 시료로써, 즉, 시료는 이벤트 MON87751이 포함된 대두의 게놈으로부터 직간접적으로 획득된 또는 유도된 DNA가 포함되나, 이에 국한되지 않은 생물학적 재료를 포함한다. "직접적으로"라는 것은 당업자가 대두 세포들을 파열시키고 (또는 파열된 대두 세포들이 포함된 대두 시료의 획득에 의해) 그리고 탐지 목적으로 게놈 DNA를 노출시킴으로써, 대두 게놈으로부터 직접적으로 DNA를 얻는 능력을 지칭한다. "간접적으로"라는 것은 당업자가 표적 또는 특정 기준 DNA, 즉 대두 세포들의 파열을 통하여 또는 파열된 대두 세포들이 포함된 대두 시료의 획득을 통하지 않고 다른 수단에 의해 특정 시료 안에 이벤트 MON87751의 존재에 대한 진단이 되는 본 명세서에서 설명된 신규한 그리고 독특한 졍션 세그먼트를 획득하는 능력을 지칭한다. 이러한 간접 수단에는 표적 서열에 특이성을 가지고 결합되도록 기획된 특정 프로브에 의해 표적화되는 DNA 서열이 포함된 DNA 세그먼트의 증폭, 또는 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 또는 이와 유사한 것들과 같은 일부 효과적인 매트릭스를 통하여 DNA의 다른 세그먼트로부터 분리에 의해 측정되고, 특징화되는, 또는 엠플리콘의 직접 서열 분석 또는 벡터 안으로 상기 엠플리콘의 클로닝과 이러한 벡터 안에 존재하는 삽입된 엠플리콘의 직접적인 서열화에 의해 특징화되는 DNA 세그먼트의 증폭을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 대안으로, 대두 염색체 안에 유전자변형 DNA가 대두 염색체 안으로 삽입된 위치에 대응하는 DNA 세그먼트는 이벤트 MON87751로 규정짓는데 이용할 수 있으며, 다양한 수단에 의해 클론될 수 있고, 그리고 그 다음 특정 시료 또는 특정 대두 게놈 안에서 이의 존재에 대해 식별 및 특징화될 수 있다. 이러한 DNA 세그먼트는 졍션(junction) 세그먼트 또는 서열로 지칭되며, 그리고 삽입된 DNA와 대두 게놈 간에 연결 부분이 상기 세그먼트에 포함되어 있는 한, 삽입된 DNA와 인접(측면) 대두 염색체 DNA의 임의의 길이가 될 수 있다. 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 및 서열 번호:10 그리고 이들 각각의 역 보체(reverse complement)는 이러한 세그먼트의 대표가 된다.
본 명세서에서 확인된 특정 서열들은 이벤트 MON87751, 또는 그 안에 포함된 구조체 안에 독특하게 존재할 수 있으며, 그리고 특정 대두 생식질(germplasm) 안에 존재할 때 또는 게놈 및/또는 대두 DNA가 포함된 특정 생물학적 시료 안에 존재할 때, 이들 서열의 직접 서열 분석에 의해, 이러한 서열들에 결합된 프로브(probes)의 탐지에 의해, 또는 본 명세서에서 설명된 특정 엠플리콘의 크기 및 어쩌면 조성물의 관찰에 의해 이들 서열의 확인은 이러한 시료 안에 이벤트 MON87751의 존재, 또는 그 안에 포함된 구조체의 존재에 대한 진단이 된다. 측면 게놈 세그먼트 (즉, 삽입된 유전자변형 DNA에 인접한 DNA 서열의 대두 게놈 세그먼트)는 약간의 가변성을 겪에 되고, 그리고 그러한 경우, 이러한 변칙에 관하여 최소한 99% 또는 그 이상의 제한이 있거나 또는 대두 게놈간에 다형성(polymorphisms)이 있는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 언급된 특정 진단 서열과 비교하여 이들 길이를 따라 완전하게 상보적인 뉴클레오티드 세그먼트는 본 발명의 범위 안에 있는 것으로 생각된다.
대두 게놈 안에 그리고 서로에 대하여 본 발명의 뉴클레오티드 세그먼트의 위치는 도 1에 설명되며, 각 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:10으로 제시된 바와 같이 설명된다. 이벤트 MON87751로 특징화되고, 그리고 시료 안에 이벤트 MON87751, 또는 그 안에 포함된 구조체의 존재에 대한 진단이 되는 뉴클레오티드 세그먼트는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 또는 서열 번호:26을 포함한다. 이러한 시료가 대두 조직 및 대두 DNA를 포함할 때, 이러한 시료 안에 이들 뉴클레오티드 서열의 하나, 또는 둘, 또는 그 이상의 존재는 이벤트 MON87751, 또는 이 안에 포함된 구조체의 존재에 대한 진단이다.
특정 DNA 분자가 대두 식물 게놈 안에 있거나, 또는 대두 식물 DNA에서 탐지될 수 있을 때 단어 "유도된(derived)"을 사용하는 것으로 의도된다. "탐지될 수 있는(capable of being detected)"이란 증폭되는 특정 DNA 세그먼트의 능력 및 DNA 서열 분석에 의해 특징화되는 또는 밝혀지는 이의 크기 및 서열을 지칭하며, 상기 특정 DNA 세그먼트, 즉, 표적 DNA 세그먼트에 특이적으로 결합하는 프로브의 능력, 그리고 상기 표적에 프로브의 결합을 탐지하는 후속적 능력을 또한 지칭한다. 본 발명의 특정 DNA 세그먼트 또는 표적 DNA 세그먼트는 삽입 이벤트 MON87751가 포함된 대두 안에 존재한다.
대두를 참고하면, 대두 세포들, 대두 종자, 대두 식물 일부분 및 대두 식물은 각 구체예에서 대두 이벤트 MON87751 DNA의 존재에 대한 진단으로 본 명세서에서 설명된 세그먼트중 임의의 하나, 둘, 또는 그 이상에 상응하는 DNA의 탐지가능한 양이 포함되는 한, 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다. 대두 식물 일부분은 세포들; 화분(pollen); 배주(ovules); 꽃; 꼬투리(pods); 종자; 뿌리 조직; 줄기 조직; 및 잎 조직을 포함한다. 이벤트 MON87751의 존재에 대한 진단으로써 본 명세서에서 설명된 DNA 세그먼트의 탐지가능한 양이 존재하는 대두로부터 만들어진 상품 산물은 본 발명의 범위 안에 있다. 이러한 상품 산물은 온전한(whole) 또는 가공된(processed) 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 콩가루, 대두 가루, 대두 플레이크(flakes), 대두 겨, 대두 우유, 대두 치즈, 대두 와인, 대두가 포함된 동물 사료, 대두가 포함된 종이, 대두가 포함된 크림, 대두 바이오매스, 그리고 대두 식물 및 대두 식물 일부분을 이용하여 만들어진 연료 산물을 포함할 수 있다.
대두 이벤트 MON87751의 DNA는 상기 이벤트가 포함된 대두 식물, 대두 종자, 및 대두 조직의 하나의 염색체 상에 각 게놈 및 각 세포에 존재할 수 있다. 상기 대두 게놈은 멘델(Mendelian) 방식으로 후대에 전달되기 때문에, 대두 식물이 이벤트 MON87751 삽입에 대하여 동형접합성(homozygous)이라면, 각 후대 대두 식물 및 세포는 부모로부터 후대로 유전된, 이벤트 MON87751 삽입이 포함된 부모 염색체의 각 대립유전자 상에 상기 이벤트 DNA를 포함할 것이다. 그러나, 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 게놈이 이형접합성(heterozygous) 또는 잡종(hybrid) 부모인 경우, 잡종 부모로부터 교배에 관여하는 화분의 약 50% 및 배주의 약 50%가 대두 이벤트 MON87751 DNA를 포함하게 될 것이며, 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 후대의 혼합 집단이 초래되며, 잡종과의 이러한 교배로부터 발생된 후대 비율은 후대로 전달되는 이벤트 MON87751 DNA를 갖는 비율이 약 50% 내지 약 75% 범위가 될 것이다.
본 발명의 DNA 분자들은 삽입된 유전자변형 이벤트 MON87751 DNA의 단부와 MON87751 삽입된 DNA의 각 단부에 인접한, 즉 측면에 있는 대두 게놈 DNA 상의 2개의 별도 졍션에 독특하거나, 또는 대두 이벤트 MON87751 삽입된 DNA에 독특할 수 있다. 프로브, 프라이머 및 일부 경우 DNA 서열 분석을 이용하여 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 분석되는 특정 시료 안에 존재하는 이들 분자는 이 시료 안에 이벤트 MON87751 대두 양의 존재에 대한 진단이 될 수 있다. 대두 이벤트 MON87751 DNA에 독특한 이러한 DNA 분자들은 다수의 방법에 의해 확인되고, 특징화될 수 있는데, 상기 독특한 DNA 분자들에게 특이적으로 결합하도록 기획된 프로브 핵산 분자들의 이용과, 이어서 상기 독특한 DNA에 결합된 이러한 프로브의 탐지, 그리고 프로브로 작용하는 최소한 2개의 상이한 DNA 분자를 이용하는 것을 포함하는데, 다만, 이러한 분자의 서열은 상기 설명된 프로브보다는 다소 특이성이 떨어질 수 있다. 적절한 혼성화 조건하에 프로브 또는 프라이머에 특정 표적 DNA을 접촉시키면 표적화된 DNA 세그먼트에 상기 프로브 또는 프라이머가 결합될 것이라는 사실을 당업자는 인지한다.
본 발명의 DNA 분자들은 증폭가능한 DNA의 표적 세그먼트일 수 있고, 특정 시료의 증폭 방법에 의해 획득된 표시된 길이의 하나 또는 그 이상의 엠플리콘으로 탐지될 때, 이러한 시료 안에 이벤트 MON87751, 또는 이 안에 포함된 구조체의 존재에 대한 진단이 될 수 있다. 이러한 DNA 분자들 또는 폴리뉴클레오티드 세그먼트는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 및 서열 번호:26으로 각 제시된 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있고, 본 명세서에서 그리고 하기 실시예들에서 추가 정의된다. 프라이머 분자들 및/또는 프로브는 대조군이 포함된 필수 시약과 함께, 그리고 사용 지침에 함께 포장된 키트 형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 재조합 DNA 분자들은 미생물 안에 존재할 수 있거나 또는 미생물로부터 유도될 수 있다. 미생물은 원핵이건 또는 진핵이건 간에 또는 그렇지 않으면, 더욱 흔히 플라스미드 또는 벡터로 지칭되는 염색체-외 DNA 구조 안에 DNA를 포함하는, 임의의 현미경적 세포를 포함하는 것으로 간주된다. 한 구체예에서, 인간의 평균적 시력 범위 아래에 있는, 전형적으로 50 입방 미크론 아래, 더욱 일반적으로 10 입방 미크론 아래에 있는 현미경적 유기체는 박테리아 (원핵생물) 및 더 고차원적인 생명체에 상응하는 세포들(진핵생물)을 포함할 수 있다. 박테리아는 서열 번호:9로 제시된 바와 같이 존재하는 각 발현 카세트가 포함된 본 발명의 신규한 DNA 세그먼트 하나 또는 그 이상 또는 모두가 포함된 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있는 흔한 현미경적 미생물이다. 식물 세포들 그리고 특히 본 발명의 대두 식물 세포들은 본 발명의 신규한 DNA 세그먼트의 임의의 하나, 둘 또는 그 이상 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하기 위한 프로브는 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA의 존재에 대한 진단이 되는 DNA의 독특한 세그먼트에 결합하도록 본 명세서에서 정의된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건하에 기능을 하는데 충분한 길이의 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 대두 이벤트 MON87751 DNA에만 존재하는 단일 졍션 또는 다른 신규한 서열에만 결합되도록 기획될 수 있거나, 또는 2개 또는 그 이상의 이러한 단일 졍션 세그먼트만 결합되도록 기획될 수 있다. 대두 DNA가 포함된 것으로 의심되는 특정 시료 안에 DNA 분자에 이러한 프로브의 결합이 탐지되면 상기 시료 안에 대두 이벤트 MON87751의 존재에 대한 진단이 된다.
프라이머는 특정 DNA 표적 세그먼트를 증폭시키는 열 증폭 반응에 이용되는 상이한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세그먼트 쌍을 포함할 수 있다. 상기 쌍에서 각 프라이머는 증폭을 위한 관심 DNA의 세그먼트 안에 또는 가까이 있는 상당히 특이적인 DNA 세그먼트에 결합되도록 기획된다. 상기 프라이머들은 이들이 핵산 서열 중합화의 국소화된 지역으로 작용하여, 하나 또는 그 이상의 엠플리콘 (DNA의 증폭된 표적 세그먼트) 생산이 초래되는 방식으로 결합된다. 본 발명에서 특정 생물학적 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA의 독특한 세그먼트에 결합하도록 기획된 프라이머를 이용하여 본 명세서에서 설명된 졍션 세그먼트가 하나 또는 그이상 포함된 특정 엠플리콘을 증폭시키고, 그리고 중합효소 반응의 완료 또는 종료시 이러한 엠플리콘의 탐지 및/또는 특징화는 특정 시료 안에 대두 이벤트 MON87751의 존재에 대한 진단이다. 당업자는 이 증폭 방법을 잘 숙지하고 있으며, 증폭의 세부사항에 대한 언급이 여기에서는 불필요하다.
본 발명의 대두 식물, 대두 식물 세포들, 대두 식물 조직 및 대두 종자는 크리소데이식스( Chrysodeixis ) spp ., 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp., 헬리코베르파 ( Helicoverpa ) spp., 크로시도세마 ( Crocidosema ) spp., 라취플루시아 ( Rachiplusia ) spp., 안티카르시아( Anticarsia ) spp., 엘라스모팔푸스 ( Elasmopalpus ) spp., 및 플라티페나 ( Plathypena ) spp이 포함되나, 이에 국한되지 않는 인시목 해충에 의한 감염에 저항성을 나타낼 수 있다. 인시목곤충 종에 의한 감염에 대한 저항성은 삽입된 유전자변형 DNA 안에 작용가능하도록 그리고 공유적으로 링크된 2개의 상이한 살충 단백질을 인코드하는 2개의 상이한 DNA 세그먼트의 발현과 연관되어 발생된다: 상기 단백질은 서열 번호:10으로 제시되며, 도 2에서 설명된 삽입된 유전자변형 DNA의 5' 전단에서 발현 카세트로부터 발현된 Cry2Ab 단백질; 그리고 서열 번호:10으로 제시되며, 도 2에서 설명된 설명된 삽입된 유전자변형 DNA의 3' 단부에서 발현 카세트로부터 발현된 Cry1A.105 단백질이다. Cry2Ab 단백질은 At.Act2 프로모터로부터 발현되며, Cry1A.105 단백질은 At.RbcS4 프로모터로부터 발현된다. Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들은 인시목 해충 종에 독성인 물질들이다.
대두 이벤트 MON87751을 만드는데 이용된 구조체는 전사의 상대적 직렬(tandem) 방향에 위치된 Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들의 발현을 구동하는 프로모터를 보유하며, 각각의 Cry 단백질들의 각 프로모터로부터 발현은 동일한 방향으로 그러나 이들의 별도 각 프로무터로부터 진행된다 (도 2 참고). 평가되는 다른 구조체들은 발현 요소들, 즉, 인헨서 (E), 프로모터 (P), 리더 (L), 인트론 (I), 엽록체 표적화 펩티드 (CTP), 및 3'UTR (T)의 복합 사용에서 변화된다. 또한, 상기 구조체들은 두 가지 Cry 단백질들 (Cry2Ab 및 Cry1A.105)의 벡터 스텍(stack)을 포함하거나, 또는 단일 Cry 단백질, 즉, Cry2Ab 또는 Cry1A.105를 포함하였다. 발현 구조체들에서 추가 변이는 벡터 스택 구조체들에서 Cry 단백질들에 대한 2개 카세트의 상대적인 방향이었다. 구체적으로, 2개 카세트는 전사의 직렬 방향에 있거나, 또는 2개 카세트는 발산(divergent) 방향에 있었고, 2개의 Cry 단백질들의 각 프로모터로부터 발현은 2개 프로모터 사이에 집중된 점으로부터 멀어지게 되는데, 즉, 각 발현 카세트의 전사는 반대 방향으로 진행되고, 모이지는 않는다. Cry1A.105를 인코드하는 DNA 서열은 이벤트 MON87751 안으로 삽입된 이식유전자 안에 있는 서열과 비교하여 일부 구조체에서 다양화된 서열이었다. 끝으로, 전사가 역 방향으로 지향되는 2개의 Cry 발현 카세트를 가진 구조체 2개에서 전사 인헨서는 발산(diverging) 프로모터 사이에 위치하였다 (도 2 참고).
이벤트 MON87751은 도 2에서 설명된 바와 같이, T-DNA 세그먼트가 포함된 구조체들중 하나로 형질전환된 상이한 수천개의 독립적인 유전자변형 이벤트와의 비교에 근거하여, 그리고 이벤트 MON87701 및/또는 이벤트 GM_A19478 (MON87701와 동일한 시점에서 생성되고, 둘다 Cry1Ac를 발현시킴); 유전자변형 이벤트 40-3-2 (제초제 글리포세이트에 대하여 내성을 부여); 그리고 비-유전자변형 대조 대두 (A3555, 또는 A5547)와 비교하여 선별되었다. 하기 실시예들에서 설명된 결과에서 이벤트 MON87751은 Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들의 발현으로 인하여 우수한 성질을 나타낸다는 것을 보여준다. 이벤트 MON87751 생성을 위하여 이용된 구조체를 이용하여 만들어진 다수의 유전자변형 이벤트는 인시목 해충의 효과적인 제어를 나타내는 다른 구조체로 만들어진 다른 이벤트보다 각각 더 그럴듯 하였다.
각각 이벤트 MON87751에 상응하는 DNA를 포함하는 대두 식물 및 종자가 포함된 이의 일부분들은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 식물 및 종자가 포함된 이의 일부분들은 인시목곤충 감염에 저항적이다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 식물 및 종자는 잡종 및 근친교배(inbreds)를 포함하고, 그리고 식물 및 종자는 오직 하나의 이벤트 MON87751 대립유전자, 즉, 이벤트 MON87751 DNA에 상응하는 좌(locus)에 관하여 이형접합성으로 특징화된 게놈을 포함한다. 이러한 잡종은 이벤트 MON87751이 포함된 식물을 상업적인 변종 개발 공정의 일부로 바람직한 생식질과 대두의 다른 농업적으로 바람직한 성질들을 가지도록 번식시킴으로써 만들어질 수 있다. 잡종은 임의의 여러 방법들에 의해 만들어질 수 있지만, 선호되는 방법은 이벤트 MON87751 DNA가 삽입된 위치의 좌에서 두 염색체 상에 이벤트 MON87751 특이적 대립유전자를 포함하는 제 1 근친교배(동형접합성) 부모를 이용하고, 그리고 상기 제1 근친교배와 MON87751 DNA를 포함하지 않는 제 2 근친교배를 함께 번식시키는 것을 이용한다. 두 가지 부모 근친교배 변종은 후대 종자 즉, 잡종 종자에 바람직한 하나 또는 그 이상의 유익한 성질을 보유할 것이며, 이들 잡종 종자는 이벤트 MON87751 대립유전자에 대하여 이형접합성이다.
이벤트 MON87751 DNA가 포함된 식물에 일부 추가 형질을 부여하는 유전자변형 성질 또는 대립 유전자가 바람직할 수 있다. 바람직한 형질을 부여하는 이러한 다른 유전자변형 대립유전자는 제초제 내성을 포함할 수 있다: GTS 40-3-2, MON87708, MON89788, A2704-12, A2704-21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP356043, GU262, W62, W98, DAS-44406-6, DAS-68416-4, FG72, BPS-CV127-9, SYHT04R, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416, pDAB8291.45.36, 127, AAD-12; 곤충 저항성: MON87701, DAS-81419-2; 증가된 강화된 오일 조성물: DP-305423, G94-1, G94-19, G168, OT96-15, MON87705, MON87769; 증가된 산출량: MON 87712, 또는 질소 고정 형질, 물 사용을 조절하는 형질, 곰팡이 감염에 대한 저항성, 선충 감염에 대한 저항성, 그리고 이와 유사한 것들. 비-유전자변형 성질 (가령, QTL 또는 성숙 집단)은 바람직한 형질을 또한 부여할 수 있고, 당업자는 이러한 비-유전자변형 형질과 이벤트 MON87751 DNA를 포함하도록 대두를 어떻게 번식시키는 지를 알 것이다.
본 발명의 전술한 측면들과 다른 측면들은 다음의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 수평선에 의해 각각 설명되는 바와 같이, 대두 이벤트 MON87751을 확인하는데 이용될 수 있는, 이종성(heterologous) 유전자변형 DNA의 세그먼트, 측면 게놈 DNA, 임의적으로 지정된 5' 및 3' 게놈/삽입된 DNA 졍션의 상대적 위치들, 그리고 이종성 유전자변형 DNA 안에 이벤트 MON87751에 독특한 서열의 상대적 위치를 나타내는 도표로써; 상기 수평선은 [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], 및 [26]으로 번호가 붙여있는데, 이는 차례로 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 및 서열 번호:26에 대응하며; 굵은 수평선은 이벤트 MON87751 (서열 번호:9) 안에 삽입된 이종성 유전자변형 DNA와 5' 및 3' 측면 게놈 DNA가 복합된 것을 나타내고, 서열 번호:7, 서열 번호:9, 및 서열 번호:8이 포함된 서열 번호:10을 나타내며; SQ26901, SQ20267, SQ25826, 및 SQ27115로 명시된 굵은 수평 화살표는 차례로 서열 번호:15, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 및 서열 번호:14에 대응하며; 가는 수평 화살표는 이벤트 MON87751의 이종성 유전자변형 삽입된 DNA의 2개의 별도 발현 카세트의 상대적인 방향을 나타내며, P는 프로모터 요소를 나타내고, L은 리더를 나타내며, P-L은 프로모터와 리더를 나타내고, I는 인트론을 나타내고, CTP는 엽록체 수송 펩티드를 나타내며, Cry2Ab는 Cry2Ab 단백질에 대한 코딩 영역을 나타내고, T=3' 전사 종료 및 폴리아데닐화 요소 (3' UTR), 그리고 Cry1A.105는 Cry1A.105 단백질의 코딩 영역을 나타낸다.
도 2는 대두 이벤트 MON87751의 선별 동안 평가되는 유전자변형 대두 이벤트를 만드는데 이용되는 11개 형질 변환 구조체 안에 Cry 단백질 발현 카세트(들)을 인코드하는 T-DNA 세그먼트, 그리고 각 구조체 내에 각 Cry 단백질 발현 카세트의 조성을 설명한다.
도 3은 구조체 1, 구조체 2, 및 구조체 3으로 생성된 이벤트에서 Cry 단백질 발현의 ELISA 결과를 비-유전자변형 대두 계통 (A3555)의 것과 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 패널 A. 식물 성장의 R1 및 R3 단계에서 수집된 잎 조직 내 Cry2Ab 단백질 수준을 나타낸다. 패널 B. 식물 성장의 R1 및 R3 단계에서 수집된 잎 조직 내 Cry1A.105 단백질 수준을 나타낸다.
도 4는 구조체 1, 구조체 5, 구조체 6, 및 구조체 4로 생성된 이벤트에서 Cry 단백질 발현의 ELISA 결과를 비-유전자변형 대두 계통 (A3555)의 것과 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 패널 A. 2개의 별도 스크린하우스 시험(screenhouse trials)에서 성장된 식물 성장의 R3 단계에서 수집된 잎 조직 내 Cry2Ab 단백질 수준을 나타낸다. 패널 B. 2개의 별도 스크린하우스 시험에서 성장된 식물 성장의 R3 단계에서 수집된 잎 조직 내 Cry1A.105 단백질 수준을 나타낸다.
도 5는 식물 성장의 R3와 R5 단계에서 수집된 잎 시료의 경우 구조체 1, 구조체 2, 구조체 3, 구조체, 4, 구조체 5, 구조체 6, 구조체 9, 구조체 7, 및 구조체 11로 생성된 이벤트에서 Cry2Ab 단백질 발현의 ELISA 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 식물 성장의 R3와 R5 단계에서 수집된 잎 시료의 경우 구조체 1, 구조체 2, 구조체 3, 구조체, 4, 구조체 5, 구조체 6, 구조체 9, 구조체 7, 및 구조체 11로 생성된 이벤트에서 Cry21A.105 단백질 발현의 ELISA 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 패널 A의 Y-축은 0 - 5000 ppm 건중량에서 플롯되었고, 패널 B의 Y-축은 0-500 ppm 건중량에서 플롯되어, R3 단계에 대한 데이터는 패널 B에서 더 잘 설명된다.
서열의 간단한 설명
서열 번호:1은 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 5' 졍션 영역을 나타내는 20개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:1은 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 1325-1344에 있다.
서열 번호:2는 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 3' 졍션 영역을 나타내는 20개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:2는 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 11444-11463에 있다.
서열 번호:3은 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 5' 졍션 영역을 나타내는 60개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:3은 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 1305-1364에 있다.
서열 번호:4는 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 3' 졍션 영역을 나타내는 60개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:4는 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 11424-11483에 있다.
서열 번호:5는 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 5' 졍션 영역을 나타내는 100개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:5는 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 1285-1384에 있다.
서열 번호:6은 대두 게놈 DNA와 통합된 유전자변형 발현 카세트의 3' 졍션 영역을 나타내는 100개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:6은 서열 번호:10의 뉴클레오티드 위치 11404-11503에 있다.
서열 번호:7은 게놈 DNA의 졍션, 그리고 유전자변형 삽입된 DNA가 포함된 5' 측면 대두 게놈 서열을 나타내는 1626개의 뉴클레오티드 서열로써, 그리고 (5'에서 3' 방향으로) 측면 게놈 DNA의 1334개 그리고 삽입된 유전자변형 DNA의 5' 단부에 임의로 지정된 292개 뉴클레오티드를 포함한다.
서열 번호:8은 게놈 DNA의 졍션, 그리고 유전자변형 삽입된 DNA가 포함된 측면 대두 게놈 서열을 나타내는 1452개 뉴클레오티드 서열로써, 그리고 (5'에서 3' 방향으로) 삽입된 유전자변형 DNA의 3' 단부의 임의로 지정된 265개 뉴클레오티드와 3' 측면 게놈 DNA의 1187개 뉴클레오티드를 포함한다.
서열 번호:9는 대두 이벤트 MON87751의 게놈에 삽입된 유전자변형 DNA에 대응하는 10119개 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호:10은 이벤트 MON87751 안에 삽입된 유전자변형 게놈의 복합 뉴클레오티드 서열과 5' 측면 게놈 DNA 뉴클레오티드 서열 및 3' 측면 게놈 DNA 뉴클레오티드 서열에 대응하는 12640개 뉴클레오티드 서열로써, 서열 번호:7 및 서열 번호:9 및 서열 번호:8을 포함한다.
서열 번호:11은 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 이용되는 SQ20267로 지칭되는 열 증폭 프라이머에 대응하는 27개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:10의 위치 11400 내지 11426에 대응하는 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
서열 번호:12는 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 이용되는 SQ25826으로 지칭되는 열 증폭 프라이머에 대응하는 26개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:10의 위치 11454 내지 11479에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 역보체와 동일하다.
서열 번호:13은 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 이용되는 PB10263으로 지칭되는 프로브에 대응하는 19개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:10의 위치 11428 내지 11446에 대응하는 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
서열 번호:14는 시료 안에 대두 야생형 대립유전자 DNA 및/또는 대두 이벤트 MON87751 DNA의 존재를 확인하는데 이용되는 SQ27115로 지칭되는 열 증폭 프라이머에 대응하는 24개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:10의 위치 11458 내지 11481에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 역보체와 동일하다.
서열 번호:15는 대두로부터 유도된 시료 안에 야생형 대립유전자 DNA의 존재를 확인하기 위하여 접합자(zygosity) 분석에 이용된 SQ26901로 지칭되는 열 증폭 프라이머에 대응하는 30개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:10의 위치 1288 내지 1317에 대응하는 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
서열 번호:16은 PB11254로 지칭되는 프로브에 대응하는 18개 뉴클레오티드 서열이며, 대두로부터 유도된 시료 안에 야생형 대립유전자 DNA의 존재를 확인하기 위하여 접합자 분석에 이용된다.
서열 번호:17은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 112개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:9의 위치 36-147과 서열 번호:10의 위치 1370-1481과 동일하다.
서열 번호:18은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 52개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:9의 위치 1305-1356과 서열 번호:10의 위치 1639-1690과 동일하다.
서열 번호:19는 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 283개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:9의 위치 1561 -1843과 서열 번호:10의 위치 2895-3177과 동일하다.
서열 번호:20은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 486개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:9의 위치 2340-2825와 서열 번호:10의 위치 3674-4159와 동일하다.
서열 번호:21은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 179개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 서열 번호:9의 위치 3326-3504와 서열 번호:10의 위치 4660-4838과 동일하다.
서열 번호:22는 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 106개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 시료 안에서 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 유용하며, 그리고 서열 번호:9의 위치 3749-3854와 서열 번호:10의 위치 5083-5188과 동일하다.
서열 번호:23은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 60개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 시료 안에서 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 유용하며, 그리고 서열 번호:9의 위치 9320 - 9379와 서열 번호:10의 위치 10654 - 10713과 동일하다.
서열 번호:24는 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 66개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 시료 안에서 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 유용하며, 그리고 서열 번호:9의 위치 9620 - 9685와 서열 번호:10의 위치 10954 - 11019과 동일하다.
서열 번호:25는 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 유전자변형 DNA (서열 번호:9)에서 독특한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 156개 뉴클레오티드 서열이며, 그리고 시료 안에서 이벤트 MON87751 DNA를 확인하는데 유용하며, 그리고 서열 번호:9의 위치 9720-9875와 서열 번호:10의 위치 11054-11209과 동일하다.
