CN1786028A

CN1786028A - 植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN1786028A
Application number: CN 200410096907
Authority: CN
Inventors: 陈明; 马有志; 李连城; 王巧燕; 徐兆师; 程宪国
Original assignee: INST OF CROP BREEDING AND CULT
Current assignee: INST OF CROP BREEDING AND CULT
Priority date: 2004-12-06
Filing date: 2004-12-06
Publication date: 2006-06-14
Anticipated expiration: 2024-12-06
Also published as: CN1786028B

Abstract

本发明公开了一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用。该结合蛋白为具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质或为将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。其编码基因为序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；或编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该蛋白及其编码基因可用于培育抗逆性提高的植物。

Description

植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫都会影响植物的正常生长和发育。了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，提高植物特别是作物的抗逆性是作物遗传研究和品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。阐明植物对逆境的反应机制，将为植物抗逆的分子育种提供科学的理论基础。研究表明，植物在水分亏缺引起植物损伤之前，就能对干旱作出包括信号转导、基因表达和代谢调节在内的适应性调整并继续生长和发育。基因与环境是调节植物生长发育的两个基本因素，探索环境条件如何调控植物的基因表达，以及环境条件对植物体内的生理功能变化的影响已成为植物遗传育种学家的最大挑战，这正是信号转导(Signal transduction)机制研究的热点问题。

植物的许多基因已被证明受非生物逆境胁迫的诱导，这些基因的表达产物有的在抗逆性中直接发挥功能，有的负责调控下游基因的表达和逆境信号的传导。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻和油菜中均有报道，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对逆境应答基因rd29A基因的启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺势作用元件，即脱水应答元件(DRE，dehydration-responsive element)。此后，发现许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件。Liu等人首次利用酵母单杂交系统，从拟南芥的cDNA表达文库中克隆到二种编码与DRE元件结合的转录因子脱水应答元件结合蛋白(DREB，dehydration-responsive element binding protein)cDNA，分别命名为DREB1A，DREB2A。它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸。在DREB类蛋白中决定DNA结合的特异性方面，V14的作用明显要比E19重要；而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特异结合DRE/CRT顺式元件，ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α-螺旋，该α-螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。

目前，在许多植物中都发现这种含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关。刘强等认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。Kasuga等的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达，转基因植株的抗逆性大大增强。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的综合抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

研究人员最早发现，在干旱、高盐及低温等逆境胁迫下，体内脱落酸(ABA)大量积累，许多与逆境胁迫耐性有关的基因是受ABA诱导的。在转录水平上研究ABA诱导基因表达调控，发现在功能基因的启动子区域内都有一个相当保守的序列(PyACGTGGC)，作为ABA应答元件(ABA responsive element，ABRE)。与ABRE特异结合的反式作用因子也相继被克隆。此外，还发现另外一些顺式作用元件参与ABA的应答反应，如在大麦HVA22基因中鉴定的偶联元件(Coupling element，CE)CE1，其核心序列是TGCCACCGG。

与此同时，研究也发现许多与逆境耐性有关的基因的表达与ABA无关，其中，有些基因受干旱和低温同时诱导，有些基因只对干旱或低温有应答反应。说明植物体内存在多条信号传递途径，负责逆境胁迫信号的感应、传递和基因表达的调控。Yamaguchi-Shinozaki等利用示差筛选法从干旱处理的拟南芥中，克隆了一批受干旱诱导的基因，其中，rd29基因编码与LEA蛋白非常相似的蛋白，它对干旱、高盐及低温胁迫均可产生应答反应，对其启动子的研究发现有二个不依赖于ABRE的DRE顺式作用元件(dehydration responsive element，DRE)。其核心序列是TACCGACAT。目前已分离克隆的与逆境耐性有关的基因，如rd17，kin1，cor6.6等基因的启动子区域内也都发现了DRE元件或DRE核心序列元件，此外，在低温应答元件CRT(C-repeat)、LTRE(Low temperature responsive element)也存在CCGAC保守序列，说明DRE元件普遍存在于逆境胁迫应答基因的启动子中，并对逆境胁迫应答起重要作用。

综合目前的研究结果，植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径：

依赖于ABA的信号传递途径有三条：

1)受干旱、高盐诱导，激活MYB、MYC类转录因子基因，调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因。

2)受干旱、高盐诱导，激活ABF/AREB类转录因子基因，调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因。

3)受干旱、高盐诱导，激活CBF4，DREB1类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

不依赖于ABA的信号传递途径有三条：

1)受干旱、高盐诱导，激活DREB2类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

2)受低温诱导，激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

3)受干旱、高盐或乙烯诱导，激活EREB类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。

目前，在水稻、玉米等主要农作物中已有DREB转录因子基因克隆的报道，从大豆中克隆DREB转录因子基因还未见报道。

DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝胶阻滞(gelretardation)试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。基本原理为：在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可证实特异性DNA与相应蛋白结合。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物脱水应答元件结合蛋白，名称为GmDREB2，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由199个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第22位-25位氨基酸残基为核定位序列，自氨基端第17位-74位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。

上述植物脱水应答元件结合蛋白编码基因(GmDREB2)，也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：2由597个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第597位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第49到第222位碱基为AP2/EREBP保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸，自5’端第88到第90位碱基为缬氨酸的编码序列，自5’端第103到第105位碱基为亮氨酸的编码序列。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增GmDREB2中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

Northern blot实验证明GmDREB2基因受高盐、冷胁迫诱导表达，而不受干旱、ABA诱导表达；EMSA(凝胶阻滞实验)证明GmDREB2在体外与DRE具有结合特异性，但结合特异性不强；酵母转录激活系统证明了GmDREB2的体内结合特异性和激活功能。本发明的GmDREB2基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是大豆)中发挥重要的作用。

附图说明

图1A-图1D为GmDREB2受胁迫诱导表达的情况

图2为GmDREB2的EMSA

具体实施方式

实施例1、GmDREB2基因的克隆

将生长14天左右的铁丰8号(抗盐碱大豆品种)大豆幼苗的根系置于是200mMNaCl溶液中处理12小时，采用Trizol法提取大豆总RNA，利用3’RACE System forRapid Amplification of cDNA Ends Kit(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)按照其说明书的步骤操作获得GmDREB2基因的全长序列。其中，3’RACE的特异引物为：5’CAG CCG TCA GAG GAT TTG GTT G 3’。GmDREB2基因具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列1的自氨基端第22位-25位氨基酸残基为核定位序列，该核定位序列的编码序列为序列2的自5′端第64位碱基-75位碱基；序列1的自氨基端第17位-74位氨基酸残基为AP2/EREBP结构域，自氨基端第30位(AP2/EREBP保守结构域中的第14位)为缬氨酸，自氨基端第35位(AP2/EREBP保守结构域中的第19位)为亮氨酸。该AP2/EREBP结构域的编码序列为序列2的自5′端第49位碱基-222位碱基。GmDREB2是一个DREB蛋白。

GmDREB2基因的序列在Genabnk上进行比对，未发现与GmDREB2基因同源的大豆DREB基因，证明GmDREB2基因是一个新的基因。

实施例2、Northern bolt检测GmDREB2基因的表达特性

1、植物材料的准备：

取14天左右的大豆幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理：将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理：将大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)ABA处理：给大豆幼苗喷洒200μM的ABA溶液，光照培养0.5小时、1小时、3小时、17小时和72小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)冷害处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养0.5小时、1小时、3小时、17小时和72小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照。

采用Trizol法分别提取上述植物材料的大豆总RNA。

2、转膜

(1)电泳及转膜用具的处理：0.1N NaOH/1mM EDTA浸泡1h，用清水冲洗干净备用；

(2)准备甲醛变性凝胶：在一个三角烧瓶中加入10ml 10×MOPs，73ml DEPC处理的水和1g琼脂糖，加热融化；当冷却到55℃左右时加入17ml甲醛，混匀，倒入RNA专用的胶槽中；

(3)在DEPC处理的0.5ml离心管中加入：

RNA+DEPC处理水 4μl(大豆总RNA约为30μg)

甲酰胺 12.5μl

甲醛 4.0μl

10×MOPs 2.5μl

溴酚兰(10×) 2.5μl

(4)样品在65℃水浴处理5min，然后点样，开始电泳，缓冲液为1×MOPs。当溴酚兰到达凝胶1/3-1/2位置时，停止电泳；

(5)用蒸馏水冲洗凝胶，用20×SSC转膜。将凝胶翻转后放在滤纸桥上，放上一张与凝胶大小相当的尼龙膜(Hybond-N⁺，Amarsharm)，赶除气泡，在膜上放3层滤纸，与尼龙膜大小相同，赶除气泡，将凝胶周围用胶片封好，放上大小相当的吸水纸，压上约500g的重物，转膜24h，其间更换吸水纸。转膜完成后，用2×SSC洗膜10min，用滤纸吸干，保鲜膜包好，紫外灯照射3min，4℃存放至杂交；

3、探针的制备

在GmDREB2基因的3’设计特异引物DREB2F和DREB2R(避开AP2/EREBP区域)，以克隆的GmDREB2基因为模板进行PCR扩增，程序及体系如下：

引物序列：GmDREB2F：5’TAT CCC GGG ATG GCG AAA CCC AGC AGC GA

GmDREB2R：5’GCA GAG CTC GCG GCC GCT CAA AAA TTC CAC AAG AAA

GA 3’

反应体系(50μl)：

模板(60ng/ul) 0.5μl

dNTP(每种10mM) 1μl

引物(各25μM) 1μl

10×缓冲液 5μl

ddh₂O 42.1μl

Taq(5U/μl) 0.4μl

其中，10×缓冲液：来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.：DR100A)。

扩增条件(PTC-200)：

取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描，在600bp左右的位置处有一条亮带。

4、探针的回收

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化探针。

5、探针标记

探针标记为随机六聚体引物法，每1-2张膜加入步骤4的探针DNA约50-100ng和DNA分子量标记，加水至14.5μl，100℃煮沸变性5min后立即置于冰浴中5min，瞬时离心，然后加入下列成分，终体积25μl，于37℃反应5h以上。

5×Oligo缓冲液 5μl

Klenow Fragment(5U/μl) 0.7μl

10×缓冲液 2.5ul

BSA(10mg/ml) 1μl

α-³²P-dCTP(10mCi/ml) 1.5μl

附：1ml 5×Oligo缓冲液中含有：

160μl H₂O

250μl 1M Tris-HCl

25μl 1M MgCl₂

5μl 1M巯基乙醇

500μl 2M HEPES

20μl 100mM dATP

20μl 100mM dGTP

20μl 100mM dTTP

10×缓冲液：来自于Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0(TaKaRa公司，Code No.：D6045)

6、预杂交和杂交反应

根据要杂交的膜的数量配制预杂交液，每10ml预杂交液的成分组成如下。

ddH₂O 6.5ml

5×HSB 2ml

DenHardt’s III 1ml

*ssDNA(10mg/ml) 0.5ml

*ssDNA为鲑鱼精DNA(Sigma)加入之前需变性：煮沸10min后立即放冰上10min。

附：5×HSB(pH6.8) 分子量(MW) g/200ml

NaCl(3M) 58.44 35.064

PIPES(0.1M) 302.4 6.048

EDTA(20mM) 372.24 1.488Denhardt’sIII g/100ml

2％ Gelatin 2

2％ Ficoll-400 2

2％ PVP-360 2

10％ SDS 10

5％ Na₄P₂O·10H₂O 5

将预杂交液混匀，于65℃预热至澄清后放入尼龙膜，65℃预杂交5-6h(新膜)；探针标记完后，加入等体积的0.4N NaOH溶液，混匀后于室温静置10min使探针变性，然后加入到预杂交液中，65℃杂交过夜；

7、洗脱

将杂交完的膜从杂交管中取出放入洗脱盒中，加入少量洗液I(2×SSC/0.1％SDS)漂洗除去过量杂交液，然后用洗液I于45℃洗两次，每次20min；再用洗液II(0.2×SSC/0.2％SDS)于45℃洗两次，每次15min。洗液I洗过后，检测杂交信号与背景情况，再决定是否继续洗脱。用滤纸吸干洗好的膜，保鲜膜包好(注意除去气泡)；

8、放射自显影

在X-射线摄影暗盒中，将杂交膜置于增感屏上，在暗室中将X-光片放在杂交膜上，再放上另一张增感屏，压紧X-射线摄影暗盒，-70℃冰箱曝光7-15天。

Northern blot分析结果如图1A-图1D所示，表明在干旱条件下GmDREB2基因表达量减少；受高盐(200mM NaCl)胁迫的诱导表达；冷胁迫1小时后GmDREB2基因表达达到高峰，GmDREB2基因不受ABA(200uM)胁迫诱导表达。说明该基因受高盐、冷胁迫诱导，不受ABA诱导。

实施例3、EMSA检测GmDREB2的体外结合特异性

1、GmDREB2基因的原核表达

将GmDREB2基因的全长序列插入原核表达载体pGEX-4T-1(购自AmershamPharmacia Biotech公司)的多克隆位点EcoRI和XhoI中，由于pGEX-4T-1的多克隆位点前面有GST(谷胱苷肽)基因，这样GmDREB2与GST蛋白就形成了融合蛋白，将构建好的表达载体转化受体大肠杆菌BL21，37℃培养6小时后，向培养基中添加IPTG至终浓度为0.5mM诱导表达12h，收集菌体，超声裂解后于4℃、12000rpm离心20分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳，结果检测到50.8KD的条带，表明融合蛋白(GmDREB2-GST)已表达。

使用MicroSpin GST Purification Module Kit(Amersham，product code：27-4570-03)按说明书的步骤纯化GmDREB2-GST融合蛋白。

2、DRE探针的标记

根据GmDREB2基因序列，合成如下DRE探针序列：(以下探针序列中带下划线的碱基指DRE的核心碱基)

DRE1： 5’＞ATT TCA TGG CCG ACC TGC TTT CAT GG C CGA CCT GCT T＜3’

DRE2： 5’＞AAG CAG GTC GGC CAT GAA AGC AG G TCG GCC ATG AAA T＜3’

DREm1(1)：5’＞ATT TCA TGG AAG ACC TGC TTT CAT GG A AGA CCT GCT T＜3’

DREm1(2)：5’＞AAG CAG GTC TTC CAT GAA AGC AG G TCT TCC ATG AAA T＜3’

DREm2(1)：5’＞ATT TCA TGG CCT CAC TGC TTT CAT GG C CTC ACT GCT T＜3’

DREm2(2)：5’＞AAG CAG TGA GGC CAT GAA AGC AG T GAG GCC ATG AAA T＜3’

DREm3(1)：5’＞ATT TCA TGG TTT TTC TGC TTT CAT GG T TTT TCT GCT T＜3’

DREm3(2)：5’＞AAG CAG AAA AAC CAT GAA AGC AG A AAA ACC ATG AAA T＜3’

其中，DRE1和DRE2为野生型的DRE探针，DREm1、DREm2、DREm3为各种突变的DRE探针。

使用T4多聚核苷酸激酶(T4-Polynucleotide Kinase，T4-PNK)对DRE探针进行(γ-³²P)dATP标记，标记体系如下：

H₂O 18.6μL

10×T4-PNK缓冲液(Promega) 2.5μL

DRE探针(浓度为1ug/ul) 1μL

T4-PNK(Promega)(5U/μL) 1μL

(γ-³²P)dATP(浓度为10uCi/ul) 2μL

37℃标记30分钟，加入1μL 0.5M EDTA终止反应，65℃ 10分钟灭活酶，4℃备用。

3、标记的DRE探针与纯化的GmDREB2-GST融合蛋白进行结合反应

以GST蛋白为对照。

结合反应体系如下：

5×结合缓冲液 4uL

纯化的GmDREB2-GST融合蛋白(浓度为0.5mg/ml)或GST蛋白(浓度为0.5mg/ml) 10uL

一种标记的DRE探针 2uL

50％甘油 2uL

H₂O 2uL

其中，5×结合缓冲液成分如下：

12.5mM HEPES-KOH(pH7.6)

250mM KCl

2.5mM DTT

2.5mM EDTA。

结合反应在冰上进行30分钟，反应的同时配好的SDS-PAGE胶200V进行1小时的预电泳，结合反应后加入1μL上样缓冲液(0.025％溴酚兰)进行SDS-PAGE电泳，170V电泳1-2小时后卸下电泳板，将胶放到水中，在将胶上的水吸干后压X光片检测GmDREB2-GST融合蛋白与标记的DRE探针的结合特性。结果如图2所示，表明野生型和突变型DRE探针都可以和纯化的GmDREB2-GST融合蛋白结合，但野生型DRE探针与纯化的GmDREB2-GST融合蛋白结合的量明显多于突变型DRE探针与纯化的GmDREB2-GST融合蛋白结合的量，结果证明纯化的GmDREB2-GST融合蛋白与DRE具有结合特异性，但结合特异性不强，GmDREB是DREB类转录因子。图2中，m1为DREm1(1)和DREm1(2)探针，m2为DREm2(1)和DREm2(2)探针，m3为DREm3(1)和DREm3(2)探针，pro为DRE1和DRE2探针，prob为不加蛋白的自由探针(DRE1和DRE2)。

实施例4、GmDREB2的体内结合特异性和激活特性

一、将GmDREB2基因构建到表达载体YEP-GAP上

1、获得GmDREB2基因编码氨基酸部分的全序列

根据已克隆的GmDREB2基因的序列设计引物，引物末端分别加EcoRI和XhoI酶切位点，以实施例1中盐处理的铁丰8号的基因组DNA为模板，PCR扩增获得编码氨基酸部分的全序列，程序及体系如下：

引物序列：

GmDREB2F：5’TAT CCC GGG ATG GCG AAA CCC AGC AGC GA

GmDREB2R：5’GCA GAG CTC GCG GCC GCT CAA AAA TTC CAC AAG

AAA GA 3’

反应体系(50μl)：

模板(60ng/ul) 0.5μl

dNTP(每种10mM) 1μl

引物(每种25μM) 1μl

10×缓冲液 5μl

ddh₂O 42.1μl

Taq(5U/μl) 0.4μl

扩增条件(PTC-200)：

取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描，结果在600bp左右的位置处有一条亮带。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化PCR产物。

2、将GmDREB2基因构建到表达载体YEP-GAP上

将步骤1中纯化的PCR产物和表达载体YEP-GAP(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分别酶切4-6hr。采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化酶切产物。将纯化的酶切PCR产物和酶切载体YEP-GAP连接4-8hr，取0.5μl连接产物，电击转化JM109菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，测序分析序列是否正确，得到含有GmDREB2基因的重组表达载体YEP-GAP-GmDREB2。

二、GmDREB2的体内结合特异性和激活特性的验证

1、酵母报道子的构建

将含有4个DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-BRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列：TACCGACAT)分别构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子和pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，分别得到重组载体pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I内切酶分别将pHis-1-DRE和pLacZi-DRE载体切成线状。先将线状pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His^-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-培养基上，选择获得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子；将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的双重酵母报道子构建方法，再构建一个含4个MDRE盒的突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)；

(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时至OD600＝0.5±0.1，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；

(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg表达载体YEP-GAP-GmDREB2、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；

(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；

(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0，15mmol/L 3-AT的SD/Hi s^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养步骤1构建的正常双重酵母报道子，另一半培养步骤1构建的突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子GmDREB2能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子(包括Pmin_HIS3启动子和P_CYCI启动子)，促使报道基因表达。从而证明了GmDREB2的体内结合特异性和激活功能。

三、药剂配制：

(1)YPD液体培养基

细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L

细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的葡萄糖，使其终浓度为20g/L。

(2)SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基

不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L

营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml

琼脂粉(Bacteriological agar) 20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

(3)营养缺陷型混合物(Drop-out mix)：(10X)

L-Isoleucine(异亮氨酸) 300mg/L

L-Valine(缬氨酸) 1500mg/L

L-Adenine(腺嘌呤) 200mg/L

L-Arginine(精氨酸) 200mg/L

L-Histidine Hcl monohydrate(组氨酸) 200mg/L

L-Leucine(亮氨酸) 1000mg/L

L-Lysine Hcl(赖氨酸) 300mg/L

L-Methionine(甲硫氨酸) 200mg/L

L-Phenylalanine(苯丙氨酸) 500mg/L

L-Threonine(苏氨酸) 2000mg/L

L-Tyrosine(酪氨酸) 300mg/L

(4)1×PEG/LiAc：

50％(w/v)PEG3350 8ml

10×TE buffer 1ml

10×LiAc 1ml

(5)10×TE Buffer：

100mM Tris-Hcl

10mM EDTA，pH＝7.5

121℃高压灭菌，室温保存。

(6)1×TE/LiAc：

10×TE buffer 1ml

10×LiAc 1ml

ddH₂O 8ml

(7)Z Buffer：

Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g/L

NaH₂PO₄·H₂O 5.5g/L

KCl 0.75g/L

MgSO₄·7H₂O 0.246g/L

调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

(8)X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：

用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。

(9)含有X-gal的Z buffer缓冲液100ml(Z buffer with X-gal)，注意现用现配：

Z buffer 98ml

β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol) 0.27ml

X-gal储存液(X-gal stock solution) 1.67ml

序列表

<160>2

<210>1

<211>198

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

Met Ala Lys Pro Ser Ser Glu Lys Pro Glu Glu His Ser Asp Ser Lys

1 5 10 15

Tyr Tyr Lys Gly Val Arg Lys Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu

20 25 30

Ile Arg Leu Pro Asn Ser Arg Gln Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Asp

35 40 45

Thr Pro Glu Lys Ala Ala Arg Ala Phe Asp Ala Ala Met Phe Cys Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Asn Ala Lys Phe Asn Phe Pro Asp Asn Pro Pro Asp Ile

65 70 75 80

Ala Gly Gly Thr Ser Met Thr Pro Ser Gln Ile Gln Ile Ala Ala Ala

85 90 95

Gln Phe Ala Asn Ala Gly Pro His Glu Gly His Ser Gly Arg Pro Glu

100 105 110

His Pro Pro Met Glu Ser Pro Ser Pro Ser Val Ser Glu Gly Thr Ile

115 120 125

Gln Thr Asp Ser Asp Val Pro Thr Leu Asn Gly Ser Val Thr Asp Leu

130 135 140

Phe Thr Pro Val Gly Ser Ser Gly Tyr Ala Ser Asp Tyr Gly Ile Phe

145 150 155 160

Pro Gly Phe Asp Asp Phe Ser Gly Asp Phe Tyr Val Pro Glu Met Pro

165 170 175

Asn Val Asn Tyr Gly Glu Glu Asn Gly Glu Gly Phe Ile Val Asp Glu

180 185 190

Ser Phe Leu Trp Asn Phe

195

<210>2

<211>597

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2

atggcgaaac ccagcagcga aaagccagag gagcatagcg attccaagta ctacaaaggg 60

gtccgaaaga gaaaatgggg caaatgggta tccgaaataa gactacccaa cagccgtcag 120

aggatttggt tgggatccta cgacaccccc gagaaggccg cgcgtgcctt cgacgcggca 180

atgttctgct tacgtggccg caacgccaag tttaacttcc ccgacaaccc acccgacatc 240

gccggcggaa cgtccatgac gccgtcgcag attcagatcg ccgccgcaca attcgccaac 300

gcggggcccc acgagggaca ttcgggccga cccgaacatc ctcccatgga atctccatcg 360

ccttctgttt cggaagggac catccaaacg gacagtgacg tccccactct taacggttca 420

gtaacggatt tgttcacgcc cgttgggtcg agtggttacg catccgatta cgggattttc 480

ccgggctttg atgatttcag tggcgatttt tatgtgccgg aaatgccgaa cgttaattat 540

ggagaagaaa acggggaagg gttcatagtt gatgaatctt tcttgtggaa tttttga 597

Claims

1、植物脱水应答元件结合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述序列表中SEQ ID №：1的自氨基端第17-74位为AP2/EREBP结构域。

3、编码权利要求1或2所述植物脱水应答元件结合蛋白的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

5、含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的植物表达载体。

6、含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的细胞系。

7、含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的宿主菌。

8、扩增权利要求3或4所述基因中任一片段的引物。

9、权利要求1或2所述的植物脱水应答元件结合蛋白在培育抗逆性提高的植物中的应用。

10、权利要求3或4所述的植物脱水应答元件结合蛋白基因在培育抗逆性提高的植物中的应用。