PL206304B1 - Sposób uzyskiwania lub zwiększania oporności na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy u roślin, transgeniczna roślina, komórka, hodowla komórkowa, tkanka i otrzymany z nich materiał reprodukcyjny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania lub zwiększania oporności na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy u roślin poprzez zmniejszenie ilości, aktywności lub funkcji białka RacB w roślinie lub jego funkcjonalnego odpowiednika oraz dobór tych roś lin, u których w przeciwieństwie lub w porównaniu do rośliny oryginalnej jest zwiększona oporność na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy. Przedmiotem wynalazku jest również transgeniczna roślina, komórka, hodowla komórkowa, tkanka i otrzymany z nich materiał reprodukcyjny.

Celem biotechnologii roślin jest wytworzenie roślin posiadających korzystne nowe właściwości, na przykład umożliwiające zwiększenie plonów rolniczych, poprawienie jakości artykułów żywnościowych lub produkowanie określonych związków chemicznych lub środków farmaceutycznych (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51: 487-96). Naturalne mechanizmy obrony roślin przed czynnikami chorobotwórczymi są często niewystarczające. Same choroby grzybicze powodują roczne straty w plonach rzędu wielu miliardów dolarów amerykańskich. Wprowadzenie obcych genów pochodzących ze źródeł roślinnych, zwierzęcych lub mikrobiologicznych może zwiększyć mechanizmy obronne. Przykładem jest ochrona tytoniu przed utratą plonów spowodowaną przez owady poprzez ekspresję endotoksyn Bacillus thuringiensis pod kontrolą promotora 35S CaMV (Vaeck i wsp. (1987) Nature 328:33-37) lub ochrona tytoniu przed zakażeniem grzybiczym poprzez ekspresję chitynazy z fasoli pod kontrolą promotora CaMV (Broglie i wsp. (1991) Science 254:1194-1197). Jednakże w większości przykładów opisuje się tylko oporność na jeden czynnik chorobotwórczy lub ich wąskie spektrum.

Istnieje tylko kilka przykładów, w których nadano oporność roślinom na szersze spektrum czynników chorobotwórczych, w szczególności na grzybicze czynniki chorobotwórcze. W systemowej oporności nabytej (SAR) - mechanizmie obronnym różnorodnych oddziaływań roślina czynnik chorobotwórczy mogą pośredniczyć endogenne substancje przekaźnikowe takie jak jasmonian (JA) lub kwas salicylowy (SA) (Ward i wsp. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes i wsp. (1992) Plant Cell 4(6):645-656). Podobne efekty mogą być także uzyskane poprzez zastosowanie syntetycznych związków takich jak kwas 2,6-dichloroizonikotynowy (INA) lub S-metylo benzo(1,2,3)tiadiazolo-7-tiokarboksylan (BTH; Bion^®) (Friedrich i wsp. (1996) Plant J 10(l):61-70; Lawton i wsp. (1996) Plant J. 10:71-82). Ekspresja białek związanych z patogenezą (PR), która wzrasta w systemowej oporności nabytej (SAR), może także w niektórych przypadkach spowodować oporność na czynnik chorobotwórczy.

W przypadku ję czmienia, opisano locus Mlo, które dział a w pewnym okresie, jako negatywny regulator procesu obronnego rośliny. Utrata genu Mlo lub utrata jego funkcji powoduje zwiększoną i przede wszystkim niespecyficzną w stosunku do szczepu oporność na przykład na dużą liczbę pleś ni (Bijschges R i wsp. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF i wsp. (1995) Plant Pathol 44:786-790). Fenotyp Mlo jest dziedziczony recesywnie, co także wskazuje na jego funkcje jako genu wrażliwości. Odmiany jęczmienia pozbawione genu Mlo, uzyskane metodami konwencjonalnego krzyżowania, są już szeroko stosowane w rolnictwie. Chociaż te odmiany są intensywnie uprawiane, wykazano nadzwyczajną trwałość tej oporności, prawdopodobnie spowodowaną recesywnością genu Mlo. Jak dotąd nie zaobserwowano przełamanie tej oporności. Oporności innych roślin podobne do oporności spowodowanej utratą genu Mlo, zwłaszcza w gatunkach zbóż, nie zostały dotąd opisane, pomimo że pszenica, żyto i inne zboża są także atakowane przez podobne pleśniowe czynniki chorobotwórcze. W przypadku pszenicy może to być spowodowane na przykład obecnością heksaploidalnego genomu, co czyni identyfikację mutantów, u których nastąpiła inaktywacja wszystkich sześciu kopii genu, niezwykle trudną.

Gen Mlo został sklonowany dopiero ostatnio (Bijschges R i wsp. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). W wyniku tego wyizolowano różne geny homologiczne z innych gatunków zbóż. Zostały opisane różne metody uzyskiwania oporności na czynniki chorobotwórcze z użyciem tych genów (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552). Oporność roślin typu Mlo na pleśniowe czynniki chorobotwórcze przejawia się w dwóch ważnych aspektach, dotyczących oporności na wnikanie poprzez zamknięcie się ściany komórkowej (ang. cell wali apposition - CWA) w miejscu spodniego wnikania w ścianie komórkowej epidermy. Rozprzestrzenianie się tego grzybiczego czynnika chorobotwórczego jest prawie wyłącznie ograniczone do tej subkomórkowej struktury (Jorgensen JH i Mortensen K (1977) Phytopathology 67:678-685; Freialdenhoven A i wsp. (1996) Plant Cell 8:5-14). Reakcja ta jest spowodowana przez geny Ror1 i Ror2, które są wymagane do zaistnienia efektu genu Mlo (Peterhansel C i wsp. (1997) 9:1397-1409). Niekorzystne

PL 206 304 B1 w opornoś ci na czynniki chorobotwórcze typu Mlo jest to, ż e roś liny pozbawione genu Mlo, nawet w nieobecnoś ci czynnika chorobotwórczego, uruchamiają mechanizmy obronne, które przejawiaj ą się w spontanicznym obumieraniu komórek li ś ci (Wolter M i wsp. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128). Kolejną, wadą jest to, że genotypy pozbawione genu Mlo są nadwrażliwe na hemibiotroficzne czynniki chorobotwórcze takie jak Magnaporte grisea (M. grisea) i Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J i wsp. (2001) Phytopathology 91:127-133). Dlatego też gen Mlo wydaje się być negatywnym regulatorem śmierci komórki. Ponownie przyczyną tego jest prawdopodobnie indukcja śmierci komórki przy braku genu Mlo, który powoduje wzrost wrażliwości na te nekrotroficzne czynniki chorobotwórcze. Ten ambiwalentny efekt, który ogranicza zastosowanie biotechnologiczne genu Mlo, jest prawdopodobnie spowodowany tym, że grzyby nekrotroficzne są zdolne do bardziej wyrazistego wykorzystania roślin HR - gospodarzy pozbawionych genu Mlo - w procesie infekcji. Korzystna byłaby oporność podobna do oporności związanej z brakiem genu Mlo, lecz pozbawiona efektu indukcji śmierci komórkowej.

Białka Rho, Rac i Cdc42 należą do rodziny małych białek G wiążących GTP (guanozynotrifosforan) i jako molekularne przełączniki regulują wiele wewnątrzkomórkowych procesów, zarówno u organizmów roślinnych jak i zwierzęcych. Jako składniki szlaków transdukcji sygnału, odgrywają ważną rolę w przetwarzaniu sygnałów zewnątrzkomórkowych, na przykład regulują oksydazę NADPH i w ten sposób uwolnienie reaktywnych cząstek tlenu (wybuch oksydacyjny). Zwierzę ce lub ludzkie białko Rac1 pełni zasadniczą rolę w tworzeniu aktywnej formy kompleksu oksydazy NADPH, co z kolei powoduje utworzenie ponadtlenku, w ten sposób przyczyniając się do obrony rośliny (Irani K i Goldschmidt-Clermont PJ (1998) Biochem Pharmacol 55: 1339-1346). U roślin i zwierząt występują analogiczne funkcje obronne (Kwong i wsp. (1995) J Biol Chem 270(34): 19868-19872; Dusi i wsp. (1996) Biochem J 314:409-412; Diekmann i wsp. (1994) Science 265:531-533; Purgin i wsp. (1997) The Plant Cell 9:2077-2091; Kleinberg i wsp. (1994) Biochemistry 33:2490-2495; Prigmore i wsp. (1995) Journal of Biol Chem 27(18): 10717-10722; Irani i wsp. (1997) Science 275:1649-1652; Low i wsp. (1994) Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions 3:361-369 (1994) ed. MJ Daniels, Kluwer Acadmic Publishers, Netherlands; Mehdy i wsp. (1994) Plant Physiol 105: 467-472; Sundaresan i wsp. (1996) Biochem J 318:379-382). Ponadto białka wiążące GTP odgrywają rolę w przebudowie cytoszkieletu i w transformacji komórki (Symon M. (1996) TIBS 21: 178-181), a takż e w aktywacji transkrypcji (Hill i wsp. (1995) Cell 81:1159-1170; Chandra i wsp. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:13393-13397).

U roś lin wystę puje znaczna rodzina białek Rac-podobnych (Winge i wsp. (1997) Plant Mol Biol 35:483-495), która jest także określana jako rodzina Rop (Lin i wsp. (1997) The Plant Cell 9:1647-1659). U roślin białka Rac wydają się spełniać funkcję w uwalnianiu reaktywnych form tlenu, powstałych w następstwie infekcji czynnikami chorobotwórczymi (Groom QJ i wsp. (1996) Plant J 10: 515-522; Hassanain HH i wsp. (2000) Biochem Biophys Res Commun 272(3):783-788; Ono E i wsp. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 759-764). Białko Rac moduluje między innymi architekturę ściany komórkowej, szlaki przekazywania sygnału w merystemie i obronę przed czynnikami chorobotwórczymi (Valster AH i wsp. (2000) Trends Cell Biol 10(4): 141-146). Nadekspresja konstytutywnie aktywnej formy białka Rac1 z ryżu indukuje nadwrażliwą odpowiedź (HR) w miejscach ataku M. grisea, powodując w ten sposób oporność na czynnik chorobotwórczy. Analogicznie ekspresja dominującej negatywnej formy białka Rac1 powoduje zwiększoną wrażliwość na infekcję M. grisea (Kawasaki T i wsp. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:10922-10926; Ono E i wsp. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 759-764). Te wyniki badań sugerują, że nadekspresja białek Rac w roślinie może powodować korzystne efekty w kontekście obrony rośliny.

Dokument patentowy WO 00/15815 opisuje pięć genów Rac pochodzących z kukurydzy. Pomimo tego, że opisano sposoby, zarówno na zwiększenie jak i obniżenie poziomu białek Rac, oraz że spekuluje się ich znaczenie w kontekście uzyskania oporności na czynniki chorobotwórcze (str. 55/ w. 25 i kolejne), tylko techniczny opis, który opisuje ich zastosowanie, w rzeczywistości dotyczy w niewielkim stopniu nadekspresj i zastrzeż onych genów Rac do uzyskania oporności na czynnik chorobotwórczy (str. 60/ w. 21 i kolejne). Autor postuluje całkiem jednoznacznie i w zgodności ze stanem techniki (str. 60/ w. 31 i kolejne): W ten sposób obecny wynalazek jest użyteczny w ochronie roślin przed czynnikami chorobotwórczymi. Od momentu, gdy roślina jest stransformowana sekwencją polinukleotydową kodującą polipeptyd Rac, ekspresja polipeptydu w roślinie nadaje jej oporność na infekcję roślinnymi czynnikami chorobotwórczymi.. Racjonalne podstawy przemawiające za tą hipotezą (obrona rośliny poprzez reaktywne formy tlenu) są wyjaśnione poniżej i poparte

PL 206 304 B1 dużą liczbą cytowań. Poza tym, nie wprowadzono żadnego rozróżnienia między pięcioma zastrzeżonymi genami Rac.

Przedmiotem obecnego wynalazku są nowe sposoby obrony roślin przed czynnikami chorobotwórczymi, które powodują skuteczną obronę przed szerokim spektrum czynników chorobotwórczych, u możliwie duż ej liczby gatunków roślin, korzystnie u roślin uprawnych wykorzystywanych w rolnictwie. Wykazano, że przedmiot ten może być osiągnięty poprzez zastosowanie sposobu według wynalazku.

Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania lub zwiększania oporności na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy u roślin, który obejmuje następujące etapy:

i) zmniejszenie ilości, aktywności lub funkcji białka RacB w roślinie lub jej tkance, organie, części lub komórce, oraz ii) dobór tych roślin, u których, w przeciwieństwie lub w porównaniu do rośliny oryginalnej, jest zwiększona oporność na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy, przy czym zmniejszenie ilości, aktywności lub funkcji białka RacB zapewnia się przy pomocy sposobu wybranego z grupy obejmującej:

a) wprowadzenie dwuniciowej sekwencji RacB kwasu nukleinowego RNA (RacB dsRNA) lub kasety(kaset) ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

b) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

c) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w kombinacji z rybozymem lub kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

d) wprowadzenie sensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w celu wywołania kosupresji lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

e) wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej dominującego-negatywnego mutanta białka RacB lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

f) wprowadzenie czynników wiążących DNA lub białka, skierowanych przeciwko genom RacB, sekwencjom RNA genu RacB lub białkom RacB albo kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

g) wprowadzenie wirusowych sekwencji kwasu nukleinowego i konstruktów ekspresyjnych powodujących degradację RNA RacB albo kasety ekspresyjnej umożliwiającej ich ekspresję,

h) wprowadzenie konstruktów wywołujących homologiczną rekombinację endogennych genów RacB, oraz

i) wprowadzenie mutacji do endogennego genu RacB.

W korzystnym wariancie sposobu biał ko RacB dobiera się z grupy biał ek obejmują cej:

a) polipeptydy określone przez Sekw. Nr 2, 4, i 6 oraz

b) funkcjonalne odpowiedniki polipeptydów określonych przez Sekw Nr 2, 4, i 6.

W kolejnym korzystnym wariancie sposobu wedł ug wynalazku funkcjonalny odpowiednik posiada przynajmniej 64% homologii z jednym z polipeptydów określonych przez Sekw Nr 2, 4, i 6.

Następny korzystny wariant sposobu według wynalazku obejmuje: (a) stabilną transformację komórki roślinnej rekombinowaną kasetą ekspresyjną zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą • dwuniciową sekwencję RacB kwasu nukleinowego RNA, lub • antysensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego, lub • antysensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego w kombinacji z rybozymem, lub • sensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego wywołującą kosupresję, lub • dominują cego-negatywnego mutanta biał ka RacB, lub • czynniki wiążące DNA lub białka skierowane przeciwko genom RacB, sekwencjom

RNA RacB lub białkom RacB • wirusowe sekwencje kwasów nukleinowych powodują ce degradację RNA RacB w funkcjonalnym połączeniu z promotorem, który jest aktywny w roślinach, (b) odtworzenie rośliny z komórki roślinnej, oraz (c) ekspresję omawianej sekwencji kwasu nukleinowego w ilości i przez okres wystarczający do wytworzenia lub zwiększenia oporności na czynnik chorobotwórczy w omawianej roślinie.

W innym korzystnym wariancie sposobu czynnik chorobotwórczy wybiera się z grupy obejmują cej bakterie, grzyby, owady, wirusy i nicienie.

W jeszcze innym korzystnym wariancie sposobu czynnik chorobotwórczy wybiera się z grupy grzybów obejmujących Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycota i Deuteromycetes.

PL 206 304 B1

W dalszym korzystnym wariancie sposobu roślinę wybiera się z jednoliściennych i dwuliś ciennych.

W kolejnym korzystnym wariancie sposobu roślinę wybiera się z grupy roś lin jednoliściennych obejmujących pszenicę, owies, proso, jęczmień, żyto, kukurydzę, ryż, grykę, sorgo, pszenżyto, pszenicę orkisz, len lub trzcinę cukrową.

W jeszcze innym korzystnym wariancie sposobu sekwencja aminokwasów biał ka RacB z ję czmienia odpowiada Sekw. Nr 2.

Przedmiotem wynalazku jest również transgeniczna roślina oraz otrzymane z niej fragmenty, charakteryzująca się tym, że jest otrzymana zgodnie z powyżej określonym sposobem.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna komórka oraz otrzymane z niej fragmenty i inne rodzaje komórek roś linnych charakteryzujące się tym, ż e są otrzymane zgodnie z powyż ej określonym sposobem.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna hodowla komórkowa oraz otrzymane z niej fragmenty charakteryzujące się tym, że są otrzymane zgodnie z powyżej określonym sposobem.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna tkanka oraz otrzymane z niej fragmenty charakteryzująca się tym, że jest otrzymana zgodnie z powyżej określonym sposobem określonym.

Przedmiotem wynalazku jest także materiał reprodukcyjny charakteryzujący się tym, że jest otrzymany z powyżej określonej transgenicznej rośliny, komórki, hodowli komórkowej lub tkanki.

W korzystnym wariancie wynalazku transgeniczna roś lina charakteryzuje się tym, ż e jest wybrana z grupy roślin obejmującej pszenicę, owies, proso, jęczmień, żyto, kukurydzę, ryż, grykę, sorgo, pszenżyto, pszenicę orkisz, len, trzcinę cukrową, rzepak, rzepak canola, rzeżuchę, Arabidopsis, kapusty, soję, lucernę, groszek, fasolę, orzech ziemny, ziemniak, tytoń, pomidor, bakłażan, paprykę, słonecznik, Tagetes, sałatę, Calendula, melon, dynię/kabaczek i cukinię.

Nieoczekiwanie, homolog genu Rac - gen RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare) (Sekw. Nr 1) (dalej w opisie określany jako hvRacB), pomimo dużej zgodności z genem Rac1 z ryżu, reguluje w sposób negatywny proces infekcji mączniakiem prawdziwym jęczmienia Blumeria (syn. Erysiphe) graminis f.sp. hordei (Bgh). W przeciwieństwie do genu poprzedniego, obniżenie ekspresji genu hvRacB w komórkach epidermy przy użyciu specyficznej sekwencji RNA interferującego - dwuniciowego dsRNA homologicznego do hvRacB (wyciszanie genu) znacząco zapobiega rozwojowi haustorii (ssawek), spowodowanemu infekcją przez Bgh. W kolejnych doświadczeniach wykazano (por. przykład 7), że fenotypu tego nie można zaobserwować u mutanta o genotypie mlo5-ror1, nazwanego jęczmień A89. To sugeruje, że gen RacB jest związany funkcjonalnie z Mlo lub Ror albo z oboma, co prawdopodobnie oznacza, że działają one w kaskadzie przekazywania sygnału.

Podobnie jak w przypadku genu Mlo, utrata funkcji genu HvRacB nadaje szeroką oporność na różne Blumeria graminis f.sp. hordei. W doświadczeniach z przejściowym wyciszeniem ekspresji genu HvRacB następuje obniżenie wydajności wnikania (rozwój haustoriów) Bgh o 44% (por. przykład 7), wynik, którego wielkość jest porównywalna z efektem uzyskanym przy użyciu dsRNA genu Mlo (Schweizer P i wsp. (2000) Plant J 24:895-903). W odmianie jęczmienia o niezmienionym genotypie Ingrid wniknięcie grzyba na poziomie w przybliżeniu 60% powoduje rozwój haustoriów, podczas gdy poziom wnikania u BCIngrid mlo5 jest praktycznie na poziomie 0%. Odmiana jęczmienia A89 (podwójny mutant mlo ror1) wykazuje wydajność wnikania na poziomie w przybliżeniu od 20 do 35%. Nie obserwowano zmian w ekspresji RacB spowodowanych szczepieniem Bgh w żadnym wariancie (por. przykład 7, fig. 3). Fakt, że wnikanie na poziomie w przybliżeniu 50% może być obserwowane nawet u wra ż liwych na czynnik chorobotwórczy odmian o niezmienionym genotypie, takich jak Pallas lub Ingrid, może być związany z podstawową, stale obecną opornością.

Interesująco, wyciszenie ekspresji genu hvRacB zwiększa jedynie zamknięcie się ściany komórkowej, ale najwidoczniej nie zwiększa spontanicznej śmierci komórkowej rośliny, odmiennie do genu Mlo. W ten sposób HvRacB różni się od OsRac1, który jest homologiem genu Rac1, pochodzącym z ryżu. (Ono E i wsp. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 759-764). HvRacB działa w głównej mierze hamująco na zamknięcie się ściany komórkowej. Ta różnica jest niezwykle ważna w związku z jego zastosowaniem do uzyskania oporności na czynniki chorobotwórcze u roślin. Jak opisano powyżej, oporność typu Mlo na biotroficzne grzyby (na przykład grzyby pleśniowe) jest rzeczywiście spowodowana, między innymi, wzrostem zamykania się ściany komórkowej, ale jej wadą jest zwiększona wrażliwość na grzyby nekrotroficzne (Jarosch B i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J i wsp. (2001) Phytopathology 91:127-133). W związku z tym, że HvRacB wpływa jedynie na zamknięcie się ściany komórkowej problem ambiwalentnej oporności może zostać ominięty.

PL 206 304 B1

W zwią zku z powyż szymi obserwacjami RacB musi być rozważ any jako kluczowy element skutecznego wniknięcia czynnika chorobotwórczego takiego jak Bgh do komórki roślinnej. Zgodnie z tym, sposób według wynalazku posiada wszystkie korzystne właściwości występujące przy braku genu Mlo, jednocześnie nie posiadając jego największego ograniczenia, czyli cechy zwiększania spontanicznej śmierci komórkowej.

Ponadto, sposób ten przewyższa wszystkie te sposoby, w których fenotyp oporny na czynniki chorobotwórcze jest realizowany przez nadekspresję białka nadającego oporność. Wyłączenie genu może być zrealizowane bez ekspresji (obcego) białka. W idealnym przypadku wszystko co należy zrobić to zdezaktywować endogenny gen. Jest to poważna korzyść dla uzyskania akceptacji konsumenta, który często obawia się roślin zawierających obce białka. W tym kontekście szczególnie korzystne jest użycie indukowalnych promotorów w celu redukcji ilości, aktywności lub funkcji białka RacB, na przykład użycie promotorów indukowalnych czynnikiem chorobotwórczym pozwala na ekspresję tego białka tylko wtedy, gdy jest to wymagane (tzn. podczas infekcji czynnikiem chorobotwórczym).

Została opisana częściowa sekwencja cDNA genu RacB jęczmienia (HvRacB-cDNA) (Nr w bazie GenBank: AJ290240), która jest wysoce konserwowana w stosunku do genu RacB ryżu (Nr w bazie GenBank: AF250327) oraz RacB kukurydzy (Nr w bazie GenBank: AF126053) i bardzo podobna do sekwencji genu Rac1 ryżu. Gen RacB kukurydzy jest jednym z pięciu genów Rac opisanych we wspomnianym wcześniej zgłoszeniu WO 00/15815 (Sekwencja Nr 3). Kompletna sekwencja kodująca białko HvRacB nie została jak dotąd opisana (zob. przykład 1). Gen RacB jęczmienia posiada geny homologiczne jak gen RacB ryżu i RacB kukurydzy, wykazujące 95% identyczności oraz jest w ponad 55% identyczny z ludzkimi genami RAC1 lub RAC2 (Hassanain i wsp. 2000, fig. 1). Ekspresja genu HvRacB jest konstytutywna w pierwotnych liściach jęczmienia (specyficznie w epidermie) i poziom jego ekspresji nie jest znacząco zmieniany przez infekcję Bgh. Zatem ekspresja tego genu występuje w tkance, która bezpośrednio oddziaływuje z czynnikiem chorobotwórczym Bgh.

Ogólnie sposób według wynalazku może być zastosowany u wszystkich gatunków roślin, korzystnie u tych, u których ekspresja białka RacB lub jego funkcjonalnego odpowiednika występuje naturalnie. Ponieważ funkcja RacB jest blisko związana z genem Mlo, który został zidentyfikowany u dużej liczby roślin, włączając dwuliścienne (Devoto A i wsp. (1999) J Biol Chem 274(49):34993-5004), można przyjąć, że RacB i jego homologi są podobnie szeroko rozmieszczone. Sekwencje pochodzące z innych roślin (na przykład Arabidopsis thaliand), które są homologiczne do sekwencji genu RacB ujawnionych w zakresie obecnego wynalazku mogą być łatwo wyszukane na przykład przy użyciu metod przeszukiwania baz danych lub bibliotek genowych z wykorzystaniem sekwencji RacB jako sekwencji zadanej lub sondy.

Termin „roślina używany tutaj dotyczy wszystkich rodzajów i gatunków wyższych i niższych roślin Królestwa Roślin. Termin ten obejmuje rośliny dojrzałe, nasiona, kiełki i sadzonki oraz pochodzące z nich części, materiał rozrodczy, organy roś linne, tkanki, protoplasty, kallusy i inne hodowle, na przykład hodowle komórkowe i każde inne grupy komórek roślinnych stanowiące funkcjonalne lub strukturalne jednostki. Termin „dojrzałe rośliny dotyczy każdego stadium rozwojowego poza stadium sadzonek. Termin „sadzonka dotyczy młodej, niedojrzałej rośliny we wczesnych stadiach rozwojowych. Termin „roślina obejmuje wszystkie rośliny jednoroczne i byliny, jednoliścienne i dwuliścienne i zawiera przykładowo (lecz nie wyłącznie) takie rodzaje jak Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lblium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea i Populus.

Korzystnie, termin roślina obejmuje jednoliścienne rośliny uprawne takie jak, na przykład gatunki zbóż jak pszenica, jęczmień, proso, żyto, pszenica perz, kukurydza, ryż, sorgo lub owies, a także trzcina cukrowa.

Termin ten ponadto dotyczy dwuliściennych roślin uprawnych takich jak, na przykład,

- roślin z rodziny Brassicacae takich jak rzepak, rzepak canola, rzeżucha, Arabidopsis, kapusty lub rzepak canola, z rodziny Leguminosae takich jak soja, lucerna, groch, fasole lub orzech ziemny,

- roślin z rodziny Solanaceae takich jak ziemniak, tytoń, pomidor, bakłażan lub pieprz, roślin z rodziny Asteraceae takich jak słonecznik, Tagetes, sałata lub Calendula,

PL 206 304 B1

- roś lin z rodziny Cucurbitaceae takich jak melon, dynia/kabaczek lub cukinia, a takż e len, bawełna, konopie, koniczyna, szpinak, czerwony pieprz, marchewka, burak, rzodkiew, burak cukrowy, słodki ziemniak, ogórek, cykoria, kalafior, brokuły, szparagi, cebula, czosnek, seler/seler naciowy, truskawka, malina, jeżyna, ananas, awokado i różne gatunki drzew, krzewów, orzechów i roślin pnących.

Korzystnie gatunki drzew obejmują śliwę, wiśnię, brzoskwinię, nektarynę, morelę, banana, papaję, mango, jabłoń, gruszę, pigwę.

Ponadto termin „roślina dotyczy roślin ozdobnych, drzew użytkowych, kwiatów, kwiatów ciętych, krzewów lub roślin trawnikowych takich jak, przykładowo (lecz nie wyłącznie) z rodziny Rosaceae takich jak róża, z rodziny Ericaceae takich jak rododendrony i różaneczniki, z rodziny Euphorbiaceae takich jak wilczomlecze i krocień, z rodziny Caryophyllaceae takich jak goździki, z rodziny Solanaceae takich jak petunie, z rodziny Gesneriaceae takich jak fiolek afrykański, z rodziny Balsaminaceae takich jak niecierpek, z rodziny Orchidaceae takich jak storczyki, z rodziny Iridaceae takich jak mieczyk, irys, frezja i krokus, z rodziny Compositae takich jak nagietek, z rodziny Geraniaceae takich jak pelargonie, z rodziny Liliaceae takich jak dracena, z rodziny Moraceae takich jak fikus, z rodziny Araceae takich jak filodendron i wiele innych.

Korzystnie w zakres wynalazku wchodzą te rośliny, które są wykorzystywane do produkcji artykułów żywnościowych i karmy dla zwierząt, najkorzystniej rodzaje i gatunki jednoliścienne, takie jak opisane wyżej gatunki zbóż.

Sposób jest stosowany szczególnie korzystnie u roślin jednoliściennych, bardziej korzystnie u roślin rolniczych takich jak pszenica, owies, proso, ję czmień, żyto, kukurydza, ryż , gryka, sorgo, pszenica perz, pszenica orkisz, len lub trzcina cukrowa.

„Oporność na czynnik chorobotwórczy oznacza zmniejszenie lub osłabienie objawów choroby rośliny powstałych w następstwie infekcji przez czynnik chorobotwórczy. Objawy mogą być różnorodne, ale korzystnie oznaczają takie, które bezpośrednio lub pośrednio wywierają niekorzystny efekt na jakość rośliny, wydajność plonów, możliwość ich wykorzystania do produkcji karmy dla zwierząt lub artykułów żywnościowych, albo inne, które powodują trudności w zasiewie, sadzeniu, zbiorze lub przetwarzaniu roślin uprawnych.

„Nadanie, „istnienie, „wytworzenie lub „zwiększenie oporności na czynnik chorobotwórczy oznacza, że mechanizm obronny specyficznego gatunku lub odmiany rośliny wykazuje zwiększoną oporność na jeden lub więcej czynników chorobotwórczych, spowodowaną zastosowaniem sposobu według wynalazku, w porównaniu do rośliny o niezmienionym genotypie („roślina oryginalna), w stosunku, do której sposób według wynalazku nie został zastosowany, w tych samych pozostałych warunkach (takich jak, na przykład warunki klimatyczne, czynniki wzrostowe, gatunki czynników chorobotwórczych i tym podobne). Zwiększona oporność przejawia się korzystnie zmniejszeniem objawów chorobowych - w dodatku do wyżej wymienionych niekorzystnych efektów - obejmujących na przykład wydajność wnikania czynnika chorobotwórczego do rośliny lub komórek roślinnych lub wydajność namnażania w roślinie lub na roślinie lub komórkach roślinnych. W tym kontekście objawy choroby są korzystnie zmniejszone o przynajmniej 10% lub przynajmniej 20%, korzystniej o przynajmniej 40% lub 60%, bardziej korzystnie o przynajmniej 70% lub 80% i najkorzystniej o przynajmniej 90% lub 95%.

„Dobór w stosunku do roślin, u których - w przeciwieństwie lub w porównaniu do rośliny oryginalnej - istnieje lub jest zwiększona oporność na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy, oznacza wszystkie te sposoby, które są odpowiednie do rozpoznania istnienia lub zwiększenia oporności na czynniki chorobotwórcze. Mogą to być objawy infekcji czynnikiem chorobotwórczym (na przykład rozwój haustoriów w przypadku infekcji grzybiczej), ale także mogą to być opisane powyżej objawy związane z jakością rośliny, wydajnością plonów, możliwością ich wykorzystania do produkcji karmy dla zwierząt lub artykułów żywnościowych i tym podobne.

„Czynnik chorobotwórczy w zakresie wynalazku oznacza przykładowo (lecz nie wyłącznie) wirusy lub wiroidy, bakterie, grzyby, zwierzęta - szkodniki takie jak, na przykład owady lub nicienie. Szczególnie korzystnym grzybem jest na przykład pleśń. Jednakże można przyjąć założenie, że obniżona ekspresja białka RacB, jego działanie lub funkcja nadają także oporność na inne czynniki chorobotwórcze. Zmiany w strukturze ściany komórkowej mogą stanowić podstawowy mechanizm w oporności na czynniki chorobotwórcze.

Następujące czynniki chorobotwórcze mogą być wymienione przykładowo (lecz nie wyłącznie):

1. Grzybicze lub grzybo-podobne czynniki chorobotwórcze:

PL 206 304 B1

Grzybicze lub grzybo-podobne czynniki chorobotwórcze (np. Chromista) korzystnie należą do grup Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycota and Deuteromycetes (Grzyby niedoskonale). W tabelach 1 i 2 wymieniono przykładowe (lecz nie wyłączne) czynniki chorobotwórcze oraz choroby z nimi związane.

T a b e l a 1:

Roślinne choroby wywołane grzybami

Choroba	Czynnik chorobotwórczy
Rdza brunatna żyta	Puccinia recondita
Rdza żółta zbóż	P. striiformis
Mączniak prawdziwy zbóż i traw	Erysiphe graminis/Blumeria graminis
Septorioza plew pszenicy	Septoria nodorum
Septorioza paskowana liści pszenicy	Septoria tritici
Fuzarioza kłosa	Fusarium spp.
Plamistość drobna	Pseudocercosporella herpotrichoides
Głownia pyląca	Ustilago spp.
Śnieć cuchnąca pszenicy	Tilletia caries
Zgorzel podstawy źdźbła	Gaeumannomyces graminis
Antraknoza liści Antraknoza kłosa	Colletotrichum graminicola (teleomorph: Glomerella graminicola Politis); Glomerella tucumanensis (anamorph: Glomerella falcatum Went)
Gnicie kłosa i ziarna typu Aspergillus	Aspergillus flavus
Rizoktonioza liści i pochewek liściowych	Rhizoctonia solani Kuhn = Rhizoctonia microsclerotia J. Matz (telomorph: Thanatephorus cucumeris)
Naczyniowa pasiastość liści zbóż	Acremonium strictum W. Gams = Cephalosporium acremonium Auct. non Corda
Czarne gnicie kłosa	Lasiodiplodia theobromae = Botiyodiplodia theobromae
Borde blanco	Marasmiellus sp.
Plamistość brązowa (plamistość czarna, gnicie kłosa)	Physoderma maydis
Gnicie ziarna typu Cephalosporium	Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium
Drewnienie ziarna	Macrophomina phaseolina
Rizoktonioza kłosa	Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii
Plamistość liści typu Curvularia	Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorph: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorph: Cochliobolus intermedius), Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus), Curvularia pallescens (teleomorph: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorph: Cochliobolus tuberculatus)
Plamistość liści typu Didymella	Didymella exitalis
Gnicie pochewki i kłosa typu Diplodia	Diplodia frumenti (teleomorph: Botryosphaeria festucae)
Gnicie kłosa, łodygi, nasienia i śnieć siewki typu Diplodia	Diplodia maydis = Stenocarpella maydis
Plamistość i pasiastość liści typu Diplodia	Stenocarpella macrospora = Diploclialeaf macrospora

PL 206 304 B1

	T a b e l a 2: Mączniaki rzekome
Choroba	Czynnik chorobotwórczy
1	2
Pasiastość brązowa mączniaka rzekomego	Sclerophthora rayssiae var. zeae
Mączniak rzekomy szalony wierzchołek	Sclerophthora macrospora = Sclerospora macrospora
Mączniak rzekomy zielonego kłosa (mącz- niak rzekomy graminicola)	Sclerospora graminicola
Mączniak rzekomy Java	Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis
Mączniak rzekomy Philippine	Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis
Mączniak rzekomy Sorgo	Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi
Mączniak rzekomy Spontaneum	Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea
Mączniak rzekomy trzciny cukrowej	Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari
Gnicie suchego kłosa (gnicie kolby, ziaren i źdźbła)	Nigrospora oryzae (teleomorph: Khuskia oryzae)
Czerń	Alternaria alternata = A. tenuis, Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Botrytis cinerea (teleomorph: Botiyotinia fuckeliana), Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis =Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus Tiegh., R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii
Sporysz zbóż i traw	Claviceps gigantea (anamorph: Sphacelia sp.)
Drobna plamistość liści	Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae
Fuzarioza kłosa i gnicie źdźbła	Fusarium subglutinans = F. moniliforme var.subglutinans
Fuzarioza ziaren, gnicie źdźbła i korzenia, gnicie nasion i śnieć siewki	Fusarium moniliforme (teleomorph: Gibberella fujikuroi)
Fuzarioza, gnicie źdźbła, siewki i korzenia	Fusarium avenaceum (teleomorph: Gibberlla avenacea)
Gnicie kłosa i źdźbła typu Gibberella	Gibberella zeae (anamorph: Fusarium graminearum)
Szare gnicie kłosa	Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae (anamorph: Macrophoma zeae)
Chwościk (szara plamistość liści)	Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeaemaydis
Helimintosporioza	Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum (teleomorph: Setosphaeria pedicellata)
Czerń zbóż	Cladosporium cladosporioides = Hormodendrum cladosporioides, C. herbarum (teleomorph: Mycosphaerella tassiana)
Plamistość liści typu Hyalothyridium	Hyalothyridium maydis
Późne więdnięcie	Cephalosporium maydis

PL 206 304 B1 cd. tabeli 2

1	2
Czerń zbóż	Alternaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae - Helminthosporium victoriae (teleomorph: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorph: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrum, Exserohilum prolatum = Drechslera polata (teleomorph: Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, (anamorph: Scolecosporiellas sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina
Północna śnieć liści zbóż (biały podmuch, gnicie źdźbła korony)	Setosphaeria turcica (anamorph: Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum)
Północna plamistość liści zbóż, gnicie kłosa typu Helminthosporium (szczep 1)	Cochliobolus carbonum (anamorph: Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum)
Gnicie kłosa typu Penicillium (niebieskie oczko, niebieska pleśń)	Penicillium spp., P. chrysogenum, P. expansum, P. oxalicum
Gnicie źdźbła i korzenia typu Phaeocytostroma	Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocytosporella zeae
Plamistość liści typu Phaeosphaeria	Phaeosphaeria maydis = Sphaerulina maydis
Gnicie kłosa typu Physalospora (Gnicie kłosa typu Bottyosphaeria)	Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola (anamorph: Diplodia frumenti)
Purpurowa pochwa liści	Hemiparasitic bacteria and fungi
Gnicie źdźbła i korzenia typu Pyrenochaeta	Phoma terrestris = Pyrenochaeta terrestris
Gnicie korzenia typu Pythium	Pythium spp., P. arrhenomanes, P. graminicola
Gnicie źdźbła typu Pythium	Pythium aphanidermatum = P. butleri L.
Choroba czerwonych ziaren (pleśń kłosa, gnicie liści i nasion)	Epicoccum nigrum
Rizoktonioza kłosa (sklerotyczne gnicie)	Rhizoctonia zeae (teleomorph: Waitea circinata)
Rizoktonioza korzenia i źdźbła	Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae
Gnicie korzeni, mniejsze	Alternaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorph: Gibberella acuminata), F. equiseti (teleomorph: G. intricans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, G. cyanogena, (anamorph: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucom sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus
Plamistość liści typu Rostratum (choroba liści, kłosa i źdźbła typu Helminthosporium)	Setosphaeria rostrata, (anamorph: Exserohilum rostratum = He/minthosporium rostratum)
Rdza zbóż zwyczajnych	Puccinia sorghi
Rdza zbóż południowych	Puccinia polysora
Rdza zbóż tropikalnych	Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae
Sklerotyczne gnicie kłosa (południowa śnieć)	Sclerotium rolfsii Sacc. (teleomorph: Athelia rolfsii)

PL 206 304 B1 cd. tabeli 2

1	2
Gnicie nasion-śnieć siewek	Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorph: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp.
Plamistość liści typu Selenophoma	Selenophoma sp.
Gnicie pochwy liściowej	Gaeumannomyces graminis
Gnicie łuski	Myrothecium gramineum
Pleśń kiszonki	Monascus purpureus, M ruber
Głownia zwyczajna	Ustilago zeae = U. maydis
Głownia fałszywa	Ustilaginoidea virens
Głownia główki	Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holcisorghi
Południowa śnieć liści zbóż i gnicie źdźbła	Cochliobolus heterostrophus (anamorph: Bipolaris maydis = Helminthosporium maydis)
Południowa plamistość liści	Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora
Gnicie źdźbła, mniejsze	Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysporum Schlechtend, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorph: Nectria haematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria sp.
Gnicie magazynowe	Aspergillus spp., Penicillium spp. i inne grzyby
Plamistość smołowa	Phyllachora maydis
Gnicie kłosa i korzenia typu Trichoderma	Trichoderma viride = T. lignorum teleomorph: Hypocrea sp.
Białe gnicie kłosa, gnicie korzenia i źdźbła	Stenocarpella maydis = Diplodia zeae
Żółta śnieć liści	Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorph: Mycosphaerella zeae-maydis)
Plamistość strefowa liści	Gloeocercospora sorghi

Następujące przykłady są szczególnie korzystne:

- Plasmodiophoromycota takie jak Plasmodiophora brassicae (kiła krzyżowych), Spongospora subterranea (parch bulw ziemniaka), Polymyxa graminis (choroba korzenia zbóż i traw),

- Oomycota takie, jak Bremia lactucae (mą czniak rzekomy sał aty), Peronospora (mą czniak rzekomy) u lwiej paszczy (P. antirrhini), cebuli (P. destructor), szpinaku (P. effusa), soi (P. manchurica), tytoniu (błękitna pleśń; P. tabacina) lucerny i koniczyny (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (mączniak rzekomy szyszek chmielowych), Plasmopara (mączniak rzekomy winorośli) (P. viticola) i sł onecznika (P. halstedii), Sclerophtohra macrospora (mą czniak rzekomy zbóż i traw), Pythium (gnicie ziaren, zgorzel siewek i gnicie korzenia i wszystkich typów roślin, na przykład zgorzel buraka Beta spowodowana przez P. debaryanum), Phytophthora infestans (śnieć ziemniaka, brązowe gnicie pomidora i tym podobne), Albugo gat. (biała rdza roślin krzyżowych).

- Ascomycota takie jak Microdochium nivale (pleśń śniegowa żyta i pszenicy), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (częściowa sterylność pochewki, głównie u pszenicy), Fusarium oxysporum (więdnięcie pomidora typu Fusarium), Blumeria graminis (mączniak prawdziwy jęczmienia (f.sp. hordei) i pszenicy (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (mączniak prawdziwy groszku), Nectria galligena (rak Nectria drzew owocowych), Unicnula necator (mączniak prawdziwy winorośli), Pseudopeziza tracheiphila (choroba czerwonego ognia winorośli), Claviceps purpurea (sporysz, na przykład żyta i traw), Gaeumannomyces graminis (zgorzel podstawy źdźbła pszenicy, żyta i traw), Magnaporthe grisea

PL 206 304 B1 (choroba wietrzna ryżu), Pyrenophora graminea (pasiastość liści jęczmienia), Pyrenophora teres (plamistość sieciowa jęczmienia), Pyrenophora tritici-repentis (śnieć liści pszenicy), Venturia inaequalis (parch jabłek), Sclerotinia sclerotium (łamliwość łodygi, gnicie łodygi), Pseudopeziza medicaginis (plamistość liści lucerny, białej i czerwonej koniczyny).

- Basidiomycetes takie jak Typhula incarnata (ś nieć typhula jęczmienia, ż yta, pszenicy), Ustilago maydis (głownia pęcherzowa kukurydzy), Ustilago nuda (głownia pyląca jęczmienia), Ustilago tritici (głownia pyląca pszenicy, orkiszu), Ustilago avenae (głownia pyląca owsa), Rhizoctonia solani (rizoktonioza korzenia ziemniaka), Sphacelotheca spp. (głownia główki sorgo), Melampsora lini (rdza lnu), Puccinia graminis (rdza łodygi pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa), Puccinia recondita (rdza liści pszenicy), Puccinia dispersa (brązowa rdza żyta), Puccinia hordei (rdza liści jęczmienia), Puccinia coronata (rdza korony owsa), Puccinia striiformis (żółta rdza pszenicy, jęczmienia, żyta i wielu traw), Uromyces appendiculatus (brązowa rdza fasoli), Sclerotium rolfsii (gnicie korzenia i łodygi wielu roślin).

- Deuteromycetes (Fungi imperfecti) takie jak Septoria nodorum (septorioza plew pszenicy (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (plamistość drobna pszenicy, jęczmienia, żyta), Rynchosporium secalis (plamistość liści żyta i jęczmienia), Alternaria solani (wczesna śnieć ziemniaka i pomidora), Phoma betae (czarna nóż ka buraka Beta), Cercospora beticola (plamistość liś ci buraka Beta), Alternaria brassicae (plamistość czarna rzepaku, kapusty i innych krzyżowych), Verticillium dahliae (więdnięcie yerticillium), Colletotrichum lindemuthianum (antraknoza fasoli), Phoma lingam (czarna nóżka kapusty i rzepaku), Botrytis cinerea (szara pleśń winorośli, truskawek, pomidora, chmielu i tym podobnych).

Najkorzystniejsze są Phytophthora infestans (śnieć ziemniaka, brązowe gnicie pomidora i tym podobnych), Microdochium nivale (poprzednio Fusarium nivale; pleśń śniegowa żyta i pszenicy), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (częściowa sterylność kłosa pszenicy), Fusarium oxysporum (fuzarioza pomidora), Blumeria graminis (mączniak prawdziwy jęczmienia (f. sp. hordei) i pszenicy (f. sp. tritici)), Magnaporthe grisea (choroba wietrzna ryżu), Sclerotinia sclerotium (łamliwość kłosa, gnicie łodygi), Septoria nodorum i Septoria tritici (septorioza plew pszenicy), Alternaria brassicae (plamistość czarna rzepaku, kapusty i innych krzyżowych), Phoma lingam (czarna nóżka kapusty i rzepaku).

2. Bakteryjne czynniki chorobotwórcze:

Bakteryjne czynniki chorobotwórcze i związane z nimi choroby wymieniono w tabeli 3 (na drodze przykładu, lecz nie ograniczenia):

T a b e l a 3: Choroby bakteryjne

Choroba	Czynnik chorobotwórczy
Bakteryjna śnieć liści i gnicie łodygi	Pseudomonas avenae subsp. avenae
Plamistość bakteryjna liści	Xanthomonas campestris pv. holcicola
Bakteryjne gnicie łodygi	Enterobacter dissohens = Erwinia dissohens
Bakteryjne gnicie wierzchołka i łodygi	Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv. zeae
Pasiastość bakteryjna	Pseudomonas andropogonis
Czekoladowe plamy	Pseudomonas syringae pv. coronafaciens
Bakteryjne więdnięcie i śnieć Gossa (więdnięcie i plamki liści)	Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = Corynebacterium michiganense pv.andnebraskense
Plamistość typu Holcus	Pseudomonas syringae pv. syringae
Purpurowa pochewka liści	Hemiparasitic bacteria
Gnicie nasion-śnieć siewek	Bacillus subtilis
Choroba Stewarta (bakteryjne więdnięcie)	Pantoea stewartii = Erwinia stewartii
Karłowatość zbóż (achapparramiento, karłowata kukurydza, karłowata kukurydza Mesa Central lub Rio Grandę)	Spiroplasma kunkelii

PL 206 304 B1

Następujące bakteryjne czynniki chorobotwórcze są szczególnie korzystne: Corynebacterium sepedonicum (bakteryjne gnicie pierścieniowe ziemniaka), Erwinia carotovora (czarna nóżka ziemniaka), Erwinia amylovora (płomienna śnieć gruszy, jabłoni, pigwy), Streptomyces scabies (parch ziemniaka), Pseudomonas syringae pv. tabaci (błyskawica tytoniu), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (tłuste plamki karłowatej fasoli), Pseudomonas syringae pv. tomato (bakteryjne drobiny pomidora), Xanthomonas campestrispv. malvacearum (bakteryjne śnieć bawełny) i Xanthomonas campestris pv. oryzae (bakteryjna śnieć liści ryżu i innych traw).

