ES2338303T3 - Nuevas secuencias de acido nucleico y su uso en metodos para lograr resistencia en plantas frente a patogenos. - Google Patents

Abstract

Método para lograr o incrementar la resistencia frente a al menos un patógeno en vegetales caracterizado porque comprende los siguientes pasos de proceso a)Reducción de la cantidad de proteína, actividad o función de una proteína RacBs en un vegetal o un tejido, órgano, parte o célula del mismo y b)selección de los vegetales en los que, a diferencia o en comparación con la planta de partida, existe o se ha incrementado la resistencia frente a al menos un patógeno.

Description

Nuevas secuencias de ácido nucleico y su uso en métodos para lograr resistencia en plantas frente a patógenos.

La invención se refiere a métodos para generar o elevar una resistencia frente a patógenos en plantas mediante la reducción de la expresión de una proteína RacB o un de un equivalente funcional de la misma, así como a los organismos, células, cultivos celulares, tejidos, plantas y material de reproducción de los mismos obtenidos con este método.

Un objeto de los trabajos biotecnológicos en plantas es la producción de plantas con propiedades novedosas ventajosas, por ejemplo para elevar la productividad agrícola, para aumentar la calidad en los productos alimenticios o para la producción de determinados productos químicos o farmacéuticos (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96). Con frecuencia los mecanismos naturales de defensa de las plantas frente a los patógenos no son suficientes. Solo las enfermedades por hongos conducen a pérdidas de cosecha por un valor de varios millardos de dólares de Estados Unidos de América al año. La introducción de genes ajenos de las plantas, animales o de fuentes microbianas puede reforzar la defensa. Ejemplos son la protección frente al resultado de la alimentación de insectos en el tabaco mediante expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis bajo control del promotor 35 S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco frente a la infestación de hongos mediante expresión de una quitinasa a partir del grano bajo control del promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los planteamientos escritos sólo ofrecen una resistencia frente a un patógeno individual o frente a un espectro estrecho de patógenos.

Existen solo pocos planteamientos que confieren a las plantas una resistencia frente a un espectro amplio de patógenos, ante todo patógenos fúngicos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR) - un mecanismo de defensa en casode diferentes interacciones planta/patógeno - puede procurarse por aplicación de sustancias mensajeras endógenas, tales como jasmonates (JA) o ácido salicílico (SA) (Ward, et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4(6):645-656). También pueden lograrse efectos similares mediante composiciones sintéticas como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) o S-metilo benzo(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarboxilato (BTH; Bion®) (Friedrich y colaboradores (1996) Plant J 10(1):61-70; Lawton y colaboradores (1996) Plant J. 10:71-82). La expresión de una proteína "pathogenesis related" (PR) (relacionada con patogénesis) que es altamente regulada en el contexto de una SAR, también puede causar parcialmente resistencia patógena.

Desde hace tiempo ya se ha descrito el Mlo-locus en cebada como regulador negativo de la defensa frente a patógenos. La pérdida o pérdida de función ("loss-of-function") del gen Mlo condiciona una resistencia elevada, y ante todo no específica para la raza, por ejemplo frente a numerosos tipos de mildiú (Büschges R y colaboradores (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF y colaboradores (1995) Plant Pathol 44:786-790). El fenotipo Mlo se hereda de manera recesiva lo cual también sugiere una función como gen de susceptibilidad. Las variedades de cebada deficientes de Mlo obtenidas mediante cultivo clásico se usan ya ampliamente en la agricultura. Aunque estas variedades ya se han cultivado intensivamente, la resistencia ha demostrado ser extraordinariamente durable, supuestamente debido a la recesividad. Hasta ahora no se han presentado rupturas en la resistencia. Resistencias similares a Mlo en otras plantas, especialmente en especies cereales, no se han descrito a pesar de que el trigo, el centeno y otros cereales también se infestan por patógenos comparables con mildiú. La razón en el caso del trigo puede ser, por ejemplo, la presencia de un genoma hexaploide, lo cual dificulta en extremo la identificación de mutantes en los que cada una de las seis copias del gen ha sido desactivada.

El gen Mlo solo se ha clonado recientemente (Büschges R y colaboradores (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Como consecuencia se han aislado diversos homólogos de otras variedades de cereales. Se han descrito diversos métodos en los que se usan estos genes para lograr una resistencia a patógenos. (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552).

La resistencia condicionada por Mlo de una planta frente a un mildiú patógeno se manifiesta en dos eventos esenciales que causan ambos una resistencia a la penetración: una formación de papilas ("cell wall apposition"; CWA) debajo del sitio de penetración del patógeno en la pared celular de la epidermis. La propagación del patógeno fúngico se restringe casi exclusivamente a esta estructura subcelular. (Jorgensen JH y Mortensen K (1977) Phytopathology 67:678-685; Freialdenhoven A y colaboradores (1996) Plant Cell 8:5-14). Esta reacción es causada por los genes Ror1 y Ror2 que se requieren para la acción de Mlo (Peterhänsel C y colaboradores (1997) 9:1397-1409). La desventaja a la resistencia a patógeno de Mlo es que las plantas con deficiencia de Mlo - incluso en ausencia de un patógeno - inician un mecanismo de defensa que se manifiesta en la muerta espontanea de las células de la hoja, por ejemplo. (Wolter M y colaboradores (1993). Mol Gen Genet 239: 122-128). Otra desventaja es que los genotipos con deficiencia de Mlo son hipersusceptibles a patógenos hemibiotróficos, tales como Magnaporte grisea (M. grisea) así como Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J y colaboradores (2001) Phytopathology 91:127-133). Por lo tanto, el gen de Mlo parece ser un regulador negativo de la muerte celular. Así mismo, la causa es supuestamente la inducción de muerte celular en ausencia del gen Mlo, lo cual aumenta la susceptibilidad frente a este patógeno bastante necrotrófico. Este efecto ambivalente que limita la aplicación biotecnológica de Mlo se debe probablemente al hecho de que los hongos necrotróficos son capaces de aprovechar los HR más fuertes de la planta con deficiencia de Mlo para su proceso de infección. Sería deseable que una deficiencia de Mlo fuera comparable a una resistencia pero sin la característica de inducir muerte celular.

Las proteínas Rho, Rac y Cdc42 son miembros de la familia de las pequeñas proteínas de enlace de GTP (guanosintrifosfato) y regulan numerosos procesos intracelulares como "interruptores moleculares", tanto en organismos vegetales como también en organismos animales. Como unidad estructural de la transducción de señal tienen un papel importante en la conversión de estímulos extracelular. Regulan, por ejemplo, la NADPH oxidasa y con esto la liberación de moléculas reactivas de oxígeno ("oxidative burst"). La Rac1 animal o humana es esencial para la formación del complejo de oxidasa activo NADPH que a su vez es importante para la formación de superóxido y de esta manera proporciona un aporte a la defensa frente a patógenos (Irani K y Goldschmidt-Clermont PJ (1998) Biochem Farmacol 55: 1339-1346). La función en la defensa de patógenos es en gran medida análoga en plantas y en animales. (Kwong y colaboradores (1995) J Biol Chem 270(34): 19868- 19872; Dusi y colaboradores (1996) Biochem J 314:409-412; Diekmann y colaboradores (1994) Science 265:531-533; Purgin y colaboradores (1997) The Plant Cell 9:2077-2091; Kleinberg y colaboradores (1994) Biochemistry 33:2490-2495; Prigmore y colaboradores (1995) Journal of Biol Chem 27(18): 10717-10722; Irani y colaboradores (1997) Science 275:1649-1652; Low y colaboradores (1994) Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions 3:361-369 (1994) eds. MJ Daniels, Kluwer Acadmic Publishers, Netherlands; Mehdy y colaboradores (1994) Plant Physiol 105: 467-472; Sundaresan y colaboradores (1996) Biochem J 318:379-382). Además, las proteínas de enlace de GTP tienen una función en la reestructuración del citoesqueleto y de la transformación celular (Symon M. (1996) TIBS 21: 178-181), así como en el caso de la activación de la transcripción (Hill y colaboradores (1995) Cell 81:1159-1170; Chandra y colaboradores (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:13393-13397).

En los vegetales existe una familia más grande de proteínas similares a Rac (Winge y colaboradores (1997) Plant Mol Biol 35: 483-495), que también se denominan familia Rop (Lin y colaboradores (1997) The Plant Cell 9:1647-1659). En vegetales las proteínas Rac parecen tener una función en la liberación de moléculas reactivas de oxígeno como consecuencia de infección patógena (Groom QJ y colaboradores (1996) Plant J 10: 515-522; Hassanain HH y colaboradores (2000) Biochem Biophys Res Commun 272 (3):783-788; Ono E y colaboradores (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 759-764). Rac modula, entre otras, la arquitectura de la pared celular, la transducción de señal en el meristemo y la defensa de patógenos (Valster AH y colaboradores (2000) Trends Cell Biol 10(4): 141-146). En el caso de la sobreexpresión de la forma constitutivamente activa, Rac1 de arroz es capaz de inducir una respuesta hipersensible ("hypersensitive response"; HR) en los sitio de una infestación de M. grisea y de esa manera causa una resistencia a patógenos. De manera análoga, la expresión de una forma dominante negativa de Rac1 produce una susceptibilidad elevada frente a M. grisea (Kawasaki T y colaboradores (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:10922-10926; Ono E y colaboradores (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 759-764). Estos hallazgos sugieren que una sobre-expresión de proteínas Rac en la planta puede provocar efectos ventajosos con respecto a la defensa de la planta.

WO 00/15815 describe cinco genes Rac de maíz. Aunque los métodos tanto para regulación arriba como regulación debajo de proteína Rac se describen y se discuten de manera especulativa en conexión con la obtención de resistencia frente a patógenos (pág.55/línea 25 y siguientes), la única enseñanza técnica que describe este uso en términos reales se refiere solamente a una sobreexpresión de los genes Rac reivindicados para obtener resistencia a patógenos (pág.60/línea 21 y siguientes). De una manera no ambigua y de conformidad con el estado de las cosas descrito en el estado de la técnica aquí se plantea el siguiente postulado (pág.60/línea 31 y siguientes): "En consecuencia, la invención es útil para proteger vegetales ante patógenos. Tan pronto un vegetal se transforma con un polinucleótido que codifica para un polipéptido Rac, la expresión del polipéptido provocará en el vegetal una resistencia contra los patógenos vegetales". Las razones detrás de eta hipótesis (defensa de patógenos mediante moléculas reactivas de oxígeno) se explican aquí abajo y se fundamentan en numerosas citas bibliográficas. Además de esto, no se hace diferenciación entre los cinco genes Rac reivindicados.

El objetivo de la presente solicitud es proporcionar nuevos métodos para la defensa de patógenos en plantas que provocan una defensa eficiente de un espectro lo más amplio posible ante patógenos en muchas especies vegetales, las más diversas posibles, preferible en los vegetales de cultivo usados en la agricultura. Este objetivo se resuelve mediante el método de la invención.

Un primer objeto de la invención comprende un método para la generación o el incremento de la resistencia frente a al menos un patógeno en plantas caracterizado porque comprende los siguientes pasos de trabajo:

a)

reducción de la cantidad de proteína, actividad o función de una proteína RacB en una planta o un tejido, órgano, parte o célula de los mismos y

b)

selección de las plantas en las que - a diferencia de o en comparación con la planta de partida - existe o se aumenta la resistencia contra al menos un patógeno.

De manera sorprendente, el homólogo de Rac, el RacB de cebada (Hordeum vulgare) (SEQ ID NO: 1) (de aquí en adelante: hvRacB) - a pesar de una gran similitud con Rac1 de arroz -tiene en contraste con éste una función de control al ataque por parte de mildiú en polvo de la cebada Blumeria (syn. Erysiphe) graminis f. sp. hordei (Bgh): la reducción de la expresión de hvRacB en la célula epidérmica a través de un planteamiento de interferencia de ARN específica para la secuencia usando hvRacB-dsARN bicaternario ("gene-silencing") impidió de manera significativa la formación de Haustorium debido a la infección Bgh. Otros experimentos mostraron (compárese Ejemplo 7), que este fenotipo no puede observarse en un genotipo mutante mlo5-ror1, que es la cebada A89. Esto sugiere que RacB se encuentra en una conexión funcional con Mlo o Ror1 o con juntos; es decir que actúa probablemente en una cadena de señal.

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De manera similar a la pérdida de función de Mlo, la de HvRacB confiere una amplia resistencia frente a diferentes aislados de Blumeria graminis f. sp. hordei. En experimentos transitorios de "gene-silencing" HvRacB reduce la eficiencia de penetración (formación de haustorias) de Bgh en 44% (compárese Ejemplo 7), un efecto que en su magnitud corresponde al efecto alcanzado por Mlo-dsRNA (Schweizer y colaboradores (2000) Plant J 24:895-903). En el tipo silvestre de la variedad de cebada Ingrid aproximadamente 60% de las penetraciones de hongos dan lugar a una formación de haustorias, mientras que la rata de penetración en BCIngrid-mlo5 es casi de 0%. La variedad de cebada A89 (doble mutante mlo-rorl) muestra una eficiencia de penetración de aproximadamente 20 a 35%. En ninguna de estas variantes fue posible observar una expresión RacB modificada debido a la inoculación de Bgh (compárese Ejemplo 7; Fig. 3). El hecho de que también puede observarse solo una penetración de aproximadamente 50% en variedades del tipo silvestre sensibles a patógenos como Pallas o Ingrid, puede atribuirse a la resistencia basal que siempre está presente.

De manera interesante y en contraste con Mlo, el "gene-silencing" de hvRacB solo refuerza la formación de papilas pero aparentemente no la muerte celular espontánea de la planta. Con esto HvRacB se diferencia de OsRac1, un homólogo de arroz de Rac1 (Ono E y colaboradores (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:759-764). HvRacB actúa de manera predominante como regulador negativo de la formación de papilas. Esta diferencia de es importancia sobresaliente para el uso con el fin de lograr una resistencia a patógeno en plantas. Como ya se ha descrito arriba, la resistencia de Mlo frente a hongos biotróficos (por ejemplo, hongos mildiú) también se condiciona realmente por una formación reforzada de papilas aunque se compensa de manera costosa con una susceptibilidad superior frente a los hongos necrotróficos. (Jarosch B y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J y colaboradores (2001) Phytopathology 91:127-133). Puesto que HvRacB solo afecta la formación de papilas, este problema de ambivalencia puede evitarse.

Debido a los hallazgos de arriba, RacB debe considerarse como un elemento clave para la penetración exitosa de un patógeno tal como Bgh dentro de la célula vegetal. Por consiguiente, el método de acuerdo con la invención tiene todas las ventajas de deficiencia Mlo sin mostrar simultáneamente su mayor desventaja, que es la muerte celular espontánea elevada.

Además, el método supera todos los métodos en los que un fenotipo resistente a patógenos se realiza por sobre-expresión de una proteína que facilita la resistencia. La exclusión de un gen puede realizarse sin expresar una proteína (ajena). En el caso ideal solo se desactiva el gen endógeno. Esto tiene ventajas no despreciables en la autorización y la aceptación por el usuario, el cual muchas veces recibe las plantas con proteínas ajenas con reserva. En este contexto es muy particularmente ventajoso el uso de promotores inducibles para la reducción de la cantidad, actividad o función de proteína RacB, lo cual hace posible una expresión solo en caso de necesidad (es decir, infestación de patógenos) al usar promotores patógeno - inducibles, por ejemplo.

Una secuencia parcial del cADN RacB de cebada (HvRacB-cADN) se ha descrito (GenBank Acc.-No.: AJ290240), la cual es altamente conservada con respecto a RacB de arroz (GenBank Acc.- No.: AF250327) y RacB de maíz (GenBank Acc.-No.: AF126053) y muy similar al Rac1 de arroz. RacB de maíz también es uno de los cinco genes Rac en la ya mencionada solicitud WO 00/15815 (secuencia No. 3). La secuencia completa codificante de la proteína HvRacB hasta ahora no se ha descrito (véase Ejemplo 1). RacB de cebada tiene una homología de 95% de identidad con RacB de arroz y es idéntico en más de 55% con el RAC1 o RAC2 humano (Hassanain y colaboradores 2000, Fig. 1). HvRacB se expresa de manera constitutiva en las hojas primarias de la cebada (específica de epidermis) y no se ve afectada en su nivel de expresión de manera esencial por una infestación de Bgh. Entre tanto se efectúa la expresión en el tejido que reacciona de manera directa con el patógeno Bgh.

El término "plantas" comprende preferiblemente plantas monocotiledóneas de cultivo, como por ejemplo variedades de cereal como trigo, cebada, centeno, triticale, maíz, arroz, sorgo o avena, así como caña de azúcar.

Además, el término "plantas dicotiledóneas de cultivo" comprende, por ejemplo

-

Brassicaceas como colza, canola, berro, arabidopsis, variedades de col, o canola, leguminosas como soya, alfalfa, arveja (guisantes), gérmenes de frijol o maní cacahuate.

-

Solanáceas como patata, tabaco, tomate, berenjena o pimentón,

-

Asteráceas como girasol, tagetes, lechuga o caléndula,

-

Cucurbitáceas como melón, calabaza o calabacín,

así como lino, algodón, cáñamo, trébol, espinaca, linaza, pimienta roja, zanahoria, remolacha, rábano, remolacha de azúcar, patata dulce, pepinillo, achicoria, coliflor, brócoli, espárragos, cebolla, ajo, apio, fresa, frambuesa, mora, piña, aguacate y las diversas variedades de árboles, arbustos, nueces y vides. Las variedades de árboles comprenden preferiblemente ciruelo,

\hbox{cerezo, melocotón, nectarina,
albaricoque, banana, papaya, mango, manzano,  pera,
membrillo.}

Además, están comprendidas las plantas ornamentales, árboles aprovechables y árboles ornamentales, flores, flores cortadas, arbustos o céspedes, como por ejemplo pero sin limitarse a, las familias de las rosáceas como rosa, ericáceas como rododendro y azaleas, euforbiaceas como flor de pascua (poinsetias) y crotón, cariofiláceas como claveles, solanáceas como petunias, gesneriáceas como violetas de Usambara (violeta africana), balsamináceas como la impatiens glanduliferao mimosa púdica, orquidáceas como orquídeas, iridáceas como gladiolos, iris, fresia y azafrán, compositas como caléndula, geraniáceas como geranios, liliaceas como dracaena, moráceas como ficus, aráceas como filodendro y otras más.

En el contexto de la invención se prefieren tales plantas que se emplean como producto alimenticio para humanos o animales, muy particularmente se prefieren los géneros monocotiledóneos y variedades como las variedades descritas de cereales.

Muy particularmente se prefiere emplear el método en plantas monocotiledóneas, lo más preferiblemente en plantas con importancia agrícola, como trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón o trigo sarraceno, sorgo, triticale, escanda o trigo de Turquía, linaza o caña de azúcar.

"Resistencia a patógenos" significa la reducción o el debilitamiento de síntomas de enfermedad de una planta causada por una infestación a través de un patógeno. Los síntomas pueden ser de múltiples tipos pero comprenden preferiblemente aquellos que conducen directa o indirectamente a perjudicar la calidad de la planta, la cantidad de la cosecha, la aptitud para el uso como producto de alimento humano o animal o que dificultan la siembra, el crecimiento, la cosecha o el procesamiento del material cosechado.

"Conferir", "existir", "generar" o "incrementar" una resistencia a patógenos significa que el mecanismo de defensa de una determinada variedad o especie de planta presenta una resistencia elevada frente a uno o más patógenos por el uso del método según la invención en comparación con el tipo silvestre de la planta ("planta de partida"), sobre la cual no se ha aplicado el método según la invención, en condiciones de otra manera iguales (como por ejemplo, condiciones de clima y de crecimiento, tipo de patógeno, etc.). En tal caso la resistencia elevada se manifiesta en una expresión reducida de los síntomas de enfermedad y los síntomas de enfermedad también comprenden, además de los efectos adversos arriba mencionados, la eficiencia de penetración de un patógeno en la planta o las células de la planta o la eficiencia de proliferación en o sobre las mismas. En este contexto, los síntomas de enfermedad se reducen preferiblemente en al menos 10% o al menos 20%, particularmente preferible en al menos 40% ó 60%, muy particularmente preferible en al menos 70% u 80%, lo más preferible en al menos 90% ó 95%.

"Selección" significa, con respecto a las plantas en las que, a diferencia o en comparación con las plantas de partida, la resistencia contra al menos un patógeno ya existe o se incrementa, todos los métodos que son adecuados para el reconocimiento de una resistencia a patógeno ya presente o que se incrementa. Estos pueden ser síntomas de la infección de patógeno (por ejemplo, formación de haustorias en infección de hongos) pero también pueden comprende los síntomas arriba descritos que se refieren a la cualidad de la planta, la cantidad de la cosecha, la aptitud para el uso como producto alimenticio humano o animal, etc.

"Patógeno" significa en el contexto de la invención, por ejemplo aunque sin limitar, virus o virusoides, bacterias, hongos, pestes animales, como por ejemplo insectos o nematodos.

Particularmente se prefieren hongos como, por ejemplo, el mildiú. Aunque debe suponerse que la reducción de la expresión de una proteína RacB, su actividad o función también efectúan una resistencia frente a otros patógenos. Las modificaciones en la estructura de pared celular pueden representar un mecanismo fundamental de la resistencia patógena.

A manera de ejemplo, aunque sin limitar, se deben mencionar los siguientes patógenos:

1. Hongos patógenos o patógenos similares a hongos

Hongos patógenos o patógenos similares a hongos (como, por ejemplo, cromista) proceden preferiblemente del grupo que comprende plasmodioforamicota, oomicota, ascomicota, quitridiomicetes, zigomicetes, basidiomicota y deuteromicetes (Fungi imperfecti). Por ejemplo, aunque sin limitar, se mencionan los patógenos listados en las tablas 1 y 2 y las enfermedades asociadas a ellos.

TABLA 1 Enfermedades vegetales por hongos

1

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2

TABLA 2 Mildiú falso

3

4

5

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Particularmente se prefieren

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Plasmodioforomycotas como plasmodiofora brassicae (hernia o digitoria de la col, clubroot of crucifers), Spongospora subterránea (powdery scab of potato tubers o roña en polvo de tubérculos de patata), Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses o enfermedad de raíz en cereales y gramíneas),

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-

Oomycotas como Bremia lactucae (mildiú falso en lechuga), Peronospora (mildiú falso) en boca de dragón (P. antirrhini), cebolla (P. destructor), espinaca (P. effusa), granos de soya (P. manchurica), tabaco ("blue mold" = moho azul de tabaco; P. tabacina) alfalfa y trébol (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (mildiú falso en lúpulo), Plasmopara (mildiú falso en uvas) (P. viticola) y girasol (P. halstedii), Sclerophtohra macrospora (mildiú falso en cereales y gramíneas), Pythium (seed rot (roña de semilla), seedling damping-off (podredumbre de plántulas), and root rot (podredumbre de raíz) and all types of plants (y todos los tipos de plantas), por ejemplo, podredumbre de pie de remolacha por P. debaryanum), Phytophthora infestans (podredumbre de hojas y tubérculos en la patata, podredumbre parda en tomate, etc.), Albugo spec. (white rust on cruciferous plants u orín blanco en plantas crucíferas).

-

Ascomycota como Microdochium nivale (moho de nieve en centeno y trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (podredumbre de espigas ante todo en trigo), Fusarium oxysporum (marchitamiento por Fusarium en tomate), Blumeria graminis (mildiú auténtico en cebada (f. sp. hordei) y trigo (f. sp. tritici)), Erysiphe pisi (Erbsenmehltau), Nectria galligena (chancro de árbol frutal), Unicnula necator (mildiú auténtico de la vid), Pseudopeziza tracheiphila (quemador (clavo) rojo de la vid), Claviceps purpurea (cornezuelo del centeno en, por ejemplo, centeno y gramíneas), Gaeumannomyces graminis (pie negro en trigo, centeno, entre otras gramíneas), Magnaporthe grisea (rice blast disease o enfermedad de ráfaga en arroz), Pyrenofora graminea (rayado de la cebada), Pyrenofora teres (enfermedad de manchas en red en cebada), Pyrenofora tritici-repentis (enfermedad de manchas en hojas (marchitamiento de hoja) en trigo), Venturia inaequalis (roña del manzano), Sclerotinia sclerotium (podredumbre de tallo, cáncer de colza), Pseudopeziza medicaginis (manchas de hojas en alfalfa, trébol blanco y rojo).

