HU228701B1

HU228701B1 - Új nukleinsav-szekvenciák és alkalmazásuk növényekben patogén-rezisztencia kialakítására szolgáló eljárásokban

Info

Publication number: HU228701B1
Application number: HU0402030A
Authority: HU
Inventors: Karl-Heinz Kogel; Ralph Hueckelhoven; Holger Schultheiss; Markus Frank
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2001-09-03
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2013-05-28
Also published as: HUP0402030A3; US20050132439A1; RU2346985C2; WO2003020939A1; HUP0402030A2; CZ2004298A3; AU2008202603A1; DE50213970D1; ES2338303T3; PL206304B1; EP1427833B1; RU2004110237A; ATE447032T1; AR036419A1; US7456335B2; AU2008202603B2; PL369209A1; EP1427833A1; CA2459251A1; CA2459251C

Description

A találmány tárgyát árpából származó űj .RacB cDNS szekvenciák ás ezeket a szekvenciákat tartalmazó expresszlós kazetták és vektorok képezik. A. találmány tárgyát képezik továbbá ezekkel az expresszlós kazettákkal vagy vektorokkal transzformált transzgén növények, ezekből származó tenyészetek, részletek vagy transzgén. szaporító anyagok és ezek felhasználása élelmiszerek, takarmányok, magok, gyógyszerek vagy finomvegyszerek előállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá növényekben patogén-rezisstenoia létrehozására vagy fokozására szolgáló módszerek RacB fehérje vagy funkcionális ekvivalense kifejeződésének csökkentése révén.

A növényi biotechnológia célja előnyös űj tulajdonságokkal rendelkező növények létrehozása, például a mezőgazdaság termelékenységének fokozása, élelmiszerek esetében a minőség növelése vagy specifikus vegyi anyagok vagy gyógyszerek előállítása érdekében (Dunwell, J. Exp. Bot. 51, <3 87-496 (20Ö0)]. A növény patooénekkei szembeni természetes védekezési mechanizmusai gyakran nem elegendőek. Csak a gombás megbetegedések egyedül évente sok billió USA dollár termelés kiesést okoznak. Növényekből, állatokból vagy mikroorganizmusokból származó idegen gének növelhetik a védekezést. Példa erre a dohány megvédése rovarok okozta károktól Saciilus thurlngzensis endotoxinoknak a 35S CaMV promoter kontrollja alatt történő kifejezésével [Vaeck et al,, Natúré 323, 33-37 (193?)] vagy a dohány megvédése gombás fertőzéstől hab kitináznak a CaMV promóter kontrolija alatt történő kifejezésévei [Broglie et al., Science 251, 1191-1197 (1991)}. A leírt megközelítések legtöbbje azonban csak egy patoqénnel szembeni vagy a patogének szűk spektruma elleni rezisztenciát nyújt,

Csupán néhány olyan megközelítés létezik, amely patogének szélesebb spektruma, főleg gomba patogének ellen, biztosít rezisztenciát a növények számára.. Általánosan megszerzett reziszSÁR; - különböző nővédelmi mechanizmust ·

Τ' ΤΊ Ί .ti (systemzc aegurreo resrsrance vény/patogén kölcsönhatásokban fellépő közvetíthetnek endogén hírvivő anyagok, úgymint jasmcnate (JA) vagy szalicilsav {salicyiíc acid - SA) [Ward et al., Plánt Cell 3, 1035-1094 (1991); üknes et al., Plánt Cell 4.(6), 645-656 (1992)]. Hasonló hatások elérhetők szintetikus vegyületekkel ís, úgymint 2,6-diklór-izonikotinsav (INA) vagy S-metil-(1,2,3)benzotiadÍazol-7-tiokarboxilát (BÍR; Bion) alkalmazásával [Friedrích et al., Plánt J. 10 (1), 61-70 (1996),* Lawtcn et ai.,

Plánt u. 10, 71-32 (1996)}. Patogenezishez kapcsolódó (pathogenesis related = PR) fehérjék kifejezése, amely BAR esetében jól szabályozott, bizonyos esetekben szintén eredményezhet patogén rezisztenciát,

Árpában az Mlo iókuszt írták le néhányszor, mint a növényi védekezés negatív szabályozóját. Az Mlo gén kiiktatása vagy funkciójának elvesztése megnövekedett és mindenek fölött fajra nem. specifikus rezisztenciát eredményez, például számos penészgombával szemben [Süschges eb ai., Cell 98, 695-705 (1997);

Jorgensen, Suphytica 26, 55-62: (1977); Lyngkjaer et al,, Plánt

Pathol. 4 4, 796-790 (1995)]. Az bio fenotipus recessziven öröklődik, amely szintén azt sugallja, hogy ez egy érzékenységet befő-

lyá-soló gén. Hagyományos- terassztéssel kapott Mlo-hiányos árpa változatokat már széles körben eltetjedten használnak a mezőgazdaságban, Bár ezeket a változatokat intenziven termesztik, ez a rezisztencia rendkívüli módon tartósnak bizonyult, valőszinűieg: a recesszivitásnak köszönhetően. Rezisztencia megszakadását eddig még nem tapasztalták. Mio-hoz hasonló rezisztenciát más növényekben, különösen gabonafélékben még nem írtak le, jóllehet a búzát, rozsot és más gabonátéléket szintén támadják hasonló patogén penészgombák, Ennek például a búzánál hexaploíd genom létezése lehet az oka, amely rendkívül nehézzé teszi olyan mutánsok azonosítását, amelyekben a génnek mind a hat példánya inaktivált,

Az bio gént csak nemrég kiónozták [Büschges et. al., Ceil 88, 695-705 (1997); Sohulze-Lefért and Vegei, Trends Plánt Sói. 5,

343-343 (2000); WO 98/09586 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés]. Ennek következményeként különböző homológokat izoláltak más gabonafa jókból, Több módszert ís leírtak már patogén-rezisztencia kialakítására ezeknek a géneknek a felhasználásával (WO 98/04586, WO 00/01722 és WO 99/47552 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentések).

Sgy növény Mio rezisztenciája patogén penészgombákkal szemben két fontos mechanizmusban nyilvánul meg, ahol mindkettő a behatolással szemben nyújt eiienáilókepességet: sejtfal appozíciő (ceil wall apposltíon - CWA; szemölcs képződés) a patogén behatolási helye alatt az epidermisz sejtfalban. A patogén penész-gomba terjedése majdnem kizárólag ebbe a szubceiiuláris szerkezetbe szorul vissza [Jorgensen and Mortensen, Phyto73.353/ΒΣ/Μ2 pathology 67, 678-685 (1977) ; Freialdenh.oven. et al., Plánt Celi 8_, 5-14 (1996)], Ezt a reakciót az Mlo hatáséhoz szükséges Pori és RorC gének okozzak [Peterhánsel et al.» 9» 1397-1409 (199'?)].

Az Mio patogén-rezisztenoia hátránya, hogy Mlo-hiányos növények - akár patogsn jelenléte nélkül is - védekező mechanizmust váltanak ki, amely például ievélsejtek spontán elhalásában nyilvánul meg [boiter et al. , Mól, Gén, Génét. 2 3 9, 122-128 (1993)], További hátránya, hogy az Mlo-hiányos genotípusok szuperérzékenyek hemibíotróf patogénskre, úgymint Mágnaporte grisears (AA grisea) és Coehi lohol us satávúéra (bipoláris soroiánrana) (Jarosch et al.» hol. Plánt Microbe Internet, 12, 508-514 (1999); Kismar et ai., Phytopathology 91» 127-133 (2001)], Tehát az Mlo gén a sejthalál negatív szabályozójának tűnik. Az ok valószínűleg a sejthalál indukciója az Mio gén hiányában, amely növeli az érzékenységet ezekkel a meglehetősen nekrotróf patogénekkel szeniben. Ez az Mlo biotechnológiai felhasználását korlátozó ambivalens hatás valószínűleg annak köszönhető, hogy nekrotróf penészek képesek kihasználni az Mlo-hiányos gazdanövény erőteljesebben kifejezett hiperérzéfceny válaszát (HP. - hypersensítive response) a fertőzési folyamathoz. Egy Mlo-hiányhoz hasonló rezisztencia lenne kívánatos olyan jellemzők nélkül, mint például a sejthalál.

Az Pho, Pác és Cdc42 fehérjék a kis GTP (guanozin-trífosz-fát) kötő fehérje család tagjai és mint „molekuláris kapcsolók nagyszámú intraceilulárís folyamatot szabályoznak mind a növényi, mind az állati szervezetben. Szignál transzdukáló elemeiként fontos szerepet játszanak az extracelluláris stimulusok át78,3S8/BS/rp.2.

ti * « * í> Λ * * φ ΪΎ • «·« »· >

K » # Λ» » * * * * X ♦ χ « fc« > Tt μ * alakításában. Például szabályozzák a NáDPH oxidázfc és ilyentormán reaktív oxigén molekulák szabaddá válását („oxidatív robbanás) . Állati vagy humán. Racl nélkülözhetetlen az aktív NADPH. oxidáz komplex kialakulásához, amely viszont fontos szuperoxídáz kialakulásához, ilyenformán közreműködve, a növényi védekezésben [Iráni and Goldschmidt-Clermont, Biochem. Pharmacol. 55, 13391346 (1998)·].. A növényi védekezésben betöltött funkció növényekben és állatokban nagymértékben hasonló [Kwong et al., J. Bioi. Chem. 270(34), 19368-19872 (1995}; Dusí et al, , Biochem. J. 314,

409-412 (1996); Diekmann et ai,, Science 265, 531-533 (1994);

Burgin et al., The Plánt Celi 9, 2077-2091 (1397)? Kleinberg et al., Biochem. 33, 2490-2495 (1994); Prigmore et ai., u. Bioi,

Chem. 27(18), 10717-1072.2 {1995); Iráni et al., Science 2?5,

1649-1652 (1997); Low et ai,, Advanoes ín Molecular Genetícs of

Plant-Microbe Interactlons 3, 361-369 (1994); Mahdy et al..

Plánt Physiol. 105, 467-472 (1994) ; Sundaresan et al., Biochem.,

J. 318, 379-382 (1996)]. Továbbá, GTP kötő fehérjék részt vesznek a sejtváz újra strukturálásában és a sejt transzformálásban [Symon et al., TI.BS 21, 178-181 (1996)] és a transzkripció aktiválásában is [Híli. et al., Celi 81, 1159-1170 (1995); Chandra et al,, Proc. háti. Acad. Sci. USA 93, 13393-13397 (1996)].

Növényekben létezik Rac-hoz hasonló fehérjéknek egy lényeges családja [Winge et al., Plánt Mól. Bioi, 35, 483-495 (1997)], amelyet Rop család néven, is neveznek [Lin et al,, The Plánt Celi

9., 1647-1659 (1997)], Növényekben a Rác fehérjéknek ágy tűnik a reaktív oxigén molekulák szabaddá tételében van funkciója patogén fertőzés következményeként [Groom et ai., Plánt u. 10, 51578.358/W&M

522 (1996'; Hassanain et al., Siochem. Siophys. Rés, Commun.

272(3), 783-733 (2000); One et al., Proc. Natl. Acad. Scí. USA 98, 759-764 (2001)]. Rác szabályozza - többek között - a. sejtfal felépülését, szignál transzdukciót a merisztémában és a patogének elleni védekezést [Vaister et ai., Trende Cell Bioi. 1.0 (4) , 141-146 (2000)]. Ha a konstitutiv aktív forma túlzottan kifejezett, rizsből származó Racl képes híperérzékeny válasz (HR) kiváltására Eb grisea támadási. helyein, ilymődon patogén-rezisztenciát eredményezve. Ennek megfelelően, Racl negatív domináns formájának kifejeződése Jő, grisea-val szemben. megnovekedett érzékenységet eredményez [Kawasaki et al., Proc. Nstl. Acad . Sci. USA 96; 10922-10926 (1999); Cno et al,, Proc. Nstl. Acad. Sci. USA 98, 759-764 (2001)]. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy Rác fehérjék túlzott kifejeződése a növényben előnyös hatásokat eredményezhet a növény védekezése tekintetében.

A WO 00/15815 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés öt, kukoricából származó Rác gént ír le. Jóllehet Rác fehérjék túlzott kifejezésének és visszafogott kifejezésének szabályozására egyaránt leírnak módszereket és ezt elméletben őszszefüggésbe hozzák patogén-rezisztencia kialakulásával (55. oldal 25, sor), az ezt a felhasználást konkrétan leíró egyetlen technikai beszámoló a patogén-rezisztencia eléréséhez a szóban forgó Rác géneknek egyedül túlzott kifejezésére vonatkozik (60. oldal 21. sor). Teljesen egyértelműen és a technika mai állásával egybehangzóan posztulátumként leszögezi (60. oldal, 31. sor); „Eszerint a találmány felhasználható növények patogénektől való megvédésében. Ha egy növényt Rác poiipeptidet kódoló poli* * * nukleotiddal transzformálunk, a poiipeptid kifejeződése a növényben rezisztenciát nyújt növénypatogének ellen. Szt a hipotézist alátámasztó magyarázat {növényi védekezés reaktív oxigén molekulákkal) következik számos irodalmi hivatkozással megerősítve.

Ezenkívül nem tesz különbséget az öt szóban forgó Rác gén között.

A találmány tárgyát képezik a patogének elleni növényi védekezésben felhasználható olyan új módszerek, amelyek a lehetőségeken belül patogének széles spektruma ellen hatékony védelmet biztosítanak olyan sok növényfajnak, amennyinek csak lehetséges, előnyösen a mezőgazdaságban termesztett gabonaféléknek. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással ez a cél elérhető.

A találmány első megvalósítási formája eljárás legalább egy patogénnel szembeni rezisztencia létrehozására vagy fokozására növényekben, amely a következő lépéseket tartalmazza:

a) RacB fehérje mennyiségének, aktivitásának vagy működésének csökkentesét növényben vagy annak egy szövetében, szervében, részletében vagy sejtjében; és fo·) azoknak a növényeknek a kiválogatását, amelyekben az eredeti növényhez képest legalább egy patogénnel szemben rezisztencia létezik vagy fokozódott.

Meglepő módon az árpából (Sördeum vulgare) származó Rác homológ RacB (az alábbiakban hvRacBj 1. számú szekvencia) a rizs

Racl-hes való nagy hasonlóság ellenére, előbbivel ellentétesen negatív kontroll funkciót mutat az árpa lisztharmat - B.iame.ria (syn. Szysiphe} gzstziinis f.sp. hordei (Sgh; - támadásával szemben: a hvdscB kifejeződésének csökkentése az epidermisz sejtben szekvencia-specifikus RNS interferenciával, kettős-szálú nvSacS dsRNS~t alkalmazva („gén csillapítás) - jelentősen gátolta hausztőria (szívőfonalak) kifejlődését Bgh fertőzésnél. További kísérletek (7. példa) azt mutatták, hogy ez a fenotipus nem figyelhető meg sí loö-rorl-mutáns genotípusban, nevezetesen A89 árpában. Ez azt sugallja, hogy RacB működőképesen kapcsolódik Miohoz vagy Rorl-hez vagy mindkettőhöz, amely valószínűsíti, hogy ezek egy szignál kaszkádban vesznek, részt.

Mio működésének elvesztéséhez hasonlóan, HvEacB széleskörű rezisztenciát közvetít Biuneria gram.iais f,sp, h erdei különböző izolátumaival szemben. Átmeneti gén csillapító· kísérletekben (7. példa) EvRacS 94%-kal csökkentette Bgh behatolási hatékonyságát (hausztőria kifejlődését), ennek a hatásnak az erőssége megfelel az Mio dsRMS-sel elért hatásnak [Schwsizer, Plánt J. 24, 895-903 (20Ö0)]. A vad típusú, Ingrid árpa változatban a gomba behatolások körülbelül 60%-a eredményezett hausztőria kifejlődést, míg a BCIngrid-mioo változatban a penetráció aránya közel 0%. Az A8 9 árpa változat (mlo-rorl kettős mutáns) körülbelül 20~35%~os behatolási hatékonyságot mutat. Sgh inokulácié következtében megváltozott RacB kifejeződést ezen változatok egyikénél sem figyeltünk meg (7. példa, 3. ábra). Az a tény, hogy még a patogénekre érzékeny vad típusoknál - úgymint Psllas vagy Ingrid fajtáknál — is csak körülbelül 50%-os behatolási arány figyelhető meg, az állandóan meglevő alapvető rezisztenciára vezethető vissza.

Érdekes módon a hvRacB gén csillapítása csak a sejtfal árpozíciót (szemölcs képződést) fokozza, a növény sejtjeinek spontán elhalását azonban nem, ellentétben MIo-val. Tehát HvRacB eltér OsRacl-töl, Raol rizs homológjától [Ono et ai., Proc. háti, Acad.

7S.35S/3S/KM

Sci. USA 99, 759-764 (2001)]. HvRaoB túlnyomó-részt a sejtfal árpozíció negatív szabályozójaként működik. Ez a különbség kiemelkedő fontosságú növények patogán-xezisztenciájának kialakításához 'történő felhasználásában. A fentiekben leírtak szerint, Mlo rezisztenciát bíotrőf gombákkal (például penészgombákkai) szemben valóban, többek között a megnövekedett sejtfal appozíció okoz, ennek árán viszont nekrotróf gombákkal szemben nő az érzékenység [Jarosch et al., Mól. Plánt Miorobe Internet. .12, S08-514 (1999); Kumar et al., Pbytopathology 91, 127-133 (2001)]. Mivel HvRaoB csak a sejtfal appozícíöt befolyásolja., ez az ambivalencia megkerülhető.

A fenti megállapítások következtében RacB-t kulcs elemnek keli tekinteni patogennek, úgymint Bgh-nak a növényi sejtbe történő sikeres behatolása szempontjából. Ennek megfelelően·, a találmány szerinti eljárás rendelkezik az Mlo-hiány minden előnyével, ugyanakkor kiküszöböli annak egyidejűleg fellépő legnagyobb hátrányát, nevezetesen a megnövekedett spontán sejtelhalást.

Továbbá az. eljárás teljesítményben felülmúlja mindazokat a módszereket, amelyekben p-atogén-rezisztens fenotípust valósítanak meg rezisztenciát közvetítő fehérje túlzott kifejezésével. Egy gén kikapcsolása megvalósítható, fehérje (idegen) kifejezése nélkül. Ideális esetben csak az endogén gént keli dezaktiválni. Ez nem elhanyagolható előnyökkel jár a felhasználó megnyerésekor, akinek az idegen fehérjét tartalmazó növényekkel szemben gyakran fenntartásai vannak. Ebben az összefüggésben különösen előnyös indukálható promóter©k alkalmazása RacB fehérje mennyiségének, aktivitásának vagy működésének csökkentésére, amely •?S',3:5S/BS/PA2

Ί

a. '.j «« * 4 »«<

»· ♦ x ’ « X <

* - ·' V»*· A

Φ .·, * « * * X· ’w.* » például patogén indukálta promoter alkalmazása esetén csak akkor teszi lehetővé a kifejeződést, amikor arra szükség van (azaz patogén fertőzésnél;.

Az árpa RacB cDNS (HvRacB-cDRS) (GenBank AJ230240) részleges szekvenciáját, amely a rizs RacR (GenBank AF250327) és a kukorica RacB (GenBank AFI2S053) szekvenciajavai összehasonlítva nagyon konzervatív és nagyon hasonlít a rizs Racl-hez, mar leírták. Kukorica RacB is egyike az öt Rác génnek a fent említett bO 00/15815 közzétételi számú szabadalmi bejelentésben (3. számú szekvencia). A HvRacB fehérje teljes kódoló szekvenciáját eddig még nem írták le (1. példa). Az árpa RacB 95%-os homoiögíát mutat rizs RacB-vel és kukorica RacB-vel és 55% fölötti azonosságot humán RACl-gyel vagy RAC2~vel [Hassanain et ai., Bioohem. Bíophys. Rés. Commun. 272 (3j , 733---788 (2000)] (1. ábra). HvRaeB konstitutivan fejeződik ki az árpa primer leveleiben (epidermisz specifikusan) és kifejeződési szintjét lényegesen nem befolyásolja Sgh fertőzés. A kifejeződés tehát abban a szövetben történik, amely közvetlen kölcsönhatásba kerül a Bgh patogénnel.

A találmány szerinti eljárás elvileg minden növényfajra alkalmazható, előnyösen azokra, amelyekben RacB fehérje vagy ennek funkcionális megfelelője természetes körülmények között kifejeződik. Mivel RacB működése funkcionálisan szorosan kapcsolódik az Mlo génhez és az utóbbit számos növényben - beleértve kétszikűé két -- azonosították [Bevető et al., J. Bioi. Chem. 27% (49) _y34993-35004 (1999)}, feltételezhető, hogy RacB és homológjai hasonlóan széles körben elterjedtek. Az itt közzétett, a találmány oltalmi körébe tartozó RacB szekvenciákkal homológ, más növé78.3'S8/BS:/BM:

nyékből (például Arabidopsis thaiiana-böl) származó szekvenciák könnyen fellelhetők adatbázisokban való kereséssel vagy génkönyvtárak screeneiésével, a RacB: szekvenciákat felhasználva ρ o te & teé π ί. <.

A „növény kifejezésbe az itt leírtak szerint beletartozik a növények királyságából a magasabb rendű és alacsonyabb rendű növények minden nemzetsége és faja. A kifejezés felöleli az érett növényeket, magokat, sarjakat és magoncokat, az. ezekből származó részeket, szaporító anyagot, növényi szerveket, szövetet, protoplasztokat, kallasst és egyéb tenyészeteket, például sejtkultúrákat és bármilyen egyéb növényi sejtcsoportot, amely funkcionális vagy szerkezeti egységeket képez. Az érett növény kifejezés a magonoon túl bármilyen kívánt fejlődési stádiumban levő növényre utal. A magom korai fejlődési stádiumban levő fiatal, éretlen növényt jelent. A „növény gyűjtőfogalomba beletartozik minden egynyári és évelő, egyszikű és kétszikű növény és példaként - korlátozást azonban nem jelentve - a Cucurbita, Kosa, Vitis, Juglans, Fragaria,

Trifolíum, Trigonelia, Vigna,

Daucus, Arabidopsís, Srassi Capsium, Datura, Hyoseyamus,

Petúnia, Digitális, Majorana, Ciahoríum, Helianthus,

Asparagus, Antirrhinwa,· Heterocallis,

Paníeum, Fenniseéum, Ranunoulus, •-\Ή t -> c? ΑΛ ·*Ν S oj .•fz-s

-J '«/ o UO /

Citros, binum,	Geránium,	Manihot,
ca, Raphanus,	Sinapsis,	Atropa,
Lycopersicon, Ri	.cotiana,	Soiarium,

oacruca, »romos,

Pelargonium,

Salpigiossís,

Nemesis, senecio,

Cucumis, Browaalia,. Giyoine, Pi-sum, Shaseoius jlíÓu.z.uxS., or Ocij Z·eo, ,λ,ύ» dordeum, Secale, T rí f icam, Sorghum, hassa és Popuzur mOSSytE/RTE »λ.

· •V * >

A „növény kifejezés előnyösen magába foglal egyszikű haszonnövényeket , például gabonaféléket, úgymint búzát, árpát, kölest, rozsot, tritikálét, kukoricát» cirobot vagy zabot és cukornádat is.

A. kifejezés felölel továbbá kétszikű haszonnövényeket, példa u i

- a Brassicaceae családba tartozókat, úgymint oiajosmagvü repcét, canclát, zsázsát, Arabidopsis-t, káposztát» hüvelyesek közül szójababot» lucernát, borsót, babot vagy földimogyorót;

-- a Solanaceae családba tartozókat, úgymint burgonyát, dohányt, paradicsomot, padlizsánt vagy paprikát, az Asteraceae családból napraforgót, Tagétes-t, salátát vagy körömvirágot (calendula);

~ a Cucurbitaceae családba tartozókat, úgymint dinnyét, tököl vagy cukkinit;

valamint lencsét, gyapotot, kendert, lóherét, spenótot, lent, rózsaborsot, karottát, retket, répát, cukorrépát, batátát, uborkát, cikóriát, karfiolt, brokkolit, spárgát, vöröshagymát, fokhagymát, zeiisrt, földiepret, málnát, szedret, ananászt, avokádót és a különböző fa-, bokor-, dió- és szőlői.adókat.. A; előnyben részesített fafajok közé tartozik a szilva, cseresznye, őszibarack, nektárin, sárgabarack, banán, papaya, mangó, alma, körte és birsalma.

Szintén idetartoznak dísznövények» hasznos fák» díszfák, virágok, vágott virágok, bokrok vagy pázsitok, úgymint - korlátozást nem jelentve - például a Rosaceae család tagjai, úgymint ; rózsa, Ericaceae család, úgymint rododendron- és szeles-félék, űuphorblaceae család, úgymint mikulásvirág es kroton, •?S.35S/S£./M-2 ** ♦

Caryophyilaceae család, úgymint szekfű~félék, Solanaceae család, úgymint petúniák, Gesneriseeae család, úgymint afrikai ibolya, Balsamínaeeae család, úgymint nebáncsvirág, Orchidaceae család, úgymint orchideák, Iridaceae család, úgymint giadíolusz, írisz, frézia és sáfrány (crocusj, Compo-sitae család, úgymint körömvirág, Geraniaceae család, úgymint, muskátli, Liiiaceae család, úgymint dracéna, Moraceae család, úgymint fikusz, Araceae család, úgymint filodendron és sok egyéb.

Előnyösen a találmány oltalmi körébe tartoznak élelmiszerek vagy takarmányok céljára felhasznált növények, különösen előnyösen az egyszikűek közé tartozó nemzetségek és fajok, úgymint a fent leírt gabonafajók.

Az eljárást különösen speciálisan, egyszikű növényekre alkalmazzuk, legelőnyösebben mezőgazdaságilag fontos növényekre, úgymint búzára, zabra, kölesre, árpára, rozsra, kukoricára, rizsre, hajdinára, cirokra, kritikáiéra, tonkölybúzára, lencsére vagy cukornádra.

A „oatogén-rezisztencia autogénnel történt fertőzést követően egy növény betegség-tüneteinek csökkenését vagy gyengülését jelenti. A tünetek sokfélék lehetnek, de elsősorban azokat értjük ide, amelyek közvetlenül vagy közvetett módon korlátozzák a növény minőségét, hozamát, alkalmasságát élelmiszerként vagy takarmányként történő felhasználásra vagy más módon, vetését, ültetését vagy a termény feldolgozását nehezítik meg.

Pstogén-rezisztencia „átadása, „fenntartása, „létrehozása vagy „növelése azt jelenti, hogy egy bizonyos növényfaj vagy változat védelmi mechanizmusa egy vagy több natogénnei szemben — '?S.333./BE/RM a ta iáimén y szerinti eljárás alkalmazásának köszönhetően — fokozódik a növény vad típusához (az „eredeti növényhez) képest, amelynél nem alkalmaztuk a találmány szerinti eljárást, egyébként azonos körülmények (úgymint például klimatikus viszonyok, növekedési feltételek, patogén fajok és hasonlók) között. A megnövekedett rezisztencia előnyösen a betegség-tünetek ősökként kifejeződésében nyilvánul meg, ahol a betegség-tünetek - a fent említett korlátozó hatásokon kívül - felölelik még például a patogén behatolási (penetrációs) hatékonyságát a növénybe vagy növényi sejtekbe vagy a szaporodási hatékonyságot a növényben vagy a növény felületén. Ebben az összefüggésben a betegségtünetek előnyösen legalább 10%-kal vagy legalább 20%~kal, különösen előnyösen legalább 40%-kal vagy 60%-kai, még előnyösebben legalább 70%-kal vagy 80%-kai és legelőnyösebben legalább S0%kai vagy 95%-kal csökkennek,

A „kiválogatás olyan növényekre vonatkoztatVa, amelyekben az eredeti növényhez képest a rezisztencia legalább egy patogénnel szemben fennáll vagy megnövekedett, felölel minden olyan módszert, amely alkalmas patogénnel szemben fennálló vagy megnövekedett rezisztencia felismerésére. Ezek lehetnek patogén fertőzés tünetei (például penészgombás fertőzés esetén hausztöria kifejlődése), de jelentheti a fent említett, a növény minőségére, hozamára vagy élelmiszerként vagy takarmányként történő alkalmazására vonatkozó tünetek megjelenését Is.

A találmány oltalmi körén belül a „patogén kifejezés - korlátozást nem jelentve ~ utalhat például vírusokra vagy víroldokra, baktériumokra, gombákra, állati kórokozókra, úgymint például •7$.25S/SS/a&3 rovarokra vagy nematódákra... Különösen előnyben részesülnek a gombák, úgymint például penészek. Feltételezhető azonban, hogy RacS fehérje csökkent kifejeződése, aktivitása vagy funkciója más patogénekkei szemben ís rezisztenciát eredményez. A sejtfal szerkezetben bekövetkező változások alkothatják a patogén-rezisztencia elsődleges mechanizmusát.

A következei patogének. említhetők korlátozást nem jelentő példákként:

1. Gomba vagy gomba-szerű patogének:

Gomba vagy gomba-szerű (például Chromista) patogének előnyösen a Rlasmodiophoramycota, Oomyoota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Sygomyoetes, Basidiomvoota. és Deateromyeetes (imperfekt gombák) csoportokba sorolhatók. Az 1. és z, táblázatban említett patogének és a velük Összefüggésbe hozható betegségek például szolgálhatnak, de nem jelentik az oltalmi, kör korlátozását.

1. táblázat: Penészgombák által okozott növénybetegségek

Betegség	Betegén
Barna roz sdá s odá s
S á r g a r o z s d á s o d á s	R. st rííforrnis
Pillangósok lisztharmata	rrysíphe gramínis/Biums.ria graminis
Toklász foltcsodás	Sectoria 77odoru?n
Levélszáradás	Ss'ptcria tritici
Kalász fuzáriózis	Fusaríum: spp.
S zártőbetegség	Pseudooercosporeilő herpofrichoío’SiS
Porüszög	Ustddago spp.
Bűza-kőüszög	Riiietia caríes
Feketelábűsácj	Saeumannomyces gráciáié

73.353/3S/JSO e

ΦΦΧΦ

; An t ro kndz isós	Col let cseri chum graaunicoie
1eveihervadas	(teleomorph.: Glomerelia gramrnáooáa
i Antro knd z í so s s zár ro thadás	Politis); Glomerelia tuccmanensis {anamorph: Glomerella faIcatűm íven t)
Aspergillus okozta kalászos magrothadás	Aspergíilas flsvus
Sávos levél- és	Miizocteuia eolani Kuhn -
héj foltosodás	Ahizoctonia microseierotia J. Matz
i rizoktdnía)	(telomorph; Thanazepharus cuecmerisd

Fekete csornósodáe.	Acremoninm strictazi ÍA Gáms Cephalosporinm acr^sonium Auct. non .^o -'VX.b¹ V· Λ A<.Vk
Fe ke t e ma g r. o t fa ad á s	““ ; p ~ ” g ; x-aszadapdoaza fneooromae ~ Botrycdiplodia theodromae

Barna foltosodás (fekete foltosodás, szárrothadás;	Bhyscderma maydis
Cephalosporium okozta	Acremcnium. s trió tűm ~
\|magrothadás	Cephaiosporium seremen ram j
Szenes r öt h adá s	Fzaercpho:3Í na pFaaenaina \|
1Co rt ίci um. okozta	Ahanatépdőrse cacuseris ~ i
j k.e..ísszror.:’\dG8.s	Corticiam sasokói \|
I	e cíiítv n a ti x a a a F a v0 uűe / P < >
\|	eragrrostidis, - C. Krcalans í
\|	(teleomorph: Cochíioholus eraorostidlsl , G'uryularia InaeqiíallSs C. íntermedia
LCurvularla okozta	(teleomorph: Coohlioholcs
\|levéltoltosodás	in termed!usj, Carvularáa furata (teleomorph: Coehiiobolus íunatosd, Curvuiaria pallescens (teleomorph: Coch.liobolus paliescersj, Cnrvüiaria senegaiensis, G. toberculsta (teleomorph: Coch.1.1 odol us tuhercula tus).
Didymella lew, ’ -ritosodás	Oidymeils exitaiis
Dipiodia okozta kalász-	Diplodia fru.me.nti (teleomorph:
rothadás és számot hadás	BotxTosphseria fostucao;

Diplodia okozta űcalászrothadás, szárrothadás, csírarothadás és magom hervadás	Diplodia maydzs ~ Stenocarpeila mayáit
Diplodia -okozta levélfoltosodás vagy levélősíkos odás	őtsrooavpella mscrospora ZJ.pl odra 1 a a f sí a c r o sp o r a

£, táblázat: Lágyrothadások (hamis lisztharmat)

Betegség-	Patógán
Barna csíkos lágyrothadás	Sclerophthora rayssiae var, zeae
Gyenge felszíni lágyrothadás	Soiergphthora maorospora Őclerospora macrospora
Zöld kalász iágyrotbadas (graminícolás lágyrothadás)	Sclerospora graminiooia
Kávé 1ág y r o tha d á s	Peronoscierosgíora maydis ~ Bclerospora maydis
Fülöp·-szigeteki lágy rőt hadás	Peronoscierospora phil.ippi'.nezfsis « Selerospors phiiippi-nensis
Cirok lágyrothadás	Peronoséi erespora sorghi Selerospora sorghi
Spontaneás lágyrothadás	^Peronosolerespora spontanea ~ ^Sclenospora spontáné®
Cukornád lágyrothadás	:peronescierespora sacchari «=· ^Solerospora sacehari )
iSzáraz kalászrothadás (cső-, mag-- és szárrothadás)	Pigrespera erysae (teleomorph: Khuskia oryzae)
Kismértékű kalászrothadás	Altemaria alternata - é. tapuís áspergilivs glancra, A. néger, áspergilins spp., )3'otryti.s cinerea (teleomorph: Detnyotinis fuekeliana}, Csoninghameila sp., Curvelaría pallescens, Doratomyces steaíonltis « Cepk a lót ri ch nm s temen í t i s , Fnsarirm culmornm, Gonatohotrys sígpiex, Pithomyces maydicus, Pnizepus zzicrosporns Tiegh., P, stolonifer - P. nigricans, Scöp.ö2ariöps.i,s Drnmptii

Ergotizmus ílőfog, varjúké”	Ciaviceps gigántea
rörrd	(atamorph: Sphaceiis sp.)
Pettyesedés	Aureobaeidiu® zeae « Fábatrelia
	seae-
Fosarium okozta kalász- és	Ft sárium suhglutinans·
szárrothadás	F. motilrrcrme var.subgiotitans
Fuser ium okozta meg-, gyb-	Fu s a r i um m on z 1. i f o rm e
kér- és szárrothadás»· csira-	iteleomorph: Gz.bfceze.L2a
rothadás és magonchervadás	íujiku.roz/
Füserium okozta szárrothadás	Fusa rzum avenaceum
és magoncgyckér--·rothadás	íteleomorph: Gzbfoez'lla avenaceá)
Gi bee re 11. a okozta kalász- és	Gl.hberel J a z ea e
szárrothadás	(unauiorph; Fu ue ru un; granunearun;}

Soferyo-spneerrs zsse Physa1ospor« zeae (anamo rph Ma'cr'ophojK» zeae) | üercospora sorcrni - Ci sorgtz

Szürke kalászrothadá

Szűrre tévéztoltcsodás

{Ce.rcospo.ra levél rol.tos<	>dá s)	ivar. maydrs.	C. zeae-magt
Helmínthosporium okozta	gyö-	*Fxserohi2um	pedicellatűm
kérrőthadas		l&eiriinthospc	rium pedicel
		i (teleomorph:	Setosohaszoú

(pedrceila ta)

Hormodendrum okozta kalász--	Ciadosporium cladospozuoldás - J
rothadás	Fonsedezidruzi cradosporiozdes, G.
(Cladosporrumos rothadás)	nerbarum (teleomorph: \|
	Mycc-spháie.re.22.a tassiana)
Hyarothyridium okozta levél-	Hyai o thyridr a® maydás
roltosodás
Késői hervadds	Cephaloepori .um maydrs

rí·,

Ji »*♦> ♦·* ]jAlternsria a 1cérna ta,

; .	A. zeicola, Bipoláris victoriae
	- Felninthosporium victoráae (teleomorph: Cochliofcolus vic'feoráa'-e,l·, C. setivus (anamorph; Bipoláris sorokiniana - Bi sorokinienum - B. satlvum), Bplcocciw- nigruzp
Kismértékű revélfoltosodás	Bxserohiiua? pro!arum ~ Breohsiera prolafca (teleomorph; Setosphaeria prcdataj Graphium pénzeiillőides. Lept csphaéri a maydi s, Léptofchyri um zeae., öpn i o sph a e re .21 a he rpo fc r i oh a, (anamorph; ScoiecosporielJa sp.) Parap/iaeosphaeria miohotii, Fhoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina
Északi gabonalevél-vész (fe-	Betosphaeria túréica (anamorph:
hér fonnyatíás, koronás szár-	ExseroLiium turcicum ~
rothadás, osikosodás)	Beim in thospori um turcicum)
Északi gabonalevél-	Cdchl.io.bolus oarborum (anamorph:
foltcsodás, Heiminthosporiom	Bipoláris zeioola -
kalászrothadás (1. fajta)	nslrninChosporium carbonum)
Fenicillium okozta kalász-	PeniciIlium spp. , F.
rothadás íkékpenész)	chrysogrentHs, P, expansa, F. oxalzcnm
Phaeocytőstroma okozta szár-	:Ph.3eocy test roma amfiguum, «
és gyökérrothadás	iPhaeocytosporeila zeae

7S. 35S/BBZR3VÍ »♦

Phaeosphaeria okozta levél-	Phaeosphaeria maydis «
foltosodás	Sohaerülina msva 1 s
Physalospora okozta kalász-	Bot.'.ryosphaeria fescoeae ~
rothadás (Botryosphaeria	Physalospora zeicola (anamorph:
okozta kalászrothadás)	Fiplodia áraménti;
Biborszínű levélhéj	Hemiparazita baktériumok és gom-
	bak
\| Pyrano-chaeta okozta szár- és	Fboms férrés trés —
{gyökérrothadás	Pyrenoohaeta terrestris
\|Pythiuni okozta gyökérrotha-	.Fythism spp„, P. arrhenoffisnes,
dás	P, grazié ni col a
Pythlum okozta szárrőthadás	Fythlazi aphanidez'metum -
I........................................................................................................	p ryr? ' 7 zn y ·>’ 7, JF vw.u-kU·.! ·χ%ί_:
(Vörös mag betegség (kalász	7 ΌΌCs71*7 Π 7 '’?7’'7
^penészedés, levél- és csira-
rothadás
Rhlzoctonia okozta kalász-	Rhizootonia zeae (teleomoron:
rothadás	itta i t ea o i roi na ta j
(szkleróolés rothadás)
Rhizootonia okozta gyökér-	Bbázoctcnia soiani, Fhizoctenia
és szárrothadás	zeae
	Aiternaria aiternsta, Cerco-spora sorghi, Fictochaeta fértilda. Fuss rima accminatusi (teleomorph: Gibbereiia aouminata? , F. egeiseti (teleomorph: ök intricans;), F. oryspormm.
Kismértékű gyökérrőthadások	F. paliidoroseum, F. poae, F, rcsewa, d, eysnogena, (anamorph; F. suipöürsum,) Mé credo eh lázi bolleyi, áínoor sp. , Periconia circénata, Phytcphébere esctorom, P. dreehsierí, P. nicotianse var. parssdtiea, Rb1zopus arrh árus

73'.3S8/SS/K&2 *<c-

Rostratum-os levélfoitosodás (Helminthosporium okozta ie- vélfcetegség, kalász- és szárrothadás	Setospha éri a rostra ta (anamorph: Fxserohilum rostratűm - Beleinthcsporium rostrafűm)
Közönséges gahona rozsda	Puccini a sorghí
Déli gabonarozsda	Pucclnia pelysóra

I Trópusi gabonarozsö ihysopezia paizeseens, st zsae ángtopsora zeae Sói éra ti am roifsií Sacc.

(telecmoroh; Átkelia roifsii) |S'-cI.erot.ium okozta kalászI rothadás (déli hervadás)

Cs ira ro thadás, magonovész

Bipoláris sorokíniana, B, zeicola ~ Beisunthosporinm carOorrn, Pi'plodia mayáis, FxserohiiiZK pedi ellistám, Fhserohilam tsroicum ® Heimipthosporius! túróisom, Fusarium avensceus, F. ooimo.rum, Ρ» ooniliförme, Gibberelia zese (anamorph: F. gram!reáromi, Macrcphomina- phaaeolina, Feniciilium spp., Féomopsís sp._fPythium spp., Bhizootonia soiani, F, .seae, Soie.roti;rs roiísii, ,Spicari« sp.

(Selenophoma ievélioltosodás

Se ienop berniéi sp.

(Héj (tok) rothadd éaaumannomyces graaims

(Déli gabonaIévé1-he rvadás (szárrothadás

Cachlicbolur heterostrophus ( (anamorph: Bipoláris msydis Beírnin thospcri um mayái s}

78,3£8ZBS/RfcZ »5

ŐZ

Főleg a következőket részesítjük előnyben:

- Pl.asiRod'lophoromyco'ta úgymint Plásmodíophore órassicae (káposzoagolyva, keresztesvirágnak bunkóé gyökere), Spongospora subterranea (burgonyegumő varasodéba) , Poiymyxa graminis (gabonák és fűfélék gyökérbetegsége).

- Oomycota úgymint Bremia lactucae (hamis lisztharmat salátán) , Peronospora (hamis iisztharroat) orosziánszájón (P. antirrhini), vöröshagymán (P. destrncfcor) _f spenóton (P. «fiúsa), szójababon (P. manchurica), dohányon („kékpenész; P. tabaoinaj lucerna és lóhere (P. trifölium) ; Pseudoperonospora huiauii (ha73.353/SZZMt mis lisztharmat komlón), Plasmopsra (hamis lisztharmat) szőlőn (bt vifcicola) és napraforgón (?. haisfcedíi), Solercphtohra macrospora (hamis lisztharmat gabonán és fűféléken), Pythium (csirarothadás, palánta kirohadás és gyökérrothadás minden növényfajnál, például P. debaryanum okozta cekiapalénta kirohadás) , Phytophthora inbeatans (káposztarothadás, burgonyavész, barna rothadás paradicsomnál és hasonlók), Aibugc spec. (fehér rozsda keresztesvirágú növényeken) <

- Ascomycota úgymint MicrodochiüxT< nivaie (hopenész rozson és búzán), Fasarium gramrnearum, Fusarium calffioru® (részleges kalász sterilitás, főleg búzán), Fusarium ozysporuss (paradicsom füzérrumos hervadása), Slumeria gramínis (lisztharmat) árpán (f.sp. hordái) és búzán (f.sp. tritici)), Frysíphe pisi (zöldborsó lisztharmat) , iVectría galiigera (gyümölcsfák ragyásodása) , Fncinula necator (szőlő lisztharmat), Pseadopeziza feracheipniia (szőlőorbánc), Claviceps purpurén (anyarozs - ergotízmus, főleg rozson és füféléken), ^aeKmánnornycea graminis (íeketeiábűság búzán, rozson és büféiében), (ká^áporthe grisea (rizs fonnyadásos betegsége) , Pyrenophora graiüinea (árpa levélcsikosodás) , iörrenopfíora teres (árpa hálós foltosodása), Pyreiaophora triticirepentis (búza levélfoltosodás), Ven túrra rnaeguaiis (varasodás almán) , Scierotinia sclarotiwK' (fehérszárúság, szártörékenység) , Pseudopeziza medicagin.Ls (levélvarasodás aibalfán, fehér- és vörösherén).

- Sasi.diomycetes úgymint Typhuin inoarnata (typhulás rothadás árpán, rozson, búzán), dstilago maydis (goiyvás üszög kukoricán), Ustilago auda (porüszög árpán), Űstiiago tritici (porüszög 73'. 35S/3S/SM ♦ ♦ * ’í búzán, tönkölyön), üstiiago avenae (porüszög zabon), PhizGdonia scdani (rizoktóniás gyökérrothadás burgonyán.· , .kohaoelotheca spp. (cirok fejes üszög), .íkélampsora lini (len rozsdásodás) , .Psocinia cramlnis (fekete rozsda, búza·--, árpa-, rozs- és zabszáron; , Puccinid recondica (levéirozsdásodás búzán.) , Puccinia dispersa (barna rozsda rozson), Puccini# hordd (levéirossdásodás árpán), Puocinia coronata (korona rozsdásodás zabon), Pucciula sfcr.iifo.rmis (sárga rozsda búzán, árpán, rozson és számos fűfélén), öromyces appendiculatus (barna rozsda babon), Scierctium rdfsii {sokféle növény gyökér- és szárrotbadása).

- Deuteromycetes (Fungi imperfecti) úgymint Seproria ncdorum (polyvaievél bámulás) búzán (Sepúoria fritici} , Pseudocerccsporeila he.?rpot.r.íc.áoldes (szártöbetegség búzán, árpán, rozson) , Pynchosporiam seoaiis (levél folt-csodás rozson és árpán), Aifernsria sciund (burgonya és paradicsom alternáriás korai elszáradása), Fhoma befcae (cékla gyökérvész), Ceroospora .feeticole (cékla cercospórás ievélfoltosodása), álfcemaria brassicae (repcebecő-rontő, fekete foltosadás káposztán és más keresztesvírágú növényen), Vérticiiiiúm dáhiias (verticí Hiúmon hervadás, repcehervadás és -szárrothadás), Colletotrieh um iindemutAlanum {hüvelyfoltosság babon), Fhoma lingae (feketelábűság káposztán és gyökérnyak” vagy szárrobhadás repcén), Bctrytis odnerea (szürkepenész szőlőn, földiepren, paradicsomon, komlón és hasonlókon).

Leginkább előnyben részesítjük a Phytophthora infestans (ká~ poszbarothadás, burgonyavész, barna rothadás paradicsomnál és hasonlók), éílcrocochium nívsJe (korábban Fusarium nivaie; {hópenész rozson és búzán) , Fusarínm graminearnm, Fusarium cnlmorum 78.353/BS/Wi

««* Ü»» ♦ Μ* >

(részleges kalász sterilitás, főleg búzán), Fusaríom oryspornm (paradicsom fnzárlumos hervadása), Biumeria gramánis (liszthsrmat) árpán (f.sp. hordái) és búzán (f.sp. tritici), i^ágnapo.rt.he grdsea (rizs fonnyadásos betegsége), Scierotinia scierotivm (fehérszárúság, szártörékenység) , Septoria nodorum és ásptoria trióiéi (polyvaievél bámulás búzán) , Aiternaria brassicae (repcebeco-rontó, fekete folt-csodás- káposztán és más keresztesvirágú növényen), Phoma iingam (fsketelábúság káposztán és gyökérnyakvagy szárrőthadás repcén) fajókat.

2. Bakteriális patogének

A 3. táblázatban megnevezett patogének és az azokkal kapcsolatba hozott betegségek példaként szolgálnak és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását.

3. táblázat: Bakteriális megbetegedések

Betegség	Patcgén
Baktériumos levél- dervadás és szárrothadás	Psendomoras a vénás s-ub-sp. svesae
baktériumos levél- fdtosodás	áánthononas campestria pv. holaicala
baktériumos szárrothadás	Kcterohactsr dlssóivers ~ Br mi η 1 a. dús so .1 ven s
Baktériumos szár- és felszíni rothadás (feketeiáhúság)	Brminia oarotovora subsp. carotovora, Eminía ohrysanthemi pv. zeae
Baktériumos csíkosodás	Pseudomota s andropogonús
Csokoládéioltok	Pseudorsonas nyringae pv, coronafacíens
Goss-félé baktériumos hervadás (levél szeplősödét és hervadás)	Ciavibaeter michiganentit subsp. nsbraskersis ~ Corynehacteriuó michúgstnense pv. andnebraskensé

?S.z5s/SS/aA2 ·Μ·

(„achapparramiento, ku~ j j korica satnyaság, Mesa I |

Central vagy Rio Grande | I kukorica satnyaság) | !

Különösen előnyben részesítjük a következő patogén baktériumokat:

Corynebaoterium sepedonicum (burgonya baktériumos gyűrűs rothadása) _r brvdnia oarotovora (burgonya feketelábúság)_r Ezwinia arnyiovora (tűzeihalás körtén, ai>án, birsalmán) , dt.reptomyoes soabies (burgonya varasodás), Pseudomonas svríngae pv. tabaci (baktériumos dohányvész), Pseutíomonas syzingae pv. phsseoiicoia (törpebab zsírtóltosodás) , Pseudomonas syringae pv. tornatö (paradicsom „bakteriális szaionnásodása), Xanfhomonas cumpestris pv. m-a-lvaceaziZR- (bakteriális levélfoltosodás gyapoton) és Xánthosionas eampesáris pv. oryzae (bakteriális rothadás rizsen és egyéb füzeiéken),

3. Virális patogének;

„Virális patogének közé tartozik minden növényt fertőző vírus, úgymint például a dohány vagy uborka mozaik vírus, gyűrűs foltosság vírusa, nekrózis vírus, kukorica csíkos mozaik vírusa és hasonlók,

A patogéneket és a velük kapcsolatos megbetegedéseket a 4. táblázatban foglaljuk össze. Az itt felsoroltakat példaként említjük, nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását. 78,/58/SS/SAS

4. táblázat; Vírusos megbetegedések

(Brazil kukorica mozaik}	(CCVBV) j
Kukorica letális nekró- 2Í.S3	Vírus komplex: A} kukorica sápkóros márványosodás vírusa (MCMV) és B) kukorica torpülés mozaik vírus (MDMV) :A. vagy B vagy Wheat strea.k isosaio vírus (WSMV - búza csikós mozaik vírus)
Uborka mozaik	Cucumber mosaic vírus (CMV ~ uborka (mozaik vírus)
Cyncdon sápkóros csíkok	(Cyncdon ohiorotic streak vírus (CCSV)
Johnson-fű mozaik	Johnsongrsss mosaic vírus (J5MV)
Kukorica bokros satnya- sága	(Mycoplasma-I.íke organism (MLö) (mi köpiaama-szerű szervezettel kaposc- latos
Kukorica sápkóros tcrpü- lése	(Maize chlorotic dwarf vírus (MCDV ~ kukorica sápkóros torpülés vírusa)
Kukorica sácköros márvá- nyesoáás	Maize ohiorotic mottle vírus (MCMV ~ (kukorica sápköros márványosság vírus)
Kukorica torpülés (moza- i	Maxze dwarf mosarc vírus (MDMV - kukorica csíkos mozaik vírus) A, D, E és F törzsek
!Ku korica 1évé1fο1tosodás	Maíze leaf fleck vírus (MLFV ~ kukorica levélfoltosodás vírusa)

?8.38e,'WRA2

nőm csikosodás betegség)
'Kukorica levél vörösödét és vörös csikosodás	Moliíoute
; Ru kori c a vörös esi kos o- cia.s	Maize red stripe vírus (MRSV - kukorica vörös osikosodás vírusa)
Kukorica gyűrűs márvá- inyosság	Maize ring mottle vírus (MRMV ~ kukorica gyűrűs márványosság vírusa)
Kukorica rio IV	Maize rio cuarto virus ÍMRCVj
Kukorica durva torpülés (nanismo rnvido)	Maíze rough dwarf vírus (MRDV - kukorica durva törpülés vírus, gyökérhajtás betegség vírusa.)
Kukorica steril satnya- ság	Kukorica steril satnyaság vírusa (sárga barázdás árpa vírus törzsek)
Kukorica csikosodás	Maíze sfreak vírus (MSV ~ kukorica csikosodás vírusa)
Kukorica sápkóros csikó- sodás (maize hója bianca)	Kukorica, sapköros csikosodás vírusa
Kukorica satnyaság	Kukorica satnyaság vírusa
Kukorica címer elhullás	Maize tassel abortion vírus (WAV - kukorica címer elhullás vírusa)
Kukorica érkinövés	Maize vein enation vírus (MVEV - kukorica érkinövés vírusa)
Kukorica „fcengurufül	Maize wallafcy ear vírus (MWEV ~ kukorica „kengurufül vírus)

78.358 ZBS/RR.

:

|Kukorica fehér leve [•Kukorica fehér vonalká [zódás mozaik [Kukorica fehér levél vírus

[Zab pszeudo-rozetta vírus (zakuklivaníe) [Zab steril törpülés

sterilé dwarf vírus (OSDV ~ zab [steril törpülés vírusa)

Rizs fekete csikós tör

Épülése ruí;« uííscá.*'» uxscbwu uwai x v iiuc (RBSDV - rizs fekete csikós törpülés vírusa)

R. i. z s c s ί κ o s oda s

Írok mozaik

Cukornád Fi j í-betegség

Ri.ce stripe vírus (RSV sodás vírusa)

Sorgnum. mosaic vírus (SrMV mozaik vírus) (sugarcane mosaic vírus (SCMV ^::: cukornád mozaik Η, I és M törzsek is)

Sugár carte Fájl disease vírus (FDV cukornád Píji-betegség vírusa)

C u kom a d mo z a i k

Sugarcane mosaic vírus (SCMV ^::: cukornád mozaik vírus) A, B, D, E, SC, SC, Sabi és M3 törzsek (rádöbben: MDMV-B)

Búza folt-mozaik

Wheat. spot mosaic vírus (WSMV ~ búza

X Οχ X ΧΠΟ XciX K v xX 'X3

4. Állatok okozta károsodások

4,1. Rovarpatogének

A következők említhetők korlátozást nem jelentő példaként: rovarok, úgymint például, bogarak, hernyók, tétvek vagy atkák. Előnyben részesített rovarok a következd nemzetségekbe tartozók: •Soleopters., Diptera ,· Bymenoptera, .Lepidoptars , éfeJ..hophsga ,· ?g.35§/BE/SM » jy* »> « * Ρ » φ .* ί

Romgpte.ra, Hesiptera, Ort.hopfera, Thysancptera, Dermaptera, Jscptera·, Ancplura., Siphonapfera., Tricboptera, stc. Különösen előnyben részesített rovarok a Coieoptera és fepídpptera nemzetségekbe tartozók, úgymint például az európai kukoricamoly (European corn borer ~ SCB), biabrotica barósri (északi kukorica gyökérféreg), Diabrotica undeoímpunctata (déli kukorica gyökérféreg) , Bisbrotios virgífera (nyugati kukorica gyökérféreg),

Agroci	s ipaálon (fekete	bagói	yprrre	hernyój é		Crymod
_{v v} _ .~ A. oe >,- a i.	a tor („üvegféreg),	Λ e j. <, a. a	docens	\ /íÁVi-O c?	kos	“5 r·- y' ff
Agroti	s giadíarra (agyagosáé	tű bac	tolypille	hernyój	bA í f	Melenot
spp«,	Aeoius mezlílzus (drót	féreg)	f Ά&Ο	sáros	(bű	za drötfs
reg),	fíoristonctus ubierii	(homoki drót	féreg),	Sphenopbor

maidra (kukorica poloska), gpáengphoras zeae (timótíű poloska), opneBcpnortrs psrvmus (réti. perte poloska.) o on e n oono ra s caiiosus (déli kukorica poloska) , Phytlogphags spp. (fehér lárvák) , Anurapbis ^aidiradJ.ois (kukorica gyökér tetű) , Bélié piaturís (vetőmag féreg) , Cölaspis brunnea (szőlő coiaspis; , Stenoigp(u.,,s lecontei (vetőmag bogár) and Clivinia impressífrons (vetőmag bogár),

Egyéb példák: gabona fűbogár föidesa A^/slsnopus), fritlégy (Oscineilu brit}, drót férgek (Agrotis Jíneatu-s) és íevéltetvek (úgymint például a zab levéltetű Khgpalosipbüm padi, a feketeribiszke levéltetű Sitobion avénae).

4.2. Komatődák

A patogéneket és a velük kapcsolatos megbetegedéseket a 6. táblázatban foglaljuk össze. Az itt. felsoroltakat példaként említjük, nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását.

?s. áss/ss/mu ** *

X *

6. táblázat:· Parazita .nématódák

Dltyjenen vs drpsaci

iGumó- vagy szár-fonalynkacsosodás Clszfás férnesedés (zab •uarerooera avenae, n, zeae, (Puncsodéra chalcoensia

Hamis ovoKér (Xlpó irama spp., X, |$-edl terraneum (dacobbua dorsaiis a ííí a r i c.a n ι® , X.

(Láncé (szúrás), Columbia LHcnlodaimüs columbus

Láncé |h\5plola.üríUiS; spp., H. galeatys lázié í;

Pratyiencáus spp., P. bracny-nírus, creratus, 3, bexircisus, P. jnegiectus, 3. penetrans., 3. Lscribneri, 3. fhornei, 3, zeae (Tüszúrá Gyűrű

Gyökérgubacs betegség jlorgidorus spp., L. brev.lannüiafcms

(Pfeícldocvne spp,, d, chítwoodi, M.

• 'ÍS fF'h i· ΐ «i. Ii

I zrcopu körkörös (spirál rosodás ₍Fnllánkos ^TömpeT^yöker ) ká- |HeIlcetylencbus spp.

iBeloncladmus spp., .3. Jo.ngáconjokri’a,s

Paratrichodorus spp., 3. ciriatiai 3, miror, guinlsulcius acatus, Trichodorrs spp, (Satnyaiás

Syleneborbyrcbus duöius

Különösen előnyben részesített fajok a Globod&xs rostochier sia és GL palllda (burgonya, paradicsom, és más Solanaceae nővé nyék eísztás férgesedése), Seterodera schachtíí (répa cisztá fonalféreg cukor- és takarmányrépán, olajos repcén, káposztán é ?

< *

ν., hasonlókon) , Heterodera avena© (zab císztás fonálféreg zabon és más gabonaféléken), űityiencbus dipsaci (gumó- vagy szár-fonálféreg, rozson, zabon, kukoricán, lóherén, dohányon és répán), Angolna trifcici (búza fonálféreg, búza (tonköly, rozs) golyóüszög betegsége), ^feloidogyne hapia (sárgarépa, uborka, saláta, paradicsom, burgonya, cukorrépa, lucerna gyökérgubacs nematódája) .

Példák előnyben részesített penészgomfoa vagy vírus patogénekre az egyes növényfajták esetében:

1. Árpa:

Penészgomba, baktérium és vírus patogének; Pucolnia graminis f.sp. hordái (fekete rozsda árpa szárán), Blumeria (Srysiphe) gramirls f.sp, dordei (árpa lágyrothadás}, árpa sárga törpüiés vírusa (8YDV),

Patogén	rovarok/nematódák:	□strinia	nublialis (e	:uropai kuko-
ricamoiy);	.Agrobis	ipa!ios	(fekete	bagolylepke	hernyója);
Schlzaphis	graminiffi	(zöld	poloska)	; Slissus	ieuoopterus
ieucopterus	(amerikai	búzarontó	féreg);	Acr-os te rn um	éllare (zöld
bűzpoloska);	Pnschlsfus servas	(barna )	bűzpoloska)?	Deiiaplatura

(vetőmag féreg) ; Aayetioia destructor (Hessian. légy) ; Petrobia latens (barna búzakukac}.

2, Szójabab:

Penészgomba, baktérium és vírus patogének: Phybopáthora megasperma fsp. giycínea, daorophoüina phaseoiina_z Ahizoctonia solani, Sclerotlnia a cl ere ti erűm, Pusarium öxysporwK, .Díapcrfhe phaseo.forum var, sojae (Pöomopsls sojae) , bisporthe phaaeolornm var. canlívorá, Scierotium rolfsií, bercospora kíkucháí, Cercospora eojins, Peronospora ®anshürica._z Collstofcrichiüa demaüium “8.358/SS/BAS ·« »

φ χ·«· ♦ κ (Colletotrichí® truncatu®) ·, Corynespors cas.siíoola_z Septoria glycínes, Phyilosticta sojieola, Aitaznaria álternata, Pseudömonas- syringae p.v. glycínea, kárthomonaa casjpestris p. v. phaseolí_z Microsphaera diffassu, Fuearíum seaítectas, PhialcpAora gregaia, szójabab Mozaik, vírus, Gíomereiia glycínes, dohány gyűrűs foltcsodás vírusa, dohány csikosodás vírusa, Phakcpsorapachyrhizi, Pytbium aph.anld.erm.atm._z Pythiu®. ultóműm, Pythium debaryanu®., paradicsom. foltos hervadás vírusa, Peterodera giycines, Fusaríu® soiatí,

Patogén rovarok/nematődák;: Preudopiusia i&cludens {szójabab araszoló lepke hernyója); Anticaraía gemmatuíis (bársonyhab hernyója); P.j.a tájpera soa.fera (zöld lóhereféreg) ; őstrínia nubíiaiis (európai kukoricamoly); Agrotís ipáilen (fekete bagolylepke hernyója); Spodoptera exígua (répa bagolypille lárvája); Helíothis virescens (gyapot bagoiypílle hernyója) ; Helicoverpa .zea (gyepottok-moly); Epilá-chhá- varíveatía (mexikói bab-bogár); Eyzus persicae (őszibarack zöld levéltetű); Pmpoasca fabae (burgonya levélbolha); Aerosternu® hílare (tőid bűzpoloska); Meianopius femurrubrum (pírosiáhü sáska) ; Pfelanoiolus dífferentiaiís (differenciál sáska) ; Hyiemya piatúra (vetőmag féreg) ; S&ricothrips variábilis (szójabab tripsz); fhripa tabaci (hagyma tripsz); fetranyehas túrkéstani (földieper pókszerű kukac); fetranyebus u.rticae (kétpettyes takácsatka) .

3. Canola uenészgomba, baktérium és vírus patogének; ái.bugo cardida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, PhízGctojiia solani, Scierotinis scíerotíorum, Mycospbaereila bras.siccole_z

73.353/3Z/MS ♦ «ί X

Py tinóm ultimum._z Peronospora parasztiba.

él térvárrá aiternata.

4. Lucerna

Penészgomba, baktérium és vírus patogének: Clavzbater mzchi?a.nese subsp. znsidzosum,· .Py tinóm uitimumz Pythzum irregulars, ythiurn débaryanum, Pytóíum aphanidermatum, ?er®a, Peronospora trífoliorum, Phoma .céda ca génié var. .medicaginis, Cercospora medicagz nis_z Pseudopezisa medícegínisz Leptotrochi.la sedicag.inásg .Pusariumy Xanthofflonas campestria p.v. aifaifae, épharogyces euteiches, Sterphylíum herbarusp Ste^hylium alfái fa e.

5. Búza

Penészgomba, baktérium és vírus patogének: Pseudomonas sjzr ingáé p.v. atrofáciensz drocystis ayrcpyríz Xantbomonas transluoens,· Pseudomonae syrlngae p.v, syr.ir>gae₇ s J. á üs v CíZ •^Cxö.^ü'O ?<<£ v ~

ganese	suesp. w:

Pythium	splendens/.
Ph y £ cph	Ϊ/1Ο.2Γ&* rfiÖÍ/i;

Caznpestrj.5 p.

élternaríő néma r un, rusarzum

Uatííaoo graaisearu®, Pusarzum avewera, rusarzum cíumorum, tritici/ Ascocbyta trítioz_z Cephaiosporium gramineum_z Coiio tetrichum gramáoiooJa, Prysíphe gxaminis f.sp. tritici_z

U002.ma gramiois f.sp. teátáci, Puccinié

x. n, uuu i ta f.sp.

í/uccima stri.i'fo:rm.i.5’z Pyrenop.ho.ra tritici-regenfi«g Septoria nodoruar, Seprőre, a tritrciz Septo-ría avenae, Pse;jdocercosporelia ?s_z Phzzoctonia herpotrichozdí

Gaout<annor;g^zces gra.tii.nis var, tritici,

Phizootonia cereaiia,

Pythium aphanidermatum.

Pytnium arrhenomanesz Pythíum i?itzmum, Sípoiaris sorokznzana,

Barley Ye.llow Dwarf Vírus (árpa. sárga törpüiés vírusa), öröme

Mosaic Vírus (rorsnok), soii borne wheat mosaic vírus (búza mo/ &„ d 5 b / Β£·/ HA<<

zaik vírus talajból)·, wheat. streak mosaic vírus (búza csíkos mozaik vírus), wheat spindia streak vírus (búsa orsós vírus), ámerícan wheat. stríate vírus (amerikai barázdás búza vírus) _f

Claviceps purpurét, fiiietít tritící, liíietía laevis, ílstiiago trítioi, Tiilefcía indioa, Uhizoctonia solaní, Pythium arrhenomannes, Pytníum gramicoit, Pytbiun apkanidezztaitas·, high piains vírus, buropean wheat striate vírus (európai barázdás búsa vírus) , Puccinié graminís f.sp, ürífici (bűzaszá.r-rozsda), Siumeria (rrysiphe.) grtminis f.sp, tritící (búza iágyrothadás) .

Patogén rovarok/nematódák: Pseudaletia unipuncttta (bagolypille lárvája); Spodoptera frugíperdá (zuhanó bagolypille lárvája); Bitsncpaipus iignoseiius (kisebb kukoricaszár-moiyj ; Agrotis orthogonis (nyugati bagolypille hernyója); Slasmcpslp'üs zígnooeiius (kisebb kukoricaszár-moly); Oulernt aieianopus (gabonalevél bogár); ítypera punotata (lóhere zsizsik); Bíabrotloa undecMapunctata hovardl (déli kukorica gyökérféreg) ; Russian wheat aphid (orosz búza-ievéitetú); Scbí.saphis gramínum (zöld poloska) ; &aerö.s4pfc«® aveaae (angol gabona-levéltetű) ; Melanoplus femurrubrum (piroslábű sáska); Me.lsncp.lus di.f.fezen ~ tiaiis (differenciái sáska); ffeianopius sauguinipes (vándorsáska); ffayetida destructor (Hosszan légy); Sitodípiosis ;nossíiana (búza muslica) ; líeromyza anezícana (búzaszár-féregj; Hyler/ya ooarotata (búza gubaosíégy); Franki ind.el la fussa (dohány tripsz); Óephus cinctus (búza levéidarázs); áceria tulipae (búza. göndörkukac),

6. Napraforgó

Penészgomba, baktérium és vírus patogének: Pla'smopbora

7S.35S/WKAZ ralstedü, Scierotinís seierotiorus?, aster yeüoivs, Septeria hfsüsnthi, Pbomcpsis bsüantbr, Altemaria heüanfchi, Alternarra ünníae, őotrytis cinerea, Phossa macdonaldii, Mserophö/nína pbaaeoiina, Frysipfce eíeheraeearum., Pn.íeopes oryeae, Fhiz.ppus arrhizes, Fhízopus stoloníf&r, Puceínia beüantbi, Véréieü.Üum daniíae, Ereáníe earoéoveruez p.v. Carotóvóra, Cephaiosporíum seremen iám, Fhytaphthora ex'yptogea, Aibugo tragepogonis.

Patogén ro var oA/neaia tódák.;. Suleima heüanthana (napraforgórügy moly); nomeeosoma eieeteüum (napraforgó moly); fygegramma exeiamséionís (napraforgó bogár); Fctayras gibbeses (sárgarépa bogár); deolasloptera mertfeldtíana (napraforgómag muslica).

7. Kukorica

Penészgomba., baktérium és vírus patogének: Pusarinm moniü-f őrssé var. sabglutizans, .Erünis steesrfcü, Rs seriem menüi forsse, Gibbereüa zes-e éEüssrium gzazíinearazp , Stenocarpeila üsáydi í'üpiogia baydís) , Pytbium ir.regeJare, Pyfcbiom debarya.oem, Pytbiem graminreoia, Pythium spiendens_z Pytbium ultimé®, Pytói.ess ap/sanidex'matum_z Aspergilius füves, Sipoiaris maydís 0, T (Cechiioboies be teres trepbus), Helisintóosporium cazbaauzi 1, 11 &

III (Coehüeboies earbonem) , Pnserobilum tereieem I, II & III,

Helmixitóosporium pedi eei latsam, Pbysederma maydxe, Ph.yi i osticta maydis, Kábafieila ssaydis, Cereospora sorghi, üstirago ziaydisy Puccinié aorgbi_z Pueeinia pelysera., Maerophomina pbaseoi ina , Eeníeüüa® ozaüeum, dígrospora eryzae, Cladosporium berberem, C?;rv?^iaria iunata, Carvulazia xnaegeaixe, Curvelaria paiiescens, Ciavibacfcer snichí.gane,se subsp. nebraskense, Triohodérma vízidé, maize dwarf mosaic vírus (kukorica csikós mozaik vírus) A & B, rn.i&s/sanua whest streak mosaic vírus (búza csíkos mozaik vírus), maize chiorotic dwarf vírus (kukorica sápkóros törpülés vírus), Clavicaps sorgíii, Pseudonomas a venae., Erminía chrysanthemi p.v. Zea, Erzdnía carotovora, cornstimt spirgpiasme, hipiodia ziuerospcra, Sclercphchora mserospora _z Peron ősei erospora sorghl, Peroncscierospora philippinesis, Peronoséierospora msydis, Peronoscierospora saccharl,· Spaoeiotheca reiiiana_z Physopelia zeae, Cepüalosporium maydis, Capiaiosporium aeremonium, maize chiorotic mottle vírus (kukorica sápköros márványosság vírus), nagyon egyszerű vírus, kukorica mozaik vírus, kukorica „rayado fino vírus, maize streak vírus (HSV; kukorica csíkoitssg vírus), kukorica csíkos foltosság vírus, kukorica durva törpülés >ys;xi .-s..ei i..··,.·'.uct vovüjüa mozzsj.is (európai Kukoricamoly); Agrotis iparion (fekete bagolypille hernyója)? Heíicöcerpa zaa (gyapottok-moly); Spcdoptera frugiperda (zuhanó bagelypiiie lárvája) ; Diafrsea granxiioseila (délnyugati kukoricamoly) ? Sias?sopalpus lignoselius (kisebb kukoricása ár-moly) ;

Pdatraea seceharsiis (cukornád-moly).? Diabroti ,·*χ íj xf x rzr ? ííb >*'

Ui \Z U. J.. -u.

rsra (nyugati kukorica gyökérféreg) ? Disörotica lengicarnís barberi (északi kukorica gyökérféreg) ; Diabrotioa undecippunctata hooardi (deli kukorica gyökérféreg); Melanotus spp. (drötférgek) ; Cyciocepbala borealfs (északi álcázott cserebogár? fehér lárva) ; Cyciecephals. immacuiaba (deli álcázott cserebogár; fehér lárva); PopéIlla japónica (japán bogár); Chaetocnema puli cári a (kukorica bolha); Sphenophorus maídis (kukorica poloska);

Phopalosiphum maidis (kukorica Ζ58/£3,''?Αΐ·

Levéltetű); Anuraohis maidé rádióis (kukorica győkértetü); Bilssus ieuoopteruo ieucopterus (amerikai búza rontó féreg); delancpius femurrsbrum (píroslábú sáska); Melancplus sanguinipes (vándorsáska); Byiemva piatúra (vetőmag féreg); Agromyza parvicornis (kukorica aknázómoiy)? Anapnothrips obscrurus (szénátripsz); Sodencpsis suiesta (tol-·· vajhangya); Tetranychus urticae (kétpattyes takácsatka).

8. Cirok

Penészgomba, baktérium és vírus patogének: Sxserehii» turcicum, Colletotrícham grasúnieola (Glomer&llci grezdnloola) , Cerooapora soraid, Glceocereospora sorghl, Aaooohyfea sorgiina, Pseadojsox’jas oyringae p.v. syringae, Xanfcbomonas oappestris p„v. ioioiooia, vseudomonas andropogonis, Pucolnia parpurea, Mscrophomlna phaseollna, Perconia circinafa, Pí^saríuz! móriiífőnné, Aitemaria alternate, Bipoláris sorghicola, fifejjninthosporium sorghiooia, Cízrvuisris furata, Phoma irsidiosa, Fseudomonas avesae (Pseudomoras slboprecipitsns), Ramuii spóra aorgrhi, Pa®niispor.a sorghicels, Phyiiachara saoonari, Sporisori® reiilanum főpnacelocheca reiiíanai, Spbaoeiotheea oruénta, Sporisorium sorgii, cukornád mozaik vírus H, kukorica csíkos mozaik város A & S, Clavlceps sorghl, Bhiroctonia solani, Acremonlum strictum, SoleropbtAona sacrospora, Peroroocle.rospora sorgbi, Peronosciercspora pAiiippinensi s, Soie-rosp?ora graminicola, Fusarium graminearwK, Pussríum onysporum, PytAium arrAenomanes, Pyrhlum graminiccla.

Patogén rovarok/nematódák: Chile parcellás (cirokmoly);

Spodoptera frugíperda (zuhanó bagolypílle lárvája); neilcoverpa zea (gyapottok-moly) ; Biaszippaipus iignoseilus (kisebb kukorica··· ?3.3,58./3£:/m '5 0 szár-moly); Fertia subterranea (szemcsezo oagoiypxxie sernyojaí; .RbvIJophsga crin.it a (fehér lárva); Rieodes, Conoderus és áeorus spp. (drótférgek); űurerna mezanopus (gabona levélbogár); úhaetocnema pulicária (kukorica bolha); úphenopnorus maidra (kukorica poloska); Rűöoaiosiphu® maidra (kukorica levéltetű);

ieueopfe.rus

Fiissus

Fzpnafzsva (-cuKornaa sarga revet tett; ;

ieucgpterus (amerikai búzarontó féreg)? Confarinia sorghicoia (cirok muslica) ? Tet-ranyc&us: cinraabarinus (kármin pőkszerű kukac) ; Tetranycbus urticae (kétpettyes takácsatka).

9. Gyapot

Patogén rovarok/nemetődák; Beliothis virescens (gyapot bagolypilie hernyója); Féiicoverpa zea (gyapottok-moly); opodopfera exigaa (répa bagolypiile lárvája); Pscfcinophora go-ssypieila (rózsaszín gyapottok-moly) ; Anthonomus grandis grandié (gyapottok zsizsik); Aphis gossypii (gyapot levéltetű); Fsecdatomosoelis seriutus (gyapot bolha) ; (friaieurodes abutiionsa (szalagos-szárnyú fehér légy); lygus rineoiaris (hár~ tyás növénypoloska); Mslangpius femurrubrum (piroslábú. sáska) ; deiangpius differentiairs (differenciái sáska); Thrips fcabaci (hagyma tripsz)? Branklinkiella fusca (dohány tripsz); Tetranychus oinnabarinus (kármin pőkszerű kukac); Tetrarychus űrticae (két-pettyes pókszerű kukac).

10. Rizs

Patogén rovarok/ némát ódák: Diatraea saccnaraiis (cukornádmoly); Spodoptera fz'ugáp&xda (zuhanó bagolypiile hernyója);

Feiicoverpa zea (gyapottok-moly); Colaspis brunnea (szóló colaspis); bissorbgptrue cryzgpáirus (rizs árasztóviz zsizsik); 7S,35S/SB/a&3

Bifcophii'ös oryzae (rizs zsizsik) ; .Vephotef tíx nigropictus (rizs bolha); Blissss ieueopterns ieucopterus (amerikai búzarontö féreg) ; Acrostersm hllare (zöld bűzpoloska) .

11. Repce

Pa tógáit rovsrok/nematódák; Brevicoryne .brassícae (káposzta levéltetű); Bhyílotreta cruciferae {keresztesvirágüak bolhája); líamestra conjgurafca (Bertha bagolypille hernyója); Riatella xylostella (gyémánthátú moly); Della ssp. (gyökérférgek).

A találmány céljaira „RacB fehérje alatt az árpa RacB fehérjéjét értjük, amelyet a 2. számú szekvenciában mutatunk be, valamint ennek homológjait a rizs (Orvsa sacive) RacB fehérjéjét

- 4. számú szekvencia - és a kukorica (Bea mays} RacB fehérjéjét

- 6. számú szekvencia - és ezek funkcionális ekvivalenseit.

A „fehérje mennyisége alatt RacB polipeptid mennyiségét értjük egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy sejtalkotórészben. A fehérje mennyiségének „csökkentése RacB fehérje mennyiségének - például az itt leírt eljárások valamelyikével történő csökkentését jelenti egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy sejtalfcotőrészben, összehasonlítva ugyanazon nemzetség vagy faj vad típusával, amelynél ezt az eljárást nem alkalmaztuk, egyébként azonos körülmények között (úgymint például tenyésztési körülmények, növény életkora és hasonlók). A csökkentés mértéke legalább 10%, előnyösen legalább 10% vagy 20%, különösen előnyösen legalább 40% vagy 00%, még előnyösebben legalább 70% vagy 80% és legelőnyösebben legalább 90% vagy 95%.

„Aktivitás alatt előnyösen egy RacB polipeptid GTP-áz aktivitását értjük egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy SejtaiXS, ♦ * * * *' ♦ ♦' <

<· « » -<

♦ * * * « X» « kotőrészben. Az aktivitás „csökkentése RacB fehérje teljes aktivitásának -· például az itt leírt eljárások valamelyikével történő - csökkentését jelenti egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy sejtalkotörészben, összehasonlítva ugyanezen nemzetség vagy faj vad típusával, amelynél ezt az eljárást nem alkalmaztuk, egyébként azonos körülmények között (úgymint például tenyésztési körülmények, növény életkora és hasonlók). A csökkentés mértéke legalább 10%, előnyösen legalább 10% vagy 20%, különösen előnyösen legalább 40% vagy 60%, még előnyösebben legalább 70% vagy 8 0% és legelőnyösebben legalább 30% vagy 95%.

„Funkció alatt előnyösen egy RacB polipeptíd szubsztrátkötő képességét értjük egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy sejtalkctórészben. Megfelelő szubsztrátok a kis molekulatcmegü vegyületek, úgymint GIF, de RacB fehérjének a fehérje kölcsönhatásban részt vevő partnerei is. A funkció „csökkentése például RacB fehérje legalább egy szübsztráthoz való kötődési képességének vagy kötési erősségének - például az Itt leírt eljárások valamelyikével történő - csökkentését jelenti egy szervezetben, szövetben, sejtben vagy sej tál kot órészben,· összehasonlítva ugyanazon nemzetség vagy faj vad típusával, amelynél ezt az eljárást nem alkalmaztuk, egyébként azonos körülmények között (úgymint például tenyésztési körülmények, növény életkora és hasonlók) . A funkció csökkenését jelenti a szubsztrát speeififásban bekövetkező változás is, amely kifejezhető például a kcat/Fm értékkel. A csökkentés mértéke legalább 10%, előnyösen, legalább 10% vagy 20%, különösen előnyösen legalább 40% vagy

60%, még előnyösebben legalább 70% vagy 80% és legelőnyösebben 7S ,35S/3£/;m χ» κ »»* « legalább 90% vagy 95%. Rácé kapcsolódási partnerei azonosíthatók a szakember számára ismert módszerekkel, például az éleszto-2-hibrid rendszerrel.

Módszerek a fehérje mennyiségének, a GTP-áz aktivitásnak vagy a szubsztrát-kötő képességnek a meghatározására ismertek a szakember számára, és már számos alkalommal leírták. különböző nemzetségekből vagy fajokból· származó GTB-ázokra és Rác .fehérjékre {Benard et al., o. Bioi. Chem. 274(19), 13198-13204 (1939) és Burstein. ES, O.ncogene 17(12), 1617-1623 (1398)],

RacB fehérje „funkcionális ekvivalensei alatt előnyösen olyan szekvenciákat értünk, amelyek a 2. számú, 4. számú vagy 6.

számú szekvenciával jellemzett RacB fehérjéből származnak vagy ezzel homológok és amelyek lényegében ugyanazokkal a sajátságokkal rendelkeznek.

Sgy funkcionálisan ekvivalensnek „lényegében, ugyanazon, tulajdonságai alatt patogén-rezisztens fenotípus átadását vagy legalább egy patogénnel szemben rezisztencia átadását vagy növelését értjük, miközben nevezett funkcionális RacB ekvivalens fehérje mennyisége, aktivitása vagy funkciója csökken a növényben vagy annak szövetében, részletében vagy sejtjeiben. Lényeges tulajdonság továbbá, hogy a funkcionális ekvivalens fehérje menynyiségének, aktivitásának vagy f.aukciójának nevezett csökkenésével egyidejűleg ne lépjen fel spontán kialakuló sejtelhalás.

Ebben az összefüggésben a patogén-rezisztenoia hatásfoka lefelé és fölfelé ís eltérhet attól az értéktől, amit a 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciával jellemzett RacB fehérje valamelyikének csökkentésével kapunk. Előnyben részesített funkciós . SSS/BS/'S&Z <1 Ο onális ekvivalensek azok, amelyekben a patogén-rezisztencia hatásfoka --- például a patogén behatolási hatékonyságával (hausztóría képződésével? mérve - nem több, mint 50%-kai, előnyösen 25%~ kai, különösen előnyösen 10%-kal tér el a 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciával jellemzett RacB fehérje csökkentésével kapott összehasonlítő értéktől. Speciálisan előnyben részesítjük azokat a szekvenciákat, ahol a csökkentés a patogén-rezlszteneia hatásfokát több, mint 50%-kal, előnyösen 100%-kal, különösen előnyösen 500%-kal, kiemelten előnyösen 1000%-kal növeli a 2< számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciával jellemzett RacB fehérje valamelyikének csökkentésével kapott Összehasonlító értekhez képest.

Az összehasonlítást előnyösen egymáshoz hasonló körülmények között végezzük, „Hasonló körülmények alatt azt értjük, hogy minden körülmény, úgymint például tenyésztési vagy szaporítási körülmények, meghatározások körülményei (úgymint puffer, hőmérséklet, szubsztrátok, patogén koncentráció és hasonlók) azonos az összehasonlító kísérletek során és csak a kísérletek összeállítása különbözik az összehasonlítandó RacB polipeptidek szekvenciájában, ezek eredetében és amennyiben indokolt, a patogénben, A patogén kiválasztásánál minden összehasonlításnál követelmény, hogy a kiválasztandó patogén a másik ekvivalenshez leginkább hasonló legyen, tekintetbe véve a fajspeclfáfást.

A „funkcionális ekvivalensek elnevezés a RacB polipeptidek

- 2. számú, 4. számú és S. számú szekvenciákban bemutatott - természetes vagy mesterséges mutációira és más növényekből származó olyan homológ polipeptidekre utal, amelyek lényegében ugyanazok78.35.8/SE/BAS kai a sajátságokkal rendelkeznek. Előnyben részesítünk a fért leírt, előnyben részesített növényekből származó homológ polípeptideket. A találmányban közzétett RacB szekvenciákkal homo· lóg, más növényekből (például Árabidgpsís thaliana-bői) szármázszekvenciák könnyen megtalálhatók például adatbázisokban törten¹kereséssel vagy genetikai könyvtárak sereenelésével, RacB szék· venciákat használva fel kutatási szekvenciaként vagy próbaként.

Mutációk magukba foglalják egy vagy több aminosav maradé szubsztitúcióját, addroíőját, delécióját, inverzióját vagy ínszer cíö ját. Ilyenformán a találmány oltalmi, körébe tartoznak azok poiípeptidek is, amelyeket a 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szék vencíákban bemutatott polipeptláek módosításával kapunk.

Két nukíeinsav-szekvencia közötti homológra alatt mindé; esetben a teljes szekvencia hosszúság mentén azonos nukleínsav -szekvenciákat értjük, amely összehasonlítást a GAP számítógépe algoritmussal (Miseonsín Package Version lö.O, University o Wisconsin, Genetíes Computer Group (GCG), Madison, USA) [Aitschu et ai., bueleic Acids Rés, 25, 3389 (1997)} végezzük a követkézparaméterek beállításával:

Gap vcighti 50

Average matek:: 10

Például az 1. számú szekvenciával a nukleinsavak szintje: legalább 80%-ban homológ szekvencia alatt azt értjük, hogy a adott szekvenciát - a fenti számitógépes algoritmussal a fent paraméterek beállításával --- az 1. számú szekvenciával összehasonlítva legalább 80%-os homolögiát kapunk.

Két poiipeptid közötti homológra alatt minden esetben a tel 73.353/3E/KA2

Lengtn weignt:

Averaoe miamatoh:

Φ ο #Χ· “''4 s>· « Κ jes szekvencia hosszúság mentén azonos amínosav-szekvenciákst értjük, amely Összehasonlítást a GAP számítógépes algoritmussal (Xisconsin Package version 10. ö, üniversíty of Wisccnsin, Genetics Computer Group (GCG) , (kadison, USA) [Altschul et al., Nucleíc Acids Rés.· 25, 3389 (1997)] végezzük a következő paraméterek beállításával;

Gap weight; 8 Length weight; 2

Average matoh: .2,91.2 Average mismatch: -2,003

Például a 2. számú szekvenciával a fehérje szinten legalább

80%-ban homológ szekvencia alatt azt értjük, hogy az adott szekvenciát - a fenti számitógépes algoritmussal a fenti paraméterek beállításával - a. 2. számú szekvenciával összehasonlítva legalább

80%-os homoiogiát kapunk.

A találmány szerinti 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban bemutatott polipeptidek bármelyikéből - szubsztitúcióval, inszezciöval vagy delécióval - származtatott funkcionális ekvivalensek legalább 60%-ban, előnyösen legalább 80%-ban, preferenciaként legalább 9ö%-ban, különösen előnyösen legalább 95%~ foan, kiemelten előnyösen legalább 38%-ban homológok a találmány szerinti 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban bemutatott polipeptidek valamelyikével és lényegében ugyanazokkal a sajátságokkal tűnnek ki, mint a 2. számú, 4. számú vagy £·. számú szekvenciakban bemutatott polipeptidek.

A találmány szerinti 1. számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákban. bemutatott nukieinsav-szekvenciákbói - szubsztitúcióval, inszéróiéval vagy delécióval - származtatott funkcionális ekvivalensek legalább 60%-foan, előnyösen legalább 80%-ban, pre78 »358/BK/R&2 **»ί XX ,>>ν« ferenciaként legalább 90%-ban, különösen előnyösen legalább 95%ban, kiemelten előnyösen legalább 98%-ban homológok a találmány szerinti 1. számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákban bemutatott nufeieinssv-szekvencíák valamelyikével és 3 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban bemutatott polípeotídekkei lényegében azonos sajátságokkal rendelkező polipeptideket kódolnak.

A RacB fehérjékkel funkcionális ekvivalensek előnyösen legalább egyet tartalmaznak a következő szekvencia motívumok közül:

a) a GXXXXGKS/T szekvenoiájű GI elemet előnyösen az N-terminális régióban, kiemelten előnyösen a GDGAVGKT szekvenciával rendelkező elemet, legelőnyösebben a KCV'TVGDGAVGKTC elemet;

b} a G2: effaktor régiót, amely tartalmazza a FTVFDN szekvencia motívumot, különösen előnyösen az NTFPTDYVPTVFDKFSAKVV szekvenciát;

o) a G3 elemet, amely tartalmazza az LWDTAGQ szekvenciát, különösen előnyösen az NLGLWDTAGQECYN szekvenciát;

d) a TKXD G4 elemet, különösen előnyösen TKLD motívumot, kiemelten előnyösen az LVGTKLDLRDDKQ szekvenciát;

s) az SXS G5 elemet, előnyösen ECSS motívumot, kiemelten előnyösen az ECSSKTG szekvenciát;

f) a CXXX C-termínális izopreniláciős motívumot [Rassanain et al.., Bioehem. Biophys. Rés. Ccman. 272(3), 783-783 (2000)], különösen előnyösen CS1L szekvenciát.

Funkcionálisan ekvivalens RacB fehérjében ezekből a motívumokból (a-f) különösen előnyösen legalább 2 vagy 3, kiemelten előnyösen legalább 4 vagy 5 fordul elő, legelőnyösebben az oszsz.es a-f motívum előfordul. A szakember számára könnyedén levevő. SSS/mymm « » zethetők további, RacB-re jellemző szekvencia motívumok - főleg Racl fehérjéktől elhatároló motívumok - az ismert RacB (vagy Racl) fehérjékkel történő sorba állítás segítségévei, ahogyan azt az 1. ábrán bemutatjuk.

A RacB fehérjéknek a 2< számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban bemutatott funkcionális ekvivalenseire példák - amely ekvivalensek a találmány szerinti eljárással csökkentendők — azonosíthatók például számos:, ismert genomiális szekvenciája szervezetből, úgymint például Arabidopsis tbaiiana-ból, Brassiea napus-böl, Adcotiana tabacum-ből, Solanum taberosum-bél vagy Bellántbinum-böl homológ.!a összehasonlitő adatbázisokból.

Más szervezetek - előnyösen az alábbiakban említett növényfajok mint transzformációs gazdaszervezetek - cDNS könyvtárainak vagy genomiális könyvtárainak sereeneiese az 1. számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciák vagy ezek részleteinek próbaként történő felhasználásával szintén egy módszer homológok azonosítására más fajokban, amely a szakemberek számára nem okoz nehézséget. Ebben az összefüggésben az 1, számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákban bemutatott nukleinsav-szekvencíákból származó próbák hosszúsága legalább 20 bp, előnyösen 50 bp, különösen előnyösen 100 bp, kiemelten előnyösen 200 bp és legelőnyösebben 400 bp. Az 1. számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákkal leírt nrkieínsav~szekven.cíákkal komplementer DNS szál ís alkalmazható a könyvtárak sereenelésére.

Ennek megfelelően, funkcionális ekvivalensek közé tartoznak olyan DNS szekvenciák, amelyek standard körülmények között hibridizálnak az 1. számú, 3. számú vagy 5, számú szekvenciákkal 73.353/3Z/K&2 .·» V ♦ ♦φ-». ** ♦ * Λ J»

Ϋ « X . * ·* Φ leírt RacB nukieínsav-szekvencíávsi, az ezzel 'komplementer szekvenciával vagy az említett szekvenciák részleteivel és amelyek komplett szekvenciákként a 2. számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban· leírt fehérjék sajátságaival megegyező tulajdonságú fehérjéket kódolnak.

„Standard hibridizációs körülmények alatt tágafofc értelemben szigorú vagy pedig kevésbé szigorú hibridizációs körülményeket értünk. Ilyen hibridizációs körülményeket írnak le, többek között Sambrook és munkatársai [Mo-lecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] vagy Ausufoei és munkatársai [Current Frotocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1989)].

Például a mosási lépés körülményei megválaszthatok a kevésbé szigorú körülmények (körülbelül 2X SBC, SO O és nagyobb szigo.-Λ .-Ά rúságú körülmények (körülbelül ü,2X SSC, 50 'C, előnyösen 65 'C;

lartományan b<

dűl (2ΌΧ SSC: 0,3 M nátrium-nitrát, 3 M nátriumklorid, pH 7,0). Ezenkívül a hőmérséklet a mosási lépés alatt a szobahőmérsékletű - körülbelül 2:2 °C - kevésbé szigorú körülményektől a körülbelül 65 ^uC-os szigorúbb körülményekig terjedhet. Mindkét paraméter, a sókonoentráció és a hőmérséklet egyidejűleg is változtatható vagy pedig egyik paraméter állandó értéken, tartható, míg a másik változik. Denaturálószerek, például fermamíd vagy SOS szintén alkalmazható a hibridizáció alatt. 50%-os foramid jelenlétében a hibridizációt előnyösen 42 ^C-on végezzük. Az alábbiakban néhány példát mutatunk be a hibridizáció és a mosási lépés körülményeire:

1. Hibridizációs körülmények választhatók, például a követ ke7 8.3.5 8 /'8?·« / R&JS ··· Q zők közül:

Cl	4X	£' <-‘X·	:~on;
b;	6X	SSC 45 Ύ	.· **Ό?Ϊ y
C í	6X :	SSC, 100	pg/ml denaturált, fragmenfá	it halsperma DNS 68	X~on;
d)	6X ;	SSC, 0,5%	SDS, 100 gg/ml denaturált	lazac-sperma DNS 63	Λ C-on;
	ct	<“· ,''	5% SDS, 100 pg/mi denaturált, fragmentáit	lazac
SO	erma	DNS, 50	% formamid 42 V-cn;
£)	50%	formami·	d, 4X SSC 42 °C-on;
cr)	50%	' F T'' F ,7'	) formamid, 0,1% BSA (bov	íné serum albumán ~	szar
xrci V >.*	smar	ha szérű	m albumin, 0,1% FI coll, 0	,1% pollvini1-pirrolidon
50	mM	nat r.iumr	-foszfát puffer pH 6,5, >	'50 raM nátrium-kior	' .3 ~í ω,
mM	nát	rium-cifc	rát 4 2 °C-on;
2X	vág	AV W* y η* Ζχ Ά ν X.·	50 ~C~on (kevésbé szigorú	kőrüimény);
30	-40%	formami	d, 2X vagy 4X SSC 42 °C-o	n (kevésbé szigorú	körül

2. Mosási lépések választhatók például a következő körülmények közöli

a) 0,015 M N-aCl./ö, ÖÖ15- M nátríum-citrát/0,1% SOS 50 ^vC-.on;

b) 0,lX SSC 65 ^GC--on;

c) Ü,1X SSC, 0,5% SDS 68®C-on;

d) O,1X SSC, 0,5%: SDS, 50% formamid 42 úD~cn;

e) 0,2X SSC, 0,1% SDS 42 °C-on;

f) 2X SSC 65 °C-on (kevésbé szigorú körülmény).

A 2, számú, 4. számú vagy 6. számú szekvenciákban bemutatott polipeptidekből származó funkcionális ekvivalensek felölelik a

35., 37., 32., 41., 43., 45., 471, 50., 52., 54., 56., 58., 60.,

62., 64., 66., 63. vagy 70, számú szekvenciával rendelkező fe~

78.35S/EE/KAS λ A

ΐ V J á KCX	i.S .	„Fűn ke	r.i.oriu .·.	í.s ekvivalí	msek közé értj		üionosén a
3 4 s kJ > f s V .»	38 .	, IC.,	42.,	44«., 46.,	4 3: 4 S ’ n * ? 5. ..· * p vb * y	53.,	55., 57»,
s- t '· 0 A « Λ O -Á » y	6ö,	, 67.	vagy	69. számú	szekvenciával c	'ende	Ikezo nuk-

leinsav-szekvenciák által kódolt fehérjéket.

RacB fehérje kifejeződés, RacB aktivitás vagy RacB funkció csökkentése sokféle módon megoldható.

„Csökkenés vagy „csökkentés a RacB fehérjével, RacB aktivitással vagy RacB funkcióval összefüggésben tág értelemben értelmezhető és magába foglalja RacB fehérje működésének részleges vagy lényegében teljes gátlását vagy blokkolását egy növényben vagy növényi részben, szövetben, szervben, sejtekben vagy magokban, amely gátlás vagy blokkolás különböző sejtbiológiái mechanizmusokon alapul.

A találmány céljai szempontjából a csökkentésbe beletartozik RacB fehérje mennyiségi csökkentése is, egészen a RacB fehérje teljes hiányáig (azaz nem mutatható ki RacB aktivitás vagy RacB működés vagy hiányzik az immunológiailag kimutatható RacB fehére) . Ebben as összefüggésben az adott RacB fehérje kifejeződése vagy a RacB aktivitás vagy RacB funkció egy sejtben vagy szervezetben előnyösen több, mint 50%-kai, különösen előnyösen több, mint 80%-kaI, kiemelten előnyösen több, mint 90%-kal csökken,

RacB fehérje kifejeződés, a RacB aktivitás vagy RacB funkció csökkentésére irányuló különböző stratégiák a találmány oltalmi körébe tartoznak. A szakember különböző módszerek sorozatával a kívánt módon képes befolyásolni RacB fehérje kifejeződését, a

RacB aktivitást vagy a RacB működést.

A RacB aktivitás vagy RacB működés csökkentését előnyösen az 'ίδ.δδδ/δΕ/ΚΆΕ endogén RacB fehérje csökkent kifejeződésével érjük el.

RacB fehérje mennyiségének, a. RacB aktivitásnak vagy RacB működésnek a csökkentése megvalósítható a kővetkező módszerek alkalmazásával:

a) Kettős-szálú RacB RNS nukieinssv-szekveneía (RacB dsRRS) és expressziős kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését ?

b) RacB antiszensz nukleinssv-szekvencia és expresszién kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését. Idetartozik minden olyan módszer, amelyben az antiszensz nukieinsav-szekvencl a RacB gén (azaz genomíális DNS szekvencia) ellen vagy RacB gén átírat (azaz RNS szekvenciák) ellen irányul, α-anomer nukle.insav—szekvenciák is beletartoznak.

c) RacB antiszensz nafcleinsav-szefcveneía bevezetése ríhozím·mai és expresszíős kazettával kombinálva, biztosítva annak kifejeződését ;

d) RacB szensz nukleinsav-szekveneíák bevezetése együttes szupressziö kiváltására és expressziős kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

e) Domináns-negatív RacB fehérjét kódoló nukieinsav-szekvencía és expressziős kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

f) RacB gének, RacB RNS-ek vagy RacB fehérjék elleni DNSvagy fehérje-kötő faktorok, és expresszíős kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

g) RacB RNS degradációját okozó vírus nukleinsav-szekveneíák vagy expressziős szerkezetek és expressziös kazetta bevezetése, 78.35S/WM2' ♦ * A * * * * biztosítva annak kifejeződését;

h) Endogén RacB génekkel homológ rekombinációt indukáló szerkezetek bevezetése, például knock-out mutánsok létrehozására;

i) Mutációk bevezetése endogén RaoB génekbe funkció vesztés kiváltására (például stop kódonok, leolvasási keret eltolások és ha s on 1 ó k 1 é t reh o zására)

Ebben az összefüggésben ezeknek a módszereknek mindegyike képes csökkenteni a RacB kifejeződést, RacB aktivitást vagy RacB működést a találmány céljainak megfelelően. Kombinált alkalmazás is megvalósítható. A szakember szájaira ismertek további módszerek, amelyek magukba foglalhatjak RaoB fehérje felépülésének vagy RaoB. mRNS transzportjának megakadályozását vagy megelőzését, riboszöma hozzákapcsolás gátlását, RNS illesztés gátlását, RacB-RNS bontó enzim indukcióját és/vagy transzlációs eiongáciő vagy terminácíő gátlását.

Az egyes előnyben részesített eljárásokat az alábbiakban részletes ebben le Írj a k aj Kettős-szálú KacB BBS nuklelrsav-szekvercía (BacS dsRHSj bevesetese

A módszert gének szabályozására kettős-szálú RNS segítségévei {„,kettős-szálú RNS interferencia; dsRNSi) ismétlődően leírták állatokra és növényi szervezetekre [Matzks et ai., Plánt Moi. Bioi. 43, 401-415 (2000); Erre et. al., Natúré 391, 306-511 (1998); KO 99/32619, KO 99/530ŐÚ, KG 00/63374, Kö 00/44914, Kö 0044895, KO 00/49035 és KO 00/63364 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentések]. Pontos utalásokat teszünk a fenti referenciákban leírt eljárásokra és módszerekre. Hatásos gén78,358 /SS /?AS *

.szupresazi ó bizonyítható átmeneti kifejeződéssel vagy átmeneti transzformációt követően ís, például biolisztikus transzformáció következményeként [Schweizer et al., Plánt ül 2000 24, 005-905 (2000)]. dsRNSi módszerek azon az elven alapúinak, hogy a gén trsnszkriptum komplementer szálának és ellentétes irányú szálának egyidejű bevezetése a szóban forgó gén kifejeződését nagy hatékonysággal erősen visszaszorítja. Az ennek következtében létrejövő fenotipus nagyban emlékeztet a megfelelő knock-out mutánsra [Waterhouse et ai., Proc. háti, Acad. S-cí. USA 95, 1395013964 {1098}].

A dsRNSr módszer különösen hatékonynak és előnyösnek bizonyult a RacB kifejeződés csökkentésében. A többek között a WO 90/32619 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt dsRN'Si megközelítések szembetűnően kiválóak a hagyományos antiszensz megközelítésekkel szemben.

Ilyenformán a találmány tárgyát képezik továbbá kettős-szálú RNS molekulák (dsRNS molekulák), amelyek növénybe (vagy sejtbe, szövetbe, szervbe vagy ezekből származó magba.) történő bevezetés révén csökkentik RacB mennyiségét.

A RacB fehérje kifejezésének csökkentésére bevezetett kettős-szálú RNS molekulákban

a) a két RNS szál közül az egyik lényegében azonos a RacS nukleinsav-szekvencíának legalább egy részletével, és

b) a megfelelő másik RNS szál lényegében azonos a RacB nukleínsav-szekvencia komplementer szálának legalább egy részletével.

További előnyben részesített megvalósítási formában a RacB fehérje kifejezésének csökkentésére bevezetett kettős-szálú RNS 76 6.z6/£R/R&£

Kuia ta LiŰCi. .>

£ ü> Ο λ A

v.> ’C * ·? —· & » jf *2 \z < fi , 61., 63., 65.

a) szensz RNS szálat, amely a RacB fehérjét kódoló bukie.insav- szekvencia szensz RNS transzkrlptumának legalább egy részletével lényegében, azonos, legalább egy ribonukleotíd-szekvenciát tartalmaz, és bj antiszensz RNS szálat, amely lényegében - előnyösen teljes egészében - komplementer az a) szerinti RNS szensz szállal,

A kettős-szálú RNS molekulák szempontjából RacB nukleínsavszekvencia alatt előnyösen az 1, számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákban bemutatott nukleinsav-szekvenciákat vagy ezeknek > 4 4 4 C 4 ö 4 η 01 g g u;

C. » y ej φ y “ν ·χ? < » ZZ U’ « fi t ? .λ, 4 f x? d fi x-' < y , 67. vagy 69. számú szekvenciákban bemutatott funkcionális ekvivalenseit értjük, „Lényegében azonos alatt azt értjük, hogy a dsRNS szekvencia a RacB· cél szekvenciával vagy a célszekvencia funkcionális ekvivalensével összevetve mutathat, inszerciókat, deléclókat vagy egyedi pontmutációkat is, miközben a kifejeződést még hatékonyan csökkenti, A fenti defínicíőnak megfeleld homoiőgia a gátló hatású dsRNS szensz szála és a RacB fehérjét vagy funkcionális ekvivalensét kódoló nukleinsav-azekvencía szensz RNS transzkriptumának legalább egy részlete között (vagy az antiszensz szál és a

RacB fehérjét vagy funkcionális ekvivalensét kódoló nukleinsavazekvencía komplementer szála között) előnyösen legalább 75%, előnyösebben legalább 80%, különösen előnyösen legalább 90%, legelőnyösebben 100%.

A rész-szegmens hossza legalább lö bázis, előnyösen legalább 25 bázis, különösen előnyösen legalább 50 bázis, kiemelten elő78 - 3^:S8'/BE/EA3 φφ · Φ» nyösen legalább 100 bázis és legelőnyösebben legalább 200 vagy

300 bázis.

Másik lehetőségként a „lényegében azonos dsRNS olyan nukleinsav-szekveneiaként is definiálható, amely tárolási fehérje gén-transzkriptum sgy részletével hifariöizáini képes (például 400 mb NaCl, 4 0 mM RIPES pH 6,4, 1 mi SDTA 50 °C-on vagy “0 ^cC-on 12-16 órán keresztül.

„Lényegében komplementer alatt azt értjük, hogy az antiszensz RNS szál a szánsz RNS szál komplementerével összehasonlítva tartalmazhat inszereíőkat, deléeiókat és egyedi pontmutációkat is, A szenes RNS szál komplementere és az antiszensz RNS szál közötti homológra előnyösen legalább 8'0%-os, előnyösebben legalább 90%-os, még előnyösebben 95%-os és legelőnyösebben 100%-os.

Rác,8 fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló nakieinsav-szekvencia „szensz RNS transzkriptumának részlete alatt egy nukieinsav-szekvenciábői, előnyösen a RacB fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló RacB génből átírt RNS vagy mRNS fragmentumait értjük. Itt a fragmentumok szekvenciájának hosszúsága előnyösen legalább 20 bázis, előnyösebben legalább 50 bázis, különösen előnyösen legalább 100 bázis, kiemelten előnyösen legalább 200 és legelőnyösebben legalább 500 bázis,

Szintén a találmány oltalmi körébe tartozik a találmány szerinti dsRNS molekulák felhasználása a találmány szerinti eljárásokban patogén-reziszteneia létrehozására növényekben.

A dsRNS egy vagy több polimerizált ribonu kleot.;,íd szálból állhat, Módosulások lehetnek mind a cukor-foszfát vázban, mind a nukleozidokban. Például a természetes RNS foszfo-diészter kötései lehetnek oly módon módosítottak, hogy legalább egy .nitrogén vagy kén heteroatomot tartalmaznak. Bázisok lehetnek oly módon módosítottak, hogy például az adenozin dezamináz aktivitása visszaszorulion. Ezeket és más módosításokat Írunk le az alábbiakban az antiszensz RNS stabilizáló módszerekben.

ugyanazon cél elérése érdekében természetesen lehetőség van számos egyedi, a fent definiált ribonukieotid-szekvencía szakaszok valamelyikét tartalmazó dsRNS molekula bevezetésére a sejtbe vagy a szervezetbe.

A dsRNS létrehozható enzimesen vagy teljesen vagy részlegesen kémiai szintézissel.

A kettős-szálú dsRNS szerkezet kialakítható két különálló, egymással komplementer RNS szálból vagy előnyösen egyedi, önmagában kompiementáiódő RNS szálból kiindulva.

Egyedüli, önmagában komplementálódó RNS szálban szensz és antiszensz szekvencia kapcsolódhat egymáshoz „linken szekvencián keresztül és képezhet például haj tű szerkezetet. A linker szekvencia előnyösen egy intron, amelyet a dsRNS szintézise után toldunk be,

A dsRNS-t kódoló nukleinsav-szekveneia további elemeket tartalmazhat, úgymint például transzkripciós terminácíós szignálokat vagy poliadeniiáciős szignálokat.

Amennyiben a két dsRNS szálat a sejtben vagy növényben akarjuk összekapcsolni, ez különböző módokon végezhető:

aj a sejt vagy növény mindkét expressziós kazettát tartalma7S . 358/B2/HA2 * * zó vektorral történő transzformálásávalίο) a sejt vagy növény két vektorral történő együttes transzformálásával, amelyek közül az egyik a szensz szál expressziós kazettáját, a másik az antiszensz szál expressziós kazettáját tartalmazza;

c) két olyan növény hibridizációjával, amelyek közül mindkettőt transzformáltunk egy-egy vektorral, ahol az egyik vektor a szensz szál expressziős kazettáját, a másik az antiszensz szál expressziós kazettáját tartalmazza.

Az RNS duplex kialakulása kezdeményezhető kívülről, vagy a sejten beiül. A dO 9:9/53050 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtakhoz hasonlóan, a dsRNS hajtő szerkezetet is tartalmazhat, ahol a szensz és antiszensz szálat iinker (például íntron) köti össze. Előnyben részesítjük az önmagában komplementálédó dsRhS struktúrákat, mivel ezek csak egy szerkezet kifejezését teszik szükségessé és a komplementer szálakat mindig ekvimoiárís arányban tartalmazzák.

A dsRNS antiszensz vagy szensz szálát kódoló vagy a dsRNS önmagában kompiementálödő szálát ködeié expressziós kazettákat előnyösen, vektorba ínszertáljuk és az alábbiakban ieirt módszerek alkalmazásával stabilan beépítjük a növényi genomba annak érdekében, hogy biztosítsuk a dsRNS folyamatos kifejeződését, például szelekciós markerek alkalmazásával.

A dsRNS bevezethető például olyan mennyiségben, amely lehetővé teszi sejtenként, legalább egy példány megjelenését. Nagyobb mennyiségek (például sejtenként legalább 5, lö, 100, 500 vagy 1000 példány) hatékonyabb csökkentést eredményezhet.

S, .sSS/BZ/ZAZ κ A »« « φ * * Φ

A korábban leírtak szerint, a dsRNS és a RacB gén transzkriptuma vagy a. funkcionális ekvivalenst kódoló gén transzkríptuma között nem szükséges löö%-os homológra megléte ahhoz, hogy a RacB kifejeződés hatékony csökkentése megvalósuljon. Ennek megfelelően, a módszer előnye, hogy toleráns olyan szekvencia eltérésekkel szemben, amelyek genetikai mutációk, polimorfizmus vagy evolúciós divergencia következményeiként létezhetnek. Ilyenformán, például lehetőség van egy szervezet RacB szekvenciája alapján létrehozott dsRRS felhasználására egy másik szervezetben a RacB kifejeződés visszaszorítására. A rizs, kukorica és árpa RacB szekvenciái közötti nagymértékű szekvencia homológra alapján az a következtetés vonható le, hogy ez a fehérje növényekben erősen konzervatív, ezért az 1. számú, 3, számú vagy 5. számú szekvenciákban közzétett RacB szekvenciák egyikéből származó dsRNS kifejezése előnyös hatásúnak tűnik más nö~ v é n v £ s fc '2. π i s ♦

Továbbá az egyes RacB fehérjék és funkcionális ekvivaienseiís közötti nagymértékű homol óg.iának köszönhetően lehetőség adódik egy szervezet bizonyos RacB szekvenciájából létrehozott egyedi dsRNS felhasználására. uovanabban a szervezetben további homolóo ' λ·—·

RacB fehérjék és/vagy ezek funkcionális ekvivalensei vagy pedig más rokon szervezetek RacB fehérjéi kifejezésének visszaszorítására. Erre a célra a dsRNS a RacB gén-transzkriptumainak előnyösen konzervatív régióknak megfelelő szekvencia régióit tartalmazza, Nevezett konzervatív régiók könnyen fellelhetők összehasonlító szekvenciák segítségével.

A dsRNB szintézise elvégezhető in vívó vagy in vitro körül78.353/SS/&&2· «

menyek között. Ezen célra dsRNS-t kódoló DNS szekvencia bevihető •egy expresszíős kazettába legalább egy genetikai kontroll elem - úgymint például promóter, enhancer (fokozó) silencer (csillapító), illesztő donor vagy illesztő akceptor vagy poiiadeniláciös szignál - szabályozása alatt, Megfelelően előnyös összeállításokat írunk le az alábbiakban. Sem poiiadeniiácrös szignál, sem transzlációt indító elemek jelenléte ne® szükséges.

dsRNS szintetizálható kémiailag vagy enzimesen. Erre a célra felhasználhatók celluíáris RNS polimerázok vagy bakteriofág RNS polimerázok 'úgymint például ϊ3, T7 vagy 3R5 RNS polimeráz). RNS in vitro kifejezésére használható módszereket írnak le a WO

97/32016 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben és az ü.S.P, 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,739,214,

5,804,693 számú szabadalmi iratokban, áz in vitro kémiai úton vagy enzimesen szintetizált dsRNS a sejtbe, szövetbe vagy szervezetbe történő bevezetése előtt teljes mértékben vagy részlegesen elválasztható a reakció-keveréktől., például extrakciőval, precipitációvai, elektroforézissel, kromatográfiás-an vagy ezeknek a módszereknek a kombinációjával. A dsRNS bevezethető közvetlenül a sejtbe vagy alkalmazható extraceliulárísan, például az interstiolális térbe juttatva.

Előnyben részesítjük azonban, a növény stabil transz formációját. olyan expresszíős szerkezettel, amely biztosítja a dsRNS kifejeződését. Erre alkalmas módszereket írunk le az alábbiakban.

bj SacB aafcie^enear nxfklainsav-svekvsncia bevezetése

Specifikus fehérje visszaszoritására irányuló olyan módszereket már sokan leírtak, ahol a fehérje mRNS-snek reihalmozódá78.358/SS/M7, sát antiszensz technológia segítségével akadályozták meg, beleértve növényekre vonatkozó eseteket (Sheeby et al., ?roc. batl.

Acad. Sói. USA 8 5, 8806-8809 (1988); Mól et al., FBBS Lett.

268 (2), 427-430 (1980); ü,S.P. 4,801,348 számú szabadalmi ír.at]>

A.2 antiszensz nukieinsav-molekula hibrídizál. vagy hozzákapcsolódik a. visszaszorítandó RacB cél fehérjét kódoló genomiális DNShez és/vagy annak celluláris mRhS~éhez. Ez gátolja a célfehérje transzkripcióját és/vagy transzlációját. Hibridizáció létrejöhet hagyományosan stabil duplex kialakulásával vagy - genomiális DNS esetében - az antiszensz ftukieinsav-molekulának. a genomiális DNS duplexhez specifikus kölcsönhatás révén történő hozzákapcsolódásával, a DNS hélix fö hornyában.

RacB fehérje csökkentésére alkalmas antiszensz nukleinsavszekvencia levezethető ezt a fehérjét kódoló nukleínsav-szekvencia - például az 1. számú, 3. számú vagy 5. számú szekvenciákban bemutatott nukleinsav—szekvencia vagy a fehérje funkcionális ekvivalensét kódoló - például a 34., 36., 38., 40., 42., 44.,

46., 48., 49., 51., 53,, 55., 57., 61., 63., 65., 67. vagy 69, számú szekvenciákban bemutatott - nukieínsav-szekvencía felhasználásával, a Watson és Crick féle bázispárosítás szabályait követve. Az antiszensz nukleinsav-szekvencia komplementer lehet a nevezett fehérje átírt mRNS-ének egészével, korlátozódhat annak kódoló régiójára vagy tartalmazhatja csupán a mRbS kódoló vagy nem-kódoló szekvenciájával részlegesen komplementer nukieotitíokat. Ilyenformán tehát az oligonukleotíd komplementer lehet például a nevezett fehérje transzlációs startját tartalmazó régiójával. Antiszensz nukleinsav-szekvenciák lehetnek például 5, 10,

7®.. 3$®/wm * φ φ Φ X Φ

15, 20, 2.5, 30, 35, 40, 45 vagy 50 nukieotíd hosszúságúak, de lehetnek hosszabbak is és tartalmazhatnak legalább 100, 200,

500, 1000, 2000 vagy 5000 nukleotidot. Antíszensz nukleinsavszekvenciák kifejexhetők rekombináns technikával vagy szintet!zálhatök kémiai vagy enzimes úton, a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. Kémiai szintézis esetén felhasználhatók természetes vagy módosított nukieotidok. Módosított nukieotidok megnövekedett, biokémiai stabilitást nyújthatnak az antiszensz nukleinsav-szekvencía számára és megnövelhetik az antiszensz nukieinsav—szskvencia és szensz célszekvencia .között kialakuló duplex fizikai stabilitását. A következők alkalmazhatok;

foszt'orti oát származékok és akrídinnal szubsztituált nukieotidok, úgymint 5-fluor-uracíi, 5-bróm-uraciI, 5-klőr-uracil, 5-jöd-uracil, hipoxantin, xantín, 4-ac.etíi-cítozin, 5-(karboxi-hidroxi-metil}uracii, 5- (karboxi-matíi-amíno-metil; -2-tiourlcin, 5“(kazbcxi-mstíl-amino-metii)uracii, dihidro-uracíl, p-D-g&íaktozlí-kveozín, .inozin, Nö-izopentenii-adenin, l-metii-guanin, l-metil-inozin, 2,2-dimetil-guanín, 2-metii-adenin, 2-metil-guanin, 3-metii-citozin, 5~metii~citozin, hú-adenin, 7-metíI-guanin, 5-metil-amino-metil-uracíl, 5-metoxi-amino~metil-2~tiouracil, β-D~mannoz.il-kveozín, 5^f-metoxi-karboxí-metíi-uracil, 5-metoxi-uracil,

2-metiItio-Nt-izopenteníl-adenin, uracil-5-oxi-ecetsav, pszeudouracii, kveozín, 2-tiocitozln, S-metil-S-tiouracil, 2-tiouracÍl,

4-tiouraciI, 5-metíi-uraeil, urací1-5-oxi-ecetsav-metil-észter, uracil-5-oxi-scetsav, 3-(S-amíno-AK-z-karboxi-propii)-uracii és 2₍ö-díamino-purín,

További előnyben részesített megvalósítási formában a RacB

ÖV ö Rd /55f /O5> ?

♦ X ν fehérje kifejeződése gátolható olyan nukieotid-szekvcnciákkal, amelyek komplementerek a RacB gén szabályozó régiójával {például 'RacB promőterrel és/vagy fokozóval) és amelyek ezzel a DNS dupla hélíxszel tripla hellkálís szerkezeteket képeznek oly módon, hogy a RacB gén transzkripciója csökken. Ilyen módszereket Írnak le üelene és Maher az alábbi hivatkozásokban [Helene, Antican.cer Drug Rés. 5{6), 563-634 (1991); Helene et ai., Ann. NY Acad. Scí, 660, 27-36 (1992); Naher, Bioassays 14 (12), 307-815 (1992)]. Egy további megvalósítási formában az antiszensz nukleinsavmolekula lehet α-anomer nukleinsav. Ilyen α-anomer nukleinsavmolekulák olyan specifikus kettős-szálú hibrideket képeznek komplementer RNS-sei, amelyben — a szokásos β-nukleinsavakkal szemben - a két szál egymással párhuzamosan fut [Gautier et ai.» Nucl, Acids Rés. 15, 6625-6641 (±987)]. Az antiszensz nukleinsavmolekula tartakmazhat továbbá 2'-C-metii-ribonukleotidokat [Inoue et ai,, buci, Acids Rés. 15, 6131-6148 (±987)] vagy koméra RNS/DNS analógokat is (Inoue et al,, FESS Lett, 215, 327-330 (1987)].

ej Rác® antiszensz nuklelnsav-scekvencáa hefejsetése ribozimA fent leírt antiszensz stratégia előnyösen kombinálható ribozim módszerrel. Katalitikus RNS molekulák vagy ribozimok adaptálhatók bármilyen cél RNS-hez történő hozzéiilesztéshez és a foszfediészter váz hasításához specifikus pozíciókban a cél RNS funkcionális dszsktiváiása céljából [Tanner, FEMS Mierofeíol, Rév. 23(3), 257-275 (1999)], A ribozim maga ezáltal nem módosul, de képes további cél RNS molekulák hasítására. A ribozim szekvenciák beépítése antiszensz RNS-ekbe átadja ezt az enzimhez ha ♦ * ♦ *« * ·» * ♦ * * *♦ ·»< w «« >

s-onió RNS-hasitó tulajdonságot ezeknek az antíszensz RNS-eknek, ilyenformán növelve azok hatékonyságát a cél RNS Inaktiválásában. Ilyen ribozim antíszensz RNS molekulák létrehozását és felhasználását Írják le például Haséihozf és munkatársai [Natúré

334, 585-591 í 19881].

Szén a módon ribozímok (például „kalapácsfejű ríbozimok) [Haselhoff and Gerlach, Natúré 334, 585-591 (1988)] katalitikusán felhasználhatók egy visszaszorítandó enzim, például RacB mRNSének hasítására és transzlációjának megakadályozására. A ribozim technika képes növelni egy antíszensz stratégia hatékonyságát. Specifikus fehérjék csökkentése céljából ríbozimok kifejezésére szolgaié módszereket írnak le az EB 0 291 533, EP 0 321 201 és EP 0 360 257 számú európai szabadalmi leírások, Ribozim kifejezését növényi sejtekben is leírták már [Steinecke et al., RMBO a. 11(4), 1525-1530 (199.2); de Eeyter et ai., Mól. Gén. Génét, 250(3), 329-338 (1996)], Megfelelő cél szekvenciák és ríbozimok meghatározhatók például az alábbi irodalomban leírtak szerint [Steinecke, Ríbozymes, Methóds in Ceil Biology 50, Galbraith et al·,, eds., Academic Press, Inc. (1995)] a ribozim RÉS és a cél RNS másodlagos szerkezetének valamint ezek kölcsönhatásának kiszámításával [Bayley et al., Plánt Mól. Síel, 18 (2), 353-361 (1992); Lloyd and Davis et al., Mól, Gén. Génét. 242(6), 653-657 (1994)]. Például összeállíthatók a Tetrahymena L-19 IVS RNS származékai olyan régiókkal, amelyek komplementerek a visszaszorítandó RacB fehérje mRNS-ével (lásd még az ü.S.P. 4,987,071 és 5,116,742 számú szabadalmi iratokat). Másik lehetőségként ilyen ríbozimok azonosíthatók sokféle ríbozimot tartalmazó könyvtárak7S-.35S/BB/M3 bői is, szelekciós eljárással [Saráéi and Szostak, Science 261, 1411-1418 (1993;).

d) RacB sxensz nalleinsa^-szeh/encia hevese fcése együttes sznpressziő kováibasára

RacB nukieinssv-szekvencía kifejezése szánsz, orientációban a megfelelő homológ endogén gén együttes visszaszorításához vezethet. Endogén génnel homológiát matató csensz RNS kifejződése csökkentheti vagy kikapcsolhatja as előző kifejeződését, ahhoz hasonlóan, mint amit antiszensz megközelítések esetében leírtak [Jorgensen et ai., Plánt Mól. Bioi. 31 (5}, 957-973 (1996); Goring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1770-1774 (1991); Smith et ai., Hol. Gén. Génét. 224, 447-481 (1990); Napol! et al.,

Plánt Cell 2, 279-289 (1.390); Van dér Krol et al,, 2, 291-299 (1990)]. Ebben as összefüggésben a visszaszorítandó homológ gén lehet teljes egészében vagy csak egy részletével reprezentált a bevezetett szerkezetben. A transzláció lehetősége nem szükséges. Ennek -a technikának az alkalmazását. írják le növényekben például hapcii és munkatársai [Plánt Cell 2, 279-289 (1990)) és as U.3.P, 5,034,323 .számú szabadalmi irat..

Az együttes szupressziót előnyösen olyan szekvencia felhasználásával valósítjuk meg, amely lényegében azonos a RacB fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló nukleínsav-szekvenciának — például az 1,, 3. vagy 5. számú szekvenciának vagy funkcionális ekvivalensét kódoló, például a 34., 361, 38

48., 49., 51., 53, _f 61, y S3.

vacv S9< számú szekvenciában bemutatott szekvenciának ···· ieoaiább egv részrétévé

φ φ

-* « « « ej Pojrtináne-negatív RacB fehérjét hódoló saileiasav-szeiveKcaeh

RacB fehérje működése vagy aktivitása hatékonyan visszafordítható e RacB fehérje domínáns-negativ változatának kifejezésével is. Módszerek egy fehérje működésének vagy aktivitásának csökkentésére annak negatív-domináns formája együttes kifejezésével. /elismertek a szakmában [hagne and Hsmmati-Brívaniou, Curr. lopícs ín Bevelop. Bioi. 36, 75—98 (1998); Perimutter and Alberoia-Ila, Curr. Opín. in Immunoi. 8J2), 285-290 (1996); Sheppard, Am. J. Respíratory Celi & Mól. Bioi. 11.(1), 1-6 (1994); Herskovítz, Natúré 329, 219-222 (1987)].

Domináns-negatív RacB változat előidézhető példán n

co·

avnak	előnyösen asz	;p ar a g ί n sa v r a	tör-
rizs	vagy árpa Ra	cm, f⁷ θ'η ώ Γ ή: θ Ύ	V- ÍV A A „ .ci

idott	esetben, más	fajokból szár	ma z 6
asoni	ő szerin is	(a kukorica,	rizs
28.	pozíciójában)	***· JflQQ-h'&fc ái?oz	ható
ramma	1 történő összehasonlítá	ssal

vagv ároa RacB fehérjéinek 20 („sorba állítással), Ezeket a mutációkat do.minán.s~negatív RacB változat létrehozására előnyösen a RacB fehérjéket kódoló nukieinsav-szekvenciák szintjén végezzük el. Megfelelő mutáció előidézhető például BCR-közvetítette in vítro műtagenezissei, a kívánt mutáció bevezetéséhez alkalmas oiígonukleotid primerek felhasználásával . Ezt a szakmában jólísmert módszerekkel hajtjuk végre, például az „LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (lakara

Shuzo, Kyoto) alkalmazható- erre a célra. A kukorica RacB fehérje domínáns-negativ változatának előállítására szolgáló módszert

6ό cnem.

Chem. Bioi. 4 ( imák le a WO 00/15815 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ís (4. példa).

Különösen előnyben részesítjük az -árpa, rizs vagy kukorica RacB fehérjék - 7., 8. és 9. számú szekvenciákban leírt ·- dombnáns-negativ változatait.

f) RacB gének, RacB RNS-ek vagy RaeB fehérjék elleni DNSvagy fehérje-kötő faktorok bevezetése

RacB gén kifejeződése szintén csökkenthető specifikus DNSkötő faktorok - például a cink ujj transzkripciós faktor típus alkalmazásával. Ezek a faktorok hozzákapcsolódnak az endogén célszekvencia (célba vett gén) genomíális szekvenciájához, előnyösen annak szabályozó régióihoz és az endogén gén represszióját eredményezik. Ilyen eljárás alkalmazása lehetővé teszi endogén RacB gén kifejeződésének csökkentését anélkül, hogy annak szekvenciáját rekombináns módon manipulálni kellene. Már leírtak alkalmas módszereket megfelelő faktorok elkészítésére [Breier et al., J, Bioi, Chem. 276: (31), 29466-29478 (2001); Breier et ai.,

J. Hol, Bioi. 305(4)_r 489-502 (2000); Beerli et al., Proc. Natl.

Ac-ad. Sci. USA 9 7 (4) , 1455-1500 (2000) ; Beerli et al., J. Bioi.

75(42), 32517-32627 (2000) ; Segal and Barbas, , 34-39 (2000); hang and Kim, u.

275(12), 8742-8740 (2000); Beerli et ai.,

USA 95(25), 14628-14633 (1958); Kim et

Curr. Opin.

Bioi. Chem.

Proc, Na 11. Acad. S c i .

ί j,., Proc. Náci. Acao.

Sci. USA 94 08), 3616-3620 (1957); Kiug et al., u. Mól. Bioi.

293(2), 215-218 (1999); Tsaí et al., Adv. Drug Deliv, Rév. 30 (13), 23-31 (1999); Mapp et al., Proc, Naf 1. Acad. Sci. USA 97(8),,

3930-3935 (2000); Sharrocks et al., Int. J. Biochem. Cell Bioi.

$ s 3)? Sv S3S *«♦ φ> «*»<

7

29-(12)¼ 1371-138? (1997); Zh-ang et al., J. Bioi. Chem. 275(43) , 33850-33860 (2000)}.

Szék a faktorok kiválaszthatók a RacB gén bármelyik kívánt részletének felhasználásával. Ez a szegmens előnyösen a promoter régióban helyezkedik el. Génszupresszióhoz azonban választható részlet a kódoló exonok vagy intro-n-ok .régiójából is. A szóban forgó szegmensek a szakember számiéra hozzáférhetőek génbankböi adatbázis kutatással vagy génbankban nem található RacB cDNSéből kiindulva, genomkönyvtár megfelelő genomiális kiónokra történő soreenelésével, A szakember rendelkezik az ezekhez szükséges szakértelemmel.

Továbbá lehetőség van. olyan, faktorok bevezetésére a sejtekbe, amelyek magát a RacB célfehérjét gátolják. A fehérje-kötő faktorok lehetnek például ap-tamerek [Bámulok and Mayer, Curr. Top Microbiol. immunoi. 243, 123-136 (1999)} vagy antitestek vagy antitest fragmentumok vagy egyszálú antitestek. Ezeknek a faktoroknak az előállítására irányuló módszereket már leírtak és ezek ismertek a szakember számára.. Például egy citopiazmás scFv antitestet a fítokróm A fehérje aktivitásának szabályozására alkalmaztak genetikailag módosított dohány növényekben [Owen et al..

Biotechnoi. (NY) 10( 7), 790-794 (1992); Frankén et al., Curr.

Opin. Biotechnoi. 8(4) , 411-416 (1.997); Whitelam, Trend Plánt Sc.i. 1., 286-272 (1996)}.

A génkífejezödés visszaszorítható külön erre a célra készített kis molekulatömegű szintetikus, például políamid típusú vegyüietekkel ís [Dervan and. Bürii, Curr, Opín, Chem, Bioi. 3, 688693 (1999); Gottesfeld et al., Gene Exp. 9(1-2), 77-91 (2000)}.

β» * Κ 'Ezek az oligomerek tartalmazzák a [3-(dimetil-amino)-prop.il]-amint,

N-metil-3-h.ídro.xi-pirrolt, N-metil-imidazolt és N-met ii-pirroit.

és adaptálhatók kettős-szálú DNS bármelyik darabjához oly módon, hogy szekvencia-specifíklus módon hozzákötődnek a DNS hélix fő hornyához és blokkolják ezeknek a génszekvenciáknak a. kífejező-

dését.	Erre	a óéira	alkaim	azható	módszereket írnak	[ ;Ci	az	alábbi
irodai	mák [	3remer et	al.,	Sí.oor	g. Med-		) ,	2 0 9	3-2103
.· ^f‘y Γ\;\ h v	. ·?< x Λ; i	sári et	al.,	Chem.	Bioi.	8(6) , 583	-592	(	<·, λ . V V .i. ?' χ
Gottes	Τ Λ ! •l·,. ti) U, ΡΛ	et al., ö	r. Mól.	. Bioi.	3 0 9 ( 3)	, 615-623 (	200	1);	Wurtz
se al,	, Org	lett. 3	(Sí, 1	201-12:1	03 (2001	L) ; Víang et	al.	, 3	ioorg.
Med. C	íhem.	9(8), 653	-657 {	2001);	ürfeach	and Dérvan,	Dr	oc.	Natl.
Acad.	Sci.	USA 98(8)	, 4 343	— 4:3 4 3	(2301; ;	Chi.ang et a	.·. V f.	. γ	Bioi.
Cher·,	27 5(3;	2), 2424b-	24254	(2000);	h

AacB KNS lebomlását okozó vírus nukleinsav™szekvenciák es w <y •'Ύ Ae &><Slti:W4SSiÁ e f f T*la yτ» ,*«> tfy Hfifr

RacB kifejeződés hatékonyan visszaszorítható a specifikus RacB BBS lebomlásának kiváltásával ís a növényben, vírus expresszíós rendszer (amplicon) segítségével [Angell et al.., Plánt J, 20(3) , 357-362 (1993)}. Szék a rendszerek, amelyeket „7I<5S (viral índuoed gene sílencíng) elnevezéssel ís illetnek, a visszaszorítandó transzkríptumokkal homológ nukleinsav-szekvenciákat juttatnak be a növénybe vírus vektorok segítségével. Ezután a transzkripció kikapcsolódik, valószínűleg a növény vírusok elleni védekező mechanizmusa következtében. Erre alkalmas technikákat és módszereket. írnak le az alábbi irodalmi hivatkozások [Ratelíff et al,, Plánt Dl 25-(2),. 237-245 (2001); Fagard and Vaucheret, Plánt Mól. Bioi. 43(2-3), 235-293 (2000);

?'S.353/3E'/OZ

Ananda'lakshmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 95 (22), 1307913084 (1998); Puiz, Platt Cell 10(6), 937-946 (1998)].

h) Fndogén AacS g-énelé®! homológ· rehomóioáoiófe indukáló szerkezetek bevezetése, például kuock-out mutánsok létrehozására Csökkent RaoB aktivitású homológ rekombináns szervezet létrehozása céljából alkalmazható például endogén. Rác® génnek legalább egy olyan részletét tartalmazó nukleinsav szerkezet, amely legalább egy nukleotíd deléciójával, addíciójával vagy szubsztitúciójával oly módon módosított, hogy működése csökkent vagy teljesen megszűnt. A módosítás vonatkozhat a gén szabályozó elemeire is (például a promóterrej oly módon, hogy a kódoló szekvencia érintetlen marad, a kifejeződés {transzkripció és/vagy transzláció) azonban nem jön létre vagy csökken.

Hagyományos homológ rekombináció esetén a módosított régió

5'- és 3^f-végén további nukleínsav-szekvencíákkal szegélyezett, amelyeknek elegendő hosszúságúnknak kell lenniük ahhoz, hogy a rekombináció lehetővé váljon, Ezek szabály szerint néhány száz bázistól néhány kíiobázisíg terjedő: hosszúságúak lehetnek [Thomas and üapeochi, Cell 51, S03 (1987)? Strepp et al., Proc. Natl,

Acad. Sci, 3SA 95(8), 4368-4373 (1998)}. Homológ rekombinációhoz a gazdaszervezetet ~ például növényt - a. rekombináns szerkezettel transzformáljuk az alábbiakban leírt módszer szerint és olyan klánokat válogatunk ki - például antibiotikum vagy herbicid rezisztencia felhasználásával — amelyekben a rekombináció sikeresen lejátszódott,

Homológ rskombináció viszonylag ritka esemény magasabb rendű eukariótákban, különösen növényekben. A gazdaszervezet oenomjába •?S.35:S/SS/M2 * ν

J történő véletlenszerű, (ranáom} beépülés van túlsúlyban. Egy lehetőség a véletlenszerűen beépült szekvenciák eltávolítására és így a helyes homológ rekombinációval rendelkező sejtklónok. számának növelésére az ü.S.P. 6,110), 736 számú szabadalmi iratban leírt, szekvencia-specifikus rekombinációs rendszer alkalmazása. Ennek segítségével újból törölhetek nem-specifikusán beépült szekvenciák és amely egyszerűsíti a sikeres homológ rekombinációval beépültek kiválogatását. Számos szekvencia-specifikus rekombinációs rendszer alkalmazható, ezekre példák a Cre/lox Pl bakteriofág rendszer, az FLP/FRT élesztő rendszer, a Gin rekomfolnáz a Mu tágból, a Pin rekombináz £h ccil-bói és a pSRl plazmád R/RS rendszere. Előnyben részesítjük a Cre/lox Pi bakteriofág rendszert és az FLP/FRT élesztő rendszert. A Cre/lox és az FLP/FRT rekombináz rendszereket már alkalmazták növényekre [ödell et al., Mól a. Gén. Génét. 223, 369-37 8 {1990}].

1/ Mutációk (péidánl stop kódonok, leolvasási keret eltolások ás hasonlók j hevese táse endogén JtaoS génekbe tunkoló veszt és létrehozása céljából

További alkalmas módszerek a RacB aktivitás csökkentésére a nonszensz .mutációk bevezetése endogén RacB génekbe, például RNS/DNS oiigonukleotidok bevezetésével a növénybe [Shu et al., hat. Biotechnol. 18 (5) , 555-558 (2000)] és knook-out mutánsok létrehozása, például T-DNS mutagenezís segítségével [Koncz et al._:, Plánt Mól. Bioi. .20(5), 963-976 (1992)], ENU (N-etil-N-nitrozo-karbamid> mutagenezissel vagy homológ rekombinációval [Hohn and Puchta, Proc. heti. Aoad, Sci. OSA 96, 8321-8323 {1939}], ront mutációk ís létrehozhatók DNS-RNS hibridek segítse78, sSS/wmu * * gével, ez „chimeraplasty néven is ismert (Cole-Strauss et al., Nuci. Acids Rés. 27 (5), 1323-1.330 (1999); Emieo, Gene Therapv Am. Sci. .87:3;, 240-247 (1999)j.

A dsRNSi módszereket, szensz RNS és „7TGS („vírus induced gene síiéncing - vírus indukálta géncsiliapítás} segítségével történő együttes kifejeződést szintén „poszt-transzkripciós géncsillapításnak (post-txanscriptlónál gene sitencing - PTGS) nevezzük. A PTGS módszerek, a RacB funkció vagy aktivitás domináns-negativ RacB változatokkal történő csökkentéséhez hasonlóan különösen előnyösek, mivel a visszaszorítandó endogén gén és a rekombinánssn kifejeződő szensz vagy dsRNS nukleínsav-szekvencia közötti (vagy az endogén gén és annak domínáns-negativ változata közötti? homolőgíára vonatkozó követelmények kisebbek, mint például. a hagyományos antíszensz megközelítés esetében. A homolőgíára vonatkozó ilyen kritériumokat említenek a dsRRS módszer leírásában és ezek általánosan alkalmazhatók PTGS módszerekre vagy do.....

mínáns-negativ megközelítésekben. A kukorica, rizs és árpa RacB fehérjék közötti nagyfokú nomológiáből következik a feltételezés, hogy ez a fehérje növényekben nagyon konzervatív. Tehát az árpából, kukoricából vagy rizsből származó RacB nukleínsavszekvenciák felhasználásával feltételezhetően szintén hatékonyan visszaszorítható homológ RacB fehérjék kifejeződése más fajokban anélkül, hogy szükség lenne az ezekben előforduló RacB homológok izolálására és szerkezeti vizsgálatára, Ennek megfelelően kevesebb munka szükséges ehhez. Hasonlóan, rizsből, kukoricából vagy árpából származó RacB fehérje domi.náns-negatív változatok felhasználása feltételezhetően szintén hatékonyan csökkenti vagy

73.353/3S/M2

ΦΦφ

Φ* V # visszaszorítja a RacB homológ működését/aktivitását más növényfajokban .

Mindazokat az anyagokat és vegyületeket, amelyek közvetlenül vagy közvetetten csökkentik RacB fehérje mennyiségét, RNS mennyiségét, génaktivitását vagy fehérje aktivitását, beleértjük az „antiRacB kifejezésbe, As „anti-RacB kifejezés félreérthetetlenül magába foglalja a fent leírt módszerekben alkalmazott nukleinsavszekvenciákat, paptídeket, fehérjéket vagy egyéb faktorokat.

salálmány célját tekintve a „bevezetés 'ej e zés minden olyan módszert felölel, amely képes közvetlenül vagy közvetetten „antí-RacB vegyületet bejuttatni növénybe vagy annak sejtjébe, sejtalkotórészébe, szövetébe, szervébe vagy magjába, vagy abban ilyen vegyületet létrehozni. Közvetlen és közvetett módszerek egyaránt idetartoznak, A bevezetés eredményezheti „an.ti~R.acS vegyület (például dsRNS) átmeneti jelenlétét vagy pedig stabil

A fent leirt megközelítések eltérő természetének köszönhetően az „anti-RacB vegyület működését kifejtheti közvetlenül (például endogén RacB génbe történő inszéróiéval}. Azonban közvetett úton is kifejtheti működését az RNS-sé történő transzkripciót követően (például antíszensz megközelítések esetében) vagy transzkripciót és fehérjévé történő transzlációt követően (például kötő-faktorok esetében), A találmány oltalmi körébe egyaránt beletartóznak közvetlenül és közvetetten működő „antiR-aeB vegyüíetek,

A „bevezetés kifejezés felölel például transzfekeiós, transzdukeiős vagy transzformációs módszereket, ?S,358/3£/KSZ * ♦ * φΦ > X * ** *

Az „anti-RacB vegyületekbe ilyenformán beletartoznak kifejeződést (azaz transzkripciót és adott esetben transzlációt) csökkentő rekombináns expresszién szerkezetek is -· például RacB dsRNS vagy RacB „antiszensz RNS - előnyösen növényben vagy növényi részben, szövetben, szervben vagy magban.

Nevezett expressziős szerkezetekben a nukleinsav molekula, amelynek kifejeződése (transzkripcicja és adott esetben transzlációja) „anti-RacB vegyületet hoz létre, előnyösen működőképesen kapcsolódik legalább egy genetikai kontroli elemmel (például promóterrel), amely biztosítja kifejeződését egy szervezetben, előnyösen növényekben. Ha az expressziős szerkezetet közvetlenül kell bevezetni a növénybe és az „anti-RacB vegyületet (például a RacB dsRNS-t) a növényen belül kell létrehozni, növény-specifikus genetikai kontroll elemeket (például prcmötereket) részesítünk előnyben. Az „anti-RacB vegyüiet azonban létrehozható más szervezetben is vagy in vit.ro körülmények között és azután vezetjük be a növénybe (a 6. és 7. példában leírtak szerint). Ebben az összefüggésben előnyben részesítünk minden olyan prokaríota vagy eukariőta genetikai kontroli elemet (például promőtere két), amely lehetővé teszi a kifejeződést az adott esetben kiválasztott szervezetben.

Működőképes kapcsolódáson azt értjük, hogy például a prométérnék a kifejezendő nukieinsav-szekvenciával (például „antiRacB vegyülettel) és adott esetben további szabályozó elemekkel, úgymint például terminátorral való szekvencia elrendezése oly scdon történjen, hogy minden egyes szabályozó elem. teljesíthesse feladatát a nukleinsav-szekvencia rekombináns kifejeződése 73.35373&/R&-2 során, a nukleinsav-szekvsnciáknak szensz vagy antiszensz RNShez viszonyított elrendezésétől függően. Ehhez kémiai értelemben, vett közvetlen kapcsolódásra nem. feltétlenül van szükség. Genetikai kontroll szekvenciák, úgymint például fokozó (enhancerj szekvenciák, kifejthetik hatásukat a célszekvenci.á.ra távoli pozíciókból is, vagy ténylegesen más DNS molekulákból, Előnyben részesített elrendezések azok, amelyekben a rekombinánsan kifejezendő nukleinsav-szekvencia a promóterként működő szekvencia mögött helyezkedik el oly módon, hogy a két szekvencia kovalensen kapcsolódik egymáshoz. A promóter szekvencia és a rekombinánsan kifejezendő nukleinsav-szekvencia közötti távolság előnyösen kevesebb, mint 2Ό0 bázispár, előnyösebben kevesebb, mint

z v u oaza aρar,	legelőnyösebben	kevesebb, mint 50 házi	spár.
Működőké:	pes kapcsolódás	és expressziós kazetta	létrehoz	n a n ó
a s zokasós r	«kombinációs és	klőnozási technikákká	1 például	a z
alábbi iroda	.Imákban leírtak	szerint [Maniatís,	pyg seft	and
Sambrook, Mól	.eoular Cloning,	A Laboratory Manual,	2nd ed.	Cold

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY) ( í -τ qa;

Siihavy, Berman and Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) (1984);

Ausubel et al,, Current Protoeols in Mölécular Biology, Greene

Publíshing Assoc, and Wiiey Interscience (1987) és Gelvin et al,, Plánt Mölécular Biology Manna1 (1990;}, A két szekvencia között további szekvenciák is elhelyezkedhetnek., amelyek például restrikciós enzimek specifikus hasítási helyeinek összekötőiként (linkerekként) működnek vagy szignál peptídeket kódolnak. Szekvenciák inszercíója fúziós fehérjék kifejeződéséhez is vezethet. 73.353/3E/J&2

A kifejezendő nukleinsav-szekvenoia és promóter kapcsolódását tartalmazó expressziős kazetta előnyösen vektorba beépített formában van és növény genomjába beépíthető, például transzformációval.

Az expressziős kazetta elnevezés azonban olyan szerkezeteket ís jelöl, amelyekben a promoter endogén EaeB gén mögött helyezkedik el, például homológ rekombinációval·, és a RacB fehérje találmány szerinti csökkentése antiszensz RacB RNS kifejeződése révén valósul meg. Ehhez hasonlóan, „anti-Rác3 vegyület (például RacB dsRNS-t vagy RacB antiszensz RNS-t kódoló nukleinsav™ szekvencia) elhelyezkedhet endogén promóter mögött oly módon, hogy ugyanaz a hatás érvényesüljön. Mindkét megközelítés ötletes expresszíós kazettákat eredményez.

A növény-specifikus promóter kifejezésbe elvileg beletartozik minden olyan promóter, amely képes gének, különösen idegen gének kifejeződésének irányítására növényekben vagy növényi részekben, növényi sejtekben, növényi szövetekben vagy növénykultúrákban. Ebben az összefüggésben a kifejeződés lehet például konstitutív,, indukálható vagy fejlődés-függő.

A következőket részesítjük előnyben:

a) Konstitutív promőterek

Előnyben részesített vektorok azok, amelyek konstitutív kifejeződést tesznek lehetővé növényekben [Benfey et al., SMBO J. 8, 2195-2202 (1988)]. „Konstitutív promóter alatt olyan örömérere két értünk, amelyek nagyszámú - előnyösen minden ~ szövetben biztosítják a kifejeződést a növényi egyedfejlődés lényeges periódusában, előnyösen a növény fejlődésének minden szakaszában.

Főleg növényi promótert vagy növényi vírusból származó promötert 7S'.35S/SS/m * * $>* ·*. ,* részesítünk előnyben. Különösen előnyben részesítjük a karfiol mozaik vírus CaMV 35S transzkriptám promotert [Franck et al., Cell 21, 285-294 (1380); Odeli et al.. Natúré 313, 810-812 (1.9855 ; Shewmaker et al,, Virology 140, 281-288 (1985) ; Gardner et al. , alant Mól. Bioi. 6, 221-228 (1988)] vagy a 19S CaMV promótert (ö.S'.P. 5,352,805 számú szabadalmi irat és WO 84/02913 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés; és [Benfey et ai., SM8O J. 8, 2195-2202 (1989)]. Egyéb alkalmas konstitutív promóter a „Rubisco email subunlt (SSU Rubisco kis alegység) promóter (U.S.P. 4,962,028 számú szabadalmi irat), a legnminB promóter (GenBank, X03677), az Rgrobaoteriüm nopalín szintetáz promoter, a TR duális promóter, az Agrr óba cseri um CCS (octopine syntha.se ~ oktopin szintetáz) promóter, az ubikvitin promóter :orr et a.

tan

Sor. tíze

29, 637-649 (1995)], az ubikvitin 1 promóter [Cbristensen et al., Plánt Mól, Bioi, 18, 675-539 (1992); Bruce et ai., Pro-c. Natl. Acad,. Sci. USA 6 6,

9692-9696 (1989)], a Smas promóter, a fahéjalkohol dehidrogenáz promóter (U.S.P. 5,683,439 számú szabadalmi irat), a vakuoium

ATPaz alegysége	t K	promöterei vagy	a búza prolinba	n gazdag i	£2 ’r·. r·
jéjének promőte	ΐ	(WO 91/13991 kö:	szétételi számú	nemzetközi	3 2:6.
hadaim! bejeler	íté	s) és további ol	. y an gének promö	£* j _e &	ϊ ú. V6 k

nek konstitutív kifejeződése növényekben iólismert a szakember számára. Különösen előnyben részesített konstitutív promóter a nítriiáz 1 (nitl) gén promótere A, thaiiana-foől (GenBank,

YÖ7648.2, nukleotídok 2456-4340,) [Billebrand et ai., Gene 170,

197-200 ;1996)].

b) Szövetspeeifikus promóterek 7g.35SZB'E/RA2

Φ*ΧΦ χ«

4 Φ Φ

Előnyben részesítünk továbbá a virágpor-tartóra (portokra; , magházra, virágra, levélre, szárra, gyökérre és magra specifikus p r orsó t e r eke fc.

Magspecifikus promóterek

Ezek közé tartozik például a fazeolin promoter {U.S-.B. 5,504,200 számú szabadalmi irat) [Bustos et ai., Plánt Cell 1(9}, 839-853 (1989)], a :2S albnmin gén promotere [Joseffson et ai., J. Bioi. Chem. 262, 12196-12201 (1987)], a legumin promóter [Shirsat et sl., Mól. gén. Génét. 215(2), 326-331 (1989)}, az USP (unknown seed protein - ismeretlen magfehérje) promóter [Baumlein et al., Női. Gén. Génét. 225(3), 459-467 (1991)], a napin gén promóter (U.3.P. 5,608,152 számú szabadalmi irat) [Stalberg et ai. , L.

Planta 199, 515-519 (1996)], a szacharóz kötő fehérje promotere (WO 00/26388 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) vagy a legumin B4 promoter [LeS4; Baumlein et ai., Mól. Gén. Gehet. 225, 121-128 (1991); Baumlein et ai., Plánt J. 2(2), 233239 (1992) ; Fiedler et al.. Biotechnoi. (NY) 13(10) , 1090Í (1995)];, az arahidgpsis oleosin promóter (WO 98/45461 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), a Brassica Bce4 prométer (WO 91/13980 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) . További alkalmas magspeoifikus promöterek a nagy molekalatömegü ylufcen.infc (high moiecular weight gintenln - HMWG) , oliadint, elágaztató enzimet (branching enzyme), AGP glükóz pirofoszfatázt AGPáz-t} vagy keményítő szintetázt kódoló gének promóterei. Továbbá előnyben részesítünk olyan promotereket, amelyek lehetővé teszik a magspeoifikus kifejeződést egyszikű növényekben, úgymint kukoricában, árpában, búzában, rozsban, 78.35Ö/SS/PA2 rizsben és hasonlókban. A következők alkalmazhatók előnyösen: az lpt2 vagy iptl gén promótere (WO 95/15389 és WÖ 95/23230 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentések) vagy a WO 99/16890 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt promőterek (a boráéin gén, glutelin gén, oryzin gén, prolemin gén, g Hadin gén, zein. gén, kasirin gén vagy a secaiin gén pr omó t. ere) .

Gumó-, tároiógyökér- vagy gyökér.specif ikus promóterek, úgymint például a patatin promőter X. osztály (B33), a burgonya ka t e ρ s z i n D í sah i hí tor pr omó tér.

Le vé1sρeo i £i kus p romóte re k

Ide tartozik a. burgonya oitoszol FBPáz promoter (NO 97/05900 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), a Rubisco (ribulőz-i,5-difoszfát karboxiláz) SSÖ (kis alegység) promőter a burgonyából származó ST-LS'I promőter [Stoekhaus et al., ?

f

EMBö -T ^f

2445-2451 (1989)}. Különösen speciálisan előnyben rs

szesit jü)	< a z	eρ 1 de rmi s z - sp e ci.f i ku s j	sromőtereket	, úgymint	P	él
az OXL?	( oxa	laze-oxídase-ifke protei	.n ~ oxa lat	oxiászhoz	h	3S
•Ρ θ Η ώ ή 6¾ j	gén.	promőterét [Wei et ai.,	P J. s n tr. Μ o 1. <	Bioi. 36,	-í	Öl

/ <.< π \

Ilyen például a fitoen szintetáz (phytoene synthase) promótér fWO 92/16635 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) vagy a F-rr gén promótere (WO 98/22593 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés).

Bortok-spécitikus promoterek

Ezek közé tartozik például az 5126 promóter (U.S.. B, 78,3j587BE/&&2

9

5, 689, 049, 5, 689,051 számú szabadalmi íratok), a glob-1 promoter és a γ-zéin promóter.

c) Kémiailag indukálható promóterek

Az expresszíós kazetták tartalmazhatnak kémiailag indukálható promotert is [Gatz et al., Annu, Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Siói. 48, 89—108 (1997)], amellyel az exogén gén kifejeződése a növényben egy bizonyos időpontra szabályozható. Ilyen prométerek, úgymint például a PR Pl promoter (Ward et ai., Plánt dől. Bioi. 22, 361-366 (1993)], szállóiísavval indukálható promoter (KO 95/19443 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) , foenzén-szulfonamíddai indukálható promoter (SP (5 388 186 számú európai szabadalmi leírás), tetraciklinnel indukálható prcmóter [Gatz et al., Plánt J. 2, 397-404 (1992) j_z abscisic savval indukálható promoter (EP 0 338 528 számú európai szabadalmi leírás) vagy hasonlóan, eta.noil.ai vagy eikiohexanonnai indukálható promoter (K0 93/21334 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés).

d) Stressz hatásra vagy patogénnei indukálható promóterek

Előnyben részesített promóterek továbbá azok., amelyek bictikus vagy abi.otl.kus stressz hatására indukálódnak, úgymint például a PRP1 gén patogénnei. indukálható promőtere (vagy gstl promótér) például a burgonyából (WO 96/28561 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) és [Kard et ai., Plánt Mól. Bioi. 22, 361-366 (1993)], a paradicsom magas hőmérsékleten indukálható hsp70 vagy hspSO promőtere (ú.S.P. 5,187,267), a burgonya alacsony hőmérsékleten indukálható a-amiláz promőtere (ΚΌ 96/12814 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), a ténnyel

További patogénnel indukálh;	szó promóterek közé tartozik a
lenből származó Fial promoter	(WO 96/34943 közzétételi számú
nemzetközi szabadalmi bejelentés.)	, a Vstl promoter [Schubert et
ai. f Plánt .Mól. Bioi. 34., 417-426	(1997)] és az SAS4. szesskviter-
pén cikláz prombter dohányból (U.	S.P.v 6,100,451 számú szabadalmi

nyeként indukálódnak, úgymint pél	.dául PR fehérjék, SÁR fehérjék,
β-l,3-giükanáz, kitináz és hason.	ló gének promóterei [Redolfi et
ai., Neth, J, Plánt Patkói. 89,	245-254 (1963); üknes et al. ,

325-342 (1987}; Somssich et al,,	Proc, Natl. Acad. Sor. USA 83,
2427-2430 (1986); Chem et al.,	Plánt J, 10, 955-966 (1996);
áhang and Sing, Proc, Natl. Acad.	Ser. USA 91, 250/-2511 (1994)
Warner et. al. , Plánt J. 3, 19)	i-20'1 (1993); Siebertz et al.,

Plánt Ceil 1, 961-968 (1989)].

Szintén idetartoznak sérülé:	sre indukálódó promóterek, úgy-
mint a pinll gén [Ryan, Ann, Rév,	Phytopath. 28, 425-449 (1990);
Duan et al.., Nat. Siotech. 14,	4 94-498 (1996.)], a unni és wun2
gének (S.S.P. 5,428,148), a winl	és win2 gének [Stanford et al.,
Mól. Gén. Génét, 215, 200-206 (IS	í89)], szisztémán [McGurl et al.,
Science 225, 1570-1573 (1992)],	a WIP1 gén (Rohmeier et al.,
Plánt Mól, Bioi, 22, 783-792 (	1993); Eckelkamp et al,, FESS

Szintén idetartoznak sérülé:	sre indukálódó promóterek, úgy-
mint a pinll gén (Ryan, Ann, Rév,	Phytopath. 28, 425-449 (1990);
Duan et al.., Nat. Siotech. 14,	4 94-498 (1996)], a wunl és wun2
gének (O.S.P. 5,428,148), a winl	és win2 gének [Stanford et al.,
Mól. Gén. Génét, 215, 200-208 (IS	í89)]_z szisztémán [McGurl et al.,
Science 225, 1575-1573 (1992)],	a WIP1 gén (Rohmeier et al.,
Plánt Mól. Bioi, 22, 783-792 (	1993); Eckelkamp et al,, FESS
73 v

SÍ

Lett. 323, 73-76 (1993)}, az ΜΡΣ gén (Corderok et ai., Plánt. J. 6(2), 141-150 (1994)] prcmóterei és hasonlók.

További patogénnel indukálható promóter forrás a PR géncsalád. Ezekben a promöterekben számos elem bizonyult előnyösnek. Ilyenformán a PR-.2d promótőrben a -364-től -28S-ig terjedő régió szalicilét specifitást nyújt (Buchel et al., Plánt Mól. Bioi. 39, 493-594 (1996)]» Az 5'-TCATCTTCTT-3^Í szekvencia ismétlődően fordul elő az árpa β-l, 3-gI.ükanáz promóterében és több, mint 30 további stressz .indukálta génben. Dohányban ez a régió egy magfehérjéhez kötődik, melynek mennyisége szalioiiáttai növekszik. A dohányból és Araőidgpsis-ból származó PR-l promóterek (EP-A 0 332 104 számú szabadalmi irat és WC 98/03536 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) szintén alkalmasak patogénnel indukálható promóterként< Előnyben részesítjük a „savas PR-5 (acrdio PR.-5 - aPR5) promőt ereket árpából [Schweizer et al.. Plánt Rhysiol. 114, 79-88 (1997)} és búzából [Rebmann et al., Plánt Mól. Bioi. 16, 329-331 (1991.)], mivel ezek különösen specifikusan patogénnel indukálhatok. Az aPR.5 fehérjék a patogén támadását követően körülbelül 4-6 órán. belül felhalmozódnak és csak nagyon korlátozott háttér kifejeződést mutatnak (WO 99/66057 közzétételt számú nemzetközi szabadalmi bejelentés). Egy megközelítés nagyobb patogénnel indukált specífitás eléréséhez, szintetikus promóterek előállítása ismert patogén-válasz elemek kombinációjából [Rushtcn et al,, Plánt Cell 14, 749-762 (2002); WO 00/01630 és WO 99/66057 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentések}. További patogénnel indukálható promóterek különböző fajokból jól ismertek a szakember számára (EP-A 1 165 794, EP-A 1 062 356, 78.358/WSA2 » 4 * * « ί« * * «

ΕΡ-Α 1 041 148 és ΕΡ-Α 1 032 €84 számú szabadalmi Irat).

e) Fejlődés-függő promóterek

További alkalmas promóterek például a gyümölcs érésre specifikus promóterek, úgymint például a paradicsom gyümölcs érésre specifikus promótere (NO 94/21794 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés és EP 409 625 számú európai szabadalmi. leírású - Fejlődés-függő promóterek közé tartoznak részben a .szövetspécifikus promóterek, mivel egyes szövetek a természetben fejlődéstől függően alakulnak ki.

Különösen előnyben részesítünk konstitutív promótereket és levél- és/vagy szár-specifikus promótereket., patogénnel indukálható és epidermisz-specifikus promötereket, leginkább előnyben részesítjük a patogénnel indukálható és epidermisz-specifikus promótereket.

Ezenkívül további olyan promóterek kapcsolódhatnak működőképesen a kifejezendő nukleínsav-szekvenciához, amelyek lehetővé teszik a kifejeződést további növényi szövetekben vagy más szervezetekben, úgymint például E. coli baktériumokban. Elvileg az Összes fent leírt promőfer alkalmas növényi p.romőter,

A találmány szerinti expressziős kazettákban vagy vektorokban jelen levő nukleínsav-szekvenoiák a promóteren kívül működőképesen kapcsolódhatnak további genetikai kontroli szekvenciákkal, A „genetikai kontroli szekvenciák'⁷ kifejezésbe tágabb értelemben minden olyan szekvenciát beleértünk, amelyek a találmány szerinti expresszíós kazettában levő gén(ek) kifejeződésére vagy működésére hatással vannak. Például genetikai kontroll szekvenciák módosítják a transzkripciót és transzlációt prokarióta vagy

78,’58/SS/SAZ eukarió-ta szervezetekben. A találmány szerinti expresszibe kazetták előnyösen tartalmazzák az embrionális epidermiszre specifikus és/vagy a rekombinánsan kifejezendő, szóban forgó nukleinsav-szekvenciától 5^f-upstream elhelyezkedő virág-specifikus promótert. és 3^Z-downstream sgy terminátor szekvenciát további genetikai kontroll szekvenciaként, és adott esetben további szokásos szabályozó elemeket, amelyek minden esetben működőképesen kapcsolódnak a rekombinánsan kifejeződő nukielnaav-szekvencíához.

Genetikai kontroll szekvenciák tartalmaznak további promőtereket, promóter elemeket vagy minimális promotereket is, amelyeknek mindegyike képes módosítani a kifejeződést irányító sajátságokat, Ilyenformán például a szövet-specifikus kifejeződés genetikai kontroll szekvenciáknak köszönhetően függhet még bizonyos stressz faktoroktól, ilyen elemeket Írnak le például, víz stresszre, abscisíc savra [Lám and Chua, J. Bioi. Chem. 2.66 (26) , 17131-17135 (1991)] és höstresszre [Sohoffi et al., Mól. Gén, Génét. 217(2-3), 246-253 (1989)].

További előnyben részesített genetikai kontroli szekvenciák például, a Gram-pozítiv promőterekben amy és 3202, élesztő vagy penészgomba prométerekben ADCi, MPa, AC, P-60, CYC'i, GAPDH, TEF, rp28, ADR.

Elvileg minden természetes promőt-er a -· fentiekben említettekhez hasonló - saját szabályozó szekvenciáival használható fel a találmány szerinti, eljárásban, Ezenkívül előnyösen használhatók szintetikus promőterek is.

Genetikai kontroll szekvenciák tartalmazzák továbbá a.z 5' nem-transz Iáit régiókat, intronokat vagy gének nem-kódoló 3'78.3S8/SB/RAZ

X *, régióit is, úgymint például az aktin-I intront vagy az 1, 2 és 6 Adhl-S intronokat [általános referenciaként lásd: The Maize Handbook, Chapt. 116, Freeiing and Walbot, eds., Springer NY (1994)]. bemutatták, hogy ezek jelentős szerepet játszhatnak a génkifejeződés szabályozásában, ilyenformán bemutatták, hogy 5' - nemtransziáit szekvenciák képesek fokozni heteroióg gének átmenet.! (tranziens) kifejeződését. Transzlációs- fokosokra (enhancer) példaként említhető a dohány mozaik vírus δ*'-vezér szekvenciája [Gailie et al., Nu-cl.- Acids. Rés. 15, 8693-8711 (1997)] és hasonlók, Továbbá ezek elősegíthetik a szövetspecífitást [Rouster et al., Plánt J. 15, 455-440 (1998)].

Az expressziós kazetta előnyösen tartalmazhat egy vagy több ismert fokozó szekvenciát, működőképesen a promöterhez kapcsolva, amely(ek) lehetővé teszi(k) a nukieinsav-szekvencia fokozott rekombináns kifejeződését. Ezenkívül előnyös szekvenciák, úgymint további szabályozó elemek vagy termínátorck szintén inssertálhstók a rekombinánsan kifejezendő nukleinsav-szekvenoiák Süvegénél, A rekombinánsan kifejezendő nukleinsav-szekvenciák egy vagy több példánya, lehet jelen a génszerkezetben.

Kontroll szekvenciaként alkalmas poliadenilációs szignálok a növényi poliadenilációs szignálok, előnyösen olyanok, amelyek lényegében megfelelnek Agrohscteriu® cumeracíens-bői származó T-DNS poliadenilációs szignáloknak, különösen a pTíACHS Ti piazmid T-DNS 3, génjének (oktopín szintetáz gén) [Gielen et ai., EMBO »J. 3, 835 (1384)] vagy funkcionális ekvivalenseinek. Példák különösen alkalmas termi na tor szekvenciákra az ÖCS (oktopixx szintetáz) terminálon és a NOS (nopalin szintetáz) terminátor.

•V φ *<S ** «♦ φ * Φ k

Kontroll szekvenciák alatt értünk továbbá olyan szekvenciákat, amelyek lehetővé tesznek homológ rekombinációt vagy inezereiót a gazdaszervezet genomjába, vagy amelyek a genomból történő eltávolítást tesznek lehetővé. Homológ rekombináció esetén például a szóban forgó gén természetes promótere kicserélhető az embrionális epidermiszre és/vagy virágra specifikus promóterrel. Eljárások, úgymint a cre/lox technológia lehetővé teszik az expresszió'S kazetta szövetspecifikus, adott esetben indukálható eltávolítását a gazdaszervezet genomjából [Sauer, Methods 14(4), 381-392 (1998)], Ebben a módszerben speciális szegélyező szekvenciák (lox szekvenciák) kapcsolódnak a céigénhez, amelyek később lehetővé teszik azok eltávolítását ere rekombináz segítségévei.

Expressziős kazetták és azokból származó vektorok tartalmazhatnak további funkcionális elemeket. Értelmezésünk szerint a funkcionális elem kifejezésbe tágabb értelemben minden olyan elem beletartozik, amely hatással van a találmány szerinti expressziös kazetták, vektorok vagy transzgén szervezetek létrehozására, megsokszorozására vagy működésére. Korlátozást nem jelentő példaként említhetők a következők;

a) .aaxfc^zrefc, amelyek rezisztenciát közvetítenek anyagcsere inhibitorral, úgymint z-dezoxiglükóz-S-foszfáttal (MG

98/45456 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), antibiotikumokkal vagy biocídekkeí, előnyösen herbícidekkel, úgymint például kanamicínnel, G418~cal, bieoxricinnei vagy higromícinnei szemben vagy pedig foszfinotricínnel és hasonlókkal szemben. Különösen előnyben részesített szelekciós marketek a herbícidekkel szembeni rezisztenciát közvetítők. Említhető pél7S.25S/SE/BAZ » « A' » ♦ · * * * *♦ «φ dák: foszfinotrieín acetil transzferázokat (PAT) kódold DNS szekvenciák, glutamin szintetáz inhibitorokat inaktiválók {bar és pat gének), 5-enoipíruvíl-sikimát-3-foszfát színtetáz gének (EPSP szintetáz gének), amelyek Glyphosate® (N~foszfonometilglicin) elleni rezisztenciát adnak át, a gox gén, amely Giyphosate®~bontő enzimet. (Glyphosate oxidoreduktazt} kódol, a deh gén (dalapont inaktiváló dehaiogenázt kódol) , szuifon.ilkarbamidot és imidazoiinont inaktiváló acetoiaktát szintetáz és bxn gének, amelyek bromoxiniit lebontó aítrilaz enzimeket kódolnak, az apektincmicin antifoiotikum rezisztenciát eredményező aasa gén, a sztreptomicin rezisztenciát átadó sztrsptömi cin foszfotranszferáz (SPT) gén, a neonácin foszfotranszferáz (NPTT1) gén, amely kanamicinnei vagy geneticidinnel szembeni rezisztenciát közvetít, a higromicín foszfotranszferáz (HPT) gén, amely higromicin rezisztenciát eredményez, a szuífonil-karbamiddai szembeni rezisztenciát közvetítő acetoiaktát színtetáz (ALS) gén (például az S4 és/vagy Hra mutációval rendelkező mutáns ALS vál~

hzgromzc	,ι.Γϊ re
szembeni	rezis
(például	az S4
b Ό 2 <a b 0 jC ?	•
b)	Kxpoxi

í\\a -S;	nos
,·χ ,·η> Tt £tr SÍ 11 bt	kst
PIX·”'·	0.
GFP)	ÍS:

«yénaár, amelyek könnyen kimutatható fehérjéket kódolnak, amelyek színes vagy enzimes aktivitásuk révén lehetővé teszik a transzformáció hatékonyságának, a kifejeződés helyének vagy a kifejeződés idejének becslését. Ebben as összefüggésben különösen előnyben részesítünk olyan riporter fehérjéket kódoló géneket [Schenborn et al., Mól. Siotechnol. 13(1)¼ 2.9-44 (1993)], a zöld fluoreszcens fehérjét (green fluorescent protein SFP) [Sheen et al,, Plánt u. 8.(5¼ 777-794 (1395); Haselhoff et al., Proe.. Natl, Acad. Sói. USA 94 (6) , 22-2127 (1997); Peichei ? & , £ /SEJ /ρ et al., Proe. Natl. Acad. Sci, USA 93(12}, 5883-5893 (1996);

Tia.n et al., Plánt Cell Rep, 16, 267-271 (1.997); Chui et al.,

Curr. Bioi. 6>, 325-330 (1996); ief'fel et al., Biotechnlques .23 (5}, 912-913 (1997) KO 97/4X228 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés], klóramfeníkol transzferáré, Iuciferázt

MiIIar et al,, Plánt ν' V V ,· fi

(Cw e t a l.	V .··>' ··' y\ /·> xür f' 4».·' t.v.& V'. v	··> J Λ t	856-859
Mól. Bioi.	Rep. 10,	324-4	14 (199
(aequorin)	gént [Pra;	sher e	t a; . ,
; o r ; a ' i a «κ, X. V \ χ.· > χ ~L c—	59-1268 (1	.985} ],	a β-ga.
í ii ö V <2* ii V 'X v	szövetben	piros	színű

O XÚ Ü ÍC Ü mU Z O	re he rget	kódoló	gén, a;
aktivitás	közvetlen	analiz	lsét te

β-galaktozidáz gént, R iókusz gént ,nü antocianin pigment termelését Ly lehetővé teszi a promoter :bi külső vegyület vagy kromogén szubsztrátok hozzáadása nélkül) [Dellaporta et ai., Chromosome Structure and Funotíon: Impact of New Concepts, 13 th Stadler Genetíos Symp. 11, 263-282 (1938)], különösen nagyon előnyben részesítjük a β-giűkuronidáz gént [Jefferson et al., EMSO J. 6, 3901—3907 (1987)}.

o) B®pHAácdó« origó, amely biztosítja a találmány szerinti expressziős kazetták vagy vektorok megsokszorozását, például E< coii-ban. Említhető példák az OR; (DNS replikációs origó), a pBR322 őri vagy a PISA őri [Mániát is, Fritsch and Sambrook, Moiecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY) (1989)}»

d) Siessek, amelyek az Agrobaoterinm közvetítette növény transzformáláshoz szükségesek, úgymint például a T--DNS jobb vagy baloldali határa vagy a vir régió.

Sikeres homológ rekombináción átesett sejtek szelekciójához pc p ·;. c /κί?' /dyx c* *

vagy transzformált sejtek szelekciójához, ezenkívül rendszerint szükség van szelekciós markor bevezetésére, amely bíociddel (például herbiciddel}, anyagcsere inhibitorral, úgymint 2-dezoxiglükóz-6-f oszf átta.l (WO 38/45456 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) vagy antibiotikummal szemben rezisztenciát nyújt azoknak a sejteknek, amelyekben sikeresen lezajlott a rekombináció. A szelekciós markor lehetővé teszi a transzformált sejtek elválasztását a nem-transzformált sejtektől [MeCormick et al.. Plánt Cell Rep. 5, 81-84 (1986}].

A találmány szerinti expressziös kazetta bevezetése egy szervezetbe vagy sejtekbe, szövetekbe, szervekbe, ezek részeibe vagy magjába (előnyösen növényekbe vagy növényi sejtekbe, szövetbe, szervbe, ezek részeibe vagy magjába) előnyösen befolyásolható olyan vektorok felhasználásával, amelyek az expressziós kazettákat tartalmazzák. Az exoressziös Kazetta nevezem vektorba (például plazmidba) megfelelő restrikciós hasítási helyen keresztül. Az így kialakult plazmidot először £. coíi-ba visszük, Megfelelően transzformáit £. coli sejteket szelektálunk, szaporítunk és a rekombináns plazmidot kinyerjük a szakember számára ismert módszerekkel. Restrikciós analízis és szekvenálás igazolhatja a helyes klónozás! lépést.

vektorokra példák lehetnek piazmídok, kozmidok, rágok, vírusok vagy agrobaktériamok, Előnyös megvalósítási formában az expressziős kazettát plazmád vektorok segítségével juttatjuk be. Előnyben részesített vektorok azok, amelyek az expressziős kazetta stabil beépülését. teszik lehetővé a gazdaszervezet genomjába.

78.358/ΕΒ/ΒΛ2

Transzformált szervezet (vagy transzformált sejt vagy szövet) létrehozásához szükséges: a szóban forgó DNS, RNS vagy fehérje bevezetése a releváns gazdaszervezetbe.

Ehhez a művelethez számos módszer áll. rendelkezésre, amelyeket a transzformáció (vagy transzdukeáé vagy transzfékelő) [Keown et al., Metn. Enzvmol. 185, 527-537 (1990)1 kifejezéssel lile-

tünk. A DNS	vagy

ímektérassa.	1 varr/

bombázással.	A sejt
kémiailag is	, példái
hogy a DNS c	iif fúzió'
protoplaszt	fúzióvá.
úavmínt mini	θ *1 ϊζ A ]<

mákkal. DNS	bevezet -
ráció, ahol
verzibilisen	félig
Írnak le az	alábbi
100, 247-250	(1991)
112 (1991);	Guerch
Neuhause et	3.J,„f Un
al., Natúré	327, 70

(1980); Horsch et al..

Plánt Sci. 52, 111-116 (1987);

Jenát. 75, 30-36 (1987) ; Klein et

Novell et al., Science 208, 1265 .ence 227, 1229-1231 (1985); deBlock et al., Plánt Physicl. 91, 694-701 (1989); Weíssbaoh and Weissbach, (eds.) Methods fór Plánt Molecular Biology, Academic Press Inc. (1988); Sehuler and 2ielinski, (eds.) Methods in Plánt Molecular Biology, Academic Press Inc. (1989)}.

Növényekben a transzformálás fent Isirt módszereit és nővé7S .358/BS7RA2.

»« * φ

átmeneti vagy stabil	transzformációra használjuk fel. Alkalmas
módszerek köze tartori	k főleg a prctopiaszt transzformáció coli-
etiléngiikoiial irnduká	ét DNS felvétellel, a génpuskával végzett
bioiisstikus módszer,	amely részecske bombázási módszerként is-

hatban és aikróm]ektá	Iás.
Ezeken a „közvet	len transzformációs technikákon kívül a

baeterium tiaaefáciens	vagy Apróba o tér iwn rhizopenes segítségévei
is. Az Apróbaoferínm	közvetítette transzformáció alkalmasabb
kétszikű növényi sej te	:k esetében, ilyen módszert írnak le példa-

használunk a transzfer	nációhoz, a Ti vagy Rí plazmid l-DNS-nek
legalább a jobboldali	határa, de legtöbb esetben a jobb- és bal-
oldali határa egyaránt	~ szegélyező régió formájában - kapcsoló-
dik a bevezetendő expr	essziós kazettához.
Előnyé s e n foináris	5 vektorokat használunk. Bináris vektorok
mind S. coii-ban, mi.í	id .Ag.robaoterium~ban képesek repli.kálődní.
Ezek rendszerint tart?	$lm.aznak szelekciós marker vént és linkért

szegélyezve. Ezek	közvetlenül bevihetők Apróbacterí ws-ba
[Hoisters et al., Mól.	Gén. Génét. 1S3, 181-187 (1978)). A sze-
lekciós marker gén lei	letévé teszi a transzformálódott agrobakté-
?s. ms/Bz/mm

« ♦ ríumok kiválogatását és például az nptll gén esetében kanamicin rezisztenciát eredményez. A gazdaszervezetként alkalmazott Agrchacterium-nak ebben az esetben már tartalmaznia kell a vír régiót hordozó plazmidot. Az utóbbi szükséges a T-DKB beviteléhez a növényi sejtbe. Ilyen siódon transzformált Agrobscúerium alkalmazható növényi sejtek transzformálására. A T-DNS felhasználását növényi sejtek transzformálására sokan tanulmányozták már és részletesen leírták (EP 120 516 számú európai szabadalmi leírás) [Hoekema, The Binary Plánt vector System, Offsetdrukkeríj Kanters, Alblasserdam, Chapt. V,; An et al., EMBO J. £, 277-287 (198 5)], Különböző bináris vektorok ismertek, amelyek közül néhány kereskedelmi forgalomban kapható, például pSlí01,2 vagy pBlhl9 (Clontech Laboratories, Inc. ÖSA).

További, növényekben való kifejezéshez alkalmas promotereket írnak le az alábbi irodalmakban [Rogers et al., Meth. Enzymol. 153, 253-277 (1987)? Schardl et al., Gene 61, 1-11 (1987); Berger et al., Proc. háti, Acad. Sci, USA 86, 8402-8406 (1989)},

Közvetlen transzformációs technikák alkalmasak bármilyen szervezethez vagy sejttípushoz,

A felhasznált piazmiddal szemben semmilyen különleges kivánalom nincsen DNS vagy RNS növényi sejtbe történő injektálása vagy elektroporácíóia esetén. Egyszerű plazmidok, úgymint a püC sorozat tagjai alkalmazhatok. Ha a transzformáit sejtekből komplett növények regenerálása a cél, szükség van még szelekciós markér génre a plazmidon.

Stabilan transzformált sejtek, azaz amelyek a bevezetett DNS-t a gazdasejt DNS-ébe beépülve tartalmazzák, kiválogathatok

7&.358/BE/R&2 a nem-transzformait sejtek közül, ha a bevezetett DNS részét képezi szelekciós markor gén, Példák markérként felhasználható génekre mindazok, amelyek képesek antibiotikumokkal vagy béreiéidekkel. (úgymint kanamioinnei, G418~oal, foleomícinnel, higronicinnel vagy foszfinotrieinnel, lásd fent) szembeni rezisztenciát átadni. Ilyen markor géneket kifejezd transzformált sejtek képesek túlélni a megfelelő antibiotikum vagy herbicid olyan koncentrációjának jelenlétében, amely a nem-transzformált vad típusú sejteket elpusztítja. Példákat említünk a fentiekben és ezek előnyösen tartalmazzák a bar gént, amely foszfinotricín herbiciddel szembeni rezisztenciát [Rathore et ai., Plánt Mól,

Bioi. 21 (5),, 871-884 (1993)], az nptil gént, amely kanamioinnei szembeni rezisztenciát, a hpt gént, amely higromicinnel szembeni rezisztenciát nyújt vagy a Glyphosafce herbiciddel szembeni rezisztenciát adó EP-SP gént. A szelekciós mar kér lehetővé teszi, transzformált sejtek kiválogatását nem-transzformált sejtek közül [McCormick et al,, Plánt Celi Kap, 5, 81-84 (1986)]. Az eredményül kapott növények termeszthetők és hagyományos úton hibridizálhatók. Két vagy több generációt kell szaporítani ahhoz, hogy megbizonyosodjunk, a genomba történt beépülés valóban stabil és örökletes.

A fent említett módszerek megtalálhatok például az alábbi irodalmakban [Jenes et al., Teohnígues fór Gene Transfer, Transgenio Plants Vol, 1, Engineeríng and ütilization, Kung and Wu eds., Aoademic Press p. 128-143 (1993) és Potrykus, Anno. Rév.

Plánt Physiol, Plánt Mól. Bioi. 42, 205-225 (1991)], A kifejezendő genetikai szerkezetet előnyösen olyan vektorba klónozzuk, amely ai79.359/aS/MS kaimas Agrofoa oteriu?a tymefaoíens transzformálására, például a pBinls plazmádba [Bevan et al., Noel. Acids Rés. 12, 8?llf (1984)].

Mihelyt létrejön a transzformált növényi sejt, komplett növény állítható elő a szakmában ismert módszerekkel. Például kallusz tenyészeteket használunk kiindulási anyagként. Ebben, mint nem differenciálódott biomasszában, sári és gyökér kifejlődése ndnkáiható ismert módon. A kapott sariak eiültethetők és tér mesztnetok,

A szakember járatos az ilyen, növényi sejtből növényi részeket és intakt növényeket regeneráló eljárásokban, Ilyen módszereket írnak le az alábbiakban [Fenneil et al.. Plánt Celi Rep. 11, 567-570 (1992); Stoeger et ai,, Plánt Celi Rep. 14, 273-273 (1995); Jahne et ai., Theor. Appl. Génét. 89, 525-533 (1994)].

A találmány szerinti eljárás előnyösen kombinálható további olyan módszerekkel, amelyek patogénnel (például rovarokkal, penészgombákkai, baktériumokkal, nematódákkai és hasonlókkal) szembeni rezisztenciát, stressz tűrőképességet eredményeznek, vagy más vonatkozásban javítják a növény tulajdonságait. Példákat említenek többek között Dunwell és munkatársai (Transgenic approaches to erop Improvement, J. Exp, Bot, 51, 487-496 (2000)}..

A találmány tárgyát képezi továbbá az árpa RacB fehérje a 2. számú szekvencia szerint és annak domínáns-negatív változata, például a 7. számú szekvencia.

A találmány tárgyát képezik, továbá az árpa RacB fehérjét kódoló uuklsinsav-szekvenciák, előnyösen az 1.. számú szekvenciában fessatatott szekvencia, az ezzel komplementer nukieinsav-szekvenoia és a. genetikai kód degeneráltsága folytán ebből származó •78.353/BE-/K&Z szekvenciák.

A találmány tárgyát képezik továbbá az árpa RacB' fehérje funkcionális ekvivalensei, a 35., 37, vagy 39. számú szekvenciában bemutatott polípeptidek.

A találmány tárgyát képezik továbbá az árpa RacB fehérje funkcionális ekvivalenseit kódoló nukieinsasv-szekvenciák, előnyösen a 34,# 36, vagy 33. számú szekvenciában bemutatott szekvenciák, az ezekkel komplementer nukleinsav-szekvenci.ák és a genetikai kód degeneráltsága folytán ebből származó szekvenciák.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti nukieinsav-szekvenoiák valamelyikét tartalmazó expressziős kazetták. A találmány szerinti transzgén expressziős kazettában az árpa RacB- fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia legalább egy - a fentiekben definiált - genetikai kontroll elemmel kapcsolódik oly módon, hogy képes kifejeződni ítranszkripcióra és adott esetben transzlációra képes) bármilyen szervezetben, előnyösen növényekben. Alkalmas genetikai kontroll elemeket már leírtunk font. A transzgén expresszíós kazetták a fenti definíciónak megfelelően tartalmazhatnak még további funkcionális elemeket. Az árpa RacB fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia. ínszertáiható az expreszszíös kazettába szensz: vagy antiszensz orientációban és ilyenformán szensz vagy antiszensz RNS kifejeződéséhez vezet. A transzgén expressziős kazettát tartalmazó transzgén vektorok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

A ,,transzgén' kifejezés például egy nukleinsav-szekvencia, vagy nevezett nukleínsav-szekvencíát tartalmazó expresszíós kazetta vagy vektor, vagy nevezett nukleínsav-szekvencíávai, 78.358/3E/R&Z ft **

US expressziós kazettával vagy vektorral transzformált szervezet vonatkozásában mindazokra a rekornbináns módszerekkel létrehozott összeállításokra utal, amelyekben vagy

a) a RacB nukleinsav-szekvencia, vagy

b) a RacB nukleinsav-szekvenoláhos működőképesen kapcsolódó genetikai kontroll szekvencia, például promóter, vagy ci a) és b) nem található meg annak természetes genetikai környezetében, vagy rekornbináns módszerekkel módosított, ahoi a módosításra példa egy vagy több nukleotid maradék szubsztitúciója, addíciója, deléciója, inverziója vagy inszerciója. Természetes genetikai környezet alatt az eredeti szervezetben levő természetes kromoszómáira lókuszt értjük vagy annak jelenlétét genomiális könyvtárban, Genomiális könyvtár esetében előnyösen megőrződik a nukleinsav-ssekvemcia természetes genetikai környezete, legalább részben. A környezet a nukieinsav-szekvenciáfc legalább egyik oldalról szegélyező, legalább 50 bp, előnyösen legalább 500 bp, különösen előnyösen legalább 1000 bp, nagyon különösen előnyösen legalább 5000 bp hosszúságú szekvencia. Természetben előforduló expressziós kazetta - például a megfelelő RacB gén és RacB promóter természetben előforduló kombinációja - akkor válik transzgén expressziós kazettává, ha nem-természetes, szintetikus (mesterséges; módszerrel módosítjuk azt., például mutagenezissel. ilyen

mödssereket	írnak
bán és a WO	Ov/15
jelentésben	• lásd

Szintén	a ta(
7S.3SS/ES/FA2

* * zetek, amelyeket legalább egy találmány szerinti nukleinsavszekvenciával, találmány szerinti ezpressziós kazettával vagy találmány szerinti vektorral transzformálunk és ilyen szervezetekből származó sejtek, sejttenyészetek, szövetek, részek - úgymint például növényi szervesetek esetében levelek, gyökerek és hasonlók - vagy szaporítóanyag, A szervezet kifejezés tágabb értelemben egyaránt utal prokariőta és eukarióta szervezetekre, előnyösen baktériumokra, élesztőkre, penészgombákra, állati és növényi szervezetekre.

A következőket részesítjük előnyben:

a) Penészgombákat, úgymint Aspergiiliis, EreMo£&eciu!B, irichodersía, áshbya, Pfenrospora, Fosaríum, Bea u verfa vagy más gomba nemzetségeket (Indián Chem. ing. Section B. Voí. 37, No, 1,2 p. 15 (1995)]. Különösen előnyben részesítjük a fonalas hemiaszkomioeta Asbbya gossyp.il vagy Bremotheoium ashbyií fajokat,

b) Élesztőket, úgymint Candida, Saocharomyces, Hansenuia vagy Picbía nemzetségbe tartozókat, különösen előnyben részesítjük a Sacchazosivces c&r&vl&áae vagy Bichla pás tori s (ATCC 201178) fajokat.

o) Növényeket a fenti „növény definíció szerint, d) Gerinceseket és gerincteleneket. Különösen előnyben részesítjük gerincesek közül a nem-humán emlősöket, úgymint kutyát, macskát, juhot, kecskét, egeret, patkányt, szarvasmarhát vagy lovat. Előnyben részesített állati sejtek közé tartoznak CHO, COS és HEK293 sejtek. Előnyben részesített gerinctelenek közé tartoznak rovarsejtek, úgymint Frosopbíia S2 és Spodpptera

Sf9 vacv Sf21 sejtek.

φφ#

e) Prokaríóta szervezeteket, úgymint Gram-poziflv vagy Gramnegatív baktériumokat, úgymint Aeetobacter, Giuoonobaeter, Corynefaactsríum, Srev.íbaote'r.iwa, .SacilJus, CIostricium , Oyanobacter, Éscherichía (főleg Éscberiohia coli), Serratia, Staphybococcas, Áercröae tér, Álca 2 i gen.es _z Penicillin® vagy Zleteielia nemzetségbe tartozókat.

Transzgén szervezetként előnyben részesített gazda- vagy kiindulási szervezetek főleg növények a fenti definíciónak megfelelően. A találmány oltalmi körébe tartozik a növények királyságából a magasabb rendű és alacsonyabb rendű növények minden nemzetsége és faja. Továbbá idetartoznak az érett növények, magok, sarjak és magoncok, valamint az ezekből származó részek, szaporítóanyagok és kultúrák, például sejtkuitűrák, Érett növények közé sorolunk a magoncon túl bármilyen fejlődési szakaszban levő növényt. A magonc kifejezés korai fejlődési szakaszban levő, éretlen fiatal növényt jelent, .A találmány szerint előnyben részesített gazdanövények főleg olyan növények, amelyek felhasználhatók a találmány szerinti eljárásban, a fenti kritériumoknak megfelelő patogén-rezisztemets kialakításához, Különösen előnyben részesítünk egyszikű növényeket, úgymint búzát, zabot, kölest, árpát, rozsot, kukoricát, rizst, tönkölybúzát, cirokot, tritikálét, lent, cukorrépát, kétszikű növényként repcét, kanalát, zsázsát, Arabidopsíst, káposztát, szóját, lucernát, borsot, babot, mogyorót, burgonyát, dohányt, paradicsomot, padlizsánt, borsot, napraforgót, Tagetest, körömvirágot, salátát, dinnyét, tököt vagy cukkinit.

A transzgén szervezetek létrehozhatók a fent leírt transz”8.358/SE formációé vagy transzfekciős módszerekkel.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti transzgén szervezetek és a transzgén növényi szervezetekből származó sejtek, sejttenyészetek, részek - úgymint például, gyökerek, levelek és hasonlók - és transzgén szaporítóanyag, takarmányok, gyógyszerek vagy finomvegyszerek előállítására.

Továbbá előnyben részesítjük gyógyszerek vagy finomvegyszerek rekombináns előállításának módszerét olyan gazdaszervezetekben, ahol a gazdaszervezetet a fent leírt expressziős kazetták valamelyikével transzformáltuk és ez az expressziós kazetta egy vagy több olyan struktúrgént tartalmaz, amely a kívánt finomvegyszert kódolja vagy a kívánt finomvegyszer bioszintéziset. katalizálja. Az eljárás során a transzformált gazdaszervezetet szaporítjuk és a kívánt finomvegyszert izoláljuk a tápközegből. Ez az eljárás széles körben alkalmazható olyan finomvegyszerek, mint enzimek, vitaminok, amincsavak, cukrok, zsírsavak, természetes és szintetikus Ízesítők, aromaanyagok és színezékek előállítására. Különösen előnyben részesítjük tokoferoiok, tokotrienoiok és ksrotenoidok előállításai, A transzformált gazdaszervezeteket szaporítjuk és a terméket elválasztjuk a gazdaszervezettől vagy a tápközegtől a szakmában ismert módszerek alkalmazásával, Gyógyszerek, úgymint például antitestek vagy vakcinák előállítását írják le az alábbi szerzők [Hood and uilka, Curr. Opin. Bíoteehnol. 10 (i) , 382-386 (1999)? Ma and Víne, Curr. Top. Microbiol, Immun. 236, 275-292 (1999)].

ί Π

1. számú szekvencia:

s z ámű s ze k véne 1. a:

számú szekvencia:

számú s z e k vénei a:

számú szekvencia;

számú szekvencia:

8. számú szekvencia:

9. számú szekvencia:

lö, számú szekvencia:

11, számú szekvencia:

Íz, számú szekvencia:

13. számú szekvencia

14. számú szekvencia:

az árpa (Sordeum vuigare) RacB fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia az árpa (Sdrdeam vuigare) RacB fehérje aminosav-szekvenciája a rizs (űryza saidva) RacB fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia a rizs (Oryza saíiva) RacB fehérje aminosav- szekvencia ja a kukorica (fsa maya) RaoR fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia a kukorica (3ea maya) RacB fehérje aminosav-szekveneiája az árpa (üordeum vuigara) RacB fehérje domináns-negatív változatának aminosavszekvenciája a rizs (Orvra sárivá) RacB fehérje domináns-negativ változatának aminosavszekvenciája a kukorica (Reá maya) RacB fehérje domináns-negativ változatának aminosavszekvenciája

CRB-l oiigonukleotid primer

5'-GGATCGGATGAGCGCGTCCAGGT?-3^f

GW-2 oiigonukleotid primer

5^f-GTCGAGCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3^!

RÁCS-Rác3 primer

-gtgggcacatagtcggtggggaaggt ~3^f

Gén eRace r* 5^r pr íme r

5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3

GeneRscer™ 5^r beágyazott primer 5^r-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA- 3

15,	s zán'íű	szekvencia;	RacB szensz primer 5^!-gttca tcaa g tgcgtcaccgt g- 3'
16.	számú	szekvencia;	RacB antiszensz primer 5^Z ~ttagctteetcagttcttecctg-3^f
17.	számú	szekvencia:	BAS szensz primer 5'-egegcegcagccgagt acgac-3'
18,	számú	szekvéneia;	SAS antiszensz primer 5^f ~gt cs c a a aaacaca tgt a acc-3'
19,	számú	szekvencia;	OXLP szensz primer 5’’ - g gc c g a ca t gc a 1t c ace a g - 3^f
20.	számú	szekvencia;	OXLP antiszensz primer 5'-catctgatattgctgggtctg-3'
21.	számú	szekvencia:	UBI szensz primer 5^f~cca.agatgcagafcettcgtga~3'
'? ’?	számú	szekvencia;	OBI antiszensz primer 5' -ttcgcgataggtaaaagagca~3^f
23.	számú	szekvencia:	Ml3 fwd primer 5*-GTAAAAGGACGGCCAGTG-3/
24.	számú	szekvencia;	Ml3 rév primer 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3^f
25.	számú	szekvencia;	HvRopS bal primer 5^f-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3'
26.	számú	szekvencia;	HvRopG jobb primer 5'-CCATGCT1CATGTCCATAGTCA-3’
27.	számú	szekvencia;	BvRacD bal primer 5'-ggatccCGACTCCATGAGGAAAGCAT-3'
28.	számú	szekvencia;	BvRacD jobb primer 5'-gtegacGCGAGACACTGGAAAACAAA-3'
29.	számú	szekvencia;	HvRop4 bal. primer 5'“GGATCCttctcgtccatttagccggc~3^?
30.	számú	szekvencia;	HvBop4 jobb primer 5' -G? C GAC t ga t cac t1gaagcatgcc a g-3'

101 ί

»

31.	számú	szekvencia
7 •J& 9	S 2 cLiCí'-a	szekvencia
33.	számú	szekvencia
34 .	számú	szekvencia
35,	s z ámú	szekvencia
36,	számú	szekvencia
37.	számú	szekvencia
38 .	számú	szekvencia

RacB5^f'SamHI primer

5^f-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGT?-3^f

RacS3^?Sáli primer *-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

VI5 mutagenezis primer

- ACCGTGGGGGACGTCGCGGTCGGCAAGAG- 3' az árpából (Bordeum vulgars) származó HvRopő RacB homológot kódoló nukleinsav szekvencia az árpából (Ho.rdeum vulgare} származó HvRopG RacB homológ amlncsav-szekvenciája az árpából (Bordán® vclgare) származó HvRacD RacB homológot kódoló nukleinsav szekvencia az árpából (Bordeum RvRacD RacB homológ ája az árρábó 1 (Her deaai HvRop4 RacB fehérje nu k 1 e i ns a v- s zekven c l a vulgare) származó aminosav~s zekvéneivii Iga re) a z á rma z ö homológot kódoló

39.

számú szekvencia;

az árpából (Bordeum vulgare) származó HvRopá RacB homológ amino-sav-szekvenciáj-a

40.

számű s z ekvene1a:

a kukoricából (Bea siavs') származó RQR6 RacB homológot kódoló nukleinsav- szekvencia (GenB-ank, AJ278665)

41. számú szekvencia számú szökve:

a kukoricából (Bea maya) származó ROR6 RacB homológ amínosav-szekvenciája az Oryza sativa subsp. japoníca RACDP -szekvencia (Gen'Bank, AF21S381} számú szekvencia:

számú szekvencia:

az Orvra sativa subsp. japonica RAGDB RacB homológ amínosav-szekvenciája az Oryza sativa ROP4 RacB homológot kódoló nukleinsav-szekvencia (GénBank, AF3S0335)

7$, 35£/£*·5·/' RAS * ·« * * ί :

az Ozyza satíva ROP4 RacB homológ arain?

sav-szekvenciája

102 »ν *·»»♦

4 ♦ *

45.

β .

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

73.3’ s s ámú s ζe kve ηc ί a:

a z ámú s zekvéneia:

számú szekvencia:

s z áraű s ze kve.nc.1 a:

számú sze k ve ne ia:

s z ámú s z e k v en ci a:

s z áraú s z e kven c i a:

számú szekvencia:

s z ámú sz ekvene i a:

számú szekvencia:

a Zea ziays RACA RacB homológot kódoló nukleínsav-sz-ekvencía (GenSank, AF126052) a Bea ziays RACA RacB homológ aminosavszekvenciaj a árpából (nordeum vul-gars) származó RacB homológot kódoló nukieinsav-szekvencia (GenBank, SM816965;

Araóidcpols thaiiana-ből (At3gSli származó RacB homológot kódoló nukleinsa v~ s zekvencia

Arabídopsía thaliana~bói (At3gS1300> származó RacB homológ aminosavszekvenciája

Arabidopsis thaliana-foól (At2gl?8ÖÖ> származó RacB homológot kódoló nukleárisa v~ sz e kvenci a

Arahídopsis thaliana-bói (At2gl780ö) származó RacB homológ aminosavs z e kvene i á j a

Arahidopsis tóaliana-bei (At4g3595ö) származó RacB homológot kódoló nukleinsav-szekvencia

Arabidcpsis thaiíana-ből (At4g.3595O) származó RacB homológ aminosavszekvenciája

Arabidccsis thaliana-bói (Atlg75840) származó RacB homológot kódoló nukleins a v-s z e kvénei a

Arabidopsís úha I.iana-ból (Atlg75840) származó RacB homológ aminosavszakvenciája

s ν ·3

57, számú szekvencia; Arásbidcps'is thaliana-ból (At4g35020).

S2ár®azó RacB homológot kódoló nukleinsav-szekvencia

58.

számú szekvencia;

59.

számú szekvencia:

Arabidopsis thaiiana-hői ;At4g35020) származó RacB homológ aminosavszekvenciája

Arabidcpsis thaliana-ból (At lg.20090) származó RacB homológot kódoló nukleins a v - s z e kve ne i a számú szekvencia számú szekvencia

Arabidopsis thali.ana-foól. (AtÍg2009ö) származó RacB homológ aminosavszekvenciája .Arabídopsis thaiiana--b6i (Ati5g45970) származó RacB homológot kódoló nukleonsav-szekvencia

62. számú szekvencia: Araóídomsls thaliana-ból (At5g4597O) származó: RacB homológ aminosavszekvenciája

63. számú szekvencia: Arabidopsis thaiíana-bői (At3g48040j származó RacB homológot kódoló nukleins a v - s z e k ven c i a

64. számú szekvencia: Arabidopsis thaüaua-ból (At3g48ű4O) származó RacB homológ aminosavs z e k ve n c i á ja számú szekvencia

Arabidopsis thaiiana-bói (Ab5g62880) származó RacB homológot kódoló nukleinsav-szekvencia

66. számú szekvencia: Arabidopsis thaliana-ból (At5g62880) származó RacB homológ aminosavszekvenciaja

67, számú, szekvencia; Arabidopsis tnaiíana-ből (Atig28950) származó RacB homológot kódoló nukleinsav-s zekvencis

68. számú szekvencia: Arabidppsis thaiiana-ból (At4g28950) származó RacB homológ aminosavszekvenciája /BE/.hAd

69. számú szekvencia:	Arahiőopsis thaliana-ból (At2g44 6'90) származó RacB homológot kódoló cukiéinsa v - szekvencia
70. számú szekvencia:	Árabiccpsís thaiiana-bói (At.2g44 690) származó RacB homológ aainosavszekvenciája
71, számú szekvencia:	Fra. 18€ oiigonukleotid primer 5^, -ATGAGCGCGiCCÁGGTTCÁTA-3'

72. számú szekvencia; Fra 187 oiigonukleotid primer

	5' ~ATCAAACÁCCCCCT?CACGT?~3'
? 3. számú s z e kvenci a:	p S ü N3ΝIT_AtRacB_s transzgén exp résszí6 s vektor Arabídopsis thaliana RacB kifejezésére szensz orientációban
74, számú szekvencia:	pSON3XT.T AtRacB as transzgén expressziős vektor Arabidppsi.a thaliana RacB kifejezésére antiszensz orientációban
75. számú szekvencia:	pSúRÖXIT HvRacB s transzgén expresszíós vektor árpa RacB fragmentum kifejezésére szensz orientációban
76. számú szekvencia:	pSUN3NIT_HvRac3_ss transzgén expresszíós vektor árpa RacB fragmentum kifejezésére antiszensz orientációban

Ak ábrák rövid leírása

1. ábra: Árpa RacB, rizs RacB, kukorica RacB és humán Rací és Rac2 fehérjék aminosav-szekvenciálnak sorba állítása (összehasonlítása)

A szürkével árnyékolt régiók mutatják a G1 elem (GXXXXGKS/T; 13--20. aminosavakh, a Gx effektor régió (29-45. aadnosavak.}, a G3 elem (LWDTAGQ; 58-64. amlnosavak), a G4 elem (TKXD; 118-121, aminosavak) , a G5 elem (EXS) és a C-termináiis izopreniiáciős motívum (CXXX) [Hassanain et ai., Biochem. Biophys, Rés. Commun. 272(3;, 753-788 (2000)}. A kötőjelek szekvencia réseket jelölnek.

78.,.3Sm./££/ílM

Csillaggal jelöljük azokat az aminosavakat, amelyek minden homológban azonosak. Azokat az aminosavakat, amelyek egyrészt árpában, másrészt rizsben és kukoricában eltérnek egymástól feketefehérrel jelöljük. Domináns-negativ RacB változat előállításához előnyösen módosított pozíciókat a szekvenciák fölött fekete háromszöggel jelölünk.

2. ábra: RacB kifejezése epídermáíis szövetben

Pallas és BCPMla.12 (P10) árpa vonalakból származó RNS-sel végzett RT-PCR (reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció) , 24 órával BghA6~tal történt inokulációt követően. Az RNS extrakodójához keskeny abaxiális epidermisz csikókat (E, a levelek beoltott területéről) távolítottunk ei a mezof.il és az adaxíáiis epidermiszből (Μ), Ubíkvitin 1 (Ebi) szolgált szövetre nem-specifikus kifejeződés markereként, OXLP az epidermiszben történd génkífejeződés pozitív kontrolljaként és Bas a mezofll sejtekben történő génkifejeződés pozitív kontrolijaként.. Az RT-PCR-t 25 ampiifikácíős cikluson keresztül végeztük az alábbiakban leírtak szerint. Az RT-PCR termékeket a gélben denaturáltuk, blottoltuk és antíszensz RNS próbák segítségével mutattuk ki szigorú körülmények között,

3. ábra: PacS-t konstitutívan kifejezzük különböző rezisztens árpa vonalakban

RNS-t izoláltunk az Ingrid ÍMSo_f Rori, Bgh-érzékeny), BClngrid-mloö ímiof, Bori, Bgh-rezisztens) és A89 (mlo5, Bori,

S gh A 6 - r a mé r s é ke l *	:.en. ér	zskeny) árpa \	rá 11 o zabokból.,	közvetlenül
inokuiálás előtt <	:ü R)	és 8, 15 vagy	24 órával Bgh-	-val történt
beoltás után és 24	óra e	Η Τ.β: J t. éVft 1	nem oltott ko:	itroll nővé-

f-φ φ nyékből (24 R). Ubikvitin 1 (übij szolgált a konstitutív kifejeződés markereként, OXXP a Sgh-índukálta génkifejeződés pozitív kontrolljaként az epidermális rétegben. Az OX.L.P kifejeződést Northern blot-tal mutattuk ki. RseR-re és üoí-ra RT-PCR-t végeztünk a leírt 25 ampiífikácíős ciklussal. Az RT-PCR termékeket a gélben denaturáltuk, blottoltuk és antiszensz RNS próbák segítségével mutattuk ki szigorú körülmények között.

4, ábra.: ,,RNS in.ter.f erencba EscB-dsR.NS-seI csökkenti a SghA6 árpa iágyrothadás penetrációs hatékonyságát árpában

A relatív penetrációs hatékonyságot (2 effícacy - RPE) 6 Önálló kísérletben határoz' bői származó .Sgh-val történt inokuiálássa!.

dsR.NS-se.1 transzformált sejtek penetrációs hatékonysága és a kontroll dsRNS-sel transzformált sejtek penetrációs hatékonysága közötti eltérés alapján, az alábbiak szerint számítottuk (itt: átlagos penetrációs hatékonyság 57%). A százalékos RÉS számítása: (RPE-l)*108.

KacS-dsRN'S-sel transzformált sejtek PS

RPS —

jót (relatíve	penetr	rabion·
itároztuk meg	Paílas	árpá-
assau.. az RP	S-t a	Aa cS-

kontroll dsRNS-sel transzformált sejtek PS ; « (RPE-1}*100

A fekete oszlopok az RPS% értékeket reprezentálják minden .116 kísérlet legalább 100 kölcsönhatási helyének kiértékelésével. A fehér oszlop a .RacP-dsRNS-sel („RACS-dsRNS) végzett kísérletek átlagos RRE% értékét mutatja. & hiba oszlop jelzi a standard hibát, „Kontroli jelzi a kontroli dsRRS-sel végzett párhuzamos kísérletek eredményeit.

4 * * ♦♦

A RacB-dsRNS~s«l bombázott sejtekben az RPES lényegesei·: csökkent a kontroll dsRNS-sei bombázott sejtekhez képest (TRi humán táróid receptor dsRNS).

5. ábra: A genetikai háttér hatása a RacB működésre

Az RPEé-ot tanulmányoztok 5 egymástól független kísérletben, olyan Railas, Ingrid vagy A89 árpát inokuláiva. BghAc-tal, amelyeket előzőleg RacB-dsRNS-sei transzformáltunk.

Az RPE% lényegesen csökkent a Railas {Mlo_f Rorl, fekete oszlopok, I. és 2. kísérlet) vagy Ingrid (Mlo, Bori, fekete oszlopok, 3,, 4. és 5. kísérlet) árpákban. Az A89 érzékeny mutánsban (mioS, rorl, fekete oszlopok, 1-5·. kísérletek) azonban nem csók-

kent az RFB%.	Fehér őszi	opofc mutatják	a számtani közép
hiba oszlopok	a standard	hibát.
6. ábra;	Konstitutív	;an aktív RacB	mutáns túlzott ki
Railas típusú	árpában

árpa RACB .konst.itnt.lvan aktív mutánsát (G -» V csere a 15. pozícióban; RacB VI5) átmenetileg túlzottan kifejeztük Pal'Ias típusú árpában 5 egymástól független kísérletben, a pGY-RacBVlS expressziós szerkezet felhasználásával, összehasonlításként megfelelő kísérleteket végeztünk csak a vektorral (pGY-vei) RacB ínszertum nélkül.

A konstitutív RacB mutáns kifejeződése szignifikánsan magasabb érzékenységet eredményezett árpa lágyrothadást okozó pato-

lökhöz viszonyítva (6A,	áfor.	a .)
relatív érzékenység min	den
az eredmények ís racB	kulc	sf
szembe ni védekézésben.

73.

7. ábra: A pGY-1 expressziós vektor plazmíd térképe [Schweizer et al., Mól. Plánt Miorcbe Interact. 12, 647-654 (1999); Shinshi et al., Plánt Mól. Bíol. 14, 357-368 (1990:]'.

Példák

Az oligonukleotidok kémiai szintézise elvégezhető például ismert módon a foszfoamidit módszer alkalmazásával [Voet, Voet, 2nd ed. Niley Press NY, p, 836-897]. A találmány céljára alkalmazott klónozás! lépéseket, úgymint például restrikciós hasításokat, agaróz géielektroforézist, DNS fragmentumok tisztítását, nukisinsavak transzferét nitrocellnlózra és nylon membránokra, DNS fragmentumok összekapcsolását, S. coli sejtek transzformálását, baktériumok szaporítását, fágok megsokszorozását és rekombináns DNS szekvencia analízisét a Sambrook és munkatársai által leírtak szerint végezzük [Moleeular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spríng Harbor Laboratory Press (1389); ISSN 0-37969-309-6].

A rekombináns DNS molekulák szekvanálását MWG-Lícor lézer fluoreszoenciás DNS szekvenálóval hajtjuk végre Sanger és munkatársai módszerét követve [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (19??)].

Növények, p&tegének és beoltás

Az Ingrid árpa változatot James McKéy-töl szereztük be (üniversity of Uppsala, Sweden). A Pailas változatot és a viszsza-ksresztszett BCIngrid-mloS vonalat Lisa Műnk (Department of Plánt Patbology, Royai Veterinary and Agricuitural üniversity, Copenhagen, Denmark) bocsátotta rendelkezésünkre. Ennek előálló?3.3-5S,>Wm

109 *·» φ» tását Krlster és munkatársai (Crop Sci, 26, 993-907 (198 6)] írják le. Az AS9 vonalat Paul Schulze-befert biztosította (Max Piánk

Institut für Süchtungsforschung Köln, Germany)..

Amennyiben másképpen nem jelezzük, az előzőleg nedves szűrőpapíron 12-36 érát sötétben csíráztatott magot egy négyszögletes edény (8 x 8 cm; 5 mag/edény) pereme mentén elvetettük P típusú Fruhstorfer-féle talajba, betakartuk földdel és rendszeresen öntöztük csapvízzel. Minden növényt ellenőrzött környezetű kamrákban vagy szekrényekben tenyésztettünk 5-8 napig, 16-18 ^C-on, 5060% relatív nedvességtartalom mellett és 16 őrá viiágosság/8 őrá sötétség ritmusban 3000 vagy 50Ό0 lux fényerőnél (foton áramlási „; „2 sűrűség 50 és 60 pmols ‘ja külön-külön) es a kísérletekben a aagonc stádiumban használtuk fel azokat. Azokban a kísérletekben, amelyekben az elsődleges leveleket használtuk fel, ez utóbbiakat hagytuk teljesen kifejlődni.

Mielőtt elvégeztük az átmeneti transzfakciós kísérleteket, a növényeket ellenőrzött környezetű kamrákban vagy szekrényekben neveltük 24 T-o-s nappali és 20 °C-os éjszakai hőmérsékleten, 50-60% relatív nedvességtartalom mellett és 16 éra világosság/8 óra sötétség ritmusban 30000 lux fényerőnél.

Árpa iágyrothadását okozó Slumaria graminís (DC> Speer f. sp. .hordei Sm. Martnai race A6 (BghA6) [Wl.be.rg, Hereditas 77, 89148 (1974)] penészgombát használtunk árpa növények beoltására. A penészgombát a Department of Biometry, JLű Siessen bocsátotta rendelkezésünkre. Az ínokulumot a fent, a növényekre leírtakkal azonos körülmények között, ellenőrzött környezetű kamrákban szaporítottuk, majd a konidiumokat már megfertőzött növényi anyag7 8.3 S 8 /SZ ZR&Z «««< ♦-> * ról vittük át 100 konidium/miíó arányban 7 napos árpa növényekre (cv. Goidén Promise), amelyet szabályosan termesztettünk.

A BghA6~tal történő beoltást ügy végeztük el, hogy már megfertőzött növényi anyagról inokuláció-s toronyban ráztuk le a konídiamokat 7 napos árpa növényekre, körülbelül 100 koniáium/mnü arányban (ha másképpen nem jelezzük;.

ext.rakci.0

Teljes RNS-t extraháltunk 8-10 elsődleges, 5 cm hosszú levél szegmensekből „RNS extrakciós puffer'^f (AGS, Heidelberg, Germany·) segítségével.

Ehhez az 5 cm hosszúságú centrális elsődleges levél szegmenseket begyűjtöttük és mozsarakban folyékony nitrogénben homogenizáltuk. A homogén!zátumot -70 Ól-on tároltak, az RNS extrákéi©a ,4 í rr ó -A.J. %

Teljes RNS-t extraháltunk a mélyhűtött levélanyagbcl RNS extrakciós kit (AGS, Heidelberg) segítségével. Ehhez a mélyhűtött levéianyag 200 mg-ját mikrocentrifuga csőben (2 ml) befedtük 1,7 ml RNS extrakciós pufferrel (AGS) és azonnal alaposan Összekevertük. 200 μΐ kloroform hozzáadását követően a keveréket újból alaposan összekevertük és 45 percig vízszintes rázögépen íattuk szobahőmérsékleten. A fázisok elválaszért követően 15 percig 20000 g mellett 4 °C-on a felső vizes fázist átvittük friss mikrómig az alsó fázist eldobtuk. A vizes fázist újra tisztítottuk, 900 μ! kloroformmal 10 másodpercig tartó homo-

i mellett rá	.zatí	rak
a csöveket	e zt	kö
ugaitur es	a	fed


uga csőbe,	mag	CÍ c
szil tóttűk.	ry A	ul

7S.35S/3£/K&2 ϊ

genizáiással, ismételt centrifugálással (lásd fent) és a vizes fázis eltávolításával (3~szor). Ezután 850 pl 2-propanolt adtunk

hozzá és a keve	éréket homo gé n i zá11 uk	és az RNS	precipitációja
38-60 percre jé	gre tettük. Ezután a	keve ré rét	20 percig cent
fugéltuk (lásd	fent), a félülúszöt	óvafosán	dekantáltük, 2
70%-os etanoit	(-20 ^VC) pipettáztunk	bele, ös	sszekevertük és
percig ceutrifu	gáltuk. Ezután a falú	iűszót ísr	tét dekantáltük

,· a

RNS a pelletet pipetta segítségével óvatosan elválasztottuk a maradék folyadéktól, majd tiszta levegőáramban megszárítettük. Ezután az RNS~t jégen 50 pl DEPC vízben oldottuk, összekevertük és 5 percig centrifugáltuk (lásd fent) . Az RNS oldatot tartalmazó felülúszó 40 pl-ét friss mikrocentrifuga csőbe vittük át és -70 'C-on tároltuk.

Az RNS koncentrációt fotometriásan határoztuk meg. Ehhez az RNS oldatot 1:99 (v/v) arányban hígítottuk desztillált vízzel és az abszorpciót mértük 260 nm-en (Beckman Photometer Dü 7400); pg RNS/ml koncentrációhoz tartozó extinkció: Rzgonm ~ 1) - Az oldatok koncentrációit ezt követően 1 pg/pl koncentrációra állítottuk be DERC vízzel, illesztve a számított RNS tartalomhoz és agarőz gélen igazoltuk.

Az RNS koncentrációk vízszintes agarőz gélben (1% agarőz 1 x MORS pufferben 0,2 pg/ml. etí.díum-bromiddal) történő igazolásához 1 ul RNS oldatot kezeltünk 1 pl 18 x MOPS, 1 pl színmarker és 7 pl DSPC víz keverékével, méret szerint szeparáltuk 1 x MORE futtató pufferben .1,5 órán keresztül 120 V feszültség mellett a gélben és UV fényben fotografáltuk. Az RNS kivonatok koncentrációjában mutatkozó bármilyen eltérést DSPC víz hozzáadásával egyenlítettünk ki és a beállítást újra ellenőriztük a gélben.

: ó . síUh/ C-t./ X'MÚÍ.

Az árpa RacB cDNS szekvencia klónozása

A HvRacB cöNS izolálásához, klónozásához, szekvenáiásához és próbák létrehozásához szükséges cDNS fragmentumokat RT-PCR segítségével kaptuk meg a „One Step RT-PCR Kit (Life Technologies Rarlsruhe, Germany vagy Qiagen, Hiiden, Germany) alkalmazásával. Ehhez árpa magoncokból származó teljes RN'S-t használtunk terápiáiként. Az RNS-t Rallas fajtából izoláltuk 3, 5 és 7 nappal a csírázást követően. Továbbá RNS-t izoláltunk Rallas fajtából és az mlo5, Míg vagy MJal2 géneket tartalmazó vlssza-keresztezott vonalakból 1, 2 és 5 nappal a Bg.hA6~t.ai történt beoltást követően, a csírázás utáni 7. napon. A. következő primer©két használtuk az RT-RCR-hez:

ONP-i 5^f-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3^# (10. számú szekvencia)

ONP-2 5^?-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3^Í(11. számú szekvencia)

1000 ng teljes RNS., 0,4 mJk dNTP-k, minden esetben 0,6 mM ONP-1 és ONP-2 primer, 10 p.l RNáz inhibitor és ί μ! enzimkeverék (1 x RT pufferben; One Step RT-POR Kit, Qiagen, Hűden) keverékét alkalmaztuk minden egyes reakcióban (25 μΐ batch). A következő hőmérséklet programot állítottuk be (PTC-100TM mode.1 96V; M<7

Research, Inc. , 'Watertown, Massachusetts) :

ciklus 30 perc, 50 “C ciklus 150 másodperc 94 °C ciklus 45 másodperc 94 ^WC, 1 perc 55 ^VC és perc 72 °C ciklus 7 perc: 72 °C

A PCR terméket 2% (w/v) agaróz gélen elektroforéz.isnek vetettük ?'3.35$/3£/SA2 ί' alá. Sz egy 642 bp teljes RT-PCR terméket adott, amely a RacS szekvenciából (1, számú szekvencia) és restrikciós endonukleázok hasítási helyeit kódol6 terminális szekvenciákból állt. A fragmentum 197 amínosavból álló poíipeptidet kódoló 591 bp hosszúságú nyílt leolvasási keretet (open rsadíng frarne) tartalmaz. A megfelelő cDNS-t agaróz gélből izoláltak és a pGSM-T vektorba (Promega, Mannbeim, Germany) klónoztak T-overhang (T-függelék) segítségével végzett ligádéval,. A oDNS-eket a plazmád DRS-ből kiindulva szekvenáifuk a „Thermo Seque.na.se Fiuorescent Labeled Primer Cyoie Sequeneing Kit (Amersham, Freiburg, Germany) alkalmazásával .

Mivel egy prímért a rizs RacB szekvenciából, mint kiindulási QNP-1 primerből (GenBank AF250327 vezettünk le, az árpa RacB cDNS-nek ezt a régióját (azaz az 5·'-véget) újra igazoltuk RÁCS technológiával a „GeneRacer Kit (Invitrogene Life Technologies) alkalmazásával. Ehhez löO ng poii-A mRMS-t 1 ai lö x C1P puffer, lö egység Rház inhibitor, 10 egység Cl? („calf intestinai phosphatase ^:::: borjú vékonybél foszíatáz) ás DERC kezeit víz keverékével kezeltünk 1 órán keresztül 50 °C-on 10 μΐ össztérfogatfoan. Az RbS kicsapásához további 90 μ! DE PC vizet és 10-0 μΐ fenol:kloroform elegyet adtunk és a keveréket körülbelül 30 másodpercig alaposan kevertük. 5 perces 20000 g mellett, történt centrifugálist követően a felső fázist 2 μΐ 10 mg/ml kagyló glikogénnel és 10 μΐ 3 M' nátrium-acetátlsl (pH 5,2) kezeltük .friss mikroreakdős edényben. 220 μΐ 95%-os etanolt adtunk hozzá és a keveréket jégen inkubáifuk. Az RNS~t. ezután 20 perces 20000 g mellett, 4 °C~on történt centrifugálissal kicsaptuk. A feiüiúszót

73.3«v3 /3^: /r/as· » J. <

φ »* eldobtuk, 500 μΐ 75%-os etanolt adagoltunk és a keveréket röviden kevertük (Vortexben) és újból centrifugáltuk 2 percig (20000 g) . A felülús2őt ezúttal is eldobtuk, a precipítátnmot 2 percig szárítottuk levegőn szobahőmérsékleten és ezt követően 6 μί DERC vízben szuszpendáítuk. A mRNS CAF struktúrákat 1 μί 10 χ TÁP puffer, 10 egység RNAsin és 1 egység TÁP ftebacce add pyrcphosphatase « dohánysav plrofoszfatáz) hozzáadásával eltávolítót tűk. A keveréket 1 órán keresztül 37 °C~on inkubáltuk, azután jégen lehűtötték. Az RNS-t a fent leírtak szerint újból kicsaptuk és 0,25 pg GeneRaeer cligonukleotid prímért tartalmazó reakcióedénybe vittük át. Az oiígonukleotid prímért újra szuszpendáltuk az RNS oldatban és a keveréket 5 percig '70 C-cn inkubáltuk, majd jégen iehűtöttük. 1 μί 10 χ ligáz puffer, 10 mM ATR, 1 egység RNAsin és 5 egység T4 RNS ligáz keverékét adtuk hozzá és ezt a keveréket 1 órán keresztül. 37 °C-on inkubáltuk. Az RNS-t újból kicsaptuk a fent leírtak szerint és 13 μί DEPC vízben újra szuszpendáítuk. 10 pmcl oiigo-dT prímért adtunk az RNS-hez és a keveréket azonnal 'felmelegítettük '70 °C-ra, majd újból Iehűtöttük jégen. Minden dNTF oldatból (25 mM} 1 μί, 2 μΐ lö x RT puffer, 5 egység (1 ul) AMV reverz transzkriptáz és 20 egység RNAsin keverékét adtuk hozzá és a reakcíóelegyet 1 órán keresztül 42 °C-on és ezt követően 15 percig 35 ~C~on inkubáltuk. Az így elkészített cDNS első szálat -20 °C-on tároltuk.

A következő prímereket használtuk az 5' -cDNS végek megsokszorozására :

khCc, Kacs primer;

5^? --gtgggeacatagtcggtggggsaggt-ú'' (12. számé szekvencia}

7$ .

» 4> « *

115

¢. Φ * * *

G eηe Race r ™ 5'-príme r:

5'~CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 (13. számú szekvencia)

GeneRacer™ 5'-beágyazott primer;

d —GGACACTGAGATeGAC i'GÁAGGAGTA—d (.14» szsmu szekvencia)

A reakció-elegy összetétele a következő volt:

μΐ Race RacB primer (5 pmói/μΐ)

0,5 u.l GeneRacer 5^f -primer (10 pmói/pi)

2,5 μΐ dNTR-k (2 mM)

0,5 μΐ cDNS

0,2 ül QiagenTAG (5 Ε/μ1)

17,8 μΐ viz

A PCR körülmények a következők voltak;

94		denaturáclő 5 pere
·«/	ciklus	30 másodperc 70	^vC-on (annealing)
		1 pere 72 °C-on	(extenziö)
		30 másodperc 94	c-on toenatu r acxc}
5	ciklus	30 másodperc 63	°C-on (annealing)
		1 perc 72 ^cC-on	(extenziő)
		30 másodpere 94	°C-on (denaturáclő)
28	2. vL. bi ki	30 másodperc 66	°C-on (annealing)
		1 perc 72 °C-on	(extenzíó)
		30 másodperc 94	C-on (denaturáclő)
72		végső extenziő 1	0 OSrC
4	O.-s L·	1 e hűtő s to vá.bb i	felhasználásig

A PCR egy körülbelül 400 bp terméket eredményezett. Ebből a termékből kiindulva a RaeB-speeífikus oiigonufcieotid prímerrel és a „GeneRacer beágyazott 5^f-prímerrel beágyazott PCR-t végeztünk;

S ,35S/$S/M2 ί

.94		denaturáció 5 p	ere
30	ciklus	30 másodperc 64	''C-on (annealing)
		1 perc 72 °C-on	(extenziój
		30 másodperc 94	°C-on (denaturáció)
η s 1	\-·	végs ő e xten z i ő	1.0' perc
	</	lehűtés további	felhasználásig

A kapót pGEM-T t PCR terméket gélben izoláltuk, plazmádba klónoztuk T~overhang 11 a gélből extrahált gáció segítségével k, szekvanáltuk. Az ONF-1 primer régiójáb azonos volt a rizs RacB szekvenciáj áv; nem. tudtunk pont-mutációkat létrehozni.

véneiában bemutatott, szekvencia azonos •iával.

an a szekvencia teljesen

5.1 úgy, hogy primerekkel

Tehát az 1. számú szokás árpa. RacB szekvenciaReverz transzkriptád polimeráz láncreakció (RT-RCR)

A „One Stop RT-PCR Kit <·Qiagen, hűden, Germany) készletet.

használtuk szemi-kvantítativ RT-PCR-hez. Fentiek szerint elkészített RNS-t. először cDNS-sé transzláltunk (reverz transzkripció) és a keresett cDNS-t ezt követő POR reakcióban specifikus primerek segítségévei megsokszoroztuk (amplífikáítuk). A templát RNS kiindulási mennyiségének becsléséhez az amplifikáciőt az exponenciális fázisban félbeszakítottak annak érdekében, hogy észrevegyük az eltéréseket a cél ENS-ben. A PCR termékeket agaróz gélben elválasztottuk egymástól, denaturáltuk, biottoltuk nylon membránokra és specifikus nem-radioaktív próbákkal mutattuk ki szigorú standard körülmények között. Hibridizációt, mosási lépéseket és ímmundetektélést végeztünk .a „Northern biot alatt le /R&2 φ Φ Φ * ί :

írtak szerint.

A kővetkező komponenseket kombináltuk az egyes reakciókban (2'5 ul> a „One Step RT-PCR Kit (Qiagen, Hűden, Germany) alkalmazásával :

1GÖO ng teljes RNS specifikus mintából

0,4 mM dNTP-k

0,6 μΜ minden egyes ssensz és antíszensz printerből

0,1 pl RNáz inhibitor pl enzimkeverek 1 x RT pufferben cDNS szintézist (reverz transzkripciót· végeztünk 30 percig 50 C-on, A reverz transzfcriptázt ezt követően 15 percig 95 ~C~on Ínaktiváltuk, amely egyidejűleg DNS polimeráz aktiválását és a cDNS denaturáeiöját okozza. Az ezt követe RCR-t a következő program szerint végeztük el:

cenaturaciö i perc 1 perc 54 Al-on (primer annealing) perc 72 ^öC~on (primer extenzic) perc 72 ^uC-on. a DNS duplexek kzaiakuiasának Perejezése 4 ~C a reakció befejezése

A PCR termékeket 1 x THE agaróz gélben etidinm~b.roimi.dos festés alkalmazásával elválasztottuk egymástól.

A következő olígonukleotid primer párokat használtuk fel az ampiifikáciökhox az egyes reakciókban (individuai batches):

a) az árpa RacB cDNS 387 bp fragmentumának megsokszorozása

RacB szánsz ciklus

RacB antíszensz

73.353/3Ε/ΚΜ

5'-gttcatcaagtgcgtcacegtg-O' (15. számú szekv.) 5^f “ttagcttcctcagttottccctcí-3^<' (16. számú szekv.) sz árpa SAS cDNS 674 fop fragmentumának. (GenBank 634917 sAu szensz

5' “cgcgccgcagccgagtacgac~3‘ számú szekv.;

SAS antiszensz 5'-gtcacaaaaacacatgtaacc-3^/ (13. számú szekv.)

c) az 506 be hosszúságú OXLP cDNS fragmentum (GenBank X931 ? 1} megsokszo. hozása

OXLP szensz 5^?~ggccgacatgeattcaccag-3' (19, számú szekv.)

OXLP antiszensz 5' “catctgatattgctgggtctg~.3^/ (20. számú szekv.)

d) az 513 fop hosszúságú döf cDNS fragmentum (GenBank M6017S) me g s o k s z o r o z á s a

UBI szensz 5'-~ccaagatgcagatcttcgtga~3^í' (21. számú szekv.}

OBI antiszensz 5* ~ttcgcgataggtaaasgagca-3^/ (22. számú szekv,}

Az összes kapott fragmentumot T~overhang ligádéval a pGER(-T vektorba lígáltuk és felhasználtuk kiindulási plazmidokként próbák (például Northern foiot-hoz) vagy dsRNS létrehozására. Az egyes szerkezeteket rendre a következők szerint jelöltük, pGSMTRAC1, pGBRT-BAS, pGBMT-OXLP, pGEXT-UBI.

5. példa:

Northern folofc analízis

A Northern biot tol ás elvégzéséhez az RNS-t aga.róz gélben szeparáltuk denaturáló körülmények között. Ehhez az RNS oldat egy részletét (amely megfelel 5 μα RNS-nek) összekevertük azonos mennyiségű minta pufferrel (etidium bromíddal) , 5 percig 94 °C~

7δ , o5o/oE/.?Aö on

119 denaturáltuk, 5 percre jégre tettük,· röviden centrifugáltuk és gélre vittük, Az 1 x NöPS gél (1,5% agaróz, ultra tisztaságú) 5 fcé:.rfogat% tömény formaldehid oldatot (36,5% v/v.) tartalmazott.

Az RNS-t 2 órán keresztül szeparáltuk 100 V mellett és ezt kővetően biottoitufc.

A Northern folottolást felfelé irányuló kapilláris RNS transzferként végeztük. Ehhez a gélt először óvatosan kevertettük 30 percig 25 mM dinátrlum-hidrogén-znátríum-dlhidrogéu-foszfát puffsrfoen (pH 6,5) és méretre vágtuk, Egv darab Whatman papírt készítettünk eiö oly módon, hogy vízszintes hordozón helyezkedjen el és két oldala beleérjen 25 mM dínátrium-hídrogén/nátrium-dihidrogén-foszfát puffért (pH 6,5) tartalmazó vályúba, A papírdarabnak ezt a részét fedtük be a géllel, a Whatman papírdarab be nem fedett részét plasztik filmmel vontuk be. A gélt ezután pozitív töltésű nylon membránnal (Boehringer-Mannheím) levegőbuborék mentesen letakartuk, amelyre körülbelül 5 cm magasságban blottolő papírt halmoztunk, A blottoló papír halmazt azután egy üveglappal és 100 g súllyal lenyomattuk. A blokkolást sgv éjszakán át végeztük szobahőmérsékleten. A membránt gyorsan leöblítettük kétszer desztillált, vízzel és keresztkotö berendezésben (Biorad) ö¥ fénnyel, 125 md fényenergiával besugároztuk az RNS rögzítése céljából. A membránra történő RNS transzfer egységességét UV fénnyel megvilágított munkalápon ellenőriztük.

Árpa mENS kimutatásához minden egyes mintából 10 pg teljes RNS~t oldottunk agaróz gélben és blöfföltük pozitív töltésű nylon memránra kapilláris transzferrel, A kimutatást DIG rendszer alkalmazásával végeztük.

7δ...3·5δ'ΖΒΕ/Μ'2 ♦ » * ·» ι : >

9Γϊ

Próba készítés: Digogygenín- vagy fluoreszcens-jelölésű RNS próbákat készítettünk a mRNS-ekkel történő hibridizációhoz, a kimutatáshoz. A próbákat a PCR termék in vitro transzkripciójával hoztuk létre T? vagy SP6 RNS poiimeráz segítségével, jelölt UTP-ket használva. A PCR-rel végzett ampiif ikáció t emp.lát ját a. fent leírt plawid vektorok - pGEMT-RACi, pGEMT-RAS, pCEMT-GXLP, pGEMT-UBI - szolgáltatták.

Az inszertum orientációjától függően különböző RNS polimerézokat használtunk az antiszensz szál létrehozására. T7 RNS polimeréit alkalmaztunk pGSMT-BAS és pGSNT-OXLP plazmád vektorokhoz, míg a pGENT-RACl és pGEMT-ŰBI plazmád vektorokhoz SP6-RNS polimeréit ,

Az egyes vektorok inszertumát PCR segítségévei sokszoroztuk meg, szegélyező standard prímereket (Mlr-fwd előre mutató és

Ml3-rév fordított) alkalmazva:

M13-fwd; 5 -GTAAAACGACGGCCAGTG-3'' (23. számú szekvencia)

Ml3-rév; 5*-GGAAACAGCTAGGACCATG-3^f (24. számú szekvencia)

A reakciót a következő végső koncentrációkkal végeztük PCR pufferben (Silverstar) .50 pl teljes térfogatban:

10% dimetil-szülfoxid (v/v) ng/μΐ minden primőrből (M13-fwd és M13-rev)

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM dNTP-k egység Tag poiimeráz (Silverstar) ng/μΙ plazmíd DNS.

Az ampiifikációt Perkin-Eimer 2400 höcikíizáló berendezésben végeztük a következő höfoklefutásckkaí:

“8.358/3£/RA2 φ

’~C denaturáciő 3 perc ciklus 30 másodperc 9« °C-on (denaturácíó) másodperc 58 °C~on. (annealing)

1,2 perc 72 °C-on (extenzió) °C végső extenzió 5 perc °C lehűtés további felhasználásig

A reakció sikerét 1% agaróz gélben igazoltuk. .A termékeket ezt követően tisztítottuk a „High Hűre PCR-~?roduct Purification Kit (Boehrínger-Mannheím) alkalmazásával. Ez körülbelül 40 μΐ oszlop eluátumot eredményezett, amelyet ismét megerősítettünk a gélben és -20 °C-on tároltuk.

Az RNS polimerizáciőt, a hibridizációt és az ímmnndetektá— lést nagyrészt a kit előállítójának utasításai szerint végeztük, tekintettel a nem-radioaktív RNS kimutatására (DIG System User is

Guide, DIG-Luminesoence Detection Kit, Soehringer-Mannheím) (Kogel et ai.. Plánt Physiol. 106, 12.64~12.77 (1394)}. A tisztított PCR termék 4 μΐ-ét 2 μΐ transzkripciós puffer, 2 μΐ NTP jelölő keverék, 2 μΐ UTP keverék és lö μΐ DEPC víz elegyével kezeltük. Ezután a T7 RNS polimeráz oldatból 2 μΐ-t pipettáztunk hozzá. A reakciót ezután 2 órán keresztül végeztük .37 °C-on, majd 100 μϊ-re feltöltöttük DEPC vízzel. Az RNS próbát etídium-bromidos gélben kimutattuk és -20 ^QC-on tároltuk.

A hibridizáció elkészítéséhez a membránokat először egy órán keresztül 68 °C-on. óvatosan kevertük 2: x SSC (salt, sodiumcítrate ~ só, nátrium-extrát) és 0,1% SDS (sodium dodecylsulfate

- nátrium-dodeeilszulfát) puffer keverékében, a puffért 2-szer vagy 3-szor cseréltük. A membránokat ezt követően hibridizációs 73.XS8/3K/RM « φ csövek belső falára vittük fel, előmelegítettük 68 ^vC~on és 30 percig inkubáltuk 10 al Dig-Easy hibridizációs' pufferrel, előmelegített hibridizációs termosztátban. Eközben 10 ul próba oldatot denaturáltunk 94 ‘'C-on 5 percig 80 pl hibridizációs pufferben és a keveréket jégre tettük, majd röviden centrifugáltuk. A hibridizációhoz azután a próbát áttettük 10 ml hibridizációs pufferbe 68 ^vC-on és a hibridizációs csőben a puffért kicseréltük ezzel a próba pufferrel. A hibridizációt egy éjszakán át, hasonlóan 68 'C-on végeztük.

Az RNS-RNS hibridek immundetektálása előtt a biotokat szigorú körülmények között kétszer mostuk 20 percig 0,1% (u/v) SDS és 0,1 x SSC keverékében 68 °C~on.

Az immundetektáfáshoz a biotokat először kétszer keverhettük percig 2 x SSC, 0,1% SDS keverékében szobahőmérsékleten. Két szigorú mosási lépést végeztünk egymás után, mindkét esetben 15 percig 68 C~on 0,1 x SSC, 0,1% SDS keverékében. Az oldatot azután kicseréltük Tweent nem tartalmazó mosöpufferrel, A reakciókeveréket 1 percig rázattnk és az oldatot blokkoló reagensre cseréltük. További 30 perces rázatás után 10 pl antí-fluoreszeens antitest oldatot adtunk hozzá és folytattuk a ráhatást 60 percig. Ezt követte két 15 perces mosási lépés Tweent tartalmazó

mosópufferben.	A membránt	ezután :	2 percig	azubsztrát
ekviIábráztuk,	hagytuk léc	sorogni,	majd ac·	etát-papír 1;
tűk át. 20 pl	CDs-Star™ és	2 mi s z	ubsztrát	ρΐϊι.Χ'θ.Κ
tán egyenlően	eloszlattuk	a membrá	n „RNS o	Idáién. Szt

Szt követően a membránt betakartuk egy második acetát-papír lappal és az éleket hővel lezártuk vízmentes zárást biztosítva, elkerülve légbu78.358/3S/?iA2 borékok keletkezését. Sötét szobában azután a membránt lö percig röntgen filmmel takartuk le, maid a filmet előhívtuk. Az expozíciós időt a lumineszcens reakció funkciójaként változtattuk.

Ha másképpen nem jelezzük, az oldatok a kit részét képezték (DiG-lnminescence detection Kit, Boehrínger Mannheim.! . Az összes többit a következő törzsoldatokböi készítettük autoklávozott.

desztillált vízzel történő hígít ássál. Ha másképpen nem. jelezzük, a törzsoldatok mindegyike^ DEPÓ vízzel készült és azt autókIávozás követte.

~ DEPC viz: desztillált vizet kezeltünk egy éjszakán keresztül 37 ^vC-on díetil-pirokarbonáttal (DEPC, 0,1% w/v) és azután autoklávoztufc,

- 10 x MOPS puffer: 0,2 M MOPS (morphcline-3-propanesnifonic acid - morfolino-3-propánszulfonsav), 0,05 m náfrium-acetát,

0,01 M EDTA, pH 7,0-re állítva 10 M NaOH-dal.

x SSC (sodium chleride/sodium citrate - nátriumklorid/nátrium-citrát): 3 M. NaCl, 0,3 M trináfrium-cítrát x 2

H₂ö, pH 7,0-re állítva 4 M HCI-val,

- 1% SDS (sodium dodeeyi suifate - nátríum-dodecílszulfát, w/v) BEEC nélkül.

- RNS minta puffer: 760 pl formamid, 260 pl formaldehid, 100 pl etidium-bromid (lö mg/ml), 80 pl glicerin, 80 pl brémfenolkék (telített), 160 pl lö x MOPS, 100 pl viz.

- 10 x mosöpuffer Tween nélkül: 1,0 M maleinsav, 1,5 M NaCl; DEEC nélkül, pH 7,5~re szilárd NaOH-dal (kb, 77 g) és lö M NaÖ-Hdal.

- Tweent tartalmazó mosöpuffer: a fenti mosöpuffer plusz

78.35Ö/SS/SX2 * « „í.

iween {u,5¾ v/v).

- 10 x blokkoló reagens: 50 g blokkoló por (Boehringer Marnibeim) 500 ml Twe-en nélküli mosőpufferben szuszpendáiva.

- Szufosz'trát puffer: 100 mM Trís (triszhídroxiraetil-aminoraetán) , 150 mb NaCl, pH 9,5~re 4 M HCl-val.

- 10 x s-zinfejlesztő: 50% glicerin (v/v)_f 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25% brőmfenoikek (w/v), 0,25% xiién cianol (w/v).

Az in vitro transzkripcióhoz felhasznált összes plazmid ípGBMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLB, pGEMT-UBI) tartalmazza a szánsz vagy antiszensz RNS szintézisét lehetővé tevő — T7 és SF6 promőtereket (pGEM-T, Rromega) az inszertált nnkieínsav-szefcven·-cia megfelelő végein. A plazmidok linearízálhatők megfelelő restrikciós enzimekkel annak érdekében, hogy biztosítva legyen az inszertált nukleinsav-szekvencia helyes transzkripciója és elkerüljük a vektor szekvenciáival való egybefüggő leolvasást.

Ehhez 10 pg plazmid DNS-t hasítottunk, minden esetben az inszertumnak a promőtertől dlsztálisan elhelyezkedő oldalán. A hasított plazmidokat 200 μΐ vízben extraháltuk azonos térfogatú fenol/kloroform/izoamila1kohol elegyével, űj Éppendorf reakció edénybe (RNáz xzentes) vittük át és 5 percig 20000 g mellett centrífágáltuk. A plazmád oldat 180 μΐ-ét 420 μΐ etanollal kezeltük és a keveréket jégre tettük, majd ezt követően 30 perces 20000 g -4 °C-on történő eentrifugálássai precípitaltuk. A preoicitátumot 10 μΐ TE pufferben vettük fel.

A RacB dsRNS elkészítéséhez a pGEMT-Racl plazmidot Spel

78.3S8/BK/XM **«» fi restrikciós enzimmel emésztettük és szensz RNS-t irtunk át T7

RNS polimeréz alkalmazásával, A pGRMT-Racl plazmidot emésztettük továbbá bcoi-gyel és antíszensz RNS-t írtunk át -SP6 RNS polimeráz felhasználásával. Az RNS' polímerázokat a Rocbe Moleeular Bioiogy (Mannheím, Germany) cégtől szereztük be.

Mindegyik transzkripciós reakció a következőket tartalmazta

40 ul térre	>gatbans:
2	μΐ	iinearizált plazmád DNS (1	ug)
2.	μί	N'TP-k (25 mM; minden egyes	NTP 1,2	’ 5 mM)
4	μΐ	20 x reakció puffer (Rocbe	Moleeular Bioiogy)
1	μί	RNAsin (27 egység; Roche Mc	lécülaz	' Bioiogy)
··->.	μί	RNS polimeráz (40 egység)
29	μί	DSPC víz
•Ύ	őrá	s 37 °C—on történő inkubá	cíőt k<	ive tőén a s z ens z
antiszer	'1SZ	szál transzkripciós reak>	siója na.	k egv-eqy részié

összekevertük, 5 perces 95 °C-on tartással denaturáltuk és ezt követően 30 perc alatt 37 °C végső hőmérsékletre lehűtve hibridizáltuk (annealíng). Másik lehetőségként a szensz és antíszensz szálak keveréke a denatnrácíőt követően 30 perc alatt -20 °C-ra hűthető. A denataráíás és hibridizáiás alatt keletkező fehérje precipítátumot rövid, 20800 g centrífugálássai eltávolítottak és a felülűszét közvetlenül felhasználtuk wolfram részecskék (lásd az alábbiakban) bevonására. Analízishez minden egyes RNS szál és a dsRNS 1 μί-ét újra. feloldottuk nem~denatarálő agaróz gélben. Sikeres hibridizáció nagyobb molekulatömegü sávval jelent meg, összevetve az egyedi szálakkal.

A dsRMS 4 μί-ét etanollal kicsaptuk (6 μί víz, 1 μΐ 3 M nát;2 6 ♦ * * ♦ « « » rium-acetát oldat és 25 pl. etanol hozzáadásával és legalább 5 perces 20000 g és 4 ^vC-on. történő centrifugálással) és a pel letet 500 ul vízben újra szuszpendáltuk. Mértük az abszorpciós spektrumot 230 és 300 nm között vagy 260 nm-sn és 280 nm-en meghatároztuk az abszorpciót a dsRNS tisztaságának és koncentrációjának megállapítása céljából. Rendszerint 80-100 pg dsRNS-t kaptunk 1,80-1,95 .0'D2so/(M>23o aránnyal. Dnázl-gyel történő emésztés adott esetben elvégezhető, de nincs számottevő hatása az eredményekre.

Kontroll dsRNS-fcénfc a humán tíróid receptor dsRNS-t használtuk (kiindulási vektor pTObetaSai [Norman et al., Cell 55(0) 989-1003 (1988)] beszerzési helye Department Genetie

Germany, az insserfcum szekvenciája GenBank NM_0öö461)

RNS létrehozásához a plazrnidot Pvul.1, az antíszensz Rt zásához; .«in dl II restrikciós enzimei emésztettük és azután T7 illetve SP6 RNS polimerázzál átírtuk, külön-külön. A kontroli dsRNS előállításához alkalmazott egyedi lépéseket a RacS dsRNS-re fent leírtakhoz hasonlóan, végeztük el.

7.

ar., Cell ö5 (b),
Génétles	Glessen,
.000461} .	A szensz
:ensz RNS	létreho-
:tük és	az RNS-t

Átmeneti (tranziens) transzformáció, RN8~ek, a penászgomba patogének fejlődésének értékelése

Pa Has fajtájú árpa levéiszegmenseit transzformáltuk RacB dsRNS-sel GFB expressziős vektorral együtt.. A leveleket ezt követően Bgh-vai oltottuk be és az eredményeket 48 óra elteltével analizáltuk fény- és fluoreszcens mikroszkópos vizsgálattal. A GFR-t kifejező sejtekbe történő behatolást a hausztőría élő sejtekben való kimutatásával igazoltuk és a penész pontos fejlődésének meghatározásával ezekben a sejtekben. Az árpa (ov,

Ό η, Ί 1 c· t ts. Λ d. c>. £s;

>§ < ~<5S/££7?A2·

X 4 X# ί ♦ .RacB dsRNS-sál történt „bombázása mind a hat kísérletben csökkentette Bgh sikeres behatolását a sejtekbe összehasonlítva olyan sejtekkel, amelyeket idegen kontroll dsRNS-sel (humán tiroíd hormon receptor dsRNS-sel) „bombáztunk. A RacB dsRNS rezisztenciát kiváltó hatása a Bgh penetrációs hatékonyságát átlagosan 44%-kal csökkentette (4. ábra).

Az átmeneti transzformáláshoz a dsRNS árpa levelek epídermális sejtjeibe történő biolisztikus bevezetésére korábban már leírt módszert [Schweizer et ai., Mól. Plánt Mícrobe Interact. 12, 647-654 (1999); Schweizer et a.i., Plánt J. 2000 24, S95-903 (2ÖOO)j alkalmaztuk. 1,1 pm. átmérőjű woifram részecskéket (részecske. söröség 25 mg/ml) vontunk he együttesen dsRNS-sel (elkészítését lásd .fent) és a pGFB vektor plazrnid DNS—ével (GFP a

CaMV 35S promoter kontrolija alatt) mint transzformációs markerrei, Minden egyes bombázáshoz a. következő mennyiségeket használtuk dsRMS-ből és a riporter plazmádból a részecskék bevonásához: 1 pg pGFP és 2 pg dsRNS. Kettős-szálú RNS-t szintetizáltunk in vitro szánsz és antíszensz RNS szálak anneaiing-jével (lásd fent).

Mikrohordozók elkészítéséhez 55 mg woifram részecskét (M 17, 1,1 um átmérő; Bio-Rad, Muních) mostunk kétszer 1 ml autofclévozott desztillált vízben és egyszer abszolút etanolban, szárítottuk és felvettük 1 ml 50%-o-s glicerinben (körülbelül 50 mg/ml törssoldat). Az oldatot 25 mg/ml-re gígítottuk 50%-os glicerinnel, felhasználás előtt alaposan összekevertük és ultrahangos fürdőben, szuszpendáltuk. A mikrohordozók bevonását minden egyes bombázáshoz 1 pg plazmád, 2 pg dsRÜS (1 μϊ), 12,5 μΐ woifram részecske szuszpenziő (25 mg/ml), 12,5 μϊ 1 M Ca(NO3>₂ oldat (ph Ό. 35'3/S£/KR2 ♦ »** φ

128

AXy* ♦ ♦ Φ·»*·· ί keverékének csöppenként, folytonos keverés mellett történő összemérésével végeztük, a keveréket 10 percig hagytuk állni szobahőmérsékleten, azután rövid ideig centrifugáltuk és a fe~ lalúszé 20 μΐ-éf eltávolítóttűk. A wolfram részecskéket tartalmazó maradékot (ultrahangos fürdőben) újra szuszpendáituk és felhasználtuk a kísérletekhez,

Körülbelül 4 cm hosszúságú árpa elsődleges levélszegmenseket használtunk fel. A szövetet 20 pg benzímidazoit tartalmazó 0,5%os Phytagar-ra (SibooBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) helyeztük Retrl-csészében (6,5 cm átmérőjű) és a széleit - közvetlenül a részecskékkel történő bombázást megelőzően - 2,2 cm x 2,3 cm derékszögű nyílással rendelkező sablonnal takartuk be. Egyiket a másik után, a csészéket a vákuum-kamra aljara helyeztük [Schweizer et al., Mól. Plánt Mi erőbe Intéract. 12, 647-654 (1929)], amely fölött egy nyitott edényen nylon hálót (lyukméret 0,2 mm, Millípore, Eschborn) helyeztünk ei diffüzérként (az aljától 5 cm-re, 11 cm-rel a makrohordoző alatt, lásd alább) , hogy az összetapadt részecskéket szétoszlassa és lelassítsa a részecskék áramlását. Minden bombázáshoz a makrohordozőt (műanyag fecskendő szurótartőt, 13 mm, Selmán Sciences, Swinney, OK), amelyet a kamra tetejéhez illesztettünk, 5,8 pl DRS-sel bevont wcifram részecskével (mikrohordozdval) töltöttünk fel. A kamrában a nyomást diafragma vákuum pumpa (Vacuubrand, Nertheim) alkalmazásával 0,9 barrel csökkentettük és a növényi szövet felszínét megbombáztuk a wolfram részecskékkel 9 bar hélium gáz nyomás mellett. Ezután a kamrát azonnal kiszellőztettük levegővel. A transzformált sejtek megjelöléséhez a leveleket a '7 S > 353/BUi/iAíi'S

plazmáddal bombáztuk fpGFP; pUClS-básisű vektor, CaMV 35S promóter/inszertált GFP gént tartalmazó terrainátor kazetta) [Schweizer et al._z Mól. Plánt Microbe Interact. 12, 64 7-.654 (1999)], amelyet az Institut für Pflanzengenetik (Gatersieben, Germany) bocsátott rendelkezésünkre. Mielőtt egy másik plazmidot használtunk volna a bombázáshoz:, a makrohordozót mindig alaposan megtisztítottuk vízzel. A bombázás utáni négyórás, kissé nyitott Petri csészékben szobahőmérsékleten és napvilágnál történő inku7 báiást követően a leveleket löö konidiom/mra⁴' mennyiségben árpa lágyrothadást okozó penészgombával. (A6 változat) oltottuk be és további 36-48 órán át Ínkubáltuk azonos körülmények között.

Levélszegmenseket bombáztunk a bevont részecskékkel részecske bejuttató puskával. 312 pg wolfram részecskét lőttünk be egy bombázáskor. 4 órával a bombázás után a levéiszegmenseket Blumerfa graminis f. sp. hordei árpa lágyrochadását okozó penésszel (A6- változat) oltottuk be és további 40 óra elteltével kiértékeltük a fertőzés tüneteire vonatkozóan. Az eredményt {például a penetrációs hatékonyságot, amelyet az érett hausztóriummal és másodlagos hlfával megtámadott sejtek százalékos arányával definiálunk) fény- és fluoreszcens mikroszkópos vizsgalattal analizáltuk. 100 konidium/mm inokuláció a transzformált sejtek körülbelül 50%-os támadási gyakoriságát eredményezi. Legalább 100 kölcsönhatási helyet értékeltünk ki minden egyes kísérletben. Transzformáit (GF?-t kifejező) sejteket azonosítottunk kék fénnyel történő gerjesztéssel. A transzformált sejtek három különböző kategóriáját különböztettük meg:

1. Sejteket, amelyekben megtörtént a behatolás, könnyen fel78.353/3E/RS.2

130 ismerhető hausztóriummal, Azokat a sejteket, amelyekben, egynél több hausztórium volt, egy sejtnek számoltuk.

2. Sejteket, amelyeket megtámadott a penészgomba appresszóriums, de hausztóriumot nem tartalmaztak. Azokat a sejteket, amelyeket ismétlődben támadott Bgh, de -nem tartalmaztak hausztóriumot, egy sejtnek számoltuk,

3. Sejteket, amelyeket nem támadott meg Bgh.

Sztomatális sejteket és szubszldiáris sejteket kizártunk az értékelésből, Bgh felszíni szerkezetét a penészgomba fénymikroszkópos vizsgálatával vagy 30 perces 0,1% CalcofIuo.ros (w/v vízben) fluoreszcens festéssel analizáltuk, A penészgomba fejlődés könnyen értékelhető Caioofluoros festést kővető fluoreszcens mikroszkópos vizