CN111434678A

CN111434678A - 植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因在耐低氮胁迫中的应用

Info

Publication number: CN111434678A
Application number: CN201910022969.1A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 马有志; 周永斌; 徐兆师; 陈隽
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN111434678B

Abstract

本发明公开了植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因在耐低氮胁迫中的应用。本发明提供的植物脱水应答元件编码蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，向植物中导入本发明植物脱水应答元件编码蛋白基因的表达盒使植物中表达植物脱水应答元件编码蛋白后，植物的耐低氮能力增强，说明植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因可以调控植物的耐低氮性，可用于培育耐低氮植物。

Description

植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因在耐低氮胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因在耐低氮胁迫中的应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫都会影响植物的正常生长和发育。了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，提高植物特别是作物的抗逆性是作物遗传研究和品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。阐明植物对逆境的反应机制，将为植物抗逆的分子育种提供科学的理论基础。研究表明，植物在水分亏缺引起植物损伤之前，就能对干旱作出包括信号转导、基因表达和代谢调节在内的适应性调整并继续生长和发育。基因与环境是调节植物生长发育的两个基本因素，探索环境条件如何调控植物的基因表达，以及环境条件对植物体内的生理功能变化的影响已成为植物遗传育种学家的最大挑战，这正是信号转导(Signal transduction)机制研究的热点问题。

植物的许多基因已被证明受非生物逆境胁迫的诱导，这些基因的表达产物有的在抗逆性中直接发挥功能，有的负责调控下游基因的表达和逆境信号的传导。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucinezipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻和油菜中均有报道，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对逆境应答基因rd29A基因的启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺势作用元件，即干旱应答元件(DRE，drought–responsive element)。此后，发现许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件。Liu等人首次利用酵母单杂交系统，从拟南芥的cDNA表达文库中克隆到二种编码与DRE元件结合的转录因子干旱应答元件结合蛋白(DREB，drought–responsive element binding protein)cDNA，分别命名为DREB1A，DREB2A。它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个氨基酸组成的DNA结合区域(DERBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸。在DREB类蛋白中决定DNA结合的特异性方面，V14的作用明显要比E19重要；而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特异结合DRE/CRT顺式元件，ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α－螺旋，该α－螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。

目前，在许多植物中都发现这种含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关。刘强等认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。Kasuga等的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达,转基因植株的抗逆性大大增强。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的综合抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

研究人员最早发现，在干旱、高盐及低温等逆境胁迫下，体内脱落酸(ABA)大量积累，许多与逆境胁迫耐性有关的基因是受ABA诱导的。在转录水平上研究ABA诱导基因表达调控，发现在功能基因的启动子区域内都有一个相当保守的序列(PyACGTGGC)，作为ABA应答元件(ABA responsive element，ABRE)。与ABRE特异结合的反式作用因子也相继被克隆。此外，还发现另外一些顺式作用元件参与ABA的应答反应，如在大麦HVA22基因中鉴定的偶联元件(Coupling element,CE)CE1，其核心序列是TGCCACCGG。

与此同时，研究也发现许多与逆境耐性有关的基因的表达与ABA无关,其中，有些基因受干旱和低温同时诱导，有些基因只对干旱或低温有应答反应。说明植物体内存在多条信号传递途径，负责逆境胁迫信号的感应、传递和基因表达的调控。Yamaguchi-Shinozaki等利用示差筛选法从干旱处理的拟南芥中，克隆了一批受干旱诱导的基因，其中，rd29基因编码与LEA蛋白非常相似的蛋白，它对干旱、高盐及低温胁迫均可产生应答反应，对其启动子的研究发现有二个不依赖于ABRE的DRE顺式作用元件(drought responsiveelement,DRE)。其核心序列是TACCGACAT。目前已分离克隆的与逆境耐性有关的基因，如rd17,kin1,cor6.6等基因的启动子区域内也都发现了DRE元件或DRE核心序列元件，此外，在低温应答元件CRT(C-repeat)、LTRE(Low temperature responsive element)也存在CCGAC保守序列，说明DRE元件普遍存在于逆境胁迫应答基因的启动子中，并对逆境胁迫应答起重要作用。

综合目前的研究结果，植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径：

依赖于ABA的信号传递途径有三条：

1)受干旱、高盐诱导，激活MYB、MYC类转录因子基因，调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因。

2)受干旱、高盐诱导，激活ABF/AREB类转录因子基因，调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因。

3)受干旱、高盐诱导，激活CBF4，DREB1类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

不依赖于ABA的信号传递途径有三条：

1)受干旱、高盐诱导，激活DREB2类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

2)受低温诱导，激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

3)受干旱、高盐或乙烯诱导，激活EREB类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

目前，在水稻、玉米等主要农作物中已有DREB转录因子基因克隆的报道，从大豆中克隆DREB转录因子基因还未见报道。

DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝胶阻滞(gelretardation)试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。基本原理为:在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可证实特异性DNA与相应蛋白结合。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐低氮胁迫能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于大豆的植物脱水应答元件蛋白(其名称为GmDREB3)的下述任一应用：

X1、在调控植物耐低氮胁迫中的应用；

X2、在制备调控植物耐低氮胁迫产品中的应用；

X3、在提高植物耐低氮胁迫性中的应用；

X4、在制备提高植物耐低氮胁迫性产品中的应用；

X5、在提高植物在低氮环境中的氮吸收能力中的应用；

X6、在制备提高植物在低氮环境中的氮吸收能力产品中的应用；

X7、在提高植物在低氮环境中的生物量中的应用；

X8、在制备提高植物在低氮环境中的生物量产品中的应用；

X9、在培育耐低氮胁迫植物中的应用；

X10、在制备耐低氮胁迫植物产品中的应用；

所述植物脱水应答元件蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的GmDREB3蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的GmDREB3蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的GmDREB3蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的GmDREB3蛋白质。

本发明还提供了与GmDREB3相关的生物材料的下述任一应用：

X1、在调控植物耐低氮胁迫中的应用；

X2、在制备调控植物耐低氮胁迫产品中的应用；

X3、在提高植物耐低氮胁迫性中的应用；

X4、在制备提高植物耐低氮胁迫性产品中的应用；

X5、在提高植物在低氮环境中的氮吸收能力中的应用；

X7、在提高植物在低氮环境中的生物量中的应用；

X8、在制备提高植物在低氮环境中的生物量产品中的应用；

X9、在培育耐低氮胁迫植物中的应用；

X10、在制备耐低氮胁迫植物产品中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码GmDREB3的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmDREB3的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmDREB3的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GMDREB3蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GMDREB3蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GMDREB3蛋白质且具有GMDREB3蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GMDREB3蛋白质的核酸分子的表达盒(GMDREB3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GMDREB3蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GMDREB3基因转录的启动子，还可包括终止GMDREB3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GMDREB3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pBluescript SK。

B3)所述重组载体可为pSH GmDREB3环形质粒，所述pSH GmDREB3环形质粒可为将pBluescript SK的SacI和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的GmDREB3基因得到的重组载体。

进一步，B2)所述表达盒可为所述pSH GmDREB3环形质粒中含有启动子、所述GmDREB3的编码基因和终止子的DNA片段。具体的，B2)所述表达盒可为利用SpeI和KpnI对所述pSH GmDREB3环形质粒进行双酶切得到的含有启动子、所述GmDREB3的编码基因和终止子的DNA片段。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

所述植物有穗，所述生物量为籽粒产量、籽粒数、穗数、千粒重、植株重量和/或植株大小；

或，所述植物无穗，所述生物量为籽粒产量、籽粒数、千粒重、植株重量和/或植株大小。

所述植株重量可体现在干重和/或鲜重上。

所述植株大小可体现在根长、根表面积、根直径和/或根体积上。

本发明还提供了下述任一方法：

Y1)培育耐低氮植物的方法，包括使受体植物中表达GmDREB3，或提高受体植物中GmDREB3的含量，或提高受体植物中GmDREB3的活性，得到耐低氮目的植物；

Y2)提高植物耐低氮胁迫性的方法，包括使受体植物中表达GmDREB3，或提高受体植物中GmDREB3的含量，或提高受体植物中GmDREB3的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比耐低氮胁迫性增强；

Y3)提高植物在低氮环境中生物量的方法，包括使受体植物中表达GmDREB3，或提高受体植物中GmDREB3的含量，或提高受体植物中GmDREB3的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比产量增加；

Y4)提高植物在低氮环境中的氮吸收能力的方法，包括使受体植物中表达GmDREB3，或提高受体植物中GmDREB3的含量，或提高受体植物中GmDREB3的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比氮吸收能力增加。

上述方法中，所述植物有穗，所述生物量为籽粒产量、籽粒数、穗数、千粒重、植株重量和/或植株大小；

所述植株重量可体现在干重和/或鲜重上。

所述植株大小可体现在株高、根长、根表面积、根直径和/或根体积上。

上述方法中，Y1)、Y2)、Y3)和Y4)所述方法均可通过向所述受体植物中导入GmDREB3的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述GMDREB3的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GMDREB3的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GMDREB3的编码基因可利用含有所述GMDREB3的编码基因的表达盒导入受体植物。所述表达盒具体可为B2)所述表达盒。

所述表达盒可通过基因枪转化法导入植物细胞。

所述目的植物理解为不仅包含GMDREB3蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了具有如下D1)-D4)中任一功能的产品，所述产品含有GmDREB3或所述生物材料：

D1)调控植物耐低氮性；

D2)提高植物耐低氮性；

D3)提高植物在低氮环境中生物量；

D4)提高植物在低氮环境中氮吸收能力。

所述产品可由GmDREB3或所述生物材料组成，也可由GmDREB3或所述生物材料以及具有相同功能的物质组成。

本发明中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物，如小麦；

M3)豆科植物，如大豆。

所述氮吸收能力为NO₃ ^-的吸收能力。

本发明中，所述植物耐低氮胁迫可体现在低氮环境中植物的硝态氮含量增加、氮吸收能力增加和/或生物量增加上。

本发明中，所述低氮是指植物生长环境中氮含量低于同种植物正常生长环境中氮含量的情况。

在本发明的一个实施例中，所述植物为小麦，所述高氮环境中NO₃ ^-的浓度为3mM，所述低氮环境中NO₃ ^-的浓度为0.3mM。

在本发明的另一个实施例中，所述植物为小麦，所述高氮环境中氮含量为92mg/Kg土壤，所述低氮环境中氮含量为75mg/Kg土壤。所述高氮环境中还可按如下方式施肥：底肥施用氮22.5克/平米(以市面上实际尿素换算)、磷7.5克/平米(以市面上实际过磷酸钙换算)，在拔节期在补充氮9.0克/平米(以尿素换算)。所述低氮环境还可按如下方式施肥：施用氮22.5克/平米(以市面上实际尿素换算)，磷7.5克/平米(市面上实际过磷酸钙换算)。

实验证明，向植物中导入本发明GmDREB3基因的表达盒使植物中表达GmDREB3蛋白质后，植物的耐低氮能力增强，表现为地上部干重、鲜重以及根的鲜重、干重、根长、根表面积、根体积、幼苗地上部氮含量均显著增加，以及产量的增加。说明，本发明的GmDREB3及其编码基因可以调控植物的耐低氮性，可用于培育耐低氮植物。

附图说明

图1为温室低氮胁迫试验植株表型。c-j均为15个单株的平均值，g是单株总根长的平均值，h为单株根表面积的平均值，j为单株根体积的平均值，k地上部鲜样的氮浓度。相同小写字母表示在同一培养条件下的不同植株的同一指标间无显著差异，不同小写字母表示在同一培养条件下的不同植株的同一指标间有显著差异。

图2为非损伤微测技术检测小麦根部NO₃ ^-流。

图3为低硝酸盐(LN)处理下的根部NO₃ ^-流。G274和鉴56为转基因植株。石4185和济麦22为受体植物。(a)为10min内动态变化，(b)为10min内的平均值。

图4为转基因品系在田间的耐低氮表型及产量表现。低氮表示低氮试验地，高氮表示高氮养分试验地。a-f为成熟植株表型。图g-j中，相同小写字母表示在同一年的不同植株的同一指标间无显著差异，不同小写字母表示在同一年的不同植株的同一指标间有显著差异。

图5为转基因品系农艺性状及生理生化特性。相同小写字母表示在同种试验地中不同植株的同一指标间无显著差异，不同小写字母表示在同种试验地中不同植株的同一指标间有显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的济麦22(李豪圣；刘建军；宋建民；刘爱峰；程敦公；赵振东，麦类作物学报,2007,Vol.27(4),p.744)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的石4185《中国农业信息》2004年第10期26-26页)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、植物脱水应答元件编码蛋白在耐低氮环境中的应用

本实施例提供了一个来源于大豆品种铁丰8号的植物脱水应答元件蛋白(其名称为GmDREB3)，氨基酸序列为序列表中序列1，其在铁丰8号中由序列表中序列2所示的DNA片段(记为GmDREB3基因)编码。

将生长14天左右的铁丰8号大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中处理12小时，提取大豆总RNA并进行反转录，克隆得到序列2所示的DNA片段。

一、转基因植株的构建

1、载体构建

将pBluescript SK(北京华越洋生物，货号VECT4780)的SacI和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的GmDREB3基因，得到重组载体，将该重组载体记为pSHGmDREB3环形质粒。

将pSH GmDREB3环形质粒通过SpeI和KpnI进行双酶切，回收含有启动子(玉米Ubiqutin启动子，Ubi)，目标基因(GmDREB3基因，His+GmDREB3，其中His为组氨酸蛋白标签)和终止子(Nos终止子)的线性最小表达框，该表达框能表达GmDREB3与His标签的融合蛋白质。

2、转基因植株的构建

分别以石4185和济麦22作为受体植物，采用基因枪转化法利用线性最小表达框构建转基因植株，以石4185作为受体得到了阳性转基因植株(G257、G274、G120)，以济麦22作为受体得到了阳性转基因植株(鉴25、鉴56、鉴211)。具体方法如下：

取授粉后12-14天受体植物未成熟胚(幼胚)，将幼胚于70％(百分比)乙醇水溶液中浸泡1分钟，然后用10％的次氯酸钠消毒15分钟，经无菌水3-5次冲洗后，超净台上取出幼胚，接种于SD2培养基上诱导幼胚愈伤组织7天，然后将诱导的愈伤组织转到高渗培养基上高渗处理4－6小时，高渗处理后愈伤组织利用线性最小表达框进行基因枪轰击，轰击后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养16－18小时，培养结束后将愈伤组织转到SD2培养基上暗培养两星期，接着将愈伤组织放到含有2－3毫克/升的除草剂Bialaphos的培养基上进行愈伤组织筛选、分化和壮苗，最后，将再生植株进行移栽，通过PCR鉴定得到阳性转基因株系。其中，SD2培养基由溶剂和溶质组成，pH为5.8，溶剂为水，各溶质及浓度如下：

大量元素：NH₄NO₃，1650mg/L；KNO₃，1900mg/L；CaCl₂·2H₂O，440mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L；

微量元素：KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

铁盐：FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；Na₂-EDTA·2H₂O，37.3mg/L；

有机物质：维生素B1，1mg/L；天冬酰胺，150mg/L；2,4-D，2mg/L；

蔗糖，30g/L；

琼脂，0.6％(质量百分比)。

高渗培养基：为向SD2培养基中加入甘露醇和山梨醇得到的培养基，甘露醇和山梨醇在该培养基中的浓度均为0.2M。

PCR鉴定所用引物为GmDREB3引物(GmDREB3F：5′-GAGCATAGCGATTCCAAGTACT-3′；GmDREB3R：5′-GTAATCGGATGCGTAACCACT-3′)。

RT-PCR分析：对上述阳性转基因株系进行RT-PCR分析，结果显示GmDREB3在阳性转基因株系中均正常转录表达，且表达水平均显著高于受体植物。所用引物为GmDREB3引物。内参为actin，内参引物为：ActinF：5′-GAAATCACAGCACTTGCACC-3′；ActinR：5′-AAGCCTTTGATCTTGAGAGC-3′。

ELISA分析：采用GmDREB3的特异性抗体(利用序列表中序列1所示的蛋白质作为抗原免疫小鼠制备得到的多克隆抗体，由北京华大蛋白质研发中心有限公司制备)检测上述阳性转基因株系茎，叶，籽粒中GmDREB3蛋白的表达，结果显示上述阳性转基因株系中GmDREB3蛋白均得到表达，叶和籽粒中GmDREB3的表达量高于茎中GmDREB3的表达量。

二、转基因植株的表型鉴定

1、温室低氮胁迫试验

待测植物：济麦22、鉴25、鉴56、鉴211；石4185、G257、G274、G120。

将发芽一周的各待测植物均分为两组，一组(实验组，高氮，HN)移入正常营养液中，另一组(对照组，LN)移入低氮营养液中，在相同培养条件下进行培养，每组三个重复。培养条件20℃，光照16h光照/8h黑暗。

1.1表型检测

培养三周后调查所有处理和重复的幼苗农艺性状(地上部鲜重、干重，根鲜重、干重)，并进行根系扫描(单株总根长，单株根表面积、平均根直径、单株根体积)，氮含量利用苏州科铭生物技术公司的植物氮含量测定试剂盒按照说明书进行测定。

低氮营养液各溶质及浓度见表1，余量为水。正常(高氮)营养液各溶质及浓度见表2，余量为水。

表1、低氮营养液各溶质及浓度

表2、正常(高氮)营养液配置各溶质及浓度

在正常培养(HN)条件下，与对照石4185相比，培养3周后的各转基因植株(G257、G274、G120)地上部和地下部农艺性状及氮含量均无显著差异(图1)。在低氮培养(LN)下，与石4185相比，各转基因植株(G257、G274、G120)的地上部干重、鲜重以及根的鲜重、干重、根长、根表面积、根体积、幼苗地上部氮含量均显著增加(图1)。说明，转基因植株具有很好的耐低氮特性。

1.3非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technology,NMT)测定根部NO₃ ^-流

委托北京旭月科技有限公司进行根部NO₃ ^-流测定，正常Hoagland营养液培养转基因G274和鉴56、对照植株石4185和济麦22幼苗3周后，低氮营养液中平衡2天进行根部NO₃ ^-流测定(图2)。检测位点在成熟区距根尖1500μm；测试液成分：0.1mM NH₄NO₃,0.1mM KCl,0.1mMCaCl₂,0.3mM MES,pH 6.0，余量为水；平衡时间：10min；重复6次。

转基因植株在低氮处理下10min内一直保持NO₃ ^-的吸收，而对照植株基本保持不吸收状态，10min平均值转基因植株的吸收值显著高于对照植物(图3)，说明转基因植株在低氮环境中的N吸收能力明显增加，转基因植株具有明显的耐低氮特性。

2、田间低氮胁迫试验

待测植物：鉴25、鉴56、鉴211、对照植株济麦22。

在北京地区低氮试验地和正常养分试验地，低氮试验地根据北京市土壤养分指标评定规则，播种前测得低氮试验地中氮含量为75mg/Kg土壤，属于中等缺氮水平，正常养分试验地中氮含量为92mg/Kg土壤，属于高氮水平。播种前施肥情况如下：

正常养分试验地：底肥施用氮22.5克/平米(以市面上实际尿素换算)、磷7.5克/平米(以市面上实际过磷酸钙换算)，在拔节期在补充氮9.0克/平米(以尿素换算)；

低氮试验地：施用氮22.5克/平米(以市面上实际尿素换算)，磷7.5克/平米(市面上实际过磷酸钙换算)。

每个小区一种植物，小区面积1.5×4m²，每个材料重复三次，灌水及田间管理按当时正常管理水平进行。

收获期每小区选20株单株进行株高、穗粒数及氮含量测定。

氮含量测定：

样品处理：

(1)成熟期每个重复小区选取均匀样段0.5m，单独收获地上部及根系(0-20cm)，每个样段选取长势一致的6个单株收获籽粒和处理干净的根系在烘箱85℃烘箱烘至恒重，用DF-300小型高速粉碎机进行粉碎。

(2)精确称取0.5000g样品置于50ml消煮管底部，加入少量蒸馏水润湿粉末样品，加入5mL浓H₂SO₄，摇匀放置过夜，以蒸馏水+浓H₂SO₄作为空白对照；

(3)在通风橱中用AIM Lab的AIM600Digestion System和配套的消煮炉进行消煮。180℃恒温1h，期间不定时摇匀；

(4)1h后升温至360℃，直至消煮液停止沸腾呈棕黑色，且冒白烟即样品已完全溶解；

(5)取出消煮管2～3min后，加入10～20滴H₂O₂，继续放置360℃消煮；

(6)停止沸腾冒白烟后，重复步骤4,5直至试管内呈无色澄清状态(根、茎、叶的最终消煮液稍微呈乳黄色)静置冷却至室温；

(7)定容。加蒸馏水至刻度线下1cm左右，待浓H₂SO₄遇水放热结束，准确定容，并颠倒混匀。

(8)静置吸取0.5mL移至含有4.5mL 4％硫酸的10mL试管中，混匀待测

样品测定：全氮测定使用了全自动连续流动分析仪，具体测定流程由中国农业科学院作物科学研究所公共检测中心进行(开放实验室)。

单株含氮量(mg/株)＝测定浓度(mg/L)×0.5ml/消煮w(g)

结果如图4所示。低氮试验地中，转基因小麦表现长势旺盛，叶片鲜绿，而对照济麦22叶片偏黄，明显的植株瘦弱，肥力不足；正常养分试验地中转基因植株和对照济麦22的生长状况无明显差异。在灌浆期低氮条件下对照济麦22表现明显的叶片发黄穗数较少，而转基因植株叶片持绿，穗多，灌浆后期差异更加明显，对照济麦22提前进入衰老，而转基因植株旗叶还保持一定的功能。收获期考察相关农艺性状发现，转基因植株2016-2017两年的田间试验中穗数、粒数、千粒重在低氮条件下均显著高于对照济麦22，所有转基因植株籽粒产量显著高于对照济麦22(表3)，增加幅度6.33％-22.53％。对各时期(成熟期)株高进行测量结果发现，与转基因植株相比，低氮试验地下对照济麦22株高显著降低。对成熟的籽粒和根系氮含量的测定，结果发现转基因植株的籽粒氮含量显著高于对照济麦22，转基因植株的根系氮浓度显著高于对照济麦22。对灌浆期光合生理指标测定发现转基因植株SPAD值在低氮下显著低于济麦22，一天的Fv/Fm测定发现在上午9点及下午15点左右转基因植株荧光动力学参数均高于非转基因对照济麦22(图5)。以上结果充分说明GmDREB3基因参与低氮胁迫的反应，提高了转基因植株在低氮环境中的氮吸收能力，并增加籽粒产量。

表3、2016-2017两年平均产量(籽粒产量，单位：吨/公顷)

表3中，“—”表示未测定该数据；a,b代表显著性差异，同一列中标有不同字母间的数据具有显著差异。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 植物脱水应答元件编码蛋白及其编码基因在耐低氮胁迫中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 198

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max Linn. Merr.)

<400> 1

Met Ala Lys Pro Ser Ser Glu Lys Pro Glu Glu His Ser Asp Ser Lys

1 5 10 15

Tyr Tyr Lys Gly Val Arg Lys Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu

20 25 30

Ile Arg Leu Pro Asn Ser Arg Gln Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Asp

35 40 45

Thr Pro Glu Lys Ala Ala Arg Ala Phe Asp Ala Ala Met Phe Cys Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Asn Ala Lys Phe Asn Phe Pro Asp Asn Pro Pro Asp Ile

65 70 75 80

Ala Gly Gly Thr Ser Met Thr Pro Ser Gln Ile Gln Ile Ala Ala Ala

85 90 95

Gln Phe Ala Asn Ala Gly Pro His Glu Gly His Ser Gly Arg Pro Glu

100 105 110

His Pro Pro Met Glu Ser Pro Ser Pro Ser Val Ser Glu Gly Thr Ile

115 120 125

Gln Thr Asp Ser Asp Val Pro Thr Leu Asn Gly Ser Val Thr Asp Leu

130 135 140

Phe Thr Pro Val Gly Ser Ser Gly Tyr Ala Ser Asp Tyr Gly Ile Phe

145 150 155 160

Pro Gly Phe Asp Asp Phe Ser Gly Asp Phe Tyr Val Pro Glu Met Pro

165 170 175

Asn Val Asn Tyr Gly Glu Glu Asn Gly Glu Gly Phe Ile Val Asp Glu

180 185 190

Ser Phe Leu Trp Asn Phe

195

<210> 2

<211> 597

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max Linn. Merr.)

<400> 2

atggcgaaac ccagcagcga aaagccagag gagcatagcg attccaagta ctacaaaggg 60

gtccgaaaga gaaaatgggg caaatgggta tccgaaataa gactacccaa cagccgtcag 120

aggatttggt tgggatccta cgacaccccc gagaaggccg cgcgtgcctt cgacgcggca 180

atgttctgct tacgtggccg caacgccaag tttaacttcc ccgacaaccc acccgacatc 240

gccggcggaa cgtccatgac gccgtcgcag attcagatcg ccgccgcaca attcgccaac 300

gcggggcccc acgagggaca ttcgggccga cccgaacatc ctcccatgga atctccatcg 360

ccttctgttt cggaagggac catccaaacg gacagtgacg tccccactct taacggttca 420

gtaacggatt tgttcacgcc cgttgggtcg agtggttacg catccgatta cgggattttc 480

ccgggctttg atgatttcag tggcgatttt tatgtgccgg aaatgccgaa cgttaattat 540

ggagaagaaa acggggaagg gttcatagtt gatgaatctt tcttgtggaa tttttga 597

Claims

1.植物脱水应答元件蛋白的下述任一应用：

X1、在调控植物耐低氮胁迫中的应用；

X2、在制备调控植物耐低氮胁迫产品中的应用；

X3、在提高植物耐低氮胁迫性中的应用；

X4、在制备提高植物耐低氮胁迫性产品中的应用；

X5、在提高植物在低氮环境中的氮吸收能力中的应用；

X7、在提高植物在低氮环境中的生物量中的应用；

X8、在制备提高植物在低氮环境中的生物量产品中的应用；

X9、在培育耐低氮胁迫植物中的应用；

X10、在制备耐低氮胁迫植物产品中的应用；

所述植物脱水应答元件蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白相关的生物材料的下述任一应用：

X1、在调控植物耐低氮胁迫中的应用；

X2、在制备调控植物耐低氮胁迫产品中的应用；

X3、在提高植物耐低氮胁迫性中的应用；

X4、在制备提高植物耐低氮胁迫性产品中的应用；

X5、在提高植物在低氮环境中的氮吸收能力中的应用；

X7、在提高植物在低氮环境中的生物量中的应用；

X8、在制备提高植物在低氮环境中的生物量产品中的应用；

X9、在培育耐低氮胁迫植物中的应用；

X10、在制备耐低氮胁迫植物产品中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的cDNA分子或DNA分子。

4.下述任一方法：

Y1)培育耐低氮植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的活性，得到耐低氮目的植物；

Y2)提高植物耐低氮胁迫性的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比耐低氮胁迫性增强；

Y3)提高植物在低氮环境中生物量的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比产量增加；

Y4)提高植物在低氮环境中的氮吸收能力的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的活性，得到目的植物，所述目的植物与所述受体植物相比氮吸收能力增加。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述植物有穗，所述生物量为籽粒产量、籽粒数、穗数、千粒重、植株重量和/或植株大小；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：Y1)、Y2)、Y3)和Y4)所述方法均通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。

8.具有如下D1)-D4)中任一功能的产品，含有权利要求1中所述植物脱水应答元件蛋白或权利要求2或3中所述生物材料：

D1)调控植物耐低氮性；

D2)提高植物耐低氮性；

D3)提高植物在低氮环境中生物量；

D4)提高植物在低氮环境中氮吸收能力。

9.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-7中任一所述的方法，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)豆科植物。

10.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-7中任一所述的方法，或权利要求8所述的产品，或权利要求9所述的应用、方法或产品，其特征在于：所述氮吸收能力为NO₃ ^-的吸收能力。