-

Basidiomycetes como Typhula incarnata (marchitamiento por Typhula en cebada, centeno, trigo), Ustilago maydis (carbón (con vesículas) en maíz), Ustilago nuda (carbón suelto en cebada), Ustilago tritici (carbón suelto en trigo, espelta o trigo de Turquía), Ustilago avenae (carbón suelto en avena), Rhizoctonia solani (podredumbre de raíz en patata), Sfacelotheca spp. (head smut of sorghum o carbón de cabeza en sorgo), Melampsora lini (rust of flax u orín de lino), Puccinia graminis (orín negro en trigo, cebada, centeno, avena), Puccinia recóndita (orín pardo en trigo), Puccinia dispersa (orín pardo en centeno), Puccinia hordei (orín pardo en Cebada), Puccinia coronata (orín de corona en avena), Puccinia striiformis (orín amarillo en trigo, cebada, centeno así como numerosas gramíneas), Uromyces appendiculatus (orín de frijol), Sclerotium rolfsii (root and stem rots of many plants o podredumbres de raíz y tallo de muchas plantas).

-

Deuteromycetes (Fungi imperfecti) como Septoria nodorum (manchas de la gluma) en trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (encamado parasitario o cercoesporelosis de trigo, cebada, centeno), Rynchosporium secalis (enfermedad de manchas en la hoja de centeno y cebada), Alternaria solani (manchas por marchitamiento en patata, tomate), Foma betae (carbón en raíz de remolacha), Cercospora beticola (enfermedad de manchas en hojas por cercosporas en remolacha), (Alternaría brassicae (negro de colza en colza, col, entre otras crucíferas), Verticillium dahliae (marchitamiento y podredumbre de tallo de colza), Colletotrichum lindemuthianum (antracnosis en frijol), podredumbre de las plántulas por Foma lingam (pie negro en col; marchitamiento del cuello de raíz y del tallo en colza), Botrytis cinerea (podredumbre gris en vid, fresa, tomate, lúpulo etc.).

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Lo que más se prefiere es Phytophthora infestans (marchitamiento de hojas y rubérculos, marchitamiento pardo en tomate, etc.), Microdochium nivale (antes Fusarium nivale; moho de nieve en centeno y trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (podredumbre de espigas en trigo), Fusarium oxysporum (marchitamiento por Fusarium en Tomate), Blumeria graminis (mildiú auténtico en Cebada (f. sp. hordei) y trigo (f. sp. tritici)), Magnaporthe grisea (rice blast disease o enfermedad de ráfaga de arroz), Sclerotinia sclerotium (podredumbre de tallo, cáncer de colza), Septoria nodorum y Septoria tritici (manchas pardas en la gluma en trigo), Alternaría brassicae (negro de colza en colza, col entre otras crucíferas), Foma lingam (podredumbre de plántulas o damping-off, pie negro en col; marchitamiento de cuello de raíz o de tallo en colza).

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2. Patógenos bacterianos

A manera de ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, menciónense los patógenos indicados en la Tabla 3: Enfermedades bacterianas.

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6

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Muy particularmente se prefieren las siguientes bacterias patógenas: Corynebacterium sepedonicum (marchitamiento anular por bacterias en patata), Erwinia carotovora (pie negro en patata), Erwinia amylovora (fuego bacteriano en pera, manzana, membrillo), Streptomyces scabies (roña de patata), Pseudomonas syringae pv. tabaci (bacteriosis del tabaco), Pseudomonas syringae pv. faseolicola (enfermedad de manchas grasas en poroto enano), Pseudomonas syringae pv. tomato ("bacterial speck" (mancha bacteriana) en tomate), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (enfermedad de manchas en hoja de algodón) y Xanthomonas campestris pv. oryzae (marchitamiento por bacterias en arroz y otras gramíneas).

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3. Patógenos virales

"Patógenos virales" incluye todos los virus en vegetales como, por ejemplo, el virus mosaico de tabaco o pepinillo, el virus ringspot (mancha anular), virus de necrosis, virus mosaico de maíz enano, etc.

A manera de ejemplo, aunque sin limitarse, menciónense los patógenos indicados en la Tabla 4 y las enfermedades asociadas con ellos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Enfermedades virales

7

8

4. Pestes animales 4.1 Insectos patógenos

A manera de ejemplo aunque sin limitarse menciónense insectos como escarabajos, orugas, piojos o ácaros. Se prefieren insectos de los géneros Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallofaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Sifonaptera, Trichoptera, etc.. Particularmente se prefieren insectos Coleoptera y Lepidoptera, como por ejemplo las orugas taladradoras de maíz (European Corn Borer (ECB)), Diabrotica barberi ("northern corn rootworm" o gusano norteño, o tortuguilla, de la raíz del maíz), Diabrotica undecimpunctata ("southern corn rootworm" o gusano sureño de la raíz del maíz), Diabrotica virgifera ("Western corn rootworm" o gusano occidental de la raíz del maíz), Agrotis ipsilon ("back cutworm" o gusano trozador negro), Crymodes devastator ("glassy cutworm" o gusano trozador vidrioso), Feltia ducens ("dingy cutworm" o gusano trozador sucio), Agrotis gladiaria ("claybacked cutworm" o gusano trozador lomo de arcilla), Melanotus spp., Aeolus mellillus ("wireworm" o gusano de alambre), Aeolus mancus ("wheat wireworm" o gusano de alambre de trigo), Horistonotus uhlerii ("sand wireworm" o gusano de alambre de arena), Sphenoforus maidis ("maize billbug" o gorgojo del maíz), Sphenoforus zeae ("timothy billbug" o gorgojo de fleo), Sphenoforus parvulus ("bluegrass billbug" gorgojo de poa), Sphenoforus callosus ("southern corn billbug" o gorgojo de maíz sureño), Phyllogfaga spp. ("white grubs" o larvas blancas), Anuraphis maidiradicis ("corn root aphid" o pulgón de raíz de maíz), Delia platura ("seedcorn maggot" o mosca gris de semillas de maíz), Colaspis brunnea ("grape colaspis" colaspis de uva), Stenolophus lecontei ("seedcorn beetle" o escarabajo de semillas de maíz) y Clivinia impressifrons ("lender seedcorn beetle" o escarabajo de semilla de maíz).

Aún más son de nombrarse: el criocero de los cereales (Oulema melanopus), mosca frit (Oscinella frit), gusanos de alambre (Agrotis lineatus) y piojos de hoja (como, por ejemplo, piojo de hoja de avena Rhopalosiphum padi, gran piojo de cereal Sitobion avenae).

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4.2 Nemátodos

Por ejemplo, sin limitarse a ellos, pueden mencionarse los patógenos ilustrados en la Tabla 6 y las enfermedades asociadas con ellos.

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TABLA 6 Nemátodos parasitarios

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Muy particularmente se prefieren Globodera rostochiensis y G. pallida (heteroderas o nematodos de raíz en patata, tomate entre otras solanáceas), Heterodera schachtii (heterodera o nematodo de la remolacha en remolacha de azúcar y de alimento animal, colza, col etc.), Heterodera avenae (heterodera o nematodo de avena en avena entre otros tipos de cereales), Ditylenchus dipsaci (heteroderas o nematodos de tallo o anguílula del tallo, anguilulosis de centeno, avena, maíz, trébol, tabaco, remolacha), Anguina tritici (nematodo de trigo, enfermedad de nematodos en trigo (espelta, centeno), Meloidogyne hapla (anguílula o nematodo de la raíz en zanahoria, pepinillo, lechuga, tomate, patata, remolacha de azúcar, alfalfa). Para las variedades individuales pueden mencionarse a manera de ejemplo preferiblemente patógenos fúngicos o virales:

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1. Cebada

Patógenos fúngicos, bacterianos y virales: Puccinia graminis f. sp. hordei (barley stem rust u orín de tallo de cebada), Blumeria (Erysiphe) graminis f. sp. hordei (Barley Powdery Mildew o mildiú polvoriento de cebada), barley yellow dwarf virus o virus enano amarillo de cebada (BYDV), insectos patógenos/nematodos:

Ostrinia nubilalis (European corn borer o gusano perforador europeo de maíz); Agrotis ipsilon (black cutworm o gusano trozador negro); Schizaphis graminum (greenbug o chinche verde); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug o chinche de los cereales); Acrosternum hilare (green stink bug o chinche verde hediondo); Euschistus servus (brown stink bug o chinche pardo hediondo); Deliaplatura (seedcorn maggot o mosca gris del trigo); Mayetiola destructor (Hessian fly o mosca de Hesse); Petrobia latens (brown wheat mite o ácaro pardo de trigo).

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2. Granos de soya

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Phytophthora megasperma f sp. glycinea, Macrofomina faseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe faseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe faseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. faseoli, Microsfaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialofora gregata, virus mosaico de granos de soya, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus o virus de mancha anular en el tabaco, Tobacco Streak virus o virus de bandas en el tabaco, Phakopsorapachyrhizi, Pythium afanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus o virus de marchitamiento con manchas en el tomate, Heterodera glycines Fusarium solani.

Insectos/nemátodos patógenos: Pseudoplusia includens (soybean looper u oruga agrimensora de granos de soya); Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar o langosta del maní); Plathypena scabra (green cloverworm o gusano verde del trébol); Ostrinia nubilalis (European corn borer o perforador europeo de maíz); Agrotis ipsilon (black cutworm o gusano trozador negro); Spodoptera exigua (beet armyworm u oruga militar de remolacha); Heliothis virescens (cotton budworm o gusano bellotero del algodón); Helicoverpa zea (cotton bollworm o gusano de las cápsulas del algodón);

Epilachna varivestis (Mexican bean beetle o escarabajo mejicano de frijol); Myzus persicae (green peach aphid o pulgón verde de melocotón); Empoasca fabae (potato leaf Hopper o gusano de la hoja de patata); Acrosternum hilare (green stink bug o chinche hediondo verde); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper o saltamontes de patas rojas); Melanoplus differentialis (differential grasshopper o saltamontes diferencial); Hylemya platura (seedcom maggot o mosca gris de semilla de maíz); Sericothrips variabilis (soybean thrips o trips de granos de soya); Thrips tabaci (onion thrips o trips de la cebolla); Tetranychus turkestani (strawberry spider mite o ácaro araña de fresa); Tetranychus urticae (twospotted spider mite o ácaro araña de dos manchas);

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3. Canola

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Albugo candida, Alternaría brassicae, Leptosfaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosfaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.

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4. Alfalfa

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium afanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Foma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Afanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.

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5. Trigo

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaría alternata, Cladesporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cefalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia recondite f. sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenofora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium afanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus (Virus enano amarillo de cebada), Brome Mosaic Virus (virus mosaic bromo), Soil Borne Wheat Mosaic Virus (virus mosaic en trigo soportado en el suelo), Wheat Streak Mosaic Virus (virus mosaic de estrías en trigo), Wheat Spindle Streak Virus (virus de estrías fusiformes en trigo), American Wheat Striate Virus (virus estriado en trigo americano), Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium afanidermatum, High Plains Virus, European wheat striate virus (virus estriado en trigo europeo), Puccinia graminis f. sp. tritici (Wheat stem rust u orín en tallo de trigo), Blumeria (Erysiphe) graminis f. sp. tritici (Wheat Powdery Mildew o mildiú polvoriento en trigo).

Insectos/nematodes patógenos: Pseudaletia unipunctata (army worm o gusano de armada); Spodoptera, frugiperda (fall armyworm o gusano de armada otoñal); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer u oruga perforadora menor en tallo de maíz); Agrotis orthogonia (western cutworm o gusano trozador occidental); Elasmopalpus Zignosellus (lesser cornstalk borer u oruga perforadora menor en tallo de maíz); Oulema melanopus (cereal leaf beetle o escarabajo de hoja de cereal); Hypera punctata (clover leaf weevil o gorgojo de hoja de trébol); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern corn rootworm o gusano de raíz en maíz del sur); Russian wheat aphid o pulgón de trigo ruso; Schizaphis graminum (greenbug o chinche verde); Macrosiphum avenae (English grain aphid o pulgón de grano inglés); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper o saltamontes de patas rojas); Melanoplus differentialis (differential grasshopper o saltamontes diferencial); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper o saltamontes migratorio); Mayetiola destructor (Hessian fly o mosca de Hesse); Sitodiplosis mosellana (wheat midge o cecidomia o mosquilla de trigo); Meromyza americana (wheat stem maggot o mosca gris de tallo de trigo); Hylemya coarctata (wheat bulb fly o mosca del bulbo de trigo); Frankliniella fusca (tobacco thrips o trips de tabaco); Cephus cinctus (wheat stem sawfly o mosca de sierra o cefo de tallo de trigo ); Aceria tulipae (wheat curl mite o ácaro de rizo en trigo);

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6. Girasol

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Plasmofora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows (amarilleo de áster), Septoria helianthi, Fomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Foma macdonaldii, Macrofomina faseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cefalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Insectos/nematodos patógenos: Suleima helianthana (sunflower bud moth o polilla de botón de girasol); Homoeosoma electellum (sunflower moth o polilla de girasol); zygogramma exclamationis (sunflower beetle o escarabajo de girasol); Bothyrus gibbosus (carrot beetle o escarabajo de zanahoria); Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge o cecidomia de semilla de girasol);

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7. Maíz

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium afanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrofomina faseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B (Virus A y B mosaico enano en maíz), Wheat Streak Mosaic Virus (virus mosaic de estrías en trigo), Maize Clorotic Dwarf Virus (virus enano clorótico en maíz), Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma (espiroplasma de achaparramiento de maíz), Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cefalosporium maydis, Cafalosporium acremonium, Maize Clorotic Mottle Virus (virus moteado clorótico en maíz), High Plains Virus (virus de planicies altas), Maize Mosaic Virus (virus mosaico en maíz), Maize Rayado Fino Virus (virus rayado fino en maíz), Maize Streak Virus (MSV, virus estriado en maíz), Maize Stripe Virus (virus listado en maíz), Maize Rough Dwarf Virus (virus enano áspero en maíz).

Insectos/nematodos patógenos: Ostrinia nubilalis (European corn borer, oruga perforadora europea); Agrotis ipsilon (black cutworm, gusano trozador negro)); Helicoverpa zea (corn earworm, gusano de la cápsula en maíz); Spodoptera frugiperda. (fall armyworm, oruga military otoñal); Diatraea grandiosella (southwestern corn borer, oruga perforadora en maíz del suroeste); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer, oruga perforadora menor en tallo de maíz); Diatraea saccharalis (surgarcane borer, oruga perforadora en caña de azúcar); Diabrotica virgifera (western corn rootworm, gusano de raíz en maíz occidental); Diabrotica longicornis barberi (northern corn rootworm, gusano de raíz en maíz del norte); Diabrotica undecimpunctata howardi (southern corn rootworm, gusano de raíz en maíz del sur); Melanotus spp. (wireworms, gusanos de alambre); Cyclocefala borealis (northern masked cavena (escarabajo enmascarado del norte); white grub, larva blanca); Cyclocefala immaculata (southern masked cavena (escarabajo enmascarado del sur); white grub, larva blanca); Popillia japonica (Japanese beetle, escarabajo japonés); Chaetocnema pulicaria (corn flea beetle, escarabajo pulga); Sphenoforus maidis (maize billbug gorgojo de maíz); Rhopalosiphum maidis (corn leaf aphid, pulgón de hoja de maíz); Anuraphis maidiradicis (corn root aphid, pulgón de raíz de maíz); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug, chinche); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper, saltamontes de patas rojas); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper, saltamontes migratorio); Hylemva platura (seedcom maggot, mosca de semilla de maíz); Agromyza parvicornis (corn blot leafminer, minador de hojas de mancha de maíz); Anafothrips obscrurus (grass thrips, trips de yerba); Solenopsis milesta (thief ant, hormiga ladrona); Tetranychus urticae (twospotted spider mite, ácaro araña de dos manchas).

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8. Sorgo

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrofomina faseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Foma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sfacelotheca reiliana), Sfacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Sugarcane mosaic H (mosaico de caña de azúcar), Maize Dwarf Mosaic Virus A & B (virus mosaico A y B enano en maíz), Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.

Insectos/nemátodos patógenos: Chilo partellus (sorghum borer o barrenador de sorgo); Spodoptera frugiperda (fall armyworm, gusano militar otoñal); Helicoverpa zea (corn ear-worm, gusano de la cápsula en maíz); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer, barrenadora menor en tallo de maíz); Feltia subterranea (granulate cutworm, gusano trozador granulado); Phvllofaga crinita (white grub, larva blanca); Eleodes, Conoderus y Aeolus spp. (wireworm o gusano de alambre); Oulema melanopus (cereal leaf beetle, escarabajo de hoja de cereal); Chaetocnema pulicaria (corn flea beetle, escarabajo pulga en maíz); Sphenoforus maidis (maize billbug, gorgojo de maíz); Rhopalosiphum maidis (corn leaf aphid, pulgón de hoja de maíz); Sifaflava (yellow sugarcane aphid, pulgón amarillo de caña de azúcar); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug, chinche); Contarinia sorghicola (sorghummidge, cecidomia de sorgo); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite, ácaro araña del clarel); Tetranychus urticae (two spotted spider mite, ácaro araña de dos manchas).

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9. Algodón

Insectos/nematodos patógenos: Heliothis virescens (cotton budworm, gusano de la bellota de algodón); Helicoverpa zea (cotton bollworm, gusano bellotero en algodón); Spodoptera exigua (beet armyworm, gusano military de remolacha); Pectinofora gossypiella (pink bollworm, gusano bellotero rosa); Anthonomus grandis grandis (boll weevil, gorgojo de capullo); Aphis gossypii (cotton aphid, pulgón de algodón); Pseudatomoscelis seriatus (cotton fleahopper, pulguilla de algodón); Trialeurodes abutilonea (bandedwinged whitefly, mosca blanca de alas con franjas); Lygus lineolaris (tarnished plant bug, chinche de planta empañada); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper, saltamontes de patas rojas); Melanoplus differentialis (differential grasshopper, saltamontes diferencial); Thrips tabaci (onion thrips, trips de cebolla); Franklinkiella fusca (tobacco thrips, trips de tabaco); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite, ácaro araña de clarel); Tetranychus urticae (twospotted spider mite, ácaro araña de dos manchas);

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10. Arroz

Insectos/nematodos patógenos: Diatraea saccharalis (sugarcane borer, barrenadora de caña de azúcar); Spodoptera frugiperda (fall armyworm, gusano militar otoñal); Helicoverpa zea (corn earworm, oruga del choclo); Colaspis brunnea (grape colaspis, colaspis de uva); Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil, gorgojo de agua en arroz); Sitophilus oryzae (rice weevil, gorgojo de arroz); Nefotettix nigropictus (rice leafhopper, saltahojas del arroz); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug, chinche); Acrosternum hilare (green stink bug, chinche hediondo verde);

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11. Colza

Insectos/nematodes patógenos: Brevicoryne brassicae (cabbage aphid, pulgón de calabaza); Phyilotreta cruciferae (Flea beetle, escarabajo pulga); Mamestra conjgurata (Bertha armyworm, gusano military de Bertha); Plutella xylostella (Diamondback moth, polilla lomo de diamante); Delia ssp. (Root maggots, mosquilla de raíz).

"Proteína RacB" significa en el contexto de la invención la proteína RacB de cebada según SEQ ID NO: 2, así como sus homólogos de arroz (Oryza sative) según SEQ ID NO: 4 y maíz (Zea mays) según SEQ ID NO: 6 como también equivalentes funcionales de las mencionadas.

"Cantidad de proteína" significa la cantidad de un polipéptido RacB en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento de célula. "Reducción" de la cantidad de proteína significa la reducción cuantitativa de la cantidad de una proteína RacB en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular - por ejemplo mediante uno de los métodos descritos abajo - en comparación con el tipo silvestre al cual no se ha aplicado este método, en condiciones marco por lo demás iguales (como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de las plantas, etc.). La reducción es de al menos 10%, preferible de al menos 10% o de al menos 20%, particularmente preferible de al menos 40% o 60%, muy particularmente preferible de al menos 70% o 80%, lo más preferible de al menos 90% o 95%.

"Actividad" significa preferiblemente la actividad GTPasa de un polipéptido RacB en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular. "Reducción" de la actividad significa la reducción de toda la actividad de una proteína RacB en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular - por ejemplo mediante uno de los métodos abajo descritos - en comparación con el tipo silvestre del mismo género y tipo sobre el cual no se ha aplicado el método, en condiciones marco por lo demás iguales (como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de las plantas, etc.). La reducción alcanza en tal caso al menos 10%, preferiblemente al menos 10% o al menos 20%, particularmente preferible al menos 40% o 60%, muy particularmente preferible al menos 70% o 80%, lo más preferible al menos 90% o 95%.

"Función" significa preferiblemente la capacidad de enlazar un sustrato de un polipéptido RacB en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular. Como sustrato se consideran los compuestos de bajo peso molecular tales como GTP pero también los compañeros de interacción de proteína de una proteína RacB. "Reducción" de la función significa, por ejemplo, la reducción cuantitativa de la capacidad de enlazar o la fuerza de enlace de una proteína RacB hacia al menos un sustrato en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular - por ejemplo, mediante uno de los métodos descritos abajo - en comparación con el tipo silvestre del mismo género y tipo sobre el cual no se ha empleado el método, en condiciones marco por lo demás iguales (como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de las plantas, etc.). Por reducción también debe entenderse la modificación de la especificidad de sustrato, como puede expresarse, por ejemplo, mediante el valor de kcat/Km. La reducción en tal caso es de al menos 10%, preferible de al menos 10% o al menos 20%, particularmente preferible de al menos 40% o 60%, muy particularmente preferible de al menos 70% o 80%, lo más preferible de al menos 90% o 95%. Los compañeros de enlace para RacB pueden identificarse,

\hbox{por ejemplo, mediante el  sistema híbrido
levadura-2 de manera corriente para el experto en la
materia.}

Para el experto en la materia son conocidos métodos para la determinación de la cantidad de proteína, de la actividad de GTPasas o de la capacidad de enlazar sustratos y se han descrito muchas veces para GTPasas, como también para proteínas Rac de diversos géneros y tipos (entre otros, Benard V y colaboradores (1999) J Biol Chem 274(19):13198-204; Burstein ES (1998) Oncogene. 17(12):1617-23).

"Equivalentes funcionales" de una proteína RacB significa preferiblemente aquellas secuencias que se derivan de una proteína RacB por SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 abgeleitet o son homólogas a ésta y presentan propiedades esencialmente iguales.

"Propiedades esencialmente iguales" de un equivalente funcional significa ante todo la concesión de fenotipo resistente a patógenos o la concesión o aumento de la resistencia a patógenos frente a al menos un patógeno cuando se reduce la cantidad de proteína. Actividad o función del dicho equivalente funcional RacB en una planta o en un tejido, parte o células del mismo. Además, en la dicha reducción de la cantidad de proteína, actividad o función del equivalente funcional debe entenderse como una propiedad esencial la ausencia de una muerte celular espontáneamente inducida.

En este contexto, la eficiencia de la resistencia a patógenos se desvía tanto hacia abajo como también hacia arriba en comparación con un valor obtenido en la reducción de una de las proteínas RacBe según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. Se prefieren aquellos equivalentes funcionales en los que la eficiencia de la resistencia a patógenos, medida por ejemplo en la eficiencia de penetración de un patógeno (formación de haustoria) - difiere en no más de 50%, preferible 25%, particularmente preferible 10% de un valor de comparación obtenido bajo reducción de una proteína RacBs según NO: 2, 4 ó 6. Particularmente se prefieren aquellas secuencias en cuya reducción la eficiencia de la resistencia a patógenos sobrepasa cuantitativamente en más de 50%, preferible 100%, particularmente preferible 500%, muy particularmente preferible 1000% un valor de comparación obtenido en la reducción de una de las proteínas RacB según SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

La comparación se realiza preferiblemente en condiciones análogas. "Condiciones análogas" significa que se mantienen idénticas todas las condiciones marco, como por ejemplo condiciones de cultivo y reproducción, condiciones de ensayo (como búferes, temperatura, sustratos, concentración de patógenos, etc.) entre los experimentos a comparar y los planteamientos se diferencian solo por la secuencia del polipéptido RacB a comparar, su organismo de procedencia y, opcionalmente, el patógeno. En la selección del patógeno cada comparación requiere que el patógeno se seleccione de tal modo que sea el más similar al otro equivalente, tomando en consideración la especificidad de la especie.

"Equivalentes funcionales" significan en especial mutaciones naturales o artificiales del polipéptido RacB según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 así como homólogos de otras plantas, las cuales presentan propiedades esencialmente iguales. Se prefieren polipéptidos homólogos de las plantas preferidas arriba descritas. Las secuencias homólogas a las secuencias RacB divulgadas en el marco de esta invención, procedentes de otras plantas (por ejemplo Arabidopsis thaliana) pueden encontrarse fácilmente a través de búsqueda en bancos de datos o mediante screening (selección) de bancos genéticos - usando las secuencias RacB como secuencias de búsqueda o sonda.

Las mutaciones comprenden sustituciones, deleciones, inversiones o inserciones de uno o más residuos de aminoácidos. De esta manera, la presente invención también comprende aquellos polipéptidos que se obtienen por modificación de un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

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Por homología entre dos secuencias de ácidos nucleicos se entiende la identidad de la secuencia de ácido nucleico por toda la longitud respectiva de la secuencia, la cual se calcula por comparación con ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) estableciendo los siguientes parámetros:

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A manera de ejemplo, por una secuencia que tiene una homología de al menos 80% a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ ID NO: 1, se entiende una secuencia que al comparar con la secuencia SEQ ID NO: 1 según el algoritmo de programa de arriba presenta una homología de al menos 80%.

Por homología entre dos polipéptidos se entiende la identidad de la secuencia de aminoácidos por toda la longitud de la secuencia respectivamente que se calcula por comparación con ayuda del algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) estableciendo los siguientes parámetros:

11

A manera de ejemplo, por una secuencia que presenta una homología de al menos 80% a nivel de proteína con la secuencia SEQ ID NO: 2, se entiende una secuencia que al compararse con la secuencia SEQ ID NO: 2 según el algoritmo de programa de arriba con el conjunto de parámetros de arriba presenta una homología de al menos 80%.

Equivalentes funcionales, derivados de un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 mediante sustitución, inserción o deleción, tienen una homología de al menos 60%, preferible de al menos 80%, preferentemente de al menos 90%, particularmente preferible de al menos 95%, muy particularmente preferible de al menos 98% con un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 y se distinguen por propiedades esencialmente iguales como las del polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

Equivalentes funcionales, derivados de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 mediante sustitución, inserción o deleción, tienen una homología de al menos 60%, preferible 80%, preferentemente de al menos 90%, particularmente preferible de al menos 95%, muy particularmente preferible de al menos 98% con un polipéptido según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 y codifican para polipéptidos con las propiedades esencialmente iguales como las de los polipéptidos según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

Las proteínas RacB comprendidas como equivalentes funcionales tienen preferiblemente al menos uno de los siguientes motivos de secuencia:

a)

Un elemento G1 GXXXXGKS/T preferible en la región N-terminal. Muy particularmente preferible un elemento con la secuencia GDGAVGKT, lo más preferible un elemento con la secuencia KCVTVGD GAVGKTC.

b)

una región efectora G2 que comprende un motivo de secuencia con PTVFDN, particularmente preferible NTFPTDYVPTVFDNFSANW.

c)

un elemento G3 que comprende LWDTAGQ, particularmente preferible NLGLWDTAGQEDYN

d)

un elemento G4 TKXD, particularmente preferible TKLD, muy particularmente preferible LVGTKLDLRD DKQ

e)

Un elemento G5 EXS, preferible ECSS, muy particularmente preferible ECSSKTG

f)

Un motivo de isoprenilación C-terminal (CXXX, Hassanain HH y colaboradores (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272(3):783-8.), particularmente preferible CSIL.

De manera particularmente preferible tienen lugar al menos 2 ó 3 de estos motivos (a a f) en una proteína RacB funcionalmente equivalente, muy particularmente preferible al menos 4 ó 5, lo más preferible todos los motivos a hasta f. Otros motivos de secuencia RacB típicos, especialmente también motivos para delimitar frente a la proteína Rac1-Proteine, pueden deducirse sin dificultad a partir de la comparación de secuencias de las proteínas RacB (o Rac1) conocidas, tal como se representa en la Fig. 1.

Ejemplos de equivalentes funcionales, a reducirse en el método de acuerdo con la invención, a la proteína RacBen según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 pueden encontrarse por ejemplo a partir de diversos organismos, cuya secuencia genómica es conocida, como por ejemplo a partir de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, mediante comparaciones de homologías de bancos de datos.

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También el screening de bibliotecas de cADN o genómicas de otros organismos, preferible de otras especies adecuadas de plantas mencionadas abajo como huésped para transformación, usando las secuencias de ácidos nucleicos descritas bajo SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 o partes de las mismas como sonda, es un método corriente para el experto en la materia para identificar homólogos en otras especies. En este caso las sondas derivadas de las secuencias de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 tienen una longitud de al menos 20 bp, preferible de al menos 50 bp, particularmente preferible de al menos 100 bp, muy particularmente preferible de al menos 200 bp, lo más preferible de al menos 400 bp. Para el screening de las bibliotecas también puede emplearse una cadena de ADN complementaria a las secuencias descritas bajo SEQ ID NO: 1, 3 ó 5.

Por consiguiente, los equivalentes funcionales comprende secuencias de ADN que hibridizan en condiciones estándar con la secuencia de ácido nucleico RacB descrita por SEQ ID NO:1, 3 ó 5, con la secuencia complementaria de ácidos nucleicos o partes de las previamente mencionadas y las cuales, como secuencias completas, codifican para proteínas que tienen propiedades iguales a las que tienen las proteínas descritas bajo SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

"Condiciones de hibridación estándar" debe entenderse de manera amplia y significa condiciones estrictas y también menos estrictas de hibridación. Tales condiciones de hibridación se han descritos en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T y colaboradores, in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57) o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, entre otras.

A manera de ejemplo, las condiciones pueden seleccionarse durante el paso de lavado a partir del rango de condiciones limitado de aquellas menos estrictas (con aproximadamente 2X SSC a 50ºC) y aquellas más estrictas (con aproximadamente 0.2X SSC a 50ºC, preferible a 65ºC) (20X SSC: citrato de sodio de 0,3M, NaCl de 3M, pH 7.0). Además, la temperatura puede elevarse durante el paso de lavado desde condiciones poco estrictas a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones fuertemente estrictas, a aproximadamente 65ºC. Ambos parámetros, concentración de sal y temperatura, pueden variarse simultáneamente, y mantener constante uno de los dos parámetros y solo variar el otro. Durante la hibridación también pueden usarse agentes denaturizantes como formamida o SDS, por ejemplo. En presencia de formamida al 50% se realiza la hibridación preferiblemente a 42ºC. A continuación, a manera de ejemplo, se indican algunas condiciones para la hibridación y el paso de lavado:

(1)

Se seleccionan condiciones de hibridación de las siguientes condiciones, por ejemplo:

a)

4X SSC a 65ºC,

b)

6X SSC a 45ºC,

c)

6X SSC, 100 \mug/ml de ADN de esperma de pez desnaturalizado, fragmentado a 68ºC,

d)

6X SSC, 0,5% SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, desnaturalizado a 68ºC,

e)

6X SSC, 0,5% SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, desnaturalizado, fragmentado, formamida al 50%, a 42ºC.

f)

Formamida al 50%, 4XSSC a 42ºC, o

g)

Formamida al 50% (vol/vol), 0,1% de albúmina de suero bovino, 0,1% de Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidona, búfer de fosfato de sodio al 50 mM, pH 6,5, NaCl de 750 mM, citrato de sodio de 75 mM a 42ºC, o

h)

2X o 4X SSC a 50ºC (condición débilmente estricta),

i)

30 a 40% de formamida, 2X ó 4X SSC a 42ºC (condición débilmente estricta).

\vskip1.000000\baselineskip

(2)

pueden seleccionarse pasos de lavado a partir de las siguientes condiciones, por ejemplo:

a)

NaCl de 0,015 M/citrato de sodio de 0,0015 M/SDS al 0,1% a 50ºC.

b)

0.1X SSC a 65ºC.

c)

0,1X SSC, 0,5% SDS a 68ºC.

d)

0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% formamida a 42ºC.

e)

0,2X SSC, 0,1% SDS a 42ºC.

f)

2X SSC a 65ºC (condición débilmente estricta).

Equivalentes funcionales derivados de un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 también comprende en especial las proteínas con la SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 o 70. En especial, equivalentes funcionales significa proteínas que se codifican mediante una secuencia de ácidos nucleicos con la SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 o 69.

La reducción de la expresión de una proteína RacBs, de la actividad RacB o de la función RacB puede realizarse de un tipo y manera variadas.

"Reducción" o "reducir", en conexión con una proteína RacB, una actividad RacB o función RacB, debe interpretarse ampliamente y comprende la inhibición o el bloqueo, los cuales se basan en diversos mecanismos biológicos celulares, parcial o esencialmente completos, de la funcionalidad de una proteína RacB en una planta o en una parte, tejido, órgano, células o semillas derivados de la planta. Una reducción en el sentido de la invención también comprende una disminución cuantitativa de una proteína RacBs hasta la ausencia esencialmente completa de la proteína RacBs (es decir, falta de capacidad de detección de la actividad RacB o de la función RacB o falta de capacidad inmunológica de detección de la proteína RacBs). En tal caso la expresión de una determinada proteína RacB o la actividad de RacB o bien la función de RacB en una célula o un organismo se reduce preferible en más de 50%, particularmente preferible en más de 80%, muy particularmente preferible en más de 90%.

Según la invención están comprendidas diversas estrategias para la reducción de la expresión de una proteína RacBs, de la actividad RacB o función RacB. El experto en la materia reconoce que se encuentra disponible una serie de diversos métodos para influir en la expresión de una proteína RacBs, la actividad RacB o la función RacB de una manera deseada.

Una reducción de la actividad RacB o de la función RacB se logra preferiblemente mediante una expresión disminuida de una proteína RacB endógena.

Una reducción de la cantidad de proteína RacB, actividad RacB o función RacB puede realizarse usando los siguientes métodos:

a)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico ARN RacB bicatenario (RacB-dsRNA) o de uno o más casetes de expresión que garantizan su expresión;

b)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico RacB antisense o de un casete de expresión que garantiza su expresión. Están comprendidos tales procesos en los que la secuencia de ácido nucleico antisense se dirige contra un gen RacB (es decir, secuencias de ADN genómicas) o una transcripción de gen RacB (es decir secuencias de RNA). También están comprendidas secuencias de ácidos nucleico \alpha-anoméri- cas.

c)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico RacB antisense combinada con una ribozima o un casete de expresión que garantiza su expresión.

d)

Introducción de secuencias de ácidos nucleicos RacB sense para la inducción de una co-supresión o de un casete de expresión que garantiza su expresión.

e)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína RacB dominante-negativa o de un casete de expresión que garantiza su expresión.

f)

Introducción de factores enlazantes de ADN o proteína frente a genes-, ARN- o proteína-RacB o de un casete de expresión que garantiza su expresión.

g)

Introducción de secuencias virales de ácido nucleico y constructos de expresión que causan la degradación de ARN RacB o de un casete de expresión que garantiza su expresión.

h)

Introducción de constructos para la inducción de una recombinación homóloga en genes RacB endógenos, para generar mutantes knock-out, por ejemplo.

i)

Introducción de mutaciones en genes RacB endógenos para generar una pérdida de función (por ejemplo, generación de codones stop, desplazamientos en el marco de lectura y similares).

\vskip1.000000\baselineskip

En este contexto, cada uno de estos métodos, de manera individual, puede ocasionar una reducción de la expresión RacB, de la actividad RacB o de la función RacB en el sentido de la invención. También es concebible una aplicación combinada. Otros métodos son conocidos por el experto en la materia y pueden comprender el impedimento o la prevención del procesamiento de la proteína RacBs, del transporte de la proteína RacBs o su mRNA, inhibición de la fijación de ribosomas, inhibición del empalme de ARN, inducción de una enzima degradadora de RacB-RNA e/o inhibición de la elongación o terminación translacional.

Los métodos individuales preferidos se describen brevemente a continuación:

a) Introducción de una secuencia de ácido nucleico RacB ARN bicatenario (RacB-dsRNA)

El método de regulación de genes por medio de un ARN bicatenario ("double-stranded RNA interference";
dsRNAi) ha sido descrito en repetidas ocasiones para organismos animales y vegetales (por ejemplo, Matzke MA y colaboradores (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Se hace referencia expresa a los procesos y métodos descritos en las citas indicadas. Una supresión de genes efectiva también puede mostrarse en el caso de una expresión transitoria o después de una transformación transitoria, por ejemplo como consecuencia de transformación biolística (Schweizer P y colaboradores (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Los métodos de dsRNAi se fundamentan en el fenómeno de que mediante la introducción simultánea de la cadena complementaria y de la contracadena de un transcripto de genes se origina la supresión altamente eficiente de la expresión del gen correspondiente. El fenotipo originado viene a ser muy similar al de un mutante knock-out correspondiente (Waterhouse PM y colaboradores (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-64).

El método dsRNAi ha demostrado ser particularmente efectivo y ventajoso para reducir la expresión RacB. Tal como se describe, entre otros, en WO 99/32619, los planteamientos dsRNAi antisense son marcadamente superiores a los planteamientos antisense clásicos.

Otro objeto de la invención se refiere por lo tanto a moléculas de ARN bicatenario (moléculas de dsRNA), que causan la reducción de un RacB al introducirse en una planta (o una célula, tejido, órgano o semillas derivados de la planta).

La molécula de ARN bicatenario para la reducción de la expresión de una proteína RacB se caracteriza porque

a)

una de las dos cadenas de ARN es esencialmente idéntica a al menos una parte de una secuencia de ácido nucleico RacB,

y

b)

la otra cadena respectiva de ARN es esencialmente idéntica a al menos una parte de la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico RacB.

En otra modalidad también preferida, la molécula de ARN bicatenario para la reducción de la expresión de una proteína RacB comprende

a)

una cadena ARN "sense" que comprende al menos una secuencia de ribonucleótidos que es esencialmente idéntica a al menos una parte del transcripto de ARN "sense" de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína RacB, y

b)

una cadena ARN "antisense" que es esencialmente - preferible totalmente - complementaria a la cadena ARN sense del literal a).

Con respecto a las moléculas de ARN bicatenario secuencia de ácido nucleico RacB significa preferiblemente una secuencia según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 o un equivalente funcional de la misma según SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 ó 69.

"Esencialmente idéntico" significa que la secuencia de dsRNA también puede tener inserciones, deleciones y mutaciones puntuales individuales en comparación con la secuencia destino RacB o una secuencia destino funcionalmente equivalente y no obstante causar una reducción eficiente de la expresión. Preferiblemente, la homología según la definición de arriba es de al menos 75%, preferible de al menos 80%, muy particularmente preferible de al menos 90%, lo más preferible de 100% entre la cadena "sense" de un dsRNA inhibitorio y al menos una parte del transcripto de ARN "sense" de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína RacB o un equivalente funcional de la misma (o bien entre la cadena "antisense" la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína RacB o un equivalente funcional de la misma). La longitud del segmento parcial es de al menos 10 bases, preferible de al menos 25 bases, particularmente preferible de al menos 50 bases, muy particularmente preferible de al menos 100 bases, lo más preferible de al menos 200 bases o al menos 300 bases.

De manera alterna, un dsRNA "esencialmente idéntico" también puede definirse como secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con una parte de una proteína de almacenamiento de un transcripto de gen (por ejemplo, en NaCl de 400 mM, PIPES de 40 mM, pH 6,4, EDTA de 1 mM a 50ºC o 70ºC por 12 a 16 h).

"Esencialmente complementaria" significa que la cadena de ARN "antisense" también puede presentar inserciones, deleciones así como mutaciones puntuales individuales en comparación con el complemento de la cadena de ARN "sense". Preferiblemente, la homología es de al menos 80%, preferible de al menos 90%, muy particularmente preferible de al menos 95%, lo más preferido de 100% entre la cadena de ARN "antisense" y el complemento de la cadena de ARN "sense".

"Parte del transcripto de ARN "sense"" de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína RacB o un equivalente funcional de la misma significa fragmentos de ARN o mARN transcritos desde una secuencia de ácido nucleico, preferiblemente un gen RacB que codifica para una proteína RacB o un equivalente funcional de la misma. En este caso, los fragmentos tienen preferiblemente una longitud de secuencia de al menos 20 bases, preferible de al menos 50 bases, particularmente preferible de al menos 100 bases, muy particularmente preferible de al menos 200 bases, lo más preferible de al menos 500 bases. También está comprendido el ARN o mARN completamente transcritos. También está comprendido el uso de la molécula de dsRNA en los métodos de la invención para generar una resistencia en las plantas frente a patógenos. El dsRNA puede consistir de una o más cadenas de ribonucleótidos polimerizados. Además, también pueden estar presentes modificaciones tanto de del esqueleto de azúcar - fosfato como también de los nucleósidos. Por ejemplo, los enlaces de fosfodiésteres del ARN natural pueden modificarse partiendo de que al menos comprenden un heteroátomo de nitrógeno o de azufre. Las bases pueden modificarse de tal manera que se restrinja la actividad de adenosindeaminase, por ejemplo. Tales y otras modificaciones se describen abajo en más detalle abajo en los métodos para la estabilización de ARN antisense. Por supuesto, para lograr el mismo propósito también se introducen a la célula o el organismo varias moléculas de dsARN individuales que comprenden respectivamente uno de los segmentos de secuencia de ribonucleótidos arriba definidos.

El dsRNA puede producirse enzimáticamente o total o parcialmente mediante síntesis química.

La estructura de dsRNA bicatenario puede formarse a partir de dos cadenas de ARN separadas, complementarias, o preferible a partir de una cadena individual autocomplementaria de ARN. En el caso de una cadena individual, autocoplementaria pueden conectarse secuencias "sense" y "antisense" mediante una secuencia enlazante ("linker") y formar, por ejemplo, una estructura de horquilla para pelo. La secuencia enlazante puede ser preferiblemente un intrón que se empalma hacia afuera después de la síntesis del dsARN. La secuencia de ácido nucleico que codifica para un dsARN puede comprender otros elementos como, por ejemplo, señales de terminación de transcripción. Cuando las dos cadenas del dsARN deben combinarse en una célula o planta, esto puede suceder de diversas maneras:

a)

Transformación de la célula o planta con un vector que comprende ambos casetes de expresión,

b)

Cotransformación de la célula o planta con dos vectores, donde uno de ellos comprende los casetes de expresión con la cadena "sense", el otro comprende los casetes de expresión con la cadena "antisense".

c)

Cruzamiento de dos plantas que se han transformado respectivamente con un vector, donde uno de los vectores comprende los casetes de expresión con la cadena "sense", el otro comprende los casetes de expresión con la cadena "antisense".

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La formación del dúplex de ARN puede iniciarse ya sea por fuera de la célula o dentro de la misma. Tal como en la WO 99/53050, el dsARN también puede comprender una estructura de horquilla de pelo enlazando cadena "sense" y "antisense" mediante un "Linker" (por ejemplo, un intrón). Las estructuras de dsARN autocomplementarias se prefieren puesto que solo requieren la expresión de un cosntructo y siempre comprenden las cadenas complementarias en una proporción equimolar.

Los casetes de expresión que codifican para la cadena "antisense" o "sense" de una dsRNA o para la cadena autocomplementaria del dsRNA se insertan preferiblemente en un vector y se insertan de manera estable (usando, por ejemplo, marcadores de selección) en el genoma de una planta con el método descrito abajo, con el fin de garantizar una expresión duradera del dsRNA.

El dsRNA puede introducirse usando una cantidad que haga posible al menos una copia por célula. Cantidades más grandes (por ejemplo, de al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) pueden ocasionar opcionalmente una reducción más eficiente.

Como ya se ha descrito, no se requiere obligatoriamente una identidad de secuencia de 100% entre dsRNA y un transcripto de gen RacB o el transcripto de gen de un gen funcionalmente equivalente para ocasionar una reducción efectiva de la expresión RacB. Por consiguiente, existe la ventaja de que el método sea tolerante con respecto a las desviaciones de secuencia, tal como se presentan a causa de mutaciones genéticas, polimorfismos o divergencias evolucionarías. Así, es posible usar, por ejemplo, el dsRNA que se ha generado a partir de la secuencia RacB de un organismo para suprimir la expresión RacB en otro organismo. La alta homología de secuencia entre las secuencias RacB de arroz, maíz y cebada permiten concluir que esta proteína se conserva en un alto grado dentro de las plantas de modo que la expresión de un dsRNA derivado de una de las secuencias RacB divulgadas según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 también puedan tener in efecto ventajoso en otras especies vegetales.

Debido a la alta homología entre las proteínas RacB individuales y sus equivalentes funcionales con un único dsRNA que se haya generado a partir de una secuencia RacB determinada de un organismo, suprimir la expresión de otras proteínas RacB homólogas y/o sus equivalentes funcionales del mismo organismo o también la expresión de proteínas RacB en otras especies relacionadas. Para este propósito, el dsRNA comprende preferiblemente la región de secuencia de transcriptos de gen RacB que corresponden a regiones conservadas. Dichas regiones conservadas pueden derivarse fácilmente de la comparación de secuencias.

El dsRNA puede sintetizarse ya sea in vivo o in vitro. Para esto, puede llevarse una secuencia de ADN que codifica para un dsRNA a un un casete de expresión bajo control de al menos un elemento de control genético (como por ejemplo, promotor, enhancer (potenciador), silencer (silenciador), splice-donor (donador de empalme) o splice-aceptador (aceptador de empalme), señal de poliadenilación). De manera correspondiente se describen abajo en más detalle construcciones ventajosas. Una poliadenilación no es necesaria ni tampoco deben estar presentes elementos para iniciar una translación.

Un dsRNA puede sintetizarse química o enzimáticamente. Para esto se usan polimerasas ARN celulares o polimerasas de ARN bacteriófagas (como, por ejemplo, polimerasas ARN T3, -T7 o -SP6). Métodos correspondientes a expresión in vitro de ARN se han descrito (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Un dsRNA sintetizado química o enzimáticamente in vitro puede purificarse total o parcialmente desde la mezcla de reacción, por ejemplo mediante extracción, precipitación, electroforesis, cromatografía o combinación de estos métodos, antes de introducirse a una célula, tejido u organismo. El dsRNA puede introducirse directamente en la célula aunque también aplicarse de manera extracelular (por ejemplo en el espacio intersticial). Sin embargo, se prefiere transformar la planta establemente con un constructo de expresión que genera la expresión del dsRNA. Abajo se describen métodos correspondientes en más detalle.

b) Introducción de una secuencia de ácido nucleico antisense RacB

En repetidas ocasiones, también en vegetales, se han descrito métodos por medio de tecnología "antisense" para suprimir una proteína específica impidiendo que mRNA se acumule (Sheehy y colaboradores (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN y colaboradores (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). La molécula de ácido nucleico antisense se híbrida o se enlaza con el mARN celular y/o ADN genómico que codifica para la proteína destina RacB a suprimir. De esta manera se suprime la transcripción y/o translación de la proteína destino. La hibridación puede originarse de manera convencional por la formación de un dúplex estable o, en el caso de ADN genómico, mediante el enlace de la molécula de ácido nucleico antisense con el dúplex del ADN genómico mediante la interacción específica en el surco grande de la hélice de ADN.

Una secuencia de ácido nucleico antisense adecuada para la reducción de una proteína RacB puede derivarse usando la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína, por ejemplo la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para un equivalente funcional del mismo, por ejemplo una secuencia según SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 ó 69, según las reglas de pares de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácido nucleico antisense puede ser complementaria a todo el mRNA transcrito de la proteína mencionada, restringirse a la región que codifica o componerse sólo de un oligonucleótido, el cual es complementario a una parte de la secuencia del mRNA que codifica o que no codifica. De esta manera, el oligonucleótido puede ser complementario, por ejemplo, a la región que comprende el inicio de translación para la proteína mencionada. Las secuencia de ácido nucleico antisense pueden tener una longitud de, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos, aunque pueden ser más largas y comprender al menos 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos. Las secuencias de ácido nucleico antisense pueden expresarse de manera recombinante o sintetizarse química o enzimáticamente usando métodos conocidos por el experto en la materia. En el caso de la síntesis química pueden usarse, por supuesto, nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden conferir a la secuencia de ácido nucleico antisense una estabilidad bioquímica elevada y conducir hacia una estabilidad física incrementada del dúplex formado a partir de la secuencia de ácido nucleico antisense y de la secuencia destino sense. Pueden usarse, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucléotidos acridina-sustituidos, tales como 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboxi-metilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, \beta-D-galactosylqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, \beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metilíio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metilo de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina.

En otra modalidad preferida puede inhibirse la expresión de una proteína RacBs mediante secuencias de nucleótidos que son complementarias a la región regulatoria de un gen RacB (por ejemplo, a un promotor y/o potenciador RacB) y formar estructuras triple-helicoidales con la hélice doble de ADN de allí, de modo que se disminuya la transcripción del gen RacB. Se describen métodos correspondientes (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helene C y colaboradores (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14 (12):807-815).

En otra modalidad la molécula de ácido nucleico antisense puede ser un ácido nucleico \alpha-anomérico. Moléculas de ácido nucleico \alpha-anomérico de este tipo forman híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los que, a diferencia de los ácidos \beta-nucleicos convencionales, las dos cadenas corren paralelas una con respecto a la otra (Gautier C y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisense también puede comprender 2'-O-metilribonucleótidos (Inoue y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) o análogos quiméricos de ARN-ADN (Inoue y colaboradores (1987) FEBS Lett 215:327-330).

c) Introducción de una secuencia de ácido nucleico RacB antisense combinada con una ribozima

La estrategia antisense arriba descrita puede acoplarse con un método de ribozima. Las moléculas ARN catalíticas o ribozimas pueden adecuarse a cualquier ARN destino y escindir el esqueleto de fosfodiéster en posiciones específicas, por lo cual el ARN destino se desactiva funcionalmente. (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275). La ribozima misma no se modifica sino que puede escindir otras moléculas de ARN destino de manera análoga, por lo cual obtiene las propiedades de una enzima. La incorporación de secuencias de ribozima en ARNs "antisense" confiere precisamente a estos ARNs "antisense" esta propiedad similar a la enzimática, que escinde el ARN y aumenta así su eficiencia en el caso de la desactivación del ARN destino. La producción y uso de las moléculas correspondientes de ARN "antisense" de ribozima se describe, por ejemplo, en Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591.

De esta manera, las ribozimas (por ejemplo, "Hammerhead"-Ribozyme; Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:
585-591) pueden usarse para escindir catalíticamente el mARN de una enzima a suprimirse, por ejemplo RacB, e impedir la translación. La tecnología de ribozima puede elevar la eficiencia de una estrategia antisense. Se describen métodos para la expresión de ribozimas para la reducción de determinadas proteínas en (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). También se ha descrito una expresión de ribozima en células vegetales (Steinecke P y colaboradores (1992) EMBO J 11(4):1525-1530; de Feyter R y colaboradores (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338). Secuencias destino adecuadas y ribozimas pueden determinarse tal como se describen, por ejemplo, en "Steinecke P, Ribozymes, Metods in Cell Biology 50, Galbraith y colaboradores eds, Academic Press, Inc. (1995), páginas 449-460", mediante cálculos de estructura secundaria de ARN de ribozima y destino, así como su interacción (Bailey CC y colaboradores (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361; Lloyd AM and Davis RW y colaboradores (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657). Por ejemplo, pueden construirse derivados de Tetrahymen L-19 IVS RNA que tienen regiones complementarias al mRNA de la proteína RacB a suprimirse (véase también US 4,987,071 y US 5,116,742). De manera alterna tales ribozimas también pueden identificarse por un proceso de selección de una biblioteca de diversas ribozimas (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418).

d) Introducción de una secuencia de ácido nucleico RacB sense para la inducción de una co-supresión

La expresión de una secuencia de ácido nucleico RacB en orientación sense puede conducir a una co-supresión del gen endógeno, homólogo correspondiente. La expresión de ARN sense con homología hacia un gen endógeno puede disminuir o eliminar la expresión del mismo, de manera similar que se ha descrito para planteamientos antisense (Jorgensen y colaboradores (1996) Plant Mol Biol 31(5):957-973; Goring y colaboradores (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith y colaboradores (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli y colaboradores (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol y colaboradores (1990) Plant Cell 2:291-99). En tal caso el constructo introducido puede representar, total o solo parcialmente, el gen homólogo a reducir. La posibilidad para la translación no es indispensable. La aplicación de esta tecnología sobre en vegetales se describe, por ejemplo, por Napoli y colaboradores (1990) The Plant Cell 2: 279-289 y en US 5,034,323.

Se prefiere realizar la co-supresión usando una secuencia que es esencialmente idéntica a al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína RacB o un equivalente funcional de la misma, por ejemplo la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para un equivalente funcional de la misma, por ejemplo una secuencia según SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 ó 69.

e) Introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína RacB dominante-negativa

La función o actividad de una proteína RacB también puede realizarse de manera efectiva mediante expresión de una variante dominante-negativa de esta proteína RacBs. Para el experto en la materia son conocidos métodos para la reducción de la función o actividad de una proteína mediante co-expresión de su forma dominante-negativa (Lagna G und Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM und Alberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1):1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22).

Una variante RacB dominante-negativa puede realizarse, por ejemplo, mediante la modificación de los aminoácidos treonina en la posición 20 en el caso de las proteínas RacB de maíz, arroz o cebada preferible en ácido aspártico. La treonina, o eventualmente también la serina (de manera análoga a la treonina en posición 20 en RacB de maíz, arroz o cebada), a mutarse preferiblemente en homólogos RacB de otras especies, puede determinarse, por ejemplo, mediante comparación apoyada en ordenador ("alignment"). Estas mutaciones para lograr una variante RacB dominante-negativa se realizan preferiblemente a nivel de la secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína RacB. Una mutación correspondiente puede realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis in vitro facilitada por PCR usando primers correspondientes de oligonucleótidos, por medio de los cuales se introduce la mutación deseada. Para esto se usan métodos corrientes para el experto en la materia. Para este propósito puede usarse, por ejemplo, el kit de mutagénesis in vitro "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto). También se describe un método para la preparación de una variante dominante-negativa de la proteína RacBs de maíz en WO 00/15815 (Ejemplo 4, página 69). Particularmente se prefieren las variantes dominate-negativas de la proteína RacB de cebada, arroz o maíz descritas bajo las SEQ ID NO: 7, 8 y 9.

f) Introducción de factores enlazantes de ADN o de proteína contra genes, ARN o proteína RacB

Una reducción de una expresión de gen RacB también es posible con factores específicos que enlazan ADN, por ejemplo con factores del tipo de los factores de transcripción de dedos de cinc. Estos factores se ubican en la secuencia genómica del gen endógeno de destino, preferible en las regiones regulatorias y originan una represión del gen endógeno. El uso de un método así hace posible la reducción de la expresión de un gen endógeno RacB sin que deba manipularse su secuencia mediante ingeniería genética. Se describen métodos correspondientes para la preparación de factores correspondientes (Dreier B y colaboradores (2001) J Biol Chem 276(31): 29466-78; Dreier B y colaboradores (2000) J Mol Biol 303(4):489-502; Beerli RR y colaboradores (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4): 1495-1500; Beerli RR y colaboradores (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12): 8742-8748; Beerli RR y colaboradores (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25) :14628-14633; Kim JS y colaboradores (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8) :3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY y colaboradores (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3):23-31; Mapp AK y colaboradores (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD y colaboradores (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12): 1371-1387; Zhang L y colaboradores (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860).

La selección de estos factores puede efectuarse usando cualquier sección de un gen RacB. Este segmento se encuentra preferiblemente en la región del promotor. Para una supresión del gen también puede ubicarse en la región de los exones o intrones codificantes. Los segmentos correspondientes pueden obtenerse por el experto en la materia mediante consulta en los bancos de datos a partir de un banco de genes o a partir de un cADN RacB, cuyo gen no está presente en el banco de genes, mediante screening de una biblioteca genómica para clones genómicos correspondientes. Los métodos requeridos para este propósito son corrientes para el experto en la materia. También pueden introducirse factores en una célula que inhiben la proteína RacB misma de destino. Los factores que enlazan proteína pueden ser, por ejemplo, aptámeros (Famulok M und Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243: 123-36) o anticuerpos o bien fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena única. La obtención de estos factores se describe y es conocida para el experto en la materia. Por ejemplo, se empleó un anticuerpo scFv citoplasmático para modular la actividad del fitocromo A de la proteína en plantas de tabaco modificadas genéticamente (Owen M y colaboradores (1992) Biotechnology (N Y) 10(7):790-794; Franken E y colaboradores (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272).

La expresión de gen también puede suprimirse mediante compuestos sintéticos de bajo peso molecular cortados a la medida, por ejemplo del tipo de la poliamida (Dervan PB y Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM y colaboradores (2000) Gene Expr 9(1-2):77-91). Estos oligómeros están compuestos de las unidades estructurales 3-(dimetilamino) propilamina, N-metil-3-hidroxipirrol, N-metilimidazol y N-metilpirroles y pueden adecuarse de tal manera a cada sección de ADN bicatenario que se enlazan de manera específica a la secuencia en el surco mayor y bloquean allí la expresión de las secuencias del gen. Se describen métodos correspondientes (véase entre otros Bremer RE y colaboradores (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ y colaboradores (2001) Chem Biol. 8(6): 583-92; Gottesfeld JM y colaboradores (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR y colaboradores (2001) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC y colaboradores (2001) Bioorg Med Chem 9(3):653-7; Urbach AR und Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8):4343-8; Chiang SY y colaboradores (2000) J Biol Chem. 275(32):24246-54).

g) Introducción de las secuencias virales de ácido nucleico que originan la degradación de RacB RNA, y de construcciones de expresión

La expresión RacB también puede realizarse efectivamente por inducción de la degradación específica de RNA RacB por la planta con ayuda de un sistema de expresión viral (Amplikon) (Angell, SM y colaboradores (1999) Plant J. 20(3):357-362). Estos sistemas, también denominados "VIGS" (viral induced gene silencing), introducen en la planta secuencias de ácido nucleico con homología hacia los transcriptos a suprimir por medio de vectores virales. La transcripción se elimina entonces, supuestamente mediada por mecanismos de defensa de la planta contra virus. Se describen técnicas y métodos correspondientes (Ratcliff F y colaboradores (2001) Plant J 25(2):237-45; Fagard M y Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3):285-93; Anandalakshmi R y colaboradores (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 (22):13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46).

h) Introducción de construcciones para la inducción de una recombinación homóloga en genes RacB endógenos, por ejemplo para la generación de mutantes knockout

Para la preparación de un organismo recombinante homólogo con actividad RacB reducida se usa, por ejemplo, una construcción de ácido nucleico que contiene al menos una parte de un gen RacB endógeno que se modifica mediante una deleción, adición o sustitución de al menos un nucleótido de tal modo que se reduce la funcionalidad o se destruye totalmente. La modificación también puede referirse a los elementos regulatorios (por ejemplo, el promotor) del gen, de modo que la secuencia codificante permanece sin modificar, aunque si queda una expresión (transcripción y/o translación) y se reduce. En el caso de la recombinación homóloga convencional la región modificada se flanquea en sus extremos 5' y 3' por otras secuencias de ácido nucleico que deben tener una longitud suficiente para hacer posible la recombinación. La longitud se encuentra normalmente en un intervalo de varios centenares de bases hasta varios kilobases (Thomas KR y Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp y colaboradores (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8):4368-4373).

Para la recombinación homóloga se transforma el organismo huésped, por ejemplo una planta, con la construcción de recombinación usando el método descrito abajo y se seleccionan clones exitosamente recombinados usando por ejemplo una resistencia a antibióticos o a herbicidas. Recombinación homóloga es un evento relativamente raro en eucariotas superiores, ante todo en plantas. Predominan integraciones casuales en el genoma huésped. Una posibilidad de retirar secuencias integradas casualmente y de aumentar así el número de clones de célula con una recombinación homóloga correcta consiste en la utilización de un sistema de recombinación específico para la secuencia, tal como se describe en US 6,110,736, a través del cual pueden deletarse nuevamente secuencias integradas de manera no específica lo cual facilita la selección de eventos integrados exitosamente por recombinación homóloga. Puede usarse un gran número de sistemas de recombinación específicos para la secuencia; a manera de ejemplo se mencionan el sistema Cre/lox del bacteriófago P1, el sistema FLP/FRT de la levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli y el sistema R/RS del plásmido pSR1. Se prefieren el bacteriofago P1 Cre/lox y el sistema de levadura FLP/FRT. El FLP/FRT y el sistema de recombinasa cre/lox se ha aplicado ya en sistemas vegetales (Odell y colaboradores (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378)

i) Introducción de mutaciones en genes endógenos RacB para la generación de una pérdida de función (por ejemplo, generación del stop-codón, desplazamientos en el marco de lectura, etc.)

Otros métodos adecuados para la reducción de la actividad RacB son la introducción de mutaciones nonsense en genes endógenos RacB, por ejemplo mediante introducción de oligonucleótidos RNA/DNA en la planta (Zhu y colaboradores (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558) así como la generación de mutantes knockout con ayuda de, por ejemplo, mutagénesis T-DNA (Koncz y colaboradores (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976), mutagénesis ENU-(N-etil-N-nitrosourea) o recombinación homóloga (Hohn B y Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96:8321-8323.). Mutaciones puntuales también pueden generarse mediante híbridos DNA-RNA que también se conocen como "chimeraplasty" (Cole-Strauss y colaboradores (1999) Nucl Acids Res 27(5):1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3): 240-247).

Los métodos del dsRNAi, de la co-supresión por medio de ARN sense y del "VIGS" ("virus induced gene silencing") también se denominan como "post-transcriptional gene silencing" (PTGS). Métodos de PTGS como también la reducción de la función o actividad con variantes RacB dominantes negativas son particularmente ventajosas porque los requerimentos para la homología entre el gen endógeno a suprimir y la secuencia de ácido nucleico sense o dsRNA expresada transgénicamente (o bien entre el gen endógeno y su variante dominante-negativa) son menores que, por ejemplo, en el caso de un planteamiento antisense clásico. Criterios correspondientes de homología se mencionan en la descripción del método dsRNAI y pueden aplicarse en general para métodos PTGS o planteamientos dominantes-negativos. Debido a la alta homología entre las proteínas RacB de maíz, arroz y cebada puede concluirse sobre un alto grado de conservación de esta proteína en las plantas. De este modo, probablemente puede suprimirse de manera efectiva la expresión de las proteínas RacB homólogas en otras especies usando las secuencias de ácido nucleico RacB de cebada, maíz o arroz sin que el aislamiento y la elucidación de la estructura de los homólogos RacB allí presentes sean requeridos de manera obligatoria. Esto aligera significativamente la cantidad de trabajo. De manera análoga, el uso de variantes dominantes-negativas de una proteína RacB de arroz, maíz o cebada supuestamente puede reducir o suprimir también de manera eficiente la función/actividad de su homólogo en otras especies de
plantas.

Todas las sustancias y compuestos que causan directa o indirectamente una reducción en la cantidad de proteína, cantidad de ARN, actividad del gen o actividad de proteína de una proteína RacB debe combinarse a continuación en el término compuestos "anti-RacB". El término compuesto "anti-RacB" incluye explícitamente las secuencias de ácido nucleico, péptido, proteínas u otros factores empleados en los métodos arriba descritos.

"Introducción" comprende, en el marco de la invención, todos los métodos que son capaces de introducir directa o indirectamente un compuesto "anti-RacB" en una planta o una célula, compartimiento, tejido, órgano o semilla de la misma, o de generar tal compuesto allí. Están comprendidos métodos directos o indirectos. La introducción puede conducir a una presencia transitoria de un compuesto "anti-RacB" (por ejemplo, de un dsRNA) o también a una duradera (estable).

Según la naturaleza diferente de los planteamientos arriba descritos, el compuesto "anti-RacB" puede ejercer su función directamente (por ejemplo, por inserción en un gen RacB endógeno). Sin embargo, la función también puede ejercerse indirectamente después de transcripción a un ARN (por ejemplo en el caso de planteamientos antisense) o después de transcripción y traslación a una proteína (por ejemplo en el caso de factores enlazantes). La invención comprende compuestos "anti-RacB" que actúan tanto directa como indirectamente.

Introducir comprende, por ejemplo, métodos como transfección, transducción o transformación. Compuestos "anti-RacB" también comprenden de esta manera, por ejemplo, construcciones recombinantes de expresión que originan una expresión (es decir, transcripción y opcionalmente translación) por ejemplo de una dsRNA-RacB o de un RNA "antisense" RacB - preferiblemente en una planta o en una parte, tejido, órgano o semillas de la misma.

En dichas construcciones de expresión se encuentra una molécula de ácido nucleico cuya expresión (transcripción y, opcionamente, translación) genera un compuesto "anti-RacB", preferible en conexión funcional con al menos un elemento genético de control (por ejemplo, un promotor) el cual garantiza una expresión en un organismo, preferiblemente en plantas. Si la construcción de expresión se introduce directamente a la planta y el compuesto "anti-RacB" (por ejemplo el dsRNA RacB) se genera allí in plantae, entonces se prefieren elementos de control genéticos específicos para plantas (por ejemplo, promotores). El compuesto "anti-RacB" también puede, sin embargo, generarse en otros organismos o in vitro y luego introducirse a la planta (como se describe en los ejemplos 6 y 7). En este contexto se prefieren todos los elementos genéticos de control procarióticos o eucarióticos (por ejemplo, promotores) que permitan la expresión en el organismo elegido en cada caso para la prepara-
ción.

Por conexión funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor con la secuencia de ácido nucleico a expresarse (por ejemplo, un compuesto "anti-RacB") y opcionalmente otros elementos regulatorios como, por ejemplo, un terminador de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios pueda cumplir su función durante la expresión de la secuencia de ácido nucleico, según la disposición de la secuencias de ácido nucleico hacia ARN sense o antisense. Para esto no es indispensable una conexión directa en el sentido químico. Secuencias genéticas de control, como por ejemplo secuencias enhancer (potenciador) también pueden ejercer su función desde posiciones alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia de destino. Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica se posiciona detrás de la secuencia que actúa como promotor de tal modo que las dos secuencias se enlazan de manera covalente la una con la otra. La distancia entre la secuencia de promotor y la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica es preferiblemente menor que 200 pares de bases, particularmente menor que 100 pares de bases, muy particularmente preferible menor que 50 pares de bases.

La producción de una conexión funcional como también la producción de un casete de expresión puede realizarse por medio de técnicas corrientes de recombinación y clonación, tal como se describen, por ejemplo, en Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML y Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Ausubel FM y colaboradores (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience y en Gelvin y colaboradores (1990) en: Plant Molecular Biology Manual. Entre ambas secuencias también pueden posicionarse otras secuencias que tienen, por ejemplo, la función de un linker (enlazante) con determinados sitios de corte de enzima de restricción, o la de un péptido de señal. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión. El casete de expresión que consiste de una conexión de promotor y secuencia de ácido nucleico a expresarse puede estar presente preferiblemente insertado en un vector e insertarse en un genoma vegetal mediante transformación, por
ejemplo.

Por un casete de expresión se deben entender también aquellas construcciones en las que un promotor se posiciona detrás de un gen RacB endógeno, por ejemplo mediante recombinación homóloga, y la reducción según la invención de una proteína RacB se origina por la expresión de un ARN RacB antisense. De manera análoga, un compuesto "anti-RacB" (por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que codifica para un dsARN RacB o un ARN RacB antisense) puede posicionarse detrás de un promotor endógeno de tal manera que se manifiesta el mismo efecto. Ambos planteamientos conducen a casetes de expresión en el sentido de la invención.

Promotores específicos para plantas significa básicamente cada promotor que puede controlar la expresión de genes, en especial genes ajenos en plantas o partes, células, tejidos, cultivos de plantas. En tal caso, la expresión puede ser, por ejemplo, constitutiva, inducible o dependiente de desarrollo.

Se prefieren:

a) Promotores constitutivos

Se prefieren vectores que hacen posible una expresión constitutiva en plantas (Benfey y colaboradores (1989) EMBO J 8:2195-2202). Promotor "constitutivo" significa aquellos promotores que garantizan una expresión en numerosos, preferiblemente en todos, tejidos por un gran período de tiempo del desarrollo de las plantas, preferible en todas las etapas del desarrollo de las plantas. Preferiblemente se usa en particular un promotor vegetal o un promotor que provenga de un virus vegetal. En especial se prefiere el promotor del transcripto ^{35}S del virus CaMV mosaico de coliflor (Franck y colaboradores (1980) Cell 21:285-294; Odell y colaboradores (1985) Nature 313:810-812; Shewmakery colaboradores (1985) Virology 140:281-288; Gardner y colaboradores (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) o el promotor CaMV 19S (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey y colaboradores (1989) EMBO J 8:2195-2202). Otros promotor constitutivo adecuado es el promotor "rubisco small subunit (SSU)" (US 4,962,028), el promotor leguminB-(Gen-Bank Acc.-Nr. X03677), el promotor de la nopalinsintasa de agrobacteria, el promotor TR-dual, el promotor OCS (octopin sintasa) de agrobacteria, el promotor ubiquitina (Holtorf S y colaboradores (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), el promotor ubiquitina 1 (Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce y colaboradores (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696), el promotor Smas, el promotor cinnamilalcoholdehidrogenasa (US 5,683,439), los promotores de las subunidades vacuolares de ATPasa o el promotor de una proteína rica en prolina, de trigo (WO 91/13991), así como otros promotores de genes cuya expresión constitutiva en plantas es conocida para el experto en la materia. Como promotor constitutivo se prefiere especialmente el promotor del gen nitrilase-1 (nit1) de A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand y colaboradores (1996) Gene 170:197-200).

b) Promotores específicos para tejidos

También se prefieren promotores con especificidades para las anteras, ovarios, flores, hojas, tallos, raíces y semillas.

Promotores específicos para semillas como, por ejemplo, el promotor de la faseolina (US 5,504,200; Bustos MM y colaboradores (1989) Plant Cell 1(9):839-53), del gen de 2S albúmina (Joseffson LG y colaboradores (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), de la legumina (Shirsat A y colaboradores (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), de la USP (unknown seed protein; Bäumlein H y colaboradores (1991) Mol Gen Genet 225 (3):459-67), del gen de napina (US 5,608,152; Stalberg K y colaboradores (1996) L Planta 199:515-519), de la proteína enlazante de sacarosa (WO 00/26388) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Bäumlein H y colaboradores (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein y colaboradores (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U y colaboradores (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), el promotor de oleosina de arabidopsis (WO 98/45461), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980). Otros promotores adecuados específicos para semillas son aquellos de los genes que codifican para la "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), gliadina, enzima de ramificación, pirofosfatasa de glucosa ADP (AGPasa) o la sintasa de almidón. También se prefieren promotores que permiten una expresión específica para semillas en monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Ventajosamente pueden emplearse el promotor del gen lpt2 o lpt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordein, del gen de glutelina, del gen de oryzina, del gen de prolamina, del gen de gliadina, del gen de glutelina, del gen de zeina, del gen de kasirina o del gen de secalina).

Promotores específicos para tubérculos, raíces de almacenamiento o raíces tales como, por ejemplo, el promotor patatina clase I (B33), el promotor inhibidor D catepsina de patata.

Promotores específicos para hojas, como el promotor de la FBPasa citosólica de la patata (WO 97/05900), el promotor SSU (small subunit) de Rubisco (ribulosa-1,5-bisfosfatcarboxilasa) o el promotor ST-LSI de patata (Stockhaus y colaboradores (1989) EMBO J 8:2445-2451). Muy particularmente se prefieren promotores específicos para epidermis como, por ejemplo, el promotor del gen OXLP ("Oxalat-Oxidase like protein"; Wei y colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112).

Promotores específicos para flores como, por ejemplo, el promotor fitoeno sintasa (WO 92/16635) o el promotor del gen P-rr (WO 98/22593).

Promotores específicos de anteras tales como el promotor 5126 (US 5,689,049, US 5,689,051), el promotor glob-1 y el promotor \gamma-zein.

c) Promotores inducibles químicamente

Los casetes de expresión también pueden contener un promotor inducible químicamente (Artículo de resumen: Gatz y colaboradores (1997) Annu Rev Plant Phisiol Plant Mol Biol 48:89- 108), mediante el cual puede controlarse la expresión del gen exógeno en la planta en un determinado punto en el tiempo. También pueden usarse promotores de este tipo como, por ejemplo, el promotor PRP1 (Ward y colaboradores (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por bencenosulfonamida (EP 0 388 186), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y colaboradores (1992) Plant J 2:397-404), un promotor inducible por ácido abscísico (EP 0 335 528) o un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (WO 93/21334).

d) Promotores inducibles por estrés o patógenos

También se prefieren promotores que se inducen por estrés biótico o abiótico, tales como, por ejemplo, el promotor inducible por patógeno del gen PRP1 (o promotor gst1) por ejemplo de patata (WO 96/28561; Ward y colaboradores (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), el promotor hsp70 o hsp80 de tomate inducible por calor (US 5,187,267), el promotor alfa-amilasa inducible por frío (WO 96/12814), el promotor PPDK inducible por luz o el promotor pinII inducido por infligir heridas (EP-A 0 375 091). Otros promotores inducibles por patógenos comprenden el promotor Fis1 de linaza (WO 96/34949), el promotor Vst1 (Schubert y colaboradores (1997) Plant Mol Biol 34:417-426) así como el promotor EAS4 sesquiterpeno-ciclasa del tabaco (US 6,100,451).

Promotores inducibles por patógenos comprenden aquellos de genes que se inducen a causa de una infestación de patógenos como, por ejemplo, genes de proteínas PR, proteínas SAR, \beta-1,3-glucanasa, quitinasa etc. (por ejemplo, Redolfi y colaboradores (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, y colaboradores (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau y colaboradores (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton y colaboradores (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich y colaboradores (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich y colaboradores (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen y colaboradores (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 2507-2511; Warner, y colaboradores (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).

También están comprendidos promotores inducibles por infligir heridas, como el del gen pinII (Ryan (1990) Ann Rev Phitopath 28:425-449; Duan y colaboradores (1996) Nat Biotech 14:494-498), del gen wun1 y wun2 (US 5,428,148), del gen win1 y win2 (Stanford y colaboradores (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), de la sistemina (McGurl y colaboradores (1992) Science 225: 1570-1573), del gen WIP1 (Rohmeier y colaboradores (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores (1993) FEBS Letters 323:73-76), del gen MPI (Corderok y colaboradores (1994) Plant J 6(2):141-150) y similares.

Una fuente de otros promotores inducibles por patógenos es la familia de genes PR. Una serie de elementos en estos promotores han demostrado ser ventajosos. Así, la región -364 hasta -288 en el promotor de PR-2d proporciona especificidad para salicilato (Buchel y colaboradores (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504). La secuencia 5'-TCATCTTCTT-3' aparece repetidamente en el promotor de la \beta-1,3-glucanasa de cebada y en más de 30 otros genes inducidos por estrés. En tabaco esta región enlaza una proteína nuclear cuya abundancia se incrementa por salicilato. Los promotores PR-1 de tabaco y arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) también son adecuados como promotores inducibles por patógenos. Puesto que se inducen por patógeno de manera particularmente específica, se prefieren promotores (aPR5) "acidic PR-5" de cebada (Schweizer y colaboradores (1997) Plant Phisiol 114:79-88) y trigo (Rebmann y colaboradores (1991) Plant Mol Biol 16:329-331). Proteínas aPR5 se acumulan en aproximadamente 4 a 6 horas después de la infestación de patógeno y muestran solo una muy pequeña expresión de fondo (WO 99/66057). Un planteamiento para lograr una especificidad elevada inducida por patógeno es la preparación de promotores sintéticos a partir de combinaciones de elementos conocidos sensibles a patógenos (Rushton y colaboradores (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057). Otros promotores inducibles por patógenos de diferentes especies son conocidos por el experto en la materia (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684;

e) Promotores dependientes de desarrollo

Otros promotores adecuados son, por ejemplo, promotores específicos de maduración de frutos como, por ejemplo, el promotor específico de maduración de frutos del tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Los promotores dependientes de desarrollo incluyen parcialmente los promotores específicos de tejidos ya que la formación de los tejidos individuales se efectúa por naturaleza en dependencia del desarrollo.

Particularmente se prefieren promotores constitutivos, específicos de hoja y/o de tallo, inducibles por patógenos y específicos de epidermis, y los que más se prefieren son promotores inducibles por patógeno y específicos de epidermis.

Además, otros promotores pueden estar enlazados funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico a expresarse y tales promotores hacen posible la expresión en otros tejidos vegetales o en otros organismos, tales como, por ejemplo, bacterias E. coli. Como promotores vegetales se toman en consideración, en principio, todos los promotores descritos arriba.

Las secuencias de ácido nucleico presentes en los casetes de expresión o en vectores de acuerdo con la invención pueden enlazarse funcionalmente a otras secuencias genéticas de control adicionalmente al promotor. El término de las secuencias genéticas de control debe entenderse en el sentido amplio y se refiere a todas aquellas secuencias que tienen un efecto en la materialización o la función del casete de expresión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, las secuencias genéticas de control modifican la transcripción y translación en organismos procarióticos o eucarióticos. Preferiblemente, los casetes de expresión de acuerdo con la invención comprenden el promotor con especificidad para la epidermis embrional y/o la flor 5' -corriente arriba de la respectiva secuencia de ácido nucleico a expresarse transgénicamente y una secuencia de terminador 3'-corriente abajo como secuencia genética de control así como opcionalmente otros elementos regulatorios usuales, respectivamente conectados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico a expresarse transgénicamente. Las secuencias genéticas de control también comprenden otros promotores, elementos de promotores o promotores mínimos, todos los cuales pueden modificar las propiedades que controlan la expresión. Así, por ejemplo, la expresión específica de tejido puede efectuarse dependiendo adicionalmente de determinados factores de estrés. Se describen elementos correspondientes, como por ejemplo para el estrés por agua, ácido abscísico (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) y estrés por calor (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989).

Otras secuencias de control ventajosas están, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SPO2, y en los promotores de levadura u hongos ADC1, MFa, AC, P-60, CIC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

En principio, todos los promotores naturales pueden usarse con sus secuencias de regulación tal como los mencionados arriba para el método de acuerdo con la invención. Además, también pueden usarse ventajosamente promotores sintéticos.

Secuencias genéticas de control también comprenden además las regiones 5'- no transladadas, intrones o la región 3'- no codificante de genes como por ejemplo actin-1 intrón, o adh1- S intrones 1, 2 y 6 (en general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha mostrado que estas pueden desempeñar un función significativa en la regulación de la expresión del gen. Se ha mostrado así que las secuencias 5' no transladadas pueden fortalecer la expresión transitoria de genes heterólogos. Por ejemplo puede mencionarse como reforzadores de translación la secuencia líder 5' del virus mosaico de tabaco (Gallie y colaboradores (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) y similares. Además, pueden promover la especificidad de tejido (Rouster J y colaboradores (1998) Plant J 15:435-440).

El casete de expresión puede contener ventajosamente una o más de las llamadas "secuencias enhancer" (secuencias potenciadoras) conectadas funcionalmente con el promotor las cuales hacen posible una expresión transgénica incrementada de la secuencia de ácido nucleico.

También pueden insertarse secuencias adicionales ventajosas en el extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico a expresarse transgénicamente, tales como otros elementos regulatorios o terminadores. Las secuencias de ácido nucleico a expresarse transgénicamente pueden contenerse en una o más copias en la construcción del gen.

Señales de poliadenilación que son adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación vegetales, preferiblemente aquellas que corresponden esencialmente a señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, en especial del gen 3 del T-AD (octopin sintasa) del Ti-plásmido pTiACHS (Gielen y colaboradores (1984) EMBO J 3:835 y siguientes) o equivalentes funcionales de las mismas. Ejemplos de secuencias terminadoras particularmente adecuadas son el terminador OCS (octopin-sintasa) y el terminador NOS (nopalin-sintasa).

Como secuencias de control también deben entenderse aquellas que hacen posible una recombinación homóloga o inserción en el genoma de un organismo huésped o permiten el retiro desde el genoma. En el caso de la recombinación homóloga el promotor natural de un gen determinado puede intercambiarse con un promotor con especificidad para epidermis embrional y/o la flor. Métodos como la tecnología cre/lox permiten una remoción específica para el tejido, inducible bajo circunstancias, del casete de expresión desde el genoma del organismo huésped (Sauer B (1998) Metods. 14(4):381-92). Aquí determinadas secuencias que flanquean se adjuntan al gen de destino (secuencias lox), las cuales hacen posible una remoción por medio de la cre-recombinasa.

Un casete de expresión y los vectores derivados del mismo pueden contener otros elementos funcionales. El término elemento funcional debe entenderse ampliamente y significa aquellos elementos que tienen una influencia en la preparación, multiplicación o función de los casetes de expresión, vectores u organismos transgénicos según la invención. A manera de ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, se nombran:

a) Marcadores de selección que confieren una resistencia contra un inhibidor de metabolismo como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456), antibióticos o biocidas, preferiblemente herbicidas como, por ejemplo Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin,

o Phosphinotricin etc. Particularmente se prefieren marcadores de selección que confieren una resistencia contra herbicidas. A manera de ejemplo se mencionan: secuencias de ADN que codifican para fosfinotricinacetil transferasas (PAT) e desactivan inhibidores de glutamina sintasa (gen bar y pat), genes 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfato sintasa (EPSP Sintasagene), que confieren una resistencia contra Glyphosat® (N-(fosfonometil)glicina), el gen gox que codifica para enzimas que degradan

Glyphosat® (oxidoreductasa de glifosato), el gen deh (que codifica para una dehalogenasa, que desactiva dalapon), acetolactato sintasas que desactivan sulfonilurea e imidazolinona así como genes bxn que codifican para enzimas nitrilasas que degradan bromoxinil, el gen aasa que confiere una resistencia contra el antibiótico apectinomicina, el gen estreptomicinfosfotransferasa (SPT) que permite una resistencia contra estreptomicina, el gen neomicinfosfotransferasa (NPTII) que confiere una resistencia contra kanamicina o geneticidina, el gen higromicinfosfotransferasa (HPT) que proporciona una resistencia contra higromicina, el gen acetolactatsintasa (ALS) que confiere una resistencia contra herbicidas de sulfonilureas (por ejemplo, variantes mutadas ALS con, por ejemplo, la mutación S4 y/o
Hra).

b) genes indicadores que codifican fácilmente para proteínas cuantificables y, mediante su color o actividad enzimática, hacen posible una evaluación de la eficacia de transformación, el sitio de expresión o el tiempo de expresión. En este contexto se prefieren de manera muy particularmente proteínas indicadoras (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) como la "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen y colaboradores (1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff y colaboradores (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel y colaboradores(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian y colaboradores (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL y colaboradores (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM y colaboradores (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), la cloramfenicol transferasa, una luciferasa (Ow y colaboradores (1986) Science 234:856-859; Millar y colaboradores (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), el gen aequorin (Prasher y colaboradores (1985) Biochem Biophis Res Commun 126(3): 1259-1268), la \beta-galactosidasa, gen R-locus (que codifica una proteína que regula la producción de pigmentos antocianina (coloración roja) en tejidos vegetales y hace así posible el análisis directo de la actividad del promotor sin adición de más sustancias auxiliares o sustratos cromogénicos; (Dellaporta y colaboradores, en: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), muy particularmente se prefiere la \beta-glucuronidasa (Jefferson y colaboradores, EMBO J. 1987, 6, 3901-
3907).

c) Orígenes de replicación que aseguran amplificación de los casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención en E. coli, por ejemplo. Ejemplos que pueden mencionarse aquí son ORI (origin of DNA replication), el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook y colaboradores: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Elementos que son necesarios para una transformación de planta mediada por agrobacteria tales como, por ejemplo, el límite izquierdo o derecho del T-ADN o la región vir.

Para la selección de células recombinadas, o también transformadas, de manera homóloga con éxito, normalmente se requiere introducir adicionalmente un marcador seleccionable que confiere a las células recombinadas exitosamente una resistencia contra un biocida (por ejemplo, un herbicida), un inhibidor de metabolismo como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas a partir de las no transformadas (McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

La introducción de un casete de expresión de acuerdo con la invención en un organismo o células, tejidos, órganos, partes o semillas del mismo (preferible en plantas o células, tejidos, órganos, partes o semillas de las plantas), puede efectuarse ventajosamente usando vectores que comprenden los casetes de expresión. El casete de expresión puede introducirse en el vector (por ejemplo, un plásmido) a través de un sitio adecuado de corte de restricción. El plásmido formado se introduce primero en E. coli correctamente transformadas se seleccionan, se hacen crecer y se obtiene el plásmido recombinante mediante métodos corrientes para el experto en la materia. El análisis de restricción y la secuenciación pueden servir para verificar el paso de clonación.

Ejemplos de vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, fagos, viruses o sino agrobacterias. En una modalidad ventajosa se introduce el casete de expresión por medio de vectores plásmidos. Los vectores preferidos son aquellos que hacen posible una integración estable del casete de expresión al genoma huésped.

La generación de un organismo transformado (o de una célula o tejido transformado) requiere introducir el ADN, ARN o proteína respectivo a la célula huésped respectiva.

Para este procedimiento, el cual se denomina transformación (o transducción o trasnfección), se encuentran disponibles un gran número de métodos (Keown y colaboradores (1990) Metods in Enzymology 185:527-537). Por ejemplo, el ADN o ARN pueden introducirse directamente mediante microinyección o mediante bombardeo con micropartículas recubiertas de ADN. Así mismo, la célula puede permeabilizarse químicamente, usando por ejemplo polietilenglicol de modo que el ADN pueda entrar a la célula por difusión. El ADN también puede introducirse mediante fusión de protoplasto con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Otro método adecuado de introducir ADN es electroporación en el que las células se permeabilizan de manera reversible mediante un pulso eléctrico. Se han descrito métodos adecuados (por ejemplo, en Bilang y colaboradores (1991) Gene 100:247-250; Scheid y colaboradores (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche y colaboradores (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause y colaboradores (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein y colaboradores (1987) Nature 327:70-73; Howell y colaboradores (1980) Science 208:1265; Horsch y colaboradores (1985) Science 227:1229-1231; DeBlock y colaboradores (1989) Plant Phisiology 91:694-701; Metods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Metods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

En plantas, los métodos descritos arriba de transformar y regenerar plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se aprovechan para transformación transitoria o estable. Son métodos adecuados ante todo la transformación de protoplasros mediante absorción de ADN inducida por polietilenglicol, el método biolístico con el arma de genes, el llamado método de "particle bombardment", la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que contiene ADN y microinyección.

Además de estas técnicas de transformación "directas", también puede efectuarse transformación por infección bacteriana mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. La transformación proporcionada por Agrobacterium es la más adecuada para células de plantas dicotiledóneas. Los métodos se describen, por ejemplo, por Horsch RB y colaboradores (1985) Science 225: 1229 y siguientes).

Si se usan agrobacterias el casete de expresión debe integrarse a plásmidos específicos, ya sea a un vector intermedio (en inglés: shuttle o intermediate vector), o a un vector binario. Si un plásmido Ti o Ri debe usarse para la transformación, al menos el límite derecho, aunque en la mayoría de los casos el límite derecho e izquierdo, del T-ADN plásmido Ti o Ri se enlaza al casete de expresión a introducirse en forma de una región flanqueante.

Preferiblemente se usan vectores binarios. Los vectores binarios son capaces de replicación tanto en E. coli como en agrobacterias. Normalmente comprenden un gen marcador de selección y un liker o polilinker flanqueados por la secuencia límite de T-ADN derecho e izquierdo. Pueden transformarse directamente e agrobacteria (Holsters y colaboradores (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). El gen marcador de selección permite la selección de agrobacterias transformadas y es, por ejemplo, el gen nptII que confiere resistencia contra kanamicina. La agrobacteria que actúa como organismo huésped en este caso ya debe contener un plásmido con la región vir. Esta se requiere para transferir el T-ADN a la célula vegetal. Una agrobacteria transformada de esta manera puede usarse para transformar células vegetales. El uso de T-ADN para transformar células vegetales ha sido investigado y descrito intensamente (EP 120 516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An y colaboradores (1985) EMBO J 4:277- 287). Se conocen diversos vectores binarios, algunos de los cuales se encuentran disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, pBI101.2 o pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

Otros promotores adecuados para la expresión en plantas se han descrito (Rogers y colaboradores (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl y colaboradores (1987) Gene 61:1-11; Berger y colaboradores (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406).

Técnicas directas de transformación son adecuadas para cualquier organismo y tipo de célula.

El plásmido usado no requiere cumplir ningún requisito particular en el caso de inyección o electroporación de ADN o ARN en células vegetales. Pueden usarse plásmidos simples como aquellos de la serie pUC. Si van a regenerarse plantas completas a partir de las células transformadas es necesario que en el plásmido se localice un gen marcador seleccionable adicional.

Células transformadas establemente, es decir aquellas que contienen el ADN introducido integrado al ADN de la célula huésped, pueden seleccionarse a partir de células no transformadas cuando un marcador seleccionable es parte del ADN introducido. Ejemplos de genes que pueden actuar como marcadores son todos aquellos que son capaces de conferir resistencia contra antibióticos o herbicidas (tales como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina) (véase arriba). Las células transformadas que expresan tales genes marcadores son capaces de sobrevivir en presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida correspondientes que matan un tipo silvestre no transformado. Arriba se mencionan ejemplos y comprenden preferiblemente el gen bar que confiere resistencia contra el herbicida fosfinotricina (Rathore KS y colaboradores (1993) Plant Mol Biol 21(5):871-884), el gen nptII que confiere resistencia contra kanamicina, el gen hpt que confiere resistencia contra higromicina o el gen EPSP que confiere resistencia contra el herbicida glifosato. El marcador de selección permite la selección de células transformadas a partir de células no transformadas (McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Las plantas resultantes pueden hacerse crecer e hibridarse de la manera usual. Dos o más generaciones deben hacerse crecer para asegurar que la interacción genómica es estable y hereditaria.

Los métodos mencionados arriba se describen, por ejemplo, en Jenes B y colaboradores (1993) Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por SD Kung y R Wu, Academic Press, páginas 128-143, así como en Potiykus (1991) Annu Rev Plant Phisiol Plant Molec Biol 42:205-225). La construcción a expresarse se clona preferiblemente a un vector que es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan y colaboradores (1984) Nucl Acids Res 12:8711 y siguientes).

Tan pronto una célula vegetal transformada ha sido regenerada, puede obtenerse una planta completa usando métodos conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, cultivos de callos se usan como material de partida. El desarrollo de brotes y raíces puede inducirse en esta biomasa celular aún no diferenciada de una manera conocida. Los brotes obtenidos pueden plantarse y hacer que crezcan.

Tales métodos son conocidos para el experto en la materia para regenerar partes de plantas y plantas enteras a partir de las células de la planta. Para este propósito se usan métodos descritos por Fennell y colaboradores (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne y colaboradores (1994) Theor Appl Genet 89:525-533.

El método de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con otros método que causan resistencia contra patógenos (por ejemplo, contra insectos, hongos, bacterias, nematodos y similares), resistencia contra estrés o algún otro mejoramiento en las propiedades de la planta. Entre otros, se mencionan ejemplos por Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000;51 Spec No; páginas 487-96.

Otro objeto de la invención se refiere a un método usando secuencias de ácido nucleico que codifican para equivalentes funcionales de la proteína RacB de cebada, preferible la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 34, 36 ó 38, la secuencia de ácido nucleico complementaria a ésta y las secuencias derivadas debido a degeneración del código genético.

Otro objeto de la invención se refiere a un método usando casetes de expresión transgénicas que comprenden una de las secuencias de ácido nucleico de arriba. En los casetes de expresión transgénicos la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína RacB de cebada se conecta con al menos un elemento genético de control según la definición de arriba de tal modo que la expresión (transcripción y opcionalmente translación) puede realizarse en un organismo cualquiera, preferiblemente en plantas. Elementos genéticos de control adecuados para este propósito se describen arriba. Los casetes de expresión transgénicos también pueden contener otros elementos funcionales según la definición de arriba. La secuencia de ácido nucleico insertada que codifica para una proteína RacB de cebada puede estar insertada en orientación sense o antisense en el casete de expresión y de esta manera conducir a la expresión de ARN sense o antisense. En el método según la invención pueden emplearse vectores transgénicos que comprenden los casetes de expresión transgénicos.

"Transgénico" con respecto a una secuencia de ácido nucleico, a un casete de expresión o a un vector que contienen dicha secuencia de ácido nucleico o a un organismo transformado con dichos secuencia de ácido nucleico, casete de expresión o vector, por ejemplo, significa todas aquellas construcciones originadas mediante métodos de ingeniería genética en los que ya sea

a)

la secuencia de ácido nucleico RacB, o

b)

una secuencia genética de control conectada funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico RacB, por ejemplo un promotor, o

c)

(a) y (b)

se encuentran en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos de ingeniería genética y la modificación puede ser, a manera de ejemplo, sustituciones, adiciones, deleciones, inversión o inserciones de uno o más residuos de nucleótido. Ambiente genético natural significa el locus cromosomático natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, se obtiene el ambiente genético de la secuencia de ácido nucleico preferiblemente al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferible de al menos 500 bp, particularmente preferible de al menos 1000 bp, muy particularmente preferible de al menos 5000 bp. Un casete de expresión que tiene lugar de manera natural, por ejemplo la combinación de ocurrencia natural del promotor RacB con el gen RacB respectivo, se vuelve un casete de expresión transgénico si este se modifica mediante métodos no naturales, sintéticos ("artificiales") como, por ejemplo, una mutagenización. Se describen métodos correspondientes (US 5, 565, 350; WO 00/15815; véase arriba también).

Otro objeto de la invención se refiere a organismos transgénicos transformados con al menos una de las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión o vectores arriba definidos, así como células, cultivos de células, tejidos, partes, como por ejemplo en el caso de organismos vegetales hojas, raíces, etc. o material de multiplicación derivados de tales organismos. Organismo debe ser entendido de manera amplia y significa organismos procarióticos o eucarióticos, preferiblemente organismos vegetales.

Como organismos transgénicos, los organismos huéspedes o de partida preferidos son ante todo vegetales según la definición nombrada arriba. En el marco de la invención se incluyen todos los géneros y especies de vegetales superiores e inferiores del reino vegetal. Además se incluyen los vegetales maduros, semillas, brotes y plántulas, así como partes derivados de los mismos, material de reproducción y cultivos, por ejemplo cultivos celulares. Vegetales maduros significan plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá de la etapa de plántula. Plántula significa una planta joven, inmadura en una etapa temprana de desarrollo. Plantas preferidas especialmente como organismos huéspedes son plantas a las que puede aplicarse el método según la invención para lograr una resistencia contra patógenos, según los criterios nombrados arriba. Muy particularmente se prefieren plantas monocotiledóneas como trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, triticale, espelta, linaza, caña de azúcar, plantas dicotiledóneas de cultivo como colza, canola, berro, arabidopsis, variedades de col, soya, alfalfa, arveja, frijol, maní, patata, tabaco, tomate, berenjena, pimentón, girasol, tagetes, lechuga, caléndula, melón, calabaza o calabacín.

La generación de los organismos transgénicos puede realizarse con el método descrito arriba para la transformación o transfección de organismos.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de los organismos transgénicos según la invención y de las células, cultivos celulares, partes, como raíces, hojas, etc., por ejemplo, en el caso de organismos vegetales transgénicos, y material transgénico de reproducción como semillas o frutas, que se derivan de los organismos, para la preparación de productos alimenticios humanos o animales, productos farmacéuticos o químicos finos.

Se prefiere además un método para la preparación recombinante de productos farmacéuticos o químicos finos en el que un organismo huésped se transforma con uno de los casetes de expresión descritos arriba y este casete de expresión contiene uno o más genes de estructura que codifican para el producto químico fino deseado o catalizan la biosíntesis de los productos químicos finos deseados, el organismo huésped transformado se cultiva y los productos químicos finos deseados se aíslan a partir del medio de cultivo. Este método es ampliamente aplicable para productos químicos finos tales como enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, saborizantes, aromatizantes y colorantes, naturales y sintéticos. Particularmente se prefiere la producción de tocoferoles y tocotrienoles, así como de carotinoides. El cultivo de los organismos huéspedes transformados así como el aislamiento desde los organismos huéspedes o bien desde el medio de cultivo se efectúa con métodos conocidos para el experto en la materia. La producción de productos farmacéuticos como, por ejemplo, anticuerpos o vacunos se describe por Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92.

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Secuencias

1. SEQ ID NO: 1: Secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína RacB de cebada (Hordeum vulgare).

2. SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácido que codifica para la proteína RacB de cebada (Hordeum vulgare).

3. SEQ ID NO: 3: Secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína RacB de arroz (Oryza sativa).

4. SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácido que codifica para la proteína RacB de arroz (Oryza sativa).