3. Wirusowe czynniki chorobotwórcze:

Wirusowe czynniki chorobotwórcze obejmują wszystkie wirusy roślinne takie jak, na przykład wirus mozaiki tytoniu lub ogórka, wirus okrągłych plamek, wirus nekrozy, wirus mozaiki karłowatej kukurydzy i tym podobne.

Wirusowe czynniki chorobotwórcze i związane z nimi choroby wymieniono w Tabeli 4 (na drodze przykładu, lecz nie ograniczenia):

T a b e l a 4: Choroby wirusowe

Choroba	Czynnik chorobotwórczy
1	2
Żłobienie amerykańskiej pszenicy (mozaikowe żłobienie pszenicy)	Wirus żłobienia amerykańskiej pszenicy (A WSMV - American wheat striate mosaic virus)
Mozaika pasiasta jęczmienia	Wirus mozaiki pasiastej jęczmienia (BSMV + Barley stripe mosaic virus)
Żółta karłowatość jęczmienia	Wirus żółtej karłowatości jęczmienia (BYDV - Barley yellow dwarf virus)
Mozaika Broma	Wirus mozaik Broma (BMV - Brome mosaic virusj
Cętkowana chloroza zbóż	Wirus cętkowanej chlorozy zbóż (CCMV - Cereal chlorotic mottle virus)
Chloroza żyłki węzła zbóż (brazylijska mozaika kukurydzy)	Wirus chlorozy żyłki zbóż (CCVBV - Corn chlorotic vein banding virus)
Nekroza zbóż	Wirus kompleksowy Wirus cętkowanej chlorozy kukurydzy (MCMV- Maize chlorotic mottle virus) i Wirus mozaiki karłowatej kukurydzy (MDMV Maize dwarf mosaic virus) A lub B lub Wirus pasiastej mozaiki pszenicy (WSMV - Wheat streak mosaic virus)
Mozaika ogórka	Wirus mozaiki ogórka (CMV- Cucumber mosaic virus)
Pasiasta chloroza Cynodonu	Wirus pasiastej chlorozy Cynodonu (CCSV - Cynodon chlorotic streak virus)
Mozaika Johnsongrassa	Wirus mozaiki Johnsongrassa (JGMV- Johnsongrass mosaic virus)
Krzaczasta karłowata kukurydza	Organizm Mycoplasmo-podobny (MLO - Mycoplasma-like organizm)
Chloroza karłowatej kukurydzy	Wirus chlorozy karłowatej kukurydzy (MCDV - Maize chlorotic dwarf virus)
Cętkowana chloroza kukurydzy	Wirus cętkowanej chlorozy kukurydzy (MCMV - Maize chlorotic mottle virus)
Mozaika karłowatej kukurydzy	Wirus mozaiki karłowatej kukurydzy (MDMV - Maize dwarf mosaic virus,) linia A, D, E i F
Drobinkowe liście kukurydzy	Wirus drobinkowych liści kukurydzy (MLFV - Maize leaf fleck wirus)
Liniowa kukurydza	Wirus liniowej kukurydzy (ML V - Maize line virus)
Mozaika kukurydzy (pasiastość ziarna liści, enanismo rayado)	Wirus mozaiki kukurydzy (MMV - Maize mosaic virus)

PL 206 304 B1 cd. tabeli 4

1	2
Karłowatość cętkowana i chlorotyczna kukurydzy	Wirus karłowatości cętkowanej i chlorotycznej kukurydzy
Przezroczyste krążki kukurydzy	Wirus przezroczystych krążków kukurydzy (MPR V -Maize pellucid nngspot virus)
Kukurydza raya gruesa	Wirus kukurydzy raya gruesa (MRGV - Maize raya gruesa virus)
Kukurydza rayado fino (choroba dokładnych pasków)	Wirus kukurydzy rayado fino (MRFV - Maize rayado fino virus)
Czerwone liście i czerwone paski kukurydzy	Mollicute
Czerwone paski kukurydzy	Wirus czerwonych pasków kukurydzy (MRSV - Maize red stripe virus)
Cętkowane krążki kukurydzy	Wirus cętkowanych krążków kukurydzy (MRMV - Maize ring mottle virus)
Kukurydza rio IV	Wirus kukurydzy rio cuarto (MRCV- Maize rio cuarto virus)
Karłowatość twarda kukurydzy (nanismo ruvido)	Wirus karłowatości twardej kukurydzy (MRD V -Maize rough dwarf virus, (Wirus choroby kultywacji zbóż)
Karłowata sterylna kukurydza	Wirus karłowatej sterylnej kukurydzy (linie pasiastości żółtej jęczmienia)
Pasiasta kukurydza	Wirus pasiastej kukurydzy (MSV - Maize streak virus)
Pasiasta kukurydza (pasiasta chlorotyczna kukurydza, kukurydza hoja blanca)	Wirus pasiastej kukurydzy
Karłowacenie kukurydzy	Wirus karłowacenia kukurydzy
Aborcja kitki kukurydzy	Wirus aborcji kitki kukurydzy (MTA V - Maize tassel abortion virus)
Choroba żyłki kukurydzy	Wirus żyłki kukurydzy (MVEV - Maize vein enation virus)
Kolba walabii kukurydzy	Wirus kolby walabii kukurydzy (MWEV - Maize wallaby ear virus)
Białe liście kukurydzy	Wirus białych liści kukurydzy
Biała liniowa mozaika kukurydzy	Wirus białej liniowej mozaiki kukurydzy (MWLMV -Maize white line mosaic virus)
Cętkowane czerwone liście	Wirus cętkowanych czerwonych liści (MRL V - Millet red leaf virus)
Mozaika zbóż północy	Wirus mozaiki zbóż północy (NCMV - Northern cereal mosaic virus)
Pseudorozetka owsa (zakuklivanie)	Wirus pseduorezetki owsa
Karłowatość sterylna owsa	Wirus karłowatości sterylnej owsa (OSDV - Oat sterile dwarf virus)
Karłowatość czarno-pasemkowa ryżu	Wirus karłowatości czarno-pasemkowej ryżu (RBSDV - Rice black-streaked dwarf virus)
Paskowany ryż	Wirus paskowanego ryżu (RS V - Rice stripe virus)
Mozaika sorgo	Wirus mozaiki sorgo (SrMV - Sorghum mosaic virus) (auch: (SCMV - sugarcane mosaic virus) Stamme H, I i M)
Choroba Fiji trzciny cukrowej	Wirus choroby Fiji trzciny cukrowej (FDV -Sugarcane Fiji disease virus)
Mozaika trzciny cukrowej	Wirus mozaiki trzciny cukrowej (SCMV - Sugarcane mosaic virus) linie A, B, D, E, SC, BC, Sabi i MB (dawniej MDMV-B)
Plamkowa mozaika pszenicy	Wirus plamkowej mozaiki pszenicy (WSMV - Wheat spot mosaic virus)

PL 206 304 B1

4. Szkodniki zwierzęce

4.1 Czynniki chorobotwórcze - Owady:

Mogą zostać wymienione następujące (na drodze przykładu, lecz nie ograniczenia) owady takie jak chrząszcze, gąsienice, wszy lub roztocza. Korzystne owady to te z rodzajów: Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mcdlophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera itd. Szczególnie korzystne są owady coleoptera i lepidoptera takie jak, na przykład omacnica prosowianka (ECB - European corn borer), Diabrotica barberi (północny robak korzenia kukurydzy), Diabrotica undecimpunctata (południowy robak korzenia kukurydzy), Diabrotica virgifera (zachodni robak korzenia kukurydzy), Agrotis ipsilon (gąsienica rolnicy czarnej), Crymodes devastator (gąsienica przezroczysta), Feltia ducens (gąsienica wyblakła), Agrotis gladiaria (gąsienica rolnicy glinowej), Melanotus spp., Aeolus mellillus (larwa sprężyka), Aeolus mancus (larwa sprężyka pszenicy), Horistonotus uhlerii (larwa sprężyka piaskowego), Sphenophorus maidis (pluskwa kukurydzy), Sphenophorus zeae (pluskwa tymotki łąkowej), Sphenophorus parvulus (pluskwa wiechliny łąkowej), Sphenophorus callosus (pluskwa zbóż południowych), Phyllogphaga spp. (białe larwy), Anuraphis maidiradicis (mszyca korzenia kukurydzy), Delia platura (czerw nasion), Colaspis brunnea (colaspis winogron), Stenolophus lecontei (chrząszcz ziarnowy) i Clivinia impressifrons (chrząszcz ziarnowy).

Innymi przykładami są: skrzypionka (Oulema melanopus), ploniarka zbożówka (Oscinella frit), larwy rolnicy (Agrotis lineatus) i mszyce (takie jak na przykład: mszyca ziaren owsa Rhopalosiphum padi, mszyca jeżyn Sitobion avenae).

4.2 Nicienie

Czynniki chorobotwórcze (nicienie) i związane z nimi choroby wymieniono w Tabeli 6 (na drodze przykładu, lecz nie ograniczenia):

T a b e l a 6: Nicienie pasożytnicze

Uszkodzenie	Nicienie - czynniki chorobotwórcze
Szydło	Dolichodorus spp., D. heterocephalus
Choroba nicieniowa cebulek i łodygi; Europa	Ditylenchus dipsaci
Jamki	Radopholus simdis
Nicieniowa choroba cyst	Heterodera avenae, H. zeae, Punctodera chalcoensis
Sztylet	Xiphinema spp., X. americanum, X. mediterraneum
Fałszywy sęk korzenia	Nacobbus dorsalis
Nacięcie, Columbia	Hoplolaimus columbus
Nacięcie	Hoplolaimus spp., H. galeatus
Rana	Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. crenatus, P. hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei, P. zeae
Igła	Longidorus spp., L. breviannulatus
Pierścień	Criconemella spp., C. ornata
Choroba korzeń-sęk	Meloidogyne spp., M. chitwoodi, M. incognita, M. javanica
Spirala	Helicotylenchus spp.
Żądło	Belonolaimus spp., B. longicaudatus
Krótki korzeń	Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp.
Karłowatość	Tylenchorhynchus dubius

Szczególnie korzystne są: Globodera rostochiensis i G. pallida (węgorek ziemniaka, pomidora i innych Solanaceae), Heterodera schachtii (wę gorek buraka cukrowego i buraka pastewnego, oleju rzepakowego, kapusty i tym podobnych), Heterodera avenae (nicieniowa cysta na owsie i innych

PL 206 304 B1 gatunkach zbóż), Ditylenchus dipsaci (węgorek łodygi i cebulki, węgorek łodygi żyta, owsa, kukurydzy, koniczyny, tytoniu, buraka), Anguina tritici (nicień ziaren, choroba sercówki pszenicy (orkiszu, żyta), Meloidogyne hapla (nicień korzenia-sęka marchwi, ogórka, sałaty, pomidora, ziemniaka, buraka cukrowego, lucerny).

Przykłady korzystnych grzybiczych i wirusowych czynników chorobotwórczych dla poszczególnych odmian:

1. Jęczmień:

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Puccinia graminis f.sp. hordei (rdza łodygi jęczmienia), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei (mączniak prawdziwy jęczmienia), wirus żółtej karłowatości jęczmienia (BYDV),

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Ostrinia nubilalis (omacnica prosowianka); Agrotis ipsilon (gąsienica rolnicy czarnej); Schizaphis graminum (zielony pluskwa); Blissus leucopterus leucopterus (pluskwa chinch); Acrosternum hilare (zielona cuchnąca pluskwą); Euschistus servus (brązowa cuchnąca pluskwa); Deliaplatura (czerw ziaren); Mayetiola destructor (muszka Hessiana); Petrobia latens (brązowy roztocz pszenicy).

2. Soja:

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, wirus mozaiki soi, Glomerella glycines, wirus okrągłych plamek tytoniu, wirus pasemek tytoniu, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, wirus plamkowego więdnięcia pomidora, Heterodera glycines Fusarium solani.

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Pseudoplusia includens (gąsienica soi); Anticarsia gemmatalis (gąsienica aksamitnej fasoli); Plathypena scabra (zielony robak koniczyny); Ostrinia nubilalis (omacnica prosowianka); Agrotis ipsilon (gąsienica rolnicy czarnej); Spodoptera exigua (gąsienica buraka); Heliothis virescens (robak pączka bawełny); Helicoverpa zea (robak torebki nasiennej bawełny); Epilachna varivestis (chrząszcz meksykańskiej fasoli); Myzus persicae (mszyca zielonej brzoskwini); Empoasca fabae (konik polny liści ziemniaka); Acrosternum hilare (zielony cuchnąca pluskwa); Melanoplus femurrubrum (czerwononogi konik polny); Melanoplus differentialis (konik polny różnicujący); Hylemya platura (czerw ziaren); Sericothrips variabilis (wciornastek sojowy); Thrips tabaci (wciornastek cebulowy); Tetranychus turkestani (roztocza truskawki); Tetranychus urticae (roztocza dwukropkowe).

3. Rzepak Canola:

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.

4. Lucerna

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.

5. Pszenica

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium cidmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris

PL 206 304 B1 sorokiniana, wirus żółtej karłowatości jęczmienia, wirus mozaiki Broma, wirus mozaiki pszenicy przenoszony przez glebę, wirus pasemkowej mozaiki pszenicy, wirus pasemkowego wrzeciona pszenicy, wirus żłobienia amerykańskiej pszenicy, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, wirus wysokich równin, europejski wirus żłobienia pszenicy Puccinia graminis f.sp. tritici (rdza łodygi pszenicy), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (mączniak prawdziwy pszenicy).

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Pseudaletia unipunctata (gąsienica); Spodoptera frugiperda (gąsienica jesienna); Elasmopalpus lignosellus (kornik zbóż mniejszy); Agrotis orthogonia (gąsienica zachodniej rolnicy); Elasmopalpus Zignosellus (kornik zbóż mniejszy); Oulema melanopus (chrząszcz liści zbóż); Hypera punctata (ryjkowiec liści koniczyny); Diabrotica undecimpunctata howardi (południowy robak korzeni zbóż); mszyca rosyjskiej pszenicy; Schizaphis graminum (zielona pluskwa); Macrosiphum avenae (mszyca angielskiego ziela); Melanoplus femurrubrum (czerwononogi konik polny); Melanoplus differentialis (konik polny różnicujący); Melanoplus sanguinipes (konik polny migrujący); Mayetiola destructor (muszka Hessian); Sitodiplosis mosellana (muszka pszenicy); Meromyza americana (czerw kłosa pszenicy); Hylemya coarctata (muszka cebulki pszenicy); Frankliniella fusca (wciornastek tytoniowy); Cephus cinctus (muszka łodygi pszenicy); Aceria tulipae (roztocze pszenicy).

6. Słonecznik

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, żółć astrów, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Suleima helianthana (ćma pąka słonecznika); Homoeosoma electellum (ćma słonecznika); zygogramma exclamationis (chrząszcz słonecznika); Bothyrus gibbosus (chrząszcz marchwi); Neolasioptera murtfeldtiana (muszka ziarna słonecznika).

7. Kukurydza

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaeąualis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, wirus karłowatości mozaiki kukurydzy A i B, wirus paskowej mozaiki pszenicy, wirus chlorotycznej karłowatości kukurydzy, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, wirus cętkowanej chlorozy kukurydzy, wirus wysokich równin, wirus mozaiki kukurydzy, wirus kukurydzy rayado fino, wirus pasemek kukurydzy (MSV), wirus wstęgi kukurydzy, wirus twardej karłowatości kukurydzy.

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Ostrinia nubilalis (omacnica prosowianka); Agrotis ipsilon (gąsienica rolnicy czarnej); Helicoverpa zea (robak kłosa zbóż); Spocloptera frugiperda (gąsienica jesienna); Diatraea grandiosella (kornik zbóż południowo-zachodnich); Elasmopalpus lignosellus (kornik zbóż mniejszy); Diatraea saccharalis (kornik trzciny cukrowej); Diabrotica virgifera (robak korzenia zbóż zachodnich); Diabrotica longicornis barberi (robak korzenia zbóż północnych; Diabrotica undecimpunctata howardi (robak korzenia zbóż południowych); Melanotus spp. (larwy sprężyka); Cyclocephala borealis (Północny biały pędrak); Cyclocephala immaculata (Południowy biały pędrak); Popillia japonica (chrząszcz japoński); Chaetocnema pulicaria (pchła chrząszcza zbóż); Sphenophorus maidis (ryjkowiec kukurydzy); Rhopalosiphum maidis (mszyca liści zbóż); Anuraphis maidiradicis (mszyca korzenia zbóż); Blissus leucopterus leucopterus (pluskwa chinch); Melanoplus femurrubrum (czerwononogi konik polny); Melanoplus sanguinipes (konik polny migrujący); Hylemva platura

PL 206 304 B1 (czerw ziaren); Agromyza parvicornis (miniarka zbóż); Anaphothrips obscrurus (wciornastek traw); Solenopsis milesta (mrówka złodziej); Tetranychus urticae (roztocze dwukropkowe).

8. Sorgo

Grzybicze, bakteryjne i wirusowe czynniki chorobotwórcze: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, mozaika trzciny cukrowej H, wirus mozaiki karłowatej kukurydzy A i B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola. Czynniki chorobotwórcze owady i nicienie: Chilo partellus (kornik sorgo); Spodoptera frugiperda (gąsienica jesienna); Helicoverpa zea (robak kłosa zbóż); Elasmopalpus lignosellus (kornik zbóż mniejszy); Feltia subterranea (gąsienica granularna); Phvllophaga crinita (biały pędrak); Eleodes, Conoderus i Aeolus spp. (larwy); Oulema melanopus (chrząszcz liści zbóż); Chaetocnema pulicaria (pchła chrząszcza zbóż); Sphenophorus maidis (pluskwa kukurydzy); Rhopalosiphum maidis (mszyca liści zbóż); Siphaflava (mszyca żółtej trzciny cukrowej); Blissus leucopterus leucopterus (pluskwa chinch); Contarinia sorghicola (muszka sorgo); Tetranychus cinnabarinus (roztocze karminowe); Tetranychus urticae (roztocze dwukropkowe).

9. Bawełna

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Heliothis virescens (robak pąka bawełny); Helicoverpa zea (robak torebki nasiennej bawełny); Spodoptera exigua (gąsienica buraka); Pectinophora gossypiella (różowy robak torebki nasiennej); Anthonomus grandis grandis (ryjkowiec torebki nasiennej); Aphis gossypii (mszyca bawełny); Pseudatomoscelis seriatus (pchła bawełny); Trialeurodes abutilonea (mącznik krzywoskrzydły); Lygus lineolaris (pluskwa plamista rośliny); Melanoplus femurrubrum (czerwononogi konik polny); Melanoplus differentialis (konik polny różnicujący); Thrips tabaci (wciornastek cebulowy); Franklinkiella fusca (wciornastek tytoniowy); Tetranychus cinnabarinus (roztocze karminowe); Tetranychus urticae (roztocze dwukropkowe).

10. Ryż

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Diatraea saccharalis (kornik trzciny cukrowej); Spodoptera frugiperda (gąsienica jesienna); Helicoverpa zea (robak pochewki kukurydzy); Colaspis brunnea (colaspis winogron); Lissorhoptrus oryzophilus (ryjkowiec wodny ryżu); Sitophilus oryzae (ryjkowiec ryżu); Nephotettix nigropictus (pasikonik ryżu); Blissus leucopterus leucopterus (pluskwa chinch); Acrosternum hilare (zielona pluskwa cuchnąca).

11. Rzepak

Czynniki chorobotwórcze - owady i nicienie: Brevicoryne brassicae (mszyca kapusty); Phyilotreta cruciferae (pchla chrząszcz); Mamestra conjgurata (gąsienica piętnówki); Plutella xylostella (pchła grzechotnika diamentowego); Delia ssp. (czerw korzenia).

Dla celów tego wynalazku białko RacB oznacza białko RacB z jęczmienia (pokazane w Sekw. Nr 2) oraz jego homologi pochodzące z ryżu (Oryza sative) (pokazane w Sekw. Nr 4) i kukurydzy (Zea mays) (pokazane w Sekw. Nr 6), oraz funkcjonalne odpowiedniki wyżej wymienionych.

Ilość białka oznacza ilość polipeptydu RacB znajdującą się w organizmie, tkance, komórce lub przedziale komórkowym. Obniżenie ilości białka oznacza ilościowe obniżenie ilości białka RacB w organizmie, tkance, komórce lub przedziale komórkowym - na przykład w wyniku zastosowania jednego ze sposobów opisanych poniżej - w porównaniu z niezmienionym genotypem tego samego rodzaju lub gatunku, w stosunku do którego sposób ten nie został zastosowany, w tych samych pozostałych warunkach (takich jak, na przykład warunki hodowli, wiek rośliny i tym podobne). Obniżenie ilości oznacza obniżenie o przynajmniej 10%, korzystnie o przynajmniej 10% lub przynajmniej 20%, szczególnie korzystnie o przynajmniej 40% lub 60%, bardziej korzystnie o przynajmniej 70% lub 80% i najkorzystniej o przynajmniej 90% lub 95%.

„Aktywność oznacza korzystnie aktywność polipeptydu RacB jako GTPazy w organizmie, tkance, komórce iub przedziale komórkowym. „Obniżenie aktywności oznacza obniżenie całkowitej aktywności białka RacB w organizmie, tkance, komórce lub przedziale komórkowym - na przykład

PL 206 304 B1 w wyniku zastosowania jednego ze sposobów opisanych poniżej - w porównaniu z niezmienionym genotypem tego samego rodzaju lub gatunku, w stosunku do którego sposób ten nie został zastosowany, w tych samych pozostałych warunkach (takich jak, na przykład warunki hodowli, wiek rośliny i tym podobne). Obniżenie ilości oznacza obniżenie o przynajmniej 10%, korzystnie o przynajmniej 10% lub przynajmniej 20%, szczególnie korzystnie o przynajmniej 40% lub 60%, bardziej korzystnie o przynajmniej 70% lub 80% i najkorzystniej o przynajmniej 90% lub 95%.

„Funkcja oznacza korzystnie zdolność polipeptydu RacB do wiązania substratu w organizmie, tkance, komórce lub przedziale komórkowym. Odpowiednie substraty oznaczają związki o niskiej masie cząsteczkowej takie jak GTP, ale także białka oddziałujące z białkiem RacB. „Obniżenie funkcji oznacza na przykład ilościowe obniżenie całkowitej zdolności wiązania lub siły wiązania przez białko RacB przynajmniej jednego substratu w organizmie, tkance, komórce lub przedziale komórkowym - na przykład w wyniku zastosowania jednego ze sposobów opisanych poniżej - w porównaniu z niezmienionym genotypem tego samego rodzaju lub gatunku, w stosunku do którego sposób ten nie został zastosowany, w tych samych pozostałych warunkach (takich jak, na przykład warunki hodowli, wiek rośliny i tym podobne). Obniżenie oznacza także zmianę w specyficzności substratu wyrażonej na przykład przez wartość kcat/Km. Obniżenie ilości oznacza obniżenie o przynajmniej 10%, korzystnie o przynajmniej 10% lub przynajmniej 20%, szczególnie korzystnie o przynajmniej 40% lub 60%, bardziej korzystnie o przynajmniej 70% lub 80% i najkorzystniej o przynajmniej 90% lub 95%. Partnerzy wiążący się do białka RacB mogą być zidentyfikowani w sposób znany specjaliście z dziedziny, na przykład w dwuhybrydowym systemie drożdżowym.

Sposoby oznaczania ilości białka, aktywności GTPaz lub zdolności wiązania substratu są znane specjaliście z dziedziny i zostały omówione wiele razy przy opisie GTPaz oraz białek Rac dla różnych rodzajów i gatunków (zob. między innymi Benard V i wsp.(1999) J Biol Chem 274(19):13198-204; Burstein ES (1998) Oncogene. 17( 12): 1617-23).

Przez termin funkcjonalne odpowiedniki białka RacB rozumie się korzystnie takie sekwencje, które pochodzą z białka RacB lub są homologiczne do tego białka RacB, opisanego w Sekw. Nr 2, 4 lub 6 i które posiadają zasadniczo te same właściwości.

Przez termin zasadniczo te same właściwości odpowiednika funkcjonalnego przede wszystkim rozumie się właściwości nadające fenotyp oporności na czynnik chorobotwórczy albo nadające lub zwiększające oporność na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy poprzez zmniejszenie ilości białka, jego aktywności lub funkcji wspomnianego odpowiednika funkcjonalnego białka RacB w roślinie albo w jej tkance, części lub komórkach. Ponadto jako zasadniczą właściwość rozumie się brak spontanicznie indukowanej śmierci komórki w połączeniu ze wspomnianym zmniejszeniem ilości białka, aktywności lub funkcji odpowiednika funkcjonalnego.

W tym kontekście, skuteczność oporności na czynnik chorobotwórczy może być zarówno większa lub mniejsza w porównaniu do wartości uzyskanej przy obniżeniu jednego z białek RacB, opisanych w Sekw. Nr 2, 4 lub 6. Korzystnymi odpowiednikami funkcjonalnymi są te, przy użyciu których, skuteczność oporności na czynnik chorobotwórczy - mierzona na przykład poprzez zdolność wnikania czynnika chorobotwórczego (tworzenie haustoriów) -różni się o nie więcej niż 50%, korzystnie o 25%, a szczególnie korzystnie o 10% w porównaniu do wartości uzyskanej przy obniżeniu jednego z białek RacB, opisanych w Sekw. Nr 2, 4 lub 6. Szczególnie korzystne są te sekwencje, przy których obniżenie podwyższa ilościowo skuteczność oporności na czynnik chorobotwórczy o więcej niż 50%, korzystnie o 100%, szczególnie korzystnie o 500%, zaś najkorzystniej o 1000% w porównaniu do wartości uzyskanej przy obniżeniu jednego z białek RacB, opisanych w Sekw. Nr 2, 4 lub 6.

Porównanie takie jest korzystnie prowadzone w analogicznych warunkach. Termin „analogiczne warunki oznacza wszystkie warunki takie jak, na przykład warunki wzrostu lub hodowli, warunki eksperymentu (takie jak bufor, temperatura, substraty, stężenie czynnika chorobotwórczego i tym podobne), które są identyczne w porównywanych eksperymentach oraz oznacza to, że układy eksperymentów różnią się tylko sekwencją porównywanego polipeptydu RacB, organizmem, z którego pochodzi i, jeśli to wymagane czynnikiem chorobotwórczym. W przypadku doboru czynnika chorobotwórczego, każde porównanie wymaga dobrania takiego czynnika chorobotwórczego, który jest najbardziej podobny do innego odpowiednika, biorąc pod uwagę specyficzność gatunkową.

Przez termin „funkcjonalne odpowiedniki rozumie się, w szczególności naturalne lub sztuczne mutacje polipeptydów RacB, pokazanych w Sekw. Nr 2, 4, 6 i homologicznych polipeptydów pochodzących z innych roślin, wykazujących zasadniczo te same właściwości. Korzystne są polipeptydy homologiczne pochodzące z opisanych powyżej roślin. Sekwencje pochodzące z innych roślin

PL 206 304 B1 (na przykład Arabidopsis thaliana), które są homologiczne do sekwencji RacB ujawnionych w zakresie obecnego wynalazku mogą być łatwo wyszukane na przykład przy użyciu metod przeszukiwania baz danych lub bibliotek genowych z wykorzystaniem sekwencji RacB jako sekwencji zadanej lub sondy.

Mutacje obejmują podstawienia, addycje, delecje, inwersje lub insercje jednej lub więcej reszty aminokwasowej. Dotyczy to także takich polipeptydów, które otrzymano przez modyfikację polipeptydów pokazanych w Sekw. Nr 2, 4, 6.

Przez homologię dwóch sekwencji kwasów nukleinowych rozumie się identyczność sekwencji kwasów nukleinowych, w każdym przypadku obejmującą całą długość sekwencji, która jest wyliczona przy pomocy programu porównującego algorytm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul i wsp. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 i kolejne), przy zastosowaniu następujących parametrów:

Gap weight (waga przerwy): 50 Length weight (waga długości): 3

Average match (średnia zgodność): 10 Average mismatch (średnia niezgodność): 0

Na przykład sekwencja, która posiada przynajmniej 80% homologii z sekwencją Sekw. Nr 1 w składzie nukleotydów oznacza sekwencję, która w porównaniu z Sekw. Nr 1 wykonanym przy użyciu powyższego programu-algorytmu i przy zastosowaniu powyższych parametrów posiada przynajmniej 80% homologii.

Przez homologię dwóch polipeptydów rozumie się identyczność sekwencji aminokwasowej, w każdym przypadku dotyczącą całej długość sekwencji, która jest wyliczona przy pomocy programu porównującego algorytm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) przy zastosowaniu następujących parametrów:

Gap weight (waga przerwy): 8 Length weight (waga długości): 2

Average match (średnia zgodność): 2,912 Average mismatch (średnia niezgodność): - 2,003

Na przykład sekwencja, która posiada przynajmniej 80% homologii z sekwencją Sekw. Nr 2 w skł adzie aminokwasów oznacza sekwencję , która w porównaniu z Sekw. Nr 2 wykonanym przy użyciu powyższego programu-algorytmu i przy zastosowaniu powyższych parametrów posiada przynajmniej 80% homologii.

Funkcjonalne odpowiedniki uzyskane z jednego z polipeptydów pokazanych w Sekw. Nr 2, 4, 6 przez podstawienie, insercję lub delecję posiadają przynajmniej 60%, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90%, szczególnie korzystnie przynajmniej 95%, a najkorzystniej przynajmniej 98% homologii z jednym z polipeptydów pokazanych w Sekw. Nr 2, 4, 6 i wyróżniają je zasadniczo te same właściwości jakie posiadają polipeptydy pokazane w Sekw. Nr 2, 4, 6.

Funkcjonalne odpowiedniki uzyskane z sekwencji kwasów nukleinowych pokazanych w Sekw. Nr 1, 3, 5 przez podstawienie, insercję lub delecję posiadają przynajmniej 60%, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90%, szczególnie korzystnie przynajmniej 95%, a najkorzystniej przynajmniej 98% homologii z jednym z polipeptydów pokazanych w Sekw. Nr 1, 3, 5 i kodują polipeptydy posiadające zasadniczo te same właściwości jak polipeptydy pokazane w Sekw. Nr 2, 4 lub 6.

Białka RacB obejmujące funkcjonalne odpowiedniki korzystnie posiadają przynajmniej jeden z nastę pują cych motywów sekwencji:

a) element G1 GXXXXGKS/T korzystnie w N-końcowym regionie, szczególnie korzystnie element ten zawiera sekwencję GDGAVGKT, najkorzystniej element ten posiada sekwencję KCVTVGDGAVGKTC.

b) region efektorowy G2 zawierający motyw o sekwencji PTVFDN, szczególnie korzystnie o sekwencji NTFPTDYVPTVFDNFSANVV.

c) element G3 zawierający sekwencję LWDTAGQ, szczególnie korzystnie sekwencję NLGLWDTAGOEDYN.

d) element G4 zawierający sekwencję TKXD, szczególnie korzystnie sekwencję TKLD, najkorzystniej sekwencję LVGTKLDLRDDKQ.

e) element G5 zawierający sekwencję EXS, szczególnie korzystnie sekwencję ECSS, najkorzystniej sekwencję ECSSKTG.

f) motyw C-końcowej izoprenylacji (CXXX, Hassanain HH i wsp. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272(3):783-8.), szczególnie korzystnie CSIL.

Szczególnie korzystnie, gdy przynajmniej 2 lub 3 takie motywy (od a do f) znajdują się w funkcjonalnym odpowiedniku białka RacB, bardziej korzystnie, gdy przynajmniej 4 lub 5 takich motywów, najkorzystniej, gdy wszystkie motywy od a do f znajdują się w funkcjonalnym odpowiedniku białka RacB. Dalsze motywy sekwencji, które są charakterystyczne dla RacB, w szczególności także motywy,

PL 206 304 B1 które pozwalają odróżnić go od białek Racl, mogą być łatwo wywnioskowane przez specjalistę z dziedziny z porównania znanych sekwencji RacB (lub Racl), jak pokazano w fig. 1.

Przykłady funkcjonalnych odpowiedników białek RacB pokazanych w Sekw. Nr 2, 4 lub 6, które to odpowiedniki mogą być obniżone przy użyciu sposobów według wynalazku, mogą być zidentyfikowane na przykład u różnych organizmów, których sekwencja genomu jest znana, takich jak na przykład Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solarium tuberosum lub Helianthinum, przy użyciu baz danych zawierających porównania homologii.

Przeszukiwanie bibliotek cDNA lub genomowych pochodzących z innych organizmów, korzystnie z gatunków roślin, określanych dalej jako organizmy transformowane, przy użyciu sekwencji kwasów nukleinowych pokazanych w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 lub ich części jako sondy, jest także sposobem identyfikacji homologów u innych gatunków. Sposoby te znane są specjaliście z dziedziny. W tym kontekście sondy pochodzące z sekwencji kwasów nukleinowych pokazanych w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 mają długość przynajmniej 20 pz, korzystnie 50 pz, szczególnie korzystnie 100 pz, korzystniej 200 pz, a najkorzystniej 400 pz. Nić DNA, która jest komplementarna do sekwencji pokazanych w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 może być również wykorzystana do przeszukiwania bibliotek.

Zgodnie z tym, funkcjonalne odpowiedniki obejmują sekwencje DNA, które hybrydyzują w standardowych warunkach z sekwencją kwasów nukleinowych RacB pokazaną w Sekw. Nr 1, 3 lub 5, z sekwencją komplementarną do niej lub jej częścią i które, jako całe sekwencje, kodują białka o tych samych właściwościach jak białka pokazane w Sekw. Nr 2, 4 lub 6. Przez termin „standardowe warunki hybrydyzacji rozumie się w szerokim sensie ostre, lub także mniej ostre warunki hybrydyzacji. Takie warunki hybrydyzacji opisano, między innymi w Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T i wsp., w Molecular Cloning (A Laboratory Manual), drugie wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, str. 9.31-9.57) lub w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Na przykład warunki etapu płukania mogą być wybrane z zakresu warunków określanych jako nisko-ostre warunki (w przybliżeniu 2X SSC w temp. 50°C) i wysoko-ostre warunki (w przybliżeniu 0,2X SSC w temp. 50°C, korzystnie w temp. 65°C) (20X SSC: 0,3M cytrynian sodu, 3M NaCl, pH 7.0). Dodatkowo temperatura etapu płukania może zostać podwyższona z temperatury pokojowej dla nisko-ostrych warunków, w przybliżeniu 22°C, do temperatury wyższej dla warunków wyższych-ostrych, w przybliż eniu 65°C. Zarówno oba parametry, stężenia soli i temperatura, mogą być zmieniane jednocześnie lub jeden z tych dwóch parametrów może być utrzymywany na stałym poziomie, podczas gdy drugi może być zmieniany. Czynniki denaturujące, na przykład formamid lub SDS mogą być wykorzystane podczas hybrydyzacji. W obecności 50% formamidu hybrydyzacja korzystnie zachodzi w temperaturze 42°C. Niektóre przykładowe warunki hybrydyzacji i etapów płukania pokazano poniżej:

(1) warunki hybrydyzacj do wyboru, na przykład z następujących warunków:

a) 4X SSC w temp. 65°C,

b) 6X SSC w temp. 45°C,

c) 6X SSC, 100 mg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy rybiej, w temp. 68°C,

d) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, w temp. 68°C,

e) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, 50% formamid, w temp. 42°C,

f) 50% formamid, 4XSSC w temp. 42°C, lub

g) 50% (v/v) formamid, 0,1% albuminy z bydlęcej surowicy, 0,1% Ficoll, 0,1% poliwinylopirolidon, 50mM bufor fosforanu sodu pH 6,5, 750 mM chlorek sodu, 75 mM cytrynian sodu w temp. 42°C, lub

h) 2X lub 4X SSC w temp. 50°C (nisko-ostre warunki),

i) 30 lub 40% formamid, 2X lub 4X SSC w temp. 42°C (nisko-ostre warunki), (2) warunki etapów płukania do wyboru, na przykład z następujących warunków:

a) 0,015 M NaCl/ 0,015 M cytrynian sodu/ 0,1% SDS w temp. 50°C,

b) 0,1X SSC w temp. 65°C,

c) 0,1X SSC, 0,5% SDS w temp. 68°C,

d) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% formamid w temp. 42°C,

e) 0,2XSSC, 0,1% SDS w temp. 42°C,

f) 2X SSC w temp. 65°C (nisko-ostre warunki).

Funkcjonalne odpowiedniki pochodzące z sekwencji polipeptydów pokazanych w Sekw. Nr 2, 4 lub 6 obejmują w szczególności także białka posiadające sekwencje pokazane w Sekw. Nr 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 lub 70. Przez termin funkcjonalne odpowiedniki

PL 206 304 B1 rozumie się w szczególności białka kodowane przez sekwencje nukleotydowe pokazane w Sekw. Nr 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 lub 69.

Obniżenie ekspresji białka RacB, aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB może być zrealizowane na wiele sposobów.

Terminy obniżenie lub obniżanie dotyczące białka RacB, aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB mogą być szeroko interpretowane i obejmują częściową lub zasadniczo całkowitą inhibicję lub blokowanie funkcjonalności białka RacB w roślinie lub jej części, tkance, organie, komórkach lub nasionach, gdzie inhibicja lub blokowanie oparte sana różnorodnych mechanizmach cytobiologicznych.

Dla celów wynalazku, obniżenie obejmuje także ilościowe obniżenie białka RacB do zasadniczo całkowitego braku białka RacB (t.j. braku wykrywalności aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB albo braku wykrywalności białka RacB przy użyciu reakcji immunologicznej). W tym kontekście ekspresja w szczególności białka RacB lub aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB w komórce lub organizmie jest korzystnie obniżona o więcej niż 50%, szczególnie korzystnie o więcej niż 80%, a najkorzystniej o wię cej niż 90%. Wynalazkiem obję te są róż norodne strategie stosowane w celu obniżenia ekspresji białka RacB, aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB. Specjalista z dziedziny jest świadomy istnienia wielu sposobów wpływania na ekspresję białka RacB, aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB w pożądany sposób.

Obniżenie aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB osiąga się korzystnie przez obniżenie ekspresji endogennego białka RacB.

Obniżenie ilości białka RacB, aktywności białka RacB lub funkcji białka RacB może być uzyskane przy zastosowaniu następujących metod:

a) wprowadzenie dwuniciowej sekwencji RacB kwasu nukleinowego RNA (RacB dsRNA) lub kasety (kaset) ekspresyjnej zapewniającej ekspresję takiej sekwencji,

b) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję. Takie metody, w których antysensowną sekwencja kwasu nukleinowego jest skierowana przeciwko genowi RacB (tj. genomowym sekwencjom DNA) łub przeciwko transkryptowi genu RacB (tj. sekwencjom RNA). Metodą są także objęte ct-anomeryczne sekwencje kwasów nukleinowych.

c) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w kombinacji z rybozymem lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

d) wprowadzenie sensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w celu wyindukowania kosupresji lub wprowadzenie kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

e) wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej dominującego-negatywnego mutanta białka RacB lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

f) wprowadzenie czynników wiążących DNA lub białka, skierowanych przeciwko genom RacB, sekwencjom RNA genu RacB lub białkom RacB albo kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

g) wprowadzenie wirusowych sekwencji kwasu nukleinowego i konstruktów ekspresyjnych powodujących degradację RNA RacB albo kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

h) wprowadzenie konstruktów w celu wyindukowania homologicznej rekombinacji endogennych genów RacB, na przykład w celu otrzymania mutantów nokautowych,

i) wprowadzenie mutacji w endogennych genach RacB w celu uzyskania utraty funkcji (na przykład wytworzenia kodonów stop, zmiany ramki odczytu i tym podobnych).

W tym kontek ś cie, każ da lub wszystkie z tych metod mogą spowodować obniż enie ekspresji RacB, aktywności RacB lub funkcji RacB dla celów wynalazku. Możliwe jest również połączenie tych metod. Kolejne metody są znane specjaliście z dziedziny i mogą obejmować wstrzymanie lub zapobieganie obróbki białka RacB, transportu białka RacB lub mRNA RacB, zahamowanie przyłączenia do rybosomu, zahamowanie składania RNA, indukcję enzymów degradujących RNA RacB i/lub zahamowanie elongacji lub terminacji translacji.

Korzystne, poszczególne procesy opisano szczegółowo poniżej:

a) wprowadzenie dwuniciowej sekwencji RacB kwasu nukleinowego RNA (RacB dsRNA)

Sposób regulacji genów przy użyciu dwuniciowego RNA („dwuniciowe RNA interferujące, dsRNAi) opisano wielokrotnie dla organizmów zwierzęcych i roślinnych (na przykład Matzke MA i wsp. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. i wsp. (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Powyższe publikacje zacytowano ze względu na opisane w nich procesy i metody. Skuteczna supresja genu

PL 206 304 B1 może także być wykazana w doświadczeniu z wykorzystaniem przejściowej ekspresji lub przejściowej transformacji na przykład w wyniku biolistycznej transformacji (Schweizer P i wsp. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Metody dsRNAi są oparte na zjawisku, w którym jednoczesne wprowadzenie nici komplementarnej i kodującej transkryptu genu powoduje supresję ekspresji genu w sposób wysoce efektywny. Otrzymany fenotyp bardzo przypomina odpowiadające mutanty nokautowe (Waterhouse PM i wsp. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-64).

Wykazano, że metoda dsRNAi jest szczególnie skuteczna i korzystna w obniżeniu ekspresji RacB. Jak opisano, między innymi w WO 99/32619, metody dsRNAi przewyższają znacząco tradycyjne techniki antysensowne.

Dwuniciowa cząsteczka RNA (cząsteczki dsRNA) po wprowadzeniu do rośliny (albo komórki, tkanki, organu lub nasion z niej pochodzących) powoduje obniżenie RacB.

W dwuniciowej cząsteczce RNA stosowanej w celu obniżenia ekspresji białka RacB,

a) jedna z dwóch nici RNA jest zasadniczo identyczna z przynajmniej częścią sekwencji kwasu nukleinowego RacB, oraz

b) odpowiadająca druga nić RNA jest zasadniczo identyczna z przynajmniej częścią komplementarnej nici sekwencji kwasu nukleinowego RacB.

Dwuniciową cząsteczkę RNA stosuje się aby obniżyć ekspresę białka RacB, przy czym cząsteczka obejmuje:

a) sensowną nić RNA obejmującą przynajmniej jedną sekwencję rybonukleotydową, która jest zasadniczo identyczna z przynajmniej częścią sensownego transkryptu RNA sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko RacB, oraz

b) antysensowną nić RNA, która jest zasadniczo - korzystnie całkowicie - komplementarna do sensownej nici RNA z pkt. a).

W odniesieniu do czą steczki dwuniciowego RNA, przez sekwencje kwasu nukleinowego RacB rozumie się korzystnie sekwencje pokazane w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 lub ich funkcjonalne odpowiedniki pokazane w Sekw. Nr 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 lub 69.

Termin „zasadniczo identyczny oznacza, że sekwencja dsRNA może także posiadać insercję, delecję lub pojedyncze mutacje punktowe w porównaniu z docelową sekwencją RacB lub docelową sekwencją odpowiednika funkcjonalnego, pod warunkiem posiadania nadal zdolności skutecznego obniżania ekspresji. W związku z powyższą definicją homologia sięga przynajmniej 75%, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90%, a najkorzystniej 100%, pomiędzy sensowną nicią inhibitorowego dsRNA i przynajmniej częścią sensownego transkryptu RNA sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej białko RacB lub jego odpowiednik funkcjonalny (lub pomiędzy antysensowną nicią komplementarnej nici sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej białko RacB lub jego odpowiednik funkcjonalny).

Długość części-segmentu wynosi przynajmniej 10 zasad, korzystnie przynajmniej 25 zasad, szczególnie korzystnie przynajmniej 50 zasad, szczególnie korzystniej przynajmniej 100 zasad i najkorzystniej przynajmniej 200 zasad lub przynajmniej 300 zasad.

Alternatywnie, „zasadniczo identyczny dsRNA może także być określony jako sekwencja kwasu nukleinowego, która jest zdolna do hybrydyzacji z częścią przechowywanego transkryptu genowego białka (na przykład w 400 mM NaCl, 40 mM PIPES o pH 6,4, 1 mM EDTA w temp. 50°C lub 70°C przez 12 do 16 h).

Przez termin zasadniczo komplementarny rozumie się to, że antysensowną nić RNA może także zawierać insercję, delecję i pojedyncze mutacje punktowe w porównaniu do odpowiadającej sensownej nici RNA. Korzystnie homologia pomiędzy antysensowną nicią RNA i odpowiadającą sensowną nicią RNA wynosi przynajmniej 80%, korzystnie przynajmniej 90%, szczególnie korzystnie 95%, najkorzystniej 100%.

Przez termin część sensownego transkryptu RNA sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej białko RacB lub jego funkcjonalny odpowiednik rozumie się fragmenty RNA lub mRNA transkrybowane z sekwencji kwasu nukleinowego, korzystnie genu RacB, kodującego białko RacB lub jego funkcjonalny odpowiednik. Tutaj, fragmenty te posiadają korzystnie długość sekwencji przynajmniej 20 zasad, korzystnie przynajmniej 50 zasad, szczególnie korzystnie przynajmniej 100 zasad, szczególnie korzystniej przynajmniej 200 zasad, a najkorzystniej przynajmniej 500 zasad. Termin obejmuje także kompletne transkrybowane RNA lub mRNA.

Cząsteczka dsRNA może być stosowana w sposobach według wynalazku do wytworzenia oporności na czynnik chorobotwórczy u roślin. dsRNA może się składać z jednej lub wielu nici spoli24

PL 206 304 B1 meryzowanych rybonukleotydów. Mogą występować modyfikacje zarówno w szkielecie cukrowofosforanowym jak i w nukleozydach. Na przykład wiązania fosfodiestrowe występujące w naturalnym kwasie RNA mogą być zmodyfikowane w sposób dotyczący przynajmniej jednego heteroatomu siarki lub azotu. Zasady mogą być zmodyfikowane w taki sposób, że aktywność na przykład dezaminazy adenozynowej jest ograniczona. Te i inne modyfikacje opisano poniżej w sposobach stabilizacji antysensownego RNA.

Dla osiągnięcia tego samego celu możliwe oczywiście jest wprowadzenie wielu indywidualnych cząsteczek dsRNA, z których każda obejmuje jeden odcinek sekwencji rybonukleotydowej zdefiniowanej powyżej do komórki lub organizmu. Cząsteczka dsRNA może być wytworzona enzymatycznie albo całkowicie lub częściowo zsyntetyzowana chemicznie.

Struktura dwuniciowej cząsteczki dsRNA może być utworzona z dwóch komplementarnych, oddzielnych nici RNA lub korzystnie z pojedynczej samo-komplementarnej nici RNA.

W pojedynczej samo-komplementarnej nici, sekwencje sensowna i antysensowną mog ą być połączone przez sekwencję łączącą („łącznik) i mogą tworzyć na przykład strukturę „spinki do włosów. Sekwencja łącząca może być korzystnie intronem, który jest wycinany po zakończeniu syntezy dsRNA.

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca dsRNA może zawierać dalsze elementy takie jak na przykład sygnały terminacji transkrypcji lub sygnały poliadenylacji.

Połączenie dwóch nici dsRNA w komórce lub roślinie może być osiągnięte w różnoraki sposób: a) przez transformację komórki lub rośliny wektorem zawierającym obie kasety ekspresyjne, b) przez kotransformację komórki lub rośliny dwoma wektorami, przy czym jeden z nich zawiera kasety ekspresyjne z nicią sensowną, a drugi zawiera kasety ekspresyjne z nicią antysensowną,

c) przez hybrydyzację dwóch roślin, z których każda została stransformowana jednym wektorem, przy czym jeden z wektorów zawierał kasety ekspresyjne z nicią sensowną, a drugi zawierał kasety ekspresyjne z nicią antysensowną.

Utworzenie dupleksu RNA może być zainicjowane albo na zewnątrz albo wewnątrz komórki. Podobnie jak w WO 99/53050, dsRNA może także zawierać strukturę „spinki do włosów, w której nić sensowna i antysensowną połączone są łącznikiem (na przykład intronem). Samo-komplementame struktury dsRNA są korzystne, ponieważ wymagają tylko ekspresji jednego konstruktu i zawsze zawierają nici komplementarne w równomolowym stosunku. Kasety ekspresyjne kodujące nić antysensowną lub sensowną dsRNA albo samo-komplementarną nić dsRNA są korzystnie wstawione do wektora oraz przy użyciu sposobów opisanych poniżej stabilnie wprowadzone do genomu rośliny w sposób zapewniający stałą ekspresję dsRNA, potwierdzaną przy użyciu na przykład markerów selekcyjnych.

dsRNA może być wprowadzone przy użyciu ilości umożliwiającej wprowadzenie przynajmniej jednej kopii na komórkę. Wprowadzenie większych ilości (na przykład przynajmniej 5, 10, 100, 500 lub 1000 kopii na komórkę) może spowodować bardziej skuteczne obniżenie.

Jak już opisano, 100% identyczność sekwencji pomiędzy dsRNA a transkryptem genu RacB lub transkryptem genu funkcjonalnego odpowiednika nie jest koniecznie wymagana do spowodowania skutecznego obniżenia ekspresji RacB. Zgodnie z tym istnieje korzyść polegająca na tym, że sposób ten jest tolerancyjny w stosunku do zmienności sekwencji, które mogą istnieć jako wynik mutacji genetycznych, polimorfizmów lub dywergencji ewolucyjnej. W ten sposób na przykład możliwe jest zastosowanie dsRNA wytworzonego na podstawie sekwencji RacB pochodzącej z jednego organizmu do zahamowania ekspresji RacB u innego organizmu. Wysoka homologia sekwencji między sekwencjami RacB pochodzącymi z ryżu, kukurydzy i jęczmienia pozwala na wniosek, że białko to jest konserwowane w wysokim stopniu w roślinach, dlatego ekspresja dsRNA pochodzącego z jednej z ujawnionych sekwencji RacB pokazanych w Sekw. Nr 1, 3 lub 5, wydaje się wywierać korzystny wpływ także u innych gatunków roś lin.

Ponadto, z powodu wysokiej homologii indywidualnych białek RacB i ich funkcjonalnych odpowiedników, możliwe jest użycie pojedynczej dsRNA wytworzonej z sekwencji RacB pewnego organizmu do zahamowania ekspresji dalszych homologów białek RacB i/lub ich funkcjonalnych odpowiedników u tego samego organizmu lub także do zahamowania ekspresji białek RacB u innych spokrewnianych gatunków. W tym celu dsRNA korzystnie obejmuje regiony sekwencji transkryptów genu RacB, które odpowiadają regionym konserwowanym. Omawiane konserwowane regiony mogą być łatwo wyszukane przy pomocy porównania sekwencji.

Cząsteczka dsRNA może być zsyntetyzowana albo in vivo albo in vitro. W tym celu sekwencja DNA kodująca dsRNA może być wprowadzona do kasety ekspresyjnej pod kontrolę przynajmniej jedPL 206 304 B1 nego genetycznego elementu kontrolnego (takiego jak, na przykład promotor, sekwencja wzmacniająca, sekwencja wyciszająca, donor składania lub akceptor składania RNA, albo sygnał poliadenylacji). Odpowiednie korzystne konstrukty opisano poniżej. Zarówno nie jest wymagana poliadenylacja jak i nie muszą być obecne elementy inicjują ce translację .

Cząsteczka dsRNA może być zsyntetyzowana chemicznie lub enzymatycznie. Do tego celu mogą być wykorzystane komórkowe polimerazy RNA lub bakteriofagowe polimerazy RNA (takie jak na przykład T3, T7 lub SP6 polimerazy RNA). Odpowiednie metody ekspresji RNA in vitro opisano w (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Czą steczka dsRNA, która została zsyntetyzowana in vitro chemicznie lub enzymatycznie może być wyizolowana całkowicie lub w pewnym stopniu z mieszaniny reakcyjnej, na przykład przy użyciu metod ekstrakcji, strącania, elektroforezy, chromatografii lub kombinacji tych metod. Izolacja poprzedza wprowadzenie cząsteczki dsRNA bezpośrednio do komórki, tkanki lub organizmu. Cząsteczka dsRNA może być wprowadzona bezpośrednio do komórki lub także być podana zewnątrzkomórkowo (na przykład do przestrzeni śródmiąższowej).

Korzystne jest, aby stabilnie transformować roślinę konstruktem ekspresyjnym, co powoduje ekspresję dsRNA. Odpowiednie metody opisano poniżej, b) wprowadzenie antysensownej sekwencji kwasu nukleinowego RacB

Istnieje wiele przykładów hamowania specyficznych białek poprzez zapobieganie akumulacji ich mRNA przy użyciu technologii antysensownej, włączając przykłady zastosowań u roślin (Sheehy i wsp. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN i wsp. (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). Antysensowną cząsteczka kwasu nukleinowego hybrydyzuje lub wiąże się z komórkowym mRNA i/lub genomowym DNA kodującym docelowe białko RacB, które ma być zahamowane. W procesie tym hamowana jest transkrypcja i/lub translacja docelowego białka. Hybrydyzacja może zachodzić w sposób konwencjonalny przez utworzenie stabilnego dupleksu lub - w przypadku genomowego DNA - przez związanie antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego do dupleksu genomowego DNA poprzez specyficzne oddziaływania w większym rowku helisy DNA.

Antysensowna sekwencja kwasu nukleinowego, odpowiednia do obniżenia białka RacB, może być wyprowadzona z sekwencji kwasu nukleinowego kodującej to białko, na przykład z sekwencji kwasów nukleinowych pokazanych w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 albo sekwencji kwasu nukleinowego kodujących ich funkcjonalne odpowiedniki pokazane w Sekw. Nr 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 lub 69, z zachowaniem reguł parowania zasad Watsona i Cricka. Antysensowna sekwencja kwasu nukleinowego może być komplementarna do całego transkrybowanego mRNA omawianego białka, może być ograniczona do regionu kodującego lub także może obejmować tylko nukleotydy, które są częściowo komplementarne do kodującej lub niekodującej sekwencji mRNA. W ten sposób, na przykł ad sekwencja oligonukleotydu moż e być komplementarna do regionu obejmującego miejsce startu translacji omawianego białka. Antysensowne sekwencje kwasu nukleinowego mogą mieć długość na przykład 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 nukleotydów, ale także mogą być dłuższe i zawierać przynajmniej 100, 200, 500, 1000, 2000 lub 5000 nukleotydów. Antysensowne sekwencje kwasu nukleinowego mogą ulegać ekspresji rekombinacyjnie albo mogą być syntetyzowane chemicznie lub enzymatycznie przy użyciu metod znanych specjaliście z dziedziny. W przypadku chemicznej syntezy mogą zostać wykorzystane naturalne lub zmodyfikowane nukleotydy. Zmodyfikowane nukleotydy mogą powodować zwiększoną stabilność biochemiczną antysensownej cząsteczki nukleotydowej i prowadzić do zwiększonej fizycznej stabilności dupleksu utworzonego z antysensownej sekwencji kwasu nukleinowego i sensownej sekwencji docelowej. Mogą zostać wykorzystane następujące, zmodyfikowane nukleotydy: na przykład pochodne fosforosiarkowe i nukleotydy podstawione akrydyną takie jak 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hypoksantyna, ksantyna, 4-acetylocytozyna, 5-(karboksyhydroksymetylo)uracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydyna,

5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, β-D-galaktozylokweozyna, inozyna, N-6-izopentenyloadenina, 1-metyloguanina, 1-metyloinozyna, 2,2-dimetyloguanina, 2-metyloadenina, 2-metyloguanina, 3-metylocytozyna, 5-metylocytozyna, N-6-adenina, 7-metyloguanina, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, β-D-mannozylokweozyna, 5'-metoksykarboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metylotio-N-6-izopentenyloadenina, kwas uracylo-5-oksyoctowy, pseudouracyl, kweozyna, 2-tiocytozyna, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu uracylo-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy, 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropylo)uracyl i 2,6-diaminopuryna.

PL 206 304 B1

Ekspresja białka RacB może być zahamowana przez sekwencje nukleotydowe, które są komplementarne do regionu regulatorowego genu RacB (na przykład promotora i/lub sekwencji wzmacniającej genu RacB) i które tworzą trójniciowe struktury z tą podwójną helisą DNA, dzięki czemu transkrypcja genu RacB jest obniżona. Metody takie opisano w (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helena C i wsp. (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12):807-815).

Antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być α-anomerycznymi kwasami nukleinowymi. Cząsteczki α-anomerycznych kwasów nukleinowych tworzą specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA. W cząsteczkach takich - w przeciwieństwie do konwencjonalnych β-kwasów nukleinowych dwie nici przebiegają równolegle wzajemnie do siebie (Gautier C i wsp. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może ponadto zawierać także 2'-O-metylorybonukleotydy (Inoue i wsp. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) lub chimeryczne analogi RNA/DNA (Inoue i wsp. (1987) FEBS Lett 215:327-330).

c) wprowadzenie antysensownej sekwencji kwasu nukleinowego RacB w kombinacji z rybozymem

Opisana powyżej strategia antysensowną może być połączona korzystnie z metodą rybozymową. Katalityczne cząsteczki RNA lub rybozymy mogą być zaprojektowane dla docelowej cząsteczki RNA, tak aby trawić szkielet fosfodiestrowy w specyficznych miejscach, dezaktywując docelowe RNA (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275). Sam rybozym nie jest zmodyfikowany w ten sposób, ale posiada analogiczną zdolność trawienia innych cząsteczek docelowego RNA, w ten sposób wykazując właściwości enzymu. Wprowadzenie sekwencji rybozymu do antysensownych RNA nadaje temu RNA, przypominającemu enzym, własności precyzyjnie trawiące te właśnie antysensowne RNA, zwiększając w ten sposób skuteczność inaktywacji docelowego RNA. Wytworzenie i wykorzystanie takich rybozymowych antysensownych cząsteczek RNA opisano na przykład w Haseloff i wsp. (1988) Nature 334: 585-591.

W ten sposób rybozymy (na przykład rybozymy typu „główka młotka Haselhoff i Gerlach (1988) Nature 334:585-591) mogą być wykorzystane do katalitycznego trawienia mRNA enzymu, który ma być zahamowany, na przykład RacB, w celu niedopuszczenia do translacji. Technika rybozymowa może zwiększać skuteczność strategii antysensownej. Sposoby ekspresji rybozymów, stosowanych w celu obniżenia specyficznych białek ujawniono w (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). Opisano także ekspresję rybozymu w komórkach roślinnych (Steinecke P i wsp. (1992) EMBO J 11(4): 1525-1530; de Feyter R i wsp. (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338).

Odpowiednie sekwencje docelowe i rybozymy mogą być wyznaczone tak jak opisano na przykład w „Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith i wsp. ed, Academic Press, Inc. (1995), str. 449-460 poprzez wyznaczenie struktury drugorzędowej RNA rybozymu i RNA sekwencji docelowej, a także ich oddziaływań (Bayley CC i wsp. (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361; Lloyd AM and Davis RW i wsp. (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657). Na przykład można skonstruować RNA L-19 IVS, pochodzące z Tetrahymena, zawierające regiony komplementarne do mRNA hamowanego białka RacB (zob. także US 4,987,071 i US 5,116,742). Alternatywnie taki rybozym może być zidentyfikowany w bibliotece, zawierającej różne rybozymy w procesie selekcyjnym (Bartel D i Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418).

d) wprowadzenie sensownej sekwencji kwasu nukleinowego RacB w celu wywołania kosupresji

Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego RacB w orientacji sensownej może prowadzić do kosupresji odpowiadającego, homologicznego, endogennego genu. Ekspresja sensownego RNA, homologicznego do endogennego genu może obniżyć lub wyłączyć ekspresję tego genu, podobnie jak to opisano dla podejścia antysensownego (Jorgensen i wsp. (1996) Plant Mol Biol 31(5):957-973; Goring i wsp. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith i wsp. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli i wsp. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Kroi i wsp. (1990) Plant Cell 2:291-99). W tym kontekście homologiczny gen, który ma być obniżony, może w całości lub częściowo być zawarty we wprowadzanym konstrukcie, przy czym nie jest wymagana możliwość translacji tego genu. Zastosowanie tej techniki u roślin opisano na przykład w Napoli i wsp. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 oraz w US 5,034,323.

Kosupresja jest korzystnie realizowana przy użyciu sekwencji zasadniczo identycznych z przynajmniej częścią sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko RacB lub jego funkcjonalny odpowiednik, na przykład z częścią sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej w Sekw. Nr 1, 3 lub 5 albo

PL 206 304 B1 sekwencji kwasu nukleinowego kodującej jego funkcjonalny odpowiednik, na przykład sekwencji pokazanej w Sekw. Nr 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 lub 69.

e) wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodujących dominujący-negatywny mutant białka RacB

Funkcja lub aktywność białka RacB może być wywołana skutecznie poprzez ekspresję wariantu białka RacB typu dominującego-negatywnego mutanta. Specjaliście z dziedziny znane są sposoby obniżania funkcji lub aktywności białka poprzez koekspresję jego dominującej-negatywnej formy (Lagna G i Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM i Alberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1): 1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22).

Na przykład dominujący-negatywny wariant RacB może być otrzymany przez modyfikację aminokwasu treoniny w pozycji 20 białek RacB z kukurydzy, ryżu lub jęczmienia do korzystnie kwasu asparaginowego. Treonina, która jest korzystnie zmutowana lub odpowiednio także seryna (podobnie do treoniny w pozycji 20 białka RacB z kukurydzy, ryżu lub jęczmienia) w białkach homologicznych do RacB, pochodzących z innych gatunków, może być znaleziona przy użyciu komputerowych technik porównawczych (ang. „alignment). Mutacje te, służące otrzymaniu dominującego-negatywnego wariantu RacB, są korzystnie wprowadzane na poziomie sekwencji kwasu nukleinowego kodujących białka RacB. Odpowiednia mutacja może być wprowadzona przy pomocy mutagenezy in vitro - techniki wykorzystującej metodę PCR i zastosowaniu odpowiednich starterów, które umożliwiają wprowadzenie pożądanej mutacji. Sposoby te są znane specjaliście z dziedziny, na przykład w tym celu może być wykorzystany zestaw „LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (Takara Shuzo, Kyoto). Sposób wytworzenia dominującego-negatywnego wariantu białka RacB z kukurydzy opisano także w WO 00/15815 (Przykład 4, str. 69).

Szczególnie korzystne są dominujące-negatywne warianty białek RacB z jęczmienia, ryżu lub kukurydzy opisane w Sekw. Nr 7, 8 i 9.

f) wprowadzenie czynników wiążących DNA lub białko skierowanych przeciwko genom RacB, sekwencjom RNA RacB lub białkom RacB

Ekspresja genu RacB może być także obniżona przy użyciu specyficznych czynników wiążących DNA, na przykład z grupy czynników transkrypcyjnych zawierających element tzw. palca cynkowego. Czynniki te łączą się z sekwencją genomową endogennego genu docelowego, korzystnie w regionach regulatorowych i powodują represję endogennego genu. Zastosowanie takiej metody umożliwia obniżenie ekspresji endogennego genu RacB, bez konieczności rekombinacyjnego manipulowania jego sekwencją. Odpowiednie metody przygotowania odpowiednich czynników opisano w (Dreier B i wsp. (2001) J Biol Chem 276(31):29466-78; Dreier B i wsp. (2000) J Mol Biol 303(4): 489-502; Beerli RR i wsp. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4): 1495-1500; Beerli RR i wsp. (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ i Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(l):34-39; Kang JS i Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12):8742-8748; Beerli RR i wsp. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25): 14628- 14633; Kim JS i wsp. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8):3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY i wsp. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3)23-31; Mapp AK i wsp. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD i wsp. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29( 12): 1371-1387; Zhang L i wsp. (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860).

Czynniki te mogą zostać wybrane do pożądanej części genu RacB. Segment taki jest korzystnie położony w regionie promotora. Niemniej jednak, w celu uzyskania supresji genu, może on także znajdować się w regionie kodującym egzony lub introny. Segmenty, o których mowa, mogą być wybrane przez specjalistę z dziedziny na podstawie przeszukiwania bazy danych Genbank, albo wykorzystując cDNA genu RacB, które nie jest obecne w bazie Genbank, poprzez przeszukiwanie bibliotek genomowych w celu uzyskania odpowiednich genomowych klonów. Specjalista z dziedziny zna wymagane do tego celu metody.

Ponadto, możliwe jest wprowadzenie do komórek czynników hamujących samo docelowe białko RacB. Czynnikami wiążącymi białka mogą być na przykład aptamery (Famulok M i Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) lub przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub jednołańcuchowe przeciwciała. Metody otrzymywania tych czynników zostały opisane i są znane specjaliście z dziedziny. Na przykład przeciwciało cytoplazmatyczne scFv zostało użyte w celu modulowania aktywności białka fitochromu A w genetycznie modyfikowanych roślinach tytoniu (Owen M i wsp. (1992) Biotechnology (NY) 10(7)790-794; Franken E i wsp. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272).

PL 206 304 B1

Ekspresja genu może być także zahamowana poprzez odpowiednio dobrane niskocząsteczkowe, syntetyczne związki, na przykład poliamidowe (Dervan PB i Biirli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM i wsp. (2000) Gene Expr 9(1-2)77-91). Związki te są oligomerami i składają się z jednostek 3-(dimetyloamino)propyloaminy, N-metylo-3-hydroksypirolu, N-metyloimidazolu i N-metylopirolu i mogą być zaadaptowane do każdego fragmentu dwuniciowego DNA w taki sposób, że mogą wiązać się w większym rowku w sposób specyficzny do sekwencji i blokować ekspresję tych sekwencji genowych. Zostały opisane odpowiednie metody (zob., m.in. Bremer RE i wsp. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ i wsp. (2001) Chem Biol. 8(6):583-92; Gottesfeld JM i wsp. (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR i wsp. (2001) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC i wsp. (2001) Bioorg Med Chem 9(3):653-7; Urbach AR i Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8):4343-8; Chiang SY i wsp. (2000) J Biol Chem. 275(32):24246-54).

g) wprowadzenie wirusowych sekwencji kwasu nukleinowego i konstruktów ekspresyjnych, które powodują degradację RNA genu RacB

Na ekspresję RacB można także skutecznie wpływać poprzez indukcję degradacji specyficznego RNA RacB w roślinie przy pomocy systemu wirusowej ekspresji (amplicon) (Angell, SM i wsp. (1999) Plant J. 20(3):357-362). W systemach tych - nazywanych także „VIGS (wyciszanie genów indukowane wirusem, ang. ,,viral induced gene silencing) wprowadza się do rośliny sekwencje kwasu nukleinowego, homologiczne do transkryptów, które mają zostać zahamowane, przy pomocy wektorów wirusowych. W wyniku tego transkrypcja jest wyłączana, prawdopodobnie w wyniku występowania mechanizmów obronnych rośliny przeciwko wirusom. Zostały opisane odpowiednie techniki i metody (Ratcliff F i wsp. (2001) Plant J 25(2):237-45; Fagard M i Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3): 285-93; Anandalakshmi R i wsp. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(22):13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46).

h) wprowadzenie konstruktów indukujących homologiczną rekombinację endogennych genów RacB, na przykład w celu otrzymania mutantów nokautowych

Przykładem elementów, służących do wytworzenia homologicznie rekombinowanych organizmów z obniżoną aktywnością RacB, są konstrukty kwasów nukleinowych, obejmujące przynajmniej częściowo endogenny gen RacB, który jest zmodyfikowany poprzez delecję, addycję lub substytucję przynajmniej jednego nukleotydu, w ten sposób, że jego działanie jest obniżone lub całkowicie zniszczone. Modyfikacja może także dotyczyć elementów regulacyjnych genu (na przykład promotora), w ten sposób, że sekwencja kodująca pozostaje nienaruszona, ale ekspresja (transkrypcja i/lub translacja) nie zachodzi i jest obniżona.

W przypadku tradycyjnej homologicznej rekombinacji, modyfikowany region jest otoczony na końcach 5' i 3' przez dalsze sekwencje kwasu nukleinowego, które muszą być wystarczająco długie, aby możliwa była rekombinacja. Ich długość zasadniczo mieści się w zakresie od kilkuset par zasad do kilku tysięcy par zasad (Thomas KR i Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp i wsp. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8):4368-4373). Organizm gospodarza, u którego ma zajść homologiczna rekombinacja - na przykład roślina - jest transformowany konstruktem rekombinacyjnym przy użyciu metod opisanych poniżej, a następnie wybierane są klony, u których zaszła właściwa rekombinacja, na przykład stosując oporność na antybiotyki lub herbicydy.

Homologiczna rekombinacja zachodzi względnie rzadko u wyższych eukariontów, szczególnie u roślin. Dominuje losowa integracja do genomu gospodarza. Jedną z możliwości eliminacji losowo zintegrowanych sekwencji, i w ten sposób zwiększenia liczby klonów komórkowych z właściwą homologiczną rekombinacją, jest zastosowanie systemu rekombinacji specyficznego do sekwencji, opisanego w US 6,110,736, w którym niespecyficznie zintegrowane sekwencje są ponownie usuwane, co upraszcza sposób wyboru przypadków, w których nastąpiła właściwa integracja na drodze homologicznej rekombinacji. Istnieje duża liczba systemów rekombinacji specyficznych do sekwencji, która może być zastosowana do tego celu, na przykład system Cre/lox z bakteriofaga P1, drożdżowy system FLP/FRT, rekombinaza Gin faga Mu, rekombinaza Pin z E. coli i system R/RS z plazmidu pSR1. Korzystne jest system Cre/lox z bakteriofaga P1 oraz drożdżowy system FLP/FRT. Systemy FLP/FRT i system rekombinazy Cre/lox zastosowano już w systemach roślinnych (Odell i wsp. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378).

i) wprowadzenie mutacji do endogennych genów RacB, w celu uzyskania utraty funkcji (na przykład wytworzenie kodonu stop, zmianę ramki odczytu i tym podobne) Kolejnymi odpowiednimi metodami, służącymi do obniżenia aktywności genu RacB, są metody wprowadzające do endogennych genów RacB mutacje typu nonsens, na przykład wprowadzenie oligonukleotydów RNA/DNA do

PL 206 304 B1 roślin (Zhu i wsp. (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558) i wytworzenie mutantów nokautowych przy pomocy, na przykład mutagenezy T-DNA (Kończ i wsp. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976), mutagenezy ENU (N-etylo-N-nitrozomocznik) lub homologicznej rekombinacji (Hohn B i Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96:8321-8323.). Mutacje punktowe mogą być wprowadzone przy użyciu hybryd DNA-RNA, znanych także jako „chimeroplasty (Cole-Strauss i wsp. (1999) Nucl Acids Res 27(5):1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3):240-247).

Metody dsRNAi, kosupresji, w których stosuje się sensowne RNA i „VIGS („wyciszanie genu indukowane wirusem”) określa się także terminem „potranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS - ang. „post-transcriptional gene silencing). Metody PTGS, podobnie jak obniżenie funkcji lub aktywności RacB przy pomocy dominujących-negatywnych wariantów RacB, są szczególnie korzystne, ponieważ wymagania dotyczące homologii pomiędzy endogennym genem, który ma być zahamowany, a sekwencją sensowną lub dsRNA kwasu nukleinowego, która ma ulegać ekspresji rekombinacyjnie (lub pomiędzy endogennym genem i jego dominującym-negatywnym wariantem) są niższe niż, na przykład w przypadku tradycyjnego podejścia antysensownego. O takich kryteriach dotyczących homologii wspomniano przy opisie metody dsRNAi i mogą one być zastosowane ogólnie do metod PTGS lub podejść z dominującym-negatywnym wariantem. W związku z wysokim stopniem homologii pomiędzy białkami RacB z kukurydzy, ryżu i jęczmienia, można założyć, że u roślin białko to jest w wysokim stopniu konserwowane. W ten sposób używając sekwencji kwasu nukleinowego RacB z jęczmienia, kukurydzy lub ryżu, przypuszczalnie można także skutecznie zahamować ekspresję homologicznych białek RacB u innych gatunków, bez konieczności izolowania i określania struktury występujących u nich homologów RacB. W ten sposób znacząco ograniczony jest nakład pracy. Podobnie użycie dominujących-negatywnych wariantów białka RacB z ryżu, kukurydzy lub jęczmienia może przypuszczalnie także skutecznie obniżyć lub zahamować funkcję/aktywność jego homologów u innych gatunków roś lin.

Wszystkie substancje i związki, które bezpośrednio lub pośrednio powodują obniżenie ilości białka, ilości RNA, aktywności genu lub aktywności białka RacB określane są terminem związki „antyRacB. Termin związek „anty-RacB obejmuje wprost sekwencje kwasów nukleinowych, peptydy, białka lub czynniki wykorzystywane w wyżej opisanych metodach.

Dla celów wynalazku, termin „wprowadzenie obejmuje wszystkie metody, za pomocą których możliwe jest bezpośrednie łub pośrednie wprowadzenie związku „anty-RacB do rośliny lub jej komórki, przedziału komórkowego, tkanki, organu lub nasienia albo wytworzenie tam takiego związku przy użyciu bezpośrednich i pośrednich metod. Wprowadzenie może prowadzić do przejściowej obecności związku „anty-RacB (na przykład dsRNA) lub także do jego stabilnej obecności.

Z powodu róż nej natury opisanych powyż ej podejść, zwią zek „anty-RacB moż e wywierać swoją funkcję bezpośrednio (na przykład poprzez wbudowanie się w endogenny gen RacB). Także może on oddziaływać pośrednio w wyniku transkrypcji i powstania RNA (na przykład w przypadku podejścia antysensownego) lub w wyniku transkrypcji i translacji i powstania białka (na przykład w przypadku czynników wiążących). Termin dotyczy zarówno bezpośrednio jak i pośrednio działających związków.

Termin „wprowadzenie dotyczy na przykład takich metod jak transfekcja, transdukcja lub transformacja.

Dlatego też, związki „Anty-RacB obejmują także ekspresyjne konstrukty rekombinacyjne, które umożliwiają ekspresję (tj. transkrypcję i jeśli to konieczne translację) na przykład dsRNA RacB lub antysensownego RNA RacB, korzystnie w roślinie lub jej części, tkance, organie lub nasieniu.

W omawianych konstruktach ekspresyjnych, czą steczka kwasu nukleinowego, której ekspresja (tj. transkrypcja i jeśli to konieczne translacja) powoduje powstanie związku „anty-RacB jest korzystnie funkcjonalnie połączona z przynajmniej jednym genetycznym elementem regulatorowym (na przykład promotorem), który zapewnia ekspresję w organizmie, korzystnie w roślinach.

Jeśli konstrukt ekspresyjny ma być wprowadzony bezpośrednio do rośliny i związek „antyRacB (na przykład dsRNA RacB) ma być w niej wytworzony, korzystne są genetyczne elementy regulatorowe, specyficzne dla roślin (na przykład promotory). Jednakże związek „anty-RacB także może zostać wytworzony w innych organizmach lub in vitro i następnie wprowadzony do rośliny (jak opisano w przykładach 6 i 7). Korzystne w tym kontekście są wszystkie prokariotyczne i eukariotyczne genetyczne elementy regulatorowe (na przykład promotory), które pozwalają na ekspresję w wybranym organizmie, w każdym przypadku do przygotowania.

Przez termin „funkcjonalne połączenie rozumie się na przykład sekwencyjne ułożenie promotora i sekwencji kwasu nukleinowego mającej ulegać ekspresji (na przykład związek „anty-RacB) oraz

PL 206 304 B1 jeśli to konieczne kolejnych elementów regulatorowych, takich jak na przykład terminator, w taki sposób, że każdy z elementów regulatorowych może pełnić swoją funkcję, gdy sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji, w zależności od ułożenie sekwencji kwasu nukleinowego w stosunku do sensownego i antysensownego RNA. W tym celu bezpośrednie połączenie w chemicznym rozumieniu nie jest koniecznie wymagane. Genetyczne sekwencje regulatorowe, takie jak na przykład sekwencje wzmacniające, mogą także wywierać swoją funkcję na sekwencję docelową z miejsca, które jest bardzo oddalone lub nawet z innych cząsteczek DNA. Korzystne rozmieszczenie to takie rozmieszczenie, w którym sekwencja kwasu nukleinowego, mająca ulec rekombinacyjnej ekspresji, jest położona za sekwencją działającą jako promotor, w ten sposób, że dwie sekwencje są ze sobą wzajemnie, kowalencyjnie połączone. Odległość pomiędzy sekwencją promotora i sekwencją kwasu nukleinowego, mającej ulegać rekombinacyjnej ekspresji, jest korzystnie mniejsza niż 200 par zasad, szczególnie korzystnie mniejsza niż 100 par zasad, a najkorzystniej mniejsza niż 50 par zasad.

Funkcjonalne połączenie i kaseta ekspresyjna mogą być wytworzone poprzez tradycyjną rekombinację i techniki klonowania, jak opisano na przykład w Maniatis T, Fritsch EF i Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), w Silhavy TJ, Berman ML i Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), w Ausubel FM i wsp. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. i Wiley Interscience i w Gelvin i wsp. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual. Jednakże kolejne sekwencje, które na przykład działają jako łącznik, posiadający miejsca trawienia dla enzymów restrykcyjnych lub jako sygnał peptydowy, mogą także zostać umieszczone pomiędzy dwoma sekwencjami. Wstawienie sekwencji może także prowadzić do ekspresji białek fuzyjnych. Korzystnie, kaseta ekspresyjna, zawierająca połączenie promotora oraz sekwencji kwasu nukleinowego mającej ulegać ekspresji, może być wstawiona w wektor i być wbudowana w genom rośliny, na przykład poprzez transformację.

Jednakże, kaseta ekspresyjna oznacza także takie konstrukcje, w których promotor jest umieszczony za endogennym genem RacB, na przykład w wyniku homologicznej rekombinacji, i obniżenie według wynalazku białka RacB jest osiągnięte przez ekspresję antysensownego RNA RacB. Analogicznie, związek „anty-RacB (na przykład sekwencja kwasu nukleinowego kodująca dsRNA RacB lub antysensowne RNA RacB) może być umieszczony za endogennym promotorem w taki sposób, że osiągnięty jest ten sam efekt. Oba podejścia prowadzą do powstania kaset ekspresyjnych.

Przez termin „promotory specyficzne dla roślin rozumie się w zasadzie każdy promotor, który jest zdolny prowadzić ekspresję genów, w szczególności obcych genów, w roślinach lub częściach roślin, komórkach roślinnych, tkankach roślinnych lub roślinnych hodowlach komórkowych. W tym kontekście ekspresja może być na przykład konstytutywna, indukowalna lub występująca w rozwoju.

Korzystne są następujące promotory:

a) promotory konstytutywne

Korzystnymi wektorami są takie, które umożliwiają konstytutywną ekspresję w roślinach (Benfey i wsp.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Przez promotor „konstytutywny rozumie się te promotory, które zapewniają ekspresję w dużej liczbie, a korzystnie we wszystkich tkankach w znacznym okresie rozwoju rośliny, korzystnie we wszystkich stadiach rozwoju rośliny. W szczególności stosuje się promotor roślinny lub promotor pochodzący z wirusa roślinnego. Szczególnie korzystny jest promotor wirusa mozaiki kalafiora CaMV 35S (Franek i wsp. (1980) Cell 21:285-294; Odell i wsp. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker i wsp. (1985) Virology 140:281-288; Gardner i wsp. (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228) lub promotor CaMV 19S (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey i wsp. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Kolejnym, korzystnym promotorem konstytutywnym jest promotor „małej podjednostki enzymu Rubisco (SSU) (US 4,962,028), promotor leguminy B (Numer w bazie Genbank X03677), promotor syntazy nopaliny z Agrobacterium nopaline, podwójny promotor TR, promotor Agrobacterium OCS (syntazy oktopiny), promotor ubikwityny (Holtorf S i wsp. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), promotor ubikwityny 1 (Christensen i wsp. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce i wsp. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696), promotor Smas, promotor dehydrogenazy alkoholu cynamonowego (US 5,683,439), promotory podjednostki pęcherzykowej ATPazy lub promotor białka bogatego w prolinę z pszenicy (WO 91/13991) oraz inne promotory genów, o których specjalista z dziedziny wie, że zapewniają konstytutywną ekspresję u roślin. Szczególnie korzystnym promotorem jest promotor genu nitrylazy-1 (nit-1), pochodzący z A. Thaliana (Numer w bazie Genbank: Y07648.2, nukleotydy 2456-4340, Hillebrand i wsp. (1996) Gene 170:197-200). b) tkankowo-specyficzne promotory.

PL 206 304 B1

Ponadto, korzystne są promotory specyficzne dla pylników, zalążni, kwiatów, liści, pnia, korzeni i nasion.

Promotory specyficzne dla nasion, takie jak, na przykład promotor fazeoliny (US 5,504,200; Bustos MM i wsp. (1989) Plant Cell l(9):839-53), promotor genu albuminy 2S (Joseffson LG i wsp. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), promotor leguminy (Shirsat A i wsp. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), promotor USP (nieznane białko nasion) (Baumlein H i wsp. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), promotor genu napiny (US 5,608,152; Stalberg K i wsp. (1996) L Planta 199:515-519), promotor białka wiążącego sacharozę (WO 00/26338) lub promotor leguminy B4 (LeB4; Baumlein H i wsp. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein i wsp. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U i wsp. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f), promotor oleozyny z Arabidopsis (WO 98/45461), promotor Bce4 z Brassica (WO 91/13980). Kolejne, odpowiednie promotory specyficzne dla nasion, to promotory genów kodujących wysoko-cząsteczkową gluteninę (HMWG), gliadynę, enzym sieciujący, pirofosfatazę ADP glukozy (AGPaza) lub syntazę skrobiową. Ponadto korzystne są promotory, które pozwalają na ekspresję specyficzną dla nasion u jednoliściennych takich jak kukurydza, jęczmień, pszenica, żyto, ryż i tym podobne. Korzystnie mogą być zastosowane promotory genu lpt2 lub lpt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) lub promotory opisane w WO 99/16890 (promotory genu hordeniny, gluteliny, oryzyny, prolaminy, gliadyny, gluteliny, zeiny, kazyryny lub sekaliny).

Promotory specyficzne dla bulw, korzeni spichrzowych lub korzeni, takie jak na przykład promotor patatyny klasy I (B33), promotor inhibitora katepsyny D ziemniaka.

Promotory specyficzne dla liści, takie jak promotor cytozolowej FBFazy z ziemniaka (WO 97/05900), promotor SSU (malej podjednostki) enzymu Rubisco (karboksylaza rybulozo-1,5-dwufosforanu) lub promotor ST-LSI z ziemniaka (Stockhaus i wsp. (1989) EMBO J 8:2445-2451). Szczególnie korzystne są promotory specyficzne dla epidermy takie jak, na przykład promotor genu OXLP (białko podobne do oksydazy szczawianu) (Wei i wsp. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112).

Promotory specyficzne dla kwiatów, takie jak, na przykład promotor syntazy fitenu (WO 92/16635) lub promotor genu P-rr (WO 98/22593).

Promotory specyficzne dla pylnika, takie jak promotor 5126 (US 5,689,049; US 5,689,051), promotor glob-1 i promotor γ-zeiny.

c) promotory indukowalne chemicznie

Kasety ekspresyjne mogą także zawierać chemicznie indukowalne promotory (artykuł przeglądowy Gatz i wsp. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), poprzez które może być kontrolowana ekspresja egzogennego genu u roślin w szczególnym punkcie czasowym. Mogą być zastosowane takie promotory jak na przykład promotor PRP1 (Ward i wsp. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), promotor indukowalny kwasem salicylowym (WO 95/19443), promotor indukowalny benzenosulfonamidem (EP 0 388 186), indukowalny promotor tetracyklinowy (Gatz i wsp. (1992) Plant J 2:397-404), promotor indukowalny kwasem abscysynowy (EP 0 335 528) lub promotor indukowalny etanolem lub cykloheksanonem (WO 93/21334).

d) promotory indukowalne stresem lub czynnikami chorobotwórczymi

Kolejnymi, korzystnymi promotorami są promotory, które są indukowane przez biotyczne lub abiotyczne czynniki stresowe takie jak, na przykład promotor genu PRP1 (lub promotor gstl) np. z ziemniaka indukowalny czynnikami chorobotwórczymi (WO 96/28561; Ward i wsp. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), promotor hsp70 lub hsp80 z pomidora, indukowalne wysoką temperaturą (US 5,187,267), promotor alfa-amylazy, indukowalny niską temperaturą (WO 96/12814), promotor PPDK, indukowalny światłem lub promotor pinII indukowalny zranieniem (EP-A 0 375 091).

Kolejne promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi obejmują promotor Fisl z lnu (WO 96/34949), promotor Vst1 (Schubert i wsp. (1997) Plant Mol Biol 34:417-426) i promotor cyklazy seskwiterpenu EAS4 z tytoniu (US 6,100,451).

Promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi obejmują promotory tych genów, które są indukowane na skutek infekcji czynnikami chorobotwórczymi takimi jak, na przykład geny białek PR, białek SAR, e-1,3-glukanazy, chitynazy i tym podobne (na przykład Redolfi i wsp. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, i wsp. (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau i wsp. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton i wsp. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich i wsp. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich i wsp. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen i wsp. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang i Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, i wsp. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz i wsp. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).

PL 206 304 B1

Promotory indukowalne zranieniem obejmują promotory takie jak promotor genu pinii (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan i wsp. (1996) Nat Biotech 14:494-498), genów wun1 i wun2 (US 5,428,148), genów win1 i win2 (Stanford i wsp. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), systeminy (McGurl i wsp. (1992) Science 225:1570-1573), genu WIP1 (Rohmeier i wsp. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp i wsp. (1993) FEBS Letters 323:73-76), genu MPI (Corderok i wsp. (1994) Plant J 6(2): 141-150) i tym podobne. Źródłem kolejnych promotorów indukowalnych czynnikami chorobotwórczymi jest rodzina genów PR. Znaleziono wiele korzystnych elementów występujących w tych promotorach. Region od -364 do -288 w promotorze PR-2d jest specyficzny dla salicylanów (Buchel i wsp. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504). Sekwencja 5'-TCATCTTCTT-3' jest spotykana wielokrotnie w promotorze e-1,3-glukanazy i w ponad 30 kolejnych genach indukowalnych czynnikami stresowymi. W tytoniu region ten jest wiązany przez białko jądrowe, którego ilość jest zwiększana przez salicylany. Podobnie promotory PR-1 z tytoniu i Arabidopsis (EP-A O 332 104; WO 98/03536) można wykorzystać jako promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi. Korzystne są promotory (aPR5) - „kwasowe PR-5 z jęczmienia (Schweizer i wsp. (1997) Plant Physiol 114:79-88) i pszenicy (Rebmann i wsp. (1991) Plant Mol Biol 16:329-331), ponieważ są one szczególnie specyficznie indukowalne czynnikami chorobotwórczymi. Białka aPR5 akumulują się w przeciągu od 4 do 6 godzin po ataku czynnika chorobotwórczego i posiadają bardzo ograniczoną ekspresję podstawową (WO 99/66057). Jednym z podejść stosowanych w celu osiągnięcia wyższej specyficzności na czynnik chorobotwórczy jest przygotowanie syntetycznych promotorów zawierających kombinacje znanych elementów indukowalnych czynnikami chorobotwórczymi (Rushton i wsp. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057). Kolejne promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi pochodzące z różnych gatunków są znane w stanie techniki specjalistom z dziedziny (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684).

e) promotory zależne od stadium rozwoju

Kolejnymi korzystnymi promotorami są na przykład promotory specyficzne dla dojrzewających owoców takie jak, na przykład promotor dojrzewającego owocu pomidora (WO 94/21794, EP 409 625). Promotory zależne od stadium rozwoju obejmują częściowo promotory tkankowo-specyficzne, ponieważ poszczególne tkanki rozwijają sie w naturze w poszczególnych stadiach rozwoju.

Szczególnie korzystne są promotory konstytutywne i specyficzne dla liści i/lub łodygi, promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi i specyficzne dla epidermy, najkorzystniejsze są promotory indukowalne czynnikami chorobotwórczymi i specyficzne dla epidermy.

Ponadto, kolejne promotory mogą być funkcjonalnie połączone z sekwencją kwasu nukleinowego, która ma ulegać ekspresji. Promotory te pozwalają na ekspresję w kolejnych tkankach roślinnych lub w innych organizmach takich jak, na przykład bakteria E.coli. Korzystnymi promotorami roślinnymi są ogólnie wszystkie wyżej wymienione promotory.

Sekwencje kwasu nukleinowego, obecne w kasetach ekspresyjnych lub wektorach mogą być funkcjonalnie połączone, poza połączeniem z promotorem, z kolejnymi genetycznymi sekwencjami regulatorowymi. Termin „genetyczne sekwencje regulatorowe oznacza w szerokim sensie wszystkie te sekwencje, które wywierają wpływ na powstanie lub funkcję kasety ekspresyjnej. Na przykład, genetyczne sekwencje regulatorowe modyfikują transkrypcję i translację w organizmach prokariotycznych lub eukariotycznych. Korzystnie, kasety ekspresyjne zawierają promotor specyficzny dla embrionalnej epidermy i/lub kwiatu, położony przed końcem 5' sekwencji kwasu nukleinowego, mającej ulegać rekombinacyjnej ekspresji oraz sekwencję terminatora, położoną za końcem 3' jako dodatkową, genetyczną sekwencję regulatorową i jeśli to konieczne, kolejne tradycyjne elementy regulatorowe, w każdym przypadku połączone funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego, mającą ulegać rekombinacyjnej ekspresji.

Genetyczne sekwencje regulatorowe obejmują także kolejne promotory, elementy promotorów lub promotory minimalne, z których wszystkie mogą modyfikować właściwości ekspresji. W ten sposób, na przykład tkankowo-specyficzna ekspresja może dodatkowo zależeć od pewnych czynników stresowych, w związku z obecnością genetycznych sekwencji regulatorowych. Takie elementy opisano, na przykład w przypadku stresu wodnego, stresu wywołanego kwasem abscysynowym (Lam E i Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) i stresu cieplnego (Schoffl F i wsp., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989).

Kolejnymi korzystnymi sekwencjami regulatorowymi są na przykład promotory bakterii Gramdodatnich amy i SPO2 oraz promotory drożdży i grzybów ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

PL 206 304 B1

Zasadniczo wszystkie naturalne promotory z ich sekwencjami regulatorowymi, jak te wspomniane powyżej, mogą zostać wykorzystane w sposobie według wynalazku. Dodatkowo korzystnie mogą być wykorzystane promotory syntetyczne.

Ponadto, genetyczne elementy regulatorowe obejmują 5'-UTR (regiony nieulegające translacji), introny lub 3' - niekodujące regiony genów, takie jak na przykład intron aktyny-1 lub introny 1, 2 i 6 genu Adh1-S (ogólny odnośnik: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling i Walbot, Eds., Springer, Nowy Jork (1994)). Wykazano, że mogą one pełnić znaczącą rolę w regulacji ekspresji genów. Tak więc wykazano, że 5' sekwencje nieulegające translacji mogą wzmacniać przejściową ekspresję genów heterologicznych. Przykładem translacyjnych sekwencji wzmacniających jest 5' sekwencja liderowa wirusa mozaiki tytoniu (Gallie i wsp. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) i tym podobne. Ponadto mogą one promować specyficzność tkankową (Rouster J i wsp. (1998) Plant J 15:435-440).

Kaseta ekspresyjna może korzystnie zawierać jeden lub więcej ze znanych sekwencji wzmacniających, połączonych funkcjonalnie z promotorem, które umożliwiają wzrost rekombinacyjnej ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego. Dodatkowo korzystne sekwencje, takie jak kolejne elementy regulatorowe lub terminatory, mogą być wstawione w końcu 3' sekwencji kwasu nukleinowego, która ma ulegać rekombinacyjnej ekspresji. Jedna lub więcej kopii sekwencji kwasu nukleinowego, mających ulegać rekombinacyjnej ekspresji może być obecna w konstrukcie genowym.

Sygnały poliadenylacji, które są odpowiednie jako sekwencje regulatorowe to roślinne sygnały poliadenylacji, korzystnie takie, które zasadniczo są zgodne z sygnałami poliadenylacji T-DNA z Agrobacterium tumefaciens, a w szczególności z genu 3 t-DNA (syntaza oktopiny) z plazmidu Ti - pTiACHS (Gielen i wsp. (1984) EMBO J 3:835 i kolejne) lub jego funkcjonalnego odpowiednika. Przykładem szczególnie korzystnych sekwencji terminatorów jest terminator OCS (syntaza oktopiny) i terminator NOS (syntaza nopaliny).

Przez sekwencje regulatorowe rozumie się ponadto takie sekwencje, które umożliwiają homologiczną rekombinację lub insercję do genomu organizmu gospodarza, lub które pozwalają na ich usunięcie z genomu. W przypadku homologicznej rekombinacji, na przykład naturalny promotor danego genu może być zamieniony na promotor specyficzny dla embrionalnej epidermy i/lub kwiatu. Metody takie jak technologia Cre/lox pozwalalają na tkankowo-specyficzne, i jeśli to konieczne, indukowalne usunięcie kasety ekspresyjnej z genomu organizmu gospodarza (Sauer B (1998) Methods. 14(4):381-92). W metodzie tej specyficzne sekwencje otaczające flankujące (sekwencje lox) są przyłączone do docelowego genu i pozwalają na jego późniejsze usunięcie przez rekombinazę Cre.

Kasety ekspresyjne i wektory z nich pochodzące mogą zawierać dalsze funkcjonalne elementy. Termin „funkcjonalny element oznacza w szerokim sensie wszystkie takie elementy, które wywierają wpływ na powstanie, namnażanie lub funkcję kaset ekspresyjnych, wektorów lub organizmów transgenicznych. Można wymienić następujące (lecz nie wyłącznie) przykłady:

a) markery selekcyjne, które nadają oporność na inhibitor metabolizmu taki jak 2-deoksyglukozo-6-fosforanu (WO 98/45456), na antybiotyki lub biocydy, korzystnie herbicydy, takie jak na przykład kanamycyna, G418, bleomycyna lub hygromycyna, lub także fosfinotrycyna i tym podobne. Szczególnie korzytne markery selekcyjne to takie, które nadają oporność na herbicydy. Przykłady, które można wymienić to: sekwencje DNA, które kodują acetylową transferazę fosfinotrycyny (PAT) i takie, które inaktywują inhibitory syntazy glutaminy (genu bar i pat), geny syntazy 5-enolopiruwulshikiminian-3-fosforanu (geny syntazy EPSP), które nadają oporność na Glyphosater (N-(fosfonometylo)glicyna), gen gox, który koduje enzym degradujący Glyphosater (oksyreduktazę Glyphosate), gen deh (kodujący dehalogenazę, która inaktywuje dalapon), syntazy acetylomleczanu inaktywujące sulfonylomocznik i imidazolinon, i geny bxn, kóre kodują nitrylazy degradujące bromoksynil, gen aasa, który nadaje oporność na antybiotyk apektynomycynę, gen (SPT) fosfotransferazy streptomycyny, który nadaje oporność na streptomycynę, gen (NPTII) fosfotransferazy neomycyny, który nadaje oporność na kanamycynę lub genetycynę, gen (HPT) fosfotransferazy higromycyny, który mediuje oporność na higromycynę, gen (ALS) syntazy acetylomleczanu, który nadaje oporność na herbicydy sulfonylomocznikowe (na przykład zmutowany wariant ALS z na przykład mutacją S4 i/lub Hra).

b) geny reporterowe, które kodują łatwe do ilościowego oznaczenia białka i poprzez ich kolor lub aktywność enzymatyczną umożliwiają ocenę wydajności transformacji, miejsca ekspresji lub czasu ekspresji. Szczególnie korzystne w tym kontekście są geny kodujące białka reporterowe (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) (Sheen i wsp.(1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff i wsp.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel i wsp.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian i wsp. (1997)

PL 206 304 B1

Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL i wsp. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM i wsp. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), transferaz ę chloramfenikolu, lucyferazę (Ow i wsp. (1986) Science 234:856-859; Millar i wsp. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), gen akweoryny (Prasher i wsp. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), gen β -galaktozydazy, locus R (kodujący białko, które reguluje produkcję pigmentów antocyjanów (czerwonych) w tkankach roślin i w ten sposób umożliwiający bezpośrednią analizę aktywności promotora bez dodatku dalszych pomocniczych substancji lub substratów chromogenicznych; Dellaporta i wsp., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), szczególnie korzystna jest β-glukuronidaza (Jefferson i wsp., EMBO J. 1987,6,3901-3907).

c) miejsca inicjacji replikacji ORI, które zapewniają amplifikację kaset ekspresyjnych lub wektorów, na przykład w E. coli. Można wymienić następujące miejsca ORI (miejsca inicjacji replikacji DNA), ori z pBR322 lub ori z P15A (Sambrook i wsp.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, II wyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). d) elementy, które są konieczne do transfonnacji rośliny przy pomocy Agrobacterium takie jak na przykład prawe lub lewe ramię regionu T-DNA lub vir.

Aby wybrać komórki, w których zaszła właściwa homologiczna rekombinacja lub także, aby wybrać komórki stransformowane, konieczne jest, aby dodatkowo wprowadzić marker selekcyjny, który nadaje oporność na biocyd (na przykład herbicyd), inhibitor metabolizmu taki jak 2-dezoksyglukozo-6-fosforan (WO 98/45456) lub antybiotyk do komórek, w których zaszła właściwa rekombinacja. Marker selekcyjny pozwala odróżnić stransformowane komórki od tych, które nie uległy transformacji (McCormick i wsp. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

Wprowadzenie kasety ekspresyjnej do organizmu lub jego komórek, tkanek, organów, części lub nasion (korzystnie do roślin lub roślinnych komórek, tkanek, organów, części lub nasion) może korzystnie być przeprowadzone przy użyciu wektorów, które zawierają kasety ekspresyjne. Kaseta ekspresyjna może być wprowadzona do wektora (na przykład plazmidu) porzez użycie odpowiednich miejsc restrykcyjnych. Otrzymany plazmid jest najpierw wprowadzany do E. coli. Następnie wybiera się prawidłowo stransformowane komórki E. coli, namnaża i oczyszcza z nich zrekombinowany plazmid, stosując techniki znane specjaliście z dziedziny. Etap klonowania można zweryfikować przy pomocy analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania.

Przykładami wektorów mogą być plazmidy, kosmidy, fagi, wirusy lub także agrobakterie. W korzystnym wariancie kaseta ekspresyjna jest wprowadzana przez wektory plazmidowe. Korzystnymi wektorami są te, które umożliwiają stabilną integrację kasety ekspresyjnej do genomu gospodarza.

Wytworzenie stransformowanego organizmu (lub stransformowanej komórki lub tkanki) wymaga wprowadzenia opisywanych DNA, RNA lub białka do odpowiedniej komórki gospodarza.

Istnieje wiele metod wykorzystywanych w procedurze określanej jak transformacja (lub transdukcja lub transfekcja)) (Keown i wsp. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). Na przykład DNA lub RNA może być wprowadzone bezpośrednio poprzez mikroinjekcję lub poprzez bombardowanie mikrocząstkami opłaszczonymi DNA. Ponadto można chemicznie wywołać przepuszczalność komórki, na przykład przy użyciu glikolu polietylenowego, dzięki czemu DNA może wejść do komórki w procesie dyfuzji. DNA może także być wprowadzone przez połączenie protoplastu z innymi jednostkami zawierającymi DNA takimi jak minikomórki, komórki, lizosomy lub liposomy. Kolejną, odpowiednią metodą wprowadzania DNA jest elektroporacja, w której komórki są odwracalnie uprzepuszczalniane impulsem elektrycznym. Odpowiednie metody opisano w (na przykład Bilang i wsp. (1991) Gene 100:247-250; Scheid i wsp. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche i wsp. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause i wsp. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein i wsp. (1987) Nature 327:70-73; Howell i wsp. (1980) Science 208:1265; Horsch i wsp.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock i wsp. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach i Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); oraz Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zieliński, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

W roślinach wyżej opisane metody transformacji i regeneracji roślin z tkanek roślinnych lub komórek roślinnych są wykorzystywane do przejściowej lub stabilnej transformacji. Korzystnymi metodami są szczególnie transformacja protoplastu poprzez pobranie DNA indukowane glikolem polietylenowym, metoda biolistyczna wykorzystująca „armatkę genową - znana jako metoda bombardowania cząstkami, elektroporacja, inkubacja nadtrawionych embrionów w roztworze z DNA i mikroiniekcja.

W dodatku do tych „bezpośrednich technik transformacji, transformacja może być także przeprowadzona przy użyciu infekcji bakteryjnej przez Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium

PL 206 304 B1 rhizogenes. Transformacja przy użyciu Agrobacterium jest odpowiednia dla komórek roślin dwuliściennych. Metody te opisano na przykład w Horsch RB i wsp. (1985) Science 225: 1229f.

W przypadku użycia agrobakterii, kaseta ekspresyjna musi być zintegrowana ze specyficznymi plazmidami, albo w wektor wahadłowy lub pośredni, lub w wektor binarny. Jeśli używa się plazmidów Ti lub Ri do transformacji, przynajmniej prawe ramię, a w większości przypadków prawe i lewe ramię T-DNA plazmidów Ti lub Ri jest połączone z kasetą ekspresyjną, która ma być wprowadzona jako otoczony region.

Korzystnie stosowane są wektory binarne. Binarne wektory są zdolne do replikacji zarówno w E.coli jak i Agrobacterium. Z zasady zawierają one marker selekcyjny oraz sekwencję łącznikową lub poliłącznikową otoczoną przez prawe i lewe ramie T-DNA. Mogą one być transferowane bezpośrednio do Agrobacterium (Holsters i wsp. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Gen markera selekcyjnego pozwala na wybór stransformowanych komórek agrobakterii i jest to, na przykład gen nptII, który nadaje oporność na kanamycynę. Agrobacterium, które działa w tym przypadku jako organizm gospodarza powinno już zawierać plazmid z regionem vir. Ten drugi jest wymagany do przeniesienia T-DNA do komórki roślinnej. W ten sposób stransformowane Agrobacterium może być użyte do transformacji komórek roślinnych. Zastosowanie T-DNA do transformacji komórek roślinnych intensywnie badano i opisano w (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An i wsp. (1985) EMBO J 4:277-287). Znane są różne binarne wektory, niektóre z nich są komercyjnie dostępne na przykład pBI101.2 lub pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

Kolejne promotory odpowiednie do ekspresji w roślinach opisano w (Rogers i wsp. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl i wsp. (1987) Gene 61:1-11; Berger i wsp. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406).

Techniki bezpośredniej transformacji są odpowiednie dla każdego organizmu i typu komórki.

W przypadku iniekcji lub elektroporacji DNA lub RNA do komórek roślinnych nie ma żadnych szczególnych wymagań w stosunku do używanego plazmidu. Mogą być zastosowane proste plazmidy takie jak te z serii pUC. Jeżeli cale rośliny mają być odtworzone z stransformowanych komórek, konieczne jest aby, plazmid posiadał dodatkowy gen markera selekcyjnego.

Stabilnie transformowane komórki tj. takie, które zawierają zintegrowane, wprowadzone DNA do DNA komórki gospodarza, mogą być odróżnione od komórek niestransformowanych wtedy, gdy marker selekcyjny jest częścią wprowadzonego DNA. Przykładami genów, które mogą działać jako takie markery są wszystkie te, które są zdolne nadać oporność na antybiotyki lub herbicydy (takie jak kanamycyna, G418, bleomycyna, higromycyna lub fosfinotrycyna) (zob. wyżej). Stransformowane komórki, w których zachodzi ekspresja takich genów markerowych są zdolne przeżyć w obecności takiego stężenia odpowiednich antybiotyków lub herbicydów, które zabija niestransformowane komórki o niezmienionym genotypie. Przykłady wymieniono powyżej i korzystnie obejmują gen bar, który nadaje oporność na herbicyd fosfinotrycynę (Rathore KS i wsp. (1993) Plant Mol Biol 21 (5):871-884), gen nptll, który nadaje oporność na kanamycynę, gen hpt, który nadaje oporność na higromycynę i gen EPSP, który nadaje oporność na herbicyd Glyphosate®. Marker selekcyjny pozwala na odróżnienie stransformowanych komórek od komórek, które nie uległy transformacji (McCormick i wsp. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Powstałe rośliny mogą być hodowane i krzyżowane w sposób tradycyjny. Powinny być wyhodowane dwa lub więcej pokolenia w celu upewnienia się, że integracja do genomu jest stabilna i dziedziczona.

Wyżej wymienione metody opisano na przykład w (Jenes B i wsp.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, wydane przez SD Kung and R Wu, Academic Press, str. 128-143 oraz w Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Konstrukty, które mają ulegać ekspresji są korzystnie wklonowane do wektora, który jest odpowiedni do transformacji Agrobacterium tumefaciens, na przykład pBin19 (Bevan i wsp. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f).

Od momentu wytworzenia stransformowanej rośliny, kompletna roślina może być otrzymana przy użyciu metod znanych specjaliście z dziedziny. Na przykład jako materiał początkowy używane są hodowle kallusa. Rozwój pędów i korzeni może zostać wyindukowany w tej masie niezróżnicowanych komórek w ogólnie znany sposób. Otrzymane pędy mogą zostać rozsadzone i hodowane.

Metody odtwarzania części roślin i całych roślin z komórek roślinnych są znane specjaliście z dziedziny. Metody te opisano na przykład w Fennell i wsp. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger i wsp. (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne i wsp. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533.

PL 206 304 B1

Sposób według wynalazku może być korzystnie połączony z kolejnymi metodami, które nadają oporność na czynnik chorobotwórczy (na przykład owady, grzyby, bakterie, nicienie i tym podobne), oporność na czynniki stresowe lub inne udoskonalenia właściwości rośliny. Przykłady wymieniono m.in. w Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000;51 Nr Spec; strony 487-96.

Białko RacB z jęczmienia pokazano w Sekw. Nr 2 a jego dominująco-negatywny wariant, na przykład opisany w Sekw. Nr 7.

Sekwencje kwasów nukleinowych kodujących białko RacB, korzystnie sekwencje kwasu nukleinowego są pokazane w Sekw. Nr 1, sekwencji do niej komplementarnej i sekwencji pochodnych, powstałych w wyniku istnienia degeneracji kodu genetycznego.

Polipeptyd kodujący funkcjonalny odpowiednik białka RacB z jęczmienia pokazano w Sekw.

Nr 35, 37 lub 39.

Sekwencje kwasów nukleinowych kodujących funkcjonalne odpowiedniki białka RacB z jęczmienia, to korzystnie sekwencje kwasów nukleinowych pokazane w Sekw. Nr 34, 36 lub 38, komplementarne do nich sekwencje kwasów nukleinowych i sekwencje pochodnych, powstałych w wyniku istnienia degeneracji kodu genetycznego.

W transgenicznych kasetach ekspresyjnych, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko RacB z jęczmienia jest połączona z przynajmniej jednym genetycznym elementem regulatorowym, jak zdefiniowano powyżej, w ten sposób, że możliwa jest jej ekspresja (transkrypcja i jeśli to konieczne translacja) w każdym organizmie, korzystnie w roślinach. Odpowiednie genetyczne elementy regulatorowe opisano powyżej. Transgeniczne kasety ekspresyjne mogą także zawierać kolejne funkcjonalne elementy według powyższej definicji. Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego białko RacB z jęczmienia może być wstawiona w sensownej lub antysensownej orientacji i w ten sposób prowadzi do ekspresji sensownego lub antysensownego RNA.

Tennin „transgeniczny na przykład w odniesieniu do sekwencji kwasu nukleinowego, kasety ekspresyjnej lub wektora zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego lub organizmu stransformowanego omawianą sekwencją kwasu nukleinowego, kasetą ekspresyjną lub wektorem, dotyczy wszystkich tych konstruktów, powstałych przy użyciu metod rekombinacji, w których albo

a) sekwencja kwasu nukleinowego RacB, lub

b) genetyczna sekwencja regulatorowa połączona funkcjonalnie z sekwencjią kwasu nukleinowego RacB, na przykład promotorem, lub

c) (a) i (b) nie są umieszczone w swoim naturalnym środowisku lub zostały zmodyfikowane przy użyciu metod rekombinacji, na przykład substytucji, addycji, delecji, inwersji lub insercji jednej lub więcej reszty nukleotydowej. Naturalne genetyczne środowisko odnosi się do naturalnego locus chromosomalnego w organizmie, z którego pochodzi, albo do obecności w bibliotece genomowej. W przypadku biblioteki genomowej, naturalne genetyczne środowisko sekwencji kwasu nukleinowego jest korzystnie zachowane, przynajmniej częściowo. Środowisko otacza sekwencję kwasu nukleinowego przynajmniej z jednej strony sekwencją o długości przynajmniej 50 pz, korzystnie przynajmniej 500 pz, szczególnie korzystnie przynajmniej 1000 pz, najkorzystniej przynajmniej 5000 pz. Naturalnie występująca kaseta ekspresyjna - na przykład naturalnie występująca kombinacja promotora RacB z odpowiadającym genem RacB - staje się transgeniczna kasetą ekspresyjną, gdy jest zmodyfikowana przy użyciu nienaturalnych, systetycznych, sztucznych metod takich jak na przykład mutageneza. Takie metody opisano w (US 5,565,350; WO 00/15815; zob. także powyżej).

Transgeniczne organizmy mogą być transformowane przynajmniej jedną z powyżej określonych sekwencji, kasetą ekspresyjną lub wektorem. Dotyczy to także komórek, hodowli komórkowych, tkanek, części - takich jak na przykład liści, korzeni i tym podobnych w przypadku organizmów roślinnych - lub materiałów rozrodczych pochodzących z takich organizmów. Termin organizm dotyczy w szerokim aspekcie prokariotycznych i eukariotycznych organizmów, korzystnie bakterii, drożdży, grzybów, organizmów zwierzęcych i organizmów roślinnych.

Korzystne są następujące:

a) grzyby takie jak Aspergillus, Eremothecium, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria lub inne grzyby opisane w Indian Chem Eng. Sekcja B. Vol 37, Nr. 1,2 (1995) na stronie 15, Tabela 6. Szczególnie korzystne są filamentowe hemiascomycete Ashbya gossypii lub Eremothecium ashbyii,

b) drożdże takie jak Cuntlida, Saccharomyces, Hansenula lub Pichia, szczególnie korzystne Saccharomyces cerevisiae lub Pichia pastoris (ATCC Nr 201178),

PL 206 304 B1

c) rośliny zgodne z powyższą definicją „roślin,

d) kręgowce i bezkręgowce. Szczególnie korzystne kręgowce to ssak nie-człowiek taki jak pies, kot, owca, koza, kura, mysz, szczur, bydło i koń. Korzystne komórki zwierzęce obejmują komórki CHO, COS i HEK293. Korzystne bezkręgowce obejmują komórki owadów takich jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, Sf21.

e) Organizmy prokariotyczne takie jak Gram-dodatnie lub Gram-ujemne bakterie takie jak Acetobacter, Gluconobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia (głównie Escherichia coli), Serratia, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium lub Klebsiella.

Organizmy gospodarza lub organizmy wyjściowe, korzystnie organizmy transgeniczne to głównie rośliny zgodnie z powyższą definicją. W zakres wynalazku wchodzą wszystkie rodzaje i gatunki wyższych i niższych roślin Królestwa Roślin. Ponadto wynalazkiem objęte są rośliny dojrzale, nasiona, pędy i siewki, oraz części, materiał rozrodowy i hodowle z nich pochodzące, na przykład hodowle komórkowe. Termin dojrzałe rośliny odnosi się do roślin w każdym stadium rozwojowym powyżej stadium siewki. Termin siewki odnosi się do młodych niedojrzałych roślin we wczesnym stadium rozwojowym. Rośliny, korzystnie jako organizmy gospodarza są w szczególności roślinami, które mogą być zastosowane w sposobie według wynalazku, do uzyskania oporności na czynnik chorobotwórczy, zgodnie z kryteriami opisanymi powyżej. Szczególnie korzystne są rośliny jednoliścienne takie jak pszenica, owies, proso, jęczmień, żyto, kukurydza, ryż, gryka, sorgo, pszenica perz, pszenica orkisz, len, trzcina cukrowa i dwuliścienne rośliny uprawne takie jak rzepak, rzepak canola, rzeżucha, Arabidopsis, kapusty, soja, lucerna, groch, fasola, orzech ziemny, ziemniak, tytoń, pomidor, bakłażan, pieprz, słonecznik, Tagetes, sałata, Calendula, melon, dynia lub cukinia.

Transgeniczne organizmy mogą być wytworzone według wyżej opisanych metod transformacji lub transfekcji organizmów.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania transgenicznych organizmów roślinnych oraz komórek, hodowli komórkowych, części - takich jak korzenie, liście i tym podobne w przypadku transgenicznych organizmów roślinnych - z nich pochodzących, oraz dotyczy transgenicznego materiału reprodukcyjnego takiego jak nasiona lub owoce, do wytwarzania artykułów żywnościowych lub karmy dla zwierząt, środków farmaceutycznych lub wysoko przetworzonych związków chemicznych.

Ponadto możliwy jest sposób rekombinacyjnej produkcji środków farmaceutycznych lub wysoko przetworzonych związków chemicznych w organizmie gospodarza, gdzie organizm gospodarza jest transformowany jedną z wyżej opisanych kaset ekspresyjnych i ta kaseta ekspresyjna zawiera jeden lub więcej genów strukturalnych, które kodują pożądane wysoko przetworzone związki chemiczne lub katalizują biosyntezę pożądanych wysoko przetworzonych związków chemicznych, z transformowanego organizmu wyprowadzana jest hodowla i pożądany wysoko przetworzony związek chemiczny jest izolowany z pożywki hodowlanej. Sposób ten może być zastosowany szeroko do wysoko przetworzonych związków chemicznych takich jak enzymy, witaminy, aminokwasy, cukry, kwasy tłuszczowe oraz naturalne i syntetyczne przyprawy, substancje zapachowe i barwniki. Szczególnie korzystna jest produkcja tokoferoli, tokotrienoli i karotenoidów. Z transformowanych organizmów gospodarza wyprowadza się hodowle, a produkty są izolowane z organizmu gospodarza lub z pożywki hodowlanej przy pomocy metod znanych specjaliście z dziedziny. Produkcja środków farmaceutycznych takich jak na przykład przeciwciała lub szczepionki została opisana w Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND. (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 236:275-92.

Sekwencje:

1. Sekw. Nr 1

2. Sekw. Nr 2

3. Sekw. Nr 3

4. Sekw. Nr 4

5. Sekw. Nr 5

6. Sekw. Nr 6

Sekwencja kwasu nukleinowego z jęczmienia (Hordeum vidgare) kodująca białko RacB. Sekwencja aminokwasowa z jęczmienia (Hordeum vulgare) kodująca białko RacB. Sekwencja kwasu nukleinowego z ryżu (Oryza sativa) kodująca białko RacB. Sekwencja aminokwasowa z ryżu (Oryza sativa) kodująca białko RacB. Sekwencja kwasu nukleinowego z kukurydzy (Zea mays) kodująca białko RacB.

Sekwencja aminokwasowa z kukurydzy (Zea mays) kodująca białko RacB.

PL 206 304 B1

7. Sekw. Nr 7 :

8. Sekw. Nr 8 :

9. Sekw. Nr 9 :

10. Sekw. Nr 10

11. Sekw. Nr 11

12. Sekw. Nr 12

13. Sekw. Nr 13

14. Sekw. Nr 14

15. Sekw. Nr 15

16. Sekw. Nr 16

17. Sekw. Nr 17

18. Sekw. Nr 18

19. Sekw. Nr 19

20. Sekw. Nr 20

21. Sekw. Nr 21

22. Sekw. Nr 22

23. Sekw. Nr 23

24. Sekw. Nr 24

25. Sekw. Nr 25

26. Sekw. Nr 26

27. Sekw. Nr 27

28. Sekw. Nr 28

29. Sekw. Nr 29

30. Sekw. Nr 30

31. Sekw. Nr 31

32. Sekw. Nr 32

33. Sekw. Nr 33

34. Sekw. Nr 34 :

Sekwencja aminokwasowa kodująca dominujący -negatywny wariant białka RacB (Hordeum vulgare). Sekwencja aminokwasowa kodująca dominujący -negatywny wariant białka RacB z ryżu (Oryza sativa). Sekwencja aminokwasowa kodująca dominujący -negatywny wariant białka RacB z kukurydzy (Zea mays) Starter oligonukleotydowy ONP-1 5 '-GGATCCGATGAGCGCGTCC AGGTT-3'

Starter oligonukleotydowy ONP-2 5' -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

Starter RACE-RacB

5' -gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3'

Starter GeneRacer™ 5'

5' -CGACTGGAGC ACG AGG AC ACTG A-3 Starter GeneRacer™ 5' następczy 5' -GGAC ACTGAC ATGGACTGAAGGAGT A-3 Starter sensowny RacB 5'-gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3'

Starter antysensowny RacB 5'-ttagcttcctcagttcttccctg-3'

Starter sensowny BAS 5'-cgcgccgcagccgagtacgac-3'

Starter antysensowny BAS 5 '-gtcacaaaaacacatgtaacc-3'

Starter sensowny OXLP 5'-ggccgacatgcattcaccag-3'

Starter antysensowny OXLP 5 '-catctgatattgctgggtctg-3'

Starter sensowny UBI 5 '-ccaagatgcagatcttcgtga-3'

Starter antysensowny UBI 5'-ttcgcgataggtaaaagagca-3'

Starter M13 fwd

5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

Starter M13 rev '-GGAAACAGCTATGACCATG-3'

Lewy starter HvRop6 5'-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3'

Prawy starter HvRop6 5 '-CCATGCTTCATCTCC ATAGTCA-3'

Lewy starter HvRacD '-ggatccCGATTCC ATCAGGAAAGC AT-3'

Prawy starter HvRacD '-gtcgacGCGAGACACTGCA AAAC AAA-3'

Lewy starter HvRop4 5 '-GGATCCttctcgtccatttagccggc-3'

Prawy starter HvRop4 5 '-GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3'

Starter RacB5'BamHI '-GGATCCGATGAGCGCGTCC AGGTT-3'

Starter RacB3'SalI '-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

Starter V15 mutagenezy '-ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3' Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca HvRop6 homolog RacB z jęczmienia (Hordeum rulgare).

PL 206 304 B1

35. Sekw. Nr 35

36. Sekw. Nr 36

37. Sekw. Nr 37

38. Sekw. Nr 38

39. Sekw. Nr 39

40. Sekw. Nr 40

41. Sekw. Nr 41

42. Sekw. Nr 42

43. Sekw. Nr 43

44. Sekw. Nr 44

45. Sekw. Nr 45

46. Sekw. Nr 46

47. Sekw. Nr 47

48. Sekw. Nr 48

49. Sekw. Nr 49

50. Sekw. Nr 50

51. Sekw. Nr 51

52. Sekw. Nr 52

53. Sekw. Nr 53

54. Sekw. Nr 54

55. Sekw. Nr 55

56. Sekw. Nr 56

57. Sekw. Nr 57

58. Sekw. Nr 58

59. Sekw. Nr 59

Sekwencja aminokwasowa kodująca HvRop6 homolog RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca HvRacD homolog RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare). Sekwencja aminokwasowa kodująca HvRacD homolog RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca HvRop4 homolog RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca HvRop4 homolog RacB z jęczmienia (Hordeum vulgare). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca ROP6 homolog RacB z Zea mays (Nr w bazie GenBank: AJ278665)

Sekwencja aminokwasowa kodująca ROP6 homolog RacB z Zea mays Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca RACDP homolog RacB z Oryza sativa podgat.japonica (RACD) (Nr w bazie GenBank: AF218381)

Sekwencja aminokwasowa kodująca RACDP homolog RacB z Oryza sativa podgat. japonica Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca ROP4 homolog RacB z Oryza sativa (Nr w bazie GenBank: AF380335)

Sekwencja aminokwasowa kodująca ROP4 homolog

RacB z Oryza sativa

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca RACA homolog RacB z Zea mays (Nr w bazie GenBank: AF126052)

Sekwencja aminokwasowa kodująca RACA homolog RacB z Zea mays Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Hordeum vulgare (Nr w bazie GenBank: BM816965)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At3g51300) Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At3g51300) Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At2g17800) Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At2g17800) Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g35950) Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g35950) Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At1g75840) Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At1g75840) Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g35020) Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g35020) Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At1g20090)

PL 206 304 B1

60. Sekw. Nr 60

61. Sekw. Nr 61

62. Sekw. Nr 62

63. Sekw. Nr 63

64. Sekw. Nr 64

65. Sekw. Nr 65

66. Sekw. Nr 66

67. Sekw. Nr 67

68. Sekw. Nr 68

69. Sekw. Nr 79

70. Sekw. Nr 70

71. Sekw. Nr 71

72. Sekw. Nr 72

73. Sekw. Nr 73

74. Sekw. Nr 74

75. Sekw. Nr 75

76. Sekw. Nr 75

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At1g20090)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At5g45970)

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At5g45970)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At3g48040)

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At3g48040)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At5g62880)

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At5g62880)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g28950)

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At4g28950)

Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At2g44690)

Sekwencja aminokwasowa kodująca homolog RacB z Arabidopsis thaliana (At2g44690)

Starter oligonukleotydowy Fra 186 '-ATGAGCGCGTCCAGGTTC AT A-3'

Starter oligonukleotydowy Fra 187 '-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3'

Transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_AtRacB_s do ekspresji

RacB z Arbidopsis thaliana w sensownej orientacji

Transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_AtRacB_as do ekspresji

RacB z Arbidopsis thaliana w antysensownej orientacji

Transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_s do ekspresji fragmentu RacB z jęczmienia w sensownej orientacji

Transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_as do ekspresji fragmentu RacB z jęczmienia w antysensownej orientacji

Figury rysunku:

1. Fig. 1: Porównanie sekwencji aminokwasowej białek RacB z jęczmienia, RacB z ryżu, RacB z kukurydzy i ludzkich Rac1 i Rac2.

Regiony zacieniowane na szaro wskazują pozycję elementu Gl (GXXXXGKS/T; aminokwasy od 13 do 20), regionu efektorowego G2 (aminokwasy od 29 do 45), elementu G3 (LWDTAGQ; aminokwasy od 58 do 64), elementu G4 (TKXD; aminokwasy od 118 do 121), elementu G5 (EXS) i C-końcowego motywu izoprenylacji (CXXX, Hassanain HH i wsp. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272(3):783-8.). Łącznik wskazuje przerwy w sekwencji. Gwiazdki oznaczają aminokwasy, które są identyczne we wszystkich homologach. Aminokwasy, które są różne u jęczmienia w porównaniu z kukurydzą i ryżem pokazane są jako białe na czarnym tle. Pozycja korzystnie zmodyfikowana w celu uzyskania dominuj ącego-negatywnego wariantu RacB jest oznaczona przez czarne trójkąty ponad sekwencją.

2. Fig. 2: Ekspresja RacB w tkance epidermy

RT-PCR z RNA jęczmienia linii Pallas i BCPM1a12 (P10) 24h po szczepieniu (ang. hai - hours after inoculation , godziny po szczepieniu) BghA6. W celu wyekstrahowania, RNA paski odosiowej epidermy (E, ze szczepionych miejsc na liściach) zostały wyizolowane z mezofilu i przyosiowej epidermy (M). Jako tkankowo-niespecyficznej kontroli użyto ubikwityny 1 (Ubi), OXPL użyto jako pozytywnej kontroli ekspresji genów w epidermie, Bas użyto jako pozytywnej kontroli ekspresji genów

PL 206 304 B1 w komórkach mezofilu. W reakcji RT-PCR zastosowano ponad 25 cykli amplifikacji jak opisano poniżej. Produkty RT-PCR zdenaturowano w żelu, przeniesiono na membranę i wykrywano przy użyciu sond antysensownego RNA w ostrych warunkach.

3. Fig. 3: Ekspresja RacB jest konstytutywna w różnych opornych liniach jęczmienia.

RNA izolowano z różnych Ingrid (Mlo, Ror1, Bgh-wrażliwych), BCIngrid-mlo5 (mlo5, Ror1, Bghopornych) i A89 (mlo5, ror1, średnio wrażliwych na BghA6) przed szczepieniem (0 φ) lub 8, 15 lub 24h po szczepieniu („hai) Bgh i 24h z nieszczepionych kontrolnych roślin (24 φ). Jako marker konstytutywnej ekspresji użyto ubikwityny 1 (Ubi), OXPL użyto jako pozytywnej kontroli dla ekspresji genów indukowanej Bgh w warstwie epidermalnej. Ekspresję OXPL wykrywano przy użyciu techniki Northern biot. W reakcji RT-PCR dla RacB i Ubi zastosowano jak opisano ponad 25 cykli amplifikacji. Produkty PCR denaturowano w żelu , przeniesiono na membranę i wykrywano przy użyciu sond antysensownego RNA w ostrych warunkach.

4. Fig. 4: Interferujące RNA dsRNA - genu RacB obniża wydajność wnikania mączniaka prawdziwego jęczmienia BghA6 w jęczmieniu.

Względną skuteczność wnikania (RPE) oznaczano w sześciu niezależnych eksperymentach szczepienia Bgh z jęczmienia odm. Pallas. RPE obliczano jako różnicę pomiędzy skutecznością wnikania komórek transformowanych dsRNA-RacB i skutecznością wnikania komórek transformowanych kontrolnym dsRNA (tutaj: średnia skuteczność wnikania 57%). Procent RPE (%-RPE) obliczano jako RPE minus 1, pomnożone przez 100.

[PE komórek transformowanych dsRNA -RacB]

[PE komórek transformowanych kontrolnym dsRNA] %-RPE = 100 * (RPE-1)

Czarne kolumny oznaczają %-RPE na podstawie oszacowania przynajmniej 100 miejsc interakcji dla każdego niezależnego eksperymentu. Białe kolumny oznaczają średnie %-RPE z eksperymentów z dsRNA-RacB (RACB-dsRNA). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy.

„kontrola oznacza równoległe eksperymenty z kontrolnym dsRNA.

W komórkach, które bombardowano dsRNA-RacB %-RPE był znacząco obniżony w porównaniu z komórkami, które były bombardowane kontrolnym dsRNA (TR: dsRNA ludzkiego receptora tyrozyny).

5. Fig. 5: Wpływ tła genetycznego na funkcję RacB.

%-RPE badano w 5 niezależnych eksperymentach, w których szczepiono jęczmień odm. Pallas, Ingrid lub A89, który wcześniej transformowano dsRNA-RacB BghA6.

%-RPE jest znacząco obniżony w Pallas (Mlo Ror1), czarne słupki, eksperymenty 1 i 2) lub Ingrid (Mlo Ror1, czarne słupki, eksperymenty 3, 4 i 5). %-RPE wrażliwego mutanta A89 (mlo5 ror1, czarne słupki, eksperymenty od 1 do 5) nie był obniżony. Białe słupki wskazują wartości średnie, a słupki błędów błąd standardowy.

6. Fig. 6: Nadekspresja konstytutywnie aktywnego mutanta RacB jęczmienia odm. Pallas.

Przeprowadzono przejściową nadekspresję konstytutywnie aktywnego mutanta jęczmienia

RACB (zamiana G->V w pozycji 15; RacB-V15) w jęczmieniu odm. Pallas w 5 niezależnych eksperymentach przy użyciu konstruktu pGY-RacBV15. Dla porównania odpowiednie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu pustego wektora, bez wstawki RacB (pGY).

W wyniku ekspresji konstytutywnego mutanta RacB obserwowano znacząco wyższą wrażliwość na atak czynników chorobotwórczych pleśni jęczmienia w porównaniu z kontrolą (fig. 6A). We wszystkich przypadkach względna wrażliwość na grzybicze czynniki chorobotwórcze jest podwyższona (fig. 6B). Wyniki te wskazują także na kluczową funkcję RacB w obronie przeciw czynnikom chorobotwórczym.

7. Fig. 7: Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego pGY-1 (Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Shinshi H i wsp. (1990) Plant Mol Biol 14:357-368).

P r z y k ł a d y

Metody ogólne

Chemiczna synteza oligonukleotydów może być przeprowadzona na przykład w znany sposób przy użyciu metody fosfoamidytowej (Voet, Voet, II wyd., Wiley Press New York, strony 896-897). Etapy klonowania dla celów obecnego wynalazku takie jak, na przykład trawienia restrykcyjne, elektroforeza w żelu agarozowym, oczyszczanie fragmentów DNA, transfer kwasów nukleinowych na membranę nitrocelulozową lub nylonową, łączenie fragmentów DNA, transformacja komórek E.coli, hodowla bakterii, namnażanie fagów i analiza sekwencji rekombinowanego DNA przeprowadzano tak, jak

PL 206 304 B1 opisano w Sambrook i wsp. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. Sekwencjonowanie cząsteczek rekombinowanego DNA przeprowadzono przy użyciu laserowego sekwenatora fluorescencyjnego DNA MWG-Licor przy pomocy metody Sangera (Sanger i wsp. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467).

P r z y k ł a d 1: Rośliny, czynniki chorobotwórcze i szczepienie.

Odmiana jęczmienia Ingrid pochodzi od James McKey, University of Uppsala, Szwecja. Odmiana Pallas i linia pochodząca z krzyżowań BCIngrid-mlo5 została dostarczona przez Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Kopenhaga, Dania. Odmianę tę opisano w (Krlster P i wsp. (1986) Crop Sci 26: 903-907). Linia A89 została dostarczona przez Paul Schulze-Lefert (Max-Plank-Institut far Zϋchtungsforschung, Kolonia, Niemcy).

Jeżeli nie wskazano inaczej nasiona, które przygotowano do kiełkowania na wilgotnym, papierowym filtrze przez 12 do 36 godzin w ciemności, wysiano wzdłuż krawędzi kwadratowej doniczki (8 x 8 cm, 5 ziaren na doniczkę) w ziemi Fruhstorfer typu P przykrytej ziemią normalną i nawadnianej regularnie wodą kranową. Wszystkie rośliny hodowano w szafkach lub komorach z kontrolowanym środowiskiem przez 5 do 8 dni w temp. 16 do 18°C, od 50 do 60% względnej wilgotności powietrza i rytmie dobowym 16h światło/8h ciemność, przy świetle o natężeniu 3000 lub 5000 luksów (gęstość strumienia fotonów 50 i 60 mmol s^-1m^-2, odpowiednio) i używano do eksperymentów podczas etapu rozsady. W eksperymentach, w których przeprowadzano podawanie do liści pierwotnych, te ostatnie były całkowicie rozwinięte.

Przed przeprowadzeniem eksperymentów transfekcji przejściowej, rośliny hodowano w szafkach lub komorach z kontrolowanym środowiskiem, w temperaturze podczas dnia 24°C i w temperaturze podczas nocy 20°C, od 50 do 60% względnej wilgotności powietrza i rytmie dobowym 16h światło/8h ciemność, przy świetle 30 000 luksów.

Do szczepienia roślin jęczmienia użyto mączniaka prawdziwego jęczmienia Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchal szczep A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6). Grzyb został dostarczony przez Department of Biometry, JLU Gieeen. Szczepienie hodowano w komorach z kontrolowanym środowiskiem w identycznych warunkach, jak te opisane powyżej dla roślin, poprzez przeniesienia konidiów zainfekowanego materiału roślinnego (100 konidiów/mm²) na 7-dniowe rośliny jęczmienia odm. Golden Promise, które rosły normalnie.

Szczepienie BghA6 przeprowadzano przy użyciu 7-dniowych sadzonek przez wytrząsanie konidiów z już zainfekowanych roślin w wieży do szczepień na poziomie w przybliżeniu 100 konidiów/mm² (jeśli nie wskazano inaczej).

P r z y k ł a d 2: Ekstrakcja RNA

Całkowite RNA ekstrahowano z 8 do 10 segmentów liści podstawowych (długość 5 cm) przy użycu „buforu do ekstrakcji RNA (AGS, Heidelberg, Niemcy).

W tym celu pobierano 5 cm środkowe segmenty liści podstawowych i homogenizowano w ciekłym azocie w moździerzu. Homogent przechowywano w temp. -70°C, aż do momentu ekstrakcji RNA.

Całkowite RNA izolowano z głęboko zamrożonego materiału z liści przy pomocy zestawu do ekstrakcji RNA (AGS, Heidelberg). W tym celu 200 mg głęboko zamrożonego materiału z liści zalewano 1,7 ml buforu do ekstrakcji RNA (AGS) w probówce wirówkowej (2 ml) i natychmiast dokładnie mieszano. Po dodaniu 200 ml chloroformu mieszaninę ponownie dokładnie mieszano i wytrząsano przez 45 minut na wytrząsarce poziomej przy 200 obr./min. w temperaturze pokojowej. W celu oddzielenia faz probówki wirowano następnie przez 15 minut przy 20 000 g w temp. 4°C, i górną, wodną fazę przenoszono do czystej probówki wirówkowej, a dolną fazę wyrzucano. Wodną fazę ponownie oczyszczano 900 ml chloroformu przez 10-sekundową homogenizację i ponowne wirowanie (zob. wyżej) i pobieranie fazy wodnej (3 razy). Następnie dodawano 850 ml 2-propanolu, mieszaninę homogenizowano i umieszczano na lodzie na 30 do 60 minut w celu wytrącenia RNA. Następnie mieszanie wirowano 20 minut (zob. wyżej), zlewano ostrożnie supernatant i dodawano pipetą 2 ml 70% etanolu, mieszano i wirowano przez 10 minut. Następnie supernatant ponownie zlewano i osad ostrożnie oczyszczano z pozostałego płynu przy użyciu pipety, a następnie w strumieniu czystego powietrza na czystym stole laboratoryjnym. Następnie RNA rozpuszczano w 50 ml wody DEPC na lodzie, mieszano i wirowano przez 5 minut (zob. wyżej). 40 ml supernatanu zawierającego roztwór RNA przenoszono do czystej probówki wirówkowej i przechowywano w temp. -70°C.

Stężenie RNA oznaczano fotometrycznie. W tym celu roztwór RNA rozcieńczano w stosunku objętościowym 1:99 (v/v) w wodzie destylowanej i mierzono absorpcję przy długości fali 260 nm (Beckman Photometer DU 7400); (E_{260 nm} = 1 dla 40 μg RN A/ml). Stężenia roztworów RNA wyrównyPL 206 304 B1 wano następnie do 1 mg/ml przy pomocy wody DEPC według wyliczonej zawartości RNA oraz potwierdzano w żelu agarozowym.

Stężenia RNA potwierdzano w żelu agarozowym (1% agaroza w buforze 1 x MOPS z bromkiem etydyny 0,2 μθ/ml). 1 μl roztworu RNA traktowano 1 μl buforu 10 x MOPS, 1 μl barwnika i 7 μl wody DEPC i rozdzielano w żelu zgodnie z wielkością w buforze 1 x MOPS przez 1,5 godziny pod napięciem 120V i fotografowano w świetle UV. Różnice w stężeniu ekstraktów RNA wyrównywano przy użyciu wody DEPC i ponownie sprawdzano w żelu.

P r z y k ł a d 3: Klonowanie sekwencji cDNA RacB jęczmienia.

Fragmenty cDNA służące do izolacji HvRacB, jego klonowania, sekwencjonowania i uzyskania sond otrzymano za pomocą techniki RT-PCR przy użyciu One Step RT-PCR Kit (Life Technologies, Karlsruhe, Niemcy lub Qiagen, Hilden, Niemcy). W tym celu jako matrycy używano całkowite RNA z sadzonek jęczmienia. RNA izolowano z odmiany Pallas 3, 5 i 7 dni po wykiełkowaniu. Ponadto RNA izolowano z odmiany Pallas i krzyżówek wstecznych z mlo5, Mlg lub Mla12 1, 2 i 5 dni po szczepieniu BghA6, które wykonano siódmego dnia po wykiełkowaniu. Do reakcji RT-PCR użyto następujących starterów:

(Sekw. Nr 10) i (Sekw. Nr 11) ng całkowitego RNA, 0,4 mM

ONP-1 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

ONP-2 5 '-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

Do każdej reakcji (25 μl całkowita objętość) stosowano 1000 dNTP, 0,6 mM w przypadku każdego startera OPN-1 i OPN-2, 10 μl inhibitora RNaz i 1 μl mieszaniny enzymu w buforze 1X RT (One Step RT-PCR Kit, Qiagen, Hilden).

Użyto następujący program temperaturowy (PTC-100TM model 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachusetts):

cykl: 30 min. w temp. 50°C cykl: 150s w temp. 94°C cykli: 45 s w temp. 94°C, 1 min. w temp. 55°C i 2 min. w temp. 72°C cykl: 7 min. w temp. 72°C

Produkt PCR rozdzielano elektroforetycznie w 2% (m/v) żelu agarozowym. Reakcja ta dała produkt RT-PCR o całkowitej długości 642 pz składający się z sekwencji RacB (Sekw. Nr 1) i końcowych sekwencji kodujących miejsca restrykcyjne dla endonukleaz restrykcyjnych. Fragment koduje otwartą ramkę odczytu o długości 591 pz, kodującą polipeptyd o długości 197 aminokwasów. Odpowiednie cDNA izolowano z żelu i wklonowano do wektora pGEM-T (Promega, Mannheim, Niemcy) przez ligację wystających zasad T. Cząsteczki cDNA zsekwencjonowano począwszy od plazmidowego DNA przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham, Freiburg, Niemcy).

Ponieważ starter początkowy OPN-1 określono na podstawie sekwencji RacB z ryżu (Nr w bazie GenBank: AF250327), region ten (t.j. koniec 5') cDNA RacB z jęczmienia zweryfikowano za pomocą techniki RACE, używając zestawu GeneRacer Kit (INVITROGENE Life Technologies). W tym celu 100 ng poli-A mRNA, 1 μl buforu 10 x CIP, 10 jednostek inhibitora RNaz, 10 jednostek enzymu CIP (jelitowej cielęcej fosfatazy) i wodę DEPC inkubowano przez 1 godzinę w temp. 50°C w całkowitej objętości 10 μ!. W celu wytrącenia RNA dodano kolejne 90 μl wody DEPC i 100 μl mieszaniny fenol:chloroform, a następnie dokładnie mieszano przez w przybliżeniu 30 sekund. Po wirowaniu przez 5 minut przy 20 000 g, do górnej fazy dodano 2 μl glikogenu z omulka (10 mg/ml), 10 μl 3M octanu sodu (pH 5,2) w czystej mikroprobówce. Do mieszaniny dodano 220 μl 95% etanolu i inkubowano na lodzie. RNA następnie wytrącano przez wirowanie przez 20 minut przy 20 000 g w temp. 4°C. Supernatant usunięto i dodano 500 μl 75% etanolu, mieszaninę krótko wytrząsano i wirowano przez 2 minuty (20 000 g). Ponownie usunięto supernatant, a osad suszono przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zawieszono w 6 μl wody DEPC. Struktury mRNA typu „CAP usuwano przez dodanie 1 μl buforu 10x TAP, 10 jednostek RNAsinu i 1 jednostki enzymu TAP (kwaśna pirofosfataza z tytoniu). Mieszaninę inkubowano przez 1 godz. w temp. 37°C i następnie ochładzano na lodzie. RNA wytrącono ponownie (jak opisano wyżej) i przeniesiono do nowej probówki reakcyjnej z 25 μg startera oligonukleotydowego GeneRacer. Starter oligonukleotydowy zawieszono w roztworze RNA, a mieszaninę inkubowano przez 5 minut w temp. 70°C, a następnie ochłodzono na lodzie. Dodano 1 μl 10x buforu do ligacji, 10 mM ATP, 1 jednostkę RNAsinu i 5 jednostek ligazy T4 RNA i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w temp. 37°C. RNA wytrącono ponownie (jak opisano wyżej) i zawieszono w 13 μl wody DEPC. Do RNA dodano 10 pmol startera oligo-dT i mieszaninę natychmiast ogrzano do temp. 70°C i ponownie ochłodzono na lodzie. Dodano 1 μl roztworu każdego z dNTP (25 mM), 2 μl buforu

PL 206 304 B1

10x RT, 5 jednostek (1 μθ odwrotnej transkryptazy AMV i 20 jednostek RNAsinu, i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 1 godzinę w temp. 42°C, a natępnie przez 15 minut w temp. 85°C. W ten sposób przygotowane jednoniciowe cDNA przechowywano w temp. - 20°C.

Następujące startery użyto do namnożenia końców 5' cDNA:

Starter RACE RacB:

5'-gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3' (Sekw. Nr 12)

Starter GeneRacer™ 5':

5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 (Sekw. Nr 13)

Starter następczy (ang. nested) GeneRacer™ 5':

5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 (Sekw. Nr 14)

Próbka (całkowita objętość 25 μθ zawierała:

μl startera RACE RacB (5 pmol/μθ

0,5 μl startera GeneRacer 5' (10 pmol/μθ

2,5 μl 10x buforu Qiagen

2,5 μl mieszaniny każdego dNTP (2 mM)

0,5 μ cDNA

0,2 μl enzymu Qiagen TAG (5U^l)

17,8 μί H2O

Warunki reakcji PCR:

94°C denaturacja przez 5 minut cykli 30 sekund w temp. 70°C (hybrydyzacja - ang. „annealing) min. w temp. 72°C (wydłużanie) sekund w temp. 94°C (denaturacja) cykli 30 sekund w temp. 68°C (hybrydyzacja) min. w temp. 72°C (wydłużanie) sekund w temp. 94°C (denaturacja) cykli 30 sekund w temp. 66°C (hybrydyzacja) min. w temp. 72°C (wydłużanie) sekund w temp. 94°C (denaturacja)

72°C końcowe wydłużanie przez 10 minut

4°C chłodzenie do momentu dalszego użycia

W wyniku reakcji PCR otrzymano produkt o długości w przybliżeniu 400 pz. Używając tego produktu wykonano następczą reakcję PCR ze starterem oligonukleotydowym specyficznym do RacB i „następczym starterem 5' GeneRacer:

94°C denaturacja przez 5 minut cykli 30 sekund w temp. 64°C (hybrydyzacja) min. w temp. 72°C (wydłużanie) sekund w temp. 94°C (denaturacja)

72°C końcowe wydłużanie przez 10 minut

4°C chłodzenie do momentu dalszego użycia

Otrzymany produkt reakcji PCR wyizolowano z żelu, wklonowano do wektora pGEM-T przez ligację wystających końców T i zsekwencjonowano. Sekwencja w regionie startera OPN-1 była całkowicie identyczna z sekwencją RacB z ryżu, co wskazuje, że poprzez startery nie została wprowadzona żadna mutacja punktowa. Dlatego sekwencja pokazana w Sekw. Nr 1 jest identyczna z sekwencją RacB z jęczmienia.

P r z y k ł a d 4: Odwrotna transkrypcja - Reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-PCR)

Do półilościowej reakcji RT-PCR użyto zestawu One Step RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany). RNA (przygotowane jak wyżej) przepisano najpierw na cDNA (odwrotna transkrypcja) i szukane cDNA namnożono następnie w reakcji PCR przy użyciu specyficznych starterów. W celu oszacowania początkowej ilości RNA matrycowego, namnażanie przerwano podczas fazy wykładniczej w celu ukazania różnic w docelowym RNA. Produkty reakcji PCR rozdzielano na żelu agarozowym, denaturowano, przenoszono na membranę nylonową i wykrywano przy użyciu specyficznych, nieradioaktywnych sond w ostrych warunkach standardowych. Hybrydyzację, etapy płukania i immunodetekcję przeprowadzano w sposób opisany w opisie techniki „Northern biot.

Następujące składniki łączono w pojedynczej reakcji (25 μl całkowitej objętości) przy użyciu zestawu One Step RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy):

PL 206 304 B1

1000 ng całkowitego RNA specyficznej próbki

0,4 mM mieszaniny każdego dNTP

0,6 μM każdego startera sensownego i antysensownego

0,1 μl inhibitora RNaz μl enzymu w buforze1x RT

Syntezę cDNA (odwrotna transkrypcja) prowadzono przez 30 minut w temp. 50°C. Następnie odwrotną transkryptazę dezaktywowano przez 15 minut w temp. 95°C, co jednocześnie powodowało aktywację polimerazy DNA i denaturację cDNA. Reakcję PCR prowadzono następnie przy użyciu następującego programu:

denaturacja przez 1 minutę w temp. 94°C cykli 1 minuta w temp. 54°C hybrydyzacja startera minuta w temp. 72°C wydłużanie startera 10 minut w temp. 72°C wypełnianie dupleksów DNA następnie: zakończenie reakcji w temp. 4°C.

Produkty reakcji PCR rozdzielano w 1x TBE żelu agarozowym z bromkiem etydyny. Następujące startery oligonukleotydowe użyto do namnażania w poszczególnych próbkach:

a) namnażanie fragmentu 387 pz z cDNA RacB z jęczmienia RacB sensowny 5'-gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3' (Sekw. Nr 15)

RacB antysensowny 5'-ttagcttcctcagttcttccctg-3' (Sekw. Nr 16)

b) namnażanie fragmentu 674 pz z cDNA BAS z jęczmienia (Nr w bazie GenBank Z34917)

BAS sensowny 5'-cgcgccgcagccgagtacgac-3' (Sekw. Nr 17)

BAS antysensowny 5'-gtcacaaaaacacatgtaacc-3' (Sekw. Nr 18)

c) namnażanie fragmentu 506 pz z cDNA OXLP (Nr w bazie GenBank X93171)

OXLP sensowny 5'-ggccgacatgcattcaccag-3' (Sekw. Nr 19)

OXLP antysensowny 5'-catctgatattgctgggtctg-3' (Sekw. Nr 20)

d) namnażanie fragmentu 513 pz z cDNA Ubi (Nr w bazie GenBank M60175)

UBI sensowny 5'-ccaagatgcagatcttcgtga-3' (Sekw. Nr 21)

UBI antysensowny 5'-ttcgcgataggtaaaagagca-3'(Sekw. Nr 22)

Wszystkie otrzymane fragmenty dodatkowo zligowano z wektorem pGEM-T przy użyciu ligacji wystających końców T i używano jako plazmidy wyjściowe do otrzymania sond (na przykład do Northern błot) lub dsRNA. Poszczególne konstrukty nazwano pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

P r z y k a d 5: Analiza techniką „Northern blot

Do przygotowania membran Northern RNA rozdzielano w żelu agarozowym w warunkach denaturujących. W tym celu część roztworu RNA (odpowiadająca 5 μg RNA) mieszano z identyczną objętością buforu do próbek (z bromkiem etydyny), denaturowano przez 5 minut w temp. 94°C, umieszczano na lodzie na 5 minut, wirowano krótko i nakładano na żel. Żel 1x MOPS (1,5% agaroza, klasy ultraczystej) zawierał 5 procent objętościowych stężonego roztworu formaldehydu (36,5% (v/v)). RNA rozdzielano przez 2 godziny pod napięciem 100V i następnie przenoszono na membranę.

Transfer RNA typu „Northern wykonano w systemu kapilarno-wznoszącym. W tym celu żel najpierw delikatnie mieszano przez 30 minut w 25 mM buforze zawierającym wodorofosforan sodu i dwuwodorofosforan sodu (pH 6,5) i docinano do odpowiedniego rozmiaru. Kawałki bibuły Whatman przygotowywano w ten sposób, aby leżały w pozycji poziomej na podstawce i wystawały z dwóch stron zanurzone w 25 mM buforze zawierającym wodorofosforan sodu i dwuwodorofosforan sodu (pH 6,5). Na taką bibułę nakładano żel, a niepokryte żelem fragmenty bibuły Whatman pokrywano parafilmem. Następnie żel pokrywano dodatnio naładowaną membraną nylonową (BoehringerMannheim), unikając pęcherzyków powietrza, po czym membrana była pokrywana blokiem bibuły o wysokości w przybliżeniu 5 cm. Dodatkowo na bibułę nakładano płytkę szklaną i obciążano odważnikiem 100 g. Transfer przeprowadzano przez noc w temperaturze pokojowej. Membranę krótko płukano w podwójnie destylowanej wodzie i naświetlano promieniami UV w aparacie do sieciowania (Biorad) światłem o energii 125 mJ w celu unieruchomienia RNA. Równomierność transferu RNA na membranę sprawdzano w aparacie UV.

Aby wykryć mRNA jęczmienia 10 μg całkowitego RNA z każdej próbki rozdzielano w żelu agarozowym i transferowano na dodatnio naładowaną membranę nylonową w transferze kapilarnym. Wykrywanie przeprowadzano z użyciem systemu DIG.

PL 206 304 B1

Przygotowanie sondy: sondy RNA znakowane digoksygeniną lub fluoresceiną przygotowywano w celu hybrydyzacji z cząsteczkami mRNA, które miały zostać wykryte. Sondy otrzymywano w procesie transkrypcji in vitro produktu PCR za pomocą polimerazy RNA - T7 lub SP6, używając znakowanych UTP. Jako matryce do namnażania za pomocą PCR służyły opisane powyżej wektory plazmidowe pGEMT-RAC1, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

W zależności od orientacji wstawki, różne polimerazy RNA używano w celu otrzymania nici antysensownej. Polimerazę RNA T7 używano do pGEMT-BAS i pGEMT-OXLP, podczas gdy polimerazę RNA SP6 używano do pGEMT-RAC1 i pGEMT-UBI.

Wstawkę z poszczególnych wektorów namnażano za pomocą PCR przy użyciu standardowych starterów otaczających (M13 fwd i rev). Reakcję prowadzono z następującymi końcowymi stężeniami w całkowitej objętości 50 μl buforu PCR (Silverstar):

M13-fwd 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' (Sekw. Nr 23)

M13-rev 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'(Sekw. Nr 24)

10% dimetylosulfotlenku (v/v) ng^l każdego startera (Ml3 fwd i rev)

1,5 mM MgCl2

0,2 mM mieszaniny każdego dNTP jedn. polimerazy Taq (Silverstar) ng^l plazmidowego DNA

Namnażanie przeprowadzano w termocyklerze (Perkin Elmar 2400) z użyciem następującego programu temperaturowego:

94°C denaturacja przez 3 minuty cykli 30 sekund w temp. 94°C (denaturacja) sekund w temp. 58°C (hybrydyzacja)

1,2 minuty w temp. 72°C (wydłużanie)

72°C końcowe wydłużanie przez 5 minut

4°C chłodzenie do momentu dalszego użycia

To czy reakcja zaszła, sprawdzano w 1% żelu agarozowym. Produkty następnie oczyszczano przy użyciu zestawu High Pure PCR-Product Purification Kit (Boehringer-Mannheim). Oczyszczanie dawało w przybliżeniu 40 μl eluatu kolumnowego, który ponownie sprawdzano w żelu i przechowywano w temp. -20°C.

Polimeryzację RNA, hybrydyzację i wykrywanie za pomocą reakcji immunologicznej przeprowadzono w znacznej mierze według instrukcji z zestawu producenta dotyczącej nieradioaktywnego wykrywania RNA (DIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel i wsp. (1994) Plant Physiol 106:1264-1277). Do 4 μl oczyszczonego produktu PCR dodano 2 μl buforu do transkrypcji, 2 μl mieszaniny znakowanych NTP, 2 μl mieszaniny NTP i 10 μl wody DEPC. Następnie dopipetowano 2 μl roztworu polimerazy RNA T7. Reakcję prowadzono przez 2 godziny w temp. 37°C i następnie dodano wody DEPC do mieszaniny do 100 μl końcowej objętości. Sondę RNA wykrywano w żelu zawierającym bromek etydyny i przechowywano w temp. - 20°C.

Do przygotowania hybrydyzacji membrany mieszano najpierw łagodnie przez 1 godzinę w temp. 68°C w buforze 2x SSC (sól, cytrynian sodu), 0,1% SDS (dodecylosiarczan sodu), bufor wymieniano 2 lub 3 razy. Następnie membrany nakładano na wewnętrzną stronę rur hybrydyzacyjnych rozgrzanych do temp. 68°C i inkubowano przez 30 minut w 10 ml buforu hybrydyzacyjnego DIG-Easy w rozgrzanym piecu hybrydyzacyjnym. W międzyczasie 10 μl roztworu sondy denaturowano przez 5 minut w temp. 94°C w 80 μl buforu hybrydyzacyjnego, mieszaninę następnie umieszczano na lodzie i krótko wirowano. W celu hybrydyzacji sondę przenoszono do 10 ml buforu hybrydyzacyjnego o temp. 68°C, bufor w rurze hybrydyzacyjnej zamieniano na bufor z sondą. Hybrydyzację prowadzono przez noc, podobnie w temp. 68°C.

Przed wykrywaniem hybryd RNA-RNA przy pomocy reakcji immunologicznej, zhybrydyzowane membrany płukano dwa razy w ostrych warunkach za każdym razem przez 20 minut w 0,1% (m/v) SDS, 0,1x SSC w temp. 68°C.

PL 206 304 B1

W celu wykrywania immunologicznego zhybrydyzowane membrany mieszano dwukrotnie przez 5 minut w 2x SSC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzano dwa etapy płukań w ostrych warunkach za każdym razem przez 15 minut w temp. 68°C w 0,1x SSC, 0,1% SDS. Roztwór następnie zamieniano na bufor do płukania bez Tween. Mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 1 minutę i roztwór wymieniano na odczynnik blokujący. Po kolejnych 30 minutach wytrząsania dodawano 10 μ! roztworu przeciwciała anty-fluoresceina i wytrząsanie kontynuowano przez 60 minut.

Następnie płukano dwa razy po 15 minut w buforze zawierającym Tween. Membrany następnie równoważono przez 2 minuty w buforze do substratu i po odsączeniu przenoszono na fragment folii acetylocelulozowej. Mieszaninę 20 μl CDP-Star™ i 2 ml buforu do substratu nanoszono równomiernie na membranę na „stronę RNA. Membranę następnie pokrywano drugim fragmentem folii acetylocelulozowej, a krawędzie zgrzewano w celu otrzymania wodoodpornego uszczelnienia, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. W ciemnym pokoju na membranę nakładano na 10 minut kliszę rentgenowską, a następnie kliszę wywoływano. Czas naświetlania różnił się w zależności od reakcji luminescencji.

Jeśli nie wskazano inaczej, roztwory pochodziły z zestawu (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Wszystkie inne przygotowywano z następujących, stężonych roztworów wyjściowych przez rozcieńczenie autoklawowaną wodą destylowaną. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie stężone roztwory wyjściowe przygotowywano z DEPC (jak woda DEPC), a następnie autoklawowano.

- woda DEPC: destylowaną wodę inkubowano przez noc w temp. 37°C z dietylopirowęglanem (DEPC, 0,1%, m/v) i następnie autoklawowano.

- bufor 10x MOPS: 0,2 M MOPS (kwas morfolino-3-propanosulfonowy), 0,05 M octan sodu, 0,01 M EDTA, pH ustawiono do wartości 7,0 przy pomocy 10 M NaOH.

- 20x SSC (chlorek sodu/cytrynian sodu, sól/cytrynian sodu): 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian trisodu x 2H2O, pH ustawiono do wartości 7,0 przy pomocy 4 M HCl.

1% SDS (dodecylosiarczan sodu) dodecylosiarczan sodu (m/v), bez DEPC.

- bufor do próbek RNA: 760 μl formamidu, 260 μl formaldehydu, 100 μl bromku etydyny (10 mg/ml), μl glicerolu, 80 μl błękitu bromofenolowego (wysyconego), 160 μl 10x MOPS, 100 μl wody.

- 10x bufor do płukania bez Tween: 1,0 M kwas maleinowego, 1,5 M NaCl, bez DEPC, ustawiano pH do wartości 7,5 przy pomocy NaOH (stałe, w przybliżeniu 77 g) i 10 M NaOH.

- bufor do płukania zawierający Tween: otrzymywano przez dodanie Tween do buforu do płukania bez Tween (0,3%, v/v).

- 10x odczynnik blokujący: zawieszano 50 g proszku blokującego (Boehringer-Mannheim) w 500 ml buforu do płukania bez Tween.

- bufor do substratu: w buforze 100 mM Tris (trishydroksymetyloaminometan), 150 mM NaCl, ustawiano pH do wartości 9,5 przy pomocy 4 M HCl.

- 10x barwnik: 50% glicerol (v/v), 1,0 mM EDTA o pH 8,0, 0,25% błękit bromofenolowy (w/v),

0,25% ksylen cyjanolowy (w/v).

P r z y k ł a d 6: Synteza dsRNA RacB in vitro.

Wszystkie plazmidy (pGEMT-RAC1, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI), które używano do transkrypcji in vitro zawierały promotory T7 i SP6 (pGEM-T, Promega), na odpowiednich końcach wstawionej sekwencji kwasu nukleinowego, co umożliwiało syntezę sensownego i antysensownego RNA. Plazmid zlinearyzowano przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych w celu zapewnienia właściwej transkrypcji wstawionej sekwencji kwasu nukleinowego i przeciwdziałania kontynuacji odczytu z sekwencji wektora.

W tym celu 10 μg plazmidowego DNA trawiono w każdym przypadku w miejscu wstawki oddalonym od promotora. Strawione plazmidy w 200 μl wody ekstrahowano w identycznej objętości mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, przenoszono do nowej probówki Eppendorf (wolnej od RNaz) i wirowano przez 5 minut przy 20 000 g. Do 180 μl roztworu plazmidu dodawano 420 μl etanolu i mieszaninę umieszczano na lodzie, a następnie wytrącano przez wirowanie przez 30 minut przy 20 000 g w temp. - 4°C. Osad zawieszano w 10 μl buforu TE.

W celu przygotowania dsRNA RacB plazmid pGEMT-Rac1 trawiono enzymem Spel i sensowne RNA transkrybowano przy użyciu polimerazy RNA T7. Ponadto pGEMT-Rac1 trawiono enzymem Ncol i antysensowne RNA transkrybowano przy użyciu polimerazy RNA SP6. Polimerazy RNA pochodziły z Roche Molecular Biology, Mannheim, Niemcy. Każda reakcja transkrypcji zawierała następujące składniki w objętości 40 μ!:

PL 206 304 B1 μl zlinearyzowanego plazmidowego DNA (1 μg) μl mieszaniny NTP (25 mM) (1,25 mM każdego NTP) μl buforu do reakcji 10x (Roche Molecular Biology) μl RNAsin (27 jednostek, Roche Molecular Biology) μl polimerazy RNA (40 jednostek) μl wody DEPC

Następnie inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C, część mieszaniny reakcji transkrypcji nici sensownej i antysensownej, odpowiednio, mieszano, denaturowano przez 5 minut w temp. 95°C, a następnie hybrydyzowano przez ochłodzenie do końcowej temp. 37°C przez 30 minut. Alternatywnie, możliwe jest zdenaturowanie mieszaniny sensownej i antysensownej nici, a następnie ochłodzenie jej przez 30 minut w temp. - 20°C. Białka, wytrącone podczas denaturacji i hybrydyzacji, usuwano przez krótkie wirowanie mieszaniny reakcyjnej przy 20 800 g, supernatant używano bezpośrednio do pokrycia kuleczek wolframowych (zob. poniżej). Do analizy 1 μl każdej nici RNA i dsRNA rozwijano w niedenaturującym żelu agarozowym. Właściwa hybrydyzacja przejawiała się zmianą wysokości migracji prążka w stronę wysokocząsteczkową w porównaniu z nicią pojedynczą.

μl dsRNA wytrącono etanolem (przez dodanie 6 μl wody, 1 μl roztworu 3M octanu sodu i 25 μl etanolu i wirowanie przez przynajmniej 5 minut przy 20 000 g w temp. 4°C) i osad zawieszono w 500 μl wody. W celu oznaczenia czystości i stężenia dsRNA mierzono widmo absorpcyjne między 230 i 300 nm lub absorpcję przy długości fali 280 i 260 nm. Zasadniczo otrzymywano 80 do 100 μg dsRNA ze stosunkiem OD260/OD280 na poziomie 1,80 do 1,95. Trawienie Dnazą I może być przeprowadzone, ale nie ma to znaczącego wpływu na wynik.

Jako kontrolne dsRNA użyto dsRNA dla ludzkiego receptora tyroksyny (wektor wyjściowy pT7betaSal (Norman C i wsp. (1988) Cell 55(6):989-1003), otrzymany od Dr. Baniahmad, Department of Genetics, Gieeen, Niemcy; sekwencję wstawki przedstawiono w bazie GenBank pod numerem NM 000461). W celu otrzymania sensownego RNA plazmid trawiono enzymem PvuII, a w celu otrzymania antysensownego RNA trawiono enzymem Hindlll, RNA transkrybowano przy użyciu polimeraz RNA T7 i SP6, odpowiednio. Poszczególne etapy procesu otrzymywania kontrolnego dsRNA przeprowadzano analogicznie do tych opisanych powyżej dla dsRNA RacB.

P r z y k ł a d 7: Przejściowa transformacja, RNAi i ocena rozwoju grzybiczych czynników chorobotwórczych.

Segmenty liści jęczmienia odm. Pallas transformowano dsRNA RacB razem z wektorem ekspresyjnym GFP. Liście następnie szczepiono Bgh, a wynik analizowano po 48 godzinach pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym. Wnikanie do komórek z ekspresją GFP oceniano przez wykrywanie haustoriów w żywych komórkach i przez ocenę rozwoju grzyba dokładnie w tych komórkach. We wszystkich sześciu eksperymentach bombardowanie jęczmienia odm. Pallas dsRNA RacB powodowało obniżenie liczby komórek, do których wniknęło Bgh w porównaniu do komórek bombardowanych innym, kontrolnym dsRNA (dsRNA dla ludzkiego receptora hormonu tyroksyny, TR). Wpływ dsRNA RacB na indukowaną oporność powodował średnio obniżenie skuteczności wnikania o 44% (fig. 4).

Metodę zastosowaną do przejściowej transformacji wcześniej opisano dla biolistycznego wprowadzania dsRNA do komórek epidermy liści jęczmienia (Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P i wsp. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Kuleczki wolframowe o średnicy 1,1 μm (gęstość kuleczek 25 mg/ml) pokrywano dsRNA (przygotowanie zob. wyżej) razem z plazmidowym DNA wektora pGFP (GFP pod kontrolą promotora CaMV 35S), jako znacznika transformacji. Do każdego bombardowania, do pokrywania używano następujących ilości dsRNA i plazmidu reporterawego: 1 pg pGFP i 2 pg dsRNA. Dwuniciowe RNA syntetyzowano in vitro przez hybrydyzację sensownego i antysensownego RNA (zob. wyżej).

Do przygotowania mikronośników, 55 mg kuleczek wolframowych (M 17, średnica 1,1 pm, BioRad, Munich) płukano dwukrotnie 1 ml autoklawowanej, destylowanej wody i jednokrotnie 1 ml alkoholu bezwodnego, suszono i zawieszano w 50% glicerolu (w przybliżeniu 50 mg/ml stężonego roztworu). Roztwór rozcieńczano do stężenia 25 mg/ml 50% glicerolem, mieszano dokładnie przed użyciem i zawieszano przy pomocy ultradźwięków. W celu pokrycia mikronośników do każdego bombardowania 1 μg plazmidu, 2 μg dsRNA (1 μθ, 12,5 μl zawiesiny kuleczek wolframowych (25 mg/ml), 12,5 μl roztworu 1 M Ca(NO3)2 (pH 10), łączono dodając kroplami przy stałym mieszaniu, mieszaninę odstawiano na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótko wirowano i odciągano 20 μl supernatantu. Resztę zawierającą kuleczki wolframowe zawieszano (łaźnia ultradźwiękowa) i stosowano do eksperymentów.

PL 206 304 B1

Używano segmentów (w przybliżeniu 4 cm długości) z podstawowych liści jęczmienia. Tkankę umieszczano na 0,5% Phytagar (GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) uzupełnionym benzimidazolem (20 μg/ml), na szalkach Petriego (średnica 6,5 cm), krawędzie przykrywano bezpośrednio przed bombardowaniem kuleczkami wzorcem z prostokątnym otworem 2,2 cm x 2,3 cm. Jedna po drugiej szalki umieszczano na dnie komory próżniowej (Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54), nad którą umieszczano nylonowe sitko (rozmiar oczka 0,2 μm, Millipore, Eschbom), które umieszczono w otworze płytki (5 cm ponad dnem, 11 cm pod makronośnikiem, zob. poniżej), aby działało jako rozpraszacz agregatów kuleczek i zwalniało strumień kuleczek. Do każdego bombardowania makronośnik (uchwyt filtra plastikowej strzykawki, 13 mm Gelman Sciences, Swinney, UK), który był umocowany na szczycie komory, ładowano 5,8 μl wolframowych kuleczek pokrytych DNA (mikronośnik, zob. poniżej). Ciśnienie w komorze obniżano o 0,9 bara przy użyciu przeponowej pompy próżniowej (Vacuubrand, Wertheim) i powierzchnię tkanki roślinnej bombardowano kuleczkami wolframowymi przy użyciu helu pod ciśnieniem 9 bar. Natychmiast potem komorę napowietrzano. W celu oznakowania stransformownych komórek liście bombardowano plazmidem (pGFP; oparty na wektorze pUC18, kaseta CaMV 35S promoter/terminator z wstawionym genem GFP; Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; otrzymany od Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institut far Pflanzengenetik [Department of Plant Genetics] IPK, Gatersleben, Niemcy). Za każdym razem, gdy używano innego plazmidu makronośnik czyszczono dokładnie wodą. Po inkubacji przez cztery godziny po bombardowaniu z lekko otwartą szalką Petriego w temperaturze pokojowej i świetle dziennym, liście szczepiono grzybem mączniaka prawdziwego jęczmienia (szczep A6), 100 konidiów/mm² i inkubowano przez kolejne 36 do 48 godzin w identycznych warunkach.

Segmenty liści bombardowano pokrytymi kuleczkami przy użyciu „armatki genowej z dopływem kuleczek. Stosowano 312 μg kuleczek wolframowych na jedno bombardowanie. 4 godziny po bombardowaniu segmenty liści szczepiono pleśnią Blumeria graminis f.sp. hordei (szczep A6) i po kolejnych 40 godzinach oceniano objawy infekcji. Wynik (na przykład skuteczność wnikania, zdefiniowana jako procent zaatakowanych komórek z dojrzałym haustorium i drugorzędowymi strzępkami grzybni (drugorzędowymi wydłużającymi strzępkami grzybni)) analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym i świetlnym. Szczepienie 100 konidiami/mm² powodowało częstość ataku w przybliżeniu 50% transformowanych komórek. Minimalnie oceniano 100 miejsc oddziaływania w pojedynczym eksperymencie. Stransformowane (z ekspresją GFP) komórki identyfikowano wzbudzając je światłem niebieskim. Rozróżniano trzy różne kategorie stransformowanych komórek.

1. Komórki, do których nastąpiło wniknięcie, zawierające łatwo rozpoznawalne haustorium.

Komórka z więcej niż jednym haustorium, liczonym jako jedna komórka.

2. Komórki zaatakowane przez grzybiczą wypustkę, ale nie zawierające haustorium. Komórka, która została zaatakowana wielokrotnie przez Bgh, ale nie zawiera haustorium, liczonego jako jedna komórka.

3. Komórki nie zaatakowane przez Bgh.

Komórki stomatalne i pomocnicze wykluczono z oceny. Powierzchnię struktur Bgh analizowano pod mikroskopem świetlnym lub barwiąc flurescencyjnie grzyby 0,1% (w/v) Calcofluorem (w wodzie) przez 30 sekund. Rozwój grzyba może być oceniony łatwo przez barwienie Calcofluorem pod mikroskopem fluorescencyjnym. Podczas gdy grzyb rozwija podstawową rurkę zarodkową oraz wypustkową rurkę zarodkową w komórkach transformowanych dsRNA RacB, nie jest zdolny do rozwinięcia haustorium. Rozwój haustorium jest warunkiem wstępnym do rozwinięcia drugorzędowych strzępek grzybni.

Względną skuteczność wnikania (RPE) obliczano jak różnicę między skutecznością wnikania (PE) do stransformowanych komórek (transformacja dsRNA RacB lub kontrolnym dsRNA) i skutecznością wnikania (PE) do niestransformowanych komórek (tutaj: średnia skuteczność wnikania 57%). Procent RPE (%-RPE) obliczano jako RPE minus 1, pomnożone przez 100.

[PE do komórek stransformowanych dsRNA RacB]

[PE do komórek stransformowanych kontrolnym dsRNA] %-RPE = 100 * (RPE - 1)

Wartość %-RPE (odchylenie od średniej skuteczności wnikania w kontroli) pozwala wyznaczyć wrażliwość komórek transfekowanych dsRNA RacB (fig. 4) W przypadku kontrolnego dsRNA nie znaleziono różnic pomiędzy transfekcją kontrolnym dsRNA i wodą w pięciu niezależnych eksperymentach dotyczących skuteczności wnikania Bgh.

PL 206 304 B1

Badano także odchylenia skuteczności wnikania (PE) w różnych genotypach. W celu pokazania funkcjonalnego połączenia z genem Mlo, zastosowano genotyp mlo5 (A89, mlo5 ror1, podłoże: Ingrid), w związku z tym, że zawiera mutację w genie Ror1, posiada zaledwie umiarkowaną wrażliwość na infekcję Bgh (Freialdenhoven i wsp. (1996) Plant cell 8:5-14). W tym podwójnie zmutowanym genotypie badano skuteczność dsRNA RacB w porównaniu do Mlo o niezmienionym genotypie. Jakkolwiek w pięciu niezależnych eksperymentach nie obserwowano efektu przeciwdziałania rozwojowi haustoriów u A89, w esperymentach równoległych z użyciem Pallas i Ingrid skuteczność wnikania (PE) była znacząco obniżona (fig. 5). Interesująco, wpływ dsRNA RacB był bardziej pogłębiony w przypadku Pallas niż w przypadku Ingrid (fig. 5, eksperymenty 1 i 2 w porównaniu do 3, 4 i 5).

Aby wykluczyć wpływ dsRNA na poziom transformacji lub poziom przeżycia atakowanych komórek, liczbę komórek z ekspresją GFP porównywano pomiędzy kontrolnymi esperymentami i eksperymentami z dsRNA RacB (tabela 7). Nie odnotowano wpływu dsRNA na całkowitą liczbą lub liczbę komórek zainfekowanych, komórek z ekspresją GFP.

T a b e l a 7:

Poziom transformacji liści jęczmienia po bombardowaniu dsRNA

Liczba komórek z ekspresją GFP w jednym bombardowaniu³

Linia	Całkowita (Kontrolne dsRNA)	Zainfekowane (Kontrolne dsRNA)	Całkowita (RacB dsRNA)	Zainfekowane (RacB dsRNA)	nc
Pallas (Mlo Ror1)	34,3+4,6	16,0±2,2	33,9±4,8	15,5±1,4	6(21)
Ingrid (Mlo Ror1)	51,0±8,9	27,6±8,7	49,9±5,6	3ł,5±7,8	3(11)
A89 (mlo5 ror1)	34,4±5,4	18,1±4,0	34.1 ±5. 5	16,7+3,8	5(22)

a: bombardowano 4 liście w jednym bombardowaniu.

Dane pokazano jako wartości średnie z błędami standardowymi, c: Liczba niezależnych eksperymentów (bombardowania n w każdym przypadku dla kontrolnego i RacB dsRNA).

P r z y k ł a d 8: Konstytutywnie aktywny mutant RACB

Otrzymano potencjalnie aktywnego mutanta RACB jęczmienia (podstawienie G->V w pozycji 15, RacB-V15) i przeprowadzono jego nadekspresję w jęczmieniu odm. Pallas w celu pozytywnego określenia RACB jako czynnika wrażliwości. Najpierw RACB pełnej długości zsyntetyzowano przy pomocy RT-PCR. Do tego celu zastosowano następujące startery oligonukleotydowe:

RacB5'BamHI: 5'-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3' (Sekw. Nr 31)

RacB3'SalI: 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3' (Sekw. Nr 32) cDNA wklonowano do pGEM-T i następnie wycięto przez miejsca na starterach i wklonowano do pGY-1 (Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; fig. 7) na miejsca restrykcyjne BamHI/Sall. Powstały konstrukt nazwano pGY1-RacB. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą konstytutywnie aktywnego mutanta RacB -RACB-V15 wytworzono przy użyciu zestawu Transformer®Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech, Heidelberg) według instrukcji producenta. Jako wyjściowy wektor zastosowano pGY1-RacB. Użyto następującego oligonukleotydu jako startera do mutagenezy: V15 : 5'-ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3' (Sekw. Nr 33)

Następnie przeprowadzono przejściową nadekspresję RACB-V15 w 5 niezależnych eksperymentach w jęczmieniu odm. Pallas, pod kontrolą promotora 35S CamV. Eksperymenty przeprowadzano w sposób opisany przez Schultheiss i wsp. (Schultheiss H i wsp. (2002) Plant Physiol 128:1447-1454), z wyjątkiem tego, że po bombardowaniu kuleczkami czekano 24 godziny zamiast 4 godzin przed szczepieniem. Kuleczki pokryto jak opisano przez Schweizer i wsp. (Schweizer P i wsp. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54).

Ekspresja konstytutywnego mutanta RacB znacząco podnosi wrażliwość na infekcję czynnikiem chorobotwórczym - mączniakiem prawdziwym jęczmienia w porównaniu do kontroli. Ponownie, wyniki te potwierdzają kluczową rolę RacB w obronie przed czynnikami chorobotwórczymi. Wpływ RACB-V15 (zob. fig. 6-A/B) jest istotny statystycznie w t-teście, gdy przeprowadzono dwusparowany test. Względna wrażliwość na grzybicze czynniki chorobotwórcze jest podwyższona we wszystkich przypadkach (fig. 6-B).

PL 206 304 B1

P r z y k ł a d 9: Kolejne homologi HvRac

Wszystkie pełne sekwencje izolowano z RNA przy użyciu specyficznych starterów, wklonowano do pGEM-T i sekwencjonowano (Hiickelhoven i wsp. (2001) Plant Mol Biol; Schultheiss i wsp. (2002) Plant Physiol 128:1447-1454). W pewnych przypadkach sekwencje były bardzo podobne do RacB.

a) HvRop6:

LEWY STARTER PRAWY STARTER

b) HvRacD:

LEWY STARTER PRAWY STARTER

c) HvRop4:

LEWY STARTER PRAWY STARTER

5'-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3' (Sekw. Nr 25) 5'-CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3' (Sekw. Nr 26)

5'-ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3' (Sekw. Nr 27) 5'-gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3' (Sekw. Nr 28) '-GGATCCttctcgtccatttagccggc-3' (Sekw. Nr 29) '-GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3' (Sekw. Nr 30)

P r z y k ł a d 10: Wytworzenie sensownych i antysensownych konstruktów z genem AtRacB służących do ekspresji w Arabidopsis thaliana

Fragment homologu RacB z Arabidopsis (MIPS-Kod: AT4g35950; Sekw. Nr 53; poniżej jako AtRacB) izolowano przy pomocy PCR z biblioteki cDNA Arabidopsis thaliana.

Sekwencje użytych starterów:

Fra 186: 5' -ATG AGCGCGTCCAGGTTC AT A-3' (Sekw. Nr 71)

Fra 187: 5'-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3' (Sekw. Nr 72)

Namnażanie przeprowadzano w termocyklerze T3 z Biometra przy użyciu następującego profilu temperaturowego:

cykli: 1 min. w temp. 95°C, 0,5 min. w temp. 59°C i 3 min. w temp. 72°C.

Następnie wydłużanie przez 5 min. w temp. 72°C.

Produkty PCR wklonowano do wektora pCR2.1 (zgodnie z zestawem pCR Script Cloning Kit, Stratagene, Heidelberg) według instrukcji producenta. Fragment wycinano z wektora enzymem restrykcyjnym EcoRI (Roche, Mannheim). Fragment izolowano z żelu elektroforetycznego i następnie oczyszczano przy użyciu kolumny z wymieniaczem anionowym (QIAex Purification Kit, Qiagen, Hilden). Podobnie trawiono binarny wektor PSUN3-Nit przy użyciu enzymów Xmal i EcoRI i poddawano oczyszczaniu w żelu agarozowym, a następnie eluowano na kolumnie z wymieniaczem anionowym (QIAex Purification Kit, Qiagen, Hilden).

Ponieważ do klonowania wstawki i wektora z wystającymi końcami 5' należy wytworzyć tępe końce, oba eluowane fragmenty AtRacB i pSUN-Nit zmieszano z 2 μl mieszaniny dNTP 1 (10 mM każdego dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Pharmacia, Freiburg) i 1,6 μl fragmentu Klenowa (USB/Amersham, Braunschweig, 2 jedn./il) w celu wypełnienia wystających końców i inkubowano przez 30 minut w temp. 37°C. W celu przeciwdziałania religacji wektory najpierw oczyszczano na kolumnach QIAquick Spin Column (Qiagen, Hilden), a następnie traktowano enzymem CIAP (Cielęcą Jelitową Fosfatazą Alkaliczną, GibcoBRL, Eggenstein, 1 U/μΟ i końcowo oczyszczano z 0,8% żelu agarozowego.

Do przygotowania następującej mieszaniny ligacyjnej o całkowitej objętości 50 μ!, do 10 μl ciętego DNA dodawano dodatkowo 34 pl H₂O, 5 μl buforu do ligacji i 1 μl ligazy T4 (Roche, Mannheim). Taką mieszaninę inkubowano przez noc w temp. 16°C. Ligazę następnie dezaktywowano przez 10 min w temp. 65°C. Następnie mieszaninę 1 igacyjną wytrącano przy pomocy 0,1 objętości octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości etanolu. Po wirowaniu (30 min., 15 000 g, 4°C) osad suszono w 70% etanolu i zawieszano w 10 μl H₂O. Do bakterii Escherichia coli, szczep DH5a transformowano 2 μl tego osadu przy użyciu elektroporacji (E. coli Pulser, Bio-Rad). Bakterie traktowane DNA wysiewano na podłoże LB z dodatkiem antybiotyku ampicyliny (50 mg/l). Po inkubacji przez 16 godzin w temp. 37°C pobierano kolonie bakterii i hodowano w probówkach zawierających 3 ml płynnej pożywki LB-Amp każda. Po inkubacji przez 16 godzin w temp. 37°C hodowle, które urosły do właściwej gęstości, wirowano. DNA plazmidowe izolowano z osadu bakteryjnego przy pomocy zestawu QIAprep DNA miniprep kit (Qiagen, Hilden) według instrukcji producenta i poddawano analizie restrykcyjnej z różnymi kombinacjami enzymów. Te trawienia kontrolne pozwalały na identyfikację konstruktów, w których gen AtRacB wklonowano w sensownej lub antysensownej orientacji za promotorem genu nitrylazy-1 (nit1) z A. thaliana, który jest konstytutywnie aktywny w roślinach (Nr w bazie GenBank Y07648.2, nukleotydy 2456-4340, Hillebrand i wsp. (1996) Gene 170:197-200). Konstrukty te nazwano pSUN3NIT_AtRacB_s (Sekw. Nr 73) i pSUN3NIT_atRacB_as (Sekw. Nr 74) i używano do transformacji roślin Arabidopsis. Konstrukty zawierały kompletną sekwencję AtRacB, w ten sposób, że wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_s,

PL 206 304 B1 który zawierał ten fragment w sensownej orientacji, był zdolny do ekspresji funkcjonalnego białka AtRacB. Wektor działa głównie jako negatywna kontrola i w większości przypadków obniża oporność na czynniki chorobotwórcze, ale w niektórych przypadkach (zob. poniżej) także podwyższa oporność na czynniki chorobotwórcze, prawdopodobnie przez efekt kosupresji.

P r z y k ł a d 11: Wytworzenie sensownych i antysensownych konstruktów z genem HvRacB służących do ekspresji w Arabidopsis thaliana

Różne niefunkcjonalne fragmenty genu HvRacB przygotowano do ekspresji w roślinach Arabidopsis. W tym celu plazmid, który zawiera gen HvRacB, wklonowany do wektora bakteryjnego pGEM-T, trawiono kombinacją enzymów BamHI/Hindlll (Roche, Mannheim). Wystające końce 5' jednoniciowe wypełniano przez traktowanie polimerazą Klenowa w obecności mieszaniny nukleotydów (zob. powyżej). Powstały fragment HvRacB z tępymi końcami wklonowano bezpośrednio do wektora pSUN3NIT, który trawiono enzymami Bglll i Spel (Roche, Mannheim) w miejscu do klonowania, a wystające końce 5' wypełniano przy pomocy polimerazy Klenowa (jak opisano powyżej). W mieszaninie ligacyjnej (każdej o całkowitej objętości 50 μθ do 10 μl przeciętego DNA dodatkowo dodawano 34 μl H₂O, 5 μl buforu do ligacji i 1 μl ligazy T4 (Roche, Mannheim). Mieszaninę inkubowano przez noc w temp. 16°C. Ligazę następnie dezaktywowano przez 10 min. w temp. 65°C. Następnie mieszaninę ligacyjną wytrącano 0,1 objętością octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętościami etanolu. Po wirowaniu (30 min, 15 000 g, 4°C) osad płukano 70% etanolem i zawieszano w 10 μl H₂O. Do bakterii Escherichia coli, szczep DH5a transformowano 2 μl tego osadu przy użyciu elektroporacji (E. coli Pulser, Bio-Rad). Bakterie transformowane DNA wysiewano na płytki LB z antybiotykiem ampicyliną (50 mg/l). Po inkubacji przez 16h w temp. 37°C, kolonie bakterii przenoszono do probówek zawierających 3 ml płynnej pożywki LB-Amp każda. Po inkubacji przez 16 godzin w temp. 37°C hodowle, które urosły do właściwej gęstości, wirowano. DNA plazmidowe izolowano z osadu bakteryjnego przy pomocy zestawu QIAprep DNA miniprep kit (Qiagen, Hilden) według instrukcji producenta i poddawano analizie restrykcyjnej z różnymi kombinacjami enzymów. Te trawienia kontrolne pozwalały na identyfikację konstruktów, w których właściwy gen wklonowano w sensownej lub antysensownej orientacji za promotorem genu nitrylazy-1 (nitl) z A. thaliana, który jest konstytutywnie aktywny w roślinach (zob. powyżej). Konstrukty te nazwano pSUN3NIT_HvRacB_s (Sekw. Nr 75) i pSUN3NIT_HvRacB_as (Sekw. Nr 76) i używano do transformacji roślin Arabidopsis. Konstrukty zawierały wycięty fragment hvRacB, w ten sposób, że nawet wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_s, który zawierał fragment w sensownej orientacji był zdolny do ekspresji funkcjonalnego białka HvRacB. Wektor działał głównie jako negatywna kontrola, ale prowadził w niektórych przypadkach (zob. poniżej) także do wzrostu oporności na czynniki chorobotwórcze, prawdopodobnie poprzez efekt kosupresji.

P r z y k ł a d 12: Transformacja Arabidopsis thaliana i analiza oporności na grzyby

Rośliny A. thaliana o niezmienionym genotypie (Columbia) posiadające szczep Agrabacterium tumefaciens (EHA105) w oparciu o zmodyfikowaną metodę (Steve Clough i Andrew Bent (1998) Plant J 16(6):735-743) próżniowej infiltracji Bechtold i wsp. (Bechtold N i wsp. (1993) CR Acad Sci Paris, Life Sciences 316:1194-1199).

Komórki A. tumefaciens transformowano wcześniej plazmidami pSUN3NIT_AtRacB_s (Sekw. Nr 73), pSUN3NIT_atRacB_as (Sekw. Nr 74), pSUN3NIT_HvRacB_s (Sekw. Nr 75) i pSUN3NIT_HvRacB_as (Sekw. Nr 76).

Nasiona pierwotnych transformantów transformowanych Agrobacterium selekcjonowano w oparciu o oporność na kanamycynę. Oporne na antybiotyk siewki sadzono do gleby, a do analizy biochemicznej używano całkowicie rozwinięte rośliny.

Do analizy oporności transgenicznych roślin Arabidopsis na grzybicze czynniki chorobotwórcze, rośliny szczepiono biotroficznymi grzybami Peronospora parasitica i Erysiphe cichoracearum.

a) Peronospora parasitica

Rośliny 5 do 8 tygodniowe spryskiwano zawiesiną konidiów (w przybliż. 10⁶ zarodników/ml). Szczepione rośliny trzymano przez noc w chłodni w przybliżeniu w temp. 16°C w warunkach ciemności i wilgotności, przykryte plastikową torebką. Po jednym dniu plastikową torebkę lekko uchylano, a później całkowicie usuwano. Sześć dni po szczepieniu rośliny ponownie przykrywano plastikową torebką na noc, w celu wyindukowania wytwarzania przetrwalników. Następnego dnia liście badano na obecność konidioforów. W następnych dniach wewnątrzkomórkowy wzrost grzyba prowadził do indukcji od słabej chlorozy aż do ciężkiej nekrozy liści. Objawy te liczono i poddawano analizie statystycznej.

PL 206 304 B1

b) Erysiphe cichoracearum

Pleśniowe grzyby biotroficzne hodowano na roślinach Arabidopsis. Do zainfekowania 4 tygodniowych transgenicznych roślin Arabidopsis z ekspresją RacB, konidiofory usuwano z powierzchni liści delikatną szczoteczką i nakładano na liście roślin transgenicznych. Rośliny inkubowano przez 7 dni w temp. 20°C. Konidiofory pojawiały się na liściach 7 dni po szczepieniu, a w następnych dniach obserwowano chlorozę i nekrozę. Objawy te liczono i poddawano analizie statystycznej.

c) Wyniki

Transgeniczne rośliny Arabidopsis, w których występowała ekspresja antysensownej sekwencji AtRacB lub HvRacB były znacząco bardziej oporne na Peronospora parasitica i na Erysiphe cichoracearum niż nietransgeniczne rośliny o niezmienionym genotypie.

Transgeniczne rośliny Arabidopsis, w których występowała ekspresja sensownej sekwencji kompletnego AtRacB były w większości przypadków znacząco bardziej wrażliwe na oba Peronospora parasitica i Erysiphe cichoracearum niż nietransgeniczne rośliny o niezmienionym genotypie. Niemniej jednak, w niektórych przypadkach obserwowano także wzrost oporności (prawdopodobnie spowodowany wpływem kosupresji).

Transgeniczne rośliny Arabidopsis, w których występowała ekspresja sensownej sekwencji fragmentu HvRacB były w niektórych przypadkach znacząco bardziej oporne na oba Peronospora parasitica i Erysiphe cichoracearum niż nietransgeniczne rośliny o niezmienionym genotypie.

PL 206 304 B1 <110> BASF Plant Science GmbH <120> Nowe sekwencje kwasów nukleinowych oraz ich zastosowanie w sposobach uzyskiwania oporności na czynniki chorobotwórcze u roślin <130> NAE 369/02 / NAE 761/01 AT <140>

<141>

<160> 76 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 857 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220>

<221> CDS <222> (90)..(680) <400> 1 atcttaacca gctccctacc tccccttctt cttcctcctc ctcccctgtc tcgcccgcag 60

cttcaccggc agcgagggaa agagggagg	atg Met 1	agc Ser	gcg Ala	tcc agg	ttc Phe	ata Ile	aag Lys	113
Ser	Arg 5
tgc gtc acc gtg ggg gac ggc gcc	gtc	ggc	aag	acc	tgc	atg	ctc	atc	161
Cys Val Thr Val Gly Asp Gly Ala	Val	Gly	Lys	Thr	Cys	Met	Leu	Ile
10 15				20
tcc tac acc tcc aac acc ttc ccc	acc	gac	tat	gtg	ccc	acg	gtg	ttt	209
Ser Tyr Thr Ser Asn Thr Phe Pro	Thr	Asp	Tyr	Val	Pro	Thr	Val	Phe
25 30			35					40
gac aac ttc agt gct aat gtt gtg	gtt	gat	ggc	aac	act	gtc	aac	ctt	257
Asp Asn Phe Ser Ala Asn Val Val	Val	Asp	Gly	Asn	Thr	Val	Asn	Leu
45		50					55
ggg eta tgg gat act gca ggt cag	gaa	gac	tac	aac	aga	ctg	aga	ccg	305
Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gin	Glu	Asp	Tyr	Asn	Arg	Leu	Arg	Pro
60	65					70
ctg agt tat cgt gga gct gat gtc	ttc	ctt	ctg	gcc	ttc	teg	ctt	atc	353
Leu Ser Tyr Arg Gly Ala Asp Val	Phe	Leu	Leu	Ala	Phe	Ser	Leu	Ile
75 80					85
agc aag gct agc tat gag aat gtt	tea	aag	aag	tgg	ata	cct	gaa	ctg	401
Ser Lys Ala Ser Tyr Glu Asn Val	Ser	Lys	Lys	Trp	ile	Pro	Glu	Leu
90 95				100
aag cat tat gca cca ggt gtg cct	att	atc	ctc	gtg	gga	aca	aag	ctt	449
Lys His Tyr Ala Pro Gly Val Pro	Ile	Ile	Leu	Val	Gly	Thr	Lys	Leu
105 110			115					120
gat ctt ega gat gac aag cag ttc	ttt	gtg	gac	cat	cct	ggt	gct	gtt	497
Asp Leu Arg Asp Asp Lys Gin Phe	Phe	Val	Asp	His	Pro	Gly	Ala	Val
125		130					135
cct atc act act gct cag ggg gag	gaa	eta	aaa	aag	tta	ata	ggc	gca	545
Pro Ile Thr Thr Ala Gin Gly Glu	Glu	Leu	Lys	Lys	Leu	Ile	Gly	Ala
140	145					150

PL 206 304 B1

ccc Pro

tac Tyr

tac Tyr 155

atc Ile

gaa Glu

tgc Cys

age Ser

teg Ser 160

aag acc

caa Gin

eta Leu

aat Asn 165

gtc Val

aag Lys

ggt Gly

593

Lys

Thr

gta

ttt

gat

gcg

gca

ata

aag

gtg

gta

ctg

cag

cca

cca

aag

gca

aag

641

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

170

175

180

aag

aag

aaa

aag

gcg

cag

agg

ggg

get

tgc

tcc

atc

ttg

tgatctaatc

690

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

185 190 195 aatcggtaga caaagaacaa gggcgaagtt gccgccatgc tatattattg ttacgtcttg 750 cttcagcgga gctgcactct catggtcgtn ctnccttccc tcacccccac cccaccctag 810 gttacccacc ggcagctgca acaaggtctc tttgtcgagg catcggg 857 <210> 2 <211> 197 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 2

Met 1

Ser Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

180

185

190

Ala Cys Ser Ile Leu 195

<210>	3
<211>	1113
<212>	DNA
<213>	Oryza	sativa
<220>
<221>	CDS
<222>	(158).	,. (748)

PL 206 304 B1 <400> 3 ccttgctttg gagagagaga cggcggcgtc ctcctccttc gagagagaga tgctgcgacc aaccttcttc gagagagaga gacggggagc tttcttggag tttcttgaga gagagagaga ggggggggag cggtcgcagg aggaggagga ggcgagg atg agc gcg tcc agg ttc Met Ser Ala Ser Arg Phe

120

175

ata Ile

aag Lys

tgc Cys

gtc Val 10

acc Thr

gtc ggg

gac Asp

ggc Gly 15

gee Ala

gtc Val

ggc Gly

aag Lys

acc Thr 20

tgc Cys

atg Met

223

Val

Gly

ctc

atc

tcc

tac

acc

tcc

aac

acc

ttc

ccc

act

gat

tat

gtt

ccg

acg

271

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

25

30

35

gtg

ttt

gac

aac

ttc

agt

gee

aac

gtc

gtg

gtt

gat

ggt

aac

acc

gtc

319

val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

40

45

50

aac

ctc

ggg

eta

tgg

gac

act

gca

ggt

cag

gag

gat

tac

aac

aga

ctg

367

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

55

60

65

70

aga

cca

ctg

agt

tat

cgt

gga

get

gat

gtt

ttc

ctt

ctg

gee

ttc

teg

415

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

75

80

85

eta

atc

agc

aag

gee

agc

tat

gag

aat

gtt

tea

aag

aag

tgg

ata

cct

463

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

90

95

100

gag

ctg

aag

cat

tat

gca

cct

ggt

gtt

cct

atc

atc

ctt

gtg

gga

aca

511

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Ile

Ile

Leu

val

Gly

Thr

105

110

115

aag

ctt

gat

ctt

ega

gat

gac

aag

cag

ttt

ttt

gtg

gac

cat

cct

ggt

559

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

120

125

130

get

gtt

cct

atc

acc

act

get

cag

gga

gag

gaa

eta

aga

aag

caa

ata

607

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

135

140

145

150

ggc

gee

cca

tac

tac

atc

gaa

tgc

agc

tea

aag

acc

caa

eta

aac

gtc

655

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

155

160

165

aag

ggc

gtt

ttc

gat

gcg

gca

ata

aag

gtg

gtg

ctg

cag

cca

ccc

aag

703

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

170

175

180

gcg

aag

aag

aag

aaa

aag

gcg

caa

agg

ggg

gcg

tgc

tcc

att

ttg

748

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

185

190

195

tgatctaatc	atcagtagac	gacgaagaag	aagaacgatg	aagttgccag	getttattat	808
tgttgcgtct	tgcttcagcg	aaacagcatt	catggtccgg	ggatcctagt	ttactggcag	868
ctgcagcaag	gcctctttgt	cgaggcaatg	agcgatccgt	ttgtttcatt	ttctcctttc	928
tgccttgtga	ttatctcgtg	tgactgacaa	gtcgtggcaa	ttaggtaact	ttcctagatg	988
gtatttcctg	tgtttgagaa	aaaaaattct	tgttatccct	gtttcataag	tagacatgat	1048
gtaatcgcac	teagtttatt	cttttccttc	ttatttcact	tcaatggaaa	attatgtttc	1108
ccttc						1113
<210> 4
<211> 197

PL 206 304 B1 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4

Met 1

Ser

Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195

<210> 5 <211> 1393 <212> DNA <213> Zea mays
<220> <221> CDS <222> (398)	..(988)
<400> 5 gtcgacccac	gcgtccgcgg	acgcgtgggc	ggacgcgtgg	gtccccaccc	accaccgcgc	60
cgggccacca	ccacccactc	taccctcccc	tccccaccac	cactagcacc	caccgtcccg	120
gcgcggagac	cgcttccctc	cctccgcctc	cgcaaccctc	tcccgcctcg	cccgcgcctc	180
cctccatttg	tccgcggctc	ccctccctcc	cgatcttaac	cacccgccac	ccggcttcct	240
ctcccccttc	ttcctccctc	aaaccagacg	ctcgcccccc	tttcctccac	gcctatcttc	300
ttcagacgac	cagcaggagg	tacgaggaag	accacctagg	aggcctctct	ctctctctcc	360
ccagccaccc	ccgtagcgag	agggagggcg	gaagagg atg agc gcg tcc agg ttc	415

Met Ser Ala Ser Arg Phe 1 5 ata aag tgc gtc acg gtc ggg gac ggc gcc gtc ggc aag acc tgc atg 463

Ile Lys Cys Val Thr Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys Thr Cys Met

15 20

PL 206 304 B1

ctc Leu

atc Ile

tcc Ser 25

tac acc tcc aac

acc Thr 30

ttc Phe

ccc Pro

acc Thr

gac Asp

tat Tyr 35

gtt Val

ccg Pro

aca Thr

511

Tyr

Thr

Ser

Asn

gtg

ttt

gat

aac

ttc

agt

gcc

aac

gtt

gtg

gtt

gat

ggt

aat

act

gtc

559

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

val

40

45

50

aac

ctc

ggc

ctc

tgg

gac

act

gca

ggt

caa

gag

gat

tac

aac

aga

ctg

607

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

55

60

65

70

aga

cca

ctg

agc

tat

cgt

gga

gct

gat

gtt

ttt

ctt

ctg

gct

ttc

tea

655

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

75

80

85

ctg

atc

agt

aag

gcc

agc

tat

gag

aat

gtt

teg

aag

aag

tgg

ata

cct

703

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

90

95

100

gaa

ctg

aag

cat

tat

gca

cct

ggt

gtg

cca

att

att

ctc

gta

ggg

aca

751

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

105

110

115

aag

ctt

gat

ctt

ega

gac

gac

aag

cag

ttc

ttt

gtg

gac

cat

cct

ggt

799

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

120

125

130

gct

gtc

cct

atc

act

act

gct

cag

gga

gag

gag

eta

aga

aag

caa

ata

847

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

135

140

145

150

ggc

gct

cca

tac

tac

atc

gaa

tgc

agc

teg

aag

acc

caa

eta

aac

gtg

895

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

val

155

160

165

aag

ggc

gtc

ttc

gat

gcg

gcg

ata

aag

gtt

gtg

ctg

cag

ccg

cct

aag

943

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

170

175

180

gcg

aag

aag

aag

aaa

aag

gtg

cag

agg

ggg

gcg

tgc

tcc

att

ttg

988

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

val

Gin

Arg

Gly

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

185

190

195

tgatctaatc atcggtagat gaagaaacaa gggcgaaggt gccatggctt tatcatcgtc 1048 gcgtcttgct tcagtggaac agcatgaatg gtccccaccc cctctaggtt tactggcggc 1108 tcggctgcag cgagttctca tctctttgtc gaggcattga gcgatatgtt tgtttcattt 1168 tcctccttcc tgccttgtga ttatctggtg tgtgtgtgtg tgtgactgac gaagtcgcgg 1228 cgattaggta actcgcttag aaggtatttc ccgtgtttga gcaaaagaaa gtatccctgt 1288 tatctctgtt ccataagtta gacatgatgt aatcgtacta agtttatttt tacttatttc 1348 acttgaatgg aaaagtatgc ttcccattta aaaaaaaaaa aaaaa 1393 <210> 6 <211> 197 <212> PRT <213> Zea mays <400> 6

Met 1

Ser

Ala Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

PL 206 304 B1

Val

Asp 50

Gly

Asn

Thr

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Ser

Lys

Lys

Trp 100

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys 105

His

Tyr

Ala

Pro

Gly 110

Val

Pro

Ile

Ile

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gin

Phe

Phe

val 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Val

Pro

Ile

Thr

Thr 140

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu 145

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile 150

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr 155

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser 160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn 165

Val

Lys

Gly

Val

Phe 170

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys 175

Val

Val

Leu

Gin

Pro 180

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys 185

Lys

Lys

Lys

Val

Gin 190

Arg

Gly

Ala Cys Ser Ile Leu 195 <210> 7 <211> 197 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

dominujące-negatywnego mutanta białka RacB z jęczmienia <220>

<221> SITE <222> (20) <223> Thr/Asn mutacja w dominującym negatywnym fenotypie <400> 7

Met 1

Ser

Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Asn 20

Cys

Met

Leu

Ile

Ser 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr 30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr 35

Val

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Val

val

Asp 50

Gly

Asn

Thr

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Ser

Lys

Lys

Trp 100

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys 105

His

Tyr

Ala

Pro

Gly 110

Val

Pro

Ile

Ile

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gin

Phe

Phe

Val 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Val

Pro

Ile

Thr

Thr 140

Ala

Gin

Gly

Glu

PL 206 304 B1

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195 <210> 8 <211> 197 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

dominujące-negatywnego mutanta białka RacB z ryżu <220>

<221> SITE <222> (20) <223> Thr/Asn mutacja w dominującym negatywnym fenotypie <400> 8

Met 1

Ser

Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys Val 10

Thr

Val

Gly Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Asn

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Arg

Gly

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195

<210> 9

<211> 197 <212> PRT

<213> Sztuczna

sekwencja

<220>

<221> SITE

PL 206 304 B1 <222> (20) <223> Thr/Asn mutacja w dominującym negatywnym fenotypie <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

dominujące-negatywnego mutanta białka RacB z kukurydzy <400> 9

Met 1

Ser Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys Val 10

Thr Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Asn

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Leu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Val

Gin

Arg

Gly

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195

<210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 10 ggatccgatg agcgcgtcca ggtt <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 11 gtcgaccttc gcccttgttc tttgtc <210> 12 <211> 26

PL 206 304 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwehcja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 12 gtgggcacat agtcggtggg gaaggt <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 13 cgactggagc acgaggacac tga <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 14 ggacactgac atggactgaa ggagta <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 15 gttcatcaag tgcgtcaccg tg <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 16 ttagcttcct cagttcttcc ctg <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 17 cgcgccgcag ccgagtacga c

PL 206 304 B1 <210> 18 <211> 21 ' <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 18 gtcacaaaaa cacatgtaac c <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 19 ggccgacatg cattcaccag <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 20 catctgatat tgctgggtct g <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 21 ccaagatgca gatcttcgtg a <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 22 ttcgcgatag gtaaaagagc a <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 23 gtaaaacgac ggccagtg

PL 206 304 B1 <210> 24 <211> 19 ' <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 24 ggaaacagct atgaccatg <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 25 gtggaggcgc ggcgaga <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 26 ccatgcttca tctccatagt ca <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 27 ggatcccgat tccatcagga aagcat <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 28 gtcgacgcga gacactgcaa aacaaa <210> 29 <211> 26 <212> DNA ' <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 29 ggatccttct cgtccattta gccggc

PL 206 304 B1 <210> 30 <211> 27 ' <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 30 gtcgactgat cacttgaagc atgccag <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 31 ggatccgatg agcgcgtcca ggtt <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> ’ <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 32 gtcgaccttc gcccttgttc tttgtc <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 33 accgtggggg acgtcgccgt cggcaagac <210> 34 <211> 721 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220>

<221> CDS <222> (38). . (673) <223> kodująca homolog RacB (Rop6) <400> 34 gtggaggcgc ggcgagagcg gcggaggcgg aggagag atg agc gtg acc aag ttc Met Ser Val Thr Lys Phe

5

atc

aag

tgc

gtc

acg

gtg

ggg

gac

ggc

gcc

gtc

ggc

aag

acc

tgc

atg

Ile

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

10

15

20

ctc

atc

tgc

tac

acc

agc

aac

agg

ttc

ccc

agt

gat

tac

atc

ccc

acg

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Arg

Phe

Pro

Ser

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

25

30

35

103

151

PL 206 304 B1

gtg Val

ttc Phe 40

gac Asp

aac Asn

ttc Phe

age Ser

gee Ala 45

aac Asn

gtc Val

tcc Ser

gtc Val

gac Asp 50

ggc Gly

aac Asn

atc Ile

gtc Val

199

aac

ctc

ggc

eta

tgg

gac

acc

gee

ggg

caa

gaa

gac

tac

age

cgg

ctg

247

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Ser

Arg

Leu

55

60

65

70

agg

ccg

ctg

age

tac

aga

ggc

gee

gac

gtg

ttc

gtg

ctc

gee

ttc

tcc

295

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

75

,80

85

ctc

atc

age

age

gee

age

tac

gag

aat

gtt

ctt

aag

aag

tgg

atg

cca

343

Leu

Ile

Ser

Ser

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Lys

Trp

Met

Pro

90

95

100

gag

ctc

ege

cgg

ttc

gcg

ccg

aat

gtc

ccc

att

gtt

ctt

gtt

ggg

acc

391

Glu

Leu

Arg

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

105

110

115

aag

eta

gat

ctg

cgt

gac

cac

aga

gee

tac

ctc

gee

gac

cac

ccc

ggt

439

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

His

Arg

Ala

Tyr

Leu

Ala

Asp

His

Pro

Gly

120

125

130

get

tea

gca

atc

aca

act

gca

cag

ggt

gaa

gaa

ctt

agg

aag

cag

atc

487

Ala

Ser

Ala

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

135

140

145

150

ggc

gee

gcg

get

tac

atc

gag

tgc

age

tcc

aag

aca

cag

cag

aac

gtc

535

Gly

Ala

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

155

160

165

aag

get

gtg

ttt

gac

acc

gee

ata

aag

gtg

gtc

ctc

cag

ccg

ccg

agg

583

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Thr

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Arg

170

175

180

aga

agg

gag

gtg

atg

tcc

gee

agg

aag

aaa

acc

agg

ega

age

tet

gga

631

Arg

Arg

Glu

Val

Met

Ser

Ala

Arg

Lys

Lys

Thr

Arg

Arg

Ser

Ser

Gly

185

190

195

tgc

tcc

atc

aag

cac

ttg

atc

tgc

ggg

agt

acg

tgc

get

get

673

Cys

Ser

Ile

Lys

His

Leu

Ile

Cys

Gly

Ser

Thr

Cys

Ala

Ala

200 205. 210 tgaattagca ccatggaggc ctggactgac tatggagatg aagcatgg 721 <210> 35 <211> 212 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 35

Met 1

Ser

Val

Thr

Lys 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Met

Leu

Ile

Cys 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Arg 30

Phe

Pro

Ser

Asp

Tyr 35

Ile

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Ser

Val

Asp 50

Gly

Asn

Ile

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Ser

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Val

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Ser 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Leu

Lys

Lys

Trp 100

Met

Pro

Glu

Leu

Arg 105

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn 110

Val

Pro

PL 206 304 B1

Ile

Val

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

His 125

Arg

Ala

Tyr

Leu

Ala 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Ser

Ala

Ile

Thr

Thr 140

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu 145

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile 150

Gly

Ala

Ala

Ala

Tyr 155

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser 160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn 165

Val

Lys

Ala

Val

Phe 170

Asp

Thr

Ala

Ile

Lys 175

Val

Val

Leu

Gin

Pro 180

Pro

Arg

Arg

Arg

Glu 185

Val

Met

Ser

Ala

Arg 190

Lys

Lys

Thr

Arg

Arg

Ser

Ser

Gly

Cys

Ser

Ile

Lys

His

Leu

Ile

Cys

Gly

Ser

195 200 205

Thr Cys Ala Ala 210 <210> 36 <211> 699 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220>

<221> CDS <222> (67) .. (657) <223> kodująca homolog RacB (RacD) <400> 36 ggatcccgat tcggcg atg Met tccatcagga aagcatatag actagcccag taaatagaaa agc gca tct cgg ttc atc aag tgc gtg acg gtg Ser Ala Ser Arg Phe Ile Lys Cys Val Thr Val

10 taagnaaaga 60 ggg gac 108 Gly Asp

ggc Gly 15

gcc Ala

gtg Val

gga Gly

aag Lys

aca Thr 20

tgc Cys

ctc Leu

ctc Leu

atc Ile

tea Ser 25

tac Tyr

aca Thr

tcc Ser

aac Asn

acc Thr 30

156

ttc

ccc

aca

gac

tat

gtc

cca

aca

gtt

ttc

gac

aac

ttc

agc

gct

aac

204

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr 35

Val

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

gtc

gtg

gtt

gac

ggc

agc

acc

gtc

aac

ctc

gga

tta

tgg

gat

act

gca

252

Val

Val

Val

Asp 50

Gly

Ser

Thr

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

gga

caa

gaa

gac

tat

aat

ega

eta

cgc

cca

eta

agc

tac

cgt

ggt

gcc

300

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

gat

gtc

ttc

ctg

ctc

gcc

ttt

tct

ctc

atc

agc

aaa

gca

agc

tac

gag

348

Asp

Val 80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

aat

gtc

act

aag

aag

tgg

att

cca

gag

tta

cgg

cac

tat

gct

cct

ggc

396

Asn 95

Val

Thr

Lys

Lys

Trp 100

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg 105

His

Tyr

Ala

Pro

Gly 110

gtg

ccc

ata

att

ctt

gtt

gga

aca

aag

ctt

gat

ctg

cgg

gat

gac

aag

444

Val

Pro

Ile

Ile

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

cag

ttt

ttt

gtg

gat

cac

cct

ggg

gcg

gtt

cct

att

tcc

act

gct

cag

492

Gin

Phe

Phe

Val 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Val

Pro

Ile

Ser

Thr 140

Ala

Gin

PL 206 304 B1

ggt Gly	gaa Glu	gag Glu 145	ctg Leu	aag aag gtg att	ggc gcg Gly Ala	act Thr	gcc tac atc gag tgc	540
Lys Lys Val	Ile 150	Ala Tyr 155	Ile	Glu Cys
agc	tca	aaa	aca	cag cag aac	atc	aag gcg	gtg	ttt gat	gcg	gcg atc	588
Ser	Ser	Lys	Thr	Gin Gin Asn	Ile	Lys Ala	Val	Phe Asp	Ala	Ala Ile
	160			165				170
aag	gtg	gtc	ctc	cag cct ccg	aag	cag aag	cgg	aag aag	agg	aag tca	636
Lys	Val	Val	Leu	Gin Pro Pro	Lys	Gin Lys	Arg	Lys Lys	Arg	Lys Ser
175				180			185			190
cag	aaa	gga	tgc	agc atc ttg	taaagctaaa atcccttttg ttttgcagtg	687
Gin	Lys	Gly	Cys	Ser Ile Leu

195 tctcgcgtcg ac 699 <210> 37 <211> 197 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 37

Met 1

Ser

Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr Val

Gly Asp Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Thr

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Ser

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Lys

Lys

Val

Ile

Gly

Ala

Thr

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Ile

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Arg

Lys

Lys

Arg

Lys

Ser

Gin

Lys

180

185

190

Gly

Cys

Ser

Ile

Leu

195

<210>	38
<211>	677
<212>	DNA
<213>	Hordeum vulgare
<220>
<221>	CDS

PL 206 304 B1 <222> (27). . (665) <223> kodująca homológ RacB (Rop4) <400> 38 ggatccttct cgtccattta gccggc atg gcg tcc agc gcc tcc cgg ttc atc 53 Met Ala Ser Ser Ala Ser Arg Phe Ile

5

aag Lys 10

tgc Cys

gtc Val

acc Thr

gtc Val

ggg Gly 15

gac ggc Asp Gly

gcc gtc Ala Val

ggc Gly 20

aag Lys

acc Thr

tgc Cys

atg Met

ctc Leu 25

101

atc

tgc

tac

acc

agc

aac

aag

ttc

CCC

acc

gac

tac

gtg

ccc

acc

gtg

149

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

'Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

30

35

40

ttc

gac

aat

ttc

agc

gcg

aac

gtg

gtg

gtg

gac

ggc

acc

acc

gtg

aac

197

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

45

50

55

ctg

ggc

ctc

tgg

gac

act

gca

ggg

cag

gag

gac

tac

aac

aga

ttg

aga

245

Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gin Glu Asp Tyr Asn Arg Leu Arg

65 70

ccg ctg Pro Leu

agc Ser

tac Tyr

cgg gga gcc gac gtc ttc gtg

ctc tcc

ttc teg

ctc Leu

293

Arg

Gly Ala 80

Asp

val

Phe

Val

Leu 85

Ser

Phe

Ser

75

gtc

agc

ega

gcc

agc

tac

gag

aat

gtc

atg

aag

aag

tgg

eta

ccg

gag

341

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Met

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

90

95

100

105

ctt

cag

cac

cat

gca

ccc

ggc

gtg

cca

aca

gtg

ctg

gtt

ggt

aca

aag

389

Leu

Gin

His

His

Ala

Pro

Gly

val

Pro

Thr

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

110

115

120

eta

gat

eta

cgt

gaa

gac

aag

caa

tac

tta

ctt

gac

cac

ccc

ggc

gtg

437

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

Gin

Tyr

Leu

Leu

Asp

His

Pro

Gly

Val

125

130

135

gtg

cct

gtt

act

aca

get

cag

ggg

gag

gaa

ctc

ege

aag

cac

atc

ggt

485

val

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

140

145

150

gca

act

tgt

tat

gtc

gaa

tgc

agc

tea

aag

aca

cag

cag

aat

gtc

aaa

533

Ala

Thr

Cys

Tyr

Val

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

155

160

165

get

gtg

ttt

gat

get

gcc

atc

aag

gta

gtg

atc

aaa

cct

cca

aca

aag

581

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Ile

Lys

Pro

Pro

Thr

Lys

170

175

180

185

cag

agg

gaa

agg

agg

aag

aag

aaa

gca

cgg

caa

gga

tgt

gca

tea

ttg

629

Gin

Arg

Glu

Arg

Arg

Lys

Lys

Lys

Ala

Arg

Gin

Gly

Cys

Ala

Ser

Leu

190

195

200

ggt

acc

ctg

tea

aga

agg

aag

ctg

gca

tgc

ttc

aag

tgatcagtcg ac

677

Gly

Thr

Leu

Ser

Arg

Arg

Lys

Leu

Ala

Cys

Phe

Lys

205 210 <210> 39 <211> 213 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 39

Met Ala 1

Ser

Ser Ala 5

Ser Arg

Phe

Ile Lys 10

Cys

Val Thr

Val Gly Asp 15

Gly Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn Lys

20

25

30

PL 206 304 B1

Phe

Pro

Thr 35

Asp Tyr Val

Pro Thr Val 40

Phe Asp Asn

Phe 45

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

Asn

Val

Met

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

Leu

Gin

His

His

Ala

Pro

Gly

100

105

110

Val

Pro

Thr

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

115

120

125

Gin

Tyr

Leu

Leu

Asp

His

Pro

Gly

Val

Val

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

130

135

140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

Ala

Thr

Cys

Tyr

Val

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Val

Val

Ile

Lys

Pro

Pro

Thr

Lys

Gin

Arg

Glu

Arg

Arg

Lys

Lys

180

185

190

Lys

Ala

Arg

Gin

Gly

Cys

Ala

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Arg

Arg

Lys

195

200

205

Leu

Ala

Cys

Phe

Lys

210 <210> 40 <211> 945 <212> DNA <213> Zea mays <220>

<221> CDS <222> (37)..(672) <223> kodująca homolog RacB (Rop6) <400> 40

gagaagaagg gggcctgccg gccggggctg ggagac	atg agc gtg	acc Thr	aag Lys 5	ttc Phe	54
Met 1	Ser Val
atc aag tgc gtc acg gtg ggc gac ggc gcg	gtg	ggc aag	acc	tgc	atg	102
Ile Lys Cys Val Thr Val Gly Asp Gly Ala	Val	Gly Lys	Thr	Cys	Met
10 15			20
ctc atc tgc tac acc agc aac aag ttc ccc	acg	gac tac	atc	ccc	acg	150
Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Asn Lys Phe Pro	Thr	Asp Tyr	Ile	Pro	Thr
25 30		35
gtg ttc gac aac ttc agc gcc aac gtc tcc	gtg	gac ggc	agc	atc	gtc	198
Val Phe Asp Asn Phe Ser Ala Asn Val Ser	Val	Asp Gly	Ser	Ile	Val
40 45		50
aac ctg ggc ctc tgg gac acc gcg ggg caa	gag	gac tac	agc	agg	ctg	246
Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gin	Glu	Asp Tyr	Ser	Arg	Leu
55 60	65				70
cgg ccg ctg agc tac agg ggc gcg gac gtg	ttc	gtg ctg	gcc	ttc	tcc	294
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Gly Ala Asp Val	Phe	Val Leu	Ala	Phe	Ser

80 85

PL 206 304 B1

ctg Leu

atc Ile

agc Ser

agg Arg 90

gcg Ala

agc 'Ser

tac gag

aac gtt

ctt Leu

aag Lys

aag Lys

tgg Trp 100

gtg Val

cca Pro

342

Tyr

Glu

Asn 95

Val

gag

ctt

ege

aga

ttc

gcg

ccc

aac

gtc

ccg

gtc

gtt

ctt

gtt

ggg

acc

390

Glu

Leu

Arg

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Val

Val

Leu

Val

Gly

Thr

105

110

115

aag

tta

gat

ctc

ege

gac

cac

aga

gee

tac

ctc

gee

gac

cat

cct

gga

438

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

His

Arg

Ala

Tyr

Leu

Ala

Asp

His

Pro

Gly

120

125

130

get

tea

gca

gtc

acc

acg

gcg

cag

ggt

gag

gaa

ctg

agg

aag

cag

atc

486

Ala

Ser

Ala

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

135

140

145

150

ggc

get

gcg

gee

tac

atc

gag

tgc

agt

tcc

aaa

acc

cag

cag

aac

gtc

534

Gly

Ala

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

155

160

165

aag

tet

gtc

ttc

gat

acg

gee

atc

aaa

gtg

gtc

ctt

cag

ccc

cca

cgg

582

Lys

Ser

Val

Phe

Asp

Thr

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Arg

170

175

180

agg

agg

gag

gca

gtg

cct

gee

agg

aag

aag

aac

agg

cgt

ggc

tcc

gga

630

Arg

Arg

Glu

Ala

Val

Pro

Ala

Arg

Lys

Lys

Asn

Arg

Arg

Gly

Ser

Gly

185

190

195

tgc

tet

ata

atg

aac'

ctt

gtg

tgt

ggc

agc

aca

tgt

get

get

672

Cys

Ser

Ile

Met

Asn

Leu

Val

Cys

Gly

Ser

Thr

Cys

Ala

Ala

200

205

210

tagggagtct atgtgctgtg ttccttggcc gcagtgttgt ataactaaga actagaacac gcaactggca catctgctgt gtaagaagtt tacgagtaag tgaaccggaa agttagtttg agttcgtcag tgctagacgc cttgagcgtg gggaggtgaa ctatagatga gctcttcaag tgtaactgta ttc ggcgtgattc ggatgactgc ggctgacttt atgttctccg atggtgtgta tgcttttgtt ttaccagact ctgatgtggt

732

792

852

912

945 <210> 41 <211> 212 <212> PRT <213> Zea mays <400> 41

Met 1

Ser

Val

Thr

Lys 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Met

Leu

Ile

Cys 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys 30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr 35

Ile

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Ser

Val

Asp 50

Gly

Ser

Ile

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Ser

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Val

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Arg 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Leu

Lys

Lys

Trp 100

Val

Pro

Glu

Leu

Arg 105

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn 110

Val

Pro

Val

Val

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

His 125

Arg

Ala

Tyr

Leu

Ala 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Ser

Ala

Val

Thr

Thr 140

Ala

Gin

Gly

Glu

PL 206 304 B1

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ser

val

Phe

Asp

Thr

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Arg

Arg

Arg

Glu

Ala

Val

Pro

Ala

Arg

Lys

Lys

180

185

190

Asn

Arg

Arg

Gly

Ser

Gly

Cys

Ser

Ile

Met

Asn

Leu

Val

Cys

Gly

Ser

195 200 205

Thr Cys Ala Ala 210 <210> 42 <211> 850 <212> DNA <213> Oryza sativa <220>

<221> CDS <222> (112) . . (702) <223> kodująca homolog RacB (RACDP / RACD) <400> 42 agcaagcagc agctgaggtg aggtccgtgg cgttggagtg aggactgagg aggaagaaga 60 gggcgggatc tagggtaccg gatgcgctgg ctgtgctgag tgagagtaga g atg agc 117 Met Ser

gcg Ala

tct Ser

cgg Arg 5

ttc Phe

atc Ile

aag Lys

tgc Cys

gtc Val 10

acc Thr

gtg Val

ggg Gly

gac Asp

ggc Gly 15

gcc Ala

gtg Val

ggc Gly

165

aag

acc

tgc

atg

ctc

atc

tcc

tac

acc

tcc

aac

acc

ttc

ccc

acg

gac

213

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

Thr

Asp

20

25

30

tat

gtt

cca

act

gtt

ttt

gat

aac

ttc

agt

gca

aat

gtt

gtg

gtc

gat

261

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

35

40

45

50

ggg

agc

act

gtg

aac

ttg

ggg

ttg

tgg

gat

aca

gca

gga

caa

gag

gac

309

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

55

60

65

tac

aat

agg

eta

cgc

ccg

ttg

agc

tat

cgt

ggc

gct

gat

gtt

ttc

ctg

357

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

Leu

70

75

80

ctg

gcc

ttt

tct

ctg

atc

agc

aaa

gca

agc

tat

gag

aat

gtt

tct

aaa

405

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Lys

85

90

95

aag

tgg

ata

cct

gaa

tta

agg

cat

tat

gct

cct

ggt

gtg

cca

ata

att

453

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Ile

Ile

100

105

110

ctc

gtt

gga

aca

aag

ctt

gat

ctg

cgg

gat

gat

aag

caa

ttt

ttc

gta

501

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

Phe

Val

115

120

125

130

gat

cac

cct

ggt

gct

gta

cct

att

tcc

act

gct

cag

ggc

gaa

gag

ctg

549

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Ser

Thr

Ala

Gin'

Gly

Glu

Glu

Leu

135

140

145

PL 206 304 B1

agg Arg

aaa Lys

ctc Leu

att Ile 150

ggt Gly

gca Ala

gcg Ala

gca Ala

tac Tyr 155

att Ile

gaa Glu

tgc Cys

agt Ser

tca Ser 160

aaa Lys

aca Thr

597

cag

caa

aac

atc

aag

gca

gtt

ttc

gat

gct

gcg

att

aag

gtg

gtt

ctc

645

Gin

Gin

Asn

Ile

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Leu

165

170

175

cag

cct

cca

aag

caa

aag

aag

aag

aag

aaa

aag

gcg

cag

aaa

gga

tgt

693

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Lys

Gly

Cys

180

185

190

gcc atc ttg taattaaatg gtagacagtg cagtgcagat cgatgtatcc 742

Ala Ile Leu

195 cttcatttgt agcctctggc ttcaatcgtc gcttgtttgt ataattacgc tagatgccac 802 cggcagaaga tataatatag tcctcctgcc tttgtggtgt tggtctct 850 <210> 43 <211> 197 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 43

Met 1

Ser Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr Val

Gly

Asp Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asp

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Val

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Ser

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Ile

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Ala

Gin

Lys

180

185

190

Gly Cys Ala Ile Leu 195

<210>	44
<211>	1169
<212>	DNA
<213>	Oryza
<220>
<221>	CDS

sativa

PL 206 304 B1 <222> (169)..(813) <223> kodująca homolog RacB (Rop 4) <400> 44 aacagttcag agaggaagca tgtgacactt ccctctgtcc ctctctctct ctctagcctc 60 caaccatcgc ttcaccaaga agccatcacc tcctcctctc tatcaagttc tctcccctct 120 cttgctgtct ctgcttgctg ctgctgctgc tcgattcggc cggcggcc atg gcg tcc 177

Met Ala Ser 1

agc gcg

tcg Ser

cgg Arg

ttc Phe

atc aag

tgc gtc Cys Val

acg Thr

gtc ggg

gac ggc

gcc Ala

gtc Val

225

Ser

Ala 5

Ile

Lys 10

Val

Gly 15

Asp

Gly

ggc

aag

acc

tgc

atg

ctc

atc

tgc

tac

acc

agc

aac

aag

ttc

ccc

act

273

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

Phe

Pro

Thr

20

25

30

35

gat

tac

gta

ccc

act

gtt

ttt

gac

aat

ttc

agt

gca

aac

gtg

gtg

gtc

321

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

40

45

50

gac

ggc

acc

acg

gtg

aat

ttg

ggt

ctc

tgg

gat

act

gca

ggg

cag

gaa

369

Asp

Gly

Thr

Thr

val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

55

60

65

gat

tac

aac

aga

ttg

agg

ccg

eta

agc

tac

cgt

ggc

gcc

gat

gtc

ttt

417

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

70

75

80

gtg

ctt

gcc

ttc

tcc

eta

gtg

agc

ega

get

agc

tat

gag

aat

gtc

atg

465

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

Met

85

90

95

aag

aag

tgg

tta

cca

gag

ctt

cag

cat

tat

gca

cca

ggg

gtg

cca

att

513

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Ile

100

105

110

115

gtg

ttg

gtt

ggg

acc

aaa

ttg

gat

ctt

cgt

gaa

gat

aaa

cac

tac

tta

561

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

His

Tyr

Leu

120

125

130

ctt

gac

cat

cct

agc

ttg

gtg

cct

gtg

act

aca

gca

cag

gga

gag

gaa

609

Leu

Asp

His

Pro

Ser

Leu

Val

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

135

140

145

ctc

cgc

aag

cac

att

ggc

gca

acg

tgt

tac

atc

gaa

tgc

agc

tea

aag

657

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

Ala

Thr

Cys

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

150

155

160

aca

cag

cag

aat

gta

aaa

get

gtg

ttt

gat

get

gcc

atc

aag

gta

gta

705

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

165

170

175

atc

aag

cct

cca

aca

aag

cag

agg

gac

agg

aag

aag

aag

aaa

aca

cgg

753

Ile

Lys

Pro

Pro

Thr

Lys

Gin

Arg

Asp

Arg

Lys

Lys

Lys

Lys

Thr

Arg

180

185

190

195

cgc

gga

tgt

tct

ttc

ttc

tgc

aag

ggt

gtc

atg

tcc

aga

aga

agg

eta

801

Arg

Gly

Cys

Ser

Phe

Phe

Cys

Lys

Gly

Val

Met

Ser

Arg

Arg

Arg

Leu

200

205

210

gta tgc ttc aag tgaacaagag gggttctttg atgagcagag cagaggtctg 853

Val Cys Phe Lys

215 tgagacaaaa tgatgtcttg tgtttgataa ttgctttatc tcaaaagttc cagtttgata 913 gttgcatttc caacctatat atatcctgtt tggcaattaa ctactacctc cgtcccaaaa 973 tataacaact tttggctatg aatctgaacg cacagttatc cagattcata gctaaaaata 1033

PL 206 304 B1 cttatatttt gggacggagg gagtactagt agtagattac tatcctgtcc atgtaatgta 1093 ttaggaaggt taatagcact ccctacatct cagaatggaa gttgttttgg ttttaaaaaa 1153 aaaaaaaaaa aaaaaa 1169 <210> 45 <211> 215 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 45

Met 1

Ala

Ser

Ser

Ala 5

Ser

Arg

Phe

Ile

Lys 10

Cys

Val

Thr

Val

Gly 15

Asp

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

20

25

30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

35

40

45

Val

Val

Val

Asp

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

Asn

Val

Met

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

100

105

110

Val

Pro

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

115

120

125

His

Tyr

Leu

Leu

Asp

His

Pro

Ser

Leu

Val

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

130

135

140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

Ala

Thr

Cys

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Val

Val

Ile

Lys

Pro

Pro

Thr

Lys

Gin

Arg

Asp

Arg

Lys

Lys

Lys

180

185

190

Lys

Thr

Arg

Arg

Gly

Cys

Ser

Phe

Phe

Cys

Lys

Gly

Val

Met

Ser

Arg

195

200

205

Arg

Arg

Leu

Val

Cys

Phe

Lys

210

215

<210> 46 <211> 1127 <212> DNA <213> Zea mays <220>

<221> CDS <222> (190) .. (831) <223> kodująca homolog RacB (RacA) <400> 46 gtcgacccac acgtactccg cctcgcctgc gcgtccgccc tccctcccct tcatccgccg agaagtcacg cccctcccct ctgcttccct caccaaacac ccccttcccc tctctgggct caccaccaaa tcgaggctcc cggagaaccg gaaggcgaga aggaccgtct gagagaagcg

120

180

PL 206 304 B1 cgcgcggcc atg gcg tcc agc gcc tct cgg ttc atc aag tgc gtc acg gtc 231 Met Ala Set Ser Ala Ser Arg Phe Ile Lys Cys Val Thr Val

1

5

10

ggc

gac

ggt

gcc

gtg

ggc

aag

aca

tgt

atg

ctc

atc

tgc

tac

acc

agc

279

Gly

Asp

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

15

20

25

30

aac

aag

ttc

ccc

act

gac

tac

ata

cct

acg

gtg

ttc

gac

aat

ttc

agt

327

Asn

Lys

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

35

40

45

gca

aat

gta

gtt

gtg

gat

ggc

acc

act

gtg

aat

ttg

ggc

ctt

tgg

gat

375

Ala

Asn

Val

Val

Val

Asp

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

50

55

60

acc

gct

ggg

cag

gaa

gat

tac

aac

ege

ctg

agg

cct

eta

agc

tac

ega

423

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

65

70

75

ggt

gca

gat

gtt

ttc

gtg

ctt

gca

ttc

tca

ctt

gtg

agc

ega

gct

agc

471

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

80

85

90

tat

gag

aat

atc

atg

aag

aag

tgg

ata

cca

gag

ctt

caa

cat

tat

gca

519

Tyr

Glu

Asn

Ile

Met

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Tyr

Ala

95

100

105

110

cct

ggg

gtg

ccc

gtt

gtt

ttg

gca

ggc

aca

aaa

ttg

gat

ctt

cgt

gaa

567

Pro

Gly

Val

Pro

Val

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

115

120

125

gac

aag

cac

tac

ttg

atg

gac

cat

cct

gga

ttg

gtg

cct

gtt

acc

act

615

Asp

Lys

His

Tyr

Leu

Met

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Thr

Thr

130

135

140

gca

cag

ggg

gag

gaa

ctt

cgt

aga

caa

att

ggt

gct

atg

tat

tac

att

663

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Arg

Gin

Ile

Gly

Ala

Met

Tyr

Tyr

Ile

145

150

155

gaa

tgc

agc

tca

aag

aca

cag

cag

aat

gtc

aaa

gct

gtg

ttc

gat

gct

711

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

160

165

170

gcc

atc

aag

gta

gta

atc

cag

cct

cca

act

aaa

ata

aga

gaa

aag

aag

759

Ala

Ile

Lys

Val

Val

Ile

Gin

Pro

Pro

Thr

Lys

Ile

Arg

Glu

Lys

Lys

175

180

185

190

aag

aaa

aaa

tca

ege

aaa

gga

tgt

tct

atg

atg

aac

atc

ttc

ggt

gga

807

Lys

Lys

Lys

Ser

Arg

Lys

Gly

Cys

Ser

Met

Met

Asn

Ile

Phe

Gly

Gly

195

200

205

aga

aaa

atg

eta

tgc

ttc

aag

tcc

tgaatggttc aagggggtct tacatggact

861

Arg

Lys

Met

Leu

Cys

Phe

Lys

Ser

210 gataccacga gtgtgacccc gagtttgcga agcttgaaat cttgatgtgc tcgttgcgca 921 tgtgtatatt tgcacctttg gttattaatg actagaggta ggtaattgaa actagtctgc 981 ttaagcgttc tgcactgctg gtgtggttag ctctatgagt taagcagttc gacagaggcc 1041 aaaccgacag tgagattttg ttctttcatg gaaatgtgcc aatgtcacag ctttttcgtg 1101 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1127 <210> 47 <211> 214 <212> PRT <213> Zea mays

PL 206 304 B1 <400> 47

Met 1

Ala

Ser

Ser

Ala Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys 10

Cys Val Thr

Val Gly Asp 15

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

20

25

30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

35

40

45

val

val

val

Asp

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

Asn

Ile

Met

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

100

105

110

Val

Pro

Val

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

115

120

125

His

Tyr

Leu

Met

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

130

135

140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Arg

Gin

Ile

Gly

Ala

Met

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Val

Val

Ile

Gin

Pro

Pro

Thr

Lys

Ile

Arg

Glu

Lys

Lys

Lys

Lys

180

185

190

Lys

Ser

Arg

Lys

Gly

Cys

Ser

Met

Met

Asn

Ile

Phe

Gly

Gly

Arg

Lys

195

200

205

Met

Leu

Cys

Phe

Lys

Ser

210

<210> 48 <211> 901 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220>

<221> misc_feature <222> (1) . .(901) <223> kodująca homolog RacB (RacA) <400> 48 cccgggctgc aggaattcgg cacgaggcaa gaagtcacgc accaaacacc accccccatc 60 accgccgctc cgctccccag tcccccaccc ctcctccgcc cccttcctcg agccgagctc 120 cgggggaagg aatcggagag gccggcgcgc ggcgagccat ggcgtccagc gcctcccggt 180 tcatcaagtg cgtcacggtg ggcgacggcg ccgtcggcaa gacctgcatg ctcatctgct 240 acaccagcaa caagttcccc accgactaca tacccacggt gttcgacaat ttcagcgcga 300 acgtggtggc ggacggcacc acggtgaatt tgggcctttg ggacaccgcc gggcaggagg 360 attacaaccg gctgaggcct ctaagctacc gcggcgccga cgttttcgtg cttgccttct 420 cccttgtgag ccgagctagc tatgagaata tcatgaagaa gtggataccg gagcttcagc 480 attacgcgcc cggcgtacct gttgtgctgg taggcacaaa actggatctt cgtgaagata 540 agcactattt gctggaccac cctgggatga tacccgttac cacagcacag ggggaggaac 600 ttcgtaagca agttggtgct ttatattaca tagagtgcag ctcaaagaca caacagaatg 660 tcaaagctgt gtttgatgct gctatcaagg tagtaatcca gccccocact aaacaaagag 720 aaaagaagaa aaagaaacag cgtcggggat gttctatgat gaacttcagc ggaaggaaat 780 gctatgcttc aaatcctgaa tgatgaaaga gaaggttcct tgcctngaac gattgtcacg 840

PL 206 304 B1 gttgcgctgc accaatttga caacacctcc aaaccggttg aatgtgctgg attgcaccgt 900 c 901 <210> 49 <211> 594 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(591) <223> kodująca homolog RacB <400> 49

atg Met 1

agc Ser

gct Ala

tcg Ser

agg Arg 5

ttc Phe

gta Val

aag Lys

tgc Cys

gtg Val 10

acg Thr

gtt Val

ggt Gly

gat Asp

gga Gly 15

gct Ala

48

gtc

gga

aaa

act

tgt

ttg

ttg

att

tct

tac

aca

agc

aac

act

ttc

cct

96

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

acg

gat

tat

gtg

cct

acc

gtt

ttc

gat

aat

ttc

agt

gcc

aat

gtt

gtg

144

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

gtt

aat

gga

agc

act

gtg

aat

ctt

gga

ttg

tgg

gac

act

gca

ggg

caa

192

Val

Asn

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

gag

gat

tac

aat

aga

tta

aga

cca

ctg

agt

tac

cgt

gga

gca

gat

gtt

240

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

ttc

att

ttg

gcc

ttc

tct

ctt

atc

agt

aaa

gcc

agt

tat

gaa

aac

gtc

288

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

tcc

aaa

aag

tgg

atc

ccg

gag

ttg

aaa

cat

tac

gcg

cct

ggt

gtc

ccc

336

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

atc

gtc

ctt

gtt

gga

aca

aag

ctt

gat

ctt

ega

gat

gat

aaa

cag

ttc

384

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

ttt

atc

gac

cat

cct

ggt

gct

gtt

ccg

att

act

act

gct

cag

gga

gag

432

Phe

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

gag

ctg

agg

aag

caa

ata

gga

gca

cct

act

tac

atc

gaa

tgc

agt

tcc

480

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

aaa

act

caa

gag

aat

gtg

aag

gcg

gtg

ttt

gac

gca

gcc

atc

ega

gtg

528

Lys

Thr

Gin

Glu

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

gtg

ttg

caa

ccg

cca

aag

cag

aag

aag

aag

aag

agc

aaa

gcg

cag

aag

576

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Ser

Lys

Ala

Gin

Lys

180

185

190

gca

tgc

tcc

att

eta

tga

594

Ala Cys Ser Ile Leu 195 <210> 50 <211> 197 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

PL 206 304 B1

<400> 50

Met

Ser

Ala

Ser

Arg

Phe

Val

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

1

5

10

15

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

val

Val

35

40

45

Val

Asn

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

val

65

70

75

80

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Glu

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Ser

Lys

Ala

Gin

Lys

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195 <210> 51 <211> 594 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1) . .(591) <223> kodująca homolog RacB <400> 51

atg

agc

get

teg

agg

ttc

ata

aag

tgt

gtc

acc

gtt

ggc

gac

gga

get

Met 1

Ser

Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

gtt

ggt

aaa

acc

tgt

ttg

ctg

att

tet

tac

acc

agc

aac

act

ttt

cct

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr 30

Phe

Pro

acg

gat

tat

gta

ccg

act

gtt

ttc

gat

aac

ttt

agc

gca

aat

gtg

gtt

Thr

Asp

Tyr 35

Val

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Val

gtt

aat

gga

gcc

act

gtg

aat

ctt

ggg

eta

tgg

gat

acc

gca

ggg

cag

Val Asn Gly Ala Thr Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gin

144

192

240

55 60

gag

gat

tat

aac aga

tta

aga

cct

ttg

agt

tac

ege

ggt

get

gat

gtt

Glu

Asp

Tyr

Asn Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

PL 206 304 B1

ttc Phe	atc Ile	tta Leu	gca Ala	ttc Phe 85	tet Ser	ctt Leu	atc Ile	agt Ser
tcc	aag	aag	tgg	atc	cca	gag	ctg	aag
Ser	Lys	Lys	Trp	Ile	Pro	Glu	Leu	Lys
			100					105
ata	gtt	ctt	gtt	gga	acc	aaa	eta	gat
Ile	Val	Leu	Val	Gly	Thr	Lys	Leu	Asp
		115					120
ttc	att	gac	cac	cct	ggc	get	gta	cca
Phe	Ile	Asp	His	Pro	Gly	Ala	Val	Pro
	130					135
gaa	ctg	aag	aaa	eta	att	gga	get	ccc
Glu	Leu	Lys	Lys	Leu	Ile	Gly	Ala	Pro
145					150
aaa	aca	caa	gag	aac	gtg	aaa	gga	gta
Lys	Thr	Gin	Glu	Asn	Val	Lys	Gly	Val
				165
gtt	ctt	caa	cct	cca	aag	cag	aag	aaa
Val	Leu	Gin	Pro	Pro	Lys	Gin	Lys	Lys
			180					185
gcc	tgc	tcc	att	ttg	taa
Ala	Cys	Ser	Ile	Leu
		195

aag Lys 90	get Ala	agt Ser	tat Tyr	gag Glu	aat Asn 95	gtc Val	288
cat	tat	gcc	cct	ggt	gtc	cct	336
His	Tyr	Ala	Pro	Gly 110	Val	Pro
ctt	cgg	gat	gac	aaa	cag	ttc	384
Leu	Arg	Asp	Asp 125	Lys	Gin	Phe
att	act	act	get	cag	gga	gag	432
Ile	Thr	Thr 140	Ala	Gin	Gly	Glu
gca	tac	atc	gag	tgc	agt	tea	480
Ala	Tyr 155	Ile	Glu	Cys	Ser	Ser 160
ttt	gat	gca	gcg	atc	ega	gtg	528
Phe 170	Asp	Ala	Ala	Ile	Arg 175	Val
aag	aaa	age	aaa	gca	caa	aaa	576
Lys	Lys	Ser	Lys	Ala 190	Gin	Lys

594 <210> 52 <211> 197 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 52

Met 1

Ser

Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr 30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr 35

Val

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Val

Val

Asn 50

Gly

Ala

Thr

val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

val

Ser

Lys

Lys

Trp 100

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys 105

His

Tyr

Ala

Pro

Gly 110

Val

Pro

ile

Val

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gin

Phe

Phe

Ile 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Val

Pro

Ile

Thr

Thr 140

Ala

Gin

Gly

Glu

Glu 145

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile 150

Gly

Ala

Pro

Ala

Tyr 155

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser 160

Lys

Thr

Gin

Glu

Asn 165

Val

Lys

Gly

Val

Phe 170

Asp

Ala

Ala

Ile

Arg 175

Val

Val

Leu

Gin

Pro 180

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys 185

Lys

Lys

Ser

Lys

Ala 190

Gin

Lys

PL 206 304 B1

Ala Cys Ser Ile Leu 195 <210> 53 <211> 594 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(591) <223> kodująca homolog RacB <400> 53

atg Met 1

agc Ser

gca Ala

tea Ser

agg Arg 5

ttc Phe

ata Ile

aag Lys

tgc Cys

gtc Val 10

acc Thr

gtt Val

ggt Gly

gat Asp

gga Gly 15

get Ala

48

gtt

ggt

aaa

acc

tgt

ttg

ctg

att

tet

tat

acc

agc

aac

acc

ttt

ccc

96

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

acg

gat

tat

gtt

ccg

act

gtt

ttc

gat

aac

ttt

agt

gca

aat

gtg

gtt

144

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

gtt

aat

gga

gcc

acg

gtg

aat

ctt

gga

ttg

tgg

gat

act

gca

ggg

caa

192

Val

Asn

Gly

Ala

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

gag

gac

tat

aac

aga

tta

aga

cct

ttg

agt

tac

cgt

ggt

get

gat

gtt

240

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

ttc

att

ctt

gcc

ttc

tet

ctc

att

agt

aag

get

agt

tat

gag

aat

gtt

288

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

tcc

aag

aag

tgg

att

cct

gag

ttg

aag

cac

tat

get

cct

ggt

gtc

cca

336

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

att

gtc

ctt

gtt

gga

acc

aaa

eta

gat

ctt

ega

gat

gac

aaa

cag

ttt

384

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

ttc

atc

gac

cat

cct

ggt

get

gtc

cct

att

acc

act

gtt

cag

gga

gag

432

Phe

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Val

Gin

Gly

Glu

130

135

140

gag

ctg

aag

aag

eta

att

gga

gcg

cca

get

tac

atc

gag

tgc

agt

tea

480

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

aaa

tea

caa

gag

aac

gtg

aag

ggc

gtg

ttt

gat

gca

gcg

atc

aga

gtg

528

Lys

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

gtc

ctt

caa

cct

cca

aag

cag

aag

aaa

aag

aag

aac

aaa

gca

caa

aag

576

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys

Ala

Gin

Lys

180

185

190

gcc tgc tcc atc ttg taa 594

Ala Cys Ser Ile Leu

195 <210> 54 <211> 197

PL 206 304 B1 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 54

Met 1

Ser

Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr Val

Gly Asp Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

Val

Asn

Gly

Ala

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Val

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys

Ala

Gin

Lys

180

185

190

Ala

Cys

Ser

Ile

Leu

195 <210> 55 <211> 591 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS

<222> (1)..

(588)

<223> kodująca homolog RacB

<400> 55

atg

agt

gct

tcg

agg

ttt

ata

aag

tgt

gtc

acc

gtc

ggc

gat

ggt

gcc

Met

Ser

Ala

Ser

Arg

Phe

Ile

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

1

5

10

15

gtc

gga

aaa

act

tgt

atg

ctg

att

tct

tac

aca

agc

aac

act

ttc

cct

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

acg

gac

tat

gtt

cca

act

gtt

ttc

gac

aac

ttc

agt

gct

aat

gtg

gtt

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

gta

gat

ggg

aac

acg

gtg

aat

ctt

gga

ttg

tgg

gat

aca

gct

ggt

caa

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

55 60

PL 206 304 B1

gaa Glu 65

gac Asp

tat Tyr

aac Asn

agg Arg

tta Leu 70

aga Arg

ccg Pro

ttg Leu

agt Ser

tac Tyr 75

cgt Arg

ggt Gly

gcc Ala

gat Asp

gtc Val 80

240

ttc

att

ctt

gca

ttc

tcg

ctt

att

agc

aaa

get

agc

tac

gag

aat

gta

288

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

gcc

aag

aag

tgg

att

cct

gag

ctt

agg

cat

tat

gcc

cct

ggt

gtt

cct

336

Ala

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

ata

atc

ctc

gtt

gga

acg

aaa

ctc

gat

Ctt

ega

gat

gac

aag

caa

ttc

384

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

ttc

ata

gac

cat

cct

ggt

gca

gtg

cct

att

act

aca

aac

cag

gga

gag

432

Phe

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Asn

Gin

Gly

Glu

130

135

140

gaa

eta

aag

aaa

ctg

ata

gga

tea

cca

atc

tac

att

gaa

tgt

agt

tea

480

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ser

Pro

Ile

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

aag

act

cag

cag

aat

gtg

aaa

gca

gtc

ttt

gac

gca

gcc

ata

aaa

gtg

528

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

gtg

ctt

cag

cca

ccg

aaa

cag

aag

aag

aag

aaa

aag

aac

aag

aac

cgc

576

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys

Asn

Arg

180

185

190

tgc gtg ttc ttg tga 591

Cys Val Phe Leu

195 <210> 56 <211> 196 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 56

Met 1

Ser

Ala

Ser

Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Met

Leu

Ile

Ser 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr 30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr 35

Val

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Val

Val

Asp 50

Gly

Asn

Thr

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Val 80

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Ala

Lys

Lys

Trp 100

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg 105

His

Tyr

Ala

Pro

Gly 110

Val

Pro

Ile

Ile

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gin

Phe

Phe

Ile 130

Asp

His

Pro

Gly

Ala 135

Val

Pro

Ile

Thr

Thr 140

Asn

Gin

Gly

Glu

Glu 145

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile 150

Gly

Ser

Pro

Ile

Tyr 155

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser 160

PL 206 304 B1

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn 165

Val

Lys

Ala

Val

Phe 170

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys 175

Val

Val

Leu

Gin

Pro 180

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys 185

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys 190

Asn

Arg

Cys Val Phe Leu 195 <210> 57 <211> 597 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1) . .(594) <223> kodująca homolog RacB <400> 57

atg Met 1

agt Ser

gct Ala

tea Ser

agg Arg 5

ttt Phe

atc Ile

aag Lys

tgt Cys

gtc Val 10

act Thr

gtc Val

ggc Gly

gac Asp

ggt Gly 15

gct Ala

48

gtt

gga

aag

act

tgt

ctt

ctc

atc

tcc

tac

act

agc

aac

act

ttc

ccc

96

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

acg

gat

tat

gtg

cca

act

gtg

ttc

gat

aat

ttc

agt

gcc

aat

gtg

att

144

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Ile

35

40

45

gtt

gat

ggc

aac

act

atc

aac

ttg

gga

ttg

tgg

gat

act

gca

ggg

caa

192

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Ile

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

gag

gac

tac

aat

aga

eta

aga

cct

ttg

agc

tat

cgc

ggt

gca

gat

gtc

240

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

ttc

tta

ctt

gca

ttc

tea

ctt

gtc

agc

aaa

gct

agc

tat

gaa

aat

gtt

288

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

val

85

90

95

tct

aaa

aag

tgg

gtt

cct

gaa

ctg

aga

cat

tat

gct

cct

ggt

gtt

ccc

336

Ser

Lys

Lys

Trp

Val

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

atc

atc

ctc

gtt

gga

aca

aag

ctt

gat

ctt

ega

gat

gat

aag

caa

ttc

384

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

ttt

gcc

gag

cac

cct

ggt

gct

gtg

cct

atc

tct

acc

gct

cag

ggt

gaa

432

Phe

Ala

Glu

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Ser

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

gaa

eta

aag

aag

ctg

att

ggg

gcg

cct

gct

tat

atc

gaa

tgc

agt

gca

480

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ala

145

150

155

160

aaa

act

caa

cag

aat

gtg

aaa

gca

gtg

ttt

gat

gcg

gct

atc

aag

gtc

528

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

gtt

ctc

cag

cca

cca

aaa

aac

aag

aag

aag

aag

aag

aga

aaa

tct

cag

576

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Asn

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Arg

Lys

Ser

Gin

180

185

190

PL 206 304 B1 aaa ggt tgt tct ata ctc tga 597

Lys Gly Cys Ser Ile Leu

195 <210> 58 <211> 198 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 58

Met 1

Ser Ala

Ser Arg 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr Val

Gly

Asp Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Leu

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Ile

35

40

45

Val

Asp

Gly

Asn

Thr

Ile

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Val

85

90

95

Ser

Lys

Lys

Trp

Val

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Phe

Ala

Glu

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Ser

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ala

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

165

170

175

Val

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Asn

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Arg

Lys

Ser

Gin

180

185

190

Lys

Gly

Cys

Ser

Ile

Leu

195 <210> 59 <211> 588 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS

<222> (1

) · ·

(585:

)

<223> kodująca homolog RacB

<400> 59

atg

gcg

tca

agg

ttt

ata

aag

tgt

gtg

acc

gtc

gga

gat

ggt

gcc

gtc

Met

Ala

Ser

Arg

Phe

Ile

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

Val

1

5

10

15

gga

aaa

act

tgc

atg

ctc

att

tct

tac

act

agc

aat

act

ttt

cct

act

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

Thr

20

25

30

gat

tat

gtg

cca

act

gtt

ttc

gac

aac

ttc

agt

gct

aat

gtg

gtt

gtt

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

Val

35

40

45

PL 206 304 B1

gat Asp

ggc Gly 50

aac Asn

act Thr

gtc Val

aat Asn

ctt Leu 55

gga Gly

ttg Leu

tgg Trp

gat Asp

act Thr 60

get Ala

ggt Gly

caa Gin

gag Glu

192

gac

tac

aac

agg

tta

ega

cct

ttg

agt

tac

cgt

ggt

get

gat

gtt

ttc

240

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

Phe

65

70

75

80

att

ctt

get

ttc

tet

ctt

att

agc

aag

get

agc

tat

gag

aat

ata

gcc

288

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Ile

Ala

85

90

95

aag

aag

tgg

att

cct

gag

ctc

agg

cat

tat

get

cct

ggt

gtt

ccc

att

336

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Ile

100

105

110

atc

ctt

gtt

ggg

aca

aaa

ctc

gat

ctt

ega

gat

gac

aag

caa

ttc

ttt

384

Ile

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

Phe

115

120

125

ata

gat

cat

cct

ggt

get

gtg

cca

att

act

aca

aac

cag

gga

gag

gaa

432

Ile

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Val

Pro

Ile

Thr

Thr

Asn

Gin

Gly

Glu

Glu

130

135

140

ctg

aag

aaa

ctg

att

gga

tet

get

gtc

tac

att

gaa

tgt

agt

tea

aag

480

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Gly

Ser

Ala

Val

Tyr

Ile

Glu

Cys

Ser

Ser

Lys

145

150

155

160

aca

cag

cag

aac

gtg

aag

gca

gtg

ttt

gat

gca

get

ata

aaa

gtg

gtg

528

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

165

170

175

ctt

cag

cca

cca

aag

cag

aag

aag

aag

aaa

aag

aat

aag

aac

cgt

tgc

576

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys

Asn

Arg

Cys

180

185

190

gcg ttc ttg tga 588

Ala Phe Leu

195 <210> 60 <211> 195 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 60

Met 1

Ala

Ser

Arg

Phe 5

Ile

Lys

Cys

Val

Thr 10

Val

Gly

Asp

Gly

Ala 15

Val

Gly

Lys

Thr

Cys 20

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr 25

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe 30

Pro

Thr

Asp

Tyr

Val 35

Pro

Thr

Val

Phe

Asp 40

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn 45

Val

Val

Val

Asp

Gly 50

Asn

Thr

Val

Asn

Leu 55

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr 60

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp 65

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg 70

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg 75

Gly

Ala

Asp

Val

Phe 80

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser 85

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala 90

Ser

Tyr

Glu

Asn

Ile 95

Ala

Lys

Lys

Trp

Ile 100

Pro

Glu

Leu

Arg

His 105

Tyr

Ala

Pro

Gly

Val 110

Pro

Ile

Ile

Leu

Val 115

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp 120

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys 125

Gin

Phe

Phe

Ile

Asp 130

His

Pro

Gly

Ala

Val 135

Pro

Ile

Thr

Thr

Asn 140

Gin

Gly

Glu

Glu

PL 206 304 B1

Leu 145

Lys

Lys

Leu

Ile ·

Gly 150

Ser

Ala

Val

Tyr

Ile 155

Glu Cys

Ser

Ser

Lys 160

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

Lys

Val

Val

165

170

175

Leu

Gin

Pro

Pro

Lys

Gin

Lys

Lys

Lys

Lys

Lys

Asn

Lys

Asn

Arg

Cys

180

185

190

Ala Phe Leu 195 <210> 61 <211> 606 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(603) <223> kodująca homolog RacB <400> 61

atg Met 1

agc Ser

aca Thr

gca Ala

aga Arg 5

ttc Phe

att Ile

aag Lys

tgt Cys

gtg Val 10

act Thr

gtc Val

gga Gly

gat Asp

gga Gly 15

gca Ala

48

gtg

gga

aag

act

tgt

atg

ctc

att

tea

tat

acc

agc

aat

acg

ttt

cct

96

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

acg

gat

tat

gtt

cca

aca

gtt

ttc

gac

aac

ttc

agc

gca

aat

gtg

gtg

144

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

gtc

gac

ggg

agt

acc

gtg

aac

ctt

ggc

ctg

tgg

gat

act

gcc

ggt

cag

192

Val

Asp

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

gaa

gat

tat

aat

agg

ctt

agg

cct

ttg

agt

tac

aga

gga

gca

gat

gtc

240

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

ttc

tta

tta

gca

ttt

tcc

ctt

ata

agc

aag

gcc

agt

tac

gag

aat

att

288

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Ile

85

90

95

cac

aaa

aag

tgg

ctt

ccg

gag

ctg

aaa

cat

tat

gct

cct

ggc

atc

ccc

336

His

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Ile

Pro

100

105

110

att

gtg

ctc

gtc

gga

aca

aaa

tta

gat

ttg

agg

gat

gac

aag

cag

ttc

384

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

ttg

aag

gat

cat

cca

gga

gca

gct

tct

ata

aca

act

gct

cag

gga

gaa

432

Leu

Lys

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

gaa

tta

agg

aaa

atg

att

gga

gct

gtt

agg

tac

tta

gag

tgc

agc

tcc

480

Glu

Leu

Arg

Lys

Met

Ile

Gly

Ala

Val

Arg

Tyr

Leu

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

aaa

acc

caa

cag

aat

gtg

aag

gca

gtg

ttt

gat

aca

gcg

ata

agg

gta

528

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Thr

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

PL 206 304 B1

gct Ala

ttg Leu

agg Arg

cca Pro 180

cca Pro

aag gca aag

aaa Lys 185

aag Lys

ata Ile

aaa Lys

cca ttg Pro Leu 190

aag Lys

act Thr

Lys Ala

Lys

aag

aga

tca

aga

ata

tgc

ttt

ttc

eta

taa

Lys

Arg

Ser

Arg

Ile

Cys

Phe

Phe

Leu

195 200 <210> 62 <211> 201 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

<400> 62

Met

Ser

Thr

Ala

Arg

Phe

Ile

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

1

5

10

15

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Pro

20

25

30

Thr

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

Val

Val

35

40

45

val

Asp

Gly

Ser

Thr

val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

Gly

Gin

50

55

60

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

Asp

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn

Ile

85

90

95

His

Lys

Lys

Trp

Leu

Pro

Glu

Leu

Lys

His

Tyr

Ala

Pro

Gly

Ile

Pro

100

105

110

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp

Lys

Gin

Phe

115

120

125

Leu

Lys

Asp

His

Pro

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Thr

Thr

Ala

Gin

Gly

Glu

130

135

140

Glu

Leu

Arg

Lys

Met

Ile

Gly

Ala

Val

Arg

Tyr

Leu

Glu

Cys

Ser

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Thr

Ala

Ile

Arg

Val

165

170

175

Ala

Leu

Arg

Pro

Pro

Lys

Ala

Lys

Lys

Lys

Ile

Lys

Pro

Leu

Lys

Thr

180

185

190

Lys

Arg

Ser

Arg

Ile

Cys

Phe

Phe

Leu

195 200 <210> 63 <211> 606 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(603) <223> kodująca homolog RacB <400> 63

atg	gct	teg	agt	gct	tca	aaa	ttc
Met 1	Ala	Ser	Ser	Ala 5	Ser	Lys	Phe
ggt	gcc	gtt	gga	aaa	act	tgt	atg
Gly	Ala	Val	Gly 20	Lys	Thr	Cys	Met

atc	aaa	tgt	gtg	act	gtt	gga	gat
Ile	Lys 10	Cys	Val	Thr	Val	Gly 15	Asp
ctc	atc	tgc	tac	act	agc	aac	aaa
Leu 25	Ile	Cys	Tyr	Thr	Ser 30	Asn	Lys

PL 206 304 B1

ttc Phe

cct Pro

act Thr 35

gac Asp

tac Tyr

ata Ile

cca Pro

aca Thr 40

gtt Val

ttt Phe

gac Asp

aac Asn

ttt Phe 45

agt Ser

gtt Val

aat Asn

144

gtt

gtg

gtt

gaa

ggc

atc

act

gtg

aac

tta

ggc

ctt

tgg

gac

act

gcc

192

Val

Val

Val

Glu

Gly

Ile

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

ggg

caa

gaa

gac

tat

aac

aga

eta

agg

cct

tta

agt

tac

aga

gga

gca

240

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

gat

gtt

ttt

gtg

ttg

gct

ttc

tca

ttg

atc

agc

ega

gct

agc

tat

gag

288

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

aat

gtg

ttt

aaa

aag

tgg

atc

cct

gaa

ctc

caa

cac

ttt

gca

cca

gga

336

Asn

Val

Phe

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Phe

Ala

Pro

Gly

100

105

110

gtc

ccc

att

gtg

ctt

gtt

ggt

acc

aaa

atg

gat

ctt

cgt

gaa

gat

aga

384

Val

Pro

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Met

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Arg

115

120

125

cat

tac

ttg

tct

gat

cat

cct

gga

ctg

tcc

ccg

gta

act

aca

tca

cag

432

His

Tyr

Leu

Ser

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Thr

Ser

Gin

130

135

140

gga

gag

gaa

ctc

cgc

aag

cat

atc

gga

gcg

act

tat

tac

att

gaa

tgt

480

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

agc

tca

aaa

act

caa

cag

aat

gtg

aaa

gcc

gta

ttt

gat

gct

gct

att

528

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

165

170

175

aaa

gta

gta

att

aaa

cca

gca

gtg

aaa

caa

aag

gag

aag

aag

aag

aag

576

Lys

Val

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Val

Lys

Gin

Lys

Glu

Lys

Lys

Lys

Lys

180

185

190

cag

aag

cct

cgc

agc

gga

tgt

ctc

teg

taa

606

Gin

Lys

Pro

Arg

Ser

Gly

Cys

Leu

Ser

195 200 <210> 64 <211> 201 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 64

Met 1

Ala

Ser

Ser

Ala 5

Ser

Lys

Phe

Ile

Lys 10

Cys

Val

Thr

Val

Gly 15

Asp

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

20

25

30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Val

Asn

35

40

45

val

Val

Val

Glu

Gly

Ile

Thr

val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

Asn

Val

Phe

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Phe

Ala

Pro

Gly

100

105

110

PL 206 304 B1

Val

Pro

Ile Val 115

Leu

Val

Gly Thr 120

Lys

Met

Asp

Leu

Arg 125

Glu

Asp

Arg

His

Tyr

Leu

Ser

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Thr

Ser

Gin

130

135

140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

His

Ile

Gly

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ala

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Val

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Val

Lys

Gin

Lys

Glu

Lys

Lys

Lys

Lys

180

185

190

Gin

Lys

Pro

Arg

Ser

Gly

Cys

Leu

Ser

195 200 <210> 65 <211> 648 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS

<222> (1) . .

(645)

<223> kodująca homolog RacB

<400> 65

atg

get

tea

agt

get

tea

aag

ttc

atc

aag

tgt

gtg

act

gtt

ggt

gat

48

Met

Ala

Ser

Ser

Ala

Ser

Lys

Phe

Ile

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

1

5

10

15

ggt

get

gtt

ggt

aaa

acc

tgt

atg

ctc

atc

tgc

tac

acc

age

aat

aaa

96

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

20

25

30

ttc

ccc

act

gac

tac

ata

cca

aca

gtt

ttt

gac

aac

ttt

agt

gca

aat

144

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

35

40

45

gtt

gtt

gtt

gaa

ggc

acc

act

gtc

aat

ttg

ggg

ctt

tgg

gac

act

get

192

Val

Val

Val

Glu

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

ggg

caa

gaa

gac

tat

aac

aga

tta

agg

cct

tta

agt

tac

agg

gga

gca

240

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

gat

gtt

ttc

gtc

ttg

tet

ttc

tea

tta

gtc

age

ega

get

age

tac

gag

288

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

aat

gtt

ttt

aaa

aag

tgg

atc

cct

gaa

ctc

caa

cac

ttt

get

cca

gga

336

Asn

Val

Phe

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Phe

Ala

Pro

Gly

100

105

110

gtt

ccc

ctt

gtc

ctt

gtt

ggt

acc

aaa

tta

gat

ctt

cgt

gaa

gat

aag

384

Val

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

115

120

125

cat

tat

ttg

get

gat

cat

cct

gga

eta

tcc

cct

gta

act

act

gca

cag

432

His

Tyr

Leu

Ala

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

130

135

140

gga

gag

gag

ttg

cgt

aag

eta

att

ggt

gcg

acg

tat

tac

att

gag

tgt

480

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

PL 206 304 B1

agt Ser

tea Ser

aaa Lys

act Thr

caa Gin 165

cag Gin

aat Asn

gtg Val

aaa Lys

gca Ala 170

gtt Val

ttt Phe

gat Asp

tet Ser

gcg Ala 175

ata Ile

aag

gaa

gtg

atc

aaa

cct

ctg

gtt

aaa

caa

aag

gag

aag

act

aag

aag

Lys

Glu

Val

Ile

Lys

Pro

Leu

Val

Lys

Gin

Lys

Glu

Lys

Thr

Lys

Lys

180

185

190

aag

aag

aag

caa

aag

teg

aat

cac

ggc

tgt

tta

tea

aat

gtt

ctg

tgt

Lys

Lys

Lys

Gin

Lys

Ser

Asn

His

Gly

Cys

Leu

Ser

Asn

Val

Leu

Cys

195

200

205

ggg

agg

ata

gtg

act

cgg

cat

tga

Gly

Arg

Ile

Val

Thr

Arg

His

210 215 <210> 66 <211> 215 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 66

Met 1

Ala

Ser

Ser

Ala 5

Ser

Lys

Phe

Ile

Lys 10

Cys

Val

Thr

Val

Gly 15

Asp

Gly

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

20

25

30

Phe

Pro

Thr

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Asn

35

40

45

Val

Val

Val

Glu

Gly

Thr

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Val

Leu

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ser

Tyr

Glu

85

90

95

Asn

Val

Phe

Lys

Lys

Trp

Ile

Pro

Glu

Leu

Gin

His

Phe

Ala

Pro

Gly

100

105

110

Val

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Leu

Asp

Leu

Arg

Glu

Asp

Lys

115

120

125

His

Tyr

Leu

Ala

Asp

His

Pro

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Thr

Ala

Gin

130

135

140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Leu

Ile

Gly

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Thr

Gin

Gin

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Ser

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Glu

Val

Ile

Lys

Pro

Leu

Val

Lys

Gin

Lys

Glu

Lys

Thr

Lys

Lys

180

185

190

Lys

Lys

Lys

Gin

Lys

Ser

Asn

His

Gly

Cys

Leu

Ser

Asn

Val

Leu

Cys

195

200

205

Gly

Arg

Ile

val

Thr

Arg

His

210

215

<210>	67
<211>	630
<212>	DNA
<213>	Arabidopsis thaliana
<220>
<221>	CDS

PL 206 304 B1 <222> (1)..(627) <223> kodująca homolog RacB <400> 67

atg Met 1

agt Ser

get Ala

tcg Ser

aag Lys 5

ttc Phe

ata Ile

aaa Lys

tgt Cys

gtt Val 10

act Thr

gtt Val

gga Gly

gat Asp

ggg Gly 15

get Ala

48

gtt

ggg

aag

aca

tgt

atg

ctt

atc

tgt

tac

act

agc

aac

aag

ttt

cct

96

Val

Gly

Lys

Thr 20

Cys

Met

Leu

Ile

Cys 25

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys 30

Phe

Pro

act

gat

tat

ata

ccg

act

gtg

ttc

gac

aat

ttc

agt

gcc

aat

gta

get

144

Thr

Asp

Tyr 35

Ile

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Ala

gtg

gat

gga

caa

atc

gtt

aat

tta

ggg

eta

tgg

gac

act

gcc

ggt

caa

192

Val

Asp 50

Gly

Gin

Ile

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

gaa

gat

tac

agt

agg

tta

aga

cca

ttg

agt

tat

aga

gga

get

gat

atc

240

Glu 65

Asp

Tyr

Ser

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Ile 80

ttc

gtc

tta

gcc

ttt

tcg

ctt

att

agc

aag

gcg

agt

tac

gaa

aat

gta

288

Phe

Val

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

ctc

aag

aag

tgg

atg

cct

gaa

ctt

cgt

cgg

ttt

gcg

cca

aat

gtt

ccc

336

Leu

Lys

Lys

Trp 100

Met

Pro

Glu

Leu

Arg 105

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn 110

Val

Pro

ata

gtt

ctt

gtt

ggt

aca

aag

eta

gat

ctc

cgg

gat

gac

aag

gga

tac

384

Ile

Val

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gly

Tyr

ctc

gcg

gat

cac

acc

aat

gtc

att

acc

tct

act

cag

gga

gag

gaa

ttg

432

Leu

Ala 130

Asp

His

Thr

Asn

Val 135

Ile

Thr

Ser

Thr

Gin 140

Gly

Glu

Glu

Leu

agg

aag

caa

att

ggt

gca

get

get

tat

att

gag

tgt

agt

tcc

aag

act

480

Arg 145

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala 150

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu 155

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr 160

caa

caa

aat

gtg

aaa

gca

gtg

ttt

gat

aca

gcg

atc

aag

gtg

gtt

ctt

528

Gin

Gin

Asn

Val

Lys 165

Ala

Val

Phe

Asp

Thr 170

Ala

Ile

Lys

Val

Val 175

Leu

cag

cct

cca

agg

agg

aaa

gag

gtc

ccg

agg

agg

agg

aag

aat

cat

aga

576

Gin

Pro

Pro

Arg 180

Arg

Lys

Glu

Val

Pro 185

Arg

Arg

Arg

Lys

Asn 190

His

Arg

aga

tcc

ggt

tgc

tcc

att

gcg

agt

att

gtc

tgt

gga

ggt

tgc

acc

get

624

Arg

Ser

Gly 195

Cys

Ser

Ile

Ala

Ser 200

Ile

Val

Cys

Gly

Gly 205

Cys

Thr

Ala

get taa 630

Ala <210> 68 <211> 209 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 68

Met 1

Ser

Ala

Ser

Lys 5

Phe

Ile

Lys

Cys

Val 10

Thr

Val

Gly

Asp

Gly 15

Ala

Val

Gly

Lys

Thr

Cys

Met

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Asn

Lys

Phe

Pro

20

25

30

PL 206 304 B1

Thr

Asp

Tyr 35

Ile

Pro

Thr

Val

Phe 40

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala 45

Asn

Val

Ala

Val

Asp 50

Gly

Gin

Ile

Val

Asn 55

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp 60

Thr

Ala

Gly

Gin

Glu 65

Asp

Tyr

Ser

Arg

Leu 70

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr 75

Arg

Gly

Ala

Asp

Ile 80

Phe

Val

Leu

Ala

Phe 85

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys 90

Ala

Ser

Tyr

Glu

Asn 95

Val

Leu

Lys

Lys

Trp 100

Met

Pro

Glu

Leu

Arg 105

Arg

Phe

Ala

Pro

Asn 110

Val

Pro

Ile

Val

Leu 115

Val

Gly

Thr

Lys

Leu 120

Asp

Leu

Arg

Asp

Asp 125

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ala 130

Asp

His

Thr

Asn

Val 135

Ile

Thr

Ser

Thr

Gin 140

Gly

Glu

Glu

Leu

Arg 145

Lys

Gin

Ile

Gly

Ala 150

Ala

Ala

Tyr

Ile

Glu 155

Cys

Ser

Ser

Lys

Thr 160

Gin

Gin

Asn

Val

Lys 165

Ala

Val

Phe

Asp

Thr 170

Ala

Ile

Lys

Val

Val 175

Leu

Gin

Pro

Pro

Arg 180

Arg

Lys

Glu

Val

Pro 185

Arg

Arg

Arg

Lys

Asn 190

His

Arg

Arg Ala

Ser

Gly 195

Cys

Ser

Ile

Ala

Ser 200

Ile

Val

Cys

Gly

Gly 205

Cys

Thr

Ala

<210> 69 <211> 600 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(597) <223> kodująca homolog RacB

<400> 69

atg Met 1

gct Ala

gca Ala

aca Thr

tea Ser 5

aca Thr

tea Ser

tea Ser

gca Ala

aca Thr 10

gct Ala

aca Thr

acg Thr

ttt Phe

ata Ile 15

aag Lys

48

tgt

gtc

act

gtt

ggc

gat

gga

gct

ctt

ttg

gtg

act

gtt

gag

atc

ttg

96

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Leu

val

Thr

Val

Glu

Ile

Leu

20

25

30

tta

tta

cag

gat

tat

gtt

cca

aca

gtg

ttc

gac

aat

ttc

aat

gct

aat

144

Leu

Leu

Gin

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Asn

Ala

Asn

35

40

45

gtt

tta

gtc

gat

ggt

aaa

act

gtc

aat

ctg

ggt

ctc

tgg

gat

act

gct

192

Val

Leu

Val

Asp

Gly

Lys

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

ggt

caa

gaa

gac

tac

aat

agg

gtt

aga

cca

ttg

agt

tac

aga

gga

gca

240

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Val

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

gat

gtt

ttc

att

ctt

gcc

ttc

tea

ctt

att

agc

agg

cct

agc

ttt

gag

288

Asp

Val

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Arg

Pro

Ser

Phe

Glu

85

90

95

PL 206 304 B1

aac

att

gct

aaa

aag

tgg

gta

ccc

gag

ctg

aga

cat

tat

gcc

ccg

act

Asn

Ile

Ala

Lvs

Lvs

Trn

val

Pro

Glu

T.G11

Arn

His

Tvr

A Ί jr

Pm

Thr

aac

att

gct

aaa

aag

tgg

gta

ccc

gag

ctg

aga

cat

tat

gcc

ccg

act

Asn

ile

Ala

Lys

Lys

Trp

Val

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Thr

100

105

110

gtg

cct

att

gtt

ctt

gtg

gga

acc

aaa

tca

gat

eta

aga

gac

aac

atg

Val

Pro

Ile

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Ser

Asp

Leu

Arg

Asp

Asn

Met

115

120

125

cag

ttc

cca

aag

aat

tat

cca

ggt

gct

tgc

aca

atc

ttc

cca

gaa

cag

Gin

Phe

Pro

Lys

Asn

Tyr

Pro

Gly

Ala

Cys

Thr

Ile

Phe

Pro

Glu

Gin

130

135

140

ggt

caa

gaa

eta

aga

aag

gaa

ata

gga

gca

tta

gca

tac

ata

gag

tgc

Gly

Gin

Glu

Leu

Arg

Lys

Glu

Ile

Gly

Ala

Leu

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

agc

tca

aaa

gca

caa

atg

aac

gta

aaa

gcc

gtg

ttt

gat

gaa

gcg

atc

Ser

Ser

Lys

Ala

Gin

Met

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

Ala

Ile

165

170

175

aaa

gta

gtt

tta

cat

cct

cct

tca

aag

act

aag

aag

ega

aag

aga

aag

Lys

Val

Val

Leu

His

Pro

Pro

Ser

Lys

Thr

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

180

185

190

atc

ggt

tta

tgc

cat

gtt

ctt

tga

Ile

Gly

Leu

Cys

His

Val

Leu

195 <210> 70 <211> 199 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 70

Met 1

Ala

Ala

Thr

Ser 5

Thr

Ser

Ser

Ala

Thr 10

Ala

Thr

Thr

Phe

Ile 15

Lys

Cys

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Thr

Val

Glu

Ile

Leu

20

25

30

Leu

Leu

Gin

Asp

Tyr

Val

Pro

Thr

Val

Phe

Asp

Asn

Phe

Asn

Ala

Asn

35

40

45

Val

Leu

Val

Asp

Gly

Lys

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Glu

Asp

Tyr

Asn

Arg

Val

Arg

Pro

Leu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ala

65

70

75

80

Asp

Val

Phe

Ile

Leu

Ala

Phe

Ser

Leu

Ile

Ser

Arg

Pro

Ser

Phe

Glu

85

90

95

Asn

Ile

Ala

Lys

Lys

Trp

Val

Pro

Glu

Leu

Arg

His

Tyr

Ala

Pro

Thr

100

105

110

Val

Pro

Ile

val

Leu

Val

Gly

Thr

Lys

Ser

Asp

Leu

Arg

Asp

Asn

Met

115

120

125

Gin

Phe

Pro

Lys

Asn

Tyr

Pro

Gly

Ala

Cys

Thr

Ile

Phe

Pro

Glu

Gin

130

135

140

Gly

Gin

Glu

Leu

Arg

Lys

Glu

Ile

Gly

Ala

Leu

Ala

Tyr

Ile

Glu

Cys

145

150

155

160

Ser

Ser

Lys

Ala

Gin

Met

Asn

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Val

Val

Leu

His

Pro

Pro

Ser

Lys

Thr

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

180

185

190

Ile

Gly

Leu

Cys

His

Val

Leu

195

PL 206 304 B1 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

starter oligonukleotydowy <400> 71 atgagcgcgt ccaggttcat a 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 72 atcaaacacg cccttcacgt t 21 <210> 73 <211> 10828 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NXT_AtRacB_s do ekspresji sensownego RNA RacB z A-thalianan <400> 73 ttccatggac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga 60 ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact 120 gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca 180 tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccca tcaagatctt 240 ggtgatgtag caagagctaa gttgtacttc gatycggttg gacattactc gagaccagat 300 gttttacact tgaccgtaaa tgagcacccg aagaaaccgg taacattcat ttcgaaggta 360 gagaaagcgg aagatgactc aaacaagtaa tcggttgtga ttcgtcagtt catgtcactc 420 ctatgaagga gtcaagttca aaatgttatg ttgagtttca aacttttatg ctaaactttt 480 tttcttaatt ttcgttaata atggaagaga accaattctc ttgtatctaa agattatcca 540 tctatcatcc aatttgagtg ttcaattctg gatgttgtgt taccctacat tctacaacca 600 tgtagccaat tattatgaat ctggctttga tttcagttgt gttcttttct ttttttcttt 660 gcatatttgc atttagaatg tttaataatt aagttactgt atttccacat acattagttc 720 caagaatata catatattaa tttatttttc ttaaaaatgt tttggaatga ctaatattga 780 caacgaaaat agaagctatg ctaaaccatt acgtatatgt gacttcacat gttgttgttt 840 tacattccct atatatatgg atggctgtca caatcagaaa cgtgatcgaa aaaagacaaa 900 cagtgtttgc ataaaaagac tatttcgttt cattgacaat ttgtgtttat ttgtaaagaa 960 aagtggcaaa gtggaatttg agttcctgca agtaagaaag atgaaataaa agacttgagt 1020 gtgtgttttt ttcttttatc tgaaagctgc aatgaaatat tcctaccaag cccgtttgat 1080 tattaattgg ggtttggttt tcttgatgcg aactaattgg ttatataaga aactatacaa 1140 tccatgttaa ttcaaaaatt ttgatttctc ttgtaggaat atgatttact atatgagact 1200 ttcttttcgc caataatagt aaatccaaag atatttgacc ggaccaaaac acattgatct 1260 attttttagt ttatttaatc cagtttctct gagataattc attaaggaaa acttagtatt 1320 aacccatcct aagattaaat aggagccaaa ctcacatttc aaatattaaa taacataaaa 1380 tggatttaaa aaatctatac gtcaaatttt atttatgaca tttcttattt aaatttatat 1440 ttaatgaaat acagctaaga caaaccaaaa aaaaaatact ttctaagtgg tccaaaacat 1500 caattccgtt caatattatt aggtagaatc gtacgaccaa aaaaggtagg ttaatacgaa 1560 attacaaaca tatctatata catagtatat attattacct attatgagga atcaaaatgc 1620 atcaaatatg gatttaagga atccataaaa gaataaattc tacggaaaaa aaaaaaagaa 1680

PL 206 304 B1 taaattcttt cgtttggatt tttcacttct ttatttttct aatcaatgca ggttcgatct aaaaaaagtc caaagactcg cgtcaccgtt cacctttccc tgattctgat ttccattgga tcaatggggc aattcataat tggtttatgc atgttttcat aggtcagttt ttcttttctt ccttgttgga atttatatat ctgctctggt tgtggttaaa cagagaatat accgtatcct gtgtatacct ttgattgtct catcctggtg aattttatca tgaagaagct acgaataaaa aaacaatgtg actggccgtc tgacaccgcg ttaaatgtat ttacatgtta aagaccggca gatcatccgg cttgggtccc gggagcggcg agcaatatca acagtcgatg gccatgggtc ttcggctggc ttccatccga agccggatca aggagcaagg ccttcccgct ccacgatagc gacaaaaaga gattgtctgt tgcgtgcaat gattgagagt gagcattttt gcaataatgg tggctccttc tcggcggggg cgccttcagt attgttttta gttaattcag taagttttta tattgtgtcc tttttatatt tctcaattat gagaaaagaa tcgttaccgt tatatattgc agtggatccc ggtgatggag acggntattc tgtgccatat acaggattat cacggtgaat ccttggtgag agggcaagag tcttgccttc cgtccgaact ttacagtgga accaaactag atgtctgatt ataatatata acttgtacat cattggtcaa ataacacacg ttataaaaga aaccttggtt ctgtccctat gctttaccac aattggagcg gacatctcat actataactg gttttacaac cgcgataatt aattgcggga attattacat acaggattca gtctgtggcg gctcagaaga ataccgtaaa cgggtagcca aatccagaaa acgacgagat gcgagcccct gtacgtgctc agcgtatgca tgagatgaca tcagtgacaa cgcgctgcct accgggcgcc tgtgcccagt ccatcttgtt gaatatgaga gacaagaaat tttctgacgt aacgttgcgg tcataacgtg ttaaactatc tgcatagatg tacattaaag atttgttttt aaatactttg cagacataaa tagtaggttt accacgtggg ctccaatagg ttctctcaag cggaattcgc ctgttggtaa atcaatcatt atgaattggg gttccgactg cttggattgt agagctttcc gactataaca tctctcatta ggtcgactat ttcctgagtt gttacttcct cccatgctta tcatgacatt gttcaagatg caggcttctt cctttaagca cacttgcaag gttgtcagat taccactgtt cgttaagcat ccagcttaca gaatcatctt cagaacgtga gactcagagc tatcctagtt ctctaatcat gcttaacgta atcttaagaa ggaactccac actcgtcaag gcacgaggaa acgctatgtc agcggccatt cctcgccgtc gatgctcttc gctcgatgcg gccgccgcat ggagatcctg cgtcgagcac cgtcctgcag cctgcgctga catagccgaa caatcatgcg ctctaattgg atttgctagc atgtgcttag ttctgtcagt actcccttaa agtgtttgac cactcgaaat acgtccgcaa tatttggtag taaaccaccg gcatcggctg gatgtgaact ctagtcccac aaaataaacg tctctgagtg ccttatgagc aacctgtttg ctccctcctt atccatacat ttttcgataa gggatactgc gtgatgaatc gattaagacc gtaaggctag ttaacaattg gaagcactat cctctcacat cactgccatt agtggacata tattcgttag cttgtatctt tcctccaatg atcttcagtc cttcgagatg caggtaagaa tttccctctc tcgagtgcag ttcggtgtta agggcgtgtt ttgacaggag tgcgcgctat aaaaacccat attcaacaga actttattgc gaaaatatcc aaggcgatag gcggtcagcc ctgatagcgg ttccaccatg gggcatgcgc gtccagatca atgtttcgct tgcatcagcc ccccggcact agctgcgcaa ttcattcagg cagccggaac tagcctctcc aaacgatcca ataccgaggg tgatagtgac ctcattaaac tccaaacgta ttctccgctc aggatcctgc cagccaattt tgtgttatta ttctccattt tgttttattt 1740 ttgtaattct taaacggggt 1800 gtttaatcaa tcaatagatt 1860 ttacaaaaaa aacaaaaaca 1920 cttgtttcat ttccaccaca 1980 tgaccacaaa aaaaaaacaa 2040 tcatgaacca aagtaaaaaa 2100 gcatcaaggt tcataaagtg 2160 ctgatttctt ataccagcaa 2220 tttttgatat ctgattcatt 2280 actaaaaatg ttgtatacat 2340 ctttagtgca aatgtggttg 2400 aggtaaatga atgatgatcc 2460 agaggtcgaa attatgtttt 2520 tttgagttac cgtggtgctg 2580 ttatgagaat gtttccaaga 2640 agagttccaa attttgatgc 2700 gctcctggtg tcccaattgt 2760 ttgtccttgt ttatgcattt 2820 ttccttttca ctttattaag 2880 aaacttcacc ttctcttgat 2940 gtgaaactga gggtagtttt 3000 gcacttcttg tgataaagca 3060 aaatagctac tgtatagcaa 3120 aactcatgat cctggccttt 3180 acaaacagtt tttcatcgac 3240 tacagttatt tcctcagtgc 3300 tgcatggaag ggagaggagc 3360 ttcaaaatca caagaggtaa 3420 gattcttctt tttttgatga 3480 tgataagggc gaattaattc 3540 gcccgatcta gtaacataga 3600 attttgtttt ctatcgcgta 3660 ctcataaata acgtcatgca 3720 aattatatga taatcatcgc 3780 caaatgtttg aacgatcggg 3840 gaacgcagca agatctagag 3900 aaggcgatgc gctgcgaatc 3960 cattcgccgc caagctcttc 4020 tccgccacac ccagccggcc 4080 atattcggca agcaggcatc 4140 gccttgagcc tggcgaacag 4200 tcctgatcga caagaccggc 4260 tggtggtcga atgggcaggt 4320 atgatggata ctttctcggc 4380 tcgcccaata gcagccagtc 4440 ggaacgcccg tcgtggccag 4500 gcaccggaca ggtcggtctt 4560 acggcggcat cagagcagcc 4620 acccaagcgg ccggagaacc 4680 gatccggtgc agattatttg 4740 gaatttatgg aacgtcagtg 4800 cttaggcgac ttttgaacgc 4860 tccagaaacc cgcggctgag 4920 aaacggcttg tcccgcgtca 4980 atgatcagat tgtcgtttcc 5040 ttggtaataa ttgtcattag 5100 tagacaagta tcaaacggat 5160 agttgtctaa gcgtcaattt 5220

PL 206 304 B1 gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag cacaaaatca ccacgcgtta ccaccacgcc ggccggccgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct atctgaatac aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa ccgaggaatc ggcgtgagcg gtcgcaaacc atccggcccg gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag ctccccgacc atggtgttga acccggagcg ctcaccccgg aaagaggcgg agcgaggaag accgaggccg cgcaccagga tcgcggccgg tcctggccgg aaaccgągcg cggtcgctgc ggttatcgct agcccgcgcc cagtgcccgc ccgcccgacg cggagcgccc gattccggtg taagcagcgc gatcaaaggc cattcttgag aaccgttctt tgaaattaaa aacacgctaa ctggcagaca aagctgaaga atcgcgcagc taaaggaggc gtgtggagga tggcactgga gtacaaatcg gcccagcggc gatcgaatcc ccgcccaagg cgcgatagtc gctggcgagg gccggcatgg gaatccatga cacgttgcgg ctggtagaaa gccaagaacg atcgtaaaga taccgcgaga ttgatcgatc gcagaagcca aagaagttct ttgaaggagg gagggcgaag gcaggggaaa aagccgtaca cggtcacaca tctttaaaac cgcacagccg gccgcttcgc ggcaatctac caaggcaccc cccggagacg cgcgtcagcg cggagtgtat ggcagctcgg 5280 ccgtgttcgc 5340 ggcgcgaggc 5400 cacagatcgc 5460 ctgcactgct 5520 tgacgcccac 5580 acgccctggc 5640 cggccaggac 5700 gtacgtgttc 5760 tttgtctgat 5820 ccgccgtcta 5880 gtatatgatg 5940 gtacttaacc 6000 ctgcaactcg 6060 gattgggcgg 6120 attgaccgcg 6180 caggcggcgg 6240 cagccaagcc 6300 attgaggtca 6360 acgcgcatcg 6420 tcccgtatca 6480 gaatcagaac 6540 tcaaaactca 6600 gtgccggccg 6660 cgccagccat 6720 tgtacgcggt 6780 taccagagtą 6840 ggcatggaaa 6900 acgggcggtt 6960 acccccaagc 7020 gcgcggcgct 7080 aacgcatcga 7140 gcaaagaatc 7200 gcgacgagca 7260 gcagcatcat 7320 tgatccgcta 7380 ccagtgtgtg 7440 accgataccg 7500 acgtactcaa 7560 cctgcattcg 7620 gccgcctggt 7680 gcgaaaccgg 7740 tcacagaagg 7800 ccggcatcgg 7860 gatggttgtt 7920 gtttcaccgt 7980 aggcggggca 8040 catccgccgg 8100 aaggtcgaaa 8160 ttgggaaccg 8220 tgtaagtgac 8280 ttattaaaac 8340 aagagctgca 8400 gtcggcctat 8460 cagggcgcgg 8520 tgcctcgcgc 8580 gtcacagctt 8640 ggtgttggcg 8700 actggcttaa 8760

PL 206 304 B1 ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 8820 cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 8880 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 8940 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 9000 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 9060 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 9120 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 9180 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 9240 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 9300 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 9360 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 9420 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 9480 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 9540 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 9600 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 9660 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat ctcccaattt 9720 gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct gatagtttgg 9780 ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt taagccgcgc cgcgaagcgg 9840 cgtcggcttg aacgaatttc tagctagaca ttatttgccg actaccttgg tgatctcgcc 9900 tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc gatcttcttc 9960 ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg 10020 ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta 10080 ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga 10140 gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc 10200 aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag 10260 caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt 10320 gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc 10380 gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc 10440 cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacggt 10500 caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc 10560 gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc 10620 tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac cgcttccccc atgatgttta actttgtttt 10680 agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt gctgctccat aacatcaaac atcgacccac 10740 ggcgtaacgc gcttgctgct tggatgcccg aggcatagac tgtaccccaa aaaaacagtc 10800 ataacaagcc atgaaaaccg ccactgcg 10828 <210> 74 <211> 10828 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_AtRacB_as do ekspresji antysensownego RNA RacB z A-thalianan <400> 74 ttccatggac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga 60 ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact 120 gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca 180 tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccca tcaagatctt 240 ggtgatgtag caagagctaa gttgtacttc gatycggttg gacattactc gagaccagat 300 gttttacact tgaccgtaaa tgagcacccg aagaaaccgg taacattcat ttcgaaggta 360 gagaaagcgg aagatgactc aaacaagtaa tcggttgtga ttcgtcagtt catgtcactc 420 ctatgaagga gtcaagttca aaatgttatg ttgagtttca aacttttatg ctaaactttt 480 tttcttaatt ttcgttaata atggaagaga accaattctc ttgtatctaa agattatcca 540 tctatcatcc aatttgagtg ttcaattctg gatgttgtgt taccctacat tctacaacca 600 tgtagccaat tattatgaat ctggctttga tttcagttgt gttcttttct ttttttcttt 660 gcatatttgc atttagaatg tttaataatt aagttactgt atttccacat acattagttc 720 caagaatata catatattaa tttatttttc ttaaaaatgt tttggaatga ctaatattga 780 caacgaaaat agaagctatg ctaaaccatt acgtatatgt gacttcacat gttgttgttt 840

PL 206 304 B1 tacattccct cagtgtttgc aagtggcaaa gtgtgttttt tattaattgg tccatgttaa ttcttttcgc attttttagt aacccatcct tggatttaaa ttaatgaaat caattccgtt attacaaaca atcaaatatg taaattcttt cgtttggatt tttcacttct ttatttttct aatcaatgca ggttcgatct aaaaaaagtc caaagactcg gttatagtca gagatgtctt ctccaattag ggtaaagctg agggacagca ccaaggttag ttttataaag tgtgttatag gaccaatgat gtacaagttt tatattatac tcagacatat agtttggttc cactgtaaaa ttcggacgaa aggcaagaat cttgccctgc caccaaggat tcaccgtggc aatcctgttc atggcacaat atanccgtgg ccatcaccaa actggccgtc tgacaccgcg ttaaatgtat ttacatgtta aagaccggca gatcatccgg cttgggtccc gggagcggcg agcaatatca acagtcgatg gccatgggtc ttcggctggc ttccatccga agccggatca atatatatgg ataaaaagac gtggaatttg ttcttttatc ggtttggttt ttcaaaaatt caataatagt ttatttaatc aagattaaat aaatctatac acagctaaga caatattatt tatctatata gatttaagga taagttttta tattgtgtcc tttttatatt tctcaattat gagaaaagaa tcgttaccgt tatatattgc agtggatccc cattgttttc ttattcgttt cttcttcagc ataaaattgc ccaggatggt acaatcaaaa gtatacactt gatacggttg attctctgaa taaccacaat cagagcagct atataaataa caacaaggac gaaaagaagc actgaccttc gaaaacatca ataaaccaaa tatgaattgg cccattgaca caatggaaat cagaatcaaa gaaaggtgtt cggtgacgca gttttacaac cgcgataatt aattgcggga attattacat acaggattca gtctgtggcg gctcagaaga ataccgtaaa cgggtagcca aatccagaaa acgacgagat gcgagcccct gtacgtgctc agcgtatgca atggctgtca tatttcgttt agttcctgca tgaaagctgc tcttgatgcg ttgatttctc aaatccaaag cagtttctct aggagccaaa gtcaaatttt caaaccaaaa aggtagaatc catagtatat atccataaaa atttgttttt aaatactttg cagacataaa tagtaggttt accacgtggg ctccaatagg ttctctcaag cggaattcgc atcaaaaaaa acctcttgtg tcctctccct actgaggaaa cgatgaaaaa aggccaggat gctatacagt ctttatcaca aactaccctc caagagaagg taataaagtg atgcataaac aattgggaca atcaaaattt ttggaaacat gcaccacggt aacataattt atcatcattc accacatttg gtatacaaca tgaatcagat gctggtataa ctttatgaac gactcagagc tatcctagtt ctctaatcat gcttaacgta atcttaagaa ggaactccac actcgtcaag gcacgaggaa acgctatgtc agcggccatt cctcgccgtc gatgctcttc gctcgatgcg gccgccgcat caatcagaaa cattgacaat agtaagaaag aatgaaatat aactaattgg ttgtaggaat atatttgacc gagataattc ctcacatttc atttatgaca aaaaaatact gtacgaccaa attattacct gaataaattc tatttggtag taaaccaccg gcatcggctg gatgtgaact ctagtcccac aaaataaacg tctctgagtg ccttatcaaa gaagaatcta attttgaact tccatgcaga taactgtatt ctgtttgtca catgagttga agctatttca agaagtgcaa agtttcacct tgaagtttta aaaaggaaaa aaggacaaat ccaggagcat ggaactctca tctcataact aactcaaagg cgacctctga atttacctgc cactaaagtt tttttagtat atcaaaaaaa gaaatcagca cttgatgcgc ttgacaggag tgcgcgctat aaaaacccat attcaacaga actttattgc gaaaatatcc aaggcgatag gcggtcagcc ctgatagcgg ttccaccatg gggcatgcgc gtccagatca atgtttcgct tgcatcagcc cgtgatcgaa aaaagacaaa 900 ttgtgtttat ttgtaaagaa 960 atgaaataaa agacttgagt 1020 tcctaccaag cccgtttgat 1080 ttatataaga aactatacaa 1140 atgatttact atatgagact 1200 ggaccaaaac acattgatct 1260 attaaggaaa acttagtatt 1320 aaatattaaa taacataaaa 1380 tttcttattt aaatttatat 1440 ttctaagtgg tccaaaacat 1500 aaaaggtagg ttaatacgaa 1560 attatgagga atcaaaatgc 1620 tacggaaaaa aaaaaaagaa 1680 ttctccattt tgttttattt 1740 ttgtaattct taaacggggt 1800 gtttaatcaa tcaatagatt 1860 ttacaaaaaa aacaaaaaca 1920 cttgtttcat ttccaccaca 1980 tgaccacaaa aaaaaaacaa 2040 tcatgaacca aagtaaaaaa 2100 cacgcccttc acgttctgca 2160 acaccgaaaa gatgattcat 2220 gcactcgatg taagctggcg 2280 gagggaaaat gcttaacggt 2340 cttacctgaa cagtggtaat 2400 tctcgaagat ctgacaacaa 2460 ctgaagatct tgcaagtgtc 2520 ttggaggatg cttaaaggcg 2580 gatacaagaa gaagcctgtt 2640 aacgaataca tcttgaacat 2700 tgtccactaa tgtcatgata 2760 tggcagtgta agcatgggaa 2820 gtgagaggag gaagtaacct 2880 agtgcttcaa ctcaggaatc 2940 attgttaaat agtcgaccag 3000 agccttacta atgagagaga 3060 tcttaatctg ttatagtcct 3120 ttcatcacgg aaagctctct 3180 agtatcccac aatccaagat 3240 atcgaaaaca gtcggaacat 3300 gtatggatcc caattcatat 3360 ggagggagaa tgattgatga 3420 aacaggtttt accaacagct 3480 tcataagggc gaattaattc 3540 gcccgatcta gtaacataga 3600 attttgtttt ctatcgcgta 3660 ctcataaata acgtcatgca 3720 aattatatga taatcatcgc 3780 caaatgtttg aacgatcggg 3840 gaacgcagca agatctagag 3900 aaggcgatgc gctgcgaatc 3960 cattcgccgc caagctcttc 4020 tccgccacac ccagccggcc 4080 atattcggca agcaggcatc 4140 gccttgagcc tggcgaacag 4200 tcctgatcga caagaccggc 4260 tggtggtcga atgggcaggt 4320 atgatggata ctttctcggc 4380

100

PL 206 304 B1 aggagcaagg ccttcccgct ccacgatagc gacaaaaaga gattgtctgt tgcgtgcaat gattgagagt gagcattttt gcaataatgg tggctccttc tcggcggggg cgccttcagt attgttttta gttaattcag gtttacacca cacaaaatca cggcattgcc cgccaaggcc gcacgcccgc tggcgtgcat cgaggccagg ggccgccgag gaaccgtttt gagccgcccg gccaagctgg aaaaggtgat cgatgagtaa agaaaggcgg ccggggccga ccgtgcggga acgtgaaggc acttggctgt cttacgacat cggatggaag gcggtgaggt cgcagcgcgt ccgagggcga tttgagttaa tccgagcgca gaagcgggtc acgccaaggc aatgagcaaa atcaagaaca ggccaggcgt ccgaggaatc gggtgatgac ggcagaagca ccggcaaccg accagatttt ggacgtggcc cgagcttcca ggattacgac ggaagggaag gttctgccgg gttaaacacc gacggtatcc gcggccggag caagaacccg ccgttttctc tgagatgaca tcagtgacaa cgcgctgcct accgggcgcc tgtgcccagt ccatcttgtt gaatatgaga gacaagaaat tttctgacgt aacgttgcgg tcataacgtg ttaaactatc tgcatagatg tacattaaag caatatatcc ccacgcgtta gagttcgagc cgaggcgtga gagctgatcg cgctcgaccc cggcgcggtg aatgaacgcc tcattaccga cgcacgtctc cggcctggcc gtgtatttga ataaacaaat gtcaggcaag tgttctgtta agatcaaccg catcggccgg gtccgcgatc atgggccacc gctacaagcg tgccgaggcg gagctaccca cgctgcccgc tgaggtaaag cgcagcagca aactttcagt aagaccatta tgaataaatg accaggcacc aagcggctgg ggcgtgagcg ctggtggaga cgccccggtg ccggcagccg ttcgttccga gttttccgtc gacgggcacg ctggtactga ggagacaagc cgagccgatg acgcacgttg gagggtgaag tacatcgaga gacgtgctga taccgcctgg ggagatcctg cgtcgagcac cgtcctgcag cctgcgctga catagccgaa caatcatgcg ctctaattgg atttgctagc atgtgcttag ttctgtcagt actcccttaa agtgtttgac cactcgaaat acgtccgcaa tgccaccagc ccaccacgcc gttccctaat agtttggccc accaggaagg tgtaccgcgc ccttccgtga aagaggaaca agagatcgag aaccgtgcgg ggccagcttg gtaaaacagc acgcaagggg acgaccatcg gtcgattccg ctaaccgttg cgcgacttcg aaggcagccg gccgacctgg gcctttgtcg ctggccgggt ggcactgccg gaggtccagg agaaaatgag aggctgcaac tgccggcgga ccgagctgct agtagatgaa gacgccgtgg gttgtctgcc gtcgcaaacc agttgaaggc aatcgtggca gtgcgccgtc tgctctatga tgtcgaagcg tagaggtttc tggcggtttc ccggccgcgt gcggaaagca ccatgcagcg ccttgattag tcgagctagc cggttcaccc cacgccgcgc ccccggcact agctgcgcaa ttcattcagg cagccggaac tagcctctcc aaacgatcca ataccgaggg tgatagtgac ctcattaaac tccaaacgta ttctccgctc aggatcctgc cagccaattt tgtgttatta cagccaacag ggccggccgc catcgaccgc ccgccctacc ccgcaccgtg acttgagcgc ggacgcattg agcatgaaac gcggagatga ctgcatgaaa gccgctgaag ttgcgtcatg aacgcatgaa caacccatct atccccaggg tcggcatcga tagtgatcga acttcgtgct tggagctggt tgtcgcgggc acgagctgcc ccgccggcac cgctggccgc caaaagcaca gttggccagc ggatcacacc atctgaatac ttttagcggc aatgccccat ggccctgcaa atccggcccg cgcgcaggcc agcggccgct gattaggaag cgtgggcacc tgaccgacga cgcagggccg ccatctaacc gttccgtcca gaaagacgac tacgaagaag ccgctacaag tgattggatg cgattacttt cgcaggcaag tcgcccaata gcagccagtc 4440 ggaacgcccg tcgtggccag 4500 gcaccggaca ggtcggtctt 4560 acggcggcat cagagcagcc 4620 acccaagcgg ccggagaacc 4680 gatccggtgc agattatttg 4740 gaatttatgg aacgtcagtg 4800 cttaggcgac ttttgaacgc 4860 tccagaaacc cgcggctgag 4920 aaacggcttg tcccgcgtca 4980 atgatcagat tgtcgtttcc 5040 ttggtaataa ttgtcattag 5100 tagacaagta tcaaacggat 5160 agttgtctaa gcgtcaattt 5220 ctccccgacc ggcagctcgg 5280 atggtgttga ccgtgttcgc 5340 acccggagcg ggcgcgaggc 5400 ctcaccccgg cacagatcgc 5460 aaagaggcgg ctgcactgct 5520 agcgaggaag tgacgcccac 5580 accgaggccg acgccctggc 5640 cgcaccagga cggccaggac 5700 tcgcggccgg gtacgtgttc 5760 tcctggccgg tttgtctgat 5820 aaaccgagcg ccgccgtcta 5880 cggtcgctgc gtatatgatg 5940 ggttatcgct gtacttaacc 6000 agcccgcgcc ctgcaactcg 6060 cagtgcccgc gattgggcgg 6120 ccgcccgacg attgaccgcg 6180 cggagcgccc caggcggcgg 6240 gattccggtg cagccaagcc 6300 taagcagcgc attgaggtca 6360 gatcaaaggc acgcgcatcg 6420 cattcttgag tcccgtatca 6480 aaccgttctt gaatcagaac 6540 tgaaattaaa tcaaaactca 6600 aacacgctaa gtgccggccg 6660 ctggcagaca cgccagccat 6720 aagctgaaga tgtacgcggt 6780 atcgcgcagc taccagagta 6840 taaaggaggc ggcatggaaa 6900 gtgtggagga acgggcggtt 6960 tggcactgga acccccaagc 7020 gtacaaatcg gcgcggcgct 7080 gcccagcggc aacgcatcga 7140 gatcgaatcc gcaaagaatc 7200 ccgcccaagg gcgacgagca 7260 cgcgatagtc gcagcatcat 7320 gctggcgagg tgatccgcta 7380 gccggcatgg ccagtgtgtg 7440 gaatccatga accgataccg 7500 cacgttgcgg acgtactcaa 7560 ctggtagaaa cctgcattcg 7620 gccaagaacg gccgcctggt 7680 atcgtaaaga gcgaaaccgg 7740 taccgcgaga tcacagaagg 7800 ttgatcgatc ccggcatcgg 7860 gcagaagcca gatggttgtt 7920

PL 206 304 B1

101 caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 7980 gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 8040 ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 8100 ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 8160 aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 8220 gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 8280 tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 8340 tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 8400 aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 8460 cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 8520 acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 8580 gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 8640 gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 8700 ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 8760 ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 8820 cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 8880 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 8940 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 9000 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 9060 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 9120 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 9180 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 9240 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 9300 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 9360 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 9420 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 9480 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 9540 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 9600 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 9660 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat ctcccaattt 9720 gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct gatagtttgg 9780 ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt taagccgcgc cgcgaagcgg 9840 cgtcggcttg aacgaatttc tagctagaca ttatttgccg actaccttgg tgatctcgcc 9900 tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc gatcttcttc 9960 ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg 10020 ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta 10080 ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga 10140 gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc 10200 aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag 10260 caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt 10320 gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc 10380 gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc 10440 cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacggt 10500 caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc 10560 gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc 10620 tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac cgcttccccc atgatgttta actttgtttt 10680 agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt gctgctccat aacatcaaac atcgacccac 10740 ggcgtaacgc gcttgctgct tggatgcccg aggcatagac tgtaccccaa aaaaacagtc 10800 ataacaagcc atgaaaaccg ccactgcg 10828 <210> 75 <211> 10036 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_s do ekspresji sensownego fragmentu RNA RacB z jęczmienia

102

PL 206 304 B1 <400> 75 ttccatggac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga 60 ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact 120 gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca 180 tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccca tcaagatctt 240 ggtgatgtag caagagctaa gttgtacttc gatycggttg gacattactc gagaccagat 300 gttttacact tgaccgtaaa tgagcacccg aagaaaccgg taacattcat ttcgaaggta 360 gagaaagcgg aagatgactc aaacaagtaa tcggttgtga ttcgtcagtt catgtcactc 420 ctatgaagga gtcaagttca aaatgttatg ttgagtttca aacttttatg ctaaactttt 480 tttcttaatt ttcgttaata atggaagaga accaattctc ttgtatctaa agattatcca 540 tctatcatcc aatttgagtg ttcaattctg gatgttgtgt taccctacat tctacaacca 600 tgtagccaat tattatgaat ctggctttga tttcagttgt gttcttttct ttttttcttt 660 gcatatttgc atttagaatg tttaataatt aagttactgt atttccacat acattagttc 720 caagaatata catatattaa tttatttttc ttaaaaatgt tttggaatga ctaatattga 780 caacgaaaat agaagctatg ctaaaccatt acgtatatgt gacttcacat gttgttgttt 840 tacattccct atatatatgg atggctgtca caatcagaaa cgtgatcgaa aaaagacaaa 900 cagtgtttgc ataaaaagac tatttcgttt cattgacaat ttgtgtttat ttgtaaagaa 960 aagtggcaaa gtggaatttg agttcctgca agtaagaaag atgaaataaa agacttgagt 1020 gtgtgttttt ttcttttatc tgaaagctgc aatgaaatat tcctaccaag cccgtttgat 1080 tattaattgg ggtttggttt tcttgatgcg aactaattgg ttatataaga aactatacaa 1140 tccatgttaa ttcaaaaatt ttgatttctc ttgtaggaat atgatttact atatgagact 1200 ttcttttcgc caataatagt aaatccaaag atatttgacc ggaccaaaac acattgatct 1260 attttttagt ttatttaatc cagtttctct gagataattc attaaggaaa acttagtatt 1320 aacccatcct aagattaaat aggagccaaa ctcacatttc aaatattaaa taacataaaa 1380 tggatttaaa aaatctatac gtcaaatttt atttatgaca tttcttattt aaatttatat 1440 ttaatgaaat acagctaaga caaaccaaaa aaaaaatact ttctaagtgg tccaaaacat 1500 caattccgtt caatattatt aggtagaatc gtacgaccaa aaaaggtagg ttaatacgaa 1560 attacaaaca tatctatata catagtatat attattacct attatgagga atcaaaatgc 1620 atcaaatatg gatttaagga atccataaaa gaataaattc tacggaaaaa aaaaaaagaa 1680 taaattcttt taagttttta atttgttttt tatttggtag ttctccattt tgttttattt 1740 cgtttggatt tattgtgtcc aaatactttg taaaccaccg ttgtaattct taaacggggt 1800 tttcacttct tttttatatt cagacataaa gcatcggctg gtttaatcaa tcaatagatt 1860 ttatttttct tctcaattat tagtaggttt gatgtgaact ttacaaaaaa aacaaaaaca 1920 aatcaatgca gagaaaagaa accacgtggg ctagtcccac cttgtttcat ttccaccaca 1980 ggttcgatct tcgttaccgt ctccaatagg aaaataaacg tgaccacaaa aaaaaaacaa 2040 aaaaaaagtc tatatattgc ttctctcaag tctctgagtg tcatgaacca aagtaaaaaa 2100 caaagactcg agtggatccc cgggccgcca tggccgcggg atggatccga tgagcgcgtc 2160 caggttcata aagtgcgtca cggtcgggga cggcgccgtc ggcaagacct gcatgctcat 2220 ctcctacacc tccaacacct tccccaccga ctatgttccg acagtgtttg ataacttcag 2280 tgccaacgtt gtggttgatg gtaatactgt caacctcggc ctctgggaca ctgcaggtca 2340 agaggattac aacagactga gaccactgag ctatcgtgga gctgatgttt ttcttctggc 2400 tttctcactg atcagtaagg ccagctatga gaatgtttcg aagaagtgga tacctgaact 2460 gaagcattat gcacctggtg tgccaattat tctcgtaggg acaaagcttg atcttcgaga 2520 cgacaagcag ttctttgtgg accatcctgg tgctgtccct atcactactg ctcagggaga 2580 ggagctaaga aagcaaatag gcgctccata ctacatcgaa tgcagctcga agacccaact 2640 aaacgtgaag ggcgtcttcg atgcggcgat aaaggttgtg ctgcagccgc ctaaggcgaa 2700 gaagaagaaa aaggtgcaga ggggggcgtg ctccattttg tgaaattcac tggccgtcgt 2760 tttacaacga ctcagagctt gacaggaggc ccgatctagt aacatagatg acaccgcgcg 2820 cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa 2880 ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat 2940 tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac 3000 aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa cgatcgggga tcatccgggt 3060 ctgtggcggg aactccacga aaatatccga acgcagcaag atctagagct tgggtcccgc 3120 tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat 3180 accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg 3240 ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa 3300 tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac 3360 gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc 3420 gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt 3480

PL 206 304 B1

103 acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag 3540 cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg 3600 agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc 3660 agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 3720 cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac 3780 cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 3840 tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 3900 atcttgttca atcatgcgaa acgatccaga tccggtgcag attatttgga ttgagagtga 3960 atatgagact ctaattggat accgagggga atttatggaa cgtcagtgga gcatttttga 4020 caagaaatat ttgctagctg atagtgacct taggcgactt ttgaacgcgc aataatggtt 4080 tctgacgtat gtgcttagct cattaaactc cagaaacccg cggctgagtg gctccttcaa 4140 cgttgcggtt ctgtcagttc caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc 4200 ataacgtgac tcccttaatt ctccgctcat gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt 4260 aaactatcag tgtttgacag gatcctgctt ggtaataatt gtcattagat tgtttttatg 4320 catagatgca ctcgaaatca gccaatttta gacaagtatc aaacggatgt taattcagta 4380 cattaaagac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca 4440 atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc 4500 acgcgttacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga 4560 gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg 4620 aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga 4680 gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg 4740 ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg 4800 gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa 4860 tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc 4920 attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg 4980 cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg 5040 gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt 5100 gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat 5160 aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt 5220 caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg 5280 ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag 5340 atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca 5400 tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt 5460 ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat 5520 gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc 5580 tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg 5640 ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga 5700 gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg 5760 ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg 5820 aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg 5880 cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa 5940 ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa 6000 gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg 6060 aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac 6120 caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa 6180 gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg 6240 cgtgagcggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct 6300 ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg 6360 ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc 6420 ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt 6480 cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt 6540 tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga 6600 cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct 6660 ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg 6720 agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg 6780 agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac 6840 gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga 6900 gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta 6960 catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga 7020

104

PL 206 304 B1 cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta 7080 ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta 7140 cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat 7200 cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat 7260 cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac 7320 ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc 7380 tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat 7440 tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga 7500 gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg 7560 cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac 7620 ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg 7680 ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc 7740 gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg 7800 acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 7860 atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg 7920 cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc 7980 agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 8040 gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 8100 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 8160 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 8220 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 8280 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 8340 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 8400 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 8460 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 8520 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 8580 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 8640 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 8700 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 8760 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 8820 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 8880 aaactcacgt taagggattt tggtcatgca tgatatatct cccaatttgt gtagggctta 8940 ttatgcacgc ttaaaaataa taaaagcaga cttgacctga tagtttggct gtgagcaatt 9000 atgtgcttag tgcatctaac gcttgagtta agccgcgccg cgaagcggcg tcggcttgaa 9060 cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg 9120 gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata 9180 agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca 9240 gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga 9300 caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt tccatagcgt 9360 taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga accggatcaa agagttcctc 9420 cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccag 9480 atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc 9540 tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga atgatgtcgt cgtgcacaac 9600 aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca ggggaagccg aagtttccaa 9660 aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccag 9720 caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac 9780 ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca actacctctg atagttgagt 9840 cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac tttgttttag ggcgactgcc 9900 ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 9960 ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa aaacagtcat aacaagccat 10020 gaaaaccgcc actgcg 10036 <210> 76 <211> 10036 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: transgeniczny wektor ekspresyjny pSUN3NIT_HvRacB_as do ekspresji sensownego fragmentu RNA RacB z

PL 206 304 B1

105 j ęczmiema <400> 76 ttccatggac ttattctaat gatagtttaa tgattacgcc ggtgatgtag gttttacact gagaaagcgg ctatgaagga tttcttaatt tctatcatcc tgtagccaat gcatatttgc caagaatata caacgaaaat tacattccct cagtgtttgc aagtggcaaa gtgtgttttt tattaattgg tccatgttaa ttcttttcgc attttttagt aacccatcct tggatttaaa ttaatgaaat caattccgtt attacaaaca atcaaatatg taaattcttt cgtttggatt tttcacttct ttatttttct aatcaatgca ggttcgatct aaaaaaagtc caaagactcg ttcttcttcg acgtttagtt agctcctctc ttgtcgtctc tgcttcagtt gagaaagcca tcctcttgac ttggcactga taggagatga aacctggacg tttacaacga cgataattta ttgcgggact tattacatgc aggattcaat ctgtggcggg tcagaagaac accgtaaagc ggtagccaac tccagaaaag atacaaatgg aaacgctctt actgaaggcg aagcttgcat caagagctaa tgaccgtaaa aagatgactc gtcaagttca ttcgttaata aatttgagtg tattatgaat atttagaatg catatattaa agaagctatg atatatatgg ataaaaagac gtggaatttg ttcttttatc ggtttggttt ttcaaaaatt caataatagt ttatttaatc aagattaaat aaatctatac acagctaaga caatattatt tatctatata gatttaagga taagttttta tattgtgtcc tttttatatt tctcaattat gagaaaagaa tcgttaccgt tatatattgc agtggatccc ccttaggcgg gggtcttcga cctgagcagt gaagatcaag caggtatcca gaagaaaaac ctgcagtgtc agttatcaaa gcatgcaggt cgctcatcgg ctcagagctt tcctagtttg ctaatcataa ttaacgtaat cttaagaaac aactccacga tcgtcaagaa acgaggaagc gctatgtcct cggccatttt acgaacggat ttctcttagg ggaaacgaca gcctgcaggt gttgtacttc tgagcacccg aaacaagtaa aaatgttatg atggaagaga ttcaattctg ctggctttga tttaataatt tttatttttc ctaaaccatt atggctgtca tatttcgttt agttcctgca tgaaagctgc tcttgatgcg ttgatttctc aaatccaaag cagtttctct aggagccaaa gtcaaatttt caaaccaaaa aggtagaatc catagtatat atccataaaa atttgttttt aaatactttg cagacataaa tagtaggttt accacgtggg ctccaatagg ttctctcaag cggtcacaaa ctgcagcaca gctgcattcg agtgataggg ctttgtccct cttcttcgaa atcagctcca ccagaggccg cactgtcgga cttgccgacg atccatcccg gacaggaggc cgcgctatat aaacccatct tcaacagaaa tttattgcca aaatatccga ggcgatagaa ggtcagccca gatagcggtc ccaccatgat aaaccttttc tttacccgcc atcagatcta cgactctaga gatycggttg aagaaaccgg tcggttgtga ttgagtttca accaattctc gatgttgtgt tttcagttgt aagttactgt ttaaaaatgt acgtatatgt caatcagaaa cattgacaat agtaagaaag aatgaaatat aactaattgg ttgtaggaat atatttgacc gagataattc ctcacatttc atttatgaca aaaaaatact gtacgaccaa attattacct gaataaattc tatttggtag taaaccaccg gcatcggctg gatgtgaact ctagtcccac aaaataaacg tctctgagtg atggagcacg acctttatcg atgtagtatg acagcaccag acgagaataa acattctcat cgatagctca aggttgacag acatagtcgg gcgccgtccc cggccatggc ccgatctagt tttgttttct cataaataac ttatatgata aatgtttgaa acgcagcaag ggcgatgcgc ttcgccgcca cgccacaccc attcggcaag acgccctttt aaatatccga 60 aatatatcct gtcaaacact 120 gtaggaaaca gctatgacca 180 ggatccccca tcaagatctt 240 gacattactc gagaccagat 300 taacattcat ttcgaaggta 360 ttcgtcagtt catgtcactc 420 aacttttatg ctaaactttt 480 ttgtatctaa agattatcca 540 taccctacat tctacaacca 600 gttcttttct ttttttcttt 660 atttccacat acattagttc 720 tttggaatga ctaatattga 780 gacttcacat gttgttgttt 840 cgtgatcgaa aaaagacaaa 900 ttgtgtttat ttgtaaagaa 960 atgaaataaa agacttgagt 1020 tcctaccaag cccgtttgat 1080 ttatataaga aactatacaa 1140 atgatttact atatgagact 1200 ggaccaaaac acattgatct 1260 attaaggaaa acttagtatt 1320 aaatattaaa taacataaaa 1380 tttcttattt aaatttatat 1440 ttctaagtgg tccaaaacat 1500 aaaaggtagg ttaatacgaa 1560 attatgagga atcaaaatgc 1620 tacggaaaaa aaaaaaagaa 1680 ttctccattt tgttttattt 1740 ttgtaattct taaacggggt 1800 gtttaatcaa tcaatagatt 1860 ttacaaaaaa aacaaaaaca 1920 cttgtttcat ttccaccaca 1980 tgaccacaaa aaaaaaacaa 2040 tcatgaacca aagtaaaaaa 2100 cccccctctg cacctttttc 2160 ccgcatcgaa gacgcccttc 2220 gagcgcctat ttgctttctt 2280 gatggtccac aaagaactgc 2340 ttggcacacc aggtgcataa 2400 agctggcctt actgatcagt 2460 gtggtctcag tctgttgtaa 2520 tattaccatc aaccacaacg 2580 tggggaaggt gttggaggtg 2640 cgaccgtgac gcactttatg 2700 ggcaattcac tggccgtcgt 2760 aacatagatg acaccgcgcg 2820 atcgcgtatt aaatgtataa 2880 gtcatgcatt acatgttaat 2940 atcatcgcaa gaccggcaac 3000 cgatcgggga tcatccgggt 3060 atctagagct tgggtcccgc 3120 tgcgaatcgg gagcggcgat 3180 agctcttcag caatatcacg 3240 agccggccac agtcgatgaa 3300 caggcatcgc catgggtcac 3360

106

PL 206 304 B1 gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc 3420 gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt 3480 acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag 3540 cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg 3600 agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc 3660 agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 3720 cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac 3780 cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 3840 tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 3900 atcttgttca atcatgcgaa acgatccaga tccggtgcag attatttgga ttgagagtga 3960 atatgagact ctaattggat accgagggga atttatggaa cgtcagtgga gcatttttga 4020 caagaaatat ttgctagctg atagtgacct taggcgactt ttgaacgcgc aataatggtt 4080 tctgacgtat gtgcttagct cattaaactc cagaaacccg cggctgagtg gctccttcaa 4140 cgttgcggtt ctgtcagttc caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc 4200 ataacgtgac tcccttaatt ctccgctcat gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt 4260 aaactatcag tgtttgacag gatcctgctt ggtaataatt gtcattagat tgtttttatg 4320 catagatgca ctcgaaatca gccaatttta gacaagtatc aaacggatgt taattcagta 4380 cattaaagac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca 4440 atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc 4500 acgcgttacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga 4560 gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg 4620 aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga 4680 gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg 4740 ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg 4800 gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa 4860 tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc 4920 attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg 4980 cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg 5040 gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt 5100 gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat 5160 aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt 5220 caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg 5280 ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag 5340 atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca 5400 tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt 5460 ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat 5520 gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc 5580 tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg 5640 ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga 5700 gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg 5760 ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg 5820 aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg 5880 cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa 5940 ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa 6000 gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg 6060 aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac 6120 caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa 6180 gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg 6240 cgtgagcggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct 6300 ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg 6360 ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc 6420 ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt 6480 cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt 6540 tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga 6600 cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct 6660 ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg 6720 agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg 6780 agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac 6840 gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga 6900

PL 206 304 B1

107 gggtgaagcc catcgagatc cgtgctgacg ccgcctggca cgaacgcagt cgggtcaaat cctagtcatg ggagcagatg tgtggatagc tgggaaccca gaaaaaaggc cctggcctgt ccttcggtcg ccgctcaaaa gtcgccactc acggtgaaaa atgccgggag cagccatgac agagcagatt gagaaaatac cgttcggctg atcaggggat taaaaaggcc aaatcgacgc tccccctgga gtccgccttt cagttcggtg cgaccgctgc atcgccactg tacagagttc ctgcgctctg acaaaccacc aaaaggatct aaactcacgt ttatgcacgc atgtgcttag cgaatttcta gacaaattct agcctgtcta gtcggcagcg caacgtaagc taaggtttca cgccgctgga atcaatgtcg tccaaattgc aatggtgact aaggtcgttg caaatcaata ggccagcaac cgatacttcg ctgctgcgta ttgctgcttg gaaaaccgcc ttgattagcc gagctagctg gttcaccccg cgccgcgccg ggcagcgccg gacctgccgg cgctaccgca ctagggcaaa acgtacattg aagccgtaca gatttttccg gcataactgt ctgcgctccc atggctggcc gaccgccggc cctctgacac cagacaagcc ccagtcacgt gtactgagag cgcatcaggc cggcgagcgg aacgcaggaa gcgttgctgg tcaagtcaga agctccctcg ctcccttcgg taggtcgttc gccttatccg gcagcagcca ttgaagtggt ctgaagccag gctggtagcg caagaagatc taagggattt ttaaaaataa tgcatctaac gctagacatt tccaactgat gcttcaagta acatccttcg actacatttc tttagcgcct cctaccaagg atcgtggctg agttcgcgct tctacagcgc atcaaagctc tcactgtgtg gtcggttcga gcgatcaccg acatcgttgc gatgcccgag actgcg gctacaagat attggatgta attacttttt caggcaaggc gagagttcaa agtacgattt acctgatcga ttgccctagc ggaacccaaa ttgggaaccg cctaaaactc ctggccagcg tacgccccgc tacggccagg gcccacatca atgcagctcc cgtcagggcg agcgatagcg tgcaccatat gctcttccgc tatcagctca agaacatgtg cgtttttcca ggtggcgaaa tgcgctctcc gaagcgtggc gctccaagct gtaactatcg ctggtaacag ggcctaacta ttaccttcgg gtggtttttt ctttgatctt tggtcatgca taaaagcaga gcttgagtta atttgccgac ctgcgcgcga tgacgggctg gcgcgatttt gctcatcgcc caaatagatc caacgctatg gctcgaagat tagctggata ggagaatctc gccgcgttgt gcttcaggcc gatggcgctc cttcccccat tgctccataa gcatagactg cgtaaagagc ccgcgagatc gatcgatccc agaagccaga gaagttctgt gaaggaggag gggcgaagca aggggaaaaa gccgtacatt gtcacacatg tttaaaactt cacagccgaa cgcttcgcgt caatctacca aggcaccctg cggagacggt cgtcagcggg gagtgtatac gcggtgtgaa ttcctcgctc ctcaaaggcg agcaaaaggc taggctccgc cccgacagga tgttccgacc gctttctcat gggctgtgtg tcttgagtcc gattagcaga cggctacact aaaaagagtt tgtttgcaag ttctacgggg tgatatatct cttgacctga agccgcgccg taccttggtg ggccaagcga atactgggcc gccggttact agcccagtcg ctgttcagga ttctcttgct acctgcaaga acgccacgga gctctctcca ttcatcaagc gccatccact gatgacgcca gatgtttaac catcaaacat taccccaaaa gaaaccgggc acagaaggca ggcatcggcc tggttgttca ttcaccgtgc gcggggcagg tccgccggtt ggtcgaaaag gggaaccgga taagtgactg attaaaactc gagctgcaaa cggcctatcg gggcgcggac cctcgcgcgt cacagcttgt tgttggcggg tggcttaact ataccgcaca actgactcgc gtaatacggt cagcaaaagg ccccctgacg ctataaagat ctgccgctta agctcacgct cacgaacccc aacccggtaa gcgaggtatg agaaggacag ggtagctctt cagcagatta tctgacgctc cccaatttgt tagtttggct cgaagcggcg atctcgcctt tcttcttctt ggcaggcgct gcgctgtacc ggcggcgagt accggatcaa tttgtcagca atgtcattgc atgatgtcgt ggggaagccg cttacggtca gcggagccgt actacctctg tttgttttag cgacccacgg aaacagtcat ggccggagta agaacccgga gttttctcta agacgatcta gcaagctgat ctggcccgat cctaatgtac gtctctttcc acccgtacat atataaaaga ttaaaacccg aagcgcctac cggccgctgg aagccgcgcc ttcggtgatg ctgtaagcgg tgtcggggcg atgcggcatc gatgcgtaag tgcgctcggt tatccacaga ccaggaaccg agcatcacaa accaggcgtt ccggatacct gtaggtatct ccgttcagcc gacacgactt taggcggtgc tatttggtat gatccggcaa cgcgcagaaa agtggaacga gtagggctta gtgagcaatt tcggcttgaa tcacgtagtg gtccaagata ccattgccca aaatgcggga tccatagcgt agagttcctc agatagccag gctgccattc cgtgcacaac aagtttccaa ccgtaaccag acaaatgtac atagttgagt ggcgactgcc cgtaacgcgc aacaagccat

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10036

108

PL 206 304 B1

Claims (18)

1. Sposób uzyskiwania lub zwiększania oporności na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy u roślin, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

i) zmniejszenie ilości, aktywności lub funkcji białka RacB w roślinie lub jej tkance, organie, części lub komórce, oraz ii) dobór tych roślin u których, w przeciwieństwie lub w porównaniu do rośliny oryginalnej, jest zwiększona oporność na przynajmniej jeden czynnik chorobotwórczy, przy czym zmniejszenie ilości, aktywności lub funkcji białka RacB zapewnia się przy pomocy sposobu wybranego z grupy obejmującej:

a) wprowadzenie dwuniciowej sekwencji RacB kwasu nukleinowego RNA (RacB dsRNA) lub kasety(kaset) ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

b) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

c) wprowadzenie antysensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w kombinacji z rybozymem lub kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

d) wprowadzenie sensownej sekwencji RacB kwasu nukleinowego w celu wywołania kosupresji lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

e) wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej dominującego-negatywnego mutanta białka RacB lub kasety ekspresyjnej zapewniającej jej ekspresję,

f) wprowadzenie czynników wiążących DNA lub białka, skierowanych przeciwko genom RacB, sekwencjom RNA genu RacB lub białkom RacB albo kasety ekspresyjnej zapewniającej ich ekspresję,

g) wprowadzenie wirusowych sekwencji kwasu nukleinowego i konstruktów ekspresyjnych powodujących degradację RNA RacB albo kasety ekspresyjnej umożliwiającej ich ekspresję,

h) wprowadzenie konstruktów wywołujących homologiczną rekombinację endogennych genów RacB, oraz

i) wprowadzenie mutacji do endogennego genu RacB.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko RacB dobiera się z grupy białek obejmującej:

a) polipeptydy określone przez Sekw. Nr 2, 4, i 6 oraz

b) funkcjonalne odpowiedniki polipeptydów określonych przez Sekw Nr 2, 4, i 6.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że funkcjonalny odpowiednik posiada przynajmniej 64% homologii z jednym z polipeptydów określonych przez Sekw Nr 2, 4, i 6.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że obejmuje:

(a) stabilną transformację komórki roślinnej rekombinowaną kasetą ekspresyjną zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą • dwuniciową sekwencję RacB kwasu nukleinowego RNA, lub • antysensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego, lub • antysensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego w kombinacji z rybozymem, lub • sensowną sekwencję RacB kwasu nukleinowego wywołującą kosupresję , lub • dominują cego-negatywnego mutanta biał ka RacB, lub • czynniki wiążące DNA lub białka skierowane przeciwko genom RacB, sekwencjom

RN A RacB lub białkom RacB • wirusowe sekwencje kwasów nukleinowych powodują ce degradację RNA RacB w funkcjonalnym połączeniu z promotorem, który jest aktywny w roślinach, (b) odtworzenie rośliny z komórki roślinnej, oraz (c) ekspresję omawianej sekwencji kwasu nukleinowego w ilości i przez okres wystarczający do wytworzenia lub zwiększenia oporności na czynnik chorobotwórczy w omawianej roślinie.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że czynnik chorobotwórczy wybiera się z grupy obejmującej bakterie, grzyby, owady, wirusy i nicienie.

6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że czynnik chorobotwórczy wybiera się z grupy grzybów obejmujących Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycota i Deuteromycetes.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że roślinę wybiera się z jednoliściennych i dwuliściennych.

PL 206 304 B1

109

8. Sposób wedł ug zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, ż e roś linę wybiera się z grupy roślin jednoliściennych obejmujących pszenicę, owies, proso, jęczmień, żyto, kukurydzę, ryż, grykę, sorgo, pszenżyto, pszenicę orkisz, len lub trzcinę cukrową.

9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, ż e sekwencja aminokwasów białka RacB z jęczmienia odpowiada Sekw. Nr 2.

10. Transgeniczna roślina oraz otrzymane z niej fragmenty, znamienna tym, że jest otrzymana zgodnie ze sposobem określonym w jednym z zastrz. od 1 do 9.

11. Transgeniczna komórka oraz otrzymane z niej fragmenty i inne rodzaje komórek roślinnych znamienne tym, że są otrzymane zgodnie ze sposobem określonym w jednym z zastrz. od 1 do 9.

12. Transgeniczna hodowla komórkowa oraz otrzymane z niej fragmenty, znamienne tym, że są otrzymane zgodnie ze sposobem określonym w jednym z zastrz. od 1 do 9.

13. Transgeniczna tkanka oraz otrzymane z niej fragmenty, znamienna tym, że jest otrzymana zgodnie ze sposobem określonym w jednym z zastrz. od 1 do 9.

14. Materiał reprodukcyjny, znamienny tym, że jest otrzymany z rośliny określonej w zastrz. 10.

15. Materiał reprodukcyjny, znamienny tym, że jest otrzymany z komórki określonej w zastrz. 11.

16. Materiał reprodukcyjny, znamienny tym, że jest otrzymany z hodowli komórkowej określonej w zastrz. 12.

17. Materiał reprodukcyjny, znamienny tym, że jest otrzymany z tkanki określonej w zastrz. 13.

18. Transgeniczna roślina według zastrz. 10, znamienna tym, że jest wybrana z grupy roślin obejmującej pszenicę, owies, proso, jęczmień, żyto, kukurydzę, ryż, grykę, sorgo, pszenżyto, pszenicę orkisz, len, trzcinę cukrową, rzepak, rzepak canola, rzeżuchę, Arabidopsis, kapusty, soję, lucernę, groszek, fasolę, orzech ziemny, ziemniak, tytoń, pomidor, bakłażan, paprykę, słonecznik, Tagetes, sałatęCalendula, melon, dynię/kabaczek i cukinię.