CN108882716B - 棉花转基因事件mon 88702以及其检测和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种转基因陆地棉事件MON 88702；包含事件MON 88702的植株、植物细胞、种子、植物部分、子代植株以及商品产品。本发明还提供对事件MON 88702具特异性的多核苷酸；包含用于事件MON 88702的多核苷酸的植株、植物细胞、种子、植物部分、子代植株以及商品产品。本发明还提供与事件MON 88702有关的方法。

Description

棉花转基因事件MON 88702以及其检测和使用方法
相关申请的引用
本申请要求2015年11月2日提交的美国临时申请号62/249,758的权益，该临时申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表的合并
命名为MONS405WO-sequence_listing.txt的文件中所含的序列表为33.3千字节(大小如在Microsoft
Figure BDA0001670858440000011
中所测量)，创建于2016年11月2日，通过电子提交与本文一起提交，并且以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及一种称为MON 88702的转基因棉花事件。所述事件通过提供先前不可用于棉花植株中的独特杀虫毒素蛋白来抵抗棉花的半翅目和缨翅目侵染。此杀虫毒素蛋白对于控制棉花植株特有的半翅目和缨翅目物种侵染来说为高度有效的。本发明还涉及与事件MON 88702有关的棉花植株、植物部分、植物种子、植物细胞、子代植株、农产品以及方法，并且提供如下核苷酸分子，所述核苷酸分子对所述事件来说是独特的，结合转基因DNA插入陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)细胞的基因组中而形成，并且适合用于检测含有棉花核酸的生物样品中此事件的存在。
发明背景
棉花在世界上许多地区是重要的作物，并且已应用生物技术方法来产生具有所需性状的棉花变种。一种此类所需性状为抗虫性。抗虫性转基因在棉花植株中表达可赋予所需抗虫性性状。许多不同因素影响转基因的表达，包括驱动转移至植物染色体的个别基因表达的盒的取向和组成、转基因插入物的染色体位置以及转基因插入的基因组结果。举例来说，在转基因的染色体插入位点有所不同但以其他方式相同的的个别事件之间，转基因表达的水平和模式可能有变化。事件之间还可能有表型和农艺学差异。
为了制备含有单一转化事件的转基因棉花植株，将重组DNA构建体的一部分转移至棉花细胞的基因组中，并且随后使棉花细胞生长成植株。使所述事件最初转移至其中的棉花细胞再生以产生R0代。可针对任何所需性状对R0植株和来自R0植株的子代植株进行测试，但事件的有效性可能会受到相对于转化事件中的整合位点的顺式和/或反式因子的影响。由事件赋予的表型还可能会受DNA构建体的尺寸和设计的影响，DNA构建体的尺寸和设计可根据表达盒中的基因元件的组合、转基因的数目、表达盒的数目以及此类元件和此类盒的构型而变化。鉴定具有所需性状的事件可能会因诸如转基因表达的植株发育模式、昼夜模式、时间模式或空间模式等因素或因诸如环境植物生长条件、水可获得性、氮有效性、热或应力等外部因素而进一步被复杂化。因此，获得赋予所需转基因表达水平以及所需表型和农艺学性状集合的事件的能力不是轻易可预测的。
归因于这些对事件功效有影响的许多因素，为了形成具有所需性状的适当表达以及对商业上获得成功来说适合的最佳表型和农业特征的事件，必须产生并分析大量的个别植株细胞转化事件。形成商业上有价值的转基因事件需要进行大量分子表征并且在许多实验事件情况下历经多年、在多个位置并且在多种条件下进行温室和田间试验。收集大量的功效、表型以及分子数据，并且然后由科学工作者和农学家队伍对所得数据和观测结果进行分析，目标是选择一个或多个在商业上适合的事件。此类事件一旦被选择，就然后被用于使用植物育种方法将所需转基因性状种质渗入至其他遗传背景中，由此产生许多不同的棉花作物变种，这些棉花作物变种含有所需性状并且适当地适应特定局部农艺学条件。
转基因棉花植物为本领域中已知的，但仅已产生表达鳞翅目毒素或除草剂耐受性基因的植株。不存在用于控制棉花作物的半翅目(诸如草盲蝽、棉跳盲蝽(cottonfleahopper)以及佛得植食蝽(verde plant bug))以及缨翅目(诸如蓟马)害虫的商业转基因棉花植株。
草盲蝽物种可通过切口威胁棉花作物最早期的现蕾并且最终威胁成铃。昆虫刺穿棉蕾并且损害花药和其他组织。当棉蕾不到5毫米长时，它们枯萎，变成棕色，并且从植株上掉落。对较大棉蕾的损害可能是对花药、花柱以及柱头，并且可能妨碍受精。如果许多棉蕾掉落，那么植株可能会将其能源用到营养生长中，从而产生产量降低的细长植株。草盲蝽物种还以顶端分生组织为食并且破坏顶端分生组织，从而造成丛生植株。如果草盲蝽刺穿幼铃(典型地不到十天龄)的壁并且以幼小种子为食，那么这些种子可能不能发育。损伤的种子周围的棉绒被染成黄色，并且可能不会正常地成熟。
棉跳盲蝽可引起棉蕾的过度损耗，从而导致产量降低和收获延迟。棉跳盲蝽在得克萨斯和俄克拉荷马州是主要的棉花害虫，并且在新墨西哥州、阿肯色州、路易斯安那州以及美国中南部其他州是偶见的害虫。当大量的害虫群体未得到控制时，产量损失可能变得极其高。棉跳盲蝽若虫和成虫以脆弱植物部分，尤其是顶芽和小蕾的汁液为食。变形或参差不齐的叶子常常被看做是这种进食的结果。最大的损害是对不比针头大的小蕾。小蕾变成棕色或黑色并且在被食用之后脱落。严重侵染的植株长得高且像鞭子一样，结果枝的生长受限，并且通常仅靠近顶部产生几个棉铃。因此难以检测昆虫和其损害，直到持续发生经济损失。
佛得植食蝽(本地物种)在过去的十至十五年间沿美国的墨西哥湾海岸作为重要的棉铃进食者出现。在这一时间期间，在南得克萨斯地区棉花产量因棉花铃腐病而遭受损失。引入引起铃腐病的细菌病涉及以棉铃为食的刺吸式昆虫。佛得植食蝽为在2010和2011年，在沿南得克萨斯的从拉瓦卡港到约格兰德谷低地的海岸弯曲地区靠近海岸的棉花田中，从盛开期到晚开期的主要的棉铃进食吸入型蝽物种(使用打击桶(beat bucket)收集的昆虫中的>98％)。这在沿岸水域8km内的田地中为常见的(在盛开期到晚开期期间每个植株平均0.42个蝽)，而在内陆田地中未检测到。在所检查的多达25％的开口棉铃上发现棉花铃腐病，所述疾病集中于发现佛得植食蝽的海岸田地中，并且它是棉铃损害的主要贡献者。田间调查的结果以及佛得植食蝽以关笼植株为食支持佛得植食蝽存在与收获时开口棉铃中的后续收获相关的棉花铃腐病的正相关(Armstrong,J.,Brewer,M.,Parker,R.以及Adamzyk,J.(2013)Verde Plant Bug(Hemiptera:Miridae)Feeding Injury to CottonBolls Characterized by Boll Age,Size,and Damage Ratings,J.Econ.Entomol.106(1):189
Figure BDA0001670858440000041
195)。以棉铃为食的佛得植食蝽还引起棉绒和种子染色。
蓟马具有“穿孔和吸入”口器，所述口器允许它们在叶细胞中打洞，插入其下颚针，并且吸取细胞液。当蓟马以细小的发育中的叶子上和结果结构上的顶芽为食时，损伤可能是严重的。当蓟马以顶芽内幼小的未发育的叶子为食时，所得损害随着这些叶子发育和扩展而放大。这是因为损坏的组织未能适当发育，而未损坏的组织持续生长。在长期进食或由大量蓟马进食之后，秧苗具有参差不齐的外观，子叶和未端叶组织上具有可见银色进食位点。随时间推移，这些银色区域的颜色将变成棕色。严重损伤的叶子通常具有皱缩破烂的外观并且常常在边缘处向上卷起。具有此类型损伤的秧苗常常被描述为“负鼠耳棉”。大量的蓟马群体可矮化生长，造成顶芽死亡(产生“发疯棉”)，推迟结果，并且降低直立程度。严重蓟马损伤可引起基本棉花产量降低。幼虫与成虫两者均显示在花上和花中进食的偏好，使得它们特别难以用化学杀虫剂控制。此外，西花蓟马(Frankliniella occidentalis)(西方花蓟马)为对棉花植株造成损害的不同植物斑萎病毒(例如番茄斑萎病毒和棉花卷叶病毒)的非常高效的载体。总之，蓟马可严重影响早季直立和植株活力并且对棉花农场主来说可能是非常昂贵的。
化学杀虫剂为当前针对豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)(西方无泽植食蝽(Westerntarnished plant bug))、牧草盲蝽(Lygus lineolaris)(无泽植食蝽)、棉伪斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)(棉跳盲蝽)、斑点淡盲蝽(Creontiades signatus)(Distant)(佛得植食蝽)以及缨翅目害虫花蓟马属(Frankliniella spp)和变异绢蓟马(Sericothrips variabilis)(蓟马)所用的昆虫控制方法。这些化学杀虫剂方法常常需要多次施加化学杀虫剂和不同类型的化学杀虫剂。举例来说，为了控制草盲蝽可能需要每季进行多达五次至十次处理。为了控制蓟马，可能需要每季进行两次至三次处理。需要进行至少一次处理来控制棉跳盲蝽。
使用化学杀虫剂来控制害虫增加农场主种植棉花的成本，特别是在经历高昆虫侵染的区域中，由此降低来源于棉花生产的任何潜在利润。此外，以多次施加来使用不同的化学杀虫剂可能对环境和益虫具有负面影响。另外，在这些棉花害虫中已观测到对化学杀虫剂的抗性。举例来说，西方花蓟马西花蓟马(Pergande)已显示对许多不同化学杀虫剂的抗性(Sten Jensen(2006)Insecticide resistance in the western flower thrips,Frankliniella occidentalis,Integrated Pest Management Reviews,5:131-146)。还观测到了对用以控制无泽植食蝽(牧草盲蝽)的多种类别的化学杀虫剂(氨基甲酸酯、有机磷酸酯以及拟除虫菊酯杀虫剂)的抗性(GL Snodgrass等,(2009)Acephate resistance inpopulations of the tarnished plant bug(Heteroptera:Miridae)from theMississippi River Delta.J Econ Entomol,102(2):699-707)。
由于与使用化学杀虫剂来控制棉花害虫相关的经济和环境保护费用以及对化学杀虫剂的抗性的产生，对表达对豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)、牧草盲蝽(无泽植食蝽)、棉伪斑腿盲蝽(棉跳盲蝽)、斑点淡盲蝽(Distant)(佛得植食蝽)以及缨翅目害虫花蓟马属和变异绢蓟马(蓟马)的杀虫毒素活性的棉花植株存在需要。
发明概述
在一个方面中，本发明提供与现有转基因棉花植株和平行构建的新事件相比展现优良特性和性能的包含事件MON 88702的转基因棉花植株。棉花事件MON 88702在插入棉花基因组中的单一基因座处含有赋予对半翅目和缨翅目害虫的抗性的性状的表达盒。
在一个实施方案中，事件MON 88702的特征为适合用于检测样品中所述事件的存在的特定独特DNA区段。样品旨在指为基本上纯的棉花DNA的组合物或含有棉花DNA的组合物。在任一情况下，样品为生物样品，即它含有生物材料，包括但不限于直接或间接获自或衍生自包含事件MON 88702的棉花的基因组的DNA。“直接”是指熟练技工能够通过破碎棉花细胞(或通过获得含有破碎的棉花细胞的棉花样品)并且出于检测的目的使基因组DNA暴露而从棉花基因组直接获得DNA。“间接”是指熟练技工能够通过除了通过直接经由破碎棉花细胞或获得含有破碎的棉花细胞的棉花样品以外的手段来获得目标或特定参考DNA，即本文描述为可诊断特定样品中事件MON 88702的存在的新颖且独特的接点区段。此类间接手段包括但不限于扩增含有由被设计成以特异性结合于靶序列的特定探针靶向的DNA序列的DNA区段，或扩增可测量和表征，即通过经由诸如琼脂糖或丙烯酰胺凝胶等某种高效基质与其他DNA区段分离来进行测量，或通过扩增子的直接序列分析或将扩增子克隆至载体中并且对存在于此类载体内的插入的扩增子直接测序来进行表征的DNA区段。或者，可通过各种手段来克隆对应于棉花染色体内转基因DNA插入棉花染色体中并且可用于定义事件MON88702的位置的DNA区段，并且然后鉴定和表征其在特定样品中或特定棉花基因组中的存在。此类DNA区段被称为接点区段或序列，并且可为任何长度的插入的DNA和相邻(侧接)棉花染色体DNA，只要插入的DNA与棉花基因组之间的连接点被包括在所述区段中即可。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6以及SEQ ID NO:10以及这些序列中的每一种的反向互补序列代表此类区段。
本文中所鉴定的特定序列可唯一地存在于事件MON 88702或其中所包含的构建体中，并且无论是通过直接序列分析、通过检测结合于此类序列的探针还是通过观测本文所描述的特定扩增子的尺寸和也许是组成来鉴定这些序列，当存在于特定棉花种质或基因组中和/或存在于含有棉花DNA的特定生物样品中时，即可诊断在此类样品中存在事件MON88702或其中所包含的构建体。已知侧接基因组区段(即，邻近插入的转基因DNA的DNA序列的棉花基因组区段)具有轻微变异性并且因此，关于棉花基因组之间的此类异常或多态性限制为至少99％或更大的同一性。在一个实施方案中，在长度范围内与本文提到的特定诊断序列相比较完全互补的核苷酸区段旨在在本发明范围内。
图1中说明了本发明的核苷酸区段相对于彼此以及在棉花基因组内的位置，并且如SEQ ID NO:10中所阐述说明了各自的核苷酸序列。表征事件MON 88702并且可诊断样品中事件MON 88702或其中所包含构建体的存在的核苷酸区段包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26。当样品含有棉花组织并且因此含有棉花DNA时，此类样品中存在这些核苷酸序列中的一个或两个或更多个可诊断事件MON 88702或其中所包含构建体的存在。
通过使用措辞“衍生”预期特定DNA分子位于棉花植物基因组中，或能够在棉花植株DNA中被检测到。“能够被检测到”是指特定DNA区段能够被扩增并且通过DNA序列分析表征或阐明其尺寸和或序列，并且还可指探针能够特异性地结合于特定DNA区段，即靶DNA区段，并且随后能够检测探针与靶标的结合。在某些实施方案中，本发明的特定DNA区段或靶DNA区段存在于含有插入事件MON 88702的棉花内。
通过提到棉花，预期棉花细胞、棉花种子、棉花植物部分以及棉花植株在本发明范围内，只要各实施方案含有可检测量的对应于本文中描述为可诊断棉花事件MON 88702DNA的存在的区段中的任何一个、两个或更多个的DNA即可。在某些实施方案中，棉花植物部分包括细胞；花粉；胚珠；花；棉绒；种子；根组织；茎组织；以及叶组织。由其中可检测量的DNA区段在本文中被描述为可诊断事件MON 88702的存在的棉花制成的商品产品在本发明的范围内。在一些实施方案中，此类商品产品可包括整粒或加工的棉花种子、棉花纤维、棉油和棉油衍生物、棉花蛋白质、棉粕、包含棉花的动物饲料、包含棉花的纸、棉花生物质、烛芯、棉线、棉绳、棉球、棉絮、棉花燃料产品(诸如衍生自棉油的燃料或衍生自轧棉机废弃物的球粒)以及棉花纤维素产品(诸如人造丝、塑料、照相胶片、玻璃纸、用于各种工业用途(诸如绝缘材料、亚麻油毡、油布、防水材料)以及作为底漆的脂肪酸)。
在一个实施方案中，棉花事件MON 88702的DNA可存在于含有所述事件的棉花植株、棉花种子以及棉花组织的各细胞中和其一个染色体上的各基因组中。随着棉花基因组被以孟德尔方式(Mendelian fashion)传递至子代，如果棉花植株对事件MON 88702插入为纯合，那么各子代棉花植株和细胞将在含有事件MON 88702插入的亲本染色体的各等位基因上含有所述事件DNA并且被子代从亲本遗传。然而，如果含有事件MON 88702 DNA的棉花基因组为杂合或杂交亲本，那么来自杂交亲本的参与交配的约百分之五十的花粉和约百分之五十的胚珠将含有棉花事件MON 88702 DNA，从而产生含有事件MON 88702 DNA的子代的混合群体，并且由杂交种的此类杂交产生的具有传递给子代的事件MON 88702 DNA的此类子代的百分比可在从约百分之五十到约百分之七十五间的任何范围内。
在另一实施方案中，本发明的DNA分子可对插入的转基因事件MON 88702 DNA的任一末端上与邻近(即侧接)MON 88702插入的DNA的各末端的棉花基因组DNA的两个分开的接点来说为独特的，或对棉花事件MON 88702插入的DNA来说为独特的。当通过本文所描述的方法使用探针、引物并且在一些情况下使用DNA序列分析所分析的特定棉花样品中存在具有这些接点序列的序列的DNA分子时，可诊断所述样品中存在一定量的事件MON 88702棉花。可以许多方式来鉴定和表征对棉花事件MON 88702 DNA来说独特的此类DNA分子，包括通过使用被设计成特异性地结合于独特DNA分子的探针核酸分子，随后检测此类探针与所述独特DNA的结合，以及通过热扩增方法，所述热扩增方法使用至少两种不同的DNA分子，所述至少两种不同的DNA分子充当探针，但此类分子的序列的特异性可能略低于上文所描述的探针。熟练技工了解，使特定靶DNA与探针或引物在适当杂交条件下接触将使得探针或引物结合于靶DNA区段。
在一个实施方案中，本发明的DNA分子可为靶DNA区段，所述靶DNA区段能够扩增，并且当作为通过特定样品的扩增方法获得的所呈现长度的一个或多个扩增子被检测到时，可诊断此类样品中事件MON 88702或其中所包含的构建体的存在。在另一实施方案中，此类DNA分子或多核苷酸区段可具有如以下中的每一种中所阐述的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26，并且在本文中和以下实施例中进一步定义。可将引物分子和/或探针与包括对照的必需试剂一起提供于试剂盒中，并且与使用说明书包装在一起。
在一个方面中，当本发明的重组DNA分子存在于微生物内或衍生自微生物时被认为在本发明范围内。在一个实施方案中，微生物旨在包括任何微观细胞，所述任何微观细胞为原核或真核的，或以其他方式在基因组或染色体或更通常被称为质粒或载体的染色体外DNA结构内含有DNA。在其他实施方案中，微观有机体包括细菌(原核生物)和对应于较高生命形式(真核生物)的细胞，所述细胞低于普通人类的视觉范围，典型地低于五十立方微米并且更通常低于十立方微米。细菌为常见的很可能可含有载体或质粒的微观微生物，所述载体或质粒含有本发明的新颖DNA区段中的一个或多个或全部，包括如SEQ ID NO:27中所阐述而存在的表达盒。在其他方面中，当植物细胞和特别是棉花植物细胞含有本发明的新颖DNA区段中的任何一个、两个或更多个或全部时，这些细胞在本发明的范围内。
在另一方面中，用于本文中的探针可包含足够长度的DNA分子或多核苷酸区段，以发挥在如本文所定义的严格杂交条件下与特定靶DNA区段结合的功能，所述特定靶DNA区段为存在于事件MON 88702 DNA内并且可诊断样品中事件MON 88702 DNA的存在的独特DNA区段。可将此类探针设计成仅结合于单一接点或仅存在于棉花事件MON 88702 DNA中的其他新颖序列，或结合于两个或更多个此类单一接点区段。在一个实施方案中，检测到此类探针与疑似含有棉花DNA的特定样品中的DNA分子的结合可诊断样品中棉花事件MON 88702的存在。
在另一方面中，引物可包含用于热扩增反应的不同寡核苷酸或多核苷酸区段的配对，所述热扩增反应扩增特定DNA靶区段。将配对中的各引物设计成结合于用于扩增的所关注的DNA区段内或其附近的相当特定的DNA区段。所述引物以此类方式结合，使得这些区段然后充当核酸序列聚合的局部化区，从而使得产生一个或多个扩增子(扩增的靶DNA区段)。在本发明的一个实施方案中，使用被设计成结合于特定生物样品中的棉花事件MON 88702DNA的独特区段并且扩增含有本文所描述的接点区段中的一个或多个的特定扩增子的引物，并且在聚合酶反应完成或终止后检测和/或表征到此类扩增子可诊断特定样品中棉花事件MON 88702的存在。熟练技工非常熟悉此扩增方法并且在此不必叙述扩增的细节。
在另一方面中，本发明提供对由半翅目和缨翅目害虫侵染具抗性的棉花植株、棉花植物细胞、棉花植物组织以及棉花种子，所述半翅目和缨翅目害虫包括但不限于豆荚草盲蝽、牧草盲蝽、棉伪斑腿盲蝽、斑点淡盲蝽、花蓟马属以及变异绢蓟马。在一个特定实施方案中，对由半翅目和缨翅目物种侵染的抗性是结合编码杀虫蛋白的DNA区段的表达而产生，所述杀虫蛋白可操作地并且共价地键联在插入的转基因DNA内：从如SEQ ID NO:10中阐述和图1b中说明的插入的转基因DNA内的表达盒表达的TIC834_16蛋白(美国专利申请US20130269060，SEQ ID NO:34)。
在棉花事件MON 88702中提供对半翅目和缨翅目害虫的抗性的TIC834_16蛋白是由嵌合FMV/Hsp81.2嵌合启动子表达(美国专利US8,940,962)。图1b示出了SEQ ID NO:10内所包含的转基因盒内的各表达元件(增强子(E)、启动子(P)、5'UTR(L)、3'UTR(T))以及TIC834_16编码序列的相对位置。评估了其他构建体并且在所用表达元件方面有所变化。用于形成棉花事件MON 88702的转基因盒当评估对半翅目和缨翅目害虫侵染的抗性时相对于其他转基因盒提供性能优势。
基于与数千种不同的独立转基因事件的比较来选择事件MON 88702，这些独立转基因事件各自用包含以SEQ ID NO:27形式呈现的转基因盒的构建体或包含TIC834_16编码序列或使用不同表达元件表达的相关变体毒素蛋白的其他构建体进行转化。将所产生的表达TIC834_16和与TIC834_16有关的变体的事件与非转基因对照棉花变种DP393对半翅目和缨翅目害虫的抗性相比较。如以下实施例中所说明的结果表明事件MON 88702归因于TIC834_16蛋白的表达而产生优良的特性。使用用于产生事件MON 88702的构建体所产生的多个转基因事件各自比使用其他构建体所产生的其他事件更可能展现对半翅目和缨翅目害虫的有效控制。
在一个方面中，含有对应于事件MON 88702的DNA的棉花植株和其包括种子的部分在本发明范围内。在一个实施方案中，此类植株和其包括种子的部分对半翅目和缨翅目侵染具抗性。在某些实施方案中，此类植株和种子包括杂交种和近交种以及仅含有事件MON88702等位基因(即关于对应于事件MON 88702 DNA的基因座被表征为杂合的基因组)的植株和种子。可通过对具有所需种质(作为商业变种开发工艺的一部分)以及棉花的其他农业所需特性的包含事件MON 88702的植株进行培育来产生此类杂交种。可通过任何数目的方法来产生杂交种，但一种优选方法利用第一近交(纯合)亲本，所述第一近交亲本在两个染色体上在插入事件MON 88702 DNA的基因座处含有事件MON 88702特异性等位基因，并且将第一近交种与不含MON 87702DNA的第二近交种一起培育。两个亲本近交变种将具有子代种子(即杂交种子)中所需的一个或多个有利特性，并且这些杂交种子对事件MON 88702等位基因为杂合的。
在一个实施方案中，赋予含有事件MON 88702 DNA的植株某一额外性状的转基因特性或等位基因可为所需的。在另一实施方案中，赋予所需性状的其他此类转基因等位基因可包括除草剂耐受性：19-51A(DD-04951A-7)、BXN、MON 1445(MON-01445-2)、MON 88701(MON-88701-3)、MON 88913(MON-88913-8)、GHB614(BCS-GH002-5)、DAS-81910-7(DAS-81910-7)、GHB119(BCS-GH005-8)、LL棉25(ACS-GH0013)、EE-GH1、EE-GH3、pDAB4468.18.07.1以及pDAB4468.19.10.3；抗虫性：281-24-236(DAS-24236-5)、3006-210-23(DAS-21023-5)、COT102(SYN-IR102-7)、COT67B(SYN-IR67B-1)、事件-1、MON 531(MON-00531-6)、MON15985(MON-15985-7)、EE-GH5、EE-GH6、COT202、COT203以及A26-5；以及抗虫性和除草剂耐受性：31807、31808、T303-3(BCS-GH003-6)以及T304-40(BCS-GH004-7)。非转基因特性(例如QTL或成熟组)也可能赋予所需性状，并且本领域技术人员将已知如何对棉花进行育种以含有此类非转基因性状和事件MON 88702 DNA。某些变种的棉花具有进一步降低来自害虫的损害可能需要的特性并且在培育还包含事件MON 88702 DNA的棉花时可能适合作为亲本品系。早熟、短季变种更可能避免晚季蚜虫、棉铃虫以及草盲蝽侵染的发作以及其损害。光叶变种与毛叶变种相比时倾向于具有减少的蚜虫群体和粉虱群体，同时蚜虫和棉铃虫产卵较少。具有鸡脚叶性状的鸡脚叶(Okra leaf)变种允许改善的叶面杀虫剂处理株冠穿透率以及还与对粉虱的抗性相关的性状。无蜜腺变种因降低的花蜜可获得性而倾向于具有较小的植食蝽群体和降低的大多数蛾物种的产卵能力。具有高腺体性状的高腺体变种具有额外的棉酚腺体，这使对蚜虫和棉铃虫的抗性增加。
由以下详细描述本发明的前述和其他方面将变得更清楚。
图式简单说明
图1a为由各水平线说明的异源转基因DNA、侧接基因组DNA、任意指定的5'和3'基因组/插入的DNA接点的区段的相对位置以及异源转基因组(transgenomic)DNA内可用于鉴定棉花事件MON 88702的对事件MON 88702来说独特的序列的相对位置的图示；水平线标记的[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]以及[10]分别对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9以及SEQ ID NO:10；水平杠标记的[10](SEQ ID NO:10)表示5'基因组侧接DNA序列([7]，SEQ ID NO:7)、插入的T-DNA盒([9]，SEQ ID NO:9)以及3'侧接DNA序列([8]，SEQ IDNO:8)的重叠群；小水平线标记的[1](SEQ ID NO:1)、[2](SEQ ID NO:2)、[3](SEQ ID NO3)、[4](SEQ ID NO:4)、[5](SEQ ID NO:5)以及[6](SEQ ID NO:6)表示可用于鉴定生物样品中事件MON 88702的存在的基因组/插入的DNA接点的独特序列；粗箭头标记的[11]SQ21940(SEQ ID NO:11)、[12]SQ-50210(SEQ ID NO:12)、[17]SQ50844(SEQ ID NO:17)、[19]SQ50843表示用于事件特异性分析和接合性分析中的引物的子集，并且相对于其杂交至SEQ ID NO:10的位置而定位；粗箭头标记的[13]PB10344和[18]PB50279为用于事件特异性分析和接合性分析的探针的子集，并且相对于其杂交至SEQ ID NO:10的位置而定位。
图1b为用以转化事件MON 88702的质粒载体中以SEQ ID NO:27([27])形式呈现的T-DNA盒的图示；[27]下方的水平箭头表示T-DNA盒(SEQ ID NO:27)内包含的元件；RB表示T-DNA右侧边界元件，E表示增强子元件，P表示启动子元件，L表示5'UTR，TIC834_6表示TIC834_6编码序列元件，T表示3'UTR，并且LB表示T-DNA左侧边界元素；水平线标记的[22]、[23]、[24]、[25]以及[26]分别对应于SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25以及SEQ ID NO:26，并且表示元件或编码序列之间可用于鉴定生物样品中事件MON88702的存在的接点的独特序列。
序列简述
SEQ ID NO:1为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的二十核苷酸序列。SEQ ID NO:1存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1642-1661处。
SEQ ID NO:2为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的二十核苷酸序列。SEQ ID NO:2存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置4785-4804处。
SEQ ID NO:3为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的六十核苷酸序列。SEQ ID NO:3存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1622-1681处。
SEQ ID NO:4为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的六十核苷酸序列。SEQ ID NO:4存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置4765-4824处。
SEQ ID NO:5为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的一百核苷酸序列。SEQ ID NO:5存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1602-1701处。
SEQ ID NO:6为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的一百核苷酸序列。SEQ ID NO:6存在于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1602-1701处。
SEQ ID NO:7为表示5'侧接棉花基因组序列直到插入的T-DNA的1,651核苷酸序列。
SEQ ID NO:8为表示插入的T-DNA之后的3'侧接棉花基因组序列的2,010核苷酸序列。SEQ ID NO:8的头四个核苷酸是衍生自未知来源并且不存在于用于转化棉花事件MON88702的非转基因DP393变种中；并且可能是在MON 88702 T-DNA的整合期间引入。
SEQ ID NO:9为对应于棉花事件MON 88702的转基因插入的T-DNA的3,143核苷酸序列。
SEQ ID NO:10为对应于5'基因组侧接DNA核苷酸序列、事件MON 88702中插入的T-DNA核苷酸序列以及3'基因组侧接DNA核苷酸序列的重叠群核苷酸序列的6,804核苷酸序列；并且包括SEQ ID NO:7(核苷酸1-1651)、SEQ ID NO:9(核苷酸1652-4794)以及SEQ IDNO:8(核苷酸4795-6804)。
SEQ ID NO:11为对应于用以鉴定样品中的棉花事件MON 88702 DNA的被称为SQ21940的热扩增引物的25核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4720至4744的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:12为对应于用以鉴定样品中的棉花事件MON 88702 DNA的被称为SQ-50210的热扩增引物的24核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4803至4826的核苷酸序列的反向互补序列相同。
SEQ ID NO:13为对应于用以鉴定样品中的棉花事件MON 88702 DNA的被称为PB10344的探针的22核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4745至4766的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:14为对应于在MON 88702事件分析中用作内部对照的被称为SQ22496的热扩增引物的23核苷酸序列，并且杂交至陆地棉纤维特异性酰基载体蛋白(ACP1)基因(基因库登录号U48777)。
SEQ ID NO:15为对应于在MON 88702事件分析中用作内部对照的被称为SQ22497的热扩增引物的19核苷酸序列，并且杂交至陆地棉纤维特异性酰基载体蛋白(ACP1)基因(基因库登录号U48777)的互补链。
SEQ ID NO:16为对应于在MON 88702事件分析中用作内部对照的被称为PB13032的探针的20核苷酸序列，并且杂交至陆地棉纤维特异性酰基载体蛋白(ACP1)基因(基因库登录U48777)。
SEQ ID NO:17为对应于用于关于样品中的事件MON 88702 DNA的接合性分析的被称为SQ50844的热扩增引物的24核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4672至4695的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:18为对应于用以鉴定样品中的棉花事件MON 88702 等位基因以便进行接合性分析的被称为PB50279的探针的20核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4735至4754的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:19为对应于用于关于样品中的事件MON 88702 DNA的接合性分析并且杂交至野生型与MON 88702等位基因两者的被称为SQ50843的热扩增引物的26核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置4852至4877的核苷酸序列的反向互补序列相同。
SEQ ID NO:20为25核苷酸序列，对应于用于关于样品中的事件MON 88702 DNA的接合性分析并且仅杂交至野生型DNA等位基因的被称为SQ50842的热扩增引物，所述野生型DNA等位基因在野生型DNA区中不含插入的MON 88702转基因盒，所述插入的MON 88702转基因盒在转基因插入期间丢失，并且因此不对应于沿SEQ ID NO:10的区。
SEQ ID NO:21为21核苷酸序列，对应于用以在关于样品中的事件MON 88702 DNA的接合性分析中鉴定野生型等位基因的被称为PB50278的探针，并且仅杂交至野生型DNA等位基因，所述野生型DNA等位基因在野生型DNA的区中不含插入的MON 88702转基因盒，所述插入的MON 88702转基因盒在转基因插入期间丢失，并且因此不对应于沿SEQ ID NO:10的区。
SEQ ID NO:22为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的转基因盒内的右侧T-DNA边界序列与FMV 35S增强子序列之间的接点的101核苷酸序列，包括右侧T-DNA边界序列的15个核苷酸、间插序列的53个核苷酸以及增强子序列的33个核苷酸。SEQ IDNO:22定位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置1705-1805处。
SEQ ID NO:23为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的转基因盒内的拟南芥(Arabidopsis thaliana)HSP81.2 5'UTR与TIC834_16编码序列之间的接点的77核苷酸序列，包括5'UTR的19个核苷酸、间插序列的37个核苷酸以及TIC834_16编码序列的21个核苷酸。SEQ ID NO:23定位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置3244-3320处。
SEQ ID NO:24为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的转基因盒内的TIC834_16编码序列与3'UTR之间的接点的97核苷酸序列，包括TIC834_16编码序列的28个核苷酸、间插序列的32个核苷酸以及3’UTR序列的37个核苷酸。SEQ ID NO:24定位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置4193-4289处。
SEQ ID NO:25为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的转基因盒内的3'UTR与左侧T-DNA边界序列之间的接点的200核苷酸序列，包括3'UTR序列的29个核苷酸、间插序列的138个核苷酸以及左侧T-DNA边界序列的33个核苷酸。SEQ ID NO:25定位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置4424-4623处。
SEQ ID NO:26为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的转基因盒内的TIC834_16编码序列的921核苷酸序列。SEQ ID NO:26定位于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置3300-4220处。
SEQ ID NO:27为表示用以转化DP393棉花以产生棉花事件MON 88702的二元质粒转化载体内所包含的转基因盒的3,598核苷酸序列。对应于棉花事件MON 88702的转基因插入的DNA的3143核苷酸序列SEQ ID NO:9定位于SEQ ID NO:27中的核苷酸位置254-3360处。
详细说明
本发明提供一种转基因棉花植株，所述转基因棉花植株通过TIC834_16的表达(即MON 88702)实现了对棉花的半翅目和缨翅目害虫的杀虫控制。具体地说，棉花事件MON88702中的TIC834_16昆虫抑制蛋白的表达提供对半翅目害虫豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)、牧草盲蝽(无泽植食蝽)、棉伪斑腿盲蝽(棉跳盲蝽)、斑点淡盲蝽(Distant)(佛得植食蝽)以及诸如花蓟马属和变异绢蓟马(蓟马)等缨翅目的抗性。事件MON 88702将满足在棉花市场中控制这些昆虫的极大需要，因为化学杀虫剂常常不提供对这些昆虫的充分控制，或需要在生长季节多次施加，从而增加了化学杀虫剂在环境中的输入并且增加棉花生产的成本。
通过使用双T-DNA二元系统进行的棉花分生组织的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化过程产生棉花事件MON 88702。在此系统中，利用采用具有两个T-DNA转基因盒的一种二元质粒载体的土壤杆菌属菌株。使用第一T-DNA转基因盒使用可选标记物来选择转化的棉花植物细胞，所述可选标记物赋予对抗生素状观霉素的耐受性。第二转基因盒为赋予对半翅目和缨翅目害虫的抗性的TIC834_16表达盒(在本文中以SEQ ID NO:27形式呈现)。选择T-DNA盒在与含有TIC834_16表达盒的T-DNA的整合位点分开的位点随机插入棉花基因组中，因此允许转化的棉花植株的基因组内的两个T-DNA区段在例如筛选R1和更高世代转基因植株的自交或回交过程期间隔离。
使通过此双T-DNA二元系统转化的棉花细胞再生成为完整的棉花植株。选择显示编码TIC834_16蛋白的T-DNA盒的完整性、T-DNA可选标记物盒不存在(即分离)以及质粒主链序列不存在的个别植株用于进一步测试。
具体地说，使用用以产生转基因棉花事件MON 88702的转化构建体产生超过200个转基因事件，并且产生包含TIC834_16或TIC834_16的相关变体的三十八个额外的构建体并且用于产生超过两千一百八十(2,180)个其他转基因棉花事件，将其与棉花事件MON 88702和类似棉花事件相比较。通过ELISA分析测试许多这些事件中杀虫蛋白TIC834_16或相关变体在叶组织中的表达。检查许多这些相同事件中作为毒素过表达的结果并且妨碍功效的蛋白质结晶的存在。在笼罩和田间试验中测试由各转化以及大多数构建体产生的事件的子集控制半翅目害虫的功效。确定用以产生棉花事件MON 88702的构建体中的植株表达元件针对所测试的半翅目害虫以最佳功效提供所述事件。在所形成和测试的事件中，事件MON88702鉴于由其产生的有益和优良特性最终被选择作为优良事件。
通过详细分子分析对插入棉花事件MON 88702的基因组的质粒DNA进行表征。此分析包括：插入物数目(棉花基因组内的整合位点数目)、基因组插入位置(棉花基因组中发生插入的特定位点)、拷贝数(一个基因座内T-DNA的拷贝数)以及转基因插入的DNA的完整性。详细分子分析证实含有TIC834_16表达盒的质粒构建体含有多个区段(元件之间用以构造或构建表达盒的接点序列)。已知这些区段(例如如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26中所阐述的序列)不天然出现在棉花基因组中或其他载体或转基因棉花事件中；它们对事件MON 88702来说为独特的。另外，棉花事件MON88702的特征为插入棉花基因组中的单一基因座中，从而在插入的DNA与棉花基因组DNA之间产生两个新的基因座或接点序列(例如如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:6中所阐述的序列)，这两个新的基因座或接点序列已知不天然地出现在棉花基因组中或其他转基因棉花事件中；它们对事件MON 88702来说为独特的。这些接点序列适合用于检测棉花细胞、棉花组织、棉花种子以及棉花植株或棉花植物产品(诸如棉花商品产品)中事件MON 88702的存在。在本文中将DNA分子探针和引物对描述为已被开发用于在含有或疑似含有含有事件MON 88702的棉花细胞、棉花种子、棉花植物部分或棉花植物组织生物样品中鉴定这些各种接点区段的存在。
详细分子分析还证实事件MON 88702含有TIC834_16表达盒的一个拷贝的单一T-DNA插入。在事件MON 88702中，除了根癌土壤杆菌右侧和左侧边界区的用于使转基因DNA从植株转化质粒转移至棉花基因组的部分，未鉴定出来自转化构建体的额外元件。最后，进行产生可诊断样品中的事件MON 88702的存在的特定扩增子的热扩增以及DNA序列分析来确定任意分配的5'和3'插入物与植物基因组的接点，证实插入物内元件的组织，并且测定在棉花事件MON 88702中插入的转基因DNA(SEQ ID NO:9)的完整DNA序列。SEQ ID NO:7为表示侧接以SEQ ID NO:9形式呈现的插入的T-DNA序列的5'DP393棉花基因组DNA序列的序列。SEQ ID NO:8为表示侧接以SEQ ID NO:9形式呈现的插入的T-DNA序列的5'DP393棉花基因组DNA序列的序列。SEQ ID NO:10表示包含5'DP393侧接序列、插入的MON 88702 T-DNA以及3'DP393侧接序列的连续序列(重叠群)，并且因此含有插入物与植物基因组的接点序列。
除非本文中另外指出，否则术语是相关领域普通技术人员根据常规用法所理解的。在Rieger等,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,第5版,Springer-Verlag:New York,1991；以及Lewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994中也可找到在分子生物学中的常见术语的定义。如本文所用，术语“棉花”意指属于棉属(Gossypium)的物种，优选是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和海岛棉(Gossypiumbarbadense L.)，并且包括可使用含有事件MON 88702的棉花植株培育的所有植物变种，包括野生棉花物种以及属于棉属的容许在物种之间育种那些植株。
本发明提供已用含有表达毒性量的杀虫蛋白TIC8334_16的表达盒的DNA构建体转化的转基因植株。毒性量的含义为有效量、杀虫量、杀虫有效量、目标昆虫抑制量、有效杀虫量、在半翅目或缨翅目昆虫膳食中杀虫的量及由相关领域普通技术人员根据常规用法理解的其他类似术语。根据本文公开的方法并且使用本文公开的DNA构建体转化的棉花植株对半翅目和缨翅目害虫具抗性。
如下产生转基因“植株”：通过用异源DNA，即包括许多所关注的有效特征的多核酸构建体转化植物细胞；使由将转基因插入植物细胞的基因组中所产生的植株再生，并且选择以插入特定基因组位置以及再生转基因植株的有效特征的数目为特征的特定植株。术语“事件”是指由将转基因DNA在特定位置插入棉花植株的基因组中所产生的独特分子序列。此序列存在于原始转化体中，并且包含插入的DNA，以及与插入的DNA直接相邻的侧接基因组序列。此类序列为独特的并且将预期因包括插入的DNA的亲本系(例如原始转化体和由自交产生的子代)与不含插入的DNA的亲本系的有性杂交而传递至接受包括所关注的转基因的插入的DNA的子代。本发明还提供原始转化体植株和包括异源DNA的转化体的子代。可通过包含所述事件的植株与子代包括异源DNA的另一植株之间的有性异交产生此类子代。甚至在与轮回亲本重复回交之后，所述事件仍存在于杂交子代中的相同染色体位置。本发明与转基因事件、包含MON 88702的棉花植株、其子代以及其中所含的DNA组合物有关。
在本申请中提到“分离的DNA分子”或等效术语或短语意在指DNA分子为单独或与其他组合物组合存在，但不存在于其天然环境内的分子。举例来说，天然地存在于有机体的基因组的DNA内的诸如编码序列、内含子序列、未翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等核酸元件只要所述元件在有机体的基因组内并且位于基因组内其天然存在的位置就不被认为是“分离的”。然而，只要所述元件不位于有机体的基因组内和基因组内其天然存在的位置，这些元件中的每一种以及这些元件的子部分在本公开范围内就将为“分离的”。类似地，编码杀虫蛋白或所述蛋白的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列将为分离的核苷酸序列，只要核苷酸序列不在编码所述蛋白质的序列天然存在的细菌的DNA内即可。编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列出于本公开的目的将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列(即插入植株或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列)均将被认为是分离的核苷酸序列，无论它存在于质粒或用以转化细胞的类似结构内，植株或细菌的基因组内，还是以可检测量存在于衍生自所述植株或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
“探针”为可与常规可检测标记或报告分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)连接的核酸。此类探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自含有MON 88702的植株或来自包括MON 88702 DNA的样品的来自MON 88702的DNA的链互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚酰胺以及特异性地结合于靶DNA序列并且可用于检测所述靶DNA序列的存在的其他探针材料。
DNA引物为多核酸，所述多核酸通过核酸杂交退火至互补的靶DNA链以形成引物与靶DNA链之间的杂合物，然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿靶DNA链延伸。本发明的DNA引物对或DNA引物组是指适合用于例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规多核酸扩增方法扩增靶核酸序列的两种DNA引物。
DNA探针和DNA引物的长度通常为十一(11)个多核苷酸或更多，常常为十八(18)个多核苷酸或更多、二十四(24)个多核苷酸或更多或三十(30)个多核苷酸或更多。将此类探针和引物选择为长度足以在高严格杂交条件下特异性地杂交至靶序列。优选地，根据本发明的探针和引物与靶序列具有完全序列相似性，不过可通过常规方法来设计保留杂交至靶序列的能力的不同于靶序列的探针。
可通过常规方法，例如通过再克隆和对此类DNA分子测序使用基于本文所公开的侧接基因组DNA和插入序列的引物和探针来验证(并且必要时，用于校正)所公开的DNA序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下杂交至靶DNA分子。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因植株的DNA的存在。也被称为核酸区段的多核酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地杂交至其他核酸分子。如本文所用，如果两个多核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么认为这两个分子能够彼此特异性地杂交。如果两个核酸分子展现完全互补性，那么认为一个核酸分子是另一核酸分子的“互补序列”。如本文所用，当分子中的一个的每一核苷酸与另一分子的核苷酸互补时，认为分子展现“完全互补性”。如果两个分子可以足够的稳定性彼此杂交以容许它们在至少常规“低严格”条件下保持退火至彼此，那么认为它们“最低限度互补”。类似地，如果分子可以足够的稳定性彼此杂交以容许它们在常规“高严格”条件下保持退火至彼此，那么认为它们“互补”。Sambrook等,1989以及Haymes等,Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,DC(1985)描述了常规严格条件。因此，偏离完全互补性为可允许的，只要此类偏离不完全阻碍分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子充当引物或探针，它仅仅需要序列足够互补以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构。
如本文所用，基本上同源的序列为将在高严格条件下特异性地杂交至相比较的核酸序列的互补序列的核酸序列。促进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃下2.0x SSC洗涤为本领域技术人员已知的或可在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。举例来说，洗涤步骤中的盐浓度可选自低严格的在50℃下约2.0x SSC至高严格的在50℃下约0.2x SSC。此外，洗涤步骤中的温度可从在室温(约22℃)下的低严格条件增加至在约65℃下的高严格条件。可改变温度与盐两者，或可使温度或盐浓度保持恒定而改变其他变量。在一个优选实施方案中，本发明的多核酸将在适度严格条件下，例如在约2.0x SSC和约65℃下特异性地杂交至以下各项中所阐述的核酸分子中的一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26，或其互补序列或任一种的片段。在一个特别优选的实施方案中，本发明的多核酸将在高严格条件下特异性地杂交至以下各项中所阐述的核酸分子中的一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26，或补体或任一种的片段。在本发明的一个方面中，本发明的优选标记物核酸分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26中所阐述的核酸序列或为其互补序列或任一种的片段。可通过本领域技术人员已知的任何数目的方法来检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法可包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签以及化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对来扩增靶核酸序列(例如通过PCR)，“严格条件”为如下的条件，所述条件容许引物对仅杂交至具有对应野生型序列(或其互补序列)的引物将结合的靶核酸序列，并且优选在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物扩增子。
术语“对(靶序列)具特异性”表明探针或引物在严格杂交条件下仅杂交至包含靶序列的样品中的靶序列。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指关于作为多核酸模板的一部分的靶多核酸分子的多核酸扩增方法的产物。举例来说，为了确定由有性杂交产生的棉花植株是否含有来自包含本发明的事件MON 88702的棉花植株的转基因植株基因组DNA，可对从棉花植物组织样品提取的DNA进行使用引物对的多核酸扩增方法，所述引物对包括第一引物，所述第一引物衍生自侧接事件MON 88702的异源插入的DNA的区中的基因组DNA序列，并且通过聚合酶5'至3'沿插入的DNA的方向伸长。第二引物衍生自异源插入的DNA分子，通过聚合酶5'至3'沿衍生出第一引物的侧接基因组DNA的方向伸长。扩增子的长度可在引物对加上一个核苷酸碱基对，或加上约五十个核苷酸碱基对，或加上约两百五十个核苷酸碱基对，或加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多的组合长度范围内。或者，引物对可衍生自插入的异源DNA两侧的基因组序列，以便产生包括整个插入物多核苷酸序列的扩增子(例如与SEQ IDNO:10的5'末端的基因组部分分离的上游引物以及与SEQ ID NO:10的3'末端的基因组部分分离的反向引物，其扩增包含本文在事件MON 88702基因组中鉴定的插入的DNA序列(SEQID NO:9)的DNA分子)。使衍生自邻近插入的转基因DNA的植株基因组序列的引物对成员距插入的DNA序列一定距离而定位，此距离可在一个核苷酸碱基对至约两万个核苷酸碱基对范围内。使用术语“扩增子”特定地排除在DNA热扩增反应中可能会形成的引物二聚体。
出于实用的目的，应设计产生具有例如在20至1000个碱基之间的有限尺寸范围的扩增子的引物。一般在热扩增反应中更可靠地产生更小(更短多核苷酸长度)尺寸的扩增子，允许更短的循环时间，并且可在琼脂糖凝胶上轻易分离和目视观察或适合在终点
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样分析中使用。可通过DNA扩增子检测领域中已知的方法产生更小的扩增子并进行检测。此外，可将使用引物对产生的扩增子克隆至载体中，增殖，分离，并且测序，或可使用本领域中充分确立的方法直接测序。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON88702或其子代的扩增子的衍生自SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:9的组合或SEQ ID NO:8与SEQID NO:9的组合的任何引物对为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON 88702或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:7的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断包含MON 88702的植株或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:8的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON 88702或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:9的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。
可通过本领域中已知的包括聚合酶链反应(PCR)的各种多核酸扩增方法中的任一种来实现多核酸扩增。扩增方法为本领域中已知的并且尤其描述于美国专利号4,683,195和4,683,202中以及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等编,Academic Press,San Diego,1990中。已开发PCR扩增方法以扩增长达22kb(千碱基)的基因组DNA以及长达42kb的噬菌体DNA(Cheng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699,1994)。在本发明的实践中可使用这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法。来自棉花事件MON 88702的异源DNA插入物或侧接基因组DNA序列的序列可通过使用衍生自本文所提供的序列的引物对含有事件MON 88702 DNA的棉花种子或从来自ATCC保藏的具有登录号PTA-122520的含有事件MON 88702 DNA的棉花种子生长的棉花植株的此类DNA分子进行扩增，随后对PCR扩增子或其克隆DNA片段进行标准DNA测序来进行验证(并且在必要时进行校正)。
可通过多种技术来检测通过这些方法产生的诊断扩增子。一种此类方法为遗传位分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov等Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994)，其中DNA寡核苷酸被设计成与相邻侧接基因组DNA序列与插入的DNA序列两者重叠。将寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在所关注的区的PCR(使用在插入的序列中的一种引物以及相邻侧接基因组序列中的另一种引物)之后，可使单链PCR产物杂交至固定的寡核苷酸并且充当使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基具特异性的标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)的单碱基延伸反应的模板。读出可为荧光的或基于ELISA的。信号指示归因于成功扩增、杂交以及单碱基延伸而存在转基因/基因组序列。
另一方法为如由Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所描述的焦磷酸测序技术。在此方法中，设计了与相邻基因组DNA和插入的DNA接点重叠的寡核苷酸。使寡核苷酸杂交至所关注的区的单链PCR产物(一种引物在插入的序列中，而另一种在侧接基因组序列中)并且在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸以及荧光素的情况下孵育。个别地添加DNTP并且合并产生所测量的光信号。光信号指示归因于成功扩增、杂交以及单碱基或多碱基延伸而存在转基因/基因组序列。
如由Chen等,(Genome Res.9:492-498,1999)所描述的荧光偏振为可用于检测本发明的扩增子的一种方法。使用此方法，设计了与基因组侧接和插入的DNA接点重叠的寡核苷酸。使寡核苷酸杂交至所关注的区的单链PCR产物(一种引物在插入的DNA中，而另一种在侧接基因组DNA序列中)并且在存在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的情况下孵育。单碱基延伸引起ddNTP的合并。可使用荧光计以偏振的变化来测量合并。偏振的变化指示归因于成功扩增、杂交以及单碱基延伸而存在转基因/基因组序列。
将
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(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)描述为一种检测和定量DNA序列的存在的方法并且在由制造商提供的说明书中可得到充分理解。简单来说，设计了与基因组侧接和插入的DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。使FRET探针和PCR引物(一种引物在插入的DNA序列中，而另一种在侧接基因组序列中)在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下循环。FRET探针的杂交使得荧光部分裂解并释放而远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号指示归因于成功扩增和杂交而存在转基因/基因组序列。
如Tyangi等(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所描述，已描述分子信标在序列检测中的使用。简单来说，设计了与侧接基因组和插入的DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构使得它含有二级结构，从而保持荧光和淬灭部分紧密靠近。使FRET探针和PCR引物(一种引物在插入的DNA序列中，而另一种在侧接基因组序列中)在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下循环。在成功PCR扩增之后，FRET探针杂交至靶序列引起探针二级结构的移除以及荧光和淬灭部分的空间分离。产生荧光信号。荧光信号指示归因于成功扩增和杂交而存在侧接/转基因插入物序列。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，所述DNA引物分子特异性地杂交至靶DNA并且在适当的反应条件下扩增诊断扩增子。所述试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或本领域中已知的任何数目的检测诊断扩增子的方法。可使用本文所公开的组合物来开发DNA检测试剂盒，并且它们适合用于鉴定样品中的棉花事件MON 88702 DNA并且可适用于培育含有事件MON 88702 DNA的棉花植株的方法。含有与如SEQ ID NO:10中所阐述的棉花基因组区的任何部分以及与如SEQ ID NO:10中所阐述的插入的转基因DNA的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒为本发明的目标。可将DNA分子用于DNA扩增方法(PCR)中或在多核酸杂交方法(即南方分析、北方分析)中用作探针。
接点序列可由来自由以下各项组成的组的序列表示：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24以及SEQ ID NO:25。举例来说，接点序列可任意地由如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所提供的核苷酸序列表示。或者，接点序列可任意地由如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所提供的核苷酸序列表示。或者，接点序列可任意地由如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所提供的核苷酸序列表示。这些核苷酸由磷酸二酯键连接并且在棉花事件MON 88702中作为重组植物细胞基因组的一部分而存在。鉴定出衍生自棉花植株、棉花种子或棉花植物部分的样品中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24以及SEQ ID NO:25中的一种或多种可确定所述DNA是获自棉花事件MON88702并且可诊断在含有来自棉花事件MON 88702的DNA的样品中的存在。因此，本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子含有以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26形式所提供的核苷酸序列中的至少一种。衍生自转基因棉花事件MON 88702的足以包括以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26形式所提供的序列中的至少一种的任何DNA区段在本发明的范围内。此外，包含与此段落内所描述的序列中的任一种互补的序列的任何多核苷酸在本发明的范围内。
本发明提供示例性DNA分子，所述示例性DNA分子可用作用于检测样品中衍生自包含事件MON 88702 DNA的棉花植株的DNA的存在的引物或探针。此类引物或探针对靶核酸序列具特异性并且因而适合用于通过本文所描述的本发明方法鉴定棉花事件MON 88702核酸序列。
“引物”典型地为被设计成用于涉及热扩增的特定退火或杂交方法中的高度纯化的分离的多核苷酸。可将一对引物与模板DNA(诸如棉花基因组DNA的样品)一起用于热扩增(诸如聚合酶链反应(PCR))中以产生扩增子，其中由此类反应产生的扩增子将具有对应于位于引物杂交至模板的两个位点之间的模板DNA序列的DNA序列。如本文所用，“扩增子”为已使用扩增技术合成的一片或一段DNA的复制品。在一些实施方案中，本发明的扩增子可包含以SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19形式所提供的序列中的至少一种。在另一实施方案中，扩增子可包含本发明事件的接点序列中的至少一种，诸如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQID NO:26。典型地将引物设计成杂交至互补靶DNA链以形成引物与靶DNA链之间的杂合物，并且引物的存在为由聚合酶识别以使用靶DNA链作为模板开始引物延伸(即额外的核苷酸聚合至延长的核苷酸分子中)的点。如本发明中所用的引物对意在指典型地在热扩增反应或其他常规核酸扩增方法中，出于线性扩增被靶向以便由引物对的个别成员结合的位置之间的多核苷酸区段的目的，使用结合双链核苷酸区段中相对的链的两种引物。以SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19的形式提供适合作为引物的示例性DNA分子。以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12形式提供的引物对适合作为第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者各具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸以充当DNA引物，所述DNA引物当与衍生自棉花事件MON 88702的模板DNA一起用于热扩增反应中时，产生可诊断样品中的棉花事件MON 88702 DNA的扩增子。
“探针”为与靶核酸的链互补的核酸。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚酰胺以及特异性地结合于靶DNA序列的其他探针材料，并且此类结合的检测可适用于诊断、鉴别、确定或证实特定样品中所述靶DNA序列的存在。可使探针连接至常规可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18的形式提供适合作为探针的示例性DNA分子。
根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全序列同一性，不过可通过常规方法设计保留优先杂交至靶序列的能力的不同于靶序列的引物和探针。为了使核酸分子充当引物或探针，它仅仅需要序列足够互补以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自棉花事件MON 88702的转基因DNA的存在。探针和引物的长度通常为至少约11个核苷酸、至少约个18核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更多。此类探针和引物在严格杂交条件下特异性地杂交至靶DNA序列。Sambrook等,1989以及Haymes等,Nucleic Acid Hybridization,A PracticalApproach,IRL Press,Washington,DC(1985)描述了常规严格条件。
可使用本领域技术人员熟知的包括热扩增方法的任何数目的方法来分离和操纵本发明中公开的DNA分子或其片段。还可如通常通过使用自动化寡核苷酸合成器实践的那样，通过其他技术，诸如通过化学方法直接合成所述片段来获得DNA分子或其片段。
因此，本文所提供的DNA分子和对应核苷酸序列尤其适合用于鉴定棉花事件MON88702、选择包含棉花事件MON 88702的植株变种或杂交种、检测样品中衍生自转基因棉花事件MON 88702的DNA的存在以及监测样品中存在和/或不存在棉花事件MON 88702或衍生自包含事件MON 88702的棉花植株的植物部分。
本发明提供棉花植株、棉花植物细胞、棉花种子、棉花植物部分(诸如花粉、胚珠、荚果、花组织、根组织、茎组织以及叶组织)、棉花子代植株、棉绒以及棉花商品产品。这些棉花植株、棉花植物细胞、棉花种子、棉花植物部分、棉花子代植株、棉绒以及棉花商品产品含有可检测量的本发明的多核苷酸，即诸如具有以以下形式提供的序列中的至少一种的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26。本发明的棉花植株、植物细胞、种子、植物部分以及子代植株还可含有一种或多种额外转基因。此类额外转基因可为编码赋予包括但不限于以下各项的所需性状的蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列：增加的抗虫性、增加的水分利用率、增加的产量表现、增加的抗旱性、增加的种子质量和/或增加的除草剂耐受性，其中所需性状是相对于缺乏此类额外转基因的棉花植株来度量。
本发明提供衍生自含有事件MON 88702DNA的转基因棉花植株的棉花植株、棉花植物细胞、棉花种子、棉花植物部分(诸如花粉、胚珠、荚果、花组织、根组织、茎组织以及叶组织)、棉花子代植株。含有事件MON 88702DNA的棉花种子的代表性样品已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)
Figure BDA0001670858440000311
ATCC贮藏室已将专利保藏名称PTA-122520分配给含有事件MON88702DNA的种子。
本发明提供一种包含具有存在于基因组中的至少一个选自以下的序列的DNA分子的微生物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25以及SEQ ID NO:26。此类微生物的实例为转基因植物细胞。微生物(诸如本发明的植物细胞)适合用于许多工业应用中，包括但不限于：(i)用作科学查询或工业研究的研究工具；(ii)在培养物中用于产生可用于后续科学研究或作为工业产品的内源性或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物或小分子；以及(iii)与现代植物组织培养技术一起用于产生然后可用于农业研究或生产的转基因植株或植物组织培养物。诸如转基因植物细胞等微生物的制备和使用利用现代微生物学技术和人类干预来产生人造的独特微生物。在此方法中，将重组DNA插入植株细胞的基因组中以形成与天然存在的植物细胞分离并且独特的转基因植物细胞。然后此转基因植物细胞可很像细菌和酵母细胞那样使用现代微生物学技术进行培养并且可以未分化、单细胞状态存在。转基因植株细胞的新的基因组成和表型为通过将异源DNA整合至细胞基因组中而形成的技术效应。本发明的另一方面为使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物(诸如转基因植物细胞)的方法包括(i)通过将重组DNA整合至细胞基因组中并且然后使用此细胞得到具有相同异源DNA的额外细胞来产生转基因细胞的方法；(ii)使用现代微生物学技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)由所培养的细胞产生和纯化内源性或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物的方法；以及(iv)使用现代植物组织培养技术用转基因植物细胞来产生转基因植株或转基因植物组织培养物的方法。
本发明的植株可将事件MON 88702 DNA，包括棉花事件MON 88702中插入的转基因传送给子代。如本文所用，“子代”包括含有衍生自祖先植株的事件MON 88702 DNA和/或包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的任何植株、植物细胞、种子和/或可再生植物部分：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26。植株、子代以及种子可对事件MON 88702的转基因为纯合或杂合的。可从由含有棉花事件MON 88702的植株产生的种子和/或由用来自含有棉花事件MON 88702的植株的花粉授精的植株产生的种子生长出子代。
可使子代植株自花授粉(也称为“自交”)以产生植株的纯育品系，即对所述转基因纯合的植株。适当子代的自交可产生对两种添加的外源基因纯合的植株。
或者，可使子代植株异交，例如与另一不相关植株一起培育以产生变种或杂交种子或植株。另一不相关植株可为转基因或非转基因的。因此，可通过使缺乏棉花事件MON88702的特异性和独特DNA的第一亲本与包含棉花事件MON 88702的第二亲本有性杂交，产生包含棉花事件MON 88702的特异性和独特DNA的杂交种来得到本发明的变种或杂交种子或植株。各亲本可为杂交种或近交种/变种，只要杂交或育种产生本发明的植株或种子，即具有含有棉花事件MON 88702的DNA的至少一个等位基因和/或具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的种子即可：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26。因此，可使两种不同的转基因植株杂交以产生含有两种独立分隔的增加的外源性基因的杂交后代。举例来说，可使赋予棉花抗虫性的含有MON 88702的TIC834_16与其他转基因棉花植株杂交以产生具有两种转基因亲本的特征的植株。此情况的一个实例将为赋予棉花半翅目和缨翅目抗虫性的含有MON 88702的TIC834_16与具有诸如除草剂耐受性(例如棉花事件MON 88913(MON-88913-8)或棉花事件LL棉25
Figure BDA0001670858440000331
)和/或控虫性(例如棉花事件MON 15985(MON-15985-7))等一种或多种额外性状的植株杂交，产生对半翅目和缨翅目害虫具有抗性并且具有至少一种或多种额外性状的子代植株或种子。还涵盖与亲本植株回交以及与非转基因植株异交，营养繁殖也是如此。可在若干参考文献中的一个中找到关于不同性状和作物常用的其他育种方法的描述，例如Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编,AmericanSociety of Agronomy,Madison WI(1987)。
本发明提供一种衍生自包含事件MON 88702的棉花植株的植物部分。如本文所用，“植物部分”是指植物中包含衍生自包含事件MON 88702的棉花植株的材料的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织、纤维以及叶。植物部分可为有活力的、无活力的、可再生的和/或不可再生的。
本发明提供一种衍生自包含事件MON 88702的棉花植株并且含有可检测量的对事件MON 88702具特异性的核酸的商品产品。如本文所用，“商品产品”是指包含衍生自含有棉花事件MON 88702 DNA的棉花植株、整粒或加工的棉花种子、一个或多个植物细胞和/或植物部分的材料的任何组合物或产品。商品产品可被出售给消费者并且可为有活力的或无活力的。无活力的商品产品包括但不限于无活力的种子；整粒或加工的种子、种子部分以及植物部分；棉花纤维、棉绒、棉油以及棉油衍生物(诸如起酥油、肥皂以及化妆品)、棉花蛋白、棉粕、包含棉花的动物饲料、包含棉花的纸、棉花生物质、烛芯、线和绳、棉球、棉絮、纤维素产品(诸如人造丝、塑料、照相胶片、玻璃纸、用于各种工业用途(诸如绝缘材料、亚麻油毡、油布、防水布)以及作为底漆的脂肪酸)以及使用棉花植株和棉花植物部分产生的燃料产品。有活力的商品产品包括但不限于种子、植株以及植物细胞。因此，可使用包含事件MON88702的棉花植株来制造典型地从棉花获得的任何商品产品。衍生自包含事件MON 88702的棉花植株的任何此类商品产品可至少含有可检测量的对应于棉花事件MON 88702的特异性和独特DNA，并且具体地说可含有可检测量的包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25以及SEQ ID NO:26。可使用核苷酸分子的任何标准检测方法，包括本文所公开的检测方法。如果商品产品中存在任何可检测量的具有至少一个选自以下的序列的DNA分子，那么商品产品在本发明的范围内：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26。
因此，本发明的植株、子代、种子、植物细胞、植物部分(诸如花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织以及叶)以及商品产品尤其适合用于生长出用于以下目的的植株：出于农业目的而产生包含棉花事件MON 88702的种子和/或植物部分、出于植物育种和研究目的而产生包含棉花事件MON 88702的子代、与微生物学技术一起用于工业和研究应用以及出售给消费者。
提供产生包含对本发明的事件MON 88702来说具特异性并且独特的DNA序列的抗虫性棉花植株的方法。这些方法中所用的转基因植株可对所述转基因为纯合或杂合的。通过这些方法产生的子代植株可为变种或杂交植株；可以是从由含有棉花事件MON 88702的植株产生的种子和/或由用来自含有棉花事件MON 88702的植株的花粉授精的植株产生的种子生长的；并且可对所述转基因为纯合或杂合的。随后可使子代植株自花授粉以产生植株的纯育品系，即对所述转基因纯合的植株，或者可使其异交，例如与另一不相关的植株一起培育，以产生变种或杂交种子或植株。
提供检测样品中衍生自包含棉花事件MON 88702的棉花细胞、棉花组织、棉花种子或棉花植株的DNA的存在的方法。一种方法由以下步骤组成：(i)从至少一个棉花细胞、棉花组织、棉花种子或棉花植株提取DNA样品，(ii)使DNA样品与至少一种引物接触，所述至少一种引物能够在适合于DNA测序的条件下产生对事件MON 88702 DNA具特异性的DNA序列，(iii)进行DNA测序反应，以及然后(iv)证实核苷酸序列包含对事件MON 88702或其中所包含的构建体具特异性的核苷酸序列，诸如选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ IDNO:26。另一方法由以下步骤组成：(i)从至少一个棉花细胞、棉花组织、棉花种子或棉花植株提取DNA样品，(ii)使DNA样品与引物对接触，所述引物对能够在适合于DNA扩增的条件下产生来自事件MON 88702 DNA的扩增子，(iii)进行DNA扩增反应，以及然后(iv)检测扩增子分子和/或证实扩增子的核苷酸序列包含对事件MON 88702具特异性的核苷酸序列，诸如选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:6。扩增子应为对事件MON 88702具特异性的扩增子，诸如那些包含以下序列的扩增子：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。在扩增子中检测到对事件MON 88702具特异性的核苷酸序列可确定和/或诊断样品中棉花事件MON 88702特异性DNA的存在。以SEQ ID NO:11和SEQID NO:12的形式提供能够在适合于DNA扩增的条件下产生来自事件MON 88702DNA的扩增子的引物对的实例。本领域技术人员可轻易设计其他引物对并且将产生包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的扩增子，其中此类引物对包含侧接插入物的基因组区内的至少一种引物和插入物内的第二引物。检测样品中衍生自包含棉花事件MON 88702的棉花细胞、棉花组织、棉花种子或棉花植株的DNA的存在的另一方法由以下步骤组成：(i)从至少一个棉花细胞、棉花组织、棉花种子或棉花植株提取DNA样品，(ii)使DNA样品与对事件MON 88702DNA具特异性的DNA探针接触，(iii)允许探针和DNA样品在严格杂交条件下杂交，以及然后(iv)检测探针与靶DNA样品之间的杂交。以SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的形式提供对事件MON 88702DNA具特异性的DNA探针序列的实例。本领域技术人员可轻易设计其他探针并且将包含侧接插入物的基因组DNA的至少一个片段以及插入物DNA的至少一个片段，诸如但不限于以下各项中所提供的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:10。检测到探针与DNA样品的杂交可诊断样品中棉花事件MON 88702特异性DNA的存在。或者，不存在杂交可诊断样品中不存在棉花事件MON 88702特异性DNA。
提供适用于鉴定样品中的棉花事件MON 88702DNA并且还可适用于培育含有适当的事件DNA的棉花植株的方法的DNA检测试剂盒。此类试剂盒含有包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26的片段的DNA引物和/或探针。此类试剂盒的一个实例包含至少一个DNA分子，所述至少一个DNA分子具有SEQ ID NO:10的长度足以充当DNA探针的连续核苷酸，所述DNA探针适合用于检测样品中衍生自包含事件MON 88702的转基因棉花植株的DNA存在和/或不存在。衍生自包含事件MON 88702的转基因棉花植株的DNA将包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子：SEQID NO:1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25以及SEQID NO:26。以SEQ ID NO:13的形式提供足以用作DNA探针的DNA分子，所述DNA分子适用于确定、检测或诊断样品中棉花事件MON 88702 DNA存在和/或不存在。本领域技术人员可轻易设计其他探针并且应包含SEQ ID NO:10的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39或至少40个连续核苷酸并且对棉花事件MON 88702 DNA足够独特以鉴定衍生自所述事件的DNA。另一类型的试剂盒包含适合用于产生适合用于检测样品中衍生自转基因棉花事件MON 88702的DNA存在和/或不存在的扩增子的引物对。此类试剂盒将采用如下方法，所述方法包括使靶DNA样品与如本文所描述的引物对接触，然后进行足以产生包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的扩增子的核酸扩增反应：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25以及SEQ ID NO:26，以及然后检测扩增子存在和/或不存在。此类方法还可包括对扩增子或其片段进行测序，所述扩增子或其片段将可确定，即诊断靶DNA样品中棉花事件MON 88702特异性DNA的存在。本领域技术人员可轻易设计其他引物对并且应包含提供于以下各项中但不限于以下各项的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25以及SEQ ID NO:26，并且对棉花事件MON 88702DNA足够独特以鉴定衍生自所述事件的DNA。
本发明的试剂盒和检测方法尤其适合用于鉴定棉花事件MON 88702、选择包含棉花事件MON 88702的植株变种或杂交种、检测样品中衍生自转基因棉花事件MON 88702的DNA的存在以及监测样品中存在和/或不存在包含事件MON 88702的棉花植株或衍生自包含事件MON 88702的棉花植株的植物部分。
可通过使用衍生自本文所提供的序列的引物扩增来自棉花事件MON 88702的异源DNA插入物、接点序列或侧接序列的序列随后进行扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证(并且必要时校正)来自所述事件的此类序列。
包括以下实施例以展示本发明的某些优选实施方案的实例。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人已发现在本发明的实践中运行良好的方法，并且因此可被视为构成用于其实践的优选模式的实例。然而，根据本公开，本领域技术人员应了解，可在所公开的特定实施方案中作出许多改变并且仍获得同样或类似结果，而不会背离本发明的精神和范围。
保藏信息
含有事件MON 88702的棉花种子的代表性样品的保藏是在2015年9月11日根据布达佩斯条约在地址位于10801University Boulevard,Manassas,Virginia USA,Zip Code20110的美国典型培养物保藏中心(ATCC)进行，并且分配ATCC登录号PTA-122520。在本申请未决期间专利和商标事务专员以及由所述专员在请求后确定对其授权的人将可获得保藏物的使用权。在专利发行后，将不可撤回地去除对公众可获得性的所有限制。保藏物将在最后请求之后在保藏所中维持达30年或5年的时间，或与专利的有效寿命一样长，以任何一个较长的为准，并且在所述时间内将根据需要替换。
实施例
实施例1
棉花事件MON 88702的选择和分子表征
此实施例描述棉花事件MON 88702的转化和选择。转基因在植株中的表达已知受染色体插入位置的影响，这或许是归因于染色质结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如增强子)紧靠整合位点(Kurt Weising等,(1988)Foreign genes in plants:transfer,structure,expression and applications.Annu.Rev.Genet.22:421-77)。由于这个原因，常常必需筛选大量的转化事件以鉴定展示所引入的所关注的基因的最佳表达的事件。举例来说，已在植株中和其他有机体中观测到事件间所引入的基因的表达水平可广泛变化。还可能存在表达的空间或时间模式的差异，例如转基因在各种植物组织中的相对表达的差异，它可能不与由存在于所引入的基因构建体中的转录调控元件所预期的模式对应。
由于这些原因，开发包含对半翅目和缨翅目具活性而不会对农业经济学、产量或堆积活力有任何负面影响的杀虫蛋白的转基因棉花植株需要历时若干年对衍生自三十九(39)种不同质粒载体构建体的约两千四百(2,400)个事件进行大量分析。(39)三十九种质粒构建体中的个别表达盒就杀虫毒素蛋白的编码序列来说因利用TIC834_16编码序列、TIC807(美国专利US8,609,936)编码序列或称为“工程化半翅目毒素蛋白”并且在美国专利申请US20130269060中称为TIC807的变体的与TIC834_16紧密相关的变体杀虫毒素蛋白的编码序列而有所改变。三十九(39)种质粒构建体中的个别表达盒还就使用不同转录调控元件以及杀虫毒素蛋白是否靶向叶绿体来说有所改变。
以SEQ ID NO:27形式呈现的转基因盒为用以产生棉花事件MON 88702的构建体。对各种质粒载体构建体的许多轮的测试和比较表明，此转基因盒当与通过来自三十八(38)种其他构建体的其他转基因盒产生的事件相比时，针对两种草盲蝽物种豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)和牧草盲蝽(无泽植食蝽)以最佳功效产生所述事件。
通过使用双T-DNA系统的土壤杆菌属介导的棉花分生组织转化(美国专利US8,044,260)形成转基因半翅目和缨翅目抗虫性棉花事件MON 88702。在此系统中，利用采用具有两个T-DNA转基因盒的一种二元质粒载体的土壤杆菌属菌株。使用第一T-DNA转基因盒使用可选标记物来选择转化的棉花植物细胞，所述可选标记物赋予对抗生素状观霉素的耐受性。将以SEQ ID NO:27形式呈现并且在图1b中展示的第二T-DNA转基因盒插入棉花基因组中以赋予对半翅目和缨翅目害虫的杀虫抗性。
以SEQ ID NO:27形式呈现并且在图1b中示出的第二T-DNA转基因盒包含右侧T-DNA边界(RB)、衍生自FMV 35S启动子的增强子(E)，所述增强子5'可操作地连接至衍生自拟南芥热休克蛋白81.2的启动子(P)形成嵌合FMV/Hsp81.2启动子(美国专利，US8,940,962)，所述嵌合FMV/Hsp81.2启动子5'可操作地连接至衍生自拟南芥热休克蛋白81.2的5'UTR(L)，所述5'UTR(L)5'可操作地连接至TIC834_16编码序列(美国专利申请，US20130269060)，所述TIC834_16编码序列5'可操作地连接至衍生自35S花椰菜花叶病毒基因VI的3'UTR(T)，随后为左侧T-DNA边界(LB)。第一T-DNA转基因选择盒随机地并且在与含有TIC834_16表达盒的第二T-DNA转基因盒的整合位点分开的位点处插入棉花基因组中，因此允许转化的棉花植株的基因组内的两个T-DNA区段在例如筛选R1和更高世代转基因植株的自交和/或回交过程期间隔离。
为了产生MON 88702，使用上文所描述的双T-DNA二元系统转化棉花变种DP393(Deltapine,St.Louis,MO)。使用状观霉素来选择转化的棉花细胞并且再生为完整棉花植株。选择具有正常表型特征的生根植株并且转移至土壤中以便生长和进一步评估。起初，使用第一T-DNA转基因选择盒和含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的第二T-DNA转基因盒由双T-DNA转化系统形成两百一十五(215)个事件。
在初步分子表征之后，将一百三十三(133)个事件鉴定为质量足以进行进一步评估和测试。使用诸如TaqMan和/或PCR分析等分析技术的组合来分析事件以确定含有TIC834_16表达盒的第二T-DNA转基因盒的存在以及盒拷贝数。对于此分析，选择三十五(35)个单拷贝R1事件并且在生长室中生长，并且分析针对牧草盲蝽(无泽植食蝽)的功效。归因于生长室的尺寸限制在三(3)次分开的实验中进行分析。
对三十五(35)个事件更详细进行进一步分子与表型表征。然后允许展示功效的植株自花授粉并且结籽以便进行R2和后续世代的进一步表征和分析。对于进一步功效筛选，选择二十四(24)个事件来进行进一步分析和表征。通过南方墨点法(Southern blot)对各事件进行分析，以确定含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的转基因盒的拷贝数、棉花基因组内的插入点以及主链的存在。如果检测到存在主链，那么使用DNA扩增技术对事件进行进一步分析，以确定主链是否键联至含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的转基因盒以及侧接左侧和右侧边界的序列的一千个碱基是否位于天然基因中。由此分析，剩下十二(12)个事件。
在十二(12)个事件中，一个事件展示左侧边界插入天然基因中(事件12)，四个事件展示右侧边界插入天然基因中(事件3、7、9以及10)，并且五个事件不能针对侧接序列进行表征(事件5、6、8以及9)。将全部十二(12)个事件用于后续功效测试中以提供针对性能的比较器。具体地说，测试和分析十二(12)个事件在生长室全植株笼罩研究中的抗虫性功效、转化的棉花植株的棉花产量以及蛋白质表达。
抗虫性功效
为了分析针对牧草盲蝽(无泽植食蝽)的功效，将十二(12)个转基因棉花事件中的每一种的五粒R1种子种在10英寸盆中。将未转化的DP393棉花变种用作阴性对照。将植株维持在环境室中，光周期为在三十二(32)摄氏度下亮十六(16)小时并且在二十三(23)摄氏度下暗八(8)小时，并且光强度在八百(800)至九百(900)微爱因斯坦(micro-Einstein)之间。在种植后四十(40)至四十五(45)天时，将个别植株关在由可吸入塑料“授粉”薄板(Vilutisand Company Inc,Frankfort,IL)制成的笼罩中。使用
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绑带将薄板衬套紧固至主茎上土壤表面上方一点。将实验室培养的两对性成熟的雄性和雌性牧草盲蝽成虫(六天龄)收集至十四毫升圆底塑料管(Bacton Dickson Labware,Franklin Lakes,NJ)中并且用于各植株。将成虫通过笼罩壁上的小缝释放到各个别笼罩中并且然后将笼罩关牢，确保昆虫不会逃走。允许昆虫交配并且将植株保持在笼罩中二十一(21)天。
在二十一(21)天之后，在笼罩下方切掉植株并且移到实验室中，在实验室中收集各植株的昆虫并且计数。在打开笼罩之前，剧烈摇晃植株以确保所有昆虫从其进食位点掉落到笼罩底部。然后打开笼罩底部并且去除全部植物材料并放在黑色薄板上。使用抽吸器收集昆虫。然后仔细检查植株以回收任何剩余的昆虫。记录各植株所收集昆虫的数目和其发育阶段。基于草盲蝽的成熟度将昆虫计数分成若干组：若虫至第3龄虫、第4龄虫、第5龄虫以及成虫。表1示出了十二个事件中的每一种的平均草盲蝽数目，其中“SEM”为标准平均误差。
表1.从用含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的转基因盒转化的关笼棉花植株回收的平均牧草盲蝽(无泽植食蝽)数目。
Figure BDA0001670858440000431
如表1中所展示，表达TIC834_16的所有事件展示对牧草盲蝽的抗性。在此分析中事件2/MON 88702提供对草盲蝽的优良控制。
转化的棉花植株的棉花产量
为了评估产量，使十二(12)个事件在田间生长至完全成熟。各事件种植四(4)行棉花植株。在生长周期期间的两个不同时间点收获每一行的棉花。针对TIC834_16的存在对事件进行评估。如果一行中具有缺乏TIC834_16的植株，那么将一整行从产量分析中排除。表2中提供了各事件的产量并且以籽棉的磅数(lb S.C.)表示。如表2中所展示，棉花事件MON88702提供优良产量。
表2.用含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的转基因盒转化的棉花植株的产量.
Figure BDA0001670858440000441
蛋白质表达
使用衍生自R2种子的植株测定蛋白质表达。使所评估的十二(12)个事件中的每一种的植株在温室中生长。在两个不同时间点对组织取样。在种植后四十五(45)天时收获叶和棉蕾(分别为45L和45S)，并且在种植后七十(70)天时收获叶(70L)。使用ELISA在冻干组织上测量蛋白质表达并且以百万分率(ppm)表示。
表3中提供了各事件的平均表达。如表3中所展示，在各事件情况下并且在各组织内TIC834_16的表达有所变化。表达水平不一定与植株对草盲蝽的抗性水平有关。
表3.用含有SEQ ID NO:27的TIC834_16表达盒的转基因盒转化的R2棉花植株的所选组织中的平均蛋白质表达.
Figure BDA0001670858440000451
在若干年的充分表征之后，两个事件显得与其余事件不同，因为相对于未转化的DP393提供对草盲蝽的高抗性、有益表型特征以及优良产量：事件2(MON 88702)和事件10。使用两个事件的左侧和右侧序列对陆地棉TM1(陆地棉)四倍体基因组与棉花D(雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii))二倍体基因组的专有组件进行BLAST分析，以鉴定插入所鉴定的棉花基因中，由此潜在地干扰天然基因的任何潜在问题。
转基因盒插入天然基因中就由管理机构批准来说可能是有问题的。此类观测结合可能使得产品不被批准或用于进行大规模实验和表征以证实插入天然基因内不在植株中引起有害作用。事件2/MON 88702基于陆地棉TM1组件和棉花D二倍体基因组似乎不插入基因内。相比之下，虽然基于陆地棉TM1组件事件10似乎不插入基因内，但基于棉花D组件，它似乎插入存在于内源性基因的第二内含子内的转基因盒。因此，事件10具有转基因盒插入内源性棉花基因中。
因为事件2/MON 88702不具有插入问题，在田间研究中与事件10相比提供优良产量，具有优选分子表征，并且在笼罩和田间试验中历经若干年展现优良性能(如上文所呈现并且在以下实施例中)，所以将其鉴定为优良事件并且因此选择所述事件用于商业化。
实施例2
在开放田间笼罩试验中棉花事件MON 88702展示对人工豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)和牧草盲蝽(无泽植食蝽)侵染的抗性
如此实施例中所证实，MON 88702提供对草盲蝽物种豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)和牧草盲蝽(无泽植食蝽)的抗性。在连续生长季节期间进行开放田间关笼实验。第1年在伊利诺斯州进行针对牧草盲蝽的试验并且第2年在田纳西州重复。第1年在亚利桑那州进行针对豆荚草盲蝽的试验并且第2年在亚利桑那州重复。将用
Figure BDA0001670858440000461
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理的棉花事件MON 88702和阴性对照DP393的种子种在两(2)个十五(15)英尺行的地块中。在种植后十五(15)至二十(20)天时，减少植株以实现植株分布均匀。在种植后三十五(35)至四十(40)天时，谨慎检验个别植株以去除存在的任何害虫和掠食者。在去除全部害虫和掠食者后，将植株关在由白色固体薄纱(JoAnneFabrics，项目号8139875)制成的笼罩(150X 228厘米)中。将底部薄纱衬套紧固至植株主茎上土壤表面上方一点并且使用
Figure BDA0001670858440000462
绑带将顶部衬套绑在一起。将金属杆置于每一行的末端，并且将各笼罩的顶部连接到线上以保持笼罩处于竖直位置。
从苜蓿或芥花田中收集草盲蝽若虫并且在实验室中饲养。在羽化当天，收集成虫并且移到新的容器中以跟踪其发育阶段。将至少一百(100)至一百五十(150)个成虫以约1:1性别比率放置于大塑料容器中，从而提供用于成功交配的均匀组群。在侵染当天，全部成虫为至少六(6)天龄，并且棉花植株为种植后四十五(45)至五十(50)天(即盛蕾期)。将两对雄性和雌蛾收集至十五毫升塑料管中并且带到田间。
将各笼罩从顶部打开并且再度检查以去除先前检查中漏掉或关笼之后孵出的任何害虫和掠食者。然后通过将草盲蝽成虫释放至笼罩中来侵染植株。每一处理侵染八(8)个植株。允许昆虫复制并且允许所得子代以关笼棉花植株为食达三十(30)天。在这段时间之后，收获植株并且如实施例1中所描述收集并记录各植株存在的草盲蝽。
表4和表5分别示出了牧草盲蝽和豆荚草盲蝽在第1年和第2年的平均下一代昆虫计数。基于草盲蝽的成熟度将昆虫计数分成若干组：小若虫(定义为若虫至第3龄虫)、大若虫(定义为处于第4龄或第5龄)以及成虫。表4和5示出了各试验的MON 88702和阴性对照DP393的平均草盲蝽数目，其中“SEM”为标准平均误差。
表4.用牧草盲蝽侵染的棉花事件MON 88702和阴性对照DP393的平均下一代昆虫计数.
Figure BDA0001670858440000471
表5.用豆荚草盲蝽侵染的棉花事件MON 88702和阴性对照DP393的平均下一代昆虫计数.
Figure BDA0001670858440000472
Figure BDA0001670858440000481
如表4和5中所展示，棉花转基因事件MON 88702提供针对牧草盲蝽和豆荚草盲蝽的防护。在MON 88702关笼植株中小若虫、大若虫以及成虫的平均昆虫计数比对照DP393植株低得多。
实施例3
棉花事件MON 88702在田间在天然草盲蝽压力下提供对牧草盲蝽和豆荚草盲蝽的抗性
此实施例证实转基因棉花事件MON 88702提供对半翅目害虫物种豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)和牧草盲蝽(无泽植食蝽)的抗性的能力。
历经3年(第1年、第2年以及第3年)在经历如根据通过两(2)种调查方法确定的经济阈值所定义的不同水平的天然草盲蝽压力的各种位置进行田间试验。对于美国三角洲地区的田地(阿肯色州(AR)、路易斯安那州(LA)、密西西比州(MS)以及田纳西州(TN))，使用罩布法来调查主导草盲蝽物种牧草盲蝽(无泽植食蝽)。罩布法大体上由将罩布放置在两行棉花之间并且在罩布上剧烈摇晃两行的植株组成。按阶段将昆虫分离并且计数。对于美国西南地区的田地(亚利桑那州(AZ)和加利福尼亚州(CA))，采用地拉网法(sweep net method)并且用以调查主导草盲蝽物种豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)。地拉网调查法大体上由通过株冠顶部拉动网，拉规定的次数并且然后在针对阶段分离之后计算昆虫数目组成。
针对所测试的各事件，每三十(30)英尺长的行使用120粒用
Figure BDA0001670858440000482
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理的种子来种植八(8)行棉花地块。各地块在田间重复四(4)次。使用未转化的棉花变种DP393作为阴性对照并且就如转基因事件一般以四(4)次重复种植在八(8)行地块中。将所取草盲蝽若虫样品分成两组：小若虫(定义为若虫至第3龄虫)和大若虫(定义为处于第4龄或第5龄)。将检测到的若虫数目以每五(5)英尺的行(5行英尺)的若虫数目表示。
表6示出了转基因棉花事件MON 88702和阴性对照DP393每5行英尺检测到的若虫数目，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株数目。表6中所示的草盲蝽压力是相对于对棉花田施加杀虫剂的经济阈值测定的。为控制草盲蝽对棉花施加杀虫剂的经济阈值视所用调查方法的类型而定定义有所不同。针对牧草盲蝽使用罩布法的常规经济阈值为每5行英尺三(3)个总草盲蝽(任何阶段)。使用地拉法的为控制豆荚草盲蝽对棉花喷洒农药的经济阈值为每一百次拉网十五(15)个总草盲蝽(包括4-8个若虫)。由于我们的试验中草盲蝽压力的天然变化，将位置分类为低、中或高压力位点。将低草盲蝽压力定义为在整个季节中低于经济阈值。将中草盲蝽压力定义为在季节中的任何时候等于或大于经济阈值的一倍，或小于经济阈值的三倍。将高草盲蝽压力定义为在季节中的任何时候等于或大于经济阈值的三倍。
对于转基因性状功效评估，在取样期间作为成虫被捉住的的总若虫数目不能假设已在所述特定地块上发育。如表6中可见，在转基因事件MON 88702行中检测到的若虫总数目一致小于未转化的对照行中的若虫总数目。此观测结果为一致的，不管各田间在整个三(3)年间的天然草盲蝽压力如何。这证实转基因棉花事件MON 88702在棉花田间实验中相对于未转化的棉花提供对牧草盲蝽与豆荚草盲蝽的优良抗性。
Figure BDA0001670858440000501
Figure BDA0001670858440000511
实施例4
棉花事件MON 88702在田间在低、中以及高天然草盲蝽压力下提供优良产量
此实施例证实转基因棉花事件MON 88702相对于未转化的棉花植株在用半翅目害虫物种豆荚草盲蝽(西方无泽植食蝽)和牧草盲蝽(无泽植食蝽)侵染的田间提供优良产量的能力。
如实施例3中所描述在连续三年内在经历不同水平的天然草盲蝽压力的各种位置进行田间试验。收获各八行地块的两个中间行并且测量产量并且以每英亩的籽棉磅数(磅/英亩)表示。
表7展示每一个田间位置的每英亩籽棉产量并且基于各田地所经历的天然草盲蝽压力进行划分。相较于对照的变化百分比的栏示出了MON 88702事件相对于未转化的DP393阴性对照增加的产量百分比。
表7.事件MON 88702和未转化的DP393在田间在变化的草盲蝽压力下的籽棉产量.
Figure BDA0001670858440000521
如表7中所展示，除了第1年LA试验的低压力，棉花转基因事件MON 88702在不同程度的天然草盲蝽压力下一致地提供较高的棉花产量。第二年，在此相同位置在低草盲蝽压力下观测到总产量提高11％。在事件MON 88702情况下在经历中和高草盲蝽压力的田间观察到的产量提高更大。在中草盲蝽压力下，视生长位置而定，事件MON 88702提供百分之三十三(33)至百分之六十八(68)的产量增加。在高草盲蝽压力下，视生长位置而定，事件MON88702提供百分之五十三(53)至百分之一百五十七(157)的产量增加。
实施例5
棉花事件MON 88702在田间在中和高天然草盲蝽压力下在施加或不施加杀虫剂的情况下提供优良产量
此实施例说明转基因棉花事件MON 88702当与相同变种的未转化的棉花相比时在中和高草盲蝽压力下在施加或不施加杀虫剂的情况下的优良产量。
在单一种植季节中在六个位置评估杀虫剂喷洒分析中的棉花产量。针对事件MON88702，每三十(30)英尺长的行使用一百二十(120)粒用
Figure BDA0001670858440000531
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理的种子来种植八(8)行棉花地块。种植未转化的棉花变种DP393并且用作阴性对照。各地块在田间重复三(3)次。设计三(3)个处理区块以评估在不用杀虫剂对地块进行处理以控制草盲蝽或用杀虫剂处理来控制草盲蝽时的条件下的棉花产量。将在所述季节期间未施加杀虫剂来控制草盲蝽的处理区块称为“未喷洒区块”。将施加杀虫剂来控制草盲蝽的两个处理区块称为“按通道(entry)喷洒”和“按区块喷洒”。对于按通道喷洒，当含有MON 88702或未转化的DP393的个别通道的平均三(3)个代表处于牧草盲蝽的常规经济阈值下或对于豆荚草盲蝽为每一百(100)次拉网十五(15)个草盲蝽时，用杀虫剂喷洒所述特定通道。对于按区块喷洒，当含有事件MON 88702与未转化的DP393两者的整个区块中的DP393的平均三(3)个代表处于牧草盲蝽的经济阈值下或对于豆荚草盲蝽为每一百次拉网十五(15)个草盲蝽时，用杀虫剂喷洒所述区块。表8示出了三(3)个区块在所测试的各位置以每英亩磅数表示的产量，以及各位置经历的天然草盲蝽压力。
如表8中所展示，未用杀虫剂处理和用杀虫剂处理的事件MON 88702相对于对应的未转化的对照DP393提供更大的产量。在没有杀虫剂处理的情况下，产量增加百分比视位置而定在21％至188％范围内。在按通道喷洒的情况下，产量增加百分比视位置而定在5％至72％范围内。在按区块喷洒的情况下，产量增加百分比视位置而定在8％至47％范围内。在所有位置，无论是否用杀虫剂处理，转基因棉花事件MON 88702均相对于未转化的对照提供增加的产量。
Figure BDA0001670858440000551
实施例6
棉花事件MON 88702在田间在中和高天然蓟马压力下提供抗性
此实施例说明转基因棉花事件MON 88702在中和高天然蓟马压力下当与未转化的棉花植株相比时在田间在单一种植季节期间在多个田间位置提供对蓟马的优良抗性的能力。
每三十(30)英尺长的行使用事件MON 88702或未转化的棉花变种DP393的一百二十(120)粒用
Figure BDA0001670858440000562
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理的种子(每行英尺四粒种子)来种植八(8)行棉花地块。各地块在田间重复四(4)次。
在2-4真叶阶段期间使用0-5的损害评级量表评估由蓟马引起的对棉花植株的损害。损害评级得分为零(0)等于没有损害并且未观测到蓟马。损害评级为一(1)对应于指示蓟马存在。损害评级为二(2)对应于对顶芽和叶的轻度损伤。损害评级为三(3)对应于对顶芽和叶的中度损伤。损害评级为四(4)对应于对顶芽和叶的重度损伤，并且有一些死亡的植株和夭折的顶芽。损害评级为五(5)对应于大多数植株的植株死亡、严重矮化、节间堆积、叶面积减小以及顶芽流产。由于所述试验中蓟马压力的天然变化，将位置分类为低、中或高压力位点。根据在所述特定位置在任何评级时间对于未转化变种所记录的最高损害评级得分来定义低、中以及高天然蓟马压力。低蓟马压力对应于损害评级低于二(2)。中蓟马压力对应于损害评级等于或大于二(2)并且小于四(4)。高蓟马压力对应于损害评级等于或大于四(4)。表9展示在单一种植季节中生长的三个位置的平均蓟马损害评级。
表9.2014年MON 88702和阴性对照DP393的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000561
如表9中所展现，棉花事件MON 88702提供针对蓟马(花蓟马属)的抗性。棉花转基因事件MON 88702一致地相对于阴性对照DP393具有显著更低的损害评级得分，不管天然蓟马压力如何。
实施例7
棉花事件MON 88702在田间在施加或不施加杀虫剂的情况下并且在处理或不处理种子的情况下提供蓟马抗性
此实施例说明转基因棉花事件MON 88702在施加或不施加杀虫剂的情况下并且在处理或不处理种子的情况下当与未转化的DP393对照相比时在田间在单一生长季节期间对多个蓟马物种提供优良蓟马抗性的能力，所述多个蓟马物种包括烟褐花蓟马属(Frankliniella fusca)(烟草蓟马)、东方花蓟马(Frankliniella tritici)(花蓟马)、西花蓟马(西方花蓟马)以及变异绢蓟马(大豆蓟马)。
每三十(30)英尺长的行使用棉花转基因事件MON 88702或未转化的DP393的一百二十(120)粒种子(每行英尺四粒种子)来种植四(4)行棉花地块。将种子用
Figure BDA0001670858440000572
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)或仅用杀真菌剂处理。此外，用杀虫剂喷洒或不用杀虫剂喷洒地块。表10中示出了实验设计。对于喷洒杀虫剂的那些地块，在一(1)至二(2)真叶阶段应用高灭磷(乙酰甲胺磷)的预防性叶面施用。在两个不同的时间点(第一个在一至二真叶阶段，而第二个在三至四真叶阶段)使用如先前实施例6中所描述的0-5的损害评级量表评估由蓟马引起的对棉花植株的损害。在各位置进行两次损害评级，除了试验1进行四次损害评级并且试验2进行三次损害评级的TN试验。
表10.蓟马抗性田间试验的实验设计.
Figure BDA0001670858440000571
Figure BDA0001670858440000581
从多个位点获得蓟马损害评级：VA、MS位点1、MS位点2、GA、MS位点3、LA位点1、LA位点2、SC以及TN。在VA、MS位点3以及TN中进行两次试验。表11至22示出了各田地位点试验中棉花转基因事件MON88702和未转化的对照DP393的平均蓟马损害评级，其中“SEM”为标准平均误差。
表11.VA试验1的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000582
表12.VA试验2的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000583
Figure BDA0001670858440000591
表13.MS位点1的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000592
表14.MS位点2的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000593
Figure BDA0001670858440000601
表15.GA的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000602
表16.MS位点3试验1的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000603
Figure BDA0001670858440000611
表17.MS位点3试验2的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000612
Figure BDA0001670858440000621
表18.LA位点1的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000622
表19.LA(位点2)的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000623
Figure BDA0001670858440000631
表20.SC的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000632
Figure BDA0001670858440000641
表21.TN试验1的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000642
Figure BDA0001670858440000651
表22.TN试验2的平均蓟马损害评级.
Figure BDA0001670858440000652
Figure BDA0001670858440000661
如表11至22中所展示，转基因棉花事件MON 88702相对于相同未转化的变种在田间条件下提供对蓟马的抗性。转基因事件MON 88702当与未转化的DP393相比时在各田间位置提供对蓟马的抗性。在转基因事件MON 88702中在未进行杀虫种子处理并且未进行预防性叶面杀虫剂施加的情况下观测到对蓟马的抗性。从仅用杀真菌剂处理的种子生长出的未喷洒的MON 88702植株的蓟马损害评级低于从用杀虫剂处理并且喷洒有叶面杀虫剂的种子生长出未转化的DP393。在VA中进行的两个试验中(表10和11)这特别突出。在许多位置，诸如VA、MS位点2以及GA，从第一数据时间点到下一个时间点MON 88702的损害评级下降，而针对未转化的DP393观测到相反趋势，不管是否进行了种子处理和预防性喷洒。收集蓟马成虫并且加以鉴定以评估各位置的物种组成。表23中示出了所观测到的物种组成。
表23:蓟马试验中不同位置的蓟马组成.
Figure BDA0001670858440000671
实施例8
如连续两年的笼罩和开放田间试验中所证实，棉花事件MON 88702提供对棉跳盲蝽(棉伪斑腿盲蝽)的抗性
此实施例说明转基因棉花事件MON 88702当与未转化的阴性对照DP393相比时提供针对半翅目害虫棉伪斑腿盲蝽(棉跳盲蝽，CFH)的抗性。
在TX中在第1年棉花生长季节期间在田间进行笼罩试验并且分析针对棉跳盲蝽的抗性。每三十(30)英尺长的行使用棉花转基因事件MON 88702或未转化的DP393阴性对照的一百二十(120)粒种子(每行英尺四粒种子)来种植两(2)行棉花地块。将种子用含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威的
Figure BDA0001670858440000672
处理。
在种植后约三十五(35)至四十(40)天时发生现蕾，在现蕾的第二周，将十(10)个随机选择的植株(每行五(5)个)关在由白色固体薄纱(JoAnne Fabrics,项目号8139875)制成的笼罩(150X 228厘米)中。将底部薄纱衬套紧固至植株主茎上土壤表面上方一点并且使用
Figure BDA0001670858440000682
绑带将顶部衬套绑在一起。将金属杆置于每一行的末端，并且将各笼罩的顶部连接到线上以保持笼罩处于竖直位置。
用两对棉跳盲蝽雄性和雌性成虫侵染各植株。将成虫释放到各个别笼罩中并且然后将笼罩关牢，确保昆虫不会逃走。允许昆虫交配并且使植株保持在笼罩中达三十(30)天。在三十天之后，在笼罩下方切掉植株并且移到实验室中，在实验室中收集各植株的昆虫并且计数。在打开笼罩之前，剧烈摇晃植株以确保所有昆虫从其进食位点掉落到笼罩底部。然后将笼罩底部打开。然后仔细检查植株以回收任何剩余的昆虫。记录各植株的昆虫数目和其发育阶段。表24中呈现了下一代小若虫(在第3龄之前)、大若虫(第4龄和第5龄)以及成虫的平均数目，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株的数目。
表24.在TX第1年田间笼罩试验中用CFH侵染的棉花事件MON 88702和阴性对照DP393的平均下一代昆虫计数.
Figure BDA0001670858440000681
如表24中可见，从棉花事件MON 88702的笼罩中回收的棉跳盲蝽昆虫的总数目约为在未转化的DP393对照中发现的数目的一半。所记录的下一代成虫的数目特定重要。未转化的DP393与事件MON 88702相比具有多约4倍的成虫，表明在发育过程中，归因于MON88702中表达的昆虫毒素TIC834_16有更少的若虫达到成年。棉跳盲蝽在卵期在包括巴豆、月见草、银叶茄以及披针叶鼠尾草(lanceleaf sage)的各种杂草宿主中过冬。卵在春天孵化，并且棉跳盲蝽侵染可获得的杂草宿主。在棉花开始现蕾后，成年棉跳盲蝽可并且常常移动至这些田地中。在早期棉花田中通常要用一代来产生经济损害数目。在此早期世代中减少成年棉跳盲蝽的数目可潜在地降低由下一代棉跳盲蝽引起的产量和经济影响。
在第2年，在温室中进行棉跳盲蝽试验。使转基因棉花事件MON 88702和未转化的DP393的十二(12)个植株在温室中生长并且以与上文所描述类似的方式关入笼中。棉跳盲蝽侵染和小若虫、大若虫以及成虫的计数也是如先前所描述来进行，除了在各笼罩中释放三对成虫。表25示出了MON 88702和DP393中所发现的下一代小若虫、大若虫以及成虫的平均数目，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株的数目。
表25.在TX第2年温室笼罩试验中用CFH侵染的棉花事件MON 88702和阴性对照DP393的平均下一代昆虫计数.
Figure BDA0001670858440000691
如表25中所展示，存在于MON 88702上的棉跳盲蝽的总数目小于阴性对照DP393。与前一年的领域笼罩试验一致，与阴性对照相关的成年棉跳盲蝽的数目比MON 88702高得多(约3倍)。
在第2年生长季节中，还在AZ和TX中针对棉跳盲蝽进行了田间试验。每三十(30)英尺长的行使用棉花转基因事件MON 88702或未转化的DP393的一百二十(120)粒种子(每行英尺四粒种子)来种植八(8)行棉花地块。将种子用
Figure BDA0001670858440000692
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理。在两个位置存在各通道的四(4)个代表。
在AZ位置使用地拉网并且在TX位置使用打击桶来收集棉跳盲蝽。地拉网法大体上由通过株冠顶部拉网，拉规定的次数并且然后在针对阶段分离之后计算昆虫数目组成。各地块进行总共二十(20)次拉网。以各进行十(10)次拉网的两(2)次操作来进行拉网。第一次操作在第二行与第三行之间进行。第二次操作在第六行与第七行之间进行。将网中所捕获的昆虫放进预先标记的袋中并且带回实验室进行计数。测定各位点的MON 88702和未转化的对照DP393的平均棉跳盲蝽若虫数目。在打击桶法中，在5加仑桶中摇晃植株，确保全部若虫从植株上下来并且将全部桶内容物放进预先标记的自封袋中。每次取样十(10)个植株进行三(3)次操作，每一地块每一时间取样总共三十(30)个植株。
除棉跳盲蝽计数之外，评估各地块的产量。从第四(4)行和第五(5)行收获棉铃并且测定平均籽棉产量并且以每英亩的籽棉产量表示。表26示出了各位点的MON 88702和未转化的对照DP393的平均棉跳盲蝽若虫数目和平均产量，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株的数目。
表26.第2年开放田间试验中的平均CFH若虫数目和平均籽棉产量.
Figure BDA0001670858440000701
表26表明MON 88702的平均棉跳盲蝽若虫数目比未转化的DP393中低。此外，MON88702中的平均棉花产量比未转化的DP393中高。
如表24-26中所展示，棉花事件MON 88702在笼罩试验中并且在田间提供对棉跳盲蝽的抗性并且提供棉花产量增加。
实施例9
如笼罩试验中所证实棉花事件MON 88702提供对佛得植食蝽(斑点淡盲蝽)的抗性
此实施例说明转基因棉花事件MON 88702当与未转化的阴性对照DP393相比时在TX中进行的笼罩试验中提供针对半翅目害虫斑点淡盲蝽(Distant)(佛得植食蝽)的抗性。
从田间的植株收集佛得植食蝽若虫并且带回实验室进行饲养。在成虫达到生殖成熟(出现之后约十(10)天)后，将它们用于侵染关笼棉花植株中的棉花事件MON 88702或未转化的对照DP393。
每三十(30)英尺长的行使用棉花转基因事件MON 88702或未转化的DP393的一百二十(120)粒种子(每行英尺四(4)粒种子)来种植八(8)行棉花地块。将种子用
Figure BDA0001670858440000713
(其含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威)处理。每一事件种植四(4)个重复地块。随机选择各事件的十二(12)个植株关入笼中。在关笼之前去除所选植株上的任何昆虫。如先前在实施例2中所描述在盛开之前至少一周时将植株关入笼中。将各植株用两对雄性和雌性佛得植食蝽侵染。在侵染之后允许昆虫产卵并且在各植株上发育四(4)周。从各植株收获八(8)至十(10)个棉铃并且检查对子囊腔的损害以及由佛得植食蝽造成的内部和外部刺穿。
表27示出了所收获的棉铃的平均受损子囊腔，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株的数目。如表27中可见，MON 88702事件植株中存在比未转化的对照DP393少的受损子囊腔。
表27.用佛得植食蝽侵染的植株每个植株每个棉铃的平均受损子囊腔.
Figure BDA0001670858440000711
表28示出了平均外部和内部刺穿，其中“SEM”为标准平均误差并且“N”为关笼和取样的植株的数目。如表28中可见，事件MON 88702的棉铃中的平均外部和内部刺穿数目比未转化的对照DP393中低。
表28.用佛得植食蝽侵染的植株每个棉铃的平均外部和内部刺穿.
Figure BDA0001670858440000712
如表27和28中所展示，如子囊腔损害的量较低以及外部和内部刺穿较少所证实，棉花事件MON 88702当与未转化的阴性对照DP393相比时展示针对佛得植食蝽的抗性。
实施例10
棉花事件MON 88702当与未转化的DP393相比时在田间提供一致的产量、类似农业经济学以及类似纤维质量
此实施例证实，转基因棉花事件MON 88702在田间提供一致的产量。
在田间在连续两年内历时两年的评估对棉花事件MON 88702与未转化的DP393进行比较，以评估在使用针对非草盲蝽与草盲蝽害虫的杀虫喷雾来控制昆虫的侵染条件下产量的任何差异。每四十(40)英尺长的行使用棉花转基因事件MON 88702或未转化的DP393阴性对照的一百六十(160)粒种子(每行英尺四(4)粒种子)来种植两(2)行棉花地块。将种子用含有杀真菌剂、杀虫剂吡虫啉以及杀线虫剂硫双威的
Figure BDA0001670858440000721
处理。各地块重复四(4)次。按需要施加杀虫喷雾以控制草盲蝽与非草盲蝽害虫，从而使对地块的任何潜在损害最小化。
在季节结束时，通过使用可商购获得的脱叶剂和开棉铃剂(boll opener)来终止生长。以此方式使用的脱叶剂常常被称为“收获助剂”。在收获之前去除叶子提供若干优点。举例来说，在收获之前去除叶子增加通过作物株冠的空气运动，这有助于更快地干燥并且预防铃腐病。此方法还允许采摘者在一天中更早地开始并且提供更快和更高效的采摘者操作。通过更有效地降低湿度，棉铃在模块中的储存得到极大改善。去除叶子还清除了染色和垃圾的主要来源，这提供更好的棉绒等级。开棉铃剂有助于成熟棉铃打开，这容许收获操作早若干天开始，增加在第一次采摘期间收获的作物的百分比，并且在许多田地中使得采摘成为浏览一遍即可的操作。当田间百分之六十(60)的棉铃打开时施加脱叶剂和开棉铃剂。
为了评估产量，收获各两(2)行地块的两行并且以“籽棉(磅/英亩)”的形式记录产量。表29中呈现了产量结果。
表29.第1年和第2年田间收获的籽棉产量(磅/英亩).
事件 第1年产量 第2年产量
MON 88702 3600.1 3855.4
DP393 3585.1 3854.0
如上表29中所展示，MON 88702与未转化的DP393在田间提供类似棉花产量。这证实棉花事件MON 88702在表达昆虫毒素TIC834_16时不经历归因于转基因表达的产量拖累。事实上，如实施例4和5中所示，棉花事件MON 88702在施加或不施加杀虫剂的情况下在草盲蝽压力的条件下提供显著的产量优势。
还评估了植株在第1年与第2年的任何表型差异。表型差异的实例包括早期活力得分(EVS)、节点数目、植株高度以及成熟度(周数)。在植株已出现之后约十(10)至十四(14)天时测定早期活力得分。所述得分为用于基于植株在地块中出现来确定地块是否具有完全产量潜力的视觉评级。使用一至五的量表来对地块进行评级。评级为四或五指示低活力，而评级为一对应于高活力。表30示出了MON 88702与阴性对照DP393之间关于早期活力、节点数目、植株高度以及植株成熟度的表型值。所述值中的每一个以平均数表示。针对各生长季节进行比较。由“*”指示的那些值表示在生长季节内与对照相比有显著差异(p＝0.05)。
表30.第1年和第2年在田间生长的MON 88702和未转化的DP393的表型特征.
Figure BDA0001670858440000731
如表30中可见，棉花转基因事件MON 88702展现与未转化的DP393类似的表型特征。在2013年就植株高度来说观测到小的差异，然而第二年MON88702与DP393两者平均高度大致相同。就早期活力直立、节点数目以及成熟度来说，MON 88702与DP393在整个生长季节不显著地不同。
在收获之前每个地块收集二十五(25)个棉铃用于评估纤维质量和其他特征。从种植行中的代表性点收集棉铃。从所选植株收获全部棉铃以防止在收集时归因于尺寸或其他特征而引入任何偏差。由所收获的棉铃测定纤维质量特性，诸如纤维强度、纤维长度、长度均匀性以及马克隆值(micronaire)。以英寸来测量纤维长度。
通过夹持一束纤维并且使其断裂来进行纤维强度测量，钳口之间间隔1/8-英寸。以克/特克斯(tex)将结果报道至最接近的十分之一。特克斯单位等于一千米纤维的重量(克)。因此，所报道的强度为使尺寸为一特克斯单位的一束纤维断裂所需的力(克)。表31示出了一般描述和对应强度测量(克/特克斯)。
表31.纤维强度描述和对应强度测量.
Figure BDA0001670858440000741
长度均匀性为三位数，是样品中纤维均匀度至最接近的十分之一的度量。表32示出了长度均匀性描述和对应长度均匀性得分。
表32.长度均匀性描述和得分.
描述 长度均匀性
非常低 ≤76.5
低 76.5-79.4
一般 79.5-82.4
高 82.5-85.4
非常高 ≥85.4
马克隆值为纤维细度和成熟度的度量。使用气流仪器来测量压制到固定体积的恒定质量的棉花纤维的透气性。通过棉花纤维试样的气流体积以马克隆值表示。马克隆值测量在3.7与4.2之间的棉花被认为在马克隆值的优质范围内。马克隆值在3.5-3.6或4.3-4.9范围内的棉花被认为是基础质量，而超过4.9或低3.5的棉花在折损范围内。马克隆值测量可能会在生长期内受到环境条件的影响，诸如湿度、温度、阳光、植物营养物以及植株或棉铃个数的极端植。有利的生长条件产生具有优质范围马克隆值读数的完全成熟的纤维。打断植物过程的诸如缺乏水分、早期冰冻或任何其他条件等不利条件将产生未成熟的纤维和低马克隆值测量。高马克隆值棉花是由诸如以下情况造成的：在棉铃成熟期间温度异常温暖或不良成铃导致碳水化合物的过度可获得性以及纤维过度成熟。纤维细度以若干方式影响加工性能和最终产品的质量。在打开、清洁以及梳理工艺中，低马克隆值或细纤维棉花需要更慢的加工速度以防止对纤维的损害。由较细的纤维制成的纱在单位截面上产生较多的纤维，在单位截面上纤维较多反过来又产生较坚固的纱。高马克隆值或粗纤维对于细纱来说不适合，因为结果会是每单位截面的纤维较少，这将降低纱强度。马克隆值和成熟度在棉花变种内为高度相关的。染料吸收率和保持率随纤维的成熟度而变化。低成熟度纤维具有不良染料吸收率和保持率，而较高马克隆值纤维具有良好的吸收率和保持率。
表33示出了在第1年和第2年连续两个生长季节针对MON 88702与未转化的阴性对照DP393所测定的纤维质量测量。由“*”指示的那些值表示在生长季节内与对照相比有显著差异(p＝0.05)。
表33.MON 88702和DP393的纤维质量.
Figure BDA0001670858440000751
如表33中可见，事件MON 88702与未转化的DP393在2013年与2014年生长季节中产生非常类似质量的纤维。事件MON 88702产生具有与阴性对照类似的长度的纤维。MON88702与DP393产生具有高至非常高均匀性的非常坚固的纤维。MON 88702与DP393之间的马克隆值测量不显著地不同。这些结果证实纤维质量不会不利地受到MON 88702中转基因盒的表达的影响。
实施例11
棉花事件MON 88702事件特异性终点
Figure BDA0001670858440000752
和接合性分析
以下实施例描述适合用于鉴定棉花样品中事件MON 88702的存在的方法。设计PCR引物对和探针以便在事件特异性终点
Figure BDA0001670858440000753
PCR中鉴定棉花基因组DNA与事件MON88702的插入的DNA之间所形成的独特接点。表34和表35中描述了用于在事件特异性终点
Figure BDA0001670858440000761
PCR中鉴定棉花样品中MON 88702的存在的条件的实例。
寡核苷酸上游引物SQ21940的序列(SEQ ID NO:11)与对应于SEQ ID NO:10的位置4720至4744的核苷酸序列相同。寡核苷酸反向引物SQ-50210的序列(SEQ ID NO:12)与对应于SEQ ID NO:10的位置4803至4826的核苷酸序列的反向互补序列相同。寡核苷酸探针PB10344的序列(SEQ ID NO:13)与对应于SEQ ID NO:10的位置4745至4766的核苷酸序列相同。在终点
Figure BDA0001670858440000762
PCR分析中可使用引物SQ21940(SEQ ID NO:11)和SQ-50210(SEQID NO:12)加上可进行荧光标记(例如6FAMTM荧光标记)的探针PB10344(SEQ ID NO:13)来鉴定样品中衍生自事件MON 88702的DNA的存在。
除SQ21940(SEQ ID NO:11)、SQ-50210(SEQ ID NO:12)以及PB10344(SEQ ID NO:13)之外，本领域技术人员应清楚的是，可设计其他引物和/或探针来扩增和/或杂交至SEQID NO:10内独特的并且适合用于检测样品中衍生自事件MON 88702的DNA的存在的序列。
在标准分子生物学实验室实践之后，开展用于事件鉴定的PCR分析来检测样品中的事件MON 88702。使用用以检测样品中衍生自事件MON 88702的DNA的存在的每种引物对和探针(例如用诸如6FAMTM等荧光标签标记的探针)的集合对标准PCR分析或
Figure BDA0001670858440000763
PCR分析的参数进行优化。用于PCR反应的对照包括对陆地棉纤维特异性酰基载体蛋白(ACP1)基因(基因库登录U48777)具特异性的内部对照引物和内部对照探针(例如
Figure BDA0001670858440000764
标记的)，并且为引物SQ22496(SEQ ID NO:14)、SQ22497(SEQ ID NO:15)以及
Figure BDA0001670858440000765
标记的探针PB13032(SEQ ID NO:17)。
通常，经过优化用于检测样品中的事件MON 88702的参数包括引物和探针浓度、模板DNA的量以及PCR扩增循环参数。用于此分析的对照包括来自含有事件MON 88702DNA的棉花的阳性对照、来自非转基因棉花的阴性对照以及不含模板DNA的阴性对照。
表34.棉花事件MON 88702事件特异性终点
Figure BDA0001670858440000766
PCR反应组分.
Figure BDA0001670858440000771
表35.终点
Figure BDA0001670858440000772
热循环器条件
步骤编号 循环次数 设定
1 1 95℃20秒
2 10 95℃3秒
2 10 64℃-1℃/循环20秒
3 30 95℃3秒
3 30 54℃20秒
4 1 10℃20始终
接合性分析适合用于确定包含事件的植株对事件DNA是纯合的(即在染色体对的各染色体上的相同位置包含外源性DNA)、对事件DNA是杂合的(即仅在染色体对的一个染色体上包含外源性DNA)还是野生型(即对事件DNA为裸的)。使用终点
Figure BDA0001670858440000773
热扩增方法来开展关于事件MON 88702的接合性分析。表36和37中提供了可用于事件特异性接合性
Figure BDA0001670858440000783
PCR中的条件的实例。对于此分析，将三种引物和两种探针与样品混合在一起。用于接合性分析中的DNA引物为引物SQ50844(SEQ ID NO:17)、SQ50843(SEQ ID NO:19)以及SQ50842(SEQ ID NO:20)。用于接合性分析中的探针为6FAMTM标记的探针PB50279(SEQID NO:18)以及
Figure BDA0001670858440000784
标记的探针PB50278(SEQ ID NO:21)。引物SQ50844(SEQ ID NO:17)和SQ50843(SEQ ID NO:19)加上探针PB50279(SEQ ID NO:18)(6FAMTM标记的)可诊断事件MON 88702DNA。引物SQ50842(SEQ ID NO:20)和SQ50843(SEQ ID NO:19)以及
Figure BDA0001670858440000785
标记的探针PB50278(SEQ ID NO:21)当不存在MON 88702的拷贝(即为野生型等位基因)时具诊断性。
当在PCR反应中将三种引物和两种探针与从对事件MON 88702为杂合的植株提取的DNA混合在一起时，存在来自6FAMTM标记的探针PB50279(SEQ ID NO:18)与
Figure BDA0001670858440000786
标记的探针PB50278(SEQ ID NO:21)的荧光信号，所述荧光信号指示并且诊断植株对事件MON88702为杂合的。当在PCR反应中将三种引物和两种探针与从关于事件MON 88702的裸植株(即野生型植株)提取的DNA混合在一起时，仅存在来自
Figure BDA0001670858440000787
标记的探针PB50278(SEQ IDNO:21)的荧光信号，所述荧光信号指示并且诊断植株关于事件MON 88702为裸的。用于此分析的模板DNA样品和对照为来自含有事件MON 88702 DNA的棉花(来自已知纯合样品与已知杂合样品)的阳性对照、来自非转基因棉花的阴性对照以及不含模板DNA的阴性对照。
表36.棉花事件MON 88702接合性
Figure BDA0001670858440000782
PCR
Figure BDA0001670858440000781
Figure BDA0001670858440000791
表37.接合性
Figure BDA0001670858440000793
热循环器条件
Figure BDA0001670858440000792
实施例12
任何MON 88702育种事件中的棉花事件MON 88702的鉴定
以下实施例描述了如何可使用棉花事件MON 88702来鉴定任何育种活动的子代内的MON 88702事件。
使用DNA引物对来产生可诊断棉花事件MON 88702的扩增子。可诊断MON 88702的扩增子包含至少一个接点序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6(在图1a中分别为[1]、[2]、[3]、[4]、[5]以及[6])。SEQ ID NO:1为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的二十(20)核苷酸序列。SEQ IDNO:1位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置1642-1661处。SEQ ID NO:2为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的二十(20)核苷酸序列。SEQ ID NO:2位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置4785-4804处。SEQ ID NO:3为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的六十(60)核苷酸序列。SEQ ID NO:3位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置1622-1681处。SEQ ID NO:4为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的六十(60)核苷酸序列。SEQ ID NO:4位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置4765-4824处。SEQ IDNO:5为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'接点区的一百核苷酸序列。SEQ IDNO:5位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置1602-1701处。SEQ ID NO:6为表示棉花基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'接点区的一百核苷酸序列。SEQ ID NO:6位于SEQ ID NO:10中的核苷酸位置1602-1701处。
将产生可诊断事件MON 88702的扩增子的引物对包括基于侧接序列和插入的TIC834_16表达盒的引物对。为获得存在SEQ ID NO:1的至少十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:7的碱基1至1651的上游引物以及基于SEQ ID NO:9的反向引物。为获得存在SEQ ID NO:2的至少十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:9的上游引物和基于SEQ ID NO:8的碱基1至2010的反向引物。为获得存在SEQ ID NO:3的至少三十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:7的碱基1至1651的上游引物以及基于SEQ ID NO:9的反向引物。为获得存在SEQ ID NO:4的至少三十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:9的上游引物以及基于SEQ ID NO:8的碱基1至2010的反向引物。为获得存在SEQ ID NO:5的至少五十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:7的碱基1至1651的上游引物以及基于SEQ ID NO:9的反向引物。为获得存在SEQ ID NO:6的至少五十一个核苷酸的诊断扩增子，将设计基于SEQ ID NO:9的上游引物以及基于SEQ ID NO:8的碱基1至2010的反向引物。
出于实用的目的，应设计产生具有优选在200至1000个碱基之间的有限尺寸范围的扩增子的引物。一般在PCR反应中更可靠地产生更小尺寸的扩增子，允许更短的循环时间，并且可在琼脂糖凝胶上轻易分离和目视观察或适合于在终点
Figure BDA0001670858440000801
样分析中使用。此外，可将使用所述引物对产生的扩增子克隆至载体中，增殖，分离，并且测序，或可使用本领域中充分确立的方法直接测序。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON 88702或其子代的扩增子的衍生自SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:9的组合或SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9的组合的任何引物对为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON88702或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:7的至少十一个连续核苷酸或其互补序列的任何单一分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON 88702或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:8的至少十一个连续核苷酸或其互补序列的任何单一分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。适合用于DNA扩增方法中以产生可诊断MON 88702或其子代的扩增子的包含SEQ ID NO:9的至少十一个连续核苷酸或其互补序列的任何单一分离的DNA多核苷酸引物分子为本发明的一个方面。
前一实施例的表34和35中说明了用于此分析的扩增条件的实例。然而，这些方法或与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7同源或互补的DNA引物的使用或MON 88702的转基因插入物(SEQ ID NO:9)中所含的产生可诊断MON 88702的扩增子的基因元件的DNA序列的任何修改在本领域范围内。诊断扩增子包含与至少一个转基因/基因组接点DNA(SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)同源或互补的DNA分子或其基本部分。
对事件MON 88702植物组织样品的分析应包括来自事件MON 88702的阳性组织对照、来自不为事件MON 88702的棉花植株的阴性对照(例如但不限于DP393)以及不含棉花基因组DNA的阴性对照。引物对将扩增内源性棉花DNA分子并且将充当DNA扩增条件的内部对照。额外的引物序列可由DNA扩增方法领域技术人员从SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9中选择，并且选择用于通过表34和表35中所示的方法制备扩增子的条件可有所不同，但产生可诊断事件MON 88702DNA的扩增子。使用这些DNA引物序列并且对表34和表35的方法加以修改在本发明的范围内。由衍生自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少一个DNA引物序列产生的可诊断MON 88702的扩增子为本发明的一个方面。
含有具有衍生自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的足够长度的连续核苷酸的至少一种DNA引物并且当用于DNA扩增方法中时产生MON 88702或其子代的诊断扩增子的DNA检测试剂盒为本发明的一个方面。当在DNA扩增方法中测试时基因组将产生可诊断MON 88702的扩增子的棉花植株或种子为本发明的一个方面。可如表35中所示通过使用应用生物系统GeneAmp PCR系统9700、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer9700、Eppendorf Mastercycler梯度热循环器或可用于产生可诊断MON 87702的扩增子的任何其他扩增系统来进行关于MON 88702扩增子的分析。
实施例13
含有事件MON 87702的植株的杂交
为了产生包含增强的农艺学、杀虫或除莠特性的棉花植株或其植物部分，使含有MON 87702的棉花植株与可能含有任何其他棉花事件或其组合的棉花植株杂交，并且对表型进行评估以测定子代植株的所得特性。由此类植物育种产生的赋予子代植株的特性可延伸超出MON 87702的半翅目和缨翅目抗性，包括但不限于地上害虫防治、除草剂耐受性、杀线虫特性、抗旱性、抗病毒性、抗真菌控制、抗细菌性、雄性不育、耐寒性、耐盐性以及增加的产量。具有改善的农艺学性状的转基因事件的实例为本领域中熟知的。以下为可用于在MON87702存在下进行育种以在棉花植株、植物部分、种子或商品产品中赋予增强的特性的可能的转基因棉花品系的非限制性列表：19-51A(DD-04951A-7)、BXN、MON 1445(MON-01445-2)、MON 88701(MON-88701-3)、MON 88913(MON-88913-8)、GHB614(BCS-GH002-5)、DAS-81910-7(DAS-81910-7)、GHB119(BCS-GH005-8)、LL棉25(ACS-GH0013)、EE-GH1、EE-GH3、pDAB4468.18.07.1、pDAB4468.19.10.3、281-24-236(DAS-24236-5)、3006-210-23(DAS-21023-5)、COT102(SYN-IR102-7)、COT67B(SYN-IR67B-1)、事件-1、MON 531(MON-00531-6)、MON15985(MON-15985-7)、EE-GH5、EE-GH6、COT202、COT203、A26-5、31807、31808、T303-3(BCS-GH003-6)以及T304-40(BCS-GH004-7)。
本说明书中引用并且作为本发明的材料的全部公开案和公布的专利文件以引用的方式并入本文中，其程度就如同各个别公开案或专利申请特定地并且个别地被指示以引用的方式并入本文中一样。
虽然已说明和描述了本发明的原理，但本领域技术人员应清楚可在布置和细节方面对本发明进行修改而不会背离此类原理。我们要求在所附权利要求书精神和范围内的全部修改型式。
Figure IDA0001670858480000011
Figure IDA0001670858480000021
Figure IDA0001670858480000031
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Claims (16)

1.一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10以及其完整互补序列。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子是来自棉花事件MON88702，包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
3.一种DNA分子，所述DNA分子包含足够长度的多核苷酸区段以充当DNA探针，所述DNA探针在严格杂交条件下与样品中的棉花事件MON 88702DNA特异性地杂交，并且所述DNA探针包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，其中检测到所述DNA分子在所述严格杂交条件下的杂交是对样品中的棉花事件MON 88702DNA的诊断，并且其中包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其中所述样品包括棉花植株、棉花植物细胞、棉花种子、棉花植物部分、棉花子代植株、棉油、棉花蛋白质、棉粕、包含棉花的动物饲料、包含棉花的纸或棉花商品产品。
5.一种DNA分子对，所述DNA分子对包含第一DNA分子和不同于所述第一DNA分子的第二DNA分子，所述DNA分子对当与含有棉花事件MON 88702模板DNA的样品一起用于扩增反应中时充当DNA引物以产生可诊断所述样品中的所述棉花事件MON 88702DNA的扩增子，其中所述扩增子包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24以及SEQ ID NO:25，并且其中包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
6.一种检测可诊断样品中的棉花事件MON 88702DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与如权利要求3所述的DNA探针接触；
b)使所述样品和所述DNA探针经受严格杂交条件；以及
c)检测所述DNA探针与所述样品的杂交，
其中所述检测步骤是对样品中的所述棉花事件MON 88702DNA的存在的诊断，并且其中包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
7.一种检测可诊断样品中的棉花事件MON 88702DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与如权利要求5所述的DNA分子对接触；
b)进行足以产生DNA扩增子的扩增反应；以及
c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在，
其中所述DNA扩增子包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24以及SEQ ID NO:25，并且其中包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
8.一种保护棉花植株免受昆虫侵染的方法，其中所述方法包括在半翅目害虫或缨翅目害虫的膳食中提供杀虫有效量的包含事件MON 88702的所述棉花植株的细胞或组织，包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述半翅目害虫是选自由以下各项组成的组：豆荚草盲蝽、牧草盲蝽以及棉伪斑腿盲蝽。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述缨翅目害虫是选自由花蓟马属和变异绢蓟马组成的组。
11.一种产生抗虫性棉花植株的方法，所述方法包括：
a)使两种不同的棉花植株有性杂交，其中所述两种不同的棉花植株中的至少一种包含转基因棉花事件MON 88702DNA；
b)从所述杂交的子代采集种子或组织样品；
c)检测可诊断来自步骤(b)的所述样品中的棉花事件MON88702的序列以鉴定包含棉花事件MON 88702DNA的子代；以及
d)选择包含棉花事件MON 88702DNA的所述子代，其中所述子代为包含转基因棉花事件MON 88702DNA的抗虫性棉花植株；
其中包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏。
12.一种微生物，所述微生物包含可检测量的重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10以及其完整互补序列。
13.如权利要求12所述的微生物，其中所述微生物为植物细胞。
14.一种测定包含事件MON 88702的棉花植株或棉花种子的接合性的方法，包含所述事件的种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-122520保藏，所述方法包括：
a)使包含棉花DNA的样品与引物组接触，所述引物组能够产生可诊断事件MON 88702的第一扩增子和可诊断不包含事件MON 88702的天然棉花基因组DNA的第二扩增子；
i)用所述样品和所述引物组进行核酸扩增反应；以及
ii)在所述核酸扩增反应中检测所述可诊断事件MON 88702的第一扩增子，或所述可诊断不包含事件MON 88702的天然棉花基因组DNA的第二扩增子，
其中仅存在所述第一扩增子可诊断对所述样品中的事件MON88702DNA为纯合的棉花植株，并且存在所述第一扩增子和所述第二扩增子两者可诊断对事件MON 88702等位基因为杂合的棉花植株；或
b)使包含棉花DNA的样品与探针组接触，所述探针组含有至少一个第一探针，所述至少一个第一探针特异性地杂交至事件MON 88702DNA；以及至少一个第二探针，所述至少一个第二探针特异性地杂交至因插入事件MON 88702的异源DNA而受干扰的棉花基因组DNA并且不杂交至事件MON 88702DNA，
i)使所述探针组与所述样品在严格杂交条件下杂交，以及
ii)检测所述第一探针或所述第二探针的杂交，其中仅检测到所述第一探针在所述杂交条件下的杂交可诊断所述样品中事件MON 88702DNA的纯合等位基因，并且其中检测到所述第一探针和所述第二探针两者在所述杂交条件下的杂交可诊断DNA样品中事件MON88702的杂合等位基因。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述引物组包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19以及SEQ ID NO:20。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述探针组包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21。
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