5. SEQ ID-NO: 5: Secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína RacB de maíz (Zea mays).

6. SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácido que codifica para la proteína RacB de maíz (Zea mays).

7. SEQ ID NO: 7: Secuencia de aminoácido que codifica para una variante dominante-negativa de la proteína RacB de cebada (Hordeum vulgare).

8. SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácido que codifica para una variante dominante-negativa de la proteína RacB de arroz (Oryza sativa).

9. SEQ ID NO: 9: Secuencia de aminoácido que codifica para una variante dominante-negativa de la proteína RacB de maíz (Zea mays).

10. SEQ ID NO: 10 primer de oligonucleótido ONP-1 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

11. SEQ ID NO: 11 Primer de oligonucleótido ONP-2 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

12. SEQ ID NO: 12 RACE-RacB Primer 5'-gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3'

13. SEQ ID NO: 13 GeneRacer^{TM} 5'-Primer: 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3

14. SEQ ID NO: 14 GeneRacer^{TM} 5'-Nested Primer: 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3

15. SEQ ID NO: 15 RacB-sense Primer 5'-gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3'

16. SEQ ID NO: 16 RacB-antisense Primer 5'-ttagcttcctcagttcttccc tg-3'

17. SEQ ID NO: 17 BAS-sense Primer 5'-cgcgccgcagccgagtacgac-3'

18. SEQ ID NO: 18 BAS-antisense Primer 5'-gtcacaaaaacacatgtaacc-3'

19. SEQ ID NO: 19 OXLP-sense Primer 5'-ggccgacatgcattcaccag-3'

20. SEQ ID NO: 20 OXLP-antisense Primer 5'-catctgatattgctgggtctg-3'

21. SEQ ID NO: 21 UBI-sense Primer 5'-ccaagatgcagatcttcgtga-3'

22. SEQ ID NO: 22 UBI-antisense Primer 5'-ttcgcgataggtaaaagagca-3'

23. SEQ ID NO: 23 M13-fwd Primer 5' -GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

24. SEQ ID NO: 24 M13-Rev Primer 5' -GGAAACAGCTATGACCATG-3'

25. SEQ ID NO: 25 HvRop6 LEFT PRIMER 5'-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3'

26. SEQ ID NO: 26 HvRop6 RIGHT PRIMER 5'-CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3'

27. SEQ ID NO: 27 HvRacD LEFT PRIMER 5' -ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3'

28. SEQ ID NO: 28 HvRacD RIGHT PRIMER 5'-gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3'

29. SEQ ID NO: 29 HvRop4 LEFT PRIMER 5'-GGATCCttctcgtccatttagccggc-3'

30. SEQ ID NO: 30 HvRop4 RIGHT PRIMER 5'-GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3'

31. SEQ ID NO: 31 RacB5'BamHI Primer 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

32. SEQ ID NO: 32 RacB3'SalI Primer 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

33. SEQ ID NO: 33 V15 Mutagenese Primer 5'-ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3'

34. SEQ ID NO: 34: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el HvRop6 homólogo RacB de cebada
(Hordeum vulgare).

35. SEQ ID NO: 35: Secuencia de aminoácido que codifica para el HvRop6 homólogo RacB de cebada (Hordeum vulgare).

36. SEQ ID NO: 36: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el HvRacD homólogo RacB de cebada
(Hordeum vulgare).

37. SEQ ID NO: 37: Secuencia de aminoácido que codifica para el HvRacD homólogo RacB de cebada (Hordeum vulgare).

38. SEQ ID NO: 38: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el HvRop4 homólogo RacB de cebada
(Hordeum vulgare).

39. SEQ ID NO: 39: Secuencia de aminoácido que codifica para el HvRop4 homólogo RacB de cebada (Hordeum vulgare).

40. SEQ ID NO: 40: Nukleinsäureseguenz que codifica para el Zea mays ROP6 (GenBank Acc.-No.: AJ278665) homólogo RacB

41. SEQ ID NO: 41 Secuencia de aminoácido que codifica para el Zea mays ROP6 homólogo RacB

42. SEQ ID NO: 42 Secuencia de ácido nucleico que codifica para el Oryza sativa subsp. japonica RACDP (RACD) (GenBank Acc.-No.: AF218381) homólogo RacB

43. SEQ ID NO: 43 Aminosecuencia que codifica para el Oryza sativa subsp. japonica RACDP homólogo RacB

44. SEQ ID NO: 44 Secuencia de ácido nucleico que codifica para el Oryza sativa ROP4 (GenBank Acc.-No.: AF380335) homólogo RacB

45. SEQ ID NO: 45 Secuencia de aminoácido que codifica para el Oryza sativa ROP4 homólogo RacB

46. SEQ ID NO: 46 Secuencia de ácido nucleico que codifica para el Zea mays RACA (GenBank Acc.-No.: AF126052) homólogo RacB

47. SEQ ID NO: 47 Secuencia de aminoácido que codifica para el Zea mays RACA homólogo RacB

48. SEQ ID NO: 48 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Hordeum vulgare (GenBank Acc.-No.: BM816965)

49. SEQ ID NO: 49 Secuencia de ácido nucleico que codifica für un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At3g51300)

50. SEQ ID NO: 50 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At3g51300)

51. SEQ ID NO: 51 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At2g17800)

52. SEQ ID NO: 52 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At2g17800)

53. SEQ ID NO: 53 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g35950)

54. SEQ ID NO: 54 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g35950)

55. SEQ ID NO: 55 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At1g75840)

56. SEQ ID NO: 56 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At1g75840)

57. SEQ ID NO: 57 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g35020)

58. SEQ ID NO: 58 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g35020)

59. SEQ ID NO: 59 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At1g20090)

60. SEQ ID NO: 60 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At1g20090)

61. SEQ ID NO: 61 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At5g45970)

62. SEQ ID NO: 62 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At5g45970)

63. SEQ ID NO: 63 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At3g48040)

64. SEQ ID NO: 64 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At3g48040)

65. SEQ ID NO: 65 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At5g62880)

66. SEQ ID NO: 66 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At5g62880)

67. SEQ ID NO: 67 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g28950)

68. SEQ ID NO: 68 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At4g28950)

69. SEQ ID NO: 79 Secuencia de ácido nucleico que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At2g44690)

70. SEQ ID NO: 70 Secuencia de aminoácido que codifica para un homólogo RacB de Arabidopsis thaliana (At2g44690)

71. SEQ ID NO: 71 Primer de oligonucleótido Fra 186 5'-ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA-3'

72. SEQ ID NO: 72 Primer de oligonucleótido Fra 187 5'-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3'

73. SEQ ID NO: 73 Vector de expresión transgénico pSUN3NITAtRacB_s para expresión de Arbidopsis thaliana RacB en orientación sense

74. SEQ ID NO: 74 Vector de expresión transgénico pSUN3NITAtRacB_as para expresión de Arbidopsis thaliana RacB en orientación antisense

75. SEQ ID NO: 75 Vector de expresión transgénico pSUN3NITHvRacB_s para expresión de un fragmento de cebada RacB en orientación sense

76. SEQ ID NO: 76 Vector de expresión transgénico pSUN3NITHvRacB_as para expresión de un fragmento de cebada RacB en orientación antisense.

Figuras

1. Fig. 1: Comparación de las secuencias de aminoácido de cebada RacB, arroz RacB, maíz RacB, así como proteínas Rac1 y Rac2 humanas. Las regiones sombreadas de gris indican la posición el elemento G1 (GXXXXGKS/T; aminoácido 13 a 20), de la región efectora G2 (aminoácido 29 a 45), del elemento G3 (LWDTAGQ; aminoácido 58 a 64), del elemento G4 (TKXD; aminoácido 118 a 121), del elemento G5 (EXS) y del motivo de isoprenilación C-terminal (CXXX, Hassanain HH et al. (2000) BiochemBiophis Res Commun. 272(3):783-8.). Los guiones indican espacios vacíos en la secuencia. Los asteriscos representan aminoácidos idénticos en todos los homólogos. Los aminoácidos que difieren entre cebada, por un lado, y maíz y arroz, por el otro lado, se indican blanco en fondo negro. La posición que se modifica ventajosamente para obtener una variante RacB dominante-negativa se marca con un triángulo negro por encima de la secuencia.

2. Fig. 2: Expresión de RacB en tejido epidérmico

RT-PCR de ARN de líneas de cebada Pallas y BCPM1a12 (P10) 24 h después de inoculación ("``hai'' hours after inoculation") con BghA6. Para la extracción del ARN se retiraron bandas de epidermis abaxial (E, de sitios inoculados de hojas) del mesofilo y de la epidermis adaxial (M). Ubiquitina 1 (Ubi) fungió como marcador para una expresión no específica de tejido, OXLP como control positivo para la expresión de gen en la epidermis, Bas como control positivo para la expresión de gen en células de mesofilo. RT-PCR se llevó a cabo con 25 ciclos de amplificicación, tal como se describe abajo. Los productos RT-PCR se desnaturizaron, se transfirieron (blotted) y se detectaron mediante sondas de ARN antisense en condiciones estrictas.

3. Fig. 3: RacB se expresa de manera constitutiva en diversas líneas resistentes de cebada.

ARN se aisló de la variedad Ingrid (Mlo, Ror1, Bgh susceptible), BCIngrid-m lo5 (mlo5, Ror1, Bgh resistente) y A89 (mlo5, ror1, BghA6 moderadamente susceptible) inmediatamente antes de la inoculación (0 Ø) ó 8, 15, 24 h después de la inoculación con Bgh, así como 24 h después a partir de plantas no inoculadas de control (24 Ø). Ubiquitina 1 (Ubi) se usó como marcador para una expresión constitutiva, OXLP como control positivo para una expresión de gen Bgh-inducida en la capa epidérmica. La expresión OXLP se detectó por Northern-Blot. La RT-PCR para RacB y Ubi se realizaron tal como se describió con 25 ciclos de amplificación. Los productos PCR se desnaturizaron en el gel, se transfirieron (blotted) y se detectaron mediante muestras de ARN antisense en condiciones estrictas.

4. Fig. 4: "RNA Interference" con RacB-dsRNA reduce la eficacia de mildiú auténtico polvoriento de cebada BghA6 en cebada.

La eficiencia relativa de penetración (RPE) se determinó en seis experimentos individuales con inoculación con Bgh de cebada cv Pallas. La RPE se calcula como la diferencia entre la eficiencia de penetración de células transformadas con RacB-dsRNA y la eficiencia de penetración de células y transformadas con dsRNA control (aquí: eficacia de penetración promedio de 57%). La RPE porcentual (%-RPE) se calcula de la RPE menos 1, multiplicada por 100.

12

Las columnas negras representan la %-RPE al evaluar al menos 100 sitios de interacción para in experimento independiente respectivamente. La columna blanca representa el %-RPE promedio de los experimentos con el RacB-dsRNA ("RACB-dsRNA"). La barra error indica el erro estándar.

"Control" representa los experimentos paralelos con un dsRNA de control.

En células que habían sido combardeadas con RacB-dsRNA, la %-RPE fue marcadamente reducida en comparación con células que habían sido bombardeadas con un dsRNA de control (TR: dsRNA receptor de tiroide humano).

5. Fig 5: Influencia del fondo genético en la función RacB

La %-RPE se investigó en 5 experimentos independientes inoculando cebada cv Pallas, Ingrid o A89, la cual había sido transformada previamente con RacB-dsRNA, con BghA6.

La %-RPE se reduce marcadamente en Pallas (Mlo Ror1, barras negras, experimentos 1 y 2) ó Ingrid (Mlo Ror1, barras negras, experimentos 3, 4 y 5). Sin embargo, la %-RPE del mutante susceptible A89 (mlo5 ror1, barras negras, experimentos 1 a 5) no se redujo. Barras blancas indican el valor medio, las barras de error indican el error estándar.

6. Fig.6: Sobre-expresión de un mutante RacB activo de manera constitutiva en cebada de la variedad Pallas

Un mutante activo de manera constitutiva de cebada RACB (intercambio G->V en posición 15; RacB-V15) se sobre-expresó transitoriamente usando la construcción de expresión pGY-RacBV15 en 5 experimentos independientes en cebada de la variedad Pallas. Para comparación se llevaron a cabo experimentos correspondientes usando el vector solo sin inserto RacB (pGY).

La expresión de un mutante RacB constitutivo da lugar a una susceptibilidad significativamente superior frente a la infestación de patógenos por mildiú de cebada en comparación con los controles (Fig. 6-A). En todos los casos, la susceptibilidad relativa frente al patógeno fúngico se incrementa (Fig. 6-B). Estos resultados demuestran también la función clave de RacB en la defensa contra patógenos.

7. Fig. 7: Mapas de plásmidos para vector de expresión pGY-1 (Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Shinshi H y colaboradores (1990) Plant Mol Biol 14:357-368).

Ejemplos Métodos generales

La síntesis química de oligonucleótidos puede efectuarse, por ejemplo, de manera conocida usando el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). Los pasos de clonación llevados a cabo para los propósitos de la presente invención, tales como escisiones de restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y nylon, enlazamiento de fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli, crecimiento de bacterias, multiplicación de fagos y análisis secuencial de ADN recombinante, por ejemplo, se llevan a cabo tal como se describe por Sambrook y colaboradores (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.

La secuenciación de moléculas de ADN recombinantes se efectúa con un secuenciador de ADN de fluorescencia láser de la empresa MWG-Licor según el método de Sanger (Sanger y colaboradores (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

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Ejemplo 1

Plantas, patógenos e inoculación

La variedad de cebada Ingrid procede de James McKey, University of Uppsala, Suecia. La variedad Pallas y la línea retrocruzada BCIngrid-mlo5 fue puesta a disposición por Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Dinamarca. Su producción se describe (Kølster P et al. (1986) Crop Sci 26: 903-907). La línea A89 fue suministrada por Paul Schulze-Lefert (Max-Plank-Institut für Züchtungsforschung, Colonia, Alemania).

A menos que se especifique de otra manera, la semilla que había sido pre-germinada sobre papel de filtro húmedo durante 12 a 36 h en la oscuridad, se sembró a lo largo del borde de una maceta cuadrada (8x8 cm) de a 5 granos por maceta, en tierra de Fruhstorfer del tipo P, se cubrieron con tierra y se regaron regularmente con agua de acueducto. Todas las plantas se cultivaron en cabinas o cámaras climatizadas para 5 a 8 días a 16 hasta 18ºC, 50 hasta 60% de humedad relativa del aire y ciclo de luz por 16 horas/oscuridad de 8 horas, con 3000 o 5000 lux (50 ó 60 \mumols^{-1}m^{-2} de densidad de flujo de fotones, respectivamente) y se usaron en los experimentos durante la etapa de plántula. En experimentos en los que se llevaron a cabo aplicaciones a las hojas primarias, éstas se desarrollaron completamente.

Antes de llevar a cabo los experimentos de transfección transitoria, las plantas se cultivaron en cabinas o cámaras de ambiente controlado a una temperatura en el día de 24ºC, y de noche de 20ºC, 50 a 60% de humedad relativa del aire y un ciclo de luz de 16 horas/de oscuridad de 8 horas con 30000 lux.

Para la inoculación de plantas de cebada se usó mildiú auténtico de cebada Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. hordei Em. Marchal de la raza A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6). Este fue proporcionado por el Institut für Biometrie, JLU Gießen. El post-cultivo del inóculo se efectuó en cámaras climatizadas en condiciones iguales, tal como se describen arriba para las plantas mediante transferencia de las conidias de material vegetal infestado, a plantas de cebada, cv. Golden Promise, de 7 días de edad, cultivadas regularmente, con una densidad de 100 conidias/mm^{2}.

La inoculación con BghA6 se llevó a cabo usando plántulas de 7 días de edad mediante agitación de las conidias de plantas ya infestadas en una torre de inoculación con aproximadamente 100 conidias/mm^{2} (mientras no se indique algo diferente).

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Ejemplo 2

Extracción de ARN

Se extrajo ARN total de 8 a 10 segmentos de hojas primarios (longitud 5 cm) mediante "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Alemania).

Para este propósito, se recogió el segmento central de hojas primarias de 5 cm de longitud y se homogenizó en un mortero en nitrógeno líquido. El homogenizado se almacenó a -70ºC hasta la extracción de ARN.

A partir de material de hojas congelado profundamente se extrajo el ARN total con ayuda de un kit de extracción de ARN (AGS, Heidelberg). Para este propósito se cubrieron 200 mg del material de hoja profundamente congelado en un tubito de microcentrífuga (2 mL) con 1,7 mL de búfer de extracción de ARN (AGS) e inmediatamente se mezcló minuciosamente. Después de adicionar 200 L de cloroformo se mezcló bien nuevamente y se agitó a temperatura ambiente por 45 min en un agitador horizontal a 200 rpm. Para separar las fases se centrifugaron a continuación los tubos durante 15 minutos a 20000 g y 4ºC, la fase acuosa superior se transfiere aun nuevo tubito de microcentrifugación y se descarta la inferior. La fase acuosa se purificó nuevamente con 900 \muL de cloroformo homogenizando por 10 segundos y recentrifugando (véase arriba) y retirando la fase acuosa (tres veces). Para precipitar el ARN se adicionaron luego 850 \muL de 2-propanol y la mezcla se homogenizó y se puso en hielo por 30 a 60 minutos. Después de esto, la mezcla se centrifugó por 20 minutos (véase arriba), el sobrenadante se decantó cuidadosamente, se pipetearon 2 ml de etanol al 70% (-20ºC), se mezcló minuciosamente y se centrifugó de nuevo por 10 minutos. El sobrenadante se decantó una vez más y el pelet se liberó cuidadosamente del fluido residual usando una pipeta y luego se secó en una corriente de aire limpio en un puesto de trabajo limpio. Después el ARN se disolvió en 50 \mum de agua DEPC en hielo, se mezcló y centrifugó por 5 minutos (véase arriba). 40 \mul del sobrenadante, como solución de ARN, se transfirieron a un nuevo tubito de microcentrifugación y se almacenaron a -70ºC.

La concentración del ARN se determinó fotométricamente. Para este propósito se diluyó la solución de ARN con agua destilada 1:99 (v/v) y se midió la extinción a 260 nm (fotómetro DU 7400, Beckman) (E_{260\ nm} = 1 a 40 \mug de ARN/mL). A continuación se ajustaron las concentraciones de las soluciones de ARN a 1 \mug/\muL con agua DEPC para ajustar los contenidos de ARN y se verificaron en un gel de agarosa.

Para verificar las concentraciones de ARN en el gel de agarosa horizontal (agarosa al 1% en búfer 1 x MOPS con 0,2 \mug/mL de bromuro de etidio) se trató 1 \mul de la solución de ARN con 1 \muL de 10 x MOPS, 1 \muL de marcados de color y 7 \muL de agua - DEPC, se separó según su tamaño en búfer corriente de 1xMOPS por 1,5 horas a un voltaje de 120 V en el gel y se fotografió bajo luz UV. Las diferencias eventuales en concentración de los extractos de ARN se ajustaron con agua DEPC y se volvió a verificar el ajuste en el gel.

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Ejemplo 3

Clonación de la secuencia cADN RacB de cebada

Los fragmentos de cADN que se requieren para aislar el cADN HvRacB, clonarlo, secuenciarlo y generar muestras se obtuvieron por medio de RT-PCR usando el "One Step RT-PCR Kit" (Life Technologies, Karlsruhe, Alemania o Qiagen, Hilden, Alemania). Para este propósito se usó como matriz el total de ARN de las plántulas de cebada. El ARN se aisló de Pallas y las líneas retrocruzadas con mlo5, Mlg o Mla12 1, 2 y 5 días después de inoculación con BghA6 al día 7 después de germinación. Para la RT-PCR se usaron los siguientes primers:

ONP-1 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

(SEQ ID NO: 10)

y

ONP-2 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

(SEQ ID NO: 11)

Para la reacción (lote de 25 \muL) se emplearon de a 1000 ng de ARN total, dNTPs de 0,4 mM, de a 0,6 mM primer OPN-1 y OPN-2, 10 \muL de inhibidor RNasa y 1 \muL de mezcla de enzima en búfer 1x RT (one step RT-P CR Kit, Qiagen, Hilden).

Se usa el siguiente programa de temperatura (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts):

1 ciclo con 30 min a 50ºC

1 ciclo con 150 sec a 94ºC

30 ciclos con 94ºC por 45 sec, 55ºC por 1 min y 72ºC por 2 min

1 ciclo con 72ºC por 7 min.

El producto PCR se separó mediante electroforesis de gel de agarosa al 2% p/v. Se obtuvo un producto RT-PCR de 642 bp en total el cual se compone de la secuencia RacB (SEQ ID NO: 1) y secuencias terminales que codifican para sitios de restricción de endonucleasa. El fragmento codifica para un marco de lectura abierto de 591 bp que codifica para un polipéptido de 197 aminoácidos. El cADN correspondiente se aisló de un gel de agarosa y se clonó a un vector pGEM-T (Promega, Mannheim, Alemania) por medio de una ligazón de saliente T. Los cADNs se secuenciaron a partir del ADN plásmido usando el "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Alemania).

Puesto que se ha derivado un primer de la secuencia RacB de arroz como primer de partida a als Ausgangsprimer OPN-1 ein Primer de der RacB-Secuencia de arroz (GenBank Acc.-No.: AF250327) se verificó esta región (es decir, el extremo 5') del cADN RacB de cebada una vez más mediante la tecnología RACE usando el "GeneRacer Kit" (INVITROGENE Life Technologies). Para este propósito se trataron 100 ng de poly-A mARN, 1 \muL de búfer 10xCIP, 10 unidades de inhibidor de ARNsa, 10 unidades de CIP ("calf intestinal fosfatase") y agua tratada con DEPC hasta un volumen total de 10 \muL por 1 h a 50ºC. Para la precipitación del ARN se adicionaron otros 90 \muL de agua DEPC y 100 \muL de fenol: cloroformo y se mezclaron minuciosamente de manera intensa por aproximadamente 30 sec. Después de 5 min de centrifugación a 20.000 g la fase superior se trató con 2 \muL de Mussel Glycogen de 10 mg/ml, 10 \muL de acetato de sodio de 3M (pH 5,2) en un nuevo recipiente de microreacción. 220 \muL de etanol al 95% se adicionaron y la mezcla se incubó en hielo. A continuación el ARN se precipitó por centrifugación durante 20 minutos a 20.000 g y 4ºC. Se descartó el sobrenadante, se adicionaron 500 \muL de etanol al 75%, la mezcla se pasó brevemente por el vórtex y se centrifugó de nuevo por 2 minutos (20000 g). De nuevo se descartó el sobrenadante y el precipitado se secó al aire por 2 min a temperatura ambiente y después se suspendió en 6 \muL de agua DEPC. Se retiraron las estructuras de mARN CAP por adición de 1 \muL de búfer 10xTAP, 10 unidades de ARNAsin y 1 unidad de TAP ("tobacco acid pyrofosfatase"). La mezcla se incubó por 1 h a 37ºC y luego se refrigeró sobre hielo. El ARN se precipitó de nuevo, tal como se describe arriba, y se trasladó a un recipiente de reacción con 0,25 \mug de primer oligonucleótido GeneRacer. El primer oligonucleótido se re-suspendió en la solución de ARN, la mezcla se incubó por 5 minutos a 70ºC y luego se enfrió sobre hielo. 1 \muL de búfer 10xLigasa, ATP de 10 mM, 1 unidad de ARNsin y 5 unidades de T4 ARN-ligasa se adicionaron y el lote de reacción se incubó por 1 h a 37ºC. El ARN se precipitó, una vez más, tal como se describe arriba y se re-suspendió en 13 \mul de agua DEPC. Se adicionó primer oligo-dT de 10 pMol al ARN, se calentó inmediatamente a 70ºC y de nuevo se enfrió sobre hielo. 1 \muL de cada solución de dNTP (25 mM), 2 mL de búfer 10xRT, 5u (1 \mul) de transcriptasa reversa AMV y 20 unidades de ARNsin se adicionaron y la solución de reacción se incubó por 1 hora a 42ºC y a continuación se incubó por 15 minutos a 85ºC. El cADN monocatenario producido de esta forma se almacenó a -20ºC.

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Para la amplificación del extremo 5'-cADN se empleó el siguiente primer:

RACE-RacB Primer: 5'-gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3'

(SEQ ID NO: 12)

GeneRacer^{TM} 5'-Primer: 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3

(SEQ ID NO: 13)

GeneRacer^{TM} 5'-Nested Primer: 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3

(SEQ ID NO: 14)

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El lote (volumen total 25 \muL) tenía la siguiente composición:

1 \mul de primer (cebador) RACE-RacB (5 pmol/\muL),

0,5 \mul de 5 '-primer GeneRacer (10 pmol/\muL)

2,5 \mul de 10x búfer Qiagen,

2,5 \mul de dNTPs (2 mM)

0,5 \mul de cDNA

0,2 \mul de QiagenTAG (5 u/microL)

17,8 \mul de H_{2}O

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Las condiciones PCR fueron:

94ºC Desnaturalización por 5 min

5 ciclos con 70ºC 30 sec (annealing o hibridación),

72ºC 1 min (extensión),

94ºC 30 sek (Desnaturalización)

5 ciclos con 68ºC 30 sec (annealing),

72ºC 1 min (extensión),

94ºC 30 sec (desnaturalización)

28 ciclos con 66ºC 30 sec (annealing),

72ºC 1 min (extensión),

94ºC 30 sec (desnaturalización)

72ºC

4ºC

10 min Extensión final enfriamiento hasta seguir procesando.

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La PCR dio como resultado un producto de alrededor de 400 bp. A partir de allí se llevó a cabo una "nested"-PCR con el cebador (primer) de oligonucleótido específico de RacB y el "GeneRacer Nested 5'-Primer":

94ºC 5 min Desnaturalización

30 Ciclos mit 64ºC 30 sek (Annealing),

72ºC 1 min (Extensión),

94ºC 30 sec (Desnaturalización)

72ºC

4ºC

10 min extensión final enfriamiento hasta seguir procesando.

El producto PCR obtenido se aisló por un gel, se extrajo del gel y se clonó en pGEM-T mediante una ligazón sobresaliente T y se secuenció. La secuencia en la región del primer OPN-1 fue absolutamente idéntica a la de racB de arroz, de modo que no podían generarse mutaciones puntuales por medio de primers. Por lo tanto, la secuencia mostrada bajo SEQ ID NO: 1 es idéntica a la secuencia RacB de cebada.

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Ejemplo 4

Transcripción reversa - Reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)

Para la RT-PCR semi-cuantitativa se empleó el "OneStep RT-PCR Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania). En este caso primero se transfirió ARN (véase preparación arriba) a cADN (transcripción reversa) y se amplificó el cADN buscado en una reacción PCR posterior con primers específicos. Para estimar la cantidad de partida de matrices de ARN se interrumpió la amplificación durante la fase exponencial para reflejar las diferencias en el ARN de destino. Los productos de PCR se separaron sobre un gel de agarosa, se desnaturalizaron, se hibridizaron (blotted) en membranas de nylon y se detectaron con sondas específicas, sin marcar radioactivamente, en condiciones estrictas. La hibridación, los pasos de lavado y la inmunodetección se efectuaron tal como se describe como "northern blot".

Para las reacciones individuales (lotes de 25 \muL) se adicionaron usando el "One Step RT-P CR Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania):

1000 ng de ARN total de una muestra determinada

0,4 mM dNTPs, respectivamente 0,6 \muM de primer sense y antisense

0,1 \mul de inhibidor RNasa

1 \muL de mezcla de enzima en búfer 1x RT

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La síntesis de cADN (transcripción reversa) se efectuó por 30 min a 50ºC. A continuación se inactivó la transcriptasa reversa por 15 min a 95ºC, lo cual causó simultáneamente la activación de la ADN-polimerasa y la desnaturalización del cADN. A continuación sigue una PCR según el siguiente programa:

1 min 94ºC Desnaturalización

25 ciclos con 1 min 54ºC adhesión (annealing) del cebador (primer)

1 min 72ºC extendió del cebador (primer)

10 min 72ºC complexión de las hebras dobles (dúplex) de ADN

Finalmente: 4ºC Interrupción de la reacción

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Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa 1xTBE con bromuro de etidio.

Para la amplificación de los lotes individuales se usaron los siguientes pares de cebadores oligonucleótidos:

a) Amplificación de un fragmento 387 bp del cADN RacB de cebada

RacB-sense 5'-gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3'

(SEQ ID NO: 15)

RacB-antisense 5'-ttagcttcctcagttcttccctg-3'

(SEQ ID NO: 16)

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b) Amplificación de un fragmento 674 bp del cADN BAS de cebada (GenBank Acc.-No Z34917)

BAS-sense 5'-cgcgccgcagccgagtacgac-3'

(SEQ ID NO: 17)

BAS-antisense 5'-gtcacaaaaacacatgtaacc-3'

(SEQ ID NO: 18)

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c) Amplificación de un fragmento de cADN OXLP 506 bp (GenBank Acc.-No X93171)

OXLP-sense 5'-ggccgacatgcattcaccag-3'

(SEQ ID NO: 19)

OXLP-antisense 5'-catctgatattgctgggtctg-3'

(SEQ ID NO: 20)

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d) Amplificación de un fragmento de cADN 513 bp Ubi (GenBank accession M60175)

UBI-sense 5'-ccaagatgcagatcttcgtga-3'

(SEQ ID NO: 21)

UBI-antisense 5'-ttcgcgataggtaaaagagca-3'

(SEQ ID NO: 22)

Todos los fragmentos obtenidos se ligaron en el vector pGEM-T por medio de una ligazón de saliente T y sirvieron como plásmidos de partida para la preparación de sondas (por ejemplo para Northern-Blot) o dsRNA. Las construcciones individuales llevaban la denominación pGEMT-RAC1, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

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Ejemplo 5

Análisis de Northern-Blot

Para preparar el Northern-blotting se separó el ARN en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes. Para este efecto, una parte de la solución de ARN (correspondiente a 5 \mum de ARN) se mezcló con un volumen idéntico de búfer de muestra (con bromuro de etidio), se desnaturalizó por 5 min a 94ºC, se puso en hielo por 5 min, se centrifugó brevemente y se aplicó al gel. El gel 1xMOPS (agarosa 1,5%, grado ultra puro) contenía 5% en volumen de solución concentrada de formaldehido (36,5% [v/v]). El ARN se separó por 2 horas a 100 V y se transfirió (blotted) a continuación.

El Northern-blotting se efectuó como una transferencia de ARN dirigida hacia arriba en una corriente capilar. Para esto, primero agitó suavemente el gel por 30 minutos en búfer de hidro/dihidro fosfato sódico de 25 mM (pH 6,5) y se cortó al tamaño. Se preparó un papel Whatman de tal modo que éste reposaba sobre una placa horizontal y se extendía en 2 lados en una tina con búfer de hidro/dihidro fosfato sódico de 25 mM (pH 6,5). Sobre este papel se colocó el gel y las partes no cubiertas del papel Whatman se cubrieron con una lámina de plástico. El gel se cubrió luego con una membrana de nylon cargada positivamente (Boehringer-Mannheim) y sin burbujas de aire, después de los cual se cubrió a su vez la membrana con papel absorbente en varias pilas de aproximadamente 5 cm de alto. Sobre el papel absorbente se colocó además una placa de vidrio y una pesa de 100 g. El blotting se efectuó por una noche a temperatura ambiente. La membrana se agitó suavemente por tiempo breve en agua bidestilada y se irradió con una energía lumínica de 125 mJ en el Crosslinker (Biorad) de luz UV para fijar el ARN. La verificación de la transferencia de ARN a la membrana se efectuó en el banco de luz UV.

Para detectar mARN de cebadan mRNA se separaron 10 \mug de ARN total sobre un gel de agarosa y se transfirió (blotted) mediante transferencia capilar sobre una membrana cargada positivamente. La detección se efectuó con el sistema DIG.

Preparación de las sondas: Para hibridar con los mARNs a detectar se prepararon sondas de ARN marcadas con digogygenina o fluoresceina. Estas se generaron mediante transcripción in vitro de un producto de PCR mediante una T7 p SP6 ARN polimerasa con UTPs marcados. Como patrón para la amplificación apoyada en PCR sirvieron los vectores de plásmido descritos arriba pGEMT-RAC1, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

Según la orientación del inserto se recurrió a diferentes ARN-polimerasas para generar la cadena (hebra) antisense. La T7-ARN-polimerasa se usó para pGEMT-BAS y pGEMT-OXLP, y la SP6-RNApolimerasa para pGEMT-RAC1 y pGEMT-UBI.

El inserto de los vectores individuales se amplificó mediante PCR usando primers (cebadores) estándar que flanquean (M13 fwd y rev). La reacción procedió en tal caso con las siguientes concentraciones finales en un volumen total de 50 \muL de búfer PCR (Silverstar):

M13-fwd: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

(SEQ ID NO: 23)

M13-Rev: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'

(SEQ ID NO: 24)

10% Dimetilsulfóxido (v/v)

De a 2 ng/\muL de primer (M13 forward y reversed)

1,5 mM de MgCl_{2},

0,2 mM de dNTPs,

4 unidades de Taq-polimerasa (Silverstar),

2 ng/gL de plásmido-ADN.

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La amplificación trancurrió en un Thermocicler (Perkin-Elmar 2400) con control de temperatura:

94ºC 3 min de desnaturalización

30 Ciclos con 94ºC 30 sec (desnaturalización)

58ºC 30 sec (adhesión o annealing),

72ºC 1,2 min (Extension),

72ºC 5 min extensión final enfriamiento hasta seguir procesando

4ºC

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El éxito de la reacción se verificó en un gel de agarosa al 1%. Los productos se purificaron con un "High Pure PCR-Product Purification Kit" (Boehringer-Mannheim). Se obtuvieron aproximadamente 40 \muL de eluato de columnas el cual se verificó de nuevo en el gel y se almacenó a - 20ºC.

La polimerización de ARN, la hibridación y la inmunodetección se llevaron a cabo en gran medida según indicaciones del productor del kit con respecto a la detección de ARN no radioactiva (DIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel y colaboradores (1994) Plant Physiol 106:1264-1277). 4 \mul de producto de PCR purificado se trataron con 2 \muL de búfer de transcripción, 2 \muL de mezcla de marcación NTP, 2 \muL de mezcla NTP y 10 \muL de agua DEPC. A continuación se pipetearon 2 \muL de la solución de T7-ARN-polimerasa. Luego, la reacción se llevó a cabo durante 2 h a 37ºC y después se completó el volumen a 100 \muL con agua DEPC. La sonda de ARN se detectó en el gel de bromuro de etidio y se almacenó a -20ºC.

Para la preparación de la hibridación primero se agitaron suavemente las membranas por 1 h a 68ºC en 2 x SSC (sal, citrato de sodio), 0,1% de búfer SDS (dodecilsulfato de sodio), y el búfer se renovó 2 a 3 veces. Después las membranas se aplicaron a la pared interna de tubos de hibridación precalentados a 68ºC y se incubaron por 30 min con 10 mL de búfer de hibridación Dig-Easy en la estufa de hibridación precalentada. Mientras tanto se habían desnaturalizado 10 \muL de solución de sonda en 80 \muL de búfer de hibridación a 94ºC por 5 min, después se pusieron en hielo y se centrifugaron brevemente. Para la hibridación se transfirió luego la sonda a 10 mL de búfer de hibridación calentado a 68ºC, y se reemplazó el búfer por este búfer de sonda en el tubo de hibridación. Luego, la hibridación se efectuó por una noche también a 68ºC.

Antes de la inmunodetección de híbridos ARN-ARN se lavaron los blots estrictamente dos veces respectivamente por 20 min en SDS de 0.1% (w/v), 0.1 x SSC a 68ºC.

Para la inmunodetección primero los blots se agitaron suavemente dos veces por 5 min a temperatura ambiente en 2 x SSC, SDS de 0,1%. Después se efectuaron 2 pasos de lavado estrictos a 68ºC en 0,1 x SSC, SDS de 0,1% de a 15 min. Después la solución se reemplazó con búfer de lavado sin Tween. Se agitó por 1 min y la solución se intercambió con un reactivo de bloqueo. Después de otros 30 min de agitación se adicionaron 10 \muL de solución anticuerpos -anti-fluoresceina y se agitó otros 60 min. Siguieron dos pasos de lavado cada uno de 15 minutos en búfer de lavado con Tween. La membrana se equilibró después 2 min en búfer de sustrato y se transfirió a una lámina de papel acetato después de drenar. Luego, sobre el "lado ARN" de la membrana se repartió uniformemente una mezcla de 20 \muL de CDP-Star^{TM} y 2 mL de búfer sustrato. Después de cubrió la membrana con un segundo papel acetato y se soldó en los bordes con calor de manera hermética al agua y sin burbujas de aire. Luego, en un cuarto oscuro la membrana se cubrió por 10 min con una película de rayos X y después se reveló. El tiempo de exposición varió dependiendo de la fuerza de reacción de luminiscencia.

A menos que se especifique algo diferente, las soluciones estaban contenidas en el alcance del suministro del kit (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Todas las demás se prepararon mediante dilución a partir de las siguientes soluciones de origen con agua destilada autoclavada. Todas las soluciones de origen se emplearon con DEPC (como agua DEPC), si no se especifica algo diferente y después se autoclavaron.

- Agua - DEPC: agua destilada se trató toda la noche a 37ºC con dietilpirocarbonato (DEPC, 0,1%, w/v) y a continuación se autoclavó.

- Búfer 10 x MOPS: MOPS de 0,2 M (ácido morfolin-3-propansulfónico), acetato de sodio de 0,05 M, EDTA de 0,01 M, pH ajustado a 7,0 con NaOH 10 M

- 20 x SSC (cloruro de sodio - citrato de sodio, sal-citrato de sodio): NaClo de 3 M, citrato trisódico de 0.3 M x 2 H_{2}O, pH ajustado a 7,0 con HCl de 4 M.

- 1% SDS (dodecilsulfato de sodio, sodiumdodecilsulfate) (w/v), sin DEPC

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- Búfer de muestras de ARN: 760 \muL de formamida, 260 \muL de formaldehido, 100 \muL de bromuro de etidio (10 mg/mL), 80 \muL de glicerina, 80 \muL de de bromfenol azul (saturado), 160 \muL de 10 x MOPS, 100 \muL de agua.

- 10 x búfer de lavado sin Tween: ácido maleico de 1,0 M, NaCl de 1,5 M; sin DEPC, con NaOH (sólido, cerca de 77 g) y NaOH de 10 M a pH ajustado a 7,5.

- Búfer de lavado con Tween: a partir de búfer de lavado sin Tween, con Tween (0,3%, v/v)

- 10 x reactivo de bloqueo: suspender 50 g de polvo de blocking (Boehringer-Mannheim) en 500 mL de búfer de lavado sin Tween.

- Búfer de sustrato: Tris (Trishidroximetilamino-methan) de 100 mM, NaCl de 150 mM con HCl de 4 M, ajustado el pH a 9,5.

- 10 x marcador de color: 50% de glicerina (v/v), EDTA de 1,0 mM, pH 8,0, 0,25% bromfenol azul (w/v), 0,25% xilenocianol (w/v).

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Ejemplo 6

Síntesis in vitro del dsRNA RacB

Todos los plásmidos (pGEMT-RAC1, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI) que se han empleado para la transcripción in vitro comprenden el promotor T7 y SP6 (pGEM-T, Promega) en los extremos respectivos de la secuencia de ácido nucleico insertada, lo cual hace posible la síntesis de ARN sense o antisense. Los plásmidos pueden linearizarse con enzimas adecuadas de restricción para asegurar una transcripción correcta de la secuencia de ácido nucleico insertada y evitar el repaso en secuencias vectoriales.

Para este efecto se cortaron 10 \mug de plásmido ADN con el lado del inserto ubicado de manera distal del promotor. Los plásmidos cortados se extraen en 200 \mul de agua con volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se transfieren a un nuevo recipiente de reacción de Eppendorf (libre de ARNse) y se centrifugan por 5 min a 20000 g. 180 \mul de la solución de plásmido se tratan con 420 \mul de etanol, se coloca sobre hielo y a continuación se precipita por centrifugación por 30 min a 20000 g y -4ºC. El precipitado se recogió en 10 \mul de búfer
TE.

Para la preparación del RacB-dsRNA se hizo digestión del plásmido pGEMT-Rac1 con SpeI y ARN sense se transcribió con la T7-ARN-polimerasa. Además se hizo digestión de pGEMT-Rac1 con NcoI y se transcribió ARN antisense con la SP6-ARNpolimerasa. Las ARN polimerasas se obtuvieron de Roche Molecular Biology, Mannheim, Alemania.

Cada reacción de transcripción contenía en un volumen de 40 \mul:

2 \mul de ADN plásmido linearizado (1 \mug)

2 \mul de NTPs (25 mM) (1,25 mM de cada NTP)

4 \mul de 10xbúfer de reacción (Roche Molecular Biology),

1 \mul de ARNsin ARNsin (27 unidades; Roche Molecular Biology),

2 \mul de ARN polimerasa (40 unidades)

29 \mul de agua - DEPC.

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Después de una incubación de 2 h a 37ºC se mezcló respectivamente una parte de la mezcla de reacción de la transcripción de la hebra "sense" o "anti-sense", se denaturalizó por 5 min a 95ºC y después se hibridizó ("annealing") una con otra por enfriamiento por 30 minutos a una temperatura final de 37ºC miteinander hibridisiert. De manera alterna, después de la desnaturalización la mezcla se enfría desde una hebra sense y antisense también por 30 min a -20ºC. El precipitado de proteína que haya formado durante la desnaturalización e hibridación se separa mediante centrifugación breve a 20.800 g y se usa el sobrenadante directamente para el recubrimiento de partículas de tungsteno (véase abajo). Para el análisis se separaron respectivamente 1 \mul de cada hebra de ARN y del dsRNA sobre un gel de agarosa que no se desnaturalice. Una hibridación exitosa se manifestó mediante un desplazamiento de bandas hacia un peso molecular superior en comparación con las hebras individuales.

4 \mul del dsRNA se precipitaron de etanol (por adición de 6 \mul de agua, 1 \mul de solución de acetato de sodio de 3M y 25 \mul de etanol, así como centrifugación por al menos 5 min a 20000 g y 4ºC) y se resuspendió en 500 \mul de agua. El espectro de absorción entre 230 y 300 nm se midió, o bien se determinó la absorción 280 y 260 nm, para determinar la pureza y la concentración del dsRNA. Normalmente se obtuvieron 80 a 100 \mug de dsRNA con un relación OD_{260}/OD_{280} de 1,80 a 1,95. Puede llevarse a cabo opcionalmente una digestión con DNasa I, aunque esto no influye esencialmente en los resultados siguientes.

Como dsRNA de control fungió el dsRNA del receptor de tiroides humana (vector de partida pT7betaSal (Norman C y colaboradores (1988) Cell 55(6):989-1003) puesto a disposición por el Dr. Baniahmad, Institut fuer Genetik, Gießen, Alemania; La secuencia del inserto se describe bajo el número de cuenta GenBank Acc.-No.: NM000461). Para la preparación del ARN sense-RNA se digirió el plásmido con PvuII, para generar el ARN antisense se digirió con HindIII y el ARN se transcribió luego con T7- o bien SP6 RNApolimerasa. Los pasos individuales del método para la preparación del dsRNA de control se llevan a cabo de manera análogo a los de arriba para el RacB-
dsRNA.

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Ejemplo 7

Transformación transitoria, RNAi y evaluación del desarrollo de patógenos fúngicos

Segmentos de hoja de cebada cv Pallas se transformaron junto con un vector de expresión GFP. A continuación se inocularon las hojas con Bgh y el resultado se analizó después de 48 h por medio de microscopía de luz y fluorescencia. La penetración en células que expresan GFP se evaluó mediante detección de haustorias en células vivas y por valoración del desarrollo de hongos precisamente en estas células. En todos los seis experimentos se llevó a cabo el bombardeo de cebada cv Pallas con RacB-dsRNA dio lugar a un número reducido de células exitosamente penetradas por Bgh en comparación con células que habían sido bombardeadas con un dsRNA de control (dsRNA receptor de hormona tiroides humana, TR). El efecto inductor de resistencia del dsRNA RacB causó una reducción promedio de la eficiencia de penetración por Bgh en 44% (Fig. 4).

Se ha empleado un método para la transformación transiente que ya se había descrito para la introducción biolística de dsRNA en células epidérmicas de hojas de cebada (Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P y colaboradores (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Se recubrieron partículas de tungsteno, que tenían un diámetro de 1,1 \mum (densidad de partícula 25 mg/ml), con dsRNA (véase arriba la preparación) junto con ADN-plásmido del vector pGFP (GFP bajo control del promotor CaMV ^{35}S) como marcador de transformación. Para este propósito, por disparo, se usaron las siguientes cantidades de dsRNA o de plásmido indicador para el recubrimiento: 1 \mug de pGFP y 2 \mug de dsRNA. ARN bicatenario se sintetizó mediante fusión (annealing) de ARN "sense" y "antisense" in vitro (véase arriba).

Para preparación de microcarrier (microsoporte) se lavaron 55 mg de partículas de tungsteno (M 17, diámetro 1,1 \mum; Bio-Rad, Munich) dos veces con 1 mL de agua destilada y una vez con 1 mL de etanol absoluto, se secaron y se tomaron en 1 mL de glicerina al 50% (cerca de 50 mg/ml de solución original). La solución se diluyó con glicerina al 50% hasta 25 mg/ml, se mezclo bien antes de consumir y se suspendió en el baño de ultrasonido. Para el revestimiento de microcarrier (microsoporte) se adicionaron por disparo 1 \mug de plásmido, 2 \mug de dsRNA (1 \muL), 12,5 \muL de suspensión de partículas de tungsteno (25 mg/ml), 12,5 \muL de solución a 1 M de Ca(NO_{3})_{2} (pH 10) a gotas, mezclando permanentemente, se centrifugó 10 min y se dejó reposar a temperatura ambiente, se centrifugó brevemente y se tomaron 20 \mul del sobrenadante. El residuo con las partículas de tungsteno se resuspendió (baño de ultrasonido) y se aplicó al experimento.

Se usaron segmentos de cerca de 4 cm de longitud de hojas primarias de cebada. Los tejidos se colocaron sobre 0,5% Phitagar (GibcoBRL^{TM} Life Technologies^{TM}, Karlsruhe) con 20 \mug/ml de benzimidazol en cajas de Petri (6,5 cm de diámetro) y los bordes se cubrieron inmediatamente antes del bombardeo de partículas con una plantilla provista de una abertura cuadrangular de 2,2 cm x 2,3 cm. Las cajas se pusieron una junto a la otra en el piso de la cámara de vacío (Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) sobre el cual se había metido (5 cm sobre el suelo, 11 cm por debajo del macrocarrier (macrosoporte), véase abajo) una malla de nylon (tamaño de malla 0,2 mm, Millipore, Eschborn) como difusor en una placa de agujeros con el fin de dispersar terrones de partículas y frenar la corriente de partículas. El macrocarrier (macrosoporte) (soporte de filtro estéril de plástico, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) que se pegó a la tapa de la cámara, se cargó con 5,8 \muL de partículas de tungsteno recubiertas de ADN (microcarrier o microsoporte, véase arriba) por disparo. Con una bomba de vacío de membrana (Vacuubrand, Wertheim) se redujo la presión en 0,9 bar en la cámara y las partículas de tungsteno se dispararon con presión de gas helio de 9 bar sobre la superficie del tejido vegetal. Inmediatamente después se aireó la cámara. Para marcar células transformadas las hojas se bombardearon con el plásmido (pGFP; vector a base de pUC18, CaMV casete promotor/terminador ^{35}S con gen GFP insertado; Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Puesto a disposición por el Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institut fuer Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Alemania). Antes de disparar otro plásmido, el macrocarrier (macrosoporte) se limpió minuciosamente con agua. Después de incubación de cuatro horas después del disparo en cajas de Petri ligeramente abiertas, temperatura ambiente y luz de día se inocularon las hojas con 100 conidias/mm^{2} del hongo mildiú auténtico de cebada (raza A6) y se incubaron por otras 36 a 48 h en las mismas condiciones.

Segmentos de hojas se bombardearon con las partículas recubiertas usando un "particle inflow gun" (arna de entrada de partículas). Por disparan se aplicaron 312 \mug de partículas de tungsteno. 4 h después del bombardeo se llevó a cabo la inoculación con mildiú Blumeria graminis f. sp. hordei (raza A6) y se evaluó después de otras 40 h con respecto a los síntomas de infección. El resultado (por ejemplo, la eficiencia de penetración, definida como fracción porcentual de células atacadas con haustoria madura y una hifa secundaria ("secondary elongating hifae"), se analizó por medio de microscopía de fluorescencia y de luz. Una inoculación con 100 conidias/mm^{2} da lugar a una frecuencia de ataque de aproximadamente 50% de las células transformadas. Para cada experimento individual se evaluó un número mínimo de 100 sitios de interacción. Las células transformadas (que expresan GFP) se identificaron excitando con luz azul. Pudieron distinguirse tres categorías diferentes de las células transforma-
das:

1.

Células penetradas que comprenden haustoria fácilmente reconocible. Una célula con más de una haustoria se contó como una célula.

2.

Células que fueron atacada por un apresorio fúngico pero no comprendían haustorio. Una célula que haya sido atacada varias veces pero no contiene haustoria se contó como una célula.

3.

Células que no fueron atacadas por Bgh.

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Células estomáticas y células al lado de las estomáticas se excluyeron de la evaluación. Las estructuras superficiales de Bgh se analizaron mediante microscopía de luz o coloración de fluorescencia del hongo con 0,1% Calcofluor (w/v en agua) por 30 sec. El desarrollo del hongo puede evaluarse fácilmente por microscopía de fluorescencia después de la tinturación con Calcofluor. En las células transformadas con RacB-dsRNA el hongo desarrolla en realidad una manguera de germen ("germ-tube") primaria y una de apresorio pero no una haustoria. La formación de haustoria es una condición previa para la formación de una hifa secundaria.

La eficiencia relativa de penetración (RPE) se calcula como la diferencia de la eficiencia de penetración en células transformadas (transformación con dsRNA -RacB o de control) y de la eficiencia de penetración en células no transformadas (aquí: eficiencia promedio de penetración 57%). La RPE porcentual (%-RPE) de calcula a partir de la RPE menos 1 y multiplicada por 100.

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El valor de %-RPE (desviación de la eficiencia promedio de penetración del control) sirve para la determinación de la susceptibilidad de las células que se transfectaron con dsRNA - RacB (Fig. 4).

En el caso del dsRNA de control, en cinco experimentos independientes no se observó ninguna diferencia entre la transfección con el dsRNA de control y agua con respecto a la eficiencia de penetración de Bgh.

También se estudió la desviación de la EP en diferentes genotipos. Para demostrar el enlace funcional con el gen Mlo se empleó un mlo5-genotipo (A89, mlo5 ror1, fondo: Ingrid) el cual solo tiene susceptibilidad moderada al ataque de Bgh debido a una mutación del gen Ror1 (Freialdenhoven A y colaboradores (1996) Plant Cell 8:5-14). En este genotipo doble-mutante se estudió la eficiencia del dsRNA-RacB en comparación con un genotipo Mlo de tipo silvestre. No obstante, en cinco experimentos independientes no pudo observarse impedimento alguno de la formación de haustoria en A89, mientras que la EP se redujo significativamente en experimentos paralelos con Pallas e Ingrid (Fig. 5). De manera interesante, el efecto del dsRNA-RacB fue más pronunciado en Pallas que en Ingrid (Fig. 5, experimentos 1 y 2 en comparación con 3, 4 y 5).

Para excluir una influencia sobre el dsRNA en la velocidad de transformación o rata de supervivencia de las células atacadas, se comparó el número de las células que expresan GFP entre los experimentos de dsRNA de control y RacB (Tabla 7). Los dsRNA-RacB no tuvieron ninguna influencia en el número total o el número de células que expresan GFP atacadas.

TABLA 7 Ratas de transformación en hojas de cebada después del bombardeo con dsRNA

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Ejemplo 8

Mutantes de RACB activos de manera constitutiva

Para la identificación positiva de RACB como factor de susceptibilidad se originó y se sobre-expresó un mutante activo de manera constitutiva putativa de cebada RACB (sustitución G->V en posición 15; RacB-V15) y en cebada de la variedad Pallas. Primero se sintetizó RACB full-lenght (longitud completa) por medio de RT-PCR. Para esto se emplearon los siguientes primer (cebadores) de oligonucleótido:

RacB5'BamHI : 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

(SEQ ID NO: 31).

RacB3'SalI : 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

(SEQ ID NO: 32).

El cDNA se clonó en pGEM-T y después se cortó por los sitios de escisión de los primers y se clonó en pGY-1 (Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Fig. 7) por medio de sitios de escisión de BamHI/SalI. La construcción lleva la denominación pGY1-RacB.

La secuencia de ácido nucleico que codifica para el mutante RacB activo de manera constitutiva RACB-V15 se produjo con el "Transformer®Site-Directed Mutagenesis Kit" (Clonetech, Heidelberg) según la instrucción del fabricante. Como vector de partida se empleó pGY1-RacB. Como primer de mutagénesis se usó el siguiente oligonucleotido:

V15: 5'-ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3'

(SEQ ID NO: 33).

RACB-V15 se sobre-expresó luego de manera transitoria en 5 experimentos independientes en cebada de la variedad Pallas bajo control del promotor ^{35}S CamV. Los experimentos se realizaron tal como se describe por Schultheiss y colaboradores (Schultheiss H y colaboradores (2002) Plant Phisiol 128:1447-1454) solo que después del bombardeo de partículas se esperó por 24 h en lugar de 4 h antes de la inoculación. El recubrimiento de las partículas ocurrió como se

\hbox{describe por Schweizer y
colaboradores  (Schweizer P y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe
Interact 12:647-54).}

La expresión de un mutante RacB constitutivo ocasiona una susceptibilidad elevada de manera significativa contra infestación de patógenos con mildiú de cebada en comparación con los controles. Estos resultados también prueban la función clave de RacB en la defensa ante patógenos. Los efectos de RACB-V15 (véase Fig 6-A/B) son significativos en el ensayo t (t-test), cuando se hace un ensayo emparejado de dos lados. La susceptibilidad relativa frente al patógeno fúngico se eleva en todos los casos (Fig. 6-B).

Ejemplo 9

Otros homólogos HvRac

Todas las secuencias de longitud completa se aislaron con primers (cebadores) específicos a partir de ARN y se clonaron en pGEM y se secuenciaron (Hückelhoven y colaboradores (2001) Plant Mol Biol; Schultheiss y colaboradores (2002) Plant Phisiol 128:1447-1454). Las secuencias son parcialmente muy similares a RacB.

a) HvRop6

LEFT PRIMER 5'-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3'

(SEQ ID NO: 25)

RIGHT PRIMER 5'-CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3'

(SEQ ID NO: 26)

\vskip1.000000\baselineskip

b) HvRacD

LEFT PRIMER 5'-ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3'

(SEQ ID NO: 27)

RIGHT PRIMER 5'-gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3'

(SEQ ID NO: 28)

\vskip1.000000\baselineskip

c) HvRop4

LEFT PRIMER 5'-GGATCCttctcgtccatttagccggc-3'

(SEQ ID NO: 29)

RIGHT PRIMER 5'-GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3'

(SEQ ID NO: 30)

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Producción de construcciones sense y antisense con el gen AtRacB para la expresión en Arabidopsis thaliana

Un fragmento de un homólogo de RacB de arabidopsis (MIPS-Code: AT4g35950; SEQ ID NO: 53; en lo sucesivo AtRacB) se aísla por medio de PCR de una biblioteca de cADN arabidopsis thaliana. Las secuencias de primer usadas son:

Fra 186: 5'-ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA-3'

(SEQ ID NO: 71)

Fra 187: 5'-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3'

(SEQ ID NO: 72).

La amplificación sucede en un Thermocicler T3 de la empresa Biometra con temperatura controlada: 35 ciclos con 1 min a 95ºC, 0,5 min a 59ºC y 3 min a 72ºC. Extensión de remate por 5 min a 72ºc.

El producto de PCR se clona en el vector pCR2.1 (según pCR Script Cloning Kit, empresa Stratagene, Heidelberg) según indicaciones del fabricante. Mediante la enzima de restricción EcoRI (empresa Roche, Mannheim) se corta un fragmento de la construcción de vector. El fragmento puede aislarse mediante electroforesis de gel con purificación a continuación mediante columnas de intercambio amónico (QIAex Purification Kit, empresa Qiagen, Hilden). De manera correspondiente, el vector binario pSUN3-Nit se corta mediante la enzima XmaI y EcoRI y se somete a una purificación mediante electroforesis de gel con elución a continuación mediante columnas de intercambio amónico (QIAex Purification Kit, empresa Qiagen, Hilden).

Ya que para la clonación de un inserto y un vector con extremos 5' que sobresalen deben generarse extremos rasos ("blunt ends"), tanto el fragmento eluido AtRacB como también el fragmento eluido pSUN3-Nit se tratan con 2 \muL de dNTPMix I (de a 10 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP; empresa Farmacia, Freiburg) y 1,6 \muL de fragmento de Klenow (Fabrica USB/Amersham, Braunschweig, 2 U/\mul) para completar el sobresalido y se incuban 30 min a 37ºC. Para evitar una religación primero se purifican los vectores por medio de una QIAquick Spin Column (empresa Qiagen,Hilden), se trata con CIAP (Calf Intestinal Alkaline Fosfatase, empresa GibcoBRL, Eggenstein, 1 U/\mul) y se purifica finalmente mediante gel de agarosa al 0,8%.

Para preparar la siguiente mezcla de ligación en un volumen total de 50 \mul, a los 10 \mul de ADN cortado se agregan además 34 \mul de H_{2}O, 5 \mul de búfer de ligación y 1 \mul de ligasa T4 (empresa Roche, Mannheim). Esta mezcla se incuba por una noche a 16ºC. A continuación se desactiva la ligasa a 65ºC por 10 min. A la ligación le sigue de nuevo una precipitación con 0,1 volumen de acetato de sodio (pH 5,2) y 2,5 volumen de etanol. Después de centrifugación (30 min, 15000 g, 4ºC) el pelet se seca en etanol de 70% y se re-suspende en 10 \mul de H_{2}O. 2 \mul de este pelet se transforman por electroporación (E. coli-Pulser, empresa Bio-Rad) en cepa de bacterias Escherichia coli DH5a. Placas LB, las cuales contienen el antibiótico ampicilina (50 mg/l), se laminan con las bacterias tratadas con ADN. Después de una incubación por 16 h a 37ºC se raspan las bacterias de las colonias cultivadas y se trasladan a tubos de ensayo cada uno con 3 ml de medio líquido LB-Amp. Después de una incubación de 16 ha 37ºC se centrifugan los cultivos crecidos densamente. De los pelets de bacterias se aísla ADN-plásmido mediante el kit de minioreparación de ADN QIAprep (Firma Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se somete a digestión analítica con diferentes combinaciones de enzima. Mediante esta digestión de control pueden aislarse construcciones en las que el gen AtRacB se encuentra clonado en orientación sense o antisense detrás del gen nitrilase-1 (nit1) de A. thaliana, activo de modo constitutivo en plantas (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nucleótido 2456-4340, Hillebrand y colaboradores (1996) Gene 170:197-200). Estas construcciones se denominan pSUN3NITAtRacBs (SEQ ID NO: 73) y pSUN3NIT atRacBas (SEQ ID NO: 74) y se usan para la transformación de plantas de arabidopsis. Las construcciones comprenden la secuencia completa de AtRacB, de tal modo que el vector de expresión pSUN3NITHvRacBs, el cual contiene el fragmenteo en orientación sense, es capaz de expresar una proteína At funcional. El vector sirve de manera primaria como control negativo y en la mayoría de los casos da lugar a una resistencia reducida frente a patógenos, aunque en algunos casos (véase abajo) también a un incremento de la resistencia frente a patógenos, probablemente por un efecto de co-supresión.

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Ejemplo 11

Preparación de construcciones sense y antisense con el gen HvRacB para la expresión en Arabidopsis thaliana

Del gen HvRacB deben producirse diversos fragmentos no funcionales para la expresión en arabidopsis-Pflanzen. Para este fin, se digiere el plásmido, que contiene el gen HvRacB subclonado en el vector bacteriano pGEMT, con las combinaciones de enzimas BamHI/HindIII (empresa Roche, Mannheim). Mediante un tratamiento con la polimerasa Klenow en presencia de una mezcla de nucleótidos (véase arriba) se completan hebras individuales 5' que sobresalen. El fragmente HvRacB resultante con estos extremos romos se clona directamente en un vector pSUN3NIT el cual se abre con las enzimas BglII und SpeI (empresa Roche, Mannheim) en su Multiple Cloning Site y sus extremos sobresalientes 5' se completan mediante tratamiento con polimerasa Klenow (tal como se describe arriba). Para las mezclas de ligación respectivamente en un volumen total de 50 \mul, se adicionan a los 10 \mul de ADN cortado, 34 \mul de H_{2}O, 5 \mul de búfer de ligación y 1 \mul de ligasa T4 (empresa Roche, Mannheim). Esta mezcla se incuba por una noche a 16ºC. A continuación de desactiva la ligasa a 65ºC por 10 min. Después de la ligación sigue de nuevo una precipitación con 0,1 volumen de acetato de sodio (pH 5,2) y 2,5 volumen de etanol. Después de la centrifugación (30 min, 15000 g, 4ºC) se seca el pelet en 70% de etanol y se resuspende en 10 \mul de H_{2}O. 2 \mul de este pelet se transforman por electroporación (E. coli-Pulser, empresa Bio-Rad) en bacterias de Escherichia coli cepa DH5a. LB-placas se laminan con las bacterias tratadas con el ADN que contienen el antibiótico ampicilina (50 mg/l). Después de una incubación por 16 h a 37ºC se raspan bacterias de las colonias crecidas y se transfieren respectivamente a tubos de ensayo con 3 ml de medio líquido LB-Amp. Después de una incubación de 16 h a 37ºC se centrifugan los cultivos crecidos densamente. De los peletes de las bacterias se aisló ADN-plásmido mediante el kit de minipreparación de ADN QIAprep (empresa Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se sometió a digestión analítica con diversas combinaciones de enzimas. Mediante esta digestión de control pueden identificarse construcciones en las que la construcción correspondiente de gen se encuentra clonado en orientación sense o antisense detrás del promotor, activo de manera constitutiva en plantas, del gen nitrilasa-1 de A. thalina (véase arriba). Estas construcciones se denominan pSUN3NITHvRacBs (SEQ ID NO: 75) y pSUN3NITHvRacBas (SEQ ID NO: 76) y se usan para la transformación de plantas de arabidopsis. Los constructos comprenden un fragmento truncado de hvRacB, de modo que el vector de expresión que contiene el fragmento en orientación sense, tampoco es capaz de expresar una proteína funcional HvRacB. El vector sirve de manera primaria como control negativo pero también da lugar en algunos casos (véase abajo) a un incremento de la resistencia frente a patógenos supuestamente mediante un efecto de
co-supresión.

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Ejemplo 12

Transformación de Arabidopsis thaliana y análisis de la resistencia ante hongos

Plantas de A. thaliana de tipo silvestre (Columbia) se vuelven con la cepa Agrabacterium tumefaciens (EHA105) con base en un método modificado (Steve Clough y Andrew Bent (1998) Plant J 16(6):735-743) del método de infiltración al vacío según Bechtold y colaboradores (Bechtold N y colaboradores (1993) CR Acad Sci Paris, Life Sciences 316:1194-1199).

Las células A. tumefaciens usadas se transforman previamente con con los plásmidos pSUN3NITAtRacB_s (SEQ ID NO: 73), pSUN3NITatRacB_as (SEQ ID NO: 74), pSUN3NITHvRacB_s (SEQ ID NO: 75) y pSUN3NITHv
RacB_as como (SEQ ID NO: 76).

Semillas de los transformantes primarios de Agrobacterium transformada se seleccionan sobre la base de su resistencia a kanamicina. Las plántulas resistentes a antibióticos se plantan en tierra y cuando ya han crecido para ser plantas desarrolladas, se usan para análisis bioquímico.

Para analizar la resistencia de las plantas transgénicas Arabidopsis frente a hongos patógenos, se realizan inoculaciones con los hongos biotrópicos Peronospora parasitica y Erysiphe cichoracearum.

\vskip1.000000\baselineskip

a)Peronospora parasitica

Plantas de 5 a 8 semanas de edad se aspergen con una suspensión de esporas de conidias (cerca de 106 esporas/ml). Las plantas inoculadas se mantienen por una noche en un refrigerador a aproximadamente 16ºC tapadas con una bolsa plástica, en la oscuridad y en condiciones de humedad. Después de un día se abre un poco la bolsa de plástico y más tarde se retira completamente. Seis días después de la inoculación las plantas se cubren de nuevo por una noche con la bolsa plástica con lo cual se induce la esporulación. Al día siguiente, se examinan las hojas para la aparición de conidioforas. El crecimiento intercelular del hongo conduce a la inducción de clorosas débiles en los siguientes días hasta necrosis severa en las hojas. Estos síntomas se cuantifican y se verifican en su importancia.

\vskip1.000000\baselineskip

b)Erysiphe cichoracearum

El hongo mildiú biotrófico se cultiva en plantas de Arabidopsis. Para infectar las plantas transgénicas que expresan RacB, de 4 semanas de edad, se retiran conidioforas de la superficie de la hoja con un cepillo fino y se aplica a las hojas de las plantas transgénicas. Las plantas se incuban por 7 días a 20ºC. 7 días después de la inoculación aparecen las conidioforas (portadores de conidias) en las hojas y pueden observarse clorosas y necrosas durante los días siguientes. Estos síntomas se cuantifican y se ensayan para evaluar su importancia.

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c) Resultados

Las plantas Arabidopsis transgénicas que expresan secuencias antisense para AtRacB o HvRacB muestran una resistencia significativamente elevada tanto frente a Peronospora parasitica como también frente a Erysiphe cichoracearum en comparación con las plantas no transgénicas de tipo silvestre.

Las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan las secuencias sense para la AtRacB completa muestran en la mayoría de los casos una susceptibilidad significativamente elevada tanto frente a Peronospora parasitica como también frente a Erysiphe cichoracearum en comparación con plantas no transgénicas de tipo silvestre. Aunque en algunos casos también se observa una resistencia elevada (probablemente por un efecto de co-supresión).

Las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan las secuencias sense para el fragmento de HvRacB muestran en algunos casos una resistencia significativamente elevada tanto frente a Peronospora parasitica como también frente a Erysiphe cichoracearum en comparación con plantas no transgénicas de tipo silvestre.

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<110> BASF Plant Science GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevas secuencias de ácido nucleico y su uso en método para lograr una resistencia a patógenos en vegetales.

\vskip0.400000\baselineskip

<130> NAE 369/02/NAE 761/01 AT

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 857

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (90)..(680)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (158)..(748)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (398)..(988)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante negativo domintante de proteína RacB de cebada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutación Thr/Asn para fenotipo negativo dominante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante negativo domintante de proteína RacB de arroz

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITE

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<222> (20)

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<223> Mutación Thr/Asn para fenotipo negativo dominante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutación Thr/Asn para fenotipo negativo dominante

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante negativo domintante de proteína RacB de maíz

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccgatg agcgcgtcca ggtt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgaccttc gcccttgttc tttgtc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgggcacat agtcggtggg gaaggt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgactggagc acgaggacac tga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacactgac atggactgaa ggagta

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcatcaag tgcgtcaccg tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagcttcct cagttcttcc ctg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgccgcag ccgagtacga c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcacaaaaa cacatgtaac c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgacatg cattcaccag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catctgatat tgctgggtct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagatgca gatcttcgtg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgcgatag gtaaaagagc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagct atgaccatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggaggcgc ggcgaga

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgcttca tctccatagt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcccgat tccatcagga aagcat

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgacgcga gacactgcaa aacaaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccttct cgtccattta gccggc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgactgat cacttgaagc atgccag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccgatg agcgcgtcca ggtt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgaccttc gcccttgttc tttgtc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtggggg acgtcgccgt cggcaagac

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 721

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38)..(673)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (Rop6)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(657)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (RacD)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 677

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(665)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (Rop4)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 945

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)..(672)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (Rop6)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 850

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)..(702)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (RACDP/RACD)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (169)..(813)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (Rop4)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\hskip0,8cm

36

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (190)..(831)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (RacA)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip0,8cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 901

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscfeature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(901)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB (RacA)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 594

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(591)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 594

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(591)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 594

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(591)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(588)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(594)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 588

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(585)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 606

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\hskip0,7cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 606

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 648

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(645)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 630

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(627)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 600

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(597)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para homólogo RacB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgagcgcgt ccaggttcat a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcaaacacg cccttcacgt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10828

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión transgénica pSUN3NITAtRacBs para expresión de ARN sentido RacB de A-thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\hskip0,8cm

69

\hskip0,8cm

70

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10828

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión transgénica pSUN3NITAtRacBs para expresión de ARN antisentido RacB de A-thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\hskip0,8cm

73

\hskip0,8cm

74

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10036

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión transgénica pSUN3NITHvRacBs para expresión de fragmento de ARN sentido RacB de cebada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\hskip0,8cm

77

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10036

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión transgénica pSUN3NITHvRacBs para expresión de fragmento de ARN antisentido RacB de cebada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\hskip0,8cm

80

\hskip0,8cm

81

\hskip0,8cm

82

Claims (14)

1. Método para lograr o incrementar la resistencia frente a al menos un patógeno en vegetales caracterizado porque comprende los siguientes pasos de proceso

a)

Reducción de la cantidad de proteína, actividad o función de una proteína RacBs en un vegetal o un tejido, órgano, parte o célula del mismo y

b)

selección de los vegetales en los que, a diferencia o en comparación con la planta de partida, existe o se ha incrementado la resistencia frente a al menos un patógeno.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína RacB se selecciona del grupo de las proteínas compuesto de

a)

un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, y

b)

un equivalente funcional de un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el equivalente funcional tiene una homología de al menos 64% con uno de los polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el cual el equivalente funcional tiene una homología de al menos 90% con uno de los polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la proteína RacBs se asegura mediante la aplicación de un método seleccionado del grupo compuesto de

a)

Introducción de una secuencia de ARN RacB bicatenario de ácido nucleico (RacB-dsRNA) o de un casete de expresión, o de casetes de expresión, que garantiza(n) su expresión,

b)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico antisense RacB o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

c)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico antisense RacB combinada con una ribozima o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

d)

Introducción de secuencias de ácido nucleico sense RacB para la inducción de una co-supresión o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

e)

Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína EacB dominante-negativa o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

f)

Introducción de factores enlazantes de ADN o de proteína frente genes, ARNs o proteínas de RacB o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

g)

Introducción de la secuencia viral de ácido nucleico que causa degradación de ARN RacB y de constructos de expresión o de un casete de expresión que garantiza su expresión,

h)

Introducción de construcciones para la inducción de una recombinación homóloga de genes RacB endógenos e

i)

introducción de mutaciones a un gen endógeno RacB.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende

(a)

la transformación estable de una célula vegetal con un casete de expresión recombinante que contiene en conexión funcional con un promotor activo en vegetales una secuencia de ácido nucleico que codifica para

a)

una secuencia de ácido nucleico de ARN RacB bicatenaria o

b)

secuencia de ácido nucleico antisense RacB, o

c)

una secuencia de ácido nucleico antisense RacB combinada con una ribozima o

d)

una secuencia de ácido nucleico sense RacB para la inducción de una co-supresión o

e)

una proteína RacB dominante-negativa

f)

factores que enlazan ADN o proteína frente a genes, ARNs o proteínas de RacB

g)

la secuencia de ácido nucleico viral que causa la degradación de ARN RacB

(b)

Regeneración de las plantas de la célula vegetal, y

(c)

Expresión de dicha secuencia de ácido nucleico en una cantidad y por un tiempo suficiente para generar o incrementar una resistencia a patógenos en dicha planta.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el patógeno se selecciona del grupo que se compone de bacterias, hongos, insectos, viruses y nematodos.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el patógeno se selecciona del grupo de los hongos que se compone de Plasmodioforamycota, Oomycota, Ascomycota, Chitridiomyceten, Zygomycetes, Basidiomycota y Deuteromycetes.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el vegetal se selecciona de las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el vegetal se selecciona del grupo que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, triticale, espelta, linaza o caña de azúcar.

11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína RacB de cebada es una según SEQ ID NO: 2.

12. Método según una de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizado porque la variante dominante negativa según la reivindicación 6 se describe por la SEQ ID NO: 7.

13. Organismo vegetal transgénico o una célula, cultivo celular, un tejido, una parte o material de propagación de éste, obtenido según un método según las reivindicaciones 1 a 12.

14. Organismo vegetal transgénico según la reivindicación 13 en el que el vegetal se selecciona del grupo de los vegetales que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, triticale, espelta, linaza, caña de azúcar, colza, canola, berro, arabidopsis, variedades de col, soya, alfalfa, arvejas, frijol, maní, patata, tabaco, tomate, berenjenas, pimentón, girasol, tagetes, lechuga, caléndula, melón, calabaza y calabacín.