CN111909928A - 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法 - Google Patents

海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111909928A
CN111909928A CN202010724821.5A CN202010724821A CN111909928A CN 111909928 A CN111909928 A CN 111909928A CN 202010724821 A CN202010724821 A CN 202010724821A CN 111909928 A CN111909928 A CN 111909928A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
kvnac
cloning
kosteletzkya virginica
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010724821.5A
Other languages
English (en)
Inventor
汤晓丽
刘晓华
朱琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ludong University
Original Assignee
Ludong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludong University filed Critical Ludong University
Priority to CN202010724821.5A priority Critical patent/CN111909928A/zh
Publication of CN111909928A publication Critical patent/CN111909928A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法，包括海滨锦葵总RNA的提取、海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析、RT‑PCR的反应，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；选用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY‑Blunt Cloning Vector载体进行连接反应，构建重组克隆载体。本发明简便、有效；从一个新的抗盐物种中实现了基因的分离克隆，成功对其提取了总RNA，并实现其在该植物体的空间表达模式。表达载体的构建为基因功能的研究奠定了基础。

Description

海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法
技术领域
本发明涉及一种基因的克隆方法及其表达载体的构建方法。
背景技术
植物固着生长的特性决定了植物体只能被动的遭受各类非生物胁迫(高温、冷害、冻害、干旱、高盐)对其带来的不利影响。为了抵御外界不良环境的影响，植物在长期的进化过程中也逐渐进化出一系列的生理和分子水平上防御机制。NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，其参与调节了植物体对多种非生物胁迫的应答响应。海滨锦葵是一种由国外引进的新的抗盐物种，目前对于其抗盐能力具体的分子机制研究很少，特别是还未发现对KvNAC基因的相关报道。
植物的NAC转录因子具有N端高度保守的DNA结合结构域(NAC结构域)和复杂多变的C端转录激活结构域。其通过调节下游基因的转录激活或抑制参与植物体对多种生命活动的调节与应答响应。近年来其在拟南芥、水稻、玉米、芒草、苹果等植物中的生物学功能均有报道，在不同的植物体中表现出复杂多样化的生物学功能，而在盐生植物中具体的生物学功能目前还是未知的，因此从抗盐植物海滨锦葵中分离并鉴定新的NAC基因对阐明抗盐植物的耐盐机制和丰富充实耐盐基因资源具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、有效的海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法。
本发明的技术解决方案是：
一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：
(一)海滨锦葵总RNA的提取：
(1)向1.5mL离心管中加入1mL RNAiso Plus RNA提取液；
(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；
(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；
(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；
(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；
(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μL RNase free ddH2O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；
(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析
(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScriptOne-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix进行反转录，获得cDNA；
(2)按照RACE试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；
RACE实验中用到的引物：
NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAA
NAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCC
NAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCC
NAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTCACCTTTG
(3)RT-PCR的反应体系采用25μL体系，各成分和体积如下：
Figure BDA0002601278850000031
PCR反应程序：
预变性：94℃ 5min；
变性：94℃ 30s，
复性50-60℃ 30s，
延伸72℃ 1-2min，从第2步开始循环30次；
后延伸：72℃ 10min；
PCR结束后，电泳观察，获得单一的扩增条带，将含有扩增条带的电泳胶切下，通过胶回收获得纯化的扩增的目的条带，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；
KvNAC基因全长1276bp，其中5`UTR328bp，3`UTR213bp，基因的ORF区为735bp，编码了244个氨基酸，该蛋白的分子量大小为28.26kD，等电点(PI)8.94；蛋白的不稳定系数为55.91，是一个不稳定的蛋白，同时其平均亲水系数为-0.848。
还对海滨锦葵KvNAC基因在不同组织中表达情况进行测定；
提取了海滨锦葵幼苗的根、茎和叶中的总RNA，通过反转录获得cDNA，用荧光定量RT-PCR测定KvNAC基因在锦葵不同组织中的表达情况，KvNAC基因在根、茎、叶中均有表达，表现出一定程度的组成型表达，其中根中的表达最高，是茎段中的3倍，叶片次之；说明其作为转录因子在植物体的各个组织中均通过调节下游靶基因的表达发挥重要作用。
一种海滨锦葵KvNAC基因植物表达载体的构建方法，其特征是：
根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；引物序列如下：
5`端：ATGGCGTTGTACGGTGAAAAG
3`端：CTAATAAAATGGCTTCTGTAGG
选用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY-Blunt Cloning Vector载体进行连接反应，构建重组克隆载体；具体的实验操作流程参照全式金公司的pEASY克隆载体使用说明进行。
本发明简便、有效；从一个新的抗盐物种中实现了基因的分离克隆，成功对其提取了总RNA，并实现其在该植物体的空间表达模式。表达载体的构建为基因功能的研究奠定了基础。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是KvNAC基因的组织表达模式示意图。
图2是KvNAC基因的PCR克隆及电泳凝胶成像示意图。
图3是KvNAC基因植物表达载体的构建流程示意图。
具体实施方式
一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，包括下列步骤：
(一)海滨锦葵总RNA的提取：
实验过程中使用的所有实验用品(1.5mL离心管、各种型号的枪头、ddH2O、研钵和研棒)需采用121℃，50min的高温高压蒸汽灭菌，彻底除去RNase污染。提取过程中所用试剂为RNA提取专用，杜绝RNase的污染。提取试剂保存于冰箱4℃，整个试验的操作过程均在低温条件下进行，减少RNA的降解。
(1)向1.5mL离心管中加入1mL RNAiso Plus RNA提取液；
(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；
(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；
(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；
(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；
(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μL RNase free ddH2O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；
(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析
(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix进行反转录，获得cDNA；
(2)按照RACE试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；
RACE实验中用到的引物：
NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAA
NAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCC
NAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCC
NAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTCACCTTTG
(3)RT-PCR的反应体系采用25μL体系，各成分和体积如下：
Figure BDA0002601278850000071
PCR反应程序：
预变性：94℃ 5min；
变性：94℃ 30s，
复性50-60℃ 30s，
延伸72℃ 1-2min，从第2步开始循环30次；
后延伸：72℃ 10min；
PCR结束后，电泳观察，获得单一的扩增条带，将含有扩增条带的电泳胶切下，通过胶回收获得纯化的扩增的目的条带，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；
KvNAC基因全长1276bp，其中5`UTR328bp，3`UTR213bp，基因的ORF区为735bp，编码了244个氨基酸，该蛋白的分子量大小为28.26kD，等电点(PI)8.94；蛋白的不稳定系数为55.91，是一个不稳定的蛋白，同时其平均亲水系数为-0.848。
KvNAC基因的全长：
ACATGGGGGTTTCAAACCTCAAAGATAAAAGCTCCAAGCAACCAGAGAGAGGACGCAAAGAAGATCAAAACAAAAAGAATTCTAAGTGTTCTTTCAGCTCGAAGAAGCTAGTGAAGAACAACACAAAGAAAAAGAGAGAGCTTTCGATTGTTTTTTTCAGTAGAGAATGAAGGGAGAATTGGAGTTGCCACCGGGTTTCAGATTCCATCCTACGGACGAGGAGTTGGTGAATCATTATTTGTGTAGGAAATGTGCATCTCAGCCTATTGCCGTCCCAATTATTGCTGATATCGATCTCTACAAGTTTGATCCATGGCAGCTTCCAGAAATGGCGTTGTACGGTGAAAAGGAGTGGTATTTCTTCTCACCAAGGGACAGAAAATACCCAAACGGATCTCGGCCGAACCGGGCGGCCGGAACTGGATATTGGAAGGCAACTGGAGCGGACAAGCCTATCAGGAAGCCCAAGACACTGGGAATAAAAAAGGCACTCGTTTTCTACGCCGGCAAAGCCCCGCGCGGTGTCAAAACCAACTGGATCATGCACGAATACCGACTCGCTAATGTCGATAGGTCCCCCGGCAAAAAGAAGAACAACCTGAGGCTTGATGACTGGGTGCTATGCCGGATATACAACAAGAAAGGAAGCATTGAGAAGCATTTCCCAACCGAACAAAAATGGTCGAGTTTCCCAGAAATGGAAGACCAGAAACCCAACATCCTAATGCACGGTCAAAACACGACACCAATTTCCAAACAACAACAACAACAACCTTCGTCGATGATGAACGATGAAGTGTTGCAAACGAATGCTTCAGATTCCGTCCCCATATTACACACGGATTCGAGTTCGTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCTGAAGTCACGTGGGAGAAAGAGGTCCAGAGCCAACCTCTTCAGCTAAGCAACAATGTGCTGGATTTCGGGTTCAATTACATGGATGTGGGGTTCCAAGACGACCCGTTTGCAAGCCAAGTTCAGTACCAGATGGAGCAGTTGTCACCTTTGCAGGACATGTTCATGTACCTACAGAAGCCATTTTATTAGATTTATGTGATTTGATGCACATGTTAAACAACATTTGCATGTGACATTAAATCTTAGGATTCCAACAGTCAATCAATGTTATTTGTCAGATTCATTCAAATGGGAGATTTGGGTAGCAAAAATTGGCGGTGAAATCAGAAATGTTGTGAATACTTAGTAAGATCGAAGGAAATTATGAATATGTAAATGAAATACCATTTTGCAATTCAAGAC；
对应的蛋白氨基酸序列：
MALYGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRAAGTGYWKATGADKPIRKPKTLGIKKALVFYAGKAPRGVKTNWIMHEYRLANVDRSPGKKKNNLRLDDWVLCRIYNKKGSIEKHFPTEQKWSSFPEMEDQKPNILMHGQNTTPISKQQQQQPSSMMNDEVLQTNASDSVPILHTDSSSSEQVLSPEVTWEKEVQSQPLQLSNNVLDFGFNYMDVGFQDDPFASQVQYQMEQLSPLQDMFMYLQKPFY-；
还对海滨锦葵KvNAC基因在不同组织中表达情况进行测定；
提取了海滨锦葵幼苗的根、茎和叶中的总RNA，通过反转录获得cDNA，用荧光定量RT-PCR测定KvNAC基因在锦葵不同组织中的表达情况，KvNAC基因在根、茎、叶中均有表达，表现出一定程度的组成型表达，其中根中的表达最高，是茎段中的3倍，叶片次之；说明其作为转录因子在植物体的各个组织中均通过调节下游靶基因的表达发挥重要作用。
一种海滨锦葵KvNAC基因植物表达载体的构建方法，根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；引物序列如下：
5`端：ATGGCGTTGTACGGTGAAAAG
3`端：CTAATAAAATGGCTTCTGTAGG
选用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY-Blunt Cloning Vector载体进行连接反应，构建重组克隆载体；具体的实验操作流程参照全式金公司的pEASY克隆载体使用说明进行。

Claims (3)

1.一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：
(一)海滨锦葵总RNA的提取：
(1)向1.5mL离心管中加入1mL RNAiso Plus RNA提取液；
(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；
(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；
(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；
(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；
(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μL RNase free ddH2O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；
(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析
(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix进行反转录，获得cDNA；
(2)按照RACE试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；
RACE实验中用到的引物：
NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAA
NAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCC
NAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCC
NAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTCACCTTTG
(3)RT-PCR的反应体系采用25μL体系，各成分和体积如下：
Figure FDA0002601278840000021
PCR反应程序：
预变性：94℃ 5min；
变性：94℃ 30s，
复性50-60℃ 30s，
延伸72℃ 1-2min，从第2步开始循环30次；
后延伸：72℃ 10min；
PCR结束后，电泳观察，获得单一的扩增条带，将含有扩增条带的电泳胶切下，通过胶回收获得纯化的扩增的目的条带，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；
KvNAC基因全长1276bp，其中5`UTR328bp，3`UTR213bp，基因的ORF区为735bp，编码了244个氨基酸，该蛋白的分子量大小为28.26kD，等电点8.94；蛋白的不稳定系数为55.91，是一个不稳定的蛋白，同时其平均亲水系数为-0.848。
2.根据权利要求1所述的海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：还对海滨锦葵KvNAC基因在不同组织中表达情况进行测定；
提取了海滨锦葵幼苗的根、茎和叶中的总RNA，通过反转录获得cDNA，用荧光定量RT-PCR测定KvNAC基因在锦葵不同组织中的表达情况，KvNAC基因在根、茎、叶中均有表达，表现出一定程度的组成型表达，其中根中的表达最高，是茎段中的3倍，叶片次之；说明其作为转录因子在植物体的各个组织中均通过调节下游靶基因的表达发挥重要作用。
3.一种海滨锦葵KvNAC基因植物表达载体的构建方法，其特征是：
根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；引物序列如下：
5`端：ATGGCGTTGTACGGTGAAAAG
3`端：CTAATAAAATGGCTTCTGTAGG
选用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY-Blunt Cloning Vector载体进行连接反应，构建重组克隆载体；具体的实验操作流程参照全式金公司的pEASY克隆载体使用说明进行。
CN202010724821.5A 2020-07-24 2020-07-24 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法 Pending CN111909928A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010724821.5A CN111909928A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010724821.5A CN111909928A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111909928A true CN111909928A (zh) 2020-11-10

Family

ID=73280800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010724821.5A Pending CN111909928A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111909928A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011063706A1 (zh) * 2009-11-27 2011-06-03 创世纪转基因技术有限公司 一种棉花nac转录因子基因及其应用
CN110540993A (zh) * 2019-09-06 2019-12-06 东北林业大学 细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011063706A1 (zh) * 2009-11-27 2011-06-03 创世纪转基因技术有限公司 一种棉花nac转录因子基因及其应用
CN110540993A (zh) * 2019-09-06 2019-12-06 东北林业大学 细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOLI TANG等: "Global Gene Expression of Kosteletzkya virginica Seedlings Responding to Salt Stress", 《PLOS ONE》 *
方志红等: "白羊草NAC转录因子基因的克隆及表达分析", 《草地学报》 *
汤晓丽: "海滨锦葵盐胁迫转录组分析和抗盐基因研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士）基础科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946665B (zh) GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用
CN114891803B (zh) 一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用
US20060021091A1 (en) Maize bZIP transcription factors and genes encoding the same and use thereof
CN112391404B (zh) 草莓SnRK2.1基因在调控草莓果实成熟和品质形成中的应用
CN110734482A (zh) 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用
CN114634939B (zh) 一种调节人参中茉莉酸甲酯合成的PgJMT1基因及其应用
CN108251432A (zh) 三七类病程相关蛋白基因PnPRlike及应用
CN110016518A (zh) 一种黄秋葵内参基因EF-1α及其应用
CN109852618A (zh) 一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用
CN113717983A (zh) 龙眼基因DlGRAS34、蛋白及其在调控植株开花中的应用
CN111718940A (zh) 一种胡萝卜响应外源激素相关的DcWRKY69基因的序列及其应用
CN105296502A (zh) 梨己糖转运蛋白基因PbHT1及其应用
CN111909928A (zh) 海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法
CN112626069A (zh) 大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用
CN106244598A (zh) 三七Dirigent类似蛋白基因PnDIR1及应用
CN113817039B (zh) 一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及应用
CN112813078B (zh) 一种转录因子LbNAP在延迟百合花期中的应用
CN108659108B (zh) 一种与黄金梨果顶硬化相关的nac转录因子
KR101668917B1 (ko) 앱시스산 수용체 CaRCAR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법
KR20110052775A (ko) 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도
Li et al. Molecular cloning and characterization of the HOS1 gene from ‘Muscat Hamburg’grapevine
CN111500595A (zh) 一种木麻黄基因CeDREB1及其应用
CN114736883B (zh) 一种具有催化功能的蛋白、其编码基因、以此基因为目的基因制备的重组蛋白及应用
CN111321151A (zh) 短小蛇根草OpWRKY2转录因子的编码序列及其应用
CN104928293B (zh) 小麦根特异表达膨胀素基因的启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201110

RJ01 Rejection of invention patent application after publication