서열 번호:26은 대두 이벤트 MON87751에서 발현된 Cry2Ab 단백질을 인코드하는 해독틀(opne reading frame)에 대응하는 1905개 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명자들은 인시목 해충 이를 테면, 그중에서도 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda ) (밤나방과 나방, FAW), 스포도프테라 에리다니 아( Spodoptera eridania) (남쪽 거염벌레, SAW), 스포도프테라 엑시구아 ( Spodoptera exigua )) (파밤나방, BAW), 스포도프테라 오르니토갈리 ( Spodoptera ornithogalli ) (황색줄무늬 거염벌레, YSAW), 크로시도세마 아포레마 ( Crocidosema aporema ) (콩 때리는 나방, BSM), 라취플루시아 누( Rachiplusia nu ) (해바라기 자벌레, SFL), 안티카르시아 겜마탈리스( Anticarsia gemmatalis) (벨벳빈 캐터필러, VBC), 크리소데이식스 인클루덴스 ( Chrysodeixis includens ) (대두 자벌레, SBL), 헬리코베르파 지아 ( Helicoverpa zea ) (대두 뿌리혹선충, SPW), 헬리코베르파 겔로토페온 ( Helicoverpa gelotopeon ) (남미 목화다래벌레 ), 엘라스모팔푸스 리그노셀루스( Elasmopalpus lignosellus ), (명충나방의 유충), 에스티그메네 아크레아( Estigmeneacrea ) (해수소택지 캐터필러), 그리고 플라티페나 스카브라( Plathypena scabra) (녹색 클로버웜)과 같은 농업에서 중요한 해충에 상업적으로 수용가능한 저항성을 나타내는 유전자변형 대두 이벤트 MON87751을 확인하였다. 상기 이벤트는 작용가능하도록 링크된 2개의 상이한 발현 카세트를 제공하는데, 하나는 Cry2Ab를 인코드하고, 다른 하나는 Cry1A.105 살충 단백질들을 인코드하며, 인시목곤충 감염으로부터 대두에 저항성을 제공하기 위하여 2가지 상이한 방식을 제공한다. 다른 유전자변형 대두 이벤트들은 당업계에 공지되어 있는데, 즉 MON 88701은 Cry1Ac 바실러스 트루링겐시스(Bacillus thuringiensis )(Bt) 독소 단백질을 발현시킨다(MacRae et al. 2005, Fischhoff & Perlak 1995). MON 88701은 스포도프테라( Spodoptera ) spp에 대한 효과는 유의적이지는 못하지만, 대두의 주요 인시목 해충에 대한 저항성을 위하여 단일 작용 방식을 제공한다. 스포도프테라(Spodoptera) spp의 제어를 포함하는, 대두의 주요 해충에 대하여 효과를 나타내는 2개 또는 그 이상의 상이한 살충 단백질들을 발현시키는 유전자변형 대두를 제공하는 것은 바림직한 것이다. 발명자들은 대두 이벤트 MON87751의 형태에서 이 문제에 대한 최소한 한 가지 해결책을 제공하는데, 이는 대두 게놈 안에 하나의 좌에 2개의 공유적으로 링크된 발현 카세트를 복합하는 것이며, 이들 카세트는 확장된 인시목곤충 종 저항성의 형질을 부여하고, 그리고 추가적으로, 인시목 종에서 저항성 발달을 방지 또는 지연시키기 위하여 한 가지 이상의 방식으로 대두 세포들, 대두 조직, 대두 잎, 대두 꼬투리, 대두 종자, 및 대두 식물에게 제공된다.
상기 대두 이벤트 MON87751은 플라스미드 구조체 1과 함께 대두 분열조직(meristem) 조직의 아그로벡테리움 ( Agrobacterium ) 매개된 형질변환 과정에 의해 생성되었다. 이 플라스미드 구조체는 2개 영역을 포함하는데, 각 영역은 아그로벡 테리움( Agrobacterium ) 경계 세그먼트 (T-DNA 세그먼트)에 의해 결합되어 있다. 첫번째 T-DNA 세그먼트는 2개의 링크된 식물 발현 카세트를 포함하는데, 하나는 선택성 표지를 인코드하는 발현 카세트이며, 다른 하나는 채점가능한(scorable) 표지를 인코드하는 발현 카세트이다. 두번째 T-DNA 세그먼트는 대두 식물 세포들에서 2개의 상이한 살충 단백질들, Cry2Ab 및 Cry1A.105의 발현에 필수적인 조절 유전자 요소들과 함께, 2개의 링크된 식물 발현 카세트를 포함한다. 플라스미드 구조체 1에서 2개의 T-DNA 세그먼트로 인하여, 상기 T-DNA 세그먼트는 대두 게놈 안으로 무작위로 삽입된, 그리고 Cry2Ab 및 Cry1A.105 발현 카세트가 포함된 T-DNA 세그먼트의 통합 부위와는 별도의 부위에 삽입된 선별/채점가능한 표지 유전자를 포함하고 있고, 따라서 자가수정(selfing) 및/또는 역교배(backcrossing) 과정 동안, 가령 유전자변형 식물의 R1과 더 후속 세대의 선별 동안 형질변환된 대두 식물의 게놈 안에서 2개의 T-DNA 세그먼트의 분리가 허용된다. 상기 형질변환된 대두 세포들은 온전한 대두 식물로 재생되었으며, Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들을 인코드하는 제 2 T-DNA 세그먼트의 통합을 보여주는 식물 집단으로부터 개별 식물들이 선별되었다. R1 및 후속 세대에서, 이벤트는 Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들을 인코드하는 제 2 T-DNA 세그먼트의 통합에 근거하여, 그리고 선택성/채점가능한 표지 카세트를 인코드하는 제 1 T-DNA 세그먼트의 부재(즉, 분비), 및 임의의 플라스미드 백본(backbone) 서열이 포함되지 않은 식물에 근거하여 선별되었다. 이벤트 MON87751의 대두 세포들이 곤충의 먹이에 제공될 때, 대두 이벤트 MON87751의 세포들에서 Cry2Ab 및 Cry1A.105 살충 독성 단백질들의 발현으로 인시목 해충에 대한 저항성이 부여된다.
대두 이벤트 MON87751의 게놈 안으로 삽입된 플라스미드 DNA는 상세한 분자 분석에 의해 특징화되었다. 이들 분석은 다음을 포함한다: 삽입 수(대두 게놈 안에 통합 부위의 수), 게놈 삽입 위치 (삽입이 발생된 대두 게놈의 특정 부위), 복사체 수 (한개 좌 안에 T-DNA 복사체의 수), 그리고 유전자변형 삽입된 DNA의 통합. 이벤트 MON87751을 일으키는, 대두 게놈 안으로 삽입된 2개의 링크된 발현 카세트가 포함된 플라스미드 구조체는 대두 게놈에서 자연적으로는 나타나지 않는 것으로 알려진 또는 다른 벡터 또는 대두의 유전자변형 이벤트 또는 그외에 없는 다수의 세그먼트 (몇 가지 발현 카세트들을 구축 또는 만드는데 이용되는 요소들 간에 졍션 서열들)(예를 들면, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 및 서열 번호:26에서 제시된 바와 같은 서열들)를 포함한다. 또한, 이벤트 MON87751에서 삽입된 유전자변형 DNA를 일으킨 형질변환 이벤트는 본 명세서에서 대두 게놈의 단일 좌 안으로의 삽입과, 이로 인하여 삽입된 DNA와 대두 게놈 DNA 사이에 새로운 2개의 좌 또는 졍션 서열이 생성되는 것으로 특징화된다. 이벤트 MON87751의 대두 게놈 안으로 삽입된 이종성 DNA 안에 추가적인 독특한 서열을 또한 특징으로 하는데, 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 게놈에만 독특할 수 있는 충분한 길이를 가진다. 이들 졍션 서열은 대두 세포들, 대두 조직, 대두 종자 및 대두 식물 또는 대두 식물 생산물 (대두 상품 생산물)에 이벤트 MON87751의 존재를 탐지하는데 유용하다. 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 세포들, 대두 종자, 대두 식물 일부분 또는 대두 식물 조직을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 시료에서 이러한 다양한 졍션 세그먼트의 존재를 확인하는데 이용하기 위하여 개발된 DNA 분자 프로브 및 프라이머 쌍들이 본 명세서에서 설명된다. 데이터에서 이벤트 MON87751은 삽입된 유전자변형 DNA의 한개 복사체와 함께 단일 T-DNA 삽입을 포함하는 것을 보여준다. 식물 형질변환 플라스미드로부터 대두 게놈으로 유전자변형 DNA 전달에 이용된 아그로벡테리움 투메페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) 좌우 경계 영역이외에 형질변환 구조체 1로부터 다른 추가적인 요소들이 MON87751 DNA에서 확인되지는 않았다. 끝으로, 시료 안에 이러한 이벤트 MON87751 DNA의 존재에 대한 진단이 되는 특이적 엠플리콘을 만드는 열 증폭, 그리고 DNA 서열 분석이 실행되어, 식물 게놈 졍션에 임의적으로 할당된 5' 및 3' 삽입을 결정하고, 상기 삽입내에 요소들의 조직을 확인하고, 그리고 대두 이벤트 MON87751에서 삽입된 이식유직전 DNA의 완전한 DNA 서열(서열 번호:9)를 결정한다.
유전자변형 대두 이벤트 MON87751을 만드는데 이용된 형질변환 구조체 1을 이용하여 십여개의 유전자변형 이벤트가 만들어지고, 그리고 10개의 추가 형질변환 구조체가 만들어지고, 대두 이벤트 MON87751 및 유사한 대두 이벤트들과 비교되는 다른 유전자변형 대두 이벤트 수십개를 만드는데 이용되었다. 이들 이벤트는 잎 조직에서 2개의 살충 단백질들, Cry2Ab 및 Cry1A.105의 발현에 대한 ELISA 분석에 의해 테스트되었다. 각 형질변환으로부터 만들어진 이벤트의 일부분집합, 그리고 대부분의 구조체들은 작은-구성의 스크린하우스 시험에서 인시목 해충의 제어 효과에 대하여 테스트되었다. 식물 발현 요소들, 그리고 형질변환 구조체 1에서 Cry2Ab 및 Cry1A.105 발현 카세트의 상대적인 방향은 테스트된 광범위한 범위의 인시목 해충에 대하여 최상의 효과를 가진 이벤트를 제공하였던 것으로 판단되었다.
본 명세서에서 다른 언급이 없는 한, 용어들은 관련 업계의 당업자들에 의해 통상적으로 이용되는 것으로 이해된다. 분자 생물학에서 통상적인 용어들의 정의는 Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; 및 Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994에서 또한 찾아볼 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "대두(soybean)"는 Glycine max 를 의미하며, 그리고 야생종 대두 종 뿐만 아니라 종간의 번식을 허용하는 속(genus) Glycine 에 속하는 이들 식물이 포함된, 이벤트 MON87751 DNA를 포함하는 대두 식물과 교배될 수 있는 모든 식물 변종을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"이란 "~가 포함되나, 이에 국한되지 않는(including but not limited to)"이란 의미다.
본 발명은 최소한 2개의 발현 카세트를 포함하는 DNA 구조체로 형질변환된 유전자변형 식물을 제공하는데; 제 1 발현 카세트는 독성량의 살충 단백질 Cry2Ab를 발현시키고, 그리고 제 2 발현 카세트는 독성량의 살충 단백질 Cry1A.105를 발현시킨다. 독성량(toxic amount)이란 효과적인 양, 살충량, 효과적인 살충량, 살충에 효과적인 양, 표적 곤충 억제량, 효과적인 살충량, 목(order) 인시목의 곤충 먹이 안에 있는 살충적 양, 그리고 관련 분야의 당업자들이 통상적 관례에 따라 이해되는 기타 유사한 용어다. 본 명세서에서 기술에 따라 형질변환된 대두 식물과 DNA 구조체는 인시목 해충에 저항성이 있다. 링크된 작물 형질들은 번식 집단 안에서 함께 이들 형질을 유지하는데 용이함을 제공하고, 그리고 인시목 해충에 저항성을 부여하는 유일한 단일 유전자 (즉, Cry1Ac)를 포함하는 식물보다 더 광범위한 범주의 인시목 해충에 대하여 저항성을 나타낸다.
관심 대상의 효과적인 특징들을 다수 포함하는 폴리핵산 구조체로 식물 세포의 형질 변환; 식물 세포의 게놈 안으로 이식유전자의 삽입으로 인하여 생성된 식물의 재생, 그리고 특정 게놈 위치로 삽입 및 재생된 유전자변형 식물의 다수의 효과적인 특징에 의해 특징화된 특정 식물의 선별에 의해 유전자 변형 "식물"이 만들어진다. 용어 "이벤트(event)"는 삽입된 DNA와, 상기 삽입된 DNA에 바로 인접된 측면 게놈 서열을 포함하는 원래 형질변환체(transformant)의 DNA를 말한다. 이러한 DNA는 독특하며, 그리고 삽입된 DNA가 포함된 한 쪽 부모 계통 (가령, 원래 형질변환체와 자가수정으로 인한 후대)과 삽입된 DNA를 포함하지 않는 부모 계통의 유성 교배(sexual cross) 결과로써, 관심 대상의 이식 유전자가 포함된 삽입된 DNA를 제공받은 후대로 전달될 것으로 예상된다. 본 발명은 원래 형질변환체 식물과 이종성 DNA가 포함된 형질변환체의 후대를 또한 제공한다. 이러한 후대는 이벤트가 포함된 식물과 또다른 식물 간에 유성 교배에 의해 만들어질 수 있으며, 이때 상기 후대는 이종성 DNA를 포함한다. 반복친(recurrent parent)으로의 역-교배를 반복한 후에도, 상기 이벤트는 교배 후대에서 동일한 염색체 위치에서 존재한다. 본 발명은 유전자변형 이벤트, MON87751을 포함하는 대두 식물, 이의 후대, 그리고 그 안에 포함된 DNA 조성물에 관계한다.
"프로브(probe)"는 통상적인 탐지가능한 라벨 또는 리포터(reporter) 분자, 가령, 방사성동위원소, 리간드, 화학발광 물질, 또는 효소에 부착될 수 있는 단리된 핵산이다. 이러한 프로브는 표적 핵산의 스트랜드(strand), 본 발명의 경우에는 MON87751을 포함하는 식물로부터 취한 또는 MON87751 DNA를 포함하는 시료로부터 취한 MON87751의 DNA 스트랜드에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합되는 폴리아미드 및 다른 프로브 재료를 포함하며, 그리고 표적 DNA 서열의 존재를 탐지하는데 이용될 수 있다.
DNA 프라이머들은 프라이머와 표적 DNA 스트랜드 사이에 하이브리드를 형성하기 위한 핵산 혼성화에 의한 상보적인 표적 DNA에 어닐되고, 그 다음, 중합효소, 가령, DNA 중합효소에 의해 표적 DNA 스트랜드를 따라 연장되는 단리된 폴리핵산이다. 본 발명의 DNA 프라이머 쌍 또는 DNA 프라이머 세트는 가령, 중합효소 쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 폴리핵산 증폭 방법들에 의한 표적 핵산 서열의 증폭에 유용한 2개의 DNA 프라이머를 지칭한다.
DNA 프로브와 DNA 프라이머는 11개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드일 수도 있고, 또는 18개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드, 24개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 30개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 이러한 프로브 및 프라이머는 높은 엄격성 혼성화 조건하에 표적 서열에 특이적으로 혼성화되는 충분한 길이를 가진 것으로 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브와 프라이머는 표적 서열과 완벽한 서열 유사성을 보유하지만, 표적 서열에 혼성화되는 능력을 보유하는 표적 서열과 상이한 프로브도 통상적인 방법에 의해 기획될 수 있다.
본 명세서에서 공개된 측면 게놈 DNA와 삽입 서열들에 근거한 프라이머와 프로브는 통상적인 방법들, 가령, 이러한 DNA 분자들의 재-클로닝 및 서열화에 의해 공개된 DNA 서열을 확인하는데 (그리고 필요한 경우 수정하는데) 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건하에 표적 DNA 분자에 혼성화된다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 이용하여 시료 안에 유전자변형 식물의 DNA 존재를 확인할 수 있다. 핵산 세그먼트 또는 이의 단편들로 또한 지칭되는 폴리핵산 분자들은 특정 조건하에 다른 핵산 분자들에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 2개의 폴리핵산 분자들은 이 2개의 분자가 역평행, 이중-스트랜드로 된 핵산 구조를 형성할 수 있다면, 서로에 대해 특이적으로 혼성화될 수 있다고 말한다. 핵산 분자는 완전한 상보성을 나타내는 경우 다른 분자의 "보체(complement)"라고 말한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 분자들중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 이 분자들은 "완전한 상보성(complete complementarity)"을 나타낸다고 말한다. 최소한 통상적으로 "낮은-엄격성(low-stringency)" 조건하에서 서로 어닐된 상태로 유지되기 위하여 충분한 안정성을 가지고 서로에 대해 혼성화된다면, 이들 두 분자는 "최소한의 상보성(minimally complementary)"이 있다라고 말한다. 유사하게, 통상적으로 "높은-엄격성(high-stringency)" 조건하에서 서로 어닐된 상태로 유지되도록 하기 위하여 충분한 안정성을 가지고 서로에 대해 혼성화된다면, 이들 두 분자는 "상보성(complementary)"이 있다라고 말한다. 통상적인 엄격성 조건은 Sambrook et al., 1989, and by Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)에 기술되어 있다. 따라서, 상기 분자들이 이중-스트랜드로 된 구조를 형성하는 능력을 완전하게 차단시키지 않는 한, 완전한 상보성으로부터 일탈(departures)은 허용된다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로 역할을 하기 위하여, 이용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중-스트랜드로 된 구조를 형성할 수 있도록 서열에 충분한 상보성만이 요구된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 실질적으로 상동성 서열은 높은 엄격성 조건하에 비교하였을 때 핵산 서열의 보체에 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열이다. DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 염걱성 조건, 예를 들면, 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC), 약 45℃, 이어서 50℃에서 2.0 x SSC로 세척과 같은 조건은 당업자들에게 공지되어 있거나, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성에서부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격성까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서 온도는 약 22℃ 실온의 낮은 엄격성에서부터 약 65℃의 높은 엄격성으로 증가될 수 있다. 온도와 염 둘다 변화될 수 있거나, 또는 다른 변수를 변화시키는 동안 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지시킬 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 폴리핵산은 중간 수준의 엄격성 조건, 예를 들면 약 2.0 x SSC와 약 65℃에서 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24로 제시된 핵산 분자들, 또는 이의 보체들 또는 이의 단편들중 하나 또는 그 이상에 특이적으로 혼성화될 것이다. 특별히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산은 높은 엄격성 조건하에서 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24로 제시된 핵산 분자들 또는 보체 또는 이의 단편들중 하나 또는 그 이상에 특이적으로 혼성화될 것이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 선호되는 표지 핵산 분자는 서열 번호:1, 또는 서열 번호:2, 또는 서열 번호:3, 또는 서열 번호:4, 또는 서열 번호:5, 또는 서열 번호:6, 또는 서열 번호:7, 또는 서열 번호:8, 또는 서열 번호:9, 또는 서열 번호:10; 또는 서열 번호:17, 또는 서열 번호:18, 또는 서열 번호:19, 또는 서열 번호:20, 또는 서열 번호:21, 또는 서열 번호:22, 또는 서열 번호: 23에서 제시된 핵산 서열, 또는 이의 보체들 또는 이의 단편들을 보유한다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 당업자에게 공지된 임의의 다수의 방법들에 의해 탐지될 수 있는데, 이들 방법들은 형광 테그, 방사능활성 테그, 항체 기반 테그 및 화학발광 테그를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
특정 증폭 프라이머 쌍을 이용한 표적 핵산 서열의 증폭(가령, PCR에 의한)에 있어서, "엄격한 조건(stringent conditions)"이란 프라이머 쌍이 오직 표적 핵산 서열에만 혼성화되는 것을 허용하여, DNA 열 증폭 반응에서 대응하는 야생형 서열 (또는 이의 보체)을 보유하는 프라이머가 표적 서열에 결합하고, 바람직하게는 독특한 증폭 산물, 엠플리콘을 만들도록 허용하는 조건을 말한다.
용어 "(표적 서열)에 특이적인"이란 프로브 또는 프라이머가 엄격성 혼성화 조건하에서 표적 서열이 포함된 시료 안에 있는 표적 서열에만 혼성화되는 것을 말한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "증폭된(amplified) DNA" 또는 "엠플리콘(amplicon)"은 폴리핵산 주형의 일부분인 표적 폴리핵산 분자에 지향된 폴리핵산 증폭 방법의 산물을 말한다. 예를 들면, 유성 교배로부터 생성된 대두 식물이 본 발명의 이벤트 MON87751을 포함하는 대두 식물의 유전자변형 식물 게놈 DNA를 포함하는 지를 판단하기 위하여, 대두 식물 조직 시료로부터 추출된 DNA는 이벤트 MON87751의 이종성 삽입된 DNA의 측면 영역에 있는 게놈 DNA 서열로부터 유도되고, 중합효소에 의해 삽입된 DNA의 5' 에서 3' 방향으로 연장된 제 1 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 이용한 폴리핵산 증폭 방법을 받게 될 수 있다. 제 2 프라이머는 이종성 삽입된 DNA 분자로부터 유도되고, 제 1 프라이머가 유도된 측면 게놈 DNA의 5'에서 3' 방향으로 중합효소에 의해 연장된다. 엠플리콘은 프라이머 쌍 길이에+ 한개 뉴클레오티드 염기 쌍, 또는 +약 50개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 또는 + 약 250개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 또는 + 약 450개의 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기 쌍의 복합 길이 범위에 있을 수 있다. 대안으로, 프라이머 쌍은 전체 삽입 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 엠플리콘을 만들기 위하여 게놈 서열로부터 삽입된 이종성 DNA의 양단 모두에서 유도될 수 있다 (가령, 서열 번호:10의 5'단부에서 게놈 부분으로부터 단리된 포워드(forward) 프라이머와 서열 번호:10의 3' 단부에서 게놈 부분으로부터 단리된 리버스(reverse) 프라이머, 이벤트 MON87751 함유 게놈에서 확인된 삽입된 이종성 DNA 서열 (서열 번호:9)을 포함하는 DNA 분자를 증폭시킨다). 삽입된 유전자변형 DNA에 인접한 식물 게놈 서열로부터 유도된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 일정거리에 위치하고, 이 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍에서 최대 약 2만개의 뉴클레오티드 염기 쌍까지 범위가 될 수 있다. 용어 "엠플리콘(amplicon)"의 사용에서 특히 DNA 열 증폭 반응에서 형성된 프라이머 이량체는 배제된다.
실질적인 목적을 위하여, 제한된 크기 범위의 엠플리콘, 예를 들면, 100 내지 1000개 염기의 엠플리콘을 생산하는 프라이머들을 기획해야만 한다. 일반적으로 더 작은 (길이가 더 짧은 폴리뉴클레오티드) 크기의 엠플리콘이 열 증폭 반응에서 좀더 신뢰성있게 만들어지며, 더 짧은 주기를 허용하고, 그리고 용이하게 분리될 수 있고, 아가로스 겔상에서 가시화될 수 있거나 또는 종점 TAQMAN®-유사 분석을 위한 용도로 개작될 수 있다. 더 작은 엠플리콘은 DNA 엠플리콘 탐지 분야에서 공지된 방법들에 의해 생산 및 탐지될 수 있다. 추가로, 프라이머 쌍을 이용하여 만들어진 엠플리콘은 벡터 안으로 클론될 수 있고, 전파되고, 단리되고, 그리고 서열화되거나 또는 당분야에서 잘 확립된 방법에 의해 직접 서열화될 수 있다. 서열 번호:7과 서열 번호:9의 조합 또는 서열 번호:8과 서열 번호:9의 조합으로부터 유도된, MON87751 또는 이의 후대를 포함하는 식물의 진단용 엠플리콘을 만들기 위하여 DNA 증폭 방법에 유용한, 임의의 프라이머 쌍은 본 발명의 한 측면이다. 서열 번호:7의 최소한 15개의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함하고, MON87751 또는 이의 후대를 포함하는 식물의 진단용 엠플리콘을 만들기 위하여 DNA 증폭 방법에 유용한, 단일 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자는 본 발명의 한 측면이다. 서열 번호:8의 최소한 15개의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함하고, MON87751 또는 이의 후대를 포함하는 식물의 진단용 엠플리콘을 만들기 위하여 DNA 증폭 방법에 유용한, 단일 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자는 본 발명의 한 측면이다. 서열 번호:9의 최소한 15개의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함하고, MON87751 또는 이의 후대를 포함하는 식물의 진단용 엠플리콘을 만들기 위하여 DNA 증폭 방법에 유용한, 단일 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자는 본 발명의 한 측면이다.
폴리핵산 증폭은 중합효소 쇄 반응 (PCR)이 포함된, 당분야에 공지된 다양한 폴리핵산 증폭 방법들중 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 증폭 방법들은 당분야에 공지되어 있으며, 그중에서도 U.S. 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호, 그리고 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990에서 설명되고 있다. 최대 22 kb (킬로베이스)의 게놈 DNA와 최대 42 kb의 박테리오파아지 DNA를 증폭시키는 PCR 증폭 방법들이 개발되었다 (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). 이들 방법들 뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 다른 방법들을 본 발명의 실시에 이용할 수 있다. 대두 이벤트 MON87751로부터 이종성 DNA 삽입 서열 또는 측면 게놈 DNA 서열은 이벤트 MON87751 DNA를 포함하는 대두 종자 또는 ATCC에 PTA-120166로 기탁된 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 종자에서 성장된 대두 식물로부터 이러한 DNA 분자들은 본 명세서에서 제공된 서열에서 유도된 프라이머들을 이용하여 증폭시키고, 이어서 PCR 엠플리콘 또는 클론된 DNA 이의 단편들의 표준 DNA 서열화에 의해 확인될 수 있고(그리고 필요하다면 수정될 수 있다).
이들 방법에 의해 생성된 진단용 엠플리콘은 다양한 기술에 의해 탐지될 수 있다. 이러한 방법중 하나는 Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)이며, 여기에서 DNA 올리고뉴클레오티드는 인접 측면 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 모두를 중첩하도록 기획된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 이량적정 플레이트의 웰 안에 고정된다. 관심 영역의 PCR 후(삽입된 서열에서 하나의 프라이머와 인접 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머를 이용하여), 단일-스트랜드로 된 PCR 산물은 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있고, 그리고 DNA 중합효소와 예상되는 다음 염기에 특이적인 라벨된 디데옥시뉴클레오티드 삼인산염 (ddNTPs)을 이용하여 단일 염기 연장 반응의 주형으로 기능한다. 해독(readout)은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인하여, 이식유전자/게놈 서열이 존재한다는 것을 나타낸다.
또다른 방법은 Winge (Innov . Pharma . Tech. 00:18-24, 2000)에서 설명된 ㅍ파이로서열화(Pyrosequencing) 기술이다. 이 방법에서, 인접 게놈 DNA와 삽입 DNA 졍션을 중첩하도록 올리고뉴클레오티드가 기획된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 영역(삽입된 서열에서 하나의 프라이머와 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머)으로부터 단일-스트랜드로 된 PCR 산물에 혼성화되고, 그리고DNA 중합효소, ATP, 술퍼릴라제(sulfurylase), 루시퍼라제(luciferase), 아피라제(apyrase), 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린(luciferin) 존재하에서 항온처리된다. DNTPs는 개별적으로 추가되며, 혼입으로 광 신호가 생성되며, 신호가 측정된다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인하여, 이식유전자/게놈 서열이 존재한다는 것을 나타낸다.
Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999)에 의해 설명된 형광 편광(Fluorescence Polarization)은 본 발명의 엠플리콘을 탐지하는데 이용될 수 있는 방법이다. 이 방법을 이용하여, 게놈 측면 및 삽입된 DNA 졍션을 중첩하는 올리고뉴클레오티드가 기획된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 영역(삽입된 DNA에서 하나의 프라이머와 측면 게놈 DNA에서 하나의 프라이머)으로부터 단일-스트랜드로 된 PCR 산물에 혼성화되고, 그리고 DNA 중합효소와 형광-라벨된 ddNTP 존재하에서 항온처리된다. 단일 염기 연장으로 ddNTP의 혼입이 초래된다. 혼입(incorporation)은 형광측정기를 이용하여 편광에서의 변화로 측정될 수 있다. 편광에서 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인하여, 이식유전자/게놈 서열이 존재한다는 것을 나타낸다.
Taqman®(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)는 DNA 서열의 존재를 탐지하고, 정량화시키는 방법으로 설명되며, 제조업자가 제시하는 지침에서 충분히 이해된다. 간략하게 설명하자면, 게놈 측면 및 삽입 DNA 졍션을 중첩하는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 기획된다. FRET 프로브와 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 한 개 프라이머와 측면 게놈 서열에서 한개 프라이머)는 열 안정적인 중합효소와 dNTPs 존재하에 순환된다(cycled). FRET 프로브의 혼성화로 인하여 FRET 프로브 상에 급냉(quenching) 모이어티로부터 떨어져 있는 형광 모이어티가 절단되고 방출되게 된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인하여, 이식유전자/게놈 서열이 존재한다는 것을 나타낸다.
Molecular Beacons은 Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303-308, 1996)에서 설명된 것과 같이, 서열 탐지에서 사용된다고 기술되고 있다. 간략하게 설명하자면, 측면 게놈과 삽입 DNA 졍션을 중첩하는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 기획된다. FRET 프로브의 독특한 구조로 인하여 형광 모이어티와 급냉 모이어티가 서로 근접되도록 유지시키는 2차 구조를 포함하게 된다. FRET 프로브와 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 한 개 프라이머와 측면 게놈 서열에서 한개 프라이머)는 열 안정적인 중합효소와 dNTPs 존재하에 순환된다(cycled). 성공적인 PCR 증폭으로 인하여, FRET 프로브가 표적 서열에 혼성화됨으로써 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 모이어티와 급냉 모이어티가 공간적으로 분리되게 된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인하여, 측면/이식유전자 삽입 서열이 존재한다는 것을 나타낸다.
DNA 증폭 방법들에 기반을 둔 DNA 탐지 키트는 표적 DNA에 특이적으로 혼성화되고, 적절한 반응 조건하에서 진단용 엠플리콘을 증폭시키는 DNA 프라이머 분자들을 포함한다. 상기 키트는 아가로스 겔 기반 탐지 방법 또는 당분야에 공지된 진단용 엠플리콘을 탐지하는 임의의 다수 방법들을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 공개된 조성물을 이용하여 DNA 탐지 키트를 개발할 수 있으며, 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA의 존재를 확인하는데 유용하고, 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 식물을 번식시키는 방법에 응용될 수 있다. 서열 번호:10에서 제시된 대두 게놈 영역의 임의 부분 및 서열 번호:10에서 제시된 바와 같이 삽입된 유전자변형 DNA의 임의 부분에 대하여 상동성인 또는 상보적인 DNA 프라이머들이 포함된 키트는 본 발명의 대상이다. 상기 DNA 분자들은 DNA 증폭 방법들 (PCR)에 이용되거나, 또는 폴리핵산 혼성화 방법들, 즉, 서던(Southern) 분석, 노던(northern) 분석에서 프로브로 이용될 수 있다.
졍션 서열은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26로 구성된 군중 한 서열에 의해 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 졍션 서열들은 서열 번호:1 및 서열 번호:2로 제공되는 뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 나타낼 수 있다. 대안으로, 상기 졍션 서열들은 서열 번호:3 및 서열 번호:4로 제공되는 뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 나타낼 수 있다. 대안으로, 상기 졍션 서열들은 서열 번호:5 및 서열 번호:6으로 제공되는 뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 나타낼 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 링키지에 의해 연계되며, 그리고 대두 이벤트 MON87751에서는 재조합 식물 세포 게놈의 일부분으로 존재할 수 있다. 대두 식물, 대두 종자, 또는 대두 식물 부분으로부터 유도된 시료 안에 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26중 하나 또는 그 이상이 확인된다는 것은 확정적으로 상기 DNA가 대두 이벤트 MON87751로부터 획득된 것이며, 시료 안에 대두 이벤트 MON87751로부터 유래된 DNA의 존재에 대한 진단이다. 따라서, 본 발명은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로 제공된 뉴클레오티드 서열중 회소한 하나를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 또는 서열 번호:26로 제공된 서열중 최소한 하나를 포함하기에 충분한, 유전자변형 대두 이벤트 MON87751로부터 유도된 임의의 DNA 세그먼트는 본 발명의 범위 내에 있다. 추가로, 이 단락에서 설명된 서열중 임의의 것에 상보적인 서열이 포함된 임의의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 식물로부터 유도된 DNA의 존재를 탐지하기 위하여 프라이머 또는 프로브로 이용될 수 있는 예시적인 DNA 분자들을 제공한다. 이러한 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 특이적이며, 이와 같이, 본 명세서에서 설명된 발명의 방법들로 대두 이벤트 MON87751 핵산 서열을 확인하는데 유용하다.
"프라이머(primer)"는 열 증폭이 관련된 특이적 어닐링 또는 혼성화 방법들에서 이용하도록 기획된 고도로 정제된, 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 프라이머의 쌍은 엠플리콘을 만들기 위하여 열 증폭, 이를 테면 중합효소 쇄 반응 (PCR)에서 대두 게놈 DNA 시료와 같은 주형 DNA와 함께 이용될 수 있으며, 이러한 반응에서 생산된 엠플리콘은 프라이머가 주형에 혼성화되는 2개 부위 사이에 위치한 주형 DNA의 서열에 상응하는 DNA 서열을 보유할 것이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "엠플리콘(amplicon)"은 증폭 기술을 이용하여 합성된 DNA 조각 또는 단편의 복제다. 본 발명의 엠플리콘은 서열 번호:11 또는 서열 번호:12로 제공된 서열중 최소 하나를 포함할 수 있다. 프라이머는 이 프라이머와 표적 DNA 스트랜드 사이에서 하이브리드가 형성되도록 상보적인 표적 DNA 스트랜드에 혼성화되도록 일반적으로 기획되며, 그리고 프라이머의 존재는 중합효소에 의해 표적 DNA 스트랜드를 주형으로 이용하여 프라이머의 연장(즉, 연장되는 뉴클레오티드 분자 안으로 추가 뉴클레오티드를 중합화)이 시작되는 인지 점이다. 본 발명에서 이용된 바와 같은 프라이머 쌍은 전형적으로 열 증폭 반응 또는 다른 통상적인 핵산 증폭 방법들에서 프라이머 쌍의 개별 구성요소에 의한 결합의 표적이 되는 위치 사이에서 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 선형적으로 증폭시키기 위한 목적으로 이중 스트랜드로 된 뉴클레오티드 세그먼트의 반대 스트랜드에 결합하는 2개 프라이머의 이용을 나타내는 것으로 의도된다. 프라이머로써 유용한 예시적인 DNA 분자들은 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:14, 또는 서열 번호:15로 제시된다. 서열 번호:11 및 서열 번호:12로 제시된 프라이머 쌍은 제 1 DNA 분자와 제 1 DNA 분자와는 상이한 제 2 DNA 분자로 유용하며, 그리고 이둘 모두는 각각 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단 엠플리콘을 만들기 위하여, 대두 이벤트 MON87751로부터 유도된 주형 DNA를 이용한 열 증폭 반응에서 함께 이용될 때, DNA 프라이머 기능을 하기 위하여 서열 번호:10의 충분한 길이의 연속 뉴클레오티드이다.
"프로브(probe)"는 표적 핵산의 스트랜드에 상보적인 단리된 핵산이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합되는 폴리아미드 및 다른 프로브 재료를 포함하며, 이러한 결합의 탐지는 특정 시료 안에 표적 DNA 서열 존재를 진단, 구별, 결정 또는 확인하는데 유용할 것이다. 프로브는 통상적인 탐지가능한 라벨 또는 리포터 분자, 가령, 방사성동위원소, 리간드, 화학발광 물질, 또는 효소에 부착될 수 있다. 프로브로 유용한 예시적인 DNA 분자는 서열 번호:13 및 서열 번호:16으로 제공된다.
본 발명에 따른 프로브와 프라이머는 표적 서열과 완벽한 서열 동일성(identity)을 보유하지만, 표적 서열에 선호적으로 혼성화되는 능력을 보유하는 표적 서열과 상이한 프라이머 및 프로브도 통상적인 방법에 의해 기획될 수 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로 역할을 하기 위하여, 이용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중-스트랜드로 된 구조를 형성할 수 있도록 서열에 충분한 상보성만이 요구된다. 시료 안에 대두 이벤트 MON87751로부터 기인된 유전자변형 DNA 존재를 확인하기 위하여 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 이용될 수 있다. 프로브와 프라이머는 일반적으로 길이가 최소한 약 11개의 뉴클레오티드, 최소한 약 18개의 뉴클레오티드, 최소한 약 24개의 뉴클레오티드, 또는 최소한 약 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 이러한 프로브와 프라이머는 엄격성 혼성화 조건하에 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화된다. 통상적인 엄격성 조건은 Sambrook et al., 1989, and by Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)에 기술되어 있다.
본 발명에서 공개된 DNA 분자, 또는 이의 단편을 단리시키고, 조작하기 위하여 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 열 증폭 방법들이 포함된 임의의 다수의 방법들이 이용될 수 있다. DNA 분자들, 또는 이의 단편들은 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성하는 것과 같은 다른 기술에 의해 또는 획득될 수 있는데, 통상적으로 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 실행된다.
본 명세서에서 제공되는 DNA 분자들과 상응하는 뉴클레오티드 서열은 그 중에서도 대두 이벤트 MON87751을 식별해내고, 대두 이벤트 MON87751이 포함된 식별 변종 또는 잡종을 선택하고, 시료 안에 유전자변형 대두 이벤트 MON87751으로부터 유도된 DNA 존재를 탐지하고, 그리고 대두 이벤트 MON87751의 존재 및/또는 부재에 대하여 시료 또는 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 식물 일부분을 모니터하는데 유용하다.
본 발명은 대두 식물, 대두 식물 세포들, 대두 종자, 대두 식물 일부분 (이를 테면 화분, 배주, 꼬투리, 꽃 조직, 뿌리 조직, 줄기 조직, 및 잎 조직), 대두 후대 식물, 대두 유, 대두 와인, 대두 우유, 대두 단백질, 및 대두 상품 생산물을 제공한다. 이들 대두 식물, 대두 식물 세포들, 대두 종자, 대두 식물 일부분, 대두 후대 식물, 대두 유, 대두 와인, 대두 우유, 대두 단백질, 및 대두 상품 생산물은 본 발명의 탐지가능한 양의 폴리뉴클레오티드, 즉, 이를 테면, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 또는 서열 번호:26로 제공된 서열중 최소한 하나를 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 대두 식물, 식물 세포들, 종자, 식물 일부분, 및 후대 식물은 하나 또는 그 이상의 추가적인 이식유전자를 또한 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 이식유전자는 곤충 저항성의 증가, 물 사용 효과의 증가, 산출량 성과의 증가, 가뭄 저항성의 증가, 종자 품질의 증가, 영양적 품질 개선, 및/또는 제초제 내성의 증가를 포함하나 이에 국한되지 않은 바람직한 형질을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 인코드하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 이때 상기 바람직한 형질은 이러한 추가적인 이식유전자가 없는 대두 식물과 비교하여 측정된다.
본 발명은 대두 식물, 대두 식물 세포들, 대두 종자, 대두 식물 일부분 (이를 테면, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃 조직, 뿌리 조직, 줄기 조직, 및 잎 조직), 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 유전자변형 대두 식물로부터 유도된 대두 후대 식물을 제공한다. 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 종자의 대표적인 시료는 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 American Type Culture Collection (ATCC®)에 기탁되었다. ATCC 기탁원은 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 종자에 대하여 Patent Deposit Designation PTA-120166 번호를 할당받았다.
본 발명은 미생물의 게놈 안에 존재하는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26로부터 선택된 최소한 하나의 서열을 갖는 DNA 분자라 포함된 미생물을 제공한다. 이러한 미생물의 예가 유전자변형 식물 세포다. 미생물, 이를 테면, 본 발명의 식물 세포는 다음에 언급된 것을 포함하나 이에 국한되지 않은 많은 산업 분야에 유용하다: (i) 과학적 조사 또는 산업 연구를 위한 연구 도구로써 이용, (ii) 후속적인 과학 연구에 이용될 수 있는 또는 산업 생산물로 이용될 수 있는 내생성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생산물 또는 작은 분자들을 생산하기 위한 배양물에 이용; 그리고 (iii) 유전자변형 식물 또는 식물 조직 배양물을 만들기 위한 현대 식물 조직 배양 기술에 이용되고, 그 다음 농업 연구 또는 생산에 이용될 수 있다. 이러한 유전자변형 식물 세포들과 같은 미생물의 생산과 사용은 인간이 만든 독특한 미생물을 만들기 위하여 현대적인 미생물학 기술 및 인간의 중재를 이용한다. 이 과정에서, 재조합 DNA는 식물 세포의 게놈 안으로 삽입되어, 자연적으로 생성되는 식물 세포와는 별개의 독특한 유전자변형 식물 세포가 창조된다. 그 다음 이러한 유전자변형 식물 세포는 현대 미생물 기술을 이용하여 박테리아 및 효모 세포들과 같이 배양될 수 있고, 분화안된, 단세포 상태로 존재할 수 있다. 상기 유전자변형 식물 세포의 새로운 유전적 조성 및 표현형은 이 세포의 게놈 안으로 이종성 DNA가 통합됨으로써 만들어진 기술 결과이다. 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 미생물의 이용 방법이다. 본 발명의 미생물, 이를 테면 유전자변형 식물 세포들의 이용 방법은 (i) 재조합 DNA를 세포의 게놈에 통합시킴으로써, 유전자변형 세포를 만드는 방법과 그 다음 이러한 세포를 이용하여 동일한 이종성 DNA를 보유하는 추가 세포를 유도하는 방법; (ii) 현대 미생물학 기술을 이용하여 재조합 DNA를 포함하는 세포를 배양하는 방법들; (iii) 배양된 세포로부터 내생성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생산물을 생산하고, 정제하는 방법을; 그리고 (iv) 유전자변형 식물 또는 유전자변형 식물 조직 배양물을 생산하기 위하여, 유전자변형 식물 세포들과 함께 현대 식물 조직 배양 기술을 이용하는 방법들을 포함한다.
본 발명의 식물은 대두 이벤트 MON87751에 삽입된 이식유전자를 포함하는 이벤트 MON87751 DNA를 후대로 전달할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "후대(progeny)"은 선조 식물로부터 유도된 이벤트 MON87751 DNA를 포함하는, 및/또는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 서열을 가진 DNA 분자를 포함하는, 임의의 식물, 종자, 식물 세포, 및/또는 재생가능한 식물 부분을 포함한다. 식물, 후대, 및 종자는 이식유전자에 대해 동정접합성 또는 이종접합성일 수 있다. 후대는 대두 이벤트 MON87751이 포함된 식물에서 생산된 종자 및/또는 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 식물의 화분으로 수정된 식물에서 생산된 종자로부터 성장될 수 있다.
후대 식물은 순종(true breeding) 계통의 식물, 즉, 이식 유전자에 대해 동종접합성인 식물을 만들기 위하여 자가-수분(또는 "자가 수정"으로도 알려짐)될 수 있다. 적절한 후대의 자가수정은 추가된 외생성 유전자들 모두에 대하여 동종접합성인 식물을 만들 수 있다.
대안으로, 후대 식물은 잡종-교배(out-crossed), 가령, 변종 또는 잡종 종자 또는 식물을 만들기 위하여, 또다른 무관한 식물과 교배될 수 있다. 다른 무관한 식물은 유전자변형 또는 비-유전자변형 식물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 변종 또는 잡종 종자 또는 식물은 대두 이벤트 MON87751의 독특하고, 특이적인 DNA가 없는 제 1 부모와 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 제 2 부모의 유성 교배에 의해 유도될 수 있으며, 대두 이벤트 MON87751의 특이적인 독특한 DNA가 포함된 잡종이 생성된다. 교배 또는 번식에 의해 본 발명의 식물 또는 종자, 즉, 대두 이벤트 MON87751의 DNA 및/또는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로부터 선택된 최소한 하나의 DNA 분자를 포함하는 최소한 하나의 대립유전자를 갖는 종자가 생성된다면, 각 부모는 잡종 또는 근친교배/변종일 수 있다. 따라서 2개의 상이한 유전자변형 식물이 교배되어 2개의 독립적으로, 분리되는 추가된 외생 유전자를 포함하는 잡종 후손이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 대두에 이중 작용 방식의 곤충 저항성을 부여는 Cry2Ab 및 Cry1A.105가 포함된 MON87751은 다른 유전자변형 대두 식물과 교배되어, 유전자변형 부모의 특징을 모두 보유한 식물이 만들어질 수 있다. 이러한 하나의 예는 대두에 이중 작용 방식의 곤충 저항성을 부여는 Cry2Ab 및 Cry1A.105가 포함된 MON87751과 하나 또는 그 이상의 추가적인 형질, 이를 테면 제초제 내성 (가령 대두 이벤트 MON89788 또는 대두 이벤트 MON　87708) 및/또는 곤충 제어 (가령 대두 이벤트 MON　88701)를 갖는 식물과 교배되어, 인시목 해충에 대한 이중 작용 저항성을 가지고, 그리고 최소한 하나 또는 그 이상의 추가적인 형질을 보유한 후대 식물 또는 종자가 생성된다. 영양 번식(vegetative propagation)과 같이, 부모 식물에 역교배(back-crossing)와 비-유전자변형 식물과의 잡종 교배(out-crossing) 또한 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 흔히 이용되는 다른 번식 방법들에 대한 설명은 몇몇 참고문헌중 하나 가령, Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명은 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 식물 부분을 제공한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "식물 부분"이란 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 재료를 포함하는 식물의 임의의 부분을 지칭한다. 식물 일부분은 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유질, 및 잎을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 식물 일부분은 생육가능한(viable), 생육불가능한, 재생가능한, 및/또는 재생불가능한 것일 수 있다.
본 발명은 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도되고, 그리고 이벤트 MON87751에 특이적인 탐지가능한 양의 핵산을 포함하는 상품 산물을 제공한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "상품 산물(commodity product)"은 대두 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 대두 식물, 온전한 또는 가공된 대두 종자, 하나 또는 그 이상의 식물 세포들 및/또는 식물 일부분으로부터 유도된 물질을 포함하는 임의의 조성물 또는 산물을 지칭한다. 상품 생산물은 소비자들에게 판매될 수 있으며, 생육가능하거나 또는 생육불가능할 수 있다. 생육불가능한 상품 생산물은 생육불가능한 종자; 온전한 또는 가공된 종자, 종자 일부분, 및 식물 일부분; 대두 유, 대두 단백질, 콩가루, 대두 가루, 대두 플레이크, 대두 겨, 대두 우유, 대두 치즈, 대두 와인, 대두가 포함된 동물 사료, 대두가 포함된 종이, 대두가 포함된 크림, 대두 바이오매스, 그리고 대두 식물 및 대두 식물 일부분을 이용하여 만든 연료 생산물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 생육가능한 상품 생산물은 종자, 식물, 및 식물 세포들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물은 대두로부터 전형적으로 획득되는 임의의 상품 산물의 제작에 이용될 수 있다. 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 이러한 임의의 상품 산물은 대두 이벤트 MON87751에 상응하는 특이적인 그리고 독특한 DNA를 최소한 탐지가능한 양으로 포함할 수 있으며, 그리고 구체적으로 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로부터 선택된 최소한 하나의 서열을 갖는 DNA 분자가 포함된 폴리뉴클레오티드를 탐지가능한 양으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 분자들의 탐지를 위한 본 명세서에서 설명된 탐지 방법들을 포함하는, 임의의 표준 방법을 이용할 수 있다. 임의의 상품 산물 안에 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로부터 선택된 최소한 하나의 서열을 갖는 DNA 분자의 탐지가능한 양이 있다면, 이 상품 산물은 본 발명의 범위 안에 속한다.
따라서, 본 발명의 식물, 후대, 종자, 식물 세포들, 식물 일부분 (이를 테면, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 그리고 상품 생산물은 농업 목적으로 대두 이벤트 MON87751이 포함된 종자 및/또는 식물 일부분을 생산하는 목적으로 식물을 키우거나, 식물 번식 및 연구 목적으로 대두 이벤트 MON87751이 포함된 후대를 생산하는 목적으로 식물을 키우거나, 산업 및 연구 분야에 미생물 기술에 이용하고, 그리고 소비자에게 시판할 목적으로 식물을 키우는데 유용하다.
본 발명의 이벤트 MON87751에 특이적인 그리고 독특한 DNA 서열을 포함하는 곤충 저항성 대두 식물을 만드는 방법들이 제공된다. 이들 방법들에 이용된 이식유전자 식물은 이 이식유전자에 대해 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있다. 이들 방법들에 의해 생산된 후대 식물은 변종 또는 잡종 식물일 수 있고; 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 식물의 화분으로 수정된 식물에서 생산된 종자로부터 성장될 수 있고; 그리고 이 이식유전자에 대해 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있다. 후대 식물은 후속적으로 자가-수정되어, 순종 계통의 식물, 즉, 이식유전자에 대해 동종접합성인 식물이 생성될 수 있거나, 또는 대란으로 잡종-교배(out-crossed), 가령, 변종 또는 잡종 종자 또는 식물을 만들기 위하여, 또다른 무관한 식물과 교배될 수 있다.
시료 안에 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 대두 세포, 대두 조직, 대두 종자, 또는 대두 식물로부터 유도된 DNA의 존재를 탐지하는 방법들이 제공된다. 한 가지 방법은 (i) 최소한 하나의 대두 세포, 대두 조직, 대두 종자, 또는 대두 식물로부터 DNA 시료를 추출하고, (ii) 상기 DNA 시료와 이벤트 MON87751 DNA에 특이적인 DNA 서열을 만들 수 있는 최소한 한 개 프리어머를 DNA 서열화에 적합한 조건하에서 접촉시키고, (iii) DNA 서열화 반응을 실행하고, 그리고 그 다음 (iv) 상기 뉴클레오티드 서열은 이벤트 MON87751에 특이적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 구조체는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 포함한다는 것을 확인하는 것으로 구성된다. 또다른 방법은 (i) 최소한 하나의 대두 세포, 대두 조직, 대두 종자, 또는 대두 식물로부터 DNA 시료를 추출하고, (ii) DNA 증폭에 적절한 조건하에 상기 DNA 시료와 이벤트 MON87751 DNA로부터 엠플리콘을 만들 수 있는 프라이머 쌍을 접촉시키고, (iii) DNA 증폭 반응을 실시하고, 그리고 그 다음 (iv) 엠플리콘 분자을 탐지하거나 및/또는 엠플리콘의 뉴클레오티드 서열은 이벤트 MON87751에 특이적인 뉴클레오티드 서열, 이를 테면, 서열 번호: 1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 및 서열 번호:6으로 구성된 군에서 선택된 하나를 포함한다는 것을 확인하는 것으로 구성된다. 상기 엠플리콘은 이벤트 MON87751에 특이적이어야 하는데, 이를 테면, 서열 번호: 1, 또는 서열 번호:2, 또는 서열 번호:3, 또는 서열 번호:4, 또는 서열 번호:5, 또는 서열 번호:6을 포함하는 엠플리콘이어야 한다. 엠플리콘에서 이벤트 MON87751에 특이적인 뉴클레오티드 서열의 탐지는 엠플리콘 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 특이적 DNA의 존재에 결정적이거나 및/또는 진단이 된다. DNA 증폭에 적합한 조건하에서 이벤트 MON87751 DNA로부터 엠플리콘을 생산할 수 있는 프라이머 쌍의 실례는 서열 번호:11, 및 서열 번호:12로 제공된다. 당업자는 다른 프라이머 쌍들을 용이하게 기획할 수 있는데, 서열 번호: 1, 또는 서열 번호:2, 또는 서열 번호:3, 또는 서열 번호:4, 또는 서열 번호:5, 또는 서열 번호:6을 포함하는 엠플리콘이 만들어질 수 있고, 이때 이러한 프라이머 쌍은 게놈 영역 안에 삽입 측면에 최소한 하나의 프라이머와, 삽입 안에 제 2 프라이머를 포함할 수 있다. 시료 안에 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 대두 세포, 대두 조직, 대두 종자, 또는 대두 식물로부터 유도된 DNA 존재를 탐지하는 또다른 방법은 (i) 최소한 하나의 대두 세포, 대두 조직, 대두 종자, 또는 대두 식물로부터 DNA 시료를 추출하고, (ii) 상기 DNA 시료에 이벤트 MON87751 DNA에 특이적인 DNA 프로브를 접촉시키고, (iii) 엄격성 혼성화 조건하에 프로브와 DNA 시료가 혼성화되도록 허용하고, 그리고 그 다음 (iv) 프로브와 표적 DNA 시료 간에 혼성화를 탐지하는 것으로 구성된다. 이벤트 MON87751 DNA에 특이적인 DNA 프로브 서열의 실례는 서열 번호:13 또는 서열 번호:16으로 제공된다. 당업자는 다른 프로브를 용이하게 기획할 수 있는데, 삽입 측면에 게놈 DNA의 최소한 하나의 단편과, 삽입 DNA의 최소한 한 단편, 이를 테면, 서열 번호: 1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 및 서열 번호:10을 포함하나 이에 국한되지 않는, 제공되는 서열을 포함할 것이다. DNA 시료에 혼성화 프로브 탐지는 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 특이적 DNA의 존재에 대한 진단이다. 혼성화의 부재는 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 특이적 DNA 부재에 대한 대안적 진단이다.
시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA의 확인에 유용한 DNA 탐지 키트가 제공되는데, 적절한 이벤트 DNA가 포함된 대두 식물을 번식시키는 방법에 또한 응용될 수 있다. 이러한 키트는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26의 단편들을 포함하는 DNA 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. 이러한 키트의 한 실례는 시료 안에 유전자변형 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 DNA의 존재 및/또는 부재를 탐지하는데 유용한 DNA 프로브로 기능을 하기 위하여 서열 번호:10의 충분한 길이의 연속 뉴클레오티드의 최소한 하나의 DNA 분자를 포함한다. 유전자변형 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 DNA는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로부터 선택된 최소한 하나의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함할 것이다. 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA의 존재 및/또는 부재의 결정, 탐지 또는 진단에 유용한, DNA 프로브로 이용하는데 충분한 DNA 분자는 서열 번호:13으로 제공된다. 당업자는 다른 프로브를 용이하게 기획할 수 있는데, 상기 이벤트로부터 유도된 DNA를 확인하기 위하여, 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대하여 충분히 독특하고, 서열 번호:10의 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 최소한 20, 최소한 21, 최소한 22, 최소한 23, 최소한 24, 최소한 25, 최소한 26, 최소한 27, 최소한 28, 최소한 29, 최소한 30, 최소한 31, 최소한 32, 최소한 33, 최소한 34, 최소한 35, 최소한 36, 최소한 37, 최소한 38, 최소한 39, 또는 최소한 40개의 연속 뉴클레오티드를 포함해야 한다. 또다른 유형의 키트는 시료 안에 유전자변형대두 이벤트 MON87751로부터 유도된 DNA를 탐지하는데 유용한 엠플리콘을 만드는데 이용되는 프라이머 쌍을 포함한다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 이러한 키트는 표적 DNA 시료에 프라이머 쌍을 접촉시키고, 그 다음 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26에서 선택된 최소한 하나의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 엠플리콘을 만드는데 충분한 핵산 증폭 반응을 실행시키고, 그리고 그 다음 상기 엠플리콘의 존재 및/또는 부재를 탐지하는 것이 포함된 방법을 이용할 것이다. 이러한 방법은 엠플리콘 또는 이의 단편의 서열화를 또한 포함할 수 있는데, 이는 표적 DNA 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 특이적 DNA의 존재에 결정적, 즉 진단이 될 수 있다. 당업자는 다른 프라이머 쌍을 용이하게 기획할 수 있는데, 상기 이벤트로부터 유도된 DNA를 확인하기 위하여, 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대하여 충분히 독특하고, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10; 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26을 포함하나, 이에 국한되지 않은 서열에서 제공된 서열의 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 최소한 20, 최소한 21, 최소한 22, 최소한 23, 최소한 24, 최소한 25, 최소한 26, 최소한 27, 최소한 28, 최소한 29, 또는 최소한 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함해야 한다.
본 발명의 키트 및 탐지 방법들은 무엇보다도 대두 이벤트 MON87751을 식별해내고, 대두 이벤트 MON87751이 포함된 식물 변종 또는 잡종을 선택하고, 시료 안에 유전자변형 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 DNA의 존재를 탐지하고, 그리고 시료 안에 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물 및/또는 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물로부터 유도된 식물 일부분에 대한 감시에 유용하다.
이종성 DNA 삽입의 서열, 졍션 서열, 또는 대두 이벤트 MON87751의 측면 서열은 본 명세서에서 제공된 서열들로부터 유도된 프라이머를 이용하여 상기 이벤트로부터 이러한 서열을 증폭시키고, 엠플리콘 또는 클론된 DNA의 표준 DNA 서열화에 의해 확인될 수 있고(그리고 필요에 따라 수정될 수 있다).
다음의 실시예들은 본 발명의 특정 바람직한 구체예들을 설명하기 위하여 포함된다. 당업자는 실시예에서 공개된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능한다고 발명자들이 발견한 방식이며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식의 실시예를 구성하는 것으로 간주된다는 것을 인지해야 한다 그러나, 당어?는 본 공개 내용에 근거하여, 공개된 특정 구체예에서 많은 변화가 있을 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 여전히 유사한 또는 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 인지해야 한다.
기탁 정보
이벤트 MON87751 DNA가 포함된 Glycine max 종자의 대표 시료의 기탁은 부다페스트 조약에 따라 2013년 2월 28일자로 American Type Culture Collection (ATCC)(주소 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, Zip Code 20110)에 기탁되었으며, ATCC 기탁번호. PTA-120166을 부여받았다. 기탁물에 대한 접근은 출원 계류 기간 동안 요청시 Commissioner of Patents and Trademarks 및 상기 장관에 의해 자격이 부여된 자에게 이용가능하다. 특허 동록시, 대중의 이용가능성에 대한 모든 제약은 비가역적으로 제거될 것이다. 기탁물은 30년간, 또는 최종 요청 후 5년, 또는 특허 존속 기간 동안(어느쪽이던 긴 쪽) 기탁소에서 유지될 것이며, 상기 기간 동안 필요에 따라 대체될 것이다.
실시예 1
본 실시예는 대두 이벤트 MON87751의 형질변환 및 선별을 설명한다. 식물에 외부 유전자들의 발현은 아마도 크로마틴 구조 (가령, 헤테로크로마틴) 또는 통합 부위 가까이에 전사 조절 요소들 (가령, 인헨서)의 근접성으로 인한 이들의 염색체 위치에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (Weising, 1988). 이러한 이유로, 관심대상의 도입된 유전자의 최적의 발현에 의해 특징화된 이벤트를 식별해내기 위하여 다수의 이벤트를 스크린할 필요성이 대개 있다. 예를 들면, 식물 및 다른 유기체들에서 이벤트들 중에 도입된 유전자의 발현 수준에 광범위한 변이가 있을 수 있음이 관찰되었다. 발현의 공간적 또는 시기적 패턴에서의 차이, 예를 들면, 다양한 식물 조직에서 이식유전자의 상대적 발현에서의 차이가 또한 있을 수 있는데, 이는 도입된 유전자 구조체안에 존재하는 전사 조절 요소들로부터 예측된 패턴에 상응하지 않을 수 있다. 이러한 이유로, 이벤트 MON87751의 선별 과정 동안 형질변환된 대두에서 상이한 11개의 발현 벡터가 생성되었고, 테스트되었다.
식물에서 상이한 11개의 발현 구조체가 형질변환되었고, 테스트되었다. 개별 발현 구조체는 발현 요소들, 즉, 인헨서 (E), 프로모터 (P), 리더 (L), 인트론 (I), 엽록체 표적화 펩티드 (CTP), 및 3' 전사 종료와 폴리아데닐화 신호 (T)의 조합 사용에 있어서 가변적이었다. 또한, T-DNA 세그먼트는 두개 Cry 단백질들 (Cry2Ab 및 Cry1A.105)을 인코드하는 2개의 발현 카세트를 포함하거나, 또는 단일 Cry 단백질, 즉, Cry2Ab 또는 Cry1A.105를 인코드하는 하나의 발현 카세트를 포함하였다. Cry2Ab 및 Cry1A.105 발현 카세트를 모두 포함하는 T-DNA 세그먼트를 가진 발현 구조체에서 추가 변이는 Cry 단백질들을 인코드하는 2개의 카세트의 상대적 방향이다. 구체적으로, 2개의 Cry 단백질 발현 카세트는 전사의 상대적 직렬 방향에 위치함으로서, 각 Cry 단백질의 각 프로모터로부터 발현은 각각 별도의 각 프로모터로부터, 그러나, 동일한 방향으로 진행되거나 (도 2 참고), 또는 2개의 Cry 단백질 발현 카세트는 역 방향으로 위치하여, 2개의 Cry 단백질들의 각 프로모터로부터의 발현은 2개 프로모터 사이에 중심을 둔 점으로부터 멀어지게 되는데, 각 Cry 단백질 발현 카세트의 전사는 반대 방향으로 진행되고, 모이지 않는다 (도 2 참고). Cry1A.105를 인코드하는 DNA 서열은 구조체 1과 3에 비교하여 구조체 4, 6, 7, 8, 및 9에서 다양화된 서열이다. 여전히 추가 변이에서, 역 전사 방향으로 위치된 2개의 Cry 발현 카세트를 가진 2개의 구조체에서, 전사 인헨서는 발산(diverging) 프로모터들 사이에 위치하고 있다 (도 2 참고).
11개의 발현 구조체는 대두 분열조직(meristem) 조직의 아그로벡테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질변환에 의해 3개 별도 시점에서 형질변환되었다. 상기 방법은 U.S. 특허 제 8,030,544호에 설명되어 있으며, 이로써 캘러스(callus)의 사용없이 형질변환된 식물의 생성이 허용된다. 간략하게 설명하자면, 발아된 A3555 대두 종자의 배아로부터 분열조직의 조직을 잘라내었다 (Asgrow, St Louis, MO). 구조체 1은 2개의 별도 T-DNA 세그먼트를 포함하는데, 각각은 아그로벡테리 움( Agrobacterium ) 경계 서열 (T-DNA 세그먼트)에 의해 결합되었다. 형질변환 구조체의 제 1 T-DNA 세그먼트는 2개의 발현 카세트를 포함하는데, 제 1 발현 카세트는 대장균( Escherichia coli )으로부터 Tn7 아데닐전이효소 유전자 (스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 저항성; aadA-SPR을 부여함) 영역을 인코드하고, 선별에 이용되며; 그리고 제 2 발현 카세트는 아그로벡테리움 투메페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58로부터 수크로즈 포스포릴라제 유전자 (수크로즈가 프락토즈와 글루코스-1-포스페이트로의 전환을 촉매함; STR+OriRi)의 영역을 인코드하고, 채점가능한 표지로 이용된다. 상이한 형질변환 구조체의 제 2 T-DNA 세그먼트는 오직 Cry2Ab만을 인코드하는 하나의 발현 카세트 (구조체 2, 5, 10 또는 11) 또는 오직 Cry1A.105만을 인코드하는 발현 카세트 (구조체 3 또는 6)를 포함하고 있으며; 또는 상이한 형질변환 구조체의 제 2 T-DNA 세그먼트는 Cry2Ab를 인코드하는 하나의 발현 카세트와 Cry1A.105를 인코드하는 하나의 발현 카세트를 포함하고 있다 (구조체 1, 4, 7, 8, 또는 9) (도 2에서 설명됨). 형질변환 구조체의 각 T-DNA 세그먼트는 별도 아그로벡테리움 ( Agrobacterium ) 경계 서열들에 의해 결합되기 때문에, 선별 및 채점가능한 표지 카세트들을 포함하는 상기 T-DNA 세그먼트는 Cry2Ab 및/또는 Cry1A.105 발현 카세트들을 인코드하는 T-DNA 세그먼트의 통합 부위와는 상이한 부위에서 대두 세포 게놈 안으로 통합될 수 있다. 따라서, 선별 및 채점가능한 표지 서열들의 분리 및 상실에 대하여 이벤트들이 스크리닝될 수 있다. 모든 이벤트들은 백본의 부재 및 선별/채점가능한 표지 카세트 서열들의 부재에 대하여 선택될 것이다. 형질변환 구조체를 가지고 있는 아그로벡테리움 ( Agrobacterium ) 과 함께 공동-배양한 후, 분열조직들은 스펙티노마이신, 카르베니실린 이나트륨염, 쎄포탁심 나트륨 염, 그리고 티카르실린 이나트륨 염/클라부라네이트 칼륨 혼합물이 포함된 선별 배지에 위치시켜 형질변환안된 식물 세포들과 과량의 아그로벡테리움(Agrobacterium)의 성장을 저지시켰다. 그 다음 싹과 뿌리 발달에 도움이 되는 배지에 분열조직을 위치시켰다. 정상적인 표현형 특징을 가진 뿌리박은 식물 (R0)이 선택되었고, 성장 및 추가 평가를 위하여 토양으로 이전되었다.
이벤트 MON87751을 만드는데 이용된 발현 구조체 1은 5' 에서 3'로 상대적인 순서의 식물 발현 요소들에서 (끼어있는 서열과 함께, 또는 끼어있는 서열 없이) 2개의 상이한 Cry 단백질들을 인코드하는 T-DNA 세그먼트를 포함하고 있다: 프로모터, 리더 및 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ) Actin 2 유전자(P-At.Act2)로부터 유도된 첫번째 인트론, 식물 발현 (CTP2-Cry2Ab)을 위하여 변형된 뉴클레오티드를 가진 바실러스 트루링겐시스 (Bacillus thuringiensis )(Bt) 로부터 Cry2Ab를 인코드하는 유전자 (곤충 저항성을 부여하는 단백질을 인코드함)와 같은 틀(frame)에 융합된 아라비돕시스 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS) 유전자로부터 유도된 N-말단 엽록체 수송 펩티드 코딩 서열을 포함하는 키메라 코딩 서열, 오리자 사티바 ( Oryza sativa) 메탈로티오닌-유사 단백질 유전자 (T.OsMth)로부터 유도된 3' 전사 종료 및 폴리아데닐화 요소 (3' UTR), 제 1 Cry 단백질 발현 카세트와 제 2 Cry 단백질 발현 카세트 사이에 끼어있는 서열; 아라비돕시스 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제 작은 하위단위 1A 유전자 (P-At.RbcS4)로부터 유도된 프로모터와 리더, 이 프로모터-리더는 키메라 코딩 서열에 링크되는데, 이 키메라 코딩 서열은 식물 발현을 위하여 변형된 뉴클레오티드를 가진 바실러스 트루링겐시스 (Bacillus thuringiensis )(Bt) 로부터 Cry1Ab1 (도메인 I & II), Cry1Fa1 (도메인 III), 및 Cry1Ac1 (프로톡신 도메인)을 인코드하는 유전자 세그먼트들로 구성된, Cry1A.105를 인코드하는 유전자 (곤충 저항성을 부여하는 단백질을 인코드함)와 같은 틀에서 융합된 수송 펩티드 절단 부위의 반복부와 성숙 단백질에서 3개 아미노산을 인코드하는 코딩 서열을 또한 포함하고, 아라비돕시스 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제 작은 하위단위 1A 단백질 유전자 (CTP1)으로부터 유도된 엽록체 수송 펩티드 코딩 서열이 포함하고, 메디카고 트루카툴라 ( Medicago truncatula ) 포스페이트 운반자 1 유전자로부터 유도된 3' UTR (T-Mt.Pt1). 구조체 1 발현 카세트에서, 2개의 별도 Cry2Ab 및 Cry1A.105 발현 카세트를 포함하고 있는 T-DNA 카세트는 Cry2Ab 카세트에 대하여 5'인 임의적으로 지정된 5' 단부 상에 아그로벡테리움 ( Agrobacterium ) 우측 경계; 그리고 Cry1A.105 카세트에 대하여 3'인 임의적으로 지정된 3' 단부 상에 아그로벡테리움( Agrobacterium ) 좌측 경계를 갖는다. Cry2Ab 카세트 (프로모터로부터 터미네이터까지)는 서열 번호:9의 위치 123-3785에 있으며, 그리고 Cry1A.105 카세트 (프로모터로부터 터미네이터까지)는 서열 번호:9의 위치 3831-9754에 있다.
구조체 2 (Cry2Ab)와 구조체 3 (Cry1A.105)의 T-DNA 카세트는 구조체 1에서 이용된 각 Cry-단백질 인코딩 유전자에 대한 동일한 요소들을 가진, 단일 Cry-단백질을 인코드하는 카세트를 포함하고 있다, 도 2 참고.
구조체 4, 5, 및 6은 각각 차례로 구조체 1, 2, 및 3과 요소 방향에서 유사하지만, Cry2Ab 및 Cry1A.105 카세트 모두에 있어서 프로모터-리더-인트론 및 엽록체 수송 펩티드가 상이하다. 상응하는 Cry 단백질 카세트 (Cry2Ab는 T-Os.Mth, 또는 Cry1A.105는 T-Mt.Pt1)에 대한 터미네이터는 발현 구조체 1 부터 11까지의 모두에서 동일하였다 (도 2 참고).
구조체 7 - 11 각각에서 Cry2Ab 및 Cry1A.105 카세트 모두에 이용된 프로모터-리더-인트론 및 엽록체 수송 펩티드, Cry-단백질 인코딩 서열, 및 터미네이터는 구조체 4, 5, 및 6에서 이용된 것들과 동일하다. 그러나, 구조체 7, 8, 및 9의 경우 Cry2Ab 카세트와 Cry1A.105 카세트의 방향은 서로에 대하여 역전되거나 또는 반대이며, 전사 방향은 이들의 각 프로모터로부터 반대방향이다, 도 2 참고. 구조체 7, 8, 및 9는 인헨서에서 차이가 있는데, 2개 구조체 사이에 인헨서가 없거나(구조체 7), 또는 인헨서가 존재하는데; 구조체 8은 인헨서 1 (E1), 또는 구조체 9는 인헨서 (E2)를 가진다, 도 2 참고. 구조체 10과 구조체 11은 E1 (구조체 10) 또는 E2 (구조체 11)을 가진 단일 Cry2Ab 카세트이다.
형질변환과 (R0) 이벤트를 토양으로 옮긴 후, 방대한 분자, 작물, 및 표현형 분석이 실행되어, 추가 테스트를 위한 이벤트들이 선별되었다. 추가적으로, 이벤트들은 자가-수정되고, 선택된 이벤트들로부터 생성된 종자는 필드 및 추가 분자 테스트에 이용되었다.
상기 분자 테스트에는 다음의 것들이 포함되었다: 복사체 수를 결정하는 분석, 발현 카세트 (구조체 1, 4, 7, 8, 및 9)가 포함된 Cry 단백질 모두의 통합, Cry 단백질 인코딩 T-DNA 카세트 (단일 Cry 단백질 발현 카세트 (구조체 2, 3, 6, 10, 또는 11) 또는 2개의 Cry 단백질 발현 카세트(구조체 1, 4, 7, 8, 또는 9)) 존재를 결정하는 분석; ELISA에 의해 측정되는 단백질 발현을 결정하는 분석, 그리고 T-DNA 발현 카세트의 분리 비율 (1:2:1 또는 1:3)을 결정하는 분석. 작물 분석 (구조체 1, 2, 및 3로부터 생성된 R0 이벤트의 경우, 2개의 해충 종 (안티카르시아 겜마탈리스 ( Anticarsia gemmatalis ) (벨벳빈 캐터필러, VBC) 및 크리소데이식스 인클루덴스 ( Chrysodeixis includens ) (대두 자벌레, SBL))에 대하여 잎 원반 생물분석에 의한 곤충 효과)가 포함되었다. R0 식물은 다 자랐고, 이벤트들은 자가-수정되었고, 각 이벤트에 대한 종자 세트들이 결정되었다.
11개의 개별 구조체로 형질변환되어 생성되고, 다양한 토양으로 이전된 R0 이벤트의 수는 420개 이벤트 내지 5000개 이상의 이벤트 범위가 되었다 (표 1 참고). 이벤트 MON87751이 생성된, 구조체 1로 형질변환된 경우, 총 1102개의 R0 식물이 토양에 뿌리를 내렸으며, 그중 281개의 이벤트만이 최초 분자 분석에 전달되었다. 구조체 1로 형질변환에 의해 생성된 이들 281개 이벤트의 추가적인 분자, 작물 및 표현형 분석에서 29개의 R1 이벤트 만이 추가 온실 분석에서 평가되었다.
Figure pct00001
구조체 1로 형질변환에 의해 생성되고, 추가 분석을 위하여 평가된 29개 R1 이벤트의 경우, R1 종자는 다음이 포함된 분석과 함께 R1 이벤트의 분석을 위하여 온실에 심었다: (a) R1 발아 (100% 발아); (b) 동종접합성 식물의 확인; (c) 동종접합성 식물은 선별/채점가능한 표지 서열을 더 이상 포함하지 않는다 (독립적으로 분리되었다)는 것을 PCR 분석으로 확인; (d) C. 인클루덴스(C. includens )에 대한 잎 원판 생물분석에 의해 측정된 곤충 효과 (SBL); 그리고 (e) 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) (밤나방과 나방, FAW)에 대한 잎 원판 생물분석에 의해 측정된 곤충 효과, (f) Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질 수준이 >4 ppm인, 나이가 들어가는 이벤트, V7 단계 잎 조직에서 ELISA에 의한 단백질 발현, 분자 분석 및 곤충 잎 원판 생물분석 결과에 추가로, 4개의 선별/이벤트로부터 작물 표현형 관찰 및 종자 세트가 수집되었다. 이들 전체 데이터에 근거하여, 구조체 1에 의한 형질변환에 의해 생성된 21개 R1 이벤트로부터 얻은 R2 종자는 작물 필드 시험 및 효과 스크린하우스 시험에서 평가되었다.
실시예 2
대조군, A3555 (부모계 배경)과 비교하였을 때, Cry2Ab 및 Cry1A.105를 발현시키는 대두 이벤트의 표현형 특징 및 산출량을 평가하도록 작물재배 필드 시험이 기획되었다. 이들 작물 필드 시험에서, 대조군과 이벤트들은 상대적 성숙도(relative maturity) 집단 3 (RM3)의 대두 변종 A3555이다. 4계절에 걸쳐, 2개의 지리학적 위치에서 무작위화된 완전한 차단 디자인(RCBD)하에서 시험물을 심었다. 한 군데 지리학적 위치에서, 각 계절에 25군데 필드 지역에서 작물 필드 시험이 실행되었으며, 제 2의 지리학적 위치에서는 각 계절에 14군데 필드 지역에서 작물 필드 시험이 실행되었으며 모든 시험의 경우 식물을 심고, 데이터를 수거함에 있어서 표준 작물 관행을 준수하였다. 수집된 데이터에는 출엽 속도(emergence rating), 묘목 활력(seeding vigor), 개화일, 꽃 색깔 관찰, 표현형 관찰, 솜털 색깔, 성숙도, 로징(lodging), 식물 키, 분쇄 득점(shattering score), 수확일, 종자 중량/구획(plot), 종자 수분/플로징로트(plodginglot), 및 에이커당 부셀 산출량(bu/ac)이 포함되었다.
데이터 분석을 위하여, 수확전 품질 문제 (즉, 정수(standing water), 부적합한 토양 수분, 열악한 출엽, 우박으로 인하여 만기 꼬투리 분쇄로 인하여 일부 위치는 중단되었거나, 또는 일부 위치는 15% 이상의 변동계수(CV) 및/또는 높은 위치 품질 지수 (LQI)로 인하여 중단되었다.
테스트된 모든 위치에 걸쳐, 취해진 표현형 척도에서 이벤트들에 대한 작물재배율(agronomic ratings)은 대조군, A3555의 정상 범위 안에 있었다는 것이 나타났다. 모든 관찰이 모든 부위에서 이루어지지는 않았으며, 일부 데이터, 예를 들면 출엽은 수집되었지만, 해당 위치가 초기 표현형 데이터의 수집 후 발생된 문제들로 인하여 누락되었기 때문에 산출량은 측정되지 않았다.
작물 필드 시험의 경우, 구조체 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 의해 생성되고, 2군데 지리학적 위치에서 각 필드 시험에서 테스트된 이벤트의 수, 그리고 테스트된 대두 이벤트 세대 (즉 R3, R4, R5, R6, 또는 R7)는 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
각 계절, 각 지리학적 위치 및 평균 산출량 (bu/acre)을 테스트하는 각 필드 시험에서 테스트된 이벤트들의 작물 필드 시험의 메타 분석에서 대조군 A3555과 비교하였을 때, 이벤트 MON87751의 산출량이 통계학적으로 유의적으로 증가되었다는 것이 나타났다 (표 2). 오직 Cry2Ab 만을 발현시키는 이벤트들은 대조군 A3555와 비교하였을 때 산출량에서 통계학적으로 유의적인 차이는 없었다, 표 3 참고. 오직 Cry1A.105만을 발현시키는 이벤트들은 대조군 A3555와 비교하였을 때 산출량에서 통계학적으로 유의적인 감소가 있었다, 표 3 참고.
Figure pct00003
실시예 3
스크린하우스 봉입물 안에 포함된 인시목 해충 집단의 인위적인 감염에 대항하여 2개의 발현 카세트 (즉, Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두)를 가진 단일 구조체로부터 T-DNA 세그먼트 삽입에 의해 Cry 단백질 모두를 발현시키는, 또는 단일 Cry 단백질들 (즉, Cry2Ab 단독, 또는 Cry1A.105 단독)를 발현시키는 실험용 대두 이벤트의 효과를 평가하기 위하여 효과 스크린하우스 시험이 실행되었다. 단일- 내지 이중-유전자 이벤트의 비교를 이용하여 이중-유전자 발현 구조체 이벤트에서 관찰된 효과에 대한 각 단일 Cry 단백질의 상대적인 기여도를 결정하였다. 2군데 지리학적 위치에서 다수의 계절 동안 스크린하우스 시험이 실행되었다. 한 군데 지리학적 위치에서, 5가지 표적 해충 종이 테스트되었다: 안티카르시아 겜마탈리스 ( Anticarsia gemmatalis ) (벨벳빈 캐터필러, VBC), 크리소데이식스 인클루덴스 ( Chrysodeixis includens ) (대두 자벌레, SBL), 스포도프테라 에리다니아( Spodoptera eridania ) (남쪽 거염벌레, SAW), 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda) (밤나방과 나방, FAW), 및 헬리코베르파 지아 ( Helicoverpa zea ) (대두 뿌리혹선충, SPW). 제 2 지리학적 위치에서, 3가지 표적 해충 종이 테스트되었다: 크로시도세마 아포레마( Crocidosema aporema ) (콩 때리는 나방, BSM), 라취플루시아 누( Rachiplusia nu ) (해바라기 자벌레, SFL), 및 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) (밤나방과 나방, FAW).
이들 스크린하우스 시험에서 테스트된 이벤트 (즉, 목록)는 각각 별도 형질변환 구조체로 형질변환된 것으로부터 생성되었다. 구조체 1, 2, 또는 3으로부터 생성된 형질변환 이벤트들은 스크린하우스 시험에서 R2 세대에서 평가되었고, 두 단백질들 모두를 발현시키는 20개 이벤트 (구조체 1에 의한 형질변환에서 생성된 이벤트), Cry2Ab 만을 발현시키는 6개 이벤트 (구조체 2에 의한 형질변환에서 생성된 이벤트), 그리고 Cry1A.105 만을 발현시키는 6개 이벤트(구조체 3에 의한 형질변환에서 생성된 이벤트)가 포함되었다. 이들중, Cry2Ab 및 Cry1A.105 (구조체 1) 모두를 가진 12개 이벤트, Cry2Ab-단독 (구조체 2)을 가진 2개의 이벤트, 그리고 Cry1A.105-단독 (구조체 3)을 가진 3개의 이벤트는 스크린하우스 시험에서 R3 세대에서 평가되었다. Cry2Ab 및 Cry1A.105 (구조체 1) 모두를 가진 11개의 이벤트는 R4 세대 스크린하우스 시험에서 추가 평가되었다. Cry2Ab 및 Cry1A.105 (구조체 1) 모두를 가진 3개의 이벤트, Cry2Ab-단독 (구조체 2)을 가진 1개의 이벤트, 그리고 Cry1A.105-단독 (구조체 3)을 가진 1개의 이벤트는 R5, R6, 및 R7 스크린하우스 시험에서 평가되었다. Cry2Ab 및 Cry1A.105를 발현시키는 10개의 이벤트 (구조체 4로 형질변환에 의해 생성된 이벤트), 3개의 Cry2Ab-단독 이벤트 (구조체 5로 형질변환에 의해 생성된 이벤트), 그리고 3개의 Cry1A.105-단독 이벤트 (구조체 6으로 형질변환에 의해 생성된 이벤트)가 R3 세대 스크린하우스 시험에서 평가되었다. Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두를 가진 2개의 이벤트, Cry2Ab-단독을 가진 1개의 이벤트, 그리고 Cry1.105-단독을 가진 1개의 이벤트는 R4 스크린하우스 시험에서 평가되었고, 그리고 각 하나의 이벤트가 R5 스크린하우스 시험에서 평가되었다. 인헨서와 함께, 반대 5'에서 3' 방향으로 Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두를 발현시키는 3개의 이벤트 (구조체 8로 형질변환에 의해 생성된 이벤트), 인헨서 없이, 반대 5'에서 3' 방향으로 Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두를 발현시키는 3개의 무더기 이벤트(구조체 7로 형질변환에 의해 생성된 이벤트7), 그리고 2개의 Cry2Ab-단독 이벤트 (구조체 10에 의한 생성된 이벤트)는 R2 세대 스크린하우스 시험에서 평가되었다. 양성 유전자변형 대두 대조군은 MON87701 또는 이벤트 GM_A19478 (MON87701와 동시에 생성된)를 포함하며, 이 둘 모두 Cry1Ac를 발현시킨다. 비-유전자변형 대두 계통 A3555 (MON87751 이벤트의 부모 배경, 상대적 성숙도 3 (RM3)) 및 A5547 (MON87701의 부모 배경 및 GM_A19478, RM5)은 음성 대조군으로 모든 스크린하우스 및 필드 시험에 포함되었다. 비-유전자변형 대두 계통 AG3705은 일부 시험에서 흰 꽃 체크로써 포함되었다.
스크린하우스 시험을 설정 및 실행에 있어서 표준 관행을 준수하였다. 네가티브 체크에 대한 최대 손상 시점(번데기 후 보통 3-4주에 스크린하우스 안에 배치된다)에서 각 감염 후 한번 구획이 평가되었다. 각 평가 시, 다음의 작물 관찰이 기록되었다: 식물 성장일 및 단계. 추가적으로, 고엽(defoliating) 곤충의 경우, 각 구획에서 예상 고엽 비율이 기록되었다. C. 아포레마(C. aporema )의 경우, 각 구획에서 10개 식물이 무작위로 선택되고, 손상된 식물의 수가 기록되었다. 일부 경우, 살아있는 유충의 수 또한 기록되었다.
고엽 데이터는 ANOVA를 거쳐 계통 간의 유의적인 가변성 원천을 결정하고, 그리고 0.05 가능성 수준(P)에서 각 위치에서 각 곤충에 대해 모사되었다. 평균에서 유의적인 차이는 Tukey-Kramer 테스트 (Kramer 1956), P = 0.05를 이용하여 결정되었다.
감염을 위하여 R. 누(R. nu ) 및 C. 아포레마(C. aporema)를 이용하여 한 계정 동안, 두군데 지리학적 위치에서 3가지 소-구획 스크린하우스 시험이 실행되었다. 시험 기획에는 표 4에 나타낸 것과 같이, 이벤트와 함께 각 이벤트 또는 대조군 당 3회 리플레케이트(replicate)로 Randomized Complete Block Design (RCBD) 테스트 블록이 포함되었다. 한 시험은 대두 성장의 중간-식물생장 단계 동안, 그리고 대두 성장의 초기 번식 단계에 한 번 더 C. 아포레마(C. aporema )로 감염되었다. 2개 시험은 대두 성장의 중간-식물생장 단계 동안 R. 누(R. nu )로 감염되었다.
C. 아포레마 (C. aporema ) 시험의 경우, 상당한 압박(heavy pressure)이 이루어졌다. 리플리케이트는 손상에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만(F = 0.8794; df = 2, 69; P = 0.4196), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 11.9398; df = 23, 48; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 손상된 식물의 최대 비율(표 4)은 평균 83-100%이었지만, Cry1Ac 양성 대조군에서는 없었다. 형질변환 구조체 1로부터 생성되고, Cry2Ab 및 Cry1A.105를 발현시키는 이벤트는 0-13%의 손상된 식물을 나타내며, 한편 Cry2Ab-단독 또는 Cry1A.105-단독을 발현시키는 이벤트들은 차례로 10-17% 및 10-13%를 나타내었다. 이 시험에서 손상된 것으로 기록된, 비록 유의적이지만, 작은 수는 손상율을 기록할 때 개인들이 이용된 기준 때문일 수도 있다.
R. 누(R. nu ) 시험의 경우, 하나의 스크린하우스 시험에서 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 고엽에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만(F = 0.203; df = 2, 69; P = 0.8167), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 20.2461; df = 23, 48; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 고엽(표 4)은 평균 60-63%이었지만, Cry1Ac 양성 대조군과 형질변환 구조체 1 에서 생성된, Cry2Ab+Cry1A.105를 발현시키는 이벤트 또는 형질변환 구조체 2 에서 생성된, Cry2Ab-단독만을 발현시키는 이벤트에서는 없었다. 형질변환 구조체 3에서 생성된, Cry1A.105-단독을 발현시키는 이벤트들은 약간 더 높은 고엽(4-10%)을 나타내었다. R. 누(R. nu )를 평가하는 제 2 스크린하우스 시험에서 중간수준의 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 이들 시험에서 고엽에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.2542; df = 2, 69; P = 0.7763), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 16.1793; df = 23, 48; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 고엽(표 4)은 평균 38-40%이었지만, 그러나 Cry1Ac 양성 대조군 (4%)에서는 무시할 수준이었으며, 그리고 구조체 1에서 생성되고, Cry2Ab+Cry1A.105를 발현시키는 이벤트 또는 구조체 2에서 생성되고, Cry2Ab-단독을 발현시키는 이벤트에서는 없었다. 구조체 3에서 생성되고, Cry1A.105-단독을 발현시키는 이벤트들은 약간 더 높은 고엽을 나타내었다(2-7%).
이들 스크린하우스 시험에서, 대두 이벤트 MON87751는 해충, C. 아포레마(C. aporema) 또는 R. 누(R. nu )의 감염으로 인한 손상된 식물은 없었으며, 이는 동일한 시험의 대조군의 손상 및/또는 고엽과 비교하였을 때 유의적이었다 (표 4).
Figure pct00004
두 번째 지리학적 위치에서 실행된 후속 계절의 소-구획 스크린하우스 시험에서, 감염을 위하여 R. 누(R. nu ), C. 아포레마 (C. aporema ) 및 S. 프루기페르다 (S. frugiperda)의 지역 실험실 집단이 이용되었다. 상기 실험을 실행하기 위한 프로토콜은 기본적으로 상기에서 설명된 것과 같고, 표 5에 나타낸 테스트된 이벤트와 대조군이 이용되었다.
C. 아포레마(C. aporema)으로 감염된 시험의 경우, 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 손상에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.2742; df = 2, 33; P = 0.7619), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 8.2313; df = 11, 24; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 손상은 식물당 평균 4.2-5.5 손상점을 가졌으며, 식물의 80-100%가 손상을 나타내지만, 양성 대조군과 모든 테스트 이벤트에서는 무시할 수준이었다 (표 5).
R. 누(R. nu )로 감염된 시험의 경우, 중간 수준의 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 손상에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.041; df = 2, 33; P = 0.9599), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 143.5526; df = 11, 24; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 손상은 식물당 평균 33.3-40.0% 고엽이었지만(경제적 임계치 이상), 그러나 양성 대조군과 구조체 6으로 형질변환에 의해 생성되고, 단독 TIC105 만을 발현시키는 이벤트를 제외하고, 모든 테스트 이벤트에는 없거나 무시할 수준이었다(표 5).
S. 프루기페르다(S. frugiperda)로 감염된 시험의 경우, 가벼운 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 손상에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.1187; df = 2, 33; P = 0.8884), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 12.8602; df = 11, 24; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 손상은 식물당 평균 7.5-15.0% 고엽이으로, 딱 경제적 임계치에 이른다. 구조체 2 또는 구조체 5에 의해 형질변환에 의해 생성된 단독 Cry2Ab을 발현시키는 이벤트에서 일부 손상이 또한 기록되었지만, 그러나 양성 대조군 및 다른 모든 테스트 이벤트에서는 없거나 무시할 수준이었다(표 5).
이들 스크린하우스 시험에서, 대두 이벤트 MON87751은 해충, C. 아포레마(C. aporema), R. 누(R. nu ), S. 프루기페르다(S. frugiperda)의 감염으로 인한 손상된 식물은 없었으며, 이는 동일한 시험의 대조군의 손상과 비교하였을 때 유의적이었다 (표 5). 대두 이벤트 MON87751은 구조체 6으로 형질변환되고, Cry1A.105만을 발현시키는 유전자변형 대두 이벤트와 비교하였을 때, R. 누(R. nu )로 인한 손상은 상당히 적었지만 (표 5), 구조체 6으로 형질변환에 의해 생성된 이벤트에서 Cry1A.105 단백질의 발현은 더 적었다. 처음으로 이들 결과는 해충 S. 프루기페르다(S. frugiperda )의 확장된 대조군 범위를 나타낸다.
Figure pct00005
한 가지 소-구획 스크린하우스 시험은 H. 지아(H. zea)의 실험실 집단 감염을 이용하여 제 1 지리학적 위치에서 실행되었다. 시험 기획에는 표 6에 나타낸 것과 같이, 이벤트와 함께 각 이벤트 및 대조군 당 3회 리플레케이트(replicate)로 Randomized Complete Block Design (RCBD) 테스트 블록이 포함되었다. H. 지아(H. zea)의 2개 감염이 있었고, 고엽은 제 1 감염의 경우 감염 후 19-27 일 (대두 성장의 R2-R3 단계), 그리고 제 2 감염의 경우 감염 후 25-28 일 (대두 성장의 R5 단계)에 평가되었다. 해충, H. 지아(H. zea)를 테스트하는 스크린하우스 시험의 결과는 다음과 같다: 중간수준의 압박이 이루어졌다. 리플리케이트는 고엽에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.326; df = 2, 105; P = 0.7225), 이벤트는 매우 유의적이었다 (F = 13.8864; df = 35, 72; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 최대 고엽(표 6)은 평균32-33%이었지만, Cry1Ac 양성 대조군 (1%)과 구조체 1에서 생성되고, Cry2Ab+Cry1A.105를 발현시키는 이벤트(2-4%)에서는 무시할 수준이었다. 구조체 4에서 생성되고, Cry2Ab+Cry1A.105를 발현시키는 이벤트 (5-12%), 구조체 5에서 생성되고 Cry2Ab만을 발현시키는 이벤트 (13-17%) 또는 구조체 6에서 생성되고, 단독 Cry1A.105만을 발현시키는 이벤트 (8-12%)에서는 다소 더 높은 고엽이 관찰되었다.
동일한 시험에서 음성 대조군에 대한 손상과 비교하였을 때, 스크린하우스 시험에서 대두 이벤트 MON87751은 H. 지아 (H. zea ) 에 의한 손상이 상당히 더 적은 것으로 나타났다. H. 지아(H. zea )에 의한 대조군 수준은 이 대두 해충 종에 대한 대조군의 상업적으로 수용가능한 수준 범위 안에 있다. 추가적으로, 이 스크린하우스 시험에서, 대두 이벤트 MON87751은 구조체 5로 생성되고, 단독 Cry2Ab만을 발현시키는 유전자변형 대두 이벤트과 비교하였을 때, 상당히 적은 손상을 가지는데 (표 6), 대조군의 확장된 수준을 나타낸다. 그러나, Cry2Ab의 발현은 구조체 2에서 생성된 이벤트보다는 구조체 5에서 생성된 이벤트에서 더 낮았고, 구조체 5에서 생성되고, 단독 Cry2Ab만을 발현시키는 이벤트의 유의적인 고엽은 구조체 5로 생성된 이벤트에서 Cry2Ab로 인하여 H. 지아 (H. zea ) 에 대항하는 감소된 효과가 있음을 나타낼 수 있다.
Figure pct00006
제 1 지리학적 위치에서 실행된 또다른 계절의 소-구획 스크린하우스 시험에서 해충 S. 에리다니아(S. eridania ) (1st-영(instar) 또는 3rd-영(instar)), A. 겜마탈리스(A. gemmatalis) (1st-영(instar)), 및 C. 인클루덴스 (C. includens ) (1st-영(instar))의 실험실 집단으로부터 감염에 대한 저항성이 테스트되었다. 이들 시험 결과는 다음과 같다: 1st-영(instar) S. 에리다니아(S. eridania)에 의해 극단적 압박이 이루어졌으며, 그리고 A. 겜마탈리스(A. gemmatalis)에 의해 중간 수준의 압박이 이루어졌다. A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (1st-영(instar)) 및 S. 에리다 니아(S. eridania) (1st-영(instar)) 유충에 의한 최대 고엽 비율(평균 ± S.E.)은 표 7에서 보고된다.
Figure pct00007
C. 인클루덴스 (C. includens ) (1st-영(instar)) 및 S. 에리다니아(S. eridania) (3rd-영(instar))를 테스트하는 실험의 경우, 극단적 압박이 이들 두 해충에 대해 이루어졌다. 이들 인위적으로-감염된 스크린하우스에서 C . 인클루덴스 (C. includens ) (1st-영(instar)) 유충 및 S. 에리다니아 (S. eridania ) (3rd-영(instar)) 유충에 의한 최대 고엽 비율(평균 ±S.E.)은 표 8에서 보고된다.
Figure pct00008
이들 스크린하우스 시험의 결과에서 동일한 시험에서 음성 대조군에 대한 손상과 비교하였을 때, 대두 이벤트 MON87751은 S. 에리다니아 (S. eridania ) (1st-영(instar) 또는 3rd-영(instar)), A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (1st-영(instar)), 또는 C. 인클루덴스 (C. includens ) (1st-영(instar))에 의한 손상이 상당히 더 적은 것으로 나타났다(표 7 및 표 8). 추가적으로, 이들 스크린하우스 시험에서, Cry1Ac을 발현시키는 유전자변형 대두 이벤트와 비교하였을 때, 대두 이벤트 MON87751은 S. 에리다니아 (S. eridania ) (1st-영(instar) 및 3rd-영(instar)) 유충에 의한 손상이 상당히 더 적은 것으로 나타났으며(표 7 및 표 8), 인시목 해충 대조군에 대한 현재 이용가능한 유전자변형 대두 이벤트에 이벤트 MON87751의 확장된 성과를 설명한다. 더욱이, 이들 스크린하우스 시험에서, [1] 구조체 4, 5, 또는 6에 의해 생성된 임의의 이벤트(3rd-영(instar) 유충), 또는 구조체 6에 의해 생성된 이벤트, 단독 Cry1A.105 이벤트 (1st 영(instar) 유충), 또는 단독 Cry1A.105를 발현시키는 구조체 3에 의해 생성된 이벤트 (1st 영(instar) 유충 및 3rd-영(instar) 유충)과 비교하였을때, 그리고 [2] 구조체 7에 의해 생성되고, 인헨서 없이 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 발현시키는 이벤트 (1st 영(instar)- 및 3rd-영(instar) 유충)와 비교하였을 때, 대두 이벤트 MON87751은 S. 에리다니아 (S. eridania ) 유충에 의한 손상이 상당히 적었고, 이는 구조체 4, 5, 6, 또는 7에 의해 생성된 이벤트보다 이벤트 MON87751의 성과가 더 우위에 있음을 나타낸다 (표 7 및 표 8).
실시예 4
인시목 해충 집단의 자연 필드 감염에 대항하여, 실험용 대두 이벤트 MON87751과 상이한 형질변환 구조체 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 이용하여 생성된 이벤트의 효과를 평가하기 위하여 오픈 필드 효과 시험이 실행되었다. 구조체 2 또는 5 (Cry2Ab 단독 발현)로 생성된 이벤트, 및 구조체 3 또는 6 (Cry1A.105 단독 발현)으로 생성된 이벤트를 구조체 1 또는 4 (Cry1Ab 및 Cry1A.105 모두 발현)로 생성된 이벤트에 비교한 것을 이용하여, 단일 구조체로부터 Cry 단백질 모두(즉, Cry2Ab 및 Cry1A.105)를 발현시키는 이벤트에서 관찰되는 효과에 대한 각 단일 Cry 단백질 (즉 Cry2Ab 단독, 또는 Cry1A.105 단독)의 상대적인 기여를 결정하였다. 풍토성 대두 해충의 고유 집단의 효과 필드 시험은 세군데 지리학적 위치에서 다양한 계절에 걸쳐 다양한 필드 시험 지역에서 실시되었다.
한 군데 지리학적 위치에서 실행된 최초 효과 필드 시험에서, 평가된 이벤트 (즉, 참여목록)는 구조체 1에 의해 생성되고, Cry 단백질들, Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두를 발현시키는 12개 이벤트 (및 이벤트 MON87751 포함), 구조체 2에 의해 생성되고, 단독 Cry2Ab만을 발현시키는 2개의 이벤트, 그리고 구조체 3에 의해 생성되고, 단독 Cry1A.105만을 발현시키는 3개의 이벤트를 포함하였다. 제 2 지리학적 위치에서 실행된 최초 효과 필드 시험에서, 구조체 1, 2 및 3에 의해 생성된 이벤트가 평가되었고, 그리고 Cry 단백질들, Cry2Ab 및 Cry1A.105를 모두 발현시키는 11개의 이벤트 (구조체 1에 의한 형질변환에 의해 생성되고, 이벤트 MON87751을 포함하며), 단독 Cry2Ab만을 발현시키는 2개의 이벤트 (구조체 2로 형질변환에 의해 생성된 이벤트), 그리고 단독 Cry1A.105만을 발현시키는 3개의 이벤트 (구조체 2으로 형질변환에 의해 생성된 이벤트3)가 포함되었다. 제 3 지리학적 위치에서 두 번째 계절에서 실행된 효과 필드 시험에서, 평가된 이벤트 (즉, 참여목록)는 Cry 단백질들, Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두를 발현시키는 3개의 이벤트 (구조체 1에 의한 형질변환에 의해 생성된 이벤트와 이벤트 MON87751을 포함), 단독 Cry2Ab만을 발현시키는 1개의 이벤트 (구조체 2로 형질변환에 의해 생성된 이벤트), 그리고 단독 Cry1A.105만을 발현시키는 1개의 이벤트 (구조체 3으로 형질변환에 의해 생성된 이벤트)가 포함되었다. 개방 필드 효과 시험에서 평가된 이벤트는 R3부터 R7까지의 세대가 포함되었다.
각 효과 필드 시험 부위에서, 테스트 블록이 심어졌고, 표적 인시목곤충 곤충의 고유 해충 집단에 의한 자연적 감염이 일어나도록 허용되었다. 상기 테스트 블록은 표적 해충 (인시목)에 대한 살충제로 처리되지 않은 상태로 유지되었다. 그러나, 비-표적 해충에 의한 유의적인 손상을 방지하기 위하여 테스트 블록들에 분무될 수 있다. 모든 실험 이벤트는 상대적 성숙도 군 3 (RM3)의 대두 생식질 배경 A3555를 가진다. 상기 시험에 다른 참여목록에는 양성 대조군 MON87701 (Cry1Ac를 발현) 또는 GM_A19459 (RM5); 네가티브 부모계 체크 A3555 (자색 꽃, RM3); 그리고 네가티브 상업적 체크 A5547 (흰 꽃, MG5) 또는 CMA5805 (흰 꽃, RM5)가 포함되었다.
개방 필드 효과 시험의 설정 및 실행에 있어서 표준 관행을 준수하였다. 인시목 해충의 유충 발생률, 고엽, 및 식물 성장 단계는 주기적으로 기록되었는데 (즉, 5-14일 마다), 기록은 표적 인시목곤충 활성의 개시에서 시작되어, 표적 인시목곤충 활성이 중단될 때 또는 식물이 성장의 R7 단계에 이를때 종료된다. 산출량 데이터를 위하여 수집되는 2 및 3열에서 식물 손상을 회피하기 위하여, 해충 발생율 데이터는 1 및 4열에서만 수집되었다. 해충 발생율 데이터의 모니터 및 기록은 다음과 같다: 고엽 인시목곤충 (즉, A. 겜마탈리스(A. gemmatalis ), C. 인클루덴스 (C. includens ), R. 누(R. nu ), 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp.)은 내려받이 천(drop cloth) 또는 버티칼 비팅 쉬트(vertical beating sheet)를 이용하여 모니터되었는데, 구획당 최소한 2개의 내려받이 천 또는 4개의 버티칼 비팅 쉬트 샘플링이 이용된다. 각 구획 안에 접하게 되는 각 표적 종의 전체 유충 수와 샘플링 수는 접하게 되는 각 표적 종에 대하여 m 열(row) 당 평균 유충의 수(전체 유충의 수 ÷ 샘플링 수 ÷ 천/쉬트의 길이, 미터)로 기록되었다. 각 구획의 동일한 지역에 반복 샘플링을 피하는 방식으로 후속 샘플링이 실행되었다. 한 군데 지리학적 위치에서 실행된 효과 필드 시험에서, 20개 또는 33개 식물/위치를 무작위로 선택하고, 유충 먹이 손상 수를 기록함으로써, H. 지아(H. zea)에 의한 손상 기회에 대하여 2개의 시험 지역에서 데이터가 또한 기록되었다. 제 2 지리학적 위치에서, 구획당 10개 식물을 무작위로 선별하고, 한 식물당 꼬투리의 총 수와 손상된 꼬투리 수를 기록함으로써, H. 지아(H. zea)에 대한 실험이 기회적으로 등급화되었다.
엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)에 의한 감염 데이터는 유충 먹이로 인한 손상(시듬, 마름, 또는 죽음)이 있는 식물 전체 수를 헤아려 기록되었다. 이 곤충에 대한 손상 데이터는 최대 손상이 기록된 단일 시험에서 취한 것이었다.
표적 해충에 추가적으로, 비-표적 해충들, 주로 경제적 임계치를 능가할 가능성이 있는 것들(가령, 방귀벌레)은 테스트 블록 안에 무작위로 선택된 위치에서 포충망, 변형된 포충망, 또는 바닥에 까는 천을 이용하여 주기적으로 감시되었고, 이들이 경제적 손상 수준에 도달했는지, 또는 이 수준에 접근하는지를 평가하였다.
만기 시험(trial maturity)에서, 각 구획의 2와 3열 전체 길이가 수확되었고, 각 구획의 총 중량 및 수분도가 기록되었다. 수확하는 동안 수확된 열에서 상당한 틈(식물이 서로 맞 닿이지 않도록)이 주지되었고, 이들 틈의 총 길이가 기록되었다. 산출량은 종자 중량을 13% 수준으로 교정한 후 산출되었다. 유충 발생율, 고엽, 및 산출량 데이터는 ANOVA를 거쳐 계통 간의 유의적인 가변성 원천을 결정하고, 그리고 0.05 가능성 수준(P)에서 각 위치에서 모사되었다. 평균에서 유의적인 차이는 Tukey-Kramer 테스트 (Kramer 1956), P = 0.05를 이용하여 결정되었다.
필드 시험 지역 1에서 실행된 개방 필드 시험에서, 고엽 모충은 성장의 R3 단계에서 처음으로 대면되었고, 성장 R6 단계까지 중간정도의 손상 수준으로 증가되었다. 대면된 종은 A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (98%), R. 누(R. nu ) (2%) 및 스포도프테라( Spodoptera ) spp (1%)을 포함하였다. 리플리케이트는 유충 발생율에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.0435; df = 2, 57; P = 0.9575), 고엽 (F = 0.0807; df = 2, 57; P = 0.9226) 또는 산출량 (F = 0.0213; df = 2, 57; P = 0.979), 이들 세 가지 모두의 경우에 이벤트는 매우 유의적이었다(유충 발생율: F = 69.6956; df = 19, 38; P < 0.0001; 고엽: F = 25.9918; df = 19, 40; P < 0.0001; 산출량: F = 3.357; df = 19, 38; P = 0.0007). 누적 유충 발생율 (표 9)은 네가티브 체크에서 m 열당 139-189마리 유충에 이르고, 임의의 상기 유전자변형 참여목록에서 유충은 실질적으로 대면되지 않았다. 네가티브 체크에서 최대 고엽 (표 9)은 평균 21-27%이었고, 모든 유전자변형 참여목록에서는 없었다. 산출량은 모든 유전자변형 참여목록에 비교하여 네가티브 체크에서 감소되었지만 (표 9), 산출량에서 가변성은 이들 감소의 유의성을 감소시켰다.
비-유전자변형 대조군과 비교하였을 때, 이벤트 MON87751은 고엽 인시목곤충 유충의 상당히 더 낮은 발생율을 보유하였고 (계절 누적), 그리고 상당히 더 낮은 고엽율(계절 최대)을 보유하였다.
Figure pct00009
필드 시험 지역 2에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 고엽 모충은 성장의 식물생장 후기에 처음 대면되었고, 성장 R3 단계까지 높은 손상 수준으로 증가되었다. 대면된 종은 A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (53%), "자벌레" (아마도 C. 인클루덴스(C. includens), 그러나 R. 누(R. nu ) 가능성도 있음) (44%) 및 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp. (3%)를 포함하였다. 리플리케이트는 유충 발생율에서 유의적인 가변성 원천은 아니었지만 (F = 0.0085; df = 2, 57; P = 0.9915) 또는 고엽 (F = 0.0027; df = 2, 57; P = 0.9973), 이들 두 가지 경우에 이벤트는 매우 유의적이었다(유충 발생율: F = 19.644; df = 19, 40; P < 0.0001; 고엽: F = 671.3147; df = 19, 40; P < 0.0001). 누적 유충 발생율 (표 10)은 네가티브 체크에서 m 열당 43-50마리 유충에 이르고, 유전자변형 참여목록에서는 무시할 수준이 대면되었다. 네가티브 체크에서 최대 고엽 (표 10)은 평균 87-90%이었고, 모든 유전자변형 참여목록에서는 미미한 수준 이상이 관찰되지는 않았다.
비-유전자변형 대조군과 비교하였을 때, 이벤트 MON87751은 고엽 인시목곤충 유충의 상당히 더 낮은 발생율을 보유하였고 (계절 누적), 그리고 상당히 더 낮은 고엽율(계절 최대)을 보유하였다
Figure pct00010
필드 시험 지역 3에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 리플리케이트는 식물 또는 산출량 당 (F = 0.2221; df = 2, 24; P = 0.8025) 총 꼬투리(F = 0.312; df = 2, 24; P = 0.7349) 또는 손상된 꼬투리(F = 0.0438; df = 2, 24; P = 0.9572)의 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 그러나, 이벤트는 산출량이 아닌 식물당(F = 0.6237, df = 8, 18, P = 0.7475)당 총 꼬투리(F = 4.3643; df = 8, 18; P = 0.0045) 및 손상된 꼬투리(F = 34.5288; df = 8, 18; P < 0.0001)에서 유의적인 가변성 원천이었다. 네가티브 체크는 30.8-31.0%의 손상된 꼬투리를 가진 식물 당 평균 25.0-26.0 꼬투리이며, 한편 이벤트 MON87751이 포함된 테스트 이벤트는 <2%의 손상된 꼬투리를 가진 식물 당 평균 28.9-38.9 꼬투리를 가진다 (표 11). 네가티브 체크에서 식물당 꼬투리의 감소된 수는 뿌리혹선충 손상에 의해 야기되는 미숙한 꼬투리 절단 결과로 인한 가능성이 있는데, 그 이유는 네가티브 체크에서(테스트 이벤트에서는 아님) 식물 아래 땅에 다수의 손상된 꼬투리가 놓여 있는 것이 관찰되었다 (표 11).
Figure pct00011
필드 시험 지역 4에서 실행된 개방 필드 시험에서, 고엽 모충은 성장의 R3 단계에서 처음으로 대면되었고, 성장 R6-R7 단계까지 높은 손상 수준으로 증가되었다. 대면된 종은 A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (77%), 플라티페나 스카브라 ( Plathypena scabra ) (녹색 클로버웜) (17%), 및 C. 인클루덴스 (C. includens ) (6%)을 포함하였다. 리플리케이트는 유충 발생율 (F = 0.0219; df = 2, 69; P = 0.9783), 고엽 (F = 0.0007; df = 2, 69; P = 0.9993), 또는 산출량 (F = 1.1477; df = 2, 69; P = 0.3233)에서 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 이벤트는 3가지 모두(유충 발생율: F = 96.9673; df = 23, 48; P < 0.0001; 고엽: F = 363.8854; df = 23, 48; P < 0.0001; 산출량: F = 1.7814; df = 23, 48; P = 0.046)에서 유의적이거나, 매우 유의적이었다. 누적 유충 발생율 (표 12)은 네가티브 체크에서 m 열당 117-123마리 유충에 이르고, 임의의 상기 유전자변형 참여목록에서 유충은 실질적으로 대면되지 않았다. 네가티브 체크에서 최대 고엽 (표 12)은 평균 68-83%이었고, 이벤트 MON87751이 포함된 모든 유전자변형 참여목록에서는 없었다.
Figure pct00012
필드 시험 지역 5에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 고엽 모충은 성장의 R2 단계에 처음 대면되었고, 성장 R5-R6 단계 동안 높은 손상 수준으로 증가되었다. 대면된 종은 A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (93%), C. 인클루덴스 (C. includens ) (5%), 및 스포도프테라 오르니토갈리 ( Spodoptera ornithogalli ) (2%)을 포함하였다. 리플리케이트는 유충 발생율 (F = 0.0206; df = 2, 69; P = 0.9796), 고엽 (F = 0.0054; df = 2, 69; P = 0.9946), 또는 산출량 (F = 0.2379; df = 2, 69; P = 0.7889)에서 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 이벤트는 3가지 모두 (유충 발생율: F = 122.46; df = 23, 48; P < 0.0001; 고엽: F = 623.0217; df = 23, 48; P < 0.0001; 산출량: F = 2.9366; df = 23, 48; P = 0.0008)에서 유의적이었다. 누적 유충 발생율 (표 13)은 네가티브 체크에서 m 열당 76-137마리 유충에 이르고, 임의의 상기 유전자변형 참여목록에서 유충은 실질적으로 대면되지 않았다. 네가티브 체크에서 최대 고엽 (표 13)은 평균 82-88%이었고, 이벤트 MON87751이 포함된 모든 유전자변형 참여목록에서는 없었다.
Figure pct00013
필드 시험 지역 6에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 고엽 모충 (주로 H. 지아(H. zea ) 및 C. 인클루덴스 (C. includens ))은 성장의 R6 단계 동안에 대면되었지만, 상당한 유의적인 수에 이르지는 않았다. 그러나, 경계, 완충대 및 네가티브 체크에서 E. 링노셀루스(E. lignosellus)에 의한 식물의 실질적인 손상은 계절 초기에 발생되었고, 손상 데이터가 기록되는 성장의 R5-R6 단계까지 식물이 시듬, 마름, 및 죽음에 이르게 된다. 리플리케이트는 E. 링노셀루스 (E. lignosellus ) 에 의해 손상된 식물의 유의적인 원천은 아니었다(F = 0.3431; df = 2, 69; P = 0.71). 이벤트는 E. 링노셀루스(E. lignosellus )에 의해 손상된 식물에 매우 유의적이었다: F = 16.7555; df = 23, 48; P < 0.0001). 네가티브 체크에서 E. 링노셀루스(E. lignosellus)에 의해 손상된 식물의 비율 (표 14)은 평균 10-28%이었고, 한편 이벤트 MON87751이 포함된 임의의 유전자변형 참여목록에서 손상을 나타내는 식물은 없었다.
Figure pct00014
필드 시험 지역 7에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 고엽 모충은 성장의 R1-R2 단계에 처음 대면되었고, 성장 R4-R6 단계 동안 높은 손상 수준으로 증가되었다. 대면된 종은 C. 인클루덴스 (C. includens ) (54%), 스포도프테 라 엑시구아 ( Spodoptera exigua ) (43%), 및 에스티그메네 아크레아( Estigmene acrea) (2%)을 포함하였다. 리플리케이트는 유충 발생율 (F = 0.0866; df = 2, 69; P = 0.9172), 또는 고엽 (F = 0.1129; df = 2, 69; P = 0.8934)에서 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 이벤트는 이 둘 모두에 대해 (유충 발생율: F = 69.918; df = 23, 48; P < 0.0001; 고엽: F = 21.6603; df = 23, 48; P < 0.0001) 상당히 유의적이었다. 누적 유충 발생율 (표 15)은 네가티브 체크에서 m 열당 152-166 마리 유충에 이르고, 한편 Cry1 Ac 대조군 또는 구조체 1, 2, 또는 3에서 생성된, Cry2Ab 및/또는 Cry1A.105를 발현시키는 이벤트에서 유충은 실질적으로 대면되지 않았다. 네가티브 체크에서 최대 고엽 (표 15)은 평균 24% 이었으나, 구조체 1, 2, 또는 3에서 생성되고, Cry2Ab 및/또는 Cry1A.105를 발현시키는, 이벤트 MON87751이 포함된 이벤트 또는 Cry1Ac 양성 대조군에서는 미미한 수준을 초과하지 않았다.
Figure pct00015
필드 시험 지역 8에서 실행된 또다른 개방 필드 시험에서, 고엽 모충 C. 인클루덴스(C. includens ) (41%), A. 겜마탈리스 (A. gemmatalis ) (38%), S. 프루기페르다 (S. frugiperda ) (13%) 및 S. 오르니토갈리(S. ornithogalli ) (8%)에 의한 중간 수준의 압박이 성장 R4-R6 단계에서 발생되었다. 리플리케이트는 유충 발생율 (F = 0.0924; df = 3, 52; P = 0.9639), 또는 고엽 (F = 0.372; df = 3, 52; P = 0.7735)에서 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 이벤트는 유충 발생율 (F = 40.008, df = 13, 42, P < 0.0001) 및 고엽 (F = 11.9356, df = 13, 42, P < 0.0001)에서 유의적인 가변성 원천이었다. 네가티브 체크에서 누적 유충 발생율은 m 열당 평균 9.1-13.9 마리 유충이며, 최대 고엽은 31-35% (후자는 다소 경제적 임계치 이상)이었지만, 양성 대조군 및 이벤트 MON87751이 포함된 모든 테스트 이벤트에서는 미미한 정도를 초과하지 않았다 (표 16). 시험에서 비-표적 해충의 유의적인 발생에 대한 기록은 없었다.
Figure pct00016
필드 시험 지역 6에서 실행된 제 2 계절의 개방 필드 시험 동안 H. 지아(H. zea)에 의한 상당한 압박이 성장 R3-R5 단계 동안 발생되었다. 리플리케이트는 손상된 꼬투리 (F = 0.0280; df = 3, 52; P = 0.9936)에서 유의적인 가변성 원천은 아니었다. 이벤트는 손상된 꼬투리 (F = 15.4758, df = 13, 42, P < 0.0001)에서 유의적인 가변성 원천이었다. 네가티브 체크에서 평균 64-78% 손상된 꼬투리가 있었지만, 이벤트 MON87751이 포함된 테스트 이벤트중 임의의 것에서 실질적인 손상이 발생되지 않았다 (표 17).
Figure pct00017
다수의 스크린하우스 시험의 결과들 (실시예 3에서 설명됨)과 복합된, 본 실시예에서 설명된 다수의 개방 필드 시험 결과는 식물의 5세대(R2에서 R7에 이르는)에서 구조체 1, 2 또는 3에 의해 생성된 유전자변형 대두 이벤트에 의해 대면되는 모든 인시목곤충 대두 해충의 유충 집단의 효과적인, 계절-지속적인 억제를 더 확인시키고, 이는 세대 안에서 그리고 세대를 지나 안정적인 이식유전자 발현을 암시한다.
복합 결과에서, 한 군데 지리학적 위치에서 표적 해충 (안티카르시아 겜마탈리스( Anticarsia gemmatalis ) 및 크리소데이식스 인클루덴스( Chrysodeixis includens ) 와 두번째 지리학적 위치에서 동일한 표적 해충에 더하여 라취플루시아 누( Rachiplusia nu ) 및 크로시도세마 아포레마( Crocidosema aporema)의 4가지 모든 주요 표적 해충에 의한 상기-임계 압박 조건하에 이벤트 MON87751이 포함된 구조체 1, 2 또는 3에 의해 생성된 유전자변형 이벤트에 의한 효과는 Cry1Ac를 발현시키는 유전자변형 이벤트와 이미 설명된 대두의 대조군 인시목 해충에 대등하였다. 구조체 2 또는 3으로부터 생성되고, 각각 차례로 단독 Cry2Ab 단백질 또는 단독 Cry1A.105 단백질을 발현시키는 이벤트 또한 Cry1Ac 단백질을 발현시키는 유전자변형 이벤트에 대등한 효과를 나타내는데, 이벤트 MON87751에서 Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들 모두의 발현으로 개선된 곤충 저항성 관리를 통하여 Cry1Ac 유전자변형 이벤트보다 개선된 내구성을 가질 것이 암시된다.
3가지 종의 거염벌레 (스포도프테라 엑시구아 ( Spodoptera exigua ), S. 프루기페르다(S. frugiperda ) 및 S. 에리다니아 (S. eridania )), 2가지 헬리오틴 뿌리혹선충 (헬리코베르파 지아( Helicoverpa zea ) 및 H. 겔로토페온 (H. gelotopeon )), 한 가지 스톡보링(stalkboring) 곤충 (엘 라스모팔푸스 리그노셀루스 ( Elasmopalpus lignosellus )) 및 한 가지 식엽충 (플라티페나 스카브라( Plathypena scabra ))이 포함된 다수의 2차 표적에 대하여 이벤트 MON87751이 포함된 구조체 1로 만들어진 이벤트들 간에 등가의 효과 또한 나타내었다.
실시예 5
본 실시예는 단백질 발현 및 방대한 분자 특징화가 포함된, 이벤트 MON87751의 분자 특징화를 설명한다. 이러한 분자 특징화는 작물 필드 시험, 효과 스크린하우스 시험, 및 효과 필드 시험에서 테스트되었는 이벤트에서 동시에 완성되었다.
이벤트 MON87751의 분자 특징화를 위하여, 이식유전자 삽입 서열 (Cry2Ab 및 Cry1A.105 카세트 모두를 포함, 서열 번호:9)의 복사체 수는 Southern 분석 및 종점 TAQMAN® 분석 조합을 이용하여 결정되었다. 분자 분석에서 오직 단일 삽입 (서열 번호:9로 나타내며, Cry2Ab 및 Cry1A.105 단백질들 모두에 대한 발현 카세트를 포함하는 T-DNA 발현 카세트)만 있고, 벡터 백본의 탐지도 없으며, 그리고 선별/채점가능한 표지 서열들이 포함된 T-DNA 카세트의 탐지도 없음이 확인되었다. 이벤트 MON87751 게놈 DNA에서 단일 삽입 (서열 번호:9)의 온전한 서열에서 상기 서열은 형질변환 구조체의 서열과 동일함이 확인되었다.
단백질 발현의 경우, 이벤트 MON87751 대립유전자에 대한 동종접합성 식물로부터 잎 시료를 수거하였고, 그리고 동결건조된 시료로부터 추출물을 준비하였고, Cry2Ab 또는 Cry1A.105에 차례로 특이적인 항체를 이용하여 Cry2Ab 또는 Cry1A.105의 단백질 수준을 측정하는 표준 프로토콜에 따라 ELISAs가 실행되었으며, 그 결과는 백만분율(ppm)로 나타내었다. 구조체 1, 2 또는 3에 의한 형질변환에 의해 생성된 이벤트와 비-유전자변형 대조군 A3555에 대한 식물 성장의 R1 및 R3 단계에서 잎 시료들이 수집되었다. ELISA 결과에서 구조체 1 및 구조체 2에서 생성된 이벤트의 Cry2Ab 수준은 건중량의 약 20 ppm 내지 약 50 ppm이었음이 나타났고, 예외적으로 이벤트 8 (링크된 바이러스성 프로모터를 보유하지만, 선택성/채점가능한 표지 T-DNA로부터 다른 서열이 포함되지 않은 것으로 판단되며, 이벤트 8은 더 이상 평가되지 않음), 그리고 구조체 3으로 생성된 이벤트(Cry1A.105 만을 발현시킴) 또는 비-유전자변형 대조군에서는 Cry2Ab 발현이 없었다 (도 3a). 더욱이, R1 및 R3 성장 단계 동안 Cry2Ab 단백질 발현 수준은 대체적으로 대등하였다. ELISA 결과에서 구조체 1 및 구조체 3에서 생성된 이벤트의 Cry1A.105 수준은 건중량의 약 150 ppm 내지 약 800 ppm이었음이 나타났고, 구조체 2로 생성된 이벤트(Cry2Ab 만을 발현시킴) 또는 비-유전자변형 대조군에서는 Cry1A.105 발현이 없었다(도 3b). 더욱이, R1 성장 단계와 비교하였을 때, R3 성장 단계에서 잎 시료의 경우 Cry1A.105 단백질 발현 수준이 더 높은 범위에 있었다.
추가적인 ELISA 결과에서 구조체 1로 만들어진 이벤트의 Cry2Ab 단백질 수준은 구조체 5 또는 구조체 4로부터 생성된 이벤트와 비교하여 더 높았으며, 그리고 예상한 바와 같이, 비-유전자변형 대조군 또는 구조체 6으로 만들어진 이벤트 (Cry1A.105 만을 발현시킴)에서는 Cry2Ab가 탐지되지 않은 것을 보여준다 (도 4a). 동일한 세트의 잎 시료에서, ELISA 결과에서 구조체 1로 만들어진 이벤트의 경우 Cry1A.105의 발현이 2배 또는 더 높았고, 구조체 6 또는 구조체 4로 만들어진 이벤트와 비교하였을 때, MON87751의 경우 대략 4배 더 높았고, 그리고 예상한 바와 같이, 비-유전자변형 대조군 또는 구조체 5로 만들어진 이벤트 (Cry2Ab 만을 발현시킴)에서는 Cry2Ab가 탐지되지 않은 것을 보여준다 (도 4b). 이들 ELISAs를 위하여, 2군데 별도 효과 스크린하우스 시험 위치 각각에서 성장된 식물의 성장 R3 단계로부터 잎 시료들이 수거되었다.
더욱이 ELISA 결과에서 구조체 1에서 생성된 이벤트, 그리고 구조체 2로 생성된 이벤트의 추출물 안에 Cry2Ab 단백질 수준은 a) 구조체 4, 구조체 5, 또는 구조체 7로부터 생성된 이벤트와 비교하여 더 높았고; b) 구조체 9, 또는 구조체 11로 생성된 이벤트와 비교하여 대략 동일하거나 또는 다소 더 낮았고; 그리고 c) 비-유전자변형 대조군 (나타내지 않음) 또는 구조체 3 또는 구조체 6으로 생성된 이벤트 (Cry1A.105 만을 발현시킴)의 경우 Cry2Ab는 탐지되지 않았음을 보여준다 (도 5). 이러한 ELISAs를 위하여, 성장의 R3 및 R5 단계에서 잎 시료가 수거되었고, 구조체 1 및 구조체 2로부터 생성된 이벤트의 경우 R5 성장 단계에서 Cry2Ab 수준이 더 높았고, Cry2Ab 수준은 구조체 9, 및 구조체 11로 부터 생성된 이벤트에서 더 높았다 (도 5). 동일한 세트의 잎 시료에서, ELISA 결과에서 구조체 1 및 3으로 만들어진 이벤트의 경우 Cry1A.105 단백질 수준은 구조체 4, 구조체 6, 구조체 9 또는 구조체 7로 만들어진 이벤트보다 상당히 더 높았고, 그리고 예상한 바와 같이, 비-유전자변형 대조군 (나타내지 않음) 또는 구조체 2 또는 구조체 5로 만들어진 이벤트 (Cry2Ab 만을 발현시킴)에서는 Cry2Ab가 탐지되지 않은 것을 보여준다 (도 6). 이러한 ELISAs를 위하여, 성장의 R3 및 R5 단계에서 잎 시료가 수거되었고, 그리고 Cry1A.105 수준은 구조체 4, 구조체 6, 구조체 9 또는 구조체 7로부터 생성된 이벤트와 비교하여 구조체 1 및 3으로부터 생성된 이벤트의 경우 R5 성장 단계에서 몇 자리수 더 높았다, 도 6a Y-축 0 - 5000 ppm 건중량에 대해 플롯팅됨, 도 6b Y-축 0-500 ppm 건중량에 대해 플롯팅됨. ELISA 데이터에서 구조체 4, 구조체 7 또는 구조체 9로 생성된 이벤트와 비교하여 구조체 1로 생성된 이벤트에서 Cry2Ab 및 Cry1A.105 모두의 발현이 더 높았음을 나타내며, 이들 구조체들은 모두 2개의 Cry 단백질 발현 카세트 - 하나의 발현 카세트는 Cry2Ab를 인코드하고, 다른 하나의 발현 카세트는 Cry1A.105를 인코드한다-를 보유한다. 추가적으로, 구조체 1 (이벤트 MON87751을 포함), 구조체 2, 및 구조체 3으로 생성된 이벤트에서 상대적으로 높은 단백질 발현은 대두의 최소한 4 세대 (R0, R1, R2, 및 R3)에 걸쳐 안정적이었으며, 동종접합성 이벤트로부터 수거된 잎 조직의 성장 R3 내지 R5 단계에서 Cry1A.105 단백질 수준은 증가되었다.
실시예 6
본 실시예는 대두 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA의 존재를 확인하는데 유용한 방법들을 설명한다. PCR 프라이머 및 프로브 쌍은 게놈 DNA와 이벤트 MON87751의 삽입된 DNA의 임의적으로 할당된 3 말단 사이에 형성된 독특한 졍션(즉, 3' 졍션)을 식별해내는 목적으로 기획되었고, 서열 번호:10, 서열 번호: 8, 서열 번호:2, 서열 번호:4, 또는 서열 번호:6이 포함되었다.
올리고뉴클레오티드 포워드 프라이머 SQ20267의 서열 (서열 번호:11)은 서열 번호:10의 위치 11400 에서부터 11426까지, 그리고 서열 번호:8의 위치 212 에서부터 238까지, 그리고 서열 번호:9의 위치 10066 에서부터 10092까지에 상응하는 뉴클레오티드 서열과 동일하다. 올리고뉴클레오티드 리버스 프라이머 SQ25826의 서열 (서열 번호:12)은 서열 번호:10의 위치 11454 에서부터 11479 까지, 그리고 서열 번호:8의 위치 266 에서부터 291까지, 그리고 서열 번호:6의 위치 51 에서부터 76까지, 그리고 서열 번호:4의 위치 31 에서부터 56까지에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 역 보체와 동일하다. 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10263의 서열 (서열 번호:13)은 서열 번호:10의 위치 11428 에서부터 11446까지, 그리고 서열 번호:9의 위치 10094 에서부터 10112 까지, 그리고 서열 번호:8의 위치 240 에서부터 258 까지, 그리고 서열 번호:6의 위치 25 에서부터 43까지, 그리고 서열 번호:4의 위치 5 에서부터 23 까지에 상응하는 뉴클레오티드 서열과 동일하다. PCR 프라이머 SQ20267 (서열 번호:11) 및 SQ25826 (서열 번호:12)은 이벤트 MON87751의 우측 졍션에서 독특한 게놈/삽입 DNA의 80개 뉴클레오티드 엠플리콘을 증폭시킨다. 형광에 의해 라벨(가령, 6FAM™ 형광 라벨)될 수 있는 프로브 PB10263 (서열 번호:13)와 함께 동일한 프라이머 쌍을 Endpoint TaqMan® PCR 분석에 이용하여, 시료 안에 이벤트 MON87751로부터 유도된 DNA 존재를 확인할 수 있다.
SQ20267 (서열 번호:11), SQ25826 (서열 번호:12) 및 PB10263 (서열 번호:13)에 추가적으로, 다른 프라이머 및/또는 프로브를 기획하여 시료 안에서 이벤트 MON87751로부터 유도된 DNA에 독특하고, 이의 탐지에 유용한 서열 번호:10 안에 서열을 증폭 및/또는 혼성화시키는 것 또한 당업자에게 자명할 것이다.
표준 분자 생물학 실험실 관례에 따라, 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA를 탐지하기 위하여 이벤트 식별용 PCR 분석이 개발되었다. 표준 PCR 분석 또는 TaqMan® PCR 분석의 매개변수들은 시료 SQ20267 (서열 번호:11), SQ25826 (서열 번호:12) 및 PB10263 (서열 번호:13) 안에 이벤트 MON87751로부터 유도된 DNA 존재를 탐지하는데 이용된 각 프라이머 쌍 및 프로브(즉 형광 테그, 이를 테면 6FAM™으로 라벨된 프로브)에 의해 최적화되었다. PCR 반응을 위한 대조군은 대두 게놈 안의 단일 복사체 유전자에 특이적인, 내부 대조군 프라이머와 내부 대조군 프로브 (가령, VIC™-라벨된)를 포함하였다. 당업자는 대두 게놈 안에 단일 복사체 유전자에 특이적인 프라이머를 어떻게 기획하는지 알 것이다. 일반적으로, 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA의 탐지를 위하여 최적화되는 매개변수에는 프라이머 및 프로브 농도, 주형 DNA의 양, 그리고 PCR 증폭 사이클링 매개변수들이 포함되었다. 주형 DNA 시료 및 대조군은 다음과 같다: [1] 분석되는 잎 시료 또는 단일 종자 시료로부터 추출된 DNA; [2] 음성 대조군 DNA (비-유전자변형 대두 DNA); [3] 음성 물 대조군 (주형 없음); 및 [4] 양성 대조군 MON87751 DNA. 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA를 식별해내는 엠플리콘을 만드는 당업자에게 공지된 다른 방법들 또한 당기술 분야 안에 있다.
이벤트를 포함하는 식물이 이벤트 DNA에 대하여 염색체 쌍의 각 염색체에서 동일한 위치에 외생 DNA를 포함하는 동종접합성인지; 이벤트 DNA에 대하여 염색체 쌍의 오직 하나의 염색체에 외생 DNA가 포함된 이종접합성인지; 또는 이벤트 DNA가 없는, 즉 야생형인지를 결정하는데 접합자 분석이 유용하다. 종점 TAQMAN® 열 증폭 방법을 이용하여 이벤트 MON87751에 대한 접합자 분석이 개발되었다. 이 분석을 위하여, 3개의 프라이머와 2개의 프로브가 분석용 시료에 혼합되었다. 3개의 프라이머는 다음과 같다: SQ20267 (서열 번호:11)-삽입된 외생 DNA의 3' 영역에 혼성화되고, 이로부터 특이적으로 연장됨; 프라이머 SQ27115 (서열 번호:14)-삽입된 외생 DNA의 3' 측면에 있는 대두 게놈 DNA에 혼성화되고, 이로부터 연장됨; 그리고 프라이머 SQ26901 (서열 번호:15)-삽입된 외생 DNA의 5' 측면에 있는 대두 게놈 DNA에 혼성화됨. 주형 DNA 안에 존재하는 삽입된 외생 DNA, 즉, 이벤트 MON87751가 있을 때, 프라이머 SQ20267 및 SQ27115 그리고 프로브 PB10263 (서열 번호:13) (6-FAM™-라벨된)는 진단적이다. 게놈 DNA 안에 존재하는 삽입된 외생 DNA의 복사체가 없을 때, 즉 야생형일 때, 프라이머 SQ26901 및 SQ27115 그리고 프로브 PB11254 (서열 번호:16) (VIC™-라벨된)는 진단적이다. PCR 반응에서 3개의 프라이머와 2개의 프로브는 이벤트 MON87751에 동종접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 혼합되고, 6-FAM™-라벨된 프로브 PB10263에서만 형광 신호가 있으며, 이는 이벤트 MON87751에 동종접합성인 식물에 대한 진단을 나타낸다. PCR 반응에서 3개의 프라이머와 2개의 프로브는 이벤트 MON87751에 이종접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 혼합되고, 6-FAM™-라벨된 프로브 PB10263 및 VIC™-라벨된 프로브 PB11254 모두에 대한 형광 신호가 있는데, 이는 이벤트 MON87751에 이종접합성인 식물에 대한 진단을 나타낸다. PCR 반응에서 3개의 프라이머와 2개의 프로브는 이벤트 MON87751가 없는 식물 (즉 야생형)로부터 추출된 DNA와 함께 혼합되고, 오직 VIC™-라벨된 프로브 PB11254 에서만 형광 신호가 있고, 이는 이벤트 MON87751이 없는 식물, 즉 야생형에 대한 진단을 나타낸다. 주형 DNA 시료 및 대조군은 다음과 같다: [1] 분석되는 잎 시료 또는 단일 종자 시료로부터 추출된 DNA; [2] 음성 대조군 DNA (비-유전자변형 대두 DNA); [3] 음성 물 대조군 (주형 없음); 및 [4] 공지의 이종접합성 시료에서 양성 대조군 MON87751 게놈 DNA; 그리고 [5] 공지의 동종접합성 시료에서 양성 대조군 MON87751 게놈 DNA.
실시예 7
다음의 실시예는 대두 이벤트 MON87751을 이용하여 임의의 번식 활성의 후대 안에 MON87751 이벤트를 어떻게 식별해내는 지를 설명한다.
DNA 이벤트 프라이머 쌍을 이용하여 대두 이벤트 MON87751에 진단적인 PCR 엠플리콘을 만들었다. MON87751에 진단적인 엠플리콘은 서열 번호:1 또는 서열 번호:2 또는 서열 번호:3 또는 서열 번호:4 또는 서열 번호:5 또는 서열 번호:6으로 제공되는 최소한 하나의 졍션 서열을 포함한다. MON87751의 진단성 엠플리콘을 만들게 되는 프라이머 쌍은 측면 서열 및 삽입된 발현 카세트(서열 번호:9)에 근거한 프라이머 쌍을 포함한다 . 서열 번호:1 또는 서열 번호:3 또는 서열 번호:5가 발견되는 진단성 엠플리콘을 얻기 위하여, 서열 번호:7의 염기 1 에서부터 1334에 기반을 둔 포워드 프라이머 분자와 삽입된 발현 카세트 DNA 서열 (서열 번호:9의 위치 1 에서부터 10119까지)에 기반을 둔 리버스 프라이머 분자를 기획할 수 있고, 이때 프라이머 분자들은 서열 번호:7 및 서열 번호:9에 특이적으로 혼성화되도록 충분한 길이의 연속 뉴클레오티드다. 서열 번호:2 또는 서열 번호:4 또는 서열 번호:6이 발견되는 진단성 엠플리콘을 얻기 위하여, 삽입된 발현 카세트 DNA 서열 (서열 번호:9의 위치 1에서부터 10119까지)에 기반을 둔 포워드 프라이머 분자와 3' 측면 서열 (서열 번호:8의 위치 266에서부터 1452까지)에 기반을 둔 리버스 프라이머 분자를 기획할 수 있고, 이때 프라이머 분자들은 서열 번호:8 및 서열 번호:9에 특이적으로 혼성화되도록 충분한 길이의 연속 뉴클레오티드다.
이 분석을 위한 증폭 조건의 실례는 실시예 4에서 설명된다. 그러나, 이들 방법들 또는 서열 번호:7 또는 서열 번호:8에 상동성 또는 상보적인 DNA 프라이머의 이용 또는 MON87751의 진단성인 엠플리콘을 만드는 MON87751의 이식유전자 삽입 (서열 번호:9) 안에 포함된 유전적 요소들의 DNA 서열에 임의의 변형은 당분야에 속한다. 진단성 엠플리콘은 최소한 하나의 이식유전자/게놈 졍션 DNA (서열 번호:1 또는 서열 번호:2 또는 서열 번호:3 또는 서열 번호:4 또는 서열 번호:5 또는 서열 번호:6)에 상동성 또는 상보성인 DNA, 또는 이의 실질적인 일부분을 포함한다. 대안으로, 진단성 엠플리콘은 최소한 하나의 독특한 이식유전자 서열 (서열 번호:17 또는 서열 번호:18 또는 서열 번호:19 또는 서열 번호:20 또는 서열 번호:21 또는 서열 번호:22 또는 서열 번호:23)에 상동성 또는 보체인 DNA를 포함한다.
이벤트 MON87751 식물 조직 시료의 분석에는 이벤트 MON87751의 양성 조직 대조군, 이벤트 MON87751이 아닌 대두 식물의 음성 대조군 (예를 들면, A3555를 포함하나 이에 국한되지 않음), 그리고 대두 게놈 DNA를 포함하지 않은 음성 대조군을 포함해야 한다. 내생성 대두 DNA 분자를 증폭시킬 수 있는 프라어머 쌍은 DNA 증폭 조건에 있어서 내부 대조군으로 삼을 것이다. 추가적인 프라이머 서열은 DNA 증폭 방법 분야에서 당업자가 서열 번호:7, 서열 번호:8, 또는 서열 번호:9로부터 선택할 수 있고, 실시예 4에서 나타낸 방법들에 의해 엠플리콘 생산을 위하여 선택된 조건이 상이할 수 있지만, 이벤트 MON87751 DNA에 대해 진단성인 엠플리콘이 결과된다. 실시예 4의 방법에서 변형과 함께, 이들 DNA 프라이머 서열의 사용은 본 발명의 범위 안에 있다. MON87751에 진단성인, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 또는 서열 번호:9로 부터 유도된 최소한 하나의 DNA 프라이머 서열에 의해 생산된 엠플리콘은 본 발명의 한 측면이다.
DNA 탐지 키트는 서열 번호:7, 서열 번호:8, 또는 서열 번호:9에서 유도된 충분한 길이의 연속 뉴클레오티드인 최소한 하나의 DNA 프라이머를 포함하며, MON87751 또는 이의 후대에 대한 진단성 엠플리콘을 만들며, 이는 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법에서 테스트될 때, MON87751에 대하여 진단성인 엠플리콘을 만들게 되는 MON87751 대두 식물, 식물 일부분, 식물 세포, 종자, 또는 상품 산물은 본 발명의 한 측면이다. MON87751 엠플리콘에 대한 분석은 Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 (최대 속도에서 운영) 또는 MJ Research DNA Engine PTC-225 열 사이클러 또는 실시예 4에 나타낸 바와 같이, MON87751의 진단성 엠플리콘을 생산하는데 이용될 수 있는 임의의 다른 증폭 시스템을 이용하여 실행될 수 있다.
실시예 8
강화된 작물, 살충, 또는 제초제 성질이 포함된 대두 식물 또는 이의 식물 일부분을 만들기 위하여, 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물은 잠재적으로 임의의 다른 대두 이벤트 또는 이의 조합이 포함된 대두 식물과 교배되고, 후대 식물의 생성된 성질을 평가하기 위하여 표현형이 평가된다. 이러한 식물 번식으로 인하여 생성된 후대 식물에 부여되는 성질은 이벤트 MON87751의 인시목곤충 저항성을 넘어서까지 연장될 수 있는데, 지상(above-ground) 해충 조절, 제초제 내성, 살선충 성질, 가뭄 저항성, 바이러스 저항성, 항-곰팡이 조절, 박테리아 저항성, 수불임(male sterility), 한냉 내성, 염 내성, 증가된 산출량, 강화된 오일 조성물, 증가된 오일 함량, 강화된 영양 사용 효과, 또는 변경된 아미노산 함량이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 개선된 작물 형질을 가진 유전자변형 이벤트의 실례는 당업계에 잘 공지되어 있다. 대두 식물, 식물 일부분, 종자, 또는 상품 산물에 강화된 성질을 부여하기 위하여 이벤트 MON87751과 함께 번식에 이용될 수 있는 가능한 유전자변형 대두 계통의 비-제한적인 목록은 다음과 같다. 번식은 다음중 임의의 그리고 모든 조합을 포함할 수 있다: 제초제 내성: 대두 GTS 40-3-2, MON87708, MON89788, A2704-12, A2704-21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP356043, GU262, W62, W98, DAS-44406-6, DAS-68416-4, FG72, BPS-CV127-9, SYHT04R, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416, pDAB8291.45.36., 127, AAD-12; 곤충 저항성: MON87701, DAS-81419-2; 증가된 강화된 오일 조성물: DP-305423, G94-1, G94-19, G168, OT96-15, MON87705, MON87769; 증가된 산출량: MON 87712.
본 발명의 재료가 되는 본 명세서에서 언급된 모든 공개 및 공개된 특허 문서는 각 개별 공개 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고자료에 편입된 것과 같이 동일한 수준으로 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
아메리칸 타입 컬처 컬렉션 PTA-120166 20130201
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> Soybean Transgenic Event MON87751 and Methods for Detection and Use Thereof <130> MONS:357WO <150> 61/834,899 <151> 2013-06-14 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 1 ttggagatct ccagtcagca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 2 catgtagatt cctatgagaa 20 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 3 tgtagatatt tcccctcact ttggagatct ccagtcagca tcatcacacc aaaagttagg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 4 catcatactc attgctgatc catgtagatt cctatgagaa tgagaggaca agacagctcg 60 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 5 ttgctctttg gagtttattt tgtagatatt tcccctcact ttggagatct ccagtcagca 60 tcatcacacc aaaagttagg cccgaatagt ttgaaattag 100 <210> 6 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 6 ttctttttct ccatattgac catcatactc attgctgatc catgtagatt cctatgagaa 60 tgagaggaca agacagctcg gtcaaaactc aatcgtcgaa 100 <210> 7 <211> 1626 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 7 ttaattttta agtaaactaa tttatgtcta aagggtttat tttaaaaata ggttaataat 60 aaaatttcat atgatttttt tatcaaacac aaaaattatt taaaattaat ttaaatttaa 120 attaatttta gactaaaaaa taatttatca atatgaagcc taatatgtga atattaccct 180 atatttacat cttaagtatg tgagttaggt ttactaatat tatatttcat aggtcttttt 240 tgttgatttt atacatattt cttttcatat aaataataac gtttttttat cgtaattatt 300 aattttttat ttttattaac aggaattcga agtcatattt atttctttct cgtttagata 360 gcaacttaat gttatgtatt tccgttaata catttttaaa aaaatttacg atattatgat 420 aagtcatgat caaatacgaa acatacttag tgtaacgtca ttaaattcca tttccatgga 480 atgtgagtac agttcattat ttaatttaat tttttttttg ttgcagaatt taattgacca 540 ggttttgtgg tgacgtctct gcacaggctt cccgtaaggc gtcctaatca taatcttaaa 600 attcttcaat atctaccttg tattttgggt aatgggaaaa tcagactcga tctgtatttt 660 cagttgcaat tctcttcctt ctcgtgactc tccagtacct tgttgatttg aacgacttgg 720 ttaatcttta aattaccttc attaaacatt cgtttgaatt aggtgttaca ttgttaggac 780 cacaacggtg tgacctcaca accttgcgga gttaattatg gtggattggt gggtacatat 840 atagactcat catcaggaac aaaaaatatc tacgaaacca ttatatttat ttttgttgtt 900 tgagactgtc tacatgaatg atacgagact aaagattgtt atttgtcagg aattgtaatt 960 tatttttact acaatataaa caacgagaaa aacaacggtt aggttgacat ggtaatcaac 1020 taattgtatt taaaaaaaaa aaaaaaaaca attgtaccat cgtacttggc tcatgagatc 1080 cccacatgct tagatcaggg caatccttaa ctatcactca tgaactcagt cacgacacat 1140 agaggaatag ttagcgaatg tgactcgaac attgcacgac tcccatgaca cctgatatgt 1200 atatatagat ccagatgaga gactcacacg tacattttac tcatcccaat tataaataca 1260 taaacactat agaacaccac taaattgctc tttggagttt attttgtaga tatttcccct 1320 cactttggag atctccagtc agcatcatca caccaaaagt taggcccgaa tagtttgaaa 1380 ttagaaagct cgcaattgag gtctgtcgac cctgcaggta cactggcgcg ccacctcagc 1440 gctgtgcctg ttgcgacaac tatttttatg tatgcaagag tcagcatatg tataattgat 1500 tcagaatcgt tttgacgagt tcggatgtag tagtagccat tatttaatgt acatactaat 1560 cgtgaatagt gaatatgatg aaacattgta tcttattgta taaatatcca taaacacatc 1620 atgaaa 1626 <210> 8 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 8 cgcatcgatc gtgaagtttc tcatctaagc ccccatttgg acgtgaatgt agacacgtcg 60 aaataaagat ttccgaatta gaataatttg tttattgctt tcgcctataa atacgacgga 120 tcgtaatttg tcgttttatc aaaatgtact ttcattttat aataacgctg cggacatcta 180 catttttgaa ttgaaaaaaa attggtaatt actctttctt tttctccata ttgaccatca 240 tactcattgc tgatccatgt agattcctat gagaatgaga ggacaagaca gctcggtcaa 300 aactcaatcg tcgaaattca atgggaacat tttggtatct aacctcaact tcaatactgg 360 agatcggaaa ttccactaac aaggaaatga ccattcgatc ggacctcatc agaactcagt 420 agtaacatat tgtatttgaa agaacaatta aatcatatat aagcttttgt ggaaaaaaag 480 gatactacgt actaaaatat aaacgttgaa gtaaattaca gaaaatgcta atttcataac 540 acggttatct tcaaatttta gtggcccgtt taagccctag ttaaatcaaa tatatgaatg 600 cagtttatgt ataaggtatg catgtgttat agttaatcga gtttagataa ttagaatcaa 660 atatatgatt aatggtacct gtgttacata aagagactaa ttaacctaag ttctgaacaa 720 gtaattaatc aaacattgaa gtgatagatg ttgggcctaa atccagagca taacctttac 780 gtcaatgaac tacaaatttt cacactagaa acatacattg aacttttttt ccttcgttta 840 aactcctttt cttttaactg tgtttccgcg tttaatcaaa ttttacgtgt gtcgaccgaa 900 agttagaaat tataactaat aacagactca agttgacgta attttttcat gatacctacg 960 tattgctcgg agtttagatg ctatataaac atgagtgatg acatggtttt aaattgtgct 1020 tccagttgtg ttaccatgaa ctaaaaaatc ttataggtaa ttgtaagaaa atatgattga 1080 tccagtcatg attgcggtta tgatgcgatt gtacagaatc aaaatacctt gaaattgcga 1140 ttgcaattgt tattacagac tccaatttaa aatcatgagt gaggatttta tgatagatcg 1200 aatcaatgtt tcacactaca cctggaataa aaacctgagt cgtttattag atctatatct 1260 tcatatgcat gcatgtacct tagctattca tttttcactg taaatcttta ctcacactta 1320 aaatagtcgt gcatttgata tttgaatgaa atttatagag ctttcgattt gagatagtcc 1380 catctctatt tgggttggtc aatcatggag catgaaaaaa acaatagttt agctaggcca 1440 ggccaaatta at 1452 <210> 9 <211> 10119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 9 ccagtcagca tcatcacacc aaaagttagg cccgaatagt ttgaaattag aaagctcgca 60 attgaggtct gtcgaccctg caggtacact ggcgcgccac ctcagcgctg tgcctgttgc 120 gacaactatt tttatgtatg caagagtcag catatgtata attgattcag aatcgttttg 180 acgagttcgg atgtagtagt agccattatt taatgtacat actaatcgtg aatagtgaat 240 atgatgaaac attgtatctt attgtataaa tatccataaa cacatcatga aagacacttt 300 ctttcacggt ctgaattaat tatgatacaa ttctaataga aaacgaatta aattacgttg 360 aattgtatga aatctaattg aacaagccaa ccacgacgac gactaacgtt gcctggattg 420 actcggttta agttaaccac taaaaaaacg gagctgtcat gtaacacgcg gatcgagcag 480 gtcacagtca tgaagccatc aaagcaaaag aactaatcca agggctgaga tgattaatta 540 gtttaaaaat tagttaacac gagggaaaag gctgtctgac agccaggtca cgttatcttt 600 acctgtggtc gaaatgattc gtgtctgtcg attttaatta tttttttgaa aggccgaaaa 660 taaagttgta agagataaac ccgcctatat aaattcatat attttctctc cgctttgaat 720 tgtctcgttg tcctcctcac tttcatcggc cgtttttgaa tctccggcga cttgacagag 780 aagaacaagg aagaagacta agagagaaag taagagataa tccaggagat tcattctccg 840 ttttgaatct tcctcaatct catcttcttc cgctctttct ttccaaggta ataggaactt 900 tctggatcta ctttatttgc tggatctcga tcttgttttc tcaatttcct tgagatttgg 960 aattcgttta atttggatct gtgaacctcc actaaatctt ttggttttac tagaatcgat 1020 ctaagttgac cgatcagtta gctcgattat agctaccaga atttggcttg accttgatgg 1080 agagatccat gttcatgtta cctgggaaat gatttgtata tgtgaattga aatctgaact 1140 gttgaagtta gattgaatct gaacactgtc aatgttagat tgaatctgaa cactgtttaa 1200 ggttagatga agtttgtgta tagattcttc gaaactttag gatttgtagt gtcgtacgtt 1260 gaacagaaag ctatttctga ttcaatcagg gtttatttga ctgtattgaa ctctttttgt 1320 gtgtttgcag cagatctaca atggcgcaag ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc 1380 catctcttat ctccaatctc tcgaaatcca gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc 1440 tgaagacgca gcagcatcca cgagcttatc cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga 1500 gtgggatgac gttaattggc tctgagcttc gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca 1560 cggcgtgcat gcttgccatg gataactcag ttttgaacag tgggagaact acaatctgtg 1620 atgcttataa cgtggcagct catgaccctt tttcttttca gcacaagagt cttgatactg 1680 tccaaaagga gtggacagaa tggaaaaaga ataaccactc tctttacttg gaccctattg 1740 tgggtactgt cgcctccttc ctccttaaaa aagttggatc actcgttgga aagagaattt 1800 tgagtgagtt gagaaatctt attttccctt caggatctac caatttgatg caagacattc 1860 tcagggagac tgaaaaattt ctcaaccaga ggcttaacac tgacaccctc gccagagtga 1920 atgctgagct tactggcttg caagctaatg ttgaggagtt taacaggcaa gtcgataatt 1980 tcctcaatcc aaacagaaac gctgtgcccc tcagcataac ttcatcagtg aacactatgc 2040 aacaactgtt tttgaataga ttgccccagt ttcagatgca aggttaccaa ctcctcttgc 2100 ttccactctt cgcccaggct gctaacctgc atctcagttt tatcagggat gtgattttga 2160 atgctgatga gtgggggatt tcagctgcca cccttaggac ctaccgcgat tatctcaaaa 2220 actacactag ggactactct aattactgca ttaacactta tcagagcgct ttcaagggac 2280 ttaataccag actgcacgac atgctcgagt ttaggactta catgtttctg aatgttttcg 2340 agtacgtcag tatttggagt cttttcaagt atcagtcact ccttgttagc agcggtgcta 2400 acttgtacgc ttctgggtca gggccccagc agactcagag ctttacaagc caggattggc 2460 ccttcctgta ttctctgttt caagtgaata gtaattacgt gttgaacggt ttctccgggg 2520 ctaggctgtc aaataccttt cccaacattg tgggacttcc tggatctact accactcacg 2580 ctctcctggc agctagggtt aattattctg gcggcattag tagcggagat attggggctt 2640 ctccattcaa tcagaatttc aactgttcta cttttcttcc tccactcctt actcccttcg 2700 ttagatcctg gttggatagt gggtctgata gagagggcgt cgccaccgtt acaaactggc 2760 aaaccgaatc ctttgaaaca acactcggac ttaggtctgg cgctttcaca gctagaggaa 2820 attccaatta ctttcctgat tattttatta ggaacataag tggcgttcca ctcgttgtta 2880 ggaatgagga cctgaggaga cctcttcatt acaacgaaat aagaaacatc gcatctccat 2940 caggcacccc tggcggagct agggcttata tggtttccgt gcataataga aagaacaaca 3000 ttcatgctgt ccacgagaat ggatcaatga ttcacctggc tcccaacgac tataccgggt 3060 ttactatttc acctattcac gccacacaag tcaacaatca gacaaggacc ttcatttccg 3120 agaaattcgg aaatcagggg gacagtctga gattcgagca gaataacact accgcaagat 3180 atactcttag aggaaatgga aattcttaca acttgtactt gagggtgagc tcaatcggca 3240 attcaacaat cagagttact attaacggca gggtgtatac tgcaacaaac gtcaacacta 3300 ctacaaacaa tgatggcgtt aatgataacg gagcaaggtt ctcagatatt aacattggga 3360 atgttgtcgc aagttccaat tcagatgtgc cccttgatat taacgtgaca cttaattcag 3420 gcacccaatt tgacttgatg aacataatgc tggtgcccac aaatatctca ccactctact 3480 aataaggcca aggcgatcta tgactgaatt gccaatgcac cagcctgtct acatgatgaa 3540 taaataaaga gtccatccag tgtgatggct catgcctgtg tgagtgtgac tgaatccatc 3600 agtgtgtgtg tgtgtttgtg tcaaccatgt gtgaatcagg tgtcaaaaat cgtggctgga 3660 aatccatgtg gtttctagct ttatgtaaat gttgtttgtg aaatataaat attgttttgt 3720 gtatgtgaat tttactctct catttttctc ttgcactcac cattctatta tagtaatttt 3780 tttaatcgcc agcagaacac gcgctgaggc aaatcctacc acctcatttg caaatttatt 3840 atgtgttttt tttccgtggt cgagattgtg tattattctt tagttattac aagactttta 3900 gctaaaattt gaaagaattt actttaagaa aatcttaaca tctgagataa tttcagcaat 3960 agattatatt tttcattact ctagcagtat ttttgcagat caatcgcaac atatatggtt 4020 gttagaaaaa atgcactata tatatatata ttattttttc aattaaaagt gcatgatata 4080 taatatatat atatatatat atgtgtgtgt gtatatggtc aaagaaattc ttatacaaat 4140 atacacgaac acatatattt gacaaaatca aagtattaca ctaaacaatg agttggtgca 4200 tggccaaaac aaatatgtag attaaaaatt ccagcctcca aaaaaaaatc caagtgttgt 4260 aaagcattat atatatatag tagatcccaa atttttgtac aattccacac tgatcgaatt 4320 tttaaagttg aatatctgac gtaggatttt tttaatgtct tacctgacca tttactaata 4380 acattcatac gttttcattt gaaatatcct ctataattat attgaatttg gcacataata 4440 agaaacctaa ttggtgattt attttactag taaatttctg gtgatgggct ttctactaga 4500 aagctctcgg aaaatcttgg accaaatcca tattccatga cttcgattgt taaccctatt 4560 agttttcaca aacatactat caatatcatt gcaacggaaa aggtacaagt aaaacattca 4620 atccgatagg gaagtgatgt aggaggttgg gaagacaggc ccagaaagag atttatctga 4680 cttgttttgt gtatagtttt caatgttcat aaaggaagat ggagacttga gaagtttttt 4740 ttggactttg tttagctttg ttgggcgttt ttttttttga tcaataactt tgttgggctt 4800 atgatttgta atattttcgt ggactcttta gtttatttag acgtgctaac tttgttgggc 4860 ttatgacttg ttgtaacata ttgtaacaga tgacttgatg tgcgactaat ctttacacat 4920 taaacatagt tctgtttttt gaaagttctt attttcattt ttatttgaat gttatatatt 4980 tttctatatt tataattcta gtaaaaggca aattttgctt ttaaatgaaa aaaatatata 5040 ttccacagtt tcacctaatc ttatgcattt agcagtacaa attcaaaaat ttcccatttt 5100 tattcatgaa tcataccatt atatattaac taaatccaag gtaaaaaaaa ggtatgaaag 5160 ctctatagta agtaaaatat aaattcccca taaggaaagg gccaagtcca ccaggcaagt 5220 aaaatgagca agcaccactc caccatcaca caatttcact catagataac gataagattc 5280 atggaattat cttccacgtg gcattattcc agcggttcaa gccgataagg gtctcaacac 5340 ctctccttag gcctttgtgg ccgttaccaa gtaaaattaa cctcacacat atccacactc 5400 aaaatccaac ggtgtagatc ctagtccact tgaatctcat gtatcctaga ccctccgatc 5460 actccaaagc ttgttctcat tgttgttatc attatatata gatgaccaaa gcactagacc 5520 aaacctcagt cacacaaaga gtaaagaaga acaatggctt cctctatgct ctcttccgct 5580 actatggttg cctctccggc tcaggccact atggtcgctc ctttcaacgg acttaagtcc 5640 tccgctgcct tcccagccac ccgcaaggct aacaacgaca ttacttccat cacaagcaac 5700 ggcggaagag ttaactgcat gcaggtgtgg cctccgattg gaaagaagaa gtttgagact 5760 ctctcttacc ttcctgacct taccgattcc ggtggtcgcg tcaactgcat gcaggccatg 5820 gacaacaacc caaacatcaa cgaatgcatt ccatacaact gcttgagtaa cccagaagtt 5880 gaagtacttg gtggagaacg cattgaaacc ggttacactc ccatcgacat ctccttgtcc 5940 ttgacacagt ttctgctcag cgagttcgtg ccaggtgctg ggttcgttct cggactagtt 6000 gacatcatct ggggtatctt tggtccatct caatgggatg cattcctggt gcaaattgag 6060 cagttgatca accagaggat cgaagagttc gccaggaacc aggccatctc taggttggaa 6120 ggattgagca atctctacca aatctatgca gagagcttca gagagtggga agccgatcct 6180 actaacccag ctctccgcga ggaaatgcgt attcaattca acgacatgaa cagcgccttg 6240 accacagcta tcccattgtt cgcagtccag aactaccaag ttcctctctt gtccgtgtac 6300 gttcaagcag ctaatcttca cctcagcgtg cttcgagacg ttagcgtgtt tgggcaaagg 6360 tggggattcg atgctgcaac catcaatagc cgttacaacg accttactag gctgattgga 6420 aactacaccg accacgctgt tcgttggtac aacactggct tggagcgtgt ctggggtcct 6480 gattctagag attggattag atacaaccag ttcaggagag aattgaccct cacagttttg 6540 gacattgtgt ctctcttccc gaactatgac tccagaacct accctatccg tacagtgtcc 6600 caacttacca gagaaatcta tactaaccca gttcttgaga acttcgacgg tagcttccgt 6660 ggttctgccc aaggtatcga aggctccatc aggagcccac acttgatgga catcttgaac 6720 agcataacta tctacaccga tgctcacaga ggagagtatt actggtctgg acaccagatc 6780 atggcctctc cagttggatt cagcgggccc gagtttacct ttcctctcta tggaactatg 6840 ggaaacgccg ctccacaaca acgtatcgtt gctcaactag gtcagggtgt ctacagaacc 6900 ttgtcttcca ccttgtacag aagacccttc aatatcggta tcaacaacca gcaactttcc 6960 gttcttgacg gaacagagtt cgcctatgga acctcttcta acttgccatc cgctgtttac 7020 agaaagagcg gaaccgttga ttccttggac gaaatcccac cacagaacaa caatgtgcca 7080 cccaggcaag gattctccca caggttgagc cacgtgtcca tgttccgttc cggattcagc 7140 aacagttccg tgagcatcat cagagctcct atgttctctt ggatacaccg tagtgctgag 7200 ttcaacaaca tcattgcatc cgacagcatt actcaaatac ccttggtgaa agcacataca 7260 cttcagtcag gtactactgt tgtcagaggt ccagggttta caggaggaga cattcttcgt 7320 cgcacaagtg gaggaccctt tgcttacact attgttaaca tcaatggcca attgccccaa 7380 aggtatcgtg caagaatccg ctatgcctct actacaaatc tcaggatcta cgtgactgtt 7440 gcaggtgaaa ggatctttgc tggtcagttc aacaagacta tggataccgg tgaccctttg 7500 acattccaat cttttagcta cgcaactatc aacacagctt ttacattccc aatgagccag 7560 agtagcttca cagtaggtgc tgacactttc agctcaggga atgaagttta catcgacagg 7620 tttgaattga ttccagttac tgcaaccctc gaggctgagt acaaccttga gagagcccag 7680 aaggctgtga acgccctctt tacctccacc aatcagcttg gcttgaaaac taacgttact 7740 gactatcaca ttgaccaagt gtccaacttg gtcacctacc ttagcgatga gttctgcctc 7800 gacgagaagc gtgaactctc cgagaaagtt aaacacgcca agcgtctcag cgacgagagg 7860 aatctcttgc aagactccaa cttcaaagac atcaacaggc agccagaacg tggttggggt 7920 ggaagcaccg ggatcaccat ccaaggaggc gacgatgtgt tcaaggagaa ctacgtcacc 7980 ctctccggaa ctttcgacga gtgctaccct acctacttgt accagaagat cgatgagtcc 8040 aaactcaaag ccttcaccag gtatcaactt agaggctaca tcgaagacag ccaagacctt 8100 gaaatctact cgatcaggta caatgccaag cacgagaccg tgaatgtccc aggtactggt 8160 tccctctggc cactttctgc ccaatctccc attgggaagt gtggagagcc taacagatgc 8220 gctccacacc ttgagtggaa tcctgacttg gactgctcct gcagggatgg cgagaagtgt 8280 gcccaccatt ctcatcactt ctccttggac atcgatgtgg gatgtactga cctgaatgag 8340 gacctcggag tctgggtcat cttcaagatc aagacccaag acggacacgc aagacttggc 8400 aaccttgagt ttctcgaaga gaaaccattg gtcggtgaag ctctcgctcg tgtgaagaga 8460 gcagagaaga agtggaggga caaacgtgag aaactcgaat gggaaactaa catcgtttac 8520 aaggaggcca aagagtccgt ggatgctttg ttcgtgaact cccaatatga tcagttgcaa 8580 gccgacacca acatcgccat gatccacgcc gcagacaaac gtgtgcacag cattcgtgag 8640 gcttacttgc ctgagttgtc cgtgatccct ggtgtgaacg ctgccatctt cgaggaactt 8700 gagggacgta tctttaccgc attctccttg tacgatgcca gaaacgtcat caagaacggt 8760 gacttcaaca atggcctcag ctgctggaat gtgaaaggtc atgtggacgt ggaggaacag 8820 aacaatcagc gttccgtcct ggttgtgcct gagtgggaag ctgaagtgtc ccaagaggtt 8880 agagtctgtc caggtagagg ctacattctc cgtgtgaccg cttacaagga gggatacggt 8940 gagggttgcg tgaccatcca cgagatcgag aacaacaccg acgagcttaa gttctccaac 9000 tgcgtcgagg aagaaatcta tcccaacaac accgttactt gcaacgacta cactgtgaat 9060 caggaagagt acggaggtgc ctacactagc cgtaacagag gttacaacga agctccttcc 9120 gttcctgctg actatgcctc cgtgtacgag gagaaatcct acacagatgg cagacgtgag 9180 aacccttgcg agttcaacag aggttacagg gactacacac cacttccagt tggctatgtt 9240 accaaggagc ttgagtactt tcctgagacc gacaaagtgt ggatcgagat cggtgaaacc 9300 gagggaacct tcatcgtgga cagcgtggag cttctcttga tggaggaata atgagcaagg 9360 aggatcatga acatcacaaa gtgaatttat tttatgtttg caccatatat tattatttgt 9420 gacacatttt agaactctta aaccattttt ctgtttgcat tttagctact ggttgttgta 9480 ttcacaataa tgatgcagtc ctatgcttct tggtgtaaga ttcaatacta tgtaaagtgt 9540 atgtctttgg ttgtatacta tttaaaatct attcttgtat tgtataattt attttagcct 9600 ttgtttgaga ttgaggttac ttgttctgtt gcatttaatc acaagttttc attttgttat 9660 acgtacgtgt tataccctgt ttttggacct aaaaatactg ggcccaattt catttcaaac 9720 tttgtcaatt atcaaatttc aactgcacag ttcacaaata gagtgaggtt gatttgcggc 9780 cgcacgtcct gcttggccta ctaggccaac gcaggcgctg gccgtgacgg ccacgagcga 9840 actaggcctt gggccgcatc gatcgtgaag tttctcatct aagcccccat ttggacgtga 9900 atgtagacac gtcgaaataa agatttccga attagaataa tttgtttatt gctttcgcct 9960 ataaatacga cggatcgtaa tttgtcgttt tatcaaaatg tactttcatt ttataataac 10020 gctgcggaca tctacatttt tgaattgaaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc 10080 catattgacc atcatactca ttgctgatcc atgtagatt 10119 <210> 10 <211> 12640 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising soybean genomic sequence and transgene sequence <400> 10 ttaattttta agtaaactaa tttatgtcta aagggtttat tttaaaaata ggttaataat 60 aaaatttcat atgatttttt tatcaaacac aaaaattatt taaaattaat ttaaatttaa 120 attaatttta gactaaaaaa taatttatca atatgaagcc taatatgtga atattaccct 180 atatttacat cttaagtatg tgagttaggt ttactaatat tatatttcat aggtcttttt 240 tgttgatttt atacatattt cttttcatat aaataataac gtttttttat cgtaattatt 300 aattttttat ttttattaac aggaattcga agtcatattt atttctttct cgtttagata 360 gcaacttaat gttatgtatt tccgttaata catttttaaa aaaatttacg atattatgat 420 aagtcatgat caaatacgaa acatacttag tgtaacgtca ttaaattcca tttccatgga 480 atgtgagtac agttcattat ttaatttaat tttttttttg ttgcagaatt taattgacca 540 ggttttgtgg tgacgtctct gcacaggctt cccgtaaggc gtcctaatca taatcttaaa 600 attcttcaat atctaccttg tattttgggt aatgggaaaa tcagactcga tctgtatttt 660 cagttgcaat tctcttcctt ctcgtgactc tccagtacct tgttgatttg aacgacttgg 720 ttaatcttta aattaccttc attaaacatt cgtttgaatt aggtgttaca ttgttaggac 780 cacaacggtg tgacctcaca accttgcgga gttaattatg gtggattggt gggtacatat 840 atagactcat catcaggaac aaaaaatatc tacgaaacca ttatatttat ttttgttgtt 900 tgagactgtc tacatgaatg atacgagact aaagattgtt atttgtcagg aattgtaatt 960 tatttttact acaatataaa caacgagaaa aacaacggtt aggttgacat ggtaatcaac 1020 taattgtatt taaaaaaaaa aaaaaaaaca attgtaccat cgtacttggc tcatgagatc 1080 cccacatgct tagatcaggg caatccttaa ctatcactca tgaactcagt cacgacacat 1140 agaggaatag ttagcgaatg tgactcgaac attgcacgac tcccatgaca cctgatatgt 1200 atatatagat ccagatgaga gactcacacg tacattttac tcatcccaat tataaataca 1260 taaacactat agaacaccac taaattgctc tttggagttt attttgtaga tatttcccct 1320 cactttggag atctccagtc agcatcatca caccaaaagt taggcccgaa tagtttgaaa 1380 ttagaaagct cgcaattgag gtctgtcgac cctgcaggta cactggcgcg ccacctcagc 1440 gctgtgcctg ttgcgacaac tatttttatg tatgcaagag tcagcatatg tataattgat 1500 tcagaatcgt tttgacgagt tcggatgtag tagtagccat tatttaatgt acatactaat 1560 cgtgaatagt gaatatgatg aaacattgta tcttattgta taaatatcca taaacacatc 1620 atgaaagaca ctttctttca cggtctgaat taattatgat acaattctaa tagaaaacga 1680 attaaattac gttgaattgt atgaaatcta attgaacaag ccaaccacga cgacgactaa 1740 cgttgcctgg attgactcgg tttaagttaa ccactaaaaa aacggagctg tcatgtaaca 1800 cgcggatcga gcaggtcaca gtcatgaagc catcaaagca aaagaactaa tccaagggct 1860 gagatgatta attagtttaa aaattagtta acacgaggga aaaggctgtc tgacagccag 1920 gtcacgttat ctttacctgt ggtcgaaatg attcgtgtct gtcgatttta attatttttt 1980 tgaaaggccg aaaataaagt tgtaagagat aaacccgcct atataaattc atatattttc 2040 tctccgcttt gaattgtctc gttgtcctcc tcactttcat cggccgtttt tgaatctccg 2100 gcgacttgac agagaagaac aaggaagaag actaagagag aaagtaagag ataatccagg 2160 agattcattc tccgttttga atcttcctca atctcatctt cttccgctct ttctttccaa 2220 ggtaatagga actttctgga tctactttat ttgctggatc tcgatcttgt tttctcaatt 2280 tccttgagat ttggaattcg tttaatttgg atctgtgaac ctccactaaa tcttttggtt 2340 ttactagaat cgatctaagt tgaccgatca gttagctcga ttatagctac cagaatttgg 2400 cttgaccttg atggagagat ccatgttcat gttacctggg aaatgatttg tatatgtgaa 2460 ttgaaatctg aactgttgaa gttagattga atctgaacac tgtcaatgtt agattgaatc 2520 tgaacactgt ttaaggttag atgaagtttg tgtatagatt cttcgaaact ttaggatttg 2580 tagtgtcgta cgttgaacag aaagctattt ctgattcaat cagggtttat ttgactgtat 2640 tgaactcttt ttgtgtgttt gcagcagatc tacaatggcg caagttagca gaatctgcaa 2700 tggtgtgcag aacccatctc ttatctccaa tctctcgaaa tccagtcaac gcaaatctcc 2760 cttatcggtt tctctgaaga cgcagcagca tccacgagct tatccgattt cgtcgtcgtg 2820 gggattgaag aagagtggga tgacgttaat tggctctgag cttcgtcctc ttaaggtcat 2880 gtcttctgtt tccacggcgt gcatgcttgc catggataac tcagttttga acagtgggag 2940 aactacaatc tgtgatgctt ataacgtggc agctcatgac cctttttctt ttcagcacaa 3000 gagtcttgat actgtccaaa aggagtggac agaatggaaa aagaataacc actctcttta 3060 cttggaccct attgtgggta ctgtcgcctc cttcctcctt aaaaaagttg gatcactcgt 3120 tggaaagaga attttgagtg agttgagaaa tcttattttc ccttcaggat ctaccaattt 3180 gatgcaagac attctcaggg agactgaaaa atttctcaac cagaggctta acactgacac 3240 cctcgccaga gtgaatgctg agcttactgg cttgcaagct aatgttgagg agtttaacag 3300 gcaagtcgat aatttcctca atccaaacag aaacgctgtg cccctcagca taacttcatc 3360 agtgaacact atgcaacaac tgtttttgaa tagattgccc cagtttcaga tgcaaggtta 3420 ccaactcctc ttgcttccac tcttcgccca ggctgctaac ctgcatctca gttttatcag 3480 ggatgtgatt ttgaatgctg atgagtgggg gatttcagct gccaccctta ggacctaccg 3540 cgattatctc aaaaactaca ctagggacta ctctaattac tgcattaaca cttatcagag 3600 cgctttcaag ggacttaata ccagactgca cgacatgctc gagtttagga cttacatgtt 3660 tctgaatgtt ttcgagtacg tcagtatttg gagtcttttc aagtatcagt cactccttgt 3720 tagcagcggt gctaacttgt acgcttctgg gtcagggccc cagcagactc agagctttac 3780 aagccaggat tggcccttcc tgtattctct gtttcaagtg aatagtaatt acgtgttgaa 3840 cggtttctcc ggggctaggc tgtcaaatac ctttcccaac attgtgggac ttcctggatc 3900 tactaccact cacgctctcc tggcagctag ggttaattat tctggcggca ttagtagcgg 3960 agatattggg gcttctccat tcaatcagaa tttcaactgt tctacttttc ttcctccact 4020 ccttactccc ttcgttagat cctggttgga tagtgggtct gatagagagg gcgtcgccac 4080 cgttacaaac tggcaaaccg aatcctttga aacaacactc ggacttaggt ctggcgcttt 4140 cacagctaga ggaaattcca attactttcc tgattatttt attaggaaca taagtggcgt 4200 tccactcgtt gttaggaatg aggacctgag gagacctctt cattacaacg aaataagaaa 4260 catcgcatct ccatcaggca cccctggcgg agctagggct tatatggttt ccgtgcataa 4320 tagaaagaac aacattcatg ctgtccacga gaatggatca atgattcacc tggctcccaa 4380 cgactatacc gggtttacta tttcacctat tcacgccaca caagtcaaca atcagacaag 4440 gaccttcatt tccgagaaat tcggaaatca gggggacagt ctgagattcg agcagaataa 4500 cactaccgca agatatactc ttagaggaaa tggaaattct tacaacttgt acttgagggt 4560 gagctcaatc ggcaattcaa caatcagagt tactattaac ggcagggtgt atactgcaac 4620 aaacgtcaac actactacaa acaatgatgg cgttaatgat aacggagcaa ggttctcaga 4680 tattaacatt gggaatgttg tcgcaagttc caattcagat gtgccccttg atattaacgt 4740 gacacttaat tcaggcaccc aatttgactt gatgaacata atgctggtgc ccacaaatat 4800 ctcaccactc tactaataag gccaaggcga tctatgactg aattgccaat gcaccagcct 4860 gtctacatga tgaataaata aagagtccat ccagtgtgat ggctcatgcc tgtgtgagtg 4920 tgactgaatc catcagtgtg tgtgtgtgtt tgtgtcaacc atgtgtgaat caggtgtcaa 4980 aaatcgtggc tggaaatcca tgtggtttct agctttatgt aaatgttgtt tgtgaaatat 5040 aaatattgtt ttgtgtatgt gaattttact ctctcatttt tctcttgcac tcaccattct 5100 attatagtaa tttttttaat cgccagcaga acacgcgctg aggcaaatcc taccacctca 5160 tttgcaaatt tattatgtgt tttttttccg tggtcgagat tgtgtattat tctttagtta 5220 ttacaagact tttagctaaa atttgaaaga atttacttta agaaaatctt aacatctgag 5280 ataatttcag caatagatta tatttttcat tactctagca gtatttttgc agatcaatcg 5340 caacatatat ggttgttaga aaaaatgcac tatatatata tatattattt tttcaattaa 5400 aagtgcatga tatataatat atatatatat atatatgtgt gtgtgtatat ggtcaaagaa 5460 attcttatac aaatatacac gaacacatat atttgacaaa atcaaagtat tacactaaac 5520 aatgagttgg tgcatggcca aaacaaatat gtagattaaa aattccagcc tccaaaaaaa 5580 aatccaagtg ttgtaaagca ttatatatat atagtagatc ccaaattttt gtacaattcc 5640 acactgatcg aatttttaaa gttgaatatc tgacgtagga tttttttaat gtcttacctg 5700 accatttact aataacattc atacgttttc atttgaaata tcctctataa ttatattgaa 5760 tttggcacat aataagaaac ctaattggtg atttatttta ctagtaaatt tctggtgatg 5820 ggctttctac tagaaagctc tcggaaaatc ttggaccaaa tccatattcc atgacttcga 5880 ttgttaaccc tattagtttt cacaaacata ctatcaatat cattgcaacg gaaaaggtac 5940 aagtaaaaca ttcaatccga tagggaagtg atgtaggagg ttgggaagac aggcccagaa 6000 agagatttat ctgacttgtt ttgtgtatag ttttcaatgt tcataaagga agatggagac 6060 ttgagaagtt ttttttggac tttgtttagc tttgttgggc gttttttttt ttgatcaata 6120 actttgttgg gcttatgatt tgtaatattt tcgtggactc tttagtttat ttagacgtgc 6180 taactttgtt gggcttatga cttgttgtaa catattgtaa cagatgactt gatgtgcgac 6240 taatctttac acattaaaca tagttctgtt ttttgaaagt tcttattttc atttttattt 6300 gaatgttata tatttttcta tatttataat tctagtaaaa ggcaaatttt gcttttaaat 6360 gaaaaaaata tatattccac agtttcacct aatcttatgc atttagcagt acaaattcaa 6420 aaatttccca tttttattca tgaatcatac cattatatat taactaaatc caaggtaaaa 6480 aaaaggtatg aaagctctat agtaagtaaa atataaattc cccataagga aagggccaag 6540 tccaccaggc aagtaaaatg agcaagcacc actccaccat cacacaattt cactcataga 6600 taacgataag attcatggaa ttatcttcca cgtggcatta ttccagcggt tcaagccgat 6660 aagggtctca acacctctcc ttaggccttt gtggccgtta ccaagtaaaa ttaacctcac 6720 acatatccac actcaaaatc caacggtgta gatcctagtc cacttgaatc tcatgtatcc 6780 tagaccctcc gatcactcca aagcttgttc tcattgttgt tatcattata tatagatgac 6840 caaagcacta gaccaaacct cagtcacaca aagagtaaag aagaacaatg gcttcctcta 6900 tgctctcttc cgctactatg gttgcctctc cggctcaggc cactatggtc gctcctttca 6960 acggacttaa gtcctccgct gccttcccag ccacccgcaa ggctaacaac gacattactt 7020 ccatcacaag caacggcgga agagttaact gcatgcaggt gtggcctccg attggaaaga 7080 agaagtttga gactctctct taccttcctg accttaccga ttccggtggt cgcgtcaact 7140 gcatgcaggc catggacaac aacccaaaca tcaacgaatg cattccatac aactgcttga 7200 gtaacccaga agttgaagta cttggtggag aacgcattga aaccggttac actcccatcg 7260 acatctcctt gtccttgaca cagtttctgc tcagcgagtt cgtgccaggt gctgggttcg 7320 ttctcggact agttgacatc atctggggta tctttggtcc atctcaatgg gatgcattcc 7380 tggtgcaaat tgagcagttg atcaaccaga ggatcgaaga gttcgccagg aaccaggcca 7440 tctctaggtt ggaaggattg agcaatctct accaaatcta tgcagagagc ttcagagagt 7500 gggaagccga tcctactaac ccagctctcc gcgaggaaat gcgtattcaa ttcaacgaca 7560 tgaacagcgc cttgaccaca gctatcccat tgttcgcagt ccagaactac caagttcctc 7620 tcttgtccgt gtacgttcaa gcagctaatc ttcacctcag cgtgcttcga gacgttagcg 7680 tgtttgggca aaggtgggga ttcgatgctg caaccatcaa tagccgttac aacgacctta 7740 ctaggctgat tggaaactac accgaccacg ctgttcgttg gtacaacact ggcttggagc 7800 gtgtctgggg tcctgattct agagattgga ttagatacaa ccagttcagg agagaattga 7860 ccctcacagt tttggacatt gtgtctctct tcccgaacta tgactccaga acctacccta 7920 tccgtacagt gtcccaactt accagagaaa tctatactaa cccagttctt gagaacttcg 7980 acggtagctt ccgtggttct gcccaaggta tcgaaggctc catcaggagc ccacacttga 8040 tggacatctt gaacagcata actatctaca ccgatgctca cagaggagag tattactggt 8100 ctggacacca gatcatggcc tctccagttg gattcagcgg gcccgagttt acctttcctc 8160 tctatggaac tatgggaaac gccgctccac aacaacgtat cgttgctcaa ctaggtcagg 8220 gtgtctacag aaccttgtct tccaccttgt acagaagacc cttcaatatc ggtatcaaca 8280 accagcaact ttccgttctt gacggaacag agttcgccta tggaacctct tctaacttgc 8340 catccgctgt ttacagaaag agcggaaccg ttgattcctt ggacgaaatc ccaccacaga 8400 acaacaatgt gccacccagg caaggattct cccacaggtt gagccacgtg tccatgttcc 8460 gttccggatt cagcaacagt tccgtgagca tcatcagagc tcctatgttc tcttggatac 8520 accgtagtgc tgagttcaac aacatcattg catccgacag cattactcaa atacccttgg 8580 tgaaagcaca tacacttcag tcaggtacta ctgttgtcag aggtccaggg tttacaggag 8640 gagacattct tcgtcgcaca agtggaggac cctttgctta cactattgtt aacatcaatg 8700 gccaattgcc ccaaaggtat cgtgcaagaa tccgctatgc ctctactaca aatctcagga 8760 tctacgtgac tgttgcaggt gaaaggatct ttgctggtca gttcaacaag actatggata 8820 ccggtgaccc tttgacattc caatctttta gctacgcaac tatcaacaca gcttttacat 8880 tcccaatgag ccagagtagc ttcacagtag gtgctgacac tttcagctca gggaatgaag 8940 tttacatcga caggtttgaa ttgattccag ttactgcaac cctcgaggct gagtacaacc 9000 ttgagagagc ccagaaggct gtgaacgccc tctttacctc caccaatcag cttggcttga 9060 aaactaacgt tactgactat cacattgacc aagtgtccaa cttggtcacc taccttagcg 9120 atgagttctg cctcgacgag aagcgtgaac tctccgagaa agttaaacac gccaagcgtc 9180 tcagcgacga gaggaatctc ttgcaagact ccaacttcaa agacatcaac aggcagccag 9240 aacgtggttg gggtggaagc accgggatca ccatccaagg aggcgacgat gtgttcaagg 9300 agaactacgt caccctctcc ggaactttcg acgagtgcta ccctacctac ttgtaccaga 9360 agatcgatga gtccaaactc aaagccttca ccaggtatca acttagaggc tacatcgaag 9420 acagccaaga ccttgaaatc tactcgatca ggtacaatgc caagcacgag accgtgaatg 9480 tcccaggtac tggttccctc tggccacttt ctgcccaatc tcccattggg aagtgtggag 9540 agcctaacag atgcgctcca caccttgagt ggaatcctga cttggactgc tcctgcaggg 9600 atggcgagaa gtgtgcccac cattctcatc acttctcctt ggacatcgat gtgggatgta 9660 ctgacctgaa tgaggacctc ggagtctggg tcatcttcaa gatcaagacc caagacggac 9720 acgcaagact tggcaacctt gagtttctcg aagagaaacc attggtcggt gaagctctcg 9780 ctcgtgtgaa gagagcagag aagaagtgga gggacaaacg tgagaaactc gaatgggaaa 9840 ctaacatcgt ttacaaggag gccaaagagt ccgtggatgc tttgttcgtg aactcccaat 9900 atgatcagtt gcaagccgac accaacatcg ccatgatcca cgccgcagac aaacgtgtgc 9960 acagcattcg tgaggcttac ttgcctgagt tgtccgtgat ccctggtgtg aacgctgcca 10020 tcttcgagga acttgaggga cgtatcttta ccgcattctc cttgtacgat gccagaaacg 10080 tcatcaagaa cggtgacttc aacaatggcc tcagctgctg gaatgtgaaa ggtcatgtgg 10140 acgtggagga acagaacaat cagcgttccg tcctggttgt gcctgagtgg gaagctgaag 10200 tgtcccaaga ggttagagtc tgtccaggta gaggctacat tctccgtgtg accgcttaca 10260 aggagggata cggtgagggt tgcgtgacca tccacgagat cgagaacaac accgacgagc 10320 ttaagttctc caactgcgtc gaggaagaaa tctatcccaa caacaccgtt acttgcaacg 10380 actacactgt gaatcaggaa gagtacggag gtgcctacac tagccgtaac agaggttaca 10440 acgaagctcc ttccgttcct gctgactatg cctccgtgta cgaggagaaa tcctacacag 10500 atggcagacg tgagaaccct tgcgagttca acagaggtta cagggactac acaccacttc 10560 cagttggcta tgttaccaag gagcttgagt actttcctga gaccgacaaa gtgtggatcg 10620 agatcggtga aaccgaggga accttcatcg tggacagcgt ggagcttctc ttgatggagg 10680 aataatgagc aaggaggatc atgaacatca caaagtgaat ttattttatg tttgcaccat 10740 atattattat ttgtgacaca ttttagaact cttaaaccat ttttctgttt gcattttagc 10800 tactggttgt tgtattcaca ataatgatgc agtcctatgc ttcttggtgt aagattcaat 10860 actatgtaaa gtgtatgtct ttggttgtat actatttaaa atctattctt gtattgtata 10920 atttatttta gcctttgttt gagattgagg ttacttgttc tgttgcattt aatcacaagt 10980 tttcattttg ttatacgtac gtgttatacc ctgtttttgg acctaaaaat actgggccca 11040 atttcatttc aaactttgtc aattatcaaa tttcaactgc acagttcaca aatagagtga 11100 ggttgatttg cggccgcacg tcctgcttgg cctactaggc caacgcaggc gctggccgtg 11160 acggccacga gcgaactagg ccttgggccg catcgatcgt gaagtttctc atctaagccc 11220 ccatttggac gtgaatgtag acacgtcgaa ataaagattt ccgaattaga ataatttgtt 11280 tattgctttc gcctataaat acgacggatc gtaatttgtc gttttatcaa aatgtacttt 11340 cattttataa taacgctgcg gacatctaca tttttgaatt gaaaaaaaat tggtaattac 11400 tctttctttt tctccatatt gaccatcata ctcattgctg atccatgtag attcctatga 11460 gaatgagagg acaagacagc tcggtcaaaa ctcaatcgtc gaaattcaat gggaacattt 11520 tggtatctaa cctcaacttc aatactggag atcggaaatt ccactaacaa ggaaatgacc 11580 attcgatcgg acctcatcag aactcagtag taacatattg tatttgaaag aacaattaaa 11640 tcatatataa gcttttgtgg aaaaaaagga tactacgtac taaaatataa acgttgaagt 11700 aaattacaga aaatgctaat ttcataacac ggttatcttc aaattttagt ggcccgttta 11760 agccctagtt aaatcaaata tatgaatgca gtttatgtat aaggtatgca tgtgttatag 11820 ttaatcgagt ttagataatt agaatcaaat atatgattaa tggtacctgt gttacataaa 11880 gagactaatt aacctaagtt ctgaacaagt aattaatcaa acattgaagt gatagatgtt 11940 gggcctaaat ccagagcata acctttacgt caatgaacta caaattttca cactagaaac 12000 atacattgaa ctttttttcc ttcgtttaaa ctccttttct tttaactgtg tttccgcgtt 12060 taatcaaatt ttacgtgtgt cgaccgaaag ttagaaatta taactaataa cagactcaag 12120 ttgacgtaat tttttcatga tacctacgta ttgctcggag tttagatgct atataaacat 12180 gagtgatgac atggttttaa attgtgcttc cagttgtgtt accatgaact aaaaaatctt 12240 ataggtaatt gtaagaaaat atgattgatc cagtcatgat tgcggttatg atgcgattgt 12300 acagaatcaa aataccttga aattgcgatt gcaattgtta ttacagactc caatttaaaa 12360 tcatgagtga ggattttatg atagatcgaa tcaatgtttc acactacacc tggaataaaa 12420 acctgagtcg tttattagat ctatatcttc atatgcatgc atgtacctta gctattcatt 12480 tttcactgta aatctttact cacacttaaa atagtcgtgc atttgatatt tgaatgaaat 12540 ttatagagct ttcgatttga gatagtccca tctctatttg ggttggtcaa tcatggagca 12600 tgaaaaaaac aatagtttag ctaggccagg ccaaattaat 12640 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 11 ctctttcttt ttctccatat tgaccat 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 12 ctgtcttgtc ctctcattct catagg 26 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Probe <400> 13 atactcattg ctgatccat 19 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 14 agctgtcttg tcctctcatt ctca 24 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 15 ctctttggag tttattttgt agatatttcc 30 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Probe <400> 16 tcactttgga gatcggag 18 <210> 17 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 17 atagtttgaa attagaaagc tcgcaattga ggtctgtcga ccctgcaggt acactggcgc 60 gccacctcag cgctgtgcct gttgcgacaa ctatttttat gtatgcaaga gt 112 <210> 18 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 18 attgaactct ttttgtgtgt ttgcagcaga tctacaatgg cgcaagttag ca 52 <210> 19 <211> 283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 19 cggcgtgcat gcttgccatg gataactcag ttttgaacag tgggagaact acaatctgtg 60 atgcttataa cgtggcagct catgaccctt tttcttttca gcacaagagt cttgatactg 120 tccaaaagga gtggacagaa tggaaaaaga ataaccactc tctttacttg gaccctattg 180 tgggtactgt cgcctccttc ctccttaaaa aagttggatc actcgttgga aagagaattt 240 tgagtgagtt gagaaatctt attttccctt caggatctac caa 283 <210> 20 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 20 gagtacgtca gtatttggag tcttttcaag tatcagtcac tccttgttag cagcggtgct 60 aacttgtacg cttctgggtc agggccccag cagactcaga gctttacaag ccaggattgg 120 cccttcctgt attctctgtt tcaagtgaat agtaattacg tgttgaacgg tttctccggg 180 gctaggctgt caaatacctt tcccaacatt gtgggacttc ctggatctac taccactcac 240 gctctcctgg cagctagggt taattattct ggcggcatta gtagcggaga tattggggct 300 tctccattca atcagaattt caactgttct acttttcttc ctccactcct tactcccttc 360 gttagatcct ggttggatag tgggtctgat agagagggcg tcgccaccgt tacaaactgg 420 caaaccgaat cctttgaaac aacactcgga cttaggtctg gcgctttcac agctagagga 480 aattcc 486 <210> 21 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 21 taacggagca aggttctcag atattaacat tgggaatgtt gtcgcaagtt ccaattcaga 60 tgtgcccctt gatattaacg tgacacttaa ttcaggcacc caatttgact tgatgaacat 120 aatgctggtg cccacaaata tctcaccact ctactaataa ggccaaggcg atctatgac 179 <210> 22 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 22 tcttgcactc accattctat tatagtaatt tttttaatcg ccagcagaac acgcgctgag 60 gcaaatccta ccacctcatt tgcaaattta ttatgtgttt tttttc 106 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 23 acagcgtgga gcttctcttg atggaggaat aatgagcaag gaggatcatg aacatcacaa 60 <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 24 cttgttctgt tgcatttaat cacaagtttt cattttgtta tacgtacgtg ttataccctg 60 tttttg 66 <210> 25 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 25 ctttgtcaat tatcaaattt caactgcaca gttcacaaat agagtgaggt tgatttgcgg 60 ccgcacgtcc tgcttggcct actaggccaa cgcaggcgct ggccgtgacg gccacgagcg 120 aactaggcct tgggccgcat cgatcgtgaa gtttct 156 <210> 26 <211> 1905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA sequence comprising transgene sequence <400> 26 atggataact cagttttgaa cagtgggaga actacaatct gtgatgctta taacgtggca 60 gctcatgacc ctttttcttt tcagcacaag agtcttgata ctgtccaaaa ggagtggaca 120 gaatggaaaa agaataacca ctctctttac ttggacccta ttgtgggtac tgtcgcctcc 180 ttcctcctta aaaaagttgg atcactcgtt ggaaagagaa ttttgagtga gttgagaaat 240 cttattttcc cttcaggatc taccaatttg atgcaagaca ttctcaggga gactgaaaaa 300 tttctcaacc agaggcttaa cactgacacc ctcgccagag tgaatgctga gcttactggc 360 ttgcaagcta atgttgagga gtttaacagg caagtcgata atttcctcaa tccaaacaga 420 aacgctgtgc ccctcagcat aacttcatca gtgaacacta tgcaacaact gtttttgaat 480 agattgcccc agtttcagat gcaaggttac caactcctct tgcttccact cttcgcccag 540 gctgctaacc tgcatctcag ttttatcagg gatgtgattt tgaatgctga tgagtggggg 600 atttcagctg ccacccttag gacctaccgc gattatctca aaaactacac tagggactac 660 tctaattact gcattaacac ttatcagagc gctttcaagg gacttaatac cagactgcac 720 gacatgctcg agtttaggac ttacatgttt ctgaatgttt tcgagtacgt cagtatttgg 780 agtcttttca agtatcagtc actccttgtt agcagcggtg ctaacttgta cgcttctggg 840 tcagggcccc agcagactca gagctttaca agccaggatt ggcccttcct gtattctctg 900 tttcaagtga atagtaatta cgtgttgaac ggtttctccg gggctaggct gtcaaatacc 960 tttcccaaca ttgtgggact tcctggatct actaccactc acgctctcct ggcagctagg 1020 gttaattatt ctggcggcat tagtagcgga gatattgggg cttctccatt caatcagaat 1080 ttcaactgtt ctacttttct tcctccactc cttactccct tcgttagatc ctggttggat 1140 agtgggtctg atagagaggg cgtcgccacc gttacaaact ggcaaaccga atcctttgaa 1200 acaacactcg gacttaggtc tggcgctttc acagctagag gaaattccaa ttactttcct 1260 gattatttta ttaggaacat aagtggcgtt ccactcgttg ttaggaatga ggacctgagg 1320 agacctcttc attacaacga aataagaaac atcgcatctc catcaggcac ccctggcgga 1380 gctagggctt atatggtttc cgtgcataat agaaagaaca acattcatgc tgtccacgag 1440 aatggatcaa tgattcacct ggctcccaac gactataccg ggtttactat ttcacctatt 1500 cacgccacac aagtcaacaa tcagacaagg accttcattt ccgagaaatt cggaaatcag 1560 ggggacagtc tgagattcga gcagaataac actaccgcaa gatatactct tagaggaaat 1620 ggaaattctt acaacttgta cttgagggtg agctcaatcg gcaattcaac aatcagagtt 1680 actattaacg gcagggtgta tactgcaaca aacgtcaaca ctactacaaa caatgatggc 1740 gttaatgata acggagcaag gttctcagat attaacattg ggaatgttgt cgcaagttcc 1800 aattcagatg tgccccttga tattaacgtg acacttaatt caggcaccca atttgacttg 1860 atgaacataa tgctggtgcc cacaaatatc tcaccactct actaa 1905

Claims (25)

  1. 대두 DNA가 포함된 시료 안에 탐지가능한 재조합 DNA 분자:
    이때 전술한 분자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
    a) 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 및 서열 번호:10으로 구성된 집단에서 선택되거나; 또는
    b) (a)에 완전하게 상보적인 뉴클레오티드,
    이때 이러한 DNA 분자의 존재는 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 재조합 DNA 분자는 ATCC 기탁번호. PTA-120166로 기탁된 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 종자의 대표 시료인, 대두 이벤트 MON87751로부터 유도된, 재조합 DNA 분자.
  3. 엄격한 혼성화 조건하에 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA와 특이적으로 혼성화되는 DNA 프로브로 기능을 하는데 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 세그먼트가 포함된 DNA 분자에 있어서, 이때 전술한 혼성화 조건하에 전술한 DNA 분자의 혼성화의 탐지는 전술한 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 되는, DNA 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 시료는 대두 식물, 대두 식물 세포, 대두 종자, 대두 식물 일부분, 대두 후대 식물, 대두 유, 대두 단백질, 또는 대두 상품 산물을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  5. 시료 내에서 전술한 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 되는 엠플리콘을 만들기 위하여 대두 이벤트 MON87751 주형 DNA가 포함된 시료와 함께 증폭 반응에 이용될 때, DNA 프라이머로 기능을 하는 제 1 DNA 분자와, 제1 DNA 분자와 상이한 제 2 DNA 분자를 포함하는 한 쌍의 DNA 분자들에 있어서, 이때 전술한 엠플리콘은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로 구성된 집단에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 한 쌍의 DNA 분자.
  6. 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 되는 DNA 세그먼트의 존재를 탐지하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 전술한 시료에 청구항 3의 DNA 프로브를 접촉시키고;
    b) 전술한 시료와 전술한 DNA 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에 두고; 그리고
    c) 전술한 시료에 대하여 전술한 DNA 프로브의 혼성화를 탐지하고,
    이때 전술한 탐지 단계는 전술한 시료 안에 전술한 대두 이벤트 MON87751 DNA의 존재에 대한 진단이 된다.
  7. 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 되는 DNA 세그먼트의 존재를 탐지하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 전술한 시료에 청구항 5의 DNA 분자 쌍을 접촉시키고;
    b) DNA 엠플리콘이 생성되는데 충분한 증폭 반응을 실행하고; 그리고
    c) 전술한 반응에서 전술한 DNA 엠플리콘의 존재를 탐지하고,
    이때 전술한 DNA 엠플리콘은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 전술한 엠플리콘의 존재 탐지는 전술한 시료 안에 대두 이벤트 MON87751 DNA에 대한 진단이 된다.
  8. 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 및 서열 번호:10으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 대두 식물, 대두 식물 일부분, 또는 이의 대두 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 전술한 대두 식물, 또는 대두 식물 일부분 또는 대두 세포는 인시목 해충 먹이에 제공될 때 살충제가 되는, 대두 식물, 대두 식물 일부분, 또는 이의 대두 세포.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 전술한 인시목 해충은 크리소데이식스( Chrysodeixis ) spp ., 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp., 헬리코베르파 ( Helicoverpa ) spp., 크로시도세마( Crocidosema ) spp., 라취플루시아 ( Rachiplusia ) spp., 안티카르시아( Anticarsia ) spp., 엘라스모팔푸스 ( Elasmopalpus ) spp., 및 플라티페나( Plathypena ) spp으로 구성된 집단에서 선택되는, 대두 식물, 대두 식물 일부분, 또는 이의 대두 세포.
  11. 청구항 8에 있어서, 이때 전술한 대두 식물은 전술한 대두 이벤트 MON87751을 포함하는 대두 식물의 임의의 후대 세대로 정의되는, 대두 식물, 대두 식물 일부분, 또는 이의 대두 세포.
  12. 곤충 감염으로부터 대두 식물을 보호하는 방법에 있어서, 이때 전술한 방법은 대두의 인시목 해충의 먹이 안에 살충성 효과량의 이벤트 MON87751이 포함된 대두 식물 세포들 또는 조직을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 전술한 인시목 해충은 크리소데이식스( Chrysodeixis ) spp ., 스포도프테라 ( Spodoptera ) spp., 헬리코베르파 ( Helicoverpa ) spp., 크로시도세마( Crocidosema ) spp., 라취플루시아 ( Rachiplusia ) spp., 안티카르시아( Anticarsia ) spp., 엘라스모팔푸스 ( Elasmopalpus ) spp., 및 플라티페나( Plathypena ) spp로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  14. 곤충 저항성 대두 식물을 생산하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 2개의 상이한 대두 식물을 유전자변형 대두 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 2개의 상이한 대두 식물중 최소한 하나와 유성 교배시키고;
    b) 전술한 교배 후대로부터 종자 또는 조직을 샘플링하고;
    c) 대두 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 후대를 식별해내기 위하여 단계 b)의 시료 안에 대두 이벤트 MON87751에 대한 진단이 되는 DNA 세그먼트의 존재를 탐지하고; 그리고
    d) 대두 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 전술한 후대를 선별하고, 이때 전술한 후대는 유전자변형 대두 이벤트 MON87751 DNA가 포함된 곤충 저항성 대두 식물이 된다.
  15. 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 및 서열 번호:10, 또는 완전한 이의 보체들로 구성된 군에서 선택된 탐지가능한 양의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 종자.
  16. 청구항 1에 따른 탐지가능한 양의 재조합 DNA 분자가 포함된 무생물 대두 식물 재료.
  17. 청구항 1에 따른 탐지가능한 양의 재조합 DNA 분자가 포함된 미생물.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 전술한 미생물은 식물 세포인, 미생물.
  19. 이벤트 MON87751에 독특한 탐지가능한 양의 DNA 분자가 포함된 대두 상품 산물에 있어서, 이때 전술한 분자는 청구항 1에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 대두 상품 산물.
  20. 청구항 19에 있어서, 온전한(whole) 또는 가공된(processed) 대두 종자, 대두유, 대두 단백질, 콩가루, 대두 가루, 대두 플레이크(flakes), 대두 겨, 대두 우유, 대두 치즈, 대두 와인, 대두가 포함된 동물 사료, 대두가 포함된 종이, 대두가 포함된 크림, 대두 바이오매스, 그리고 대두 식물 및 대두 식물 일부분으로 구성된 군에서 선택된 상품 산물로 더 정의되는 대두 상품 산물.
  21. 이벤트 MON87751 DNA의 존재에 대한 진단성 엠플리콘을 생산하는 DNA 증폭 방법에서 테스트될 때, 주형으로 기능을 하는 DNA가 포함된 대두 식물, 대두 식물 일부분, 또는 이의 대두 종자.
  22. 이벤트 MON87751가 포함된 대두 식물 또는 대두 종자의 접합자를 결정하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 이벤트 MON87751에 대하여 진단성인 제 1 엠플리콘과 이벤트 MON87751을 포함하지 않는 고유 대두 게놈 DNA에 진단성인 제 2 엠플리콘을 생산할 수 있는 프라이머 세트에 대두 DNA가 포함된 시료를 접촉시키고;
    i) 전술한 시료와 전술한 프라이머 세트로 핵산 증폭 반응을 실행하고; 그리고
    ii) 전술한 핵산 증폭 반응에서 이벤트 MON87751에 대하여 진단성인 전술한 1 엠플리콘, 또는 이벤트 MON87751을 포함하지 않는 고유 대두 게놈 DNA에 진단성인 전술한 2 엠플리콘을 탐지하고;
    이때 전술한 제 1 엠플리콘만이 존재한다는 것은 시료 안에 동종접합성 이벤트 MON87751 DNA의 진단이 되며, 그리고 전술한 제 1 엠플리콘과 전술한 제 2 플리콘 둘 다 존재한다는 것은 이벤트 MON87751대립유전자에 대하여 대두 식물 이종접합성의 진단이 되며;
    b) 이벤트 MON87751 DNA에 특이적으로 혼성화되는 최소한 제1 프로브와, 이벤트 MON87751의 이종성 DNA의 삽입에 의해 교란된 대두 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화되고, 그리고 이벤트 MON87751 DNA에 혼성화되지 않는 최소한 제 2 프로브에 대두 DNA가 포함된 시료를 접촉시키고,
    i) 엄격한 혼성화 조건하에 프로브를 전술한 시료에 혼성화시키고,
    이때 전술한 혼성화 조건하에 전술한 제 1 프로브만의 혼성화 탐지는 전술한 시료 안에 이벤트 MON87751의 동종접합성 대립유전자에 대한 진단이 되며, 이때 전술한 혼성화 조건하에 전술한 제 1 프로브와 전술한 제 2 프로브 모두의 혼성화 탐지는 전술한 시료 안에 이벤트 MON87751 DNA의 이종접합성 대립유전자에 대한 진단이 된다.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 프라이머 세트는 서열 번호:11, 서열 번호:14 및 서열 번호:15를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 프로브 세트는 서열 번호:13 및 서열 번호:16을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 10에 있어서, 이때 전술한 대두 식물은 MON87751, MON89788, MON87708, MON87701, MON87712, MON87769, MON87705, MON87754, GTS 40-3-2, A2704-12, A2704-21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP-305423, DP356043, G94-1, G94-19, G168, GU262, OT96-15, W62, W98,
    Figure pct00018
    DAS-68416-4, FG72, BPS-CV127-9 대두, SYHT04R, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416, pDAB8291.45.36.2, pDAB9582.814.19.1, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, 및 이벤트 127로 구성된 군에서 선택된 유전자변형 이벤트를 더 포함하는 대두 식물, 또는 대두 식물의 일부분.
KR1020167000825A 2013-06-14 2014-06-12 탐지용 대두 유전자변형 이벤트 mon87751 및 이의 이용 방법 KR102180294B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361834899P 2013-06-14 2013-06-14
US61/834,899 2013-06-14
PCT/US2014/042100 WO2014201235A2 (en) 2013-06-14 2014-06-12 Soybean transgenic event mon87751 and methods for detection and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160019534A true KR20160019534A (ko) 2016-02-19
KR102180294B1 KR102180294B1 (ko) 2020-11-18

Family

ID=52020504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167000825A KR102180294B1 (ko) 2013-06-14 2014-06-12 탐지용 대두 유전자변형 이벤트 mon87751 및 이의 이용 방법

Country Status (22)

Country Link
US (5) US9719145B2 (ko)
EP (2) EP3296403A1 (ko)
JP (1) JP6635916B2 (ko)
KR (1) KR102180294B1 (ko)
CN (1) CN105531376B (ko)
AR (2) AR096610A1 (ko)
AU (1) AU2014278155B2 (ko)
BR (1) BR112015031127A2 (ko)
CA (1) CA2914941A1 (ko)
CL (1) CL2015003608A1 (ko)
CR (2) CR20200207A (ko)
EA (1) EA036941B1 (ko)
ES (1) ES2869439T3 (ko)
GT (1) GT201500345A (ko)
MX (1) MX356384B (ko)
NI (1) NI201500174A (ko)
PT (1) PT3008187T (ko)
TW (1) TWI718088B (ko)
UA (1) UA124407C2 (ko)
UY (1) UY35613A (ko)
WO (1) WO2014201235A2 (ko)
ZA (1) ZA201509201B (ko)

Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015057571A2 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Mendel Biotechnology, Inc. Yield improvement in plants
WO2015069557A2 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Mendel Biotechnology, Inc. Resource use efficiency improvement in plants
BR112018004779A8 (pt) 2015-09-11 2022-08-09 Bayer Cropscience Lp Variantes de hppd e métodos de uso
CN106086194A (zh) * 2016-06-27 2016-11-09 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 实时荧光pcr技术鉴定转基因大豆das‑44406‑6品系的引物组和方法
BR112019011293A2 (pt) 2016-12-19 2019-10-08 Basf Se compostos de fórmula i, intermediários, composição agroquímica, uso e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos
BR112019012499A2 (pt) 2016-12-22 2020-04-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto, proteção de plantas, produção de uma planta, identificação do evento de elite ee-gm5, confirmação da pureza de sementes, determinação do estado de zigosidade, redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento, processo para controle de ervas daninhas, uso da planta, uso de uma semente de soja, par de iniciadores, sonda, estojos e métodos de detecção da presença do evento de elite ee-gm5
US11572361B2 (en) 2016-12-22 2023-02-07 Syngenta Participations Ag Polymorphs
CA3046232A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event ee-gm4 and methods and kits for identifying such event in biological samples
GB201622007D0 (en) 2016-12-22 2017-02-08 And See Cambridge Display Tech Ltd Syngenta Participations Ag Polymorphs
US11425910B2 (en) 2017-02-21 2022-08-30 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
UY37623A (es) 2017-03-03 2018-09-28 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol tiofeno fungicidas
CA3055680A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2018177880A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
EP3606913B1 (en) 2017-04-03 2022-04-27 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184985A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019020756B1 (pt) 2017-04-05 2023-11-28 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de oxadiazol microbicidas, composição agroquímica compreendendo os mesmos, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso desses compostos
BR112019020819B1 (pt) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag Composto de fórmula (i), composição agroquímica, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por micro-organismos fitopatogênicos e uso de um composto de fórmula (i)
WO2018184987A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184986A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184982A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3606912A1 (en) 2017-04-07 2020-02-12 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018202487A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted 5-(haloalkyl)-5-hydroxy-isoxazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3630753A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019024993A2 (pt) 2017-06-02 2020-06-16 Syngenta Participations Ag Composições fungicidas
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US11154058B2 (en) 2017-06-14 2021-10-26 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
EP3642187A1 (en) 2017-06-19 2020-04-29 Basf Se 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi
CN107177687A (zh) * 2017-06-22 2017-09-19 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 转基因棉花mon88701品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CA3067309A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2019011929A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019011923A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019011928A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
BR112020000371A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-14 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
BR112020000414A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-21 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbicidas
WO2019012003A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
BR112020004441B1 (pt) 2017-09-18 2024-01-16 Basf Se Compostos da fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso de compostos e método não-terapêutico de combate de fungos
UY37912A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan grupos terminales heteroarilo o heteroariloxi
UY37913A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan un grupo terminal cuaternario
EP3710429B1 (en) 2017-11-15 2023-04-05 Syngenta Participations AG Microbiocidal picolinamide derivatives
US11147275B2 (en) 2017-11-23 2021-10-19 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2019145221A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 BASF Agro B.V. New agrochemical formulations
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
WO2019154663A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
UA126830C2 (uk) 2018-03-01 2023-02-08 Басф Агро Б.В. Фунгіцидні композиції мефентрифлуконазолу
US20190276840A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 James A. Baum Methods and compositions for making and using compatible insecticidal proteins
BR112020021645A2 (pt) 2018-04-26 2021-01-26 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbicidas
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
US20210269426A1 (en) 2018-06-29 2021-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112020027003A2 (pt) 2018-07-02 2021-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de 3-(2-tienil)-5-(trifluorometil)-1,2,4-oxadiazol como fungicidas agroquímicos
EP3823966A1 (en) 2018-07-16 2021-05-26 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3613736A1 (en) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituted glutarimide derivatives
EP3628158A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide
BR112021007156A2 (pt) 2018-10-17 2021-07-20 Syngenta Crop Protection Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
AR116628A1 (es) 2018-10-18 2021-05-26 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos microbiocidas
ES2955718T3 (es) 2018-10-23 2023-12-05 Basf Se Compuestos pesticidas tricíclicos
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
EP3670501A1 (en) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
MA54689B1 (fr) 2019-01-11 2023-07-31 Basf Se Formes cristallines de 1-(1,2-diméthylpropyl)-n-éthyl-5-méthyl-n-pyridazine-4-yl-pyrazole-4-carboxamide
EP3696177A1 (en) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2020165403A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds
US20220132849A1 (en) 2019-02-20 2022-05-05 Syngenta Crop Protection Ag Use of spiropidion
GB201903942D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
WO2020208095A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal picolinamide derivatives
CN113966171A (zh) 2019-04-10 2022-01-21 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
CN113748337A (zh) * 2019-04-16 2021-12-03 花王株式会社 大豆的产量预测方法
EP3769623A1 (en) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
WO2020239517A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
MX2021014864A (es) 2019-06-06 2022-01-18 Basf Se N-(pirid-3-il)carboxamidas fungicidas.
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
EP3994124A1 (en) 2019-07-05 2022-05-11 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal picolinamide derivatives
GB201910037D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
CN111247255B (zh) * 2019-08-09 2023-06-27 北京大北农生物技术有限公司 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法
AU2019460919B2 (en) * 2019-08-09 2024-03-21 Beijing Dabeinong Biotechnology Co., Ltd. Nucleic acid sequence for detecting soybean plant DBN8002 and detection method therefor
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
UY39115A (es) 2020-03-05 2021-10-29 Syngenta Crop Protection Ag Mezclas fungicidas de derivados de arilo metoxiacrilato
KR20220151177A (ko) 2020-03-05 2022-11-14 신젠타 크롭 프로텍션 아게 살진균 조성물
CN115443267A (zh) 2020-04-28 2022-12-06 巴斯夫欧洲公司 杀害虫化合物
EP3903584A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv
EP3903581A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i
EP3903583A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii
EP3903582A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii
GB202006399D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006386D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal Compounds
GB202006480D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006606D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
EP3909950A1 (en) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP3945089A1 (en) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
CN111705154A (zh) * 2020-07-13 2020-09-25 大连海关技术中心 检测转基因大豆mon87712的试剂盒及方法
EP3939961A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
EP3970494A1 (en) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii
MX2023002436A (es) 2020-08-31 2023-03-22 Basf Se Mejora del rendimiento.
GB202014840D0 (en) 2020-09-21 2020-11-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
EP4236691A1 (en) 2020-10-27 2023-09-06 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
AR124281A1 (es) 2020-11-27 2023-03-15 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones plaguicidas
UY39544A (es) 2020-12-02 2022-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas que comprenden una mezcla de componentes (a) y (b) como principios activos
WO2022117650A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
KR20230121790A (ko) 2020-12-14 2023-08-21 바스프 에스이 술폭시민 살충제
EP4043444A1 (en) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
AR125089A1 (es) 2021-03-19 2023-06-07 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones plaguicidas
EP4333616A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 Basf Se Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms
CN117222314A (zh) 2021-05-04 2023-12-12 先正达农作物保护股份公司 烯草酮用于昆虫控制的用途
EP4091451A1 (en) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
WO2022243109A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Basf Se New substituted quinolines as fungicides
KR20240008857A (ko) 2021-05-18 2024-01-19 바스프 에스이 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘
WO2022243111A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Basf Se New substituted pyridines as fungicides
EP4355764A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Basf Se Yield improvement by gene combinations
CN117597025A (zh) 2021-07-02 2024-02-23 先正达农作物保护股份公司 精吡氟禾草灵用于昆虫控制的用途
EP4119547A1 (en) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
WO2023011958A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Basf Se (3-pirydyl)-quinazoline
WO2023011957A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Basf Se (3-quinolyl)-quinazoline
EP4140986A1 (en) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4140995A1 (en) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4151631A1 (en) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
EP4194453A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4198033A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023156270A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Basf Se Coumarin synthesis and uses thereof
EP4238971A1 (en) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
WO2023183765A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Donald Danforth Plant Science Center Geminivirus resistant plants
WO2024006698A2 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event gm_csm63770 and methods for detection and uses thereof
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
CN116064891A (zh) * 2022-08-08 2023-05-05 拱北海关技术中心 用于检测mon87751转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
CN116103326B (zh) * 2022-08-19 2023-12-29 大连民族大学 用于转基因大豆品系特异性检测的质粒标准分子及其应用
CN116103332A (zh) * 2022-09-07 2023-05-12 杭州瑞丰生物科技有限公司 转基因大豆事件cal16及其检测方法
EP4342885A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026371A1 (en) * 1998-11-04 2000-05-11 Monsanto Co. Methods for transforming plants to express bacillus thuringiensis delta-endotoxins
JP2009505679A (ja) * 2005-08-31 2009-02-12 モンサント テクノロジー エルエルシー 殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
EG26529A (en) 2001-06-11 2014-01-27 مونسانتو تكنولوجى ل ل سى Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera
US7166771B2 (en) * 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
EP2021476B1 (en) * 2006-05-26 2014-07-09 Monsanto Technology, LLC Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof
DE102007009957A1 (de) * 2006-12-27 2008-07-03 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionsptentials transgener Pflanzen
WO2008112633A2 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Monsanto Technology Llc Method of meristem excision and transformation
EP2209897A1 (en) * 2007-11-15 2010-07-28 Monsanto Technology, LLC Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87701 and methods for detection thereof
KR101597376B1 (ko) * 2008-02-15 2016-02-26 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 트랜스제닉 계통 ｍｏｎ８７７６９에 상응하는 대두 식물 및 종자, 및 그의 검출 방법
WO2011084629A1 (en) * 2009-12-16 2011-07-14 Dow Agrosciences Llc Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects
KR102270067B1 (ko) 2013-03-14 2021-06-28 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 성분 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026371A1 (en) * 1998-11-04 2000-05-11 Monsanto Co. Methods for transforming plants to express bacillus thuringiensis delta-endotoxins
JP2009505679A (ja) * 2005-08-31 2009-02-12 モンサント テクノロジー エルエルシー 殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列

Also Published As

Publication number Publication date
US9719145B2 (en) 2017-08-01
PT3008187T (pt) 2021-05-24
WO2014201235A3 (en) 2015-01-29
ES2869439T3 (es) 2021-10-25
US20220195538A1 (en) 2022-06-23
CN105531376A (zh) 2016-04-27
EP3008187B1 (en) 2021-03-31
EP3008187A4 (en) 2017-02-01
US20140373191A1 (en) 2014-12-18
CR20160020A (es) 2016-02-08
UY35613A (es) 2015-01-30
EP3296403A1 (en) 2018-03-21
WO2014201235A2 (en) 2014-12-18
JP6635916B2 (ja) 2020-01-29
UA124407C2 (uk) 2021-09-15
KR102180294B1 (ko) 2020-11-18
NI201500174A (es) 2016-01-25
TW201534720A (zh) 2015-09-16
US20240084407A1 (en) 2024-03-14
CA2914941A1 (en) 2014-12-18
TWI718088B (zh) 2021-02-11
BR112015031127A2 (pt) 2017-12-12
JP2016521576A (ja) 2016-07-25
US11236399B2 (en) 2022-02-01
MX2015017071A (es) 2016-04-21
US11767568B2 (en) 2023-09-26
US10584391B2 (en) 2020-03-10
US20200216917A1 (en) 2020-07-09
GT201500345A (es) 2017-11-24
ZA201509201B (en) 2017-03-29
AU2014278155B2 (en) 2018-05-17
CL2015003608A1 (es) 2016-05-20
AU2014278155A1 (en) 2016-01-21
EP3008187A2 (en) 2016-04-20
CR20200207A (es) 2020-07-19
AR118831A2 (es) 2021-11-03
CN105531376B (zh) 2019-08-02
MX356384B (es) 2018-05-24
EA201690018A1 (ru) 2016-05-31
EA036941B1 (ru) 2021-01-18
US20170362667A1 (en) 2017-12-21
AR096610A1 (es) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102180294B1 (ko) 탐지용 대두 유전자변형 이벤트 mon87751 및 이의 이용 방법
US20220010326A1 (en) Transgenic Maize Event MON 87419 and Methods of Use Thereof
KR101818775B1 (ko) 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법
JP6315481B2 (ja) トウモロコシイベントｍｏｎ８７４１１
KR101813722B1 (ko) 벼의 17314 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법
CN101027396A (zh) Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定
KR20140051362A (ko) 대두 이벤트 ｐＤＡＢ９５８２.８１４.１９.１ 및 ｐＤＡＢ４４６８.０４.１６.１의 곤충 저항성 및 제초제 내성 육종 스택
US11578339B2 (en) Transgenic corn event MON95275 and methods for detection and uses thereof
CN112852991A (zh) 转基因玉米事件lp007-7及其检测方法
KR20210038439A (ko) 옥수수 형질전환 이벤트 mon 95379 및 검출 방법, 그리고 이의 용도
CN111247255A (zh) 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法
KR20220031927A (ko) 대두 식물 dbn8002를 검출하기 위한 핵산 서열 및 이의 검출 방법
AU2016349780A1 (en) Cotton transgenic event mon 88702 and methods for detection and uses thereof
WO2023155193A1 (zh) 用于检测大豆植物dbn8205的核酸序列及其检测方法
US20240035100A1 (en) Soybean transgenic event gm_csm63770 and methods for detection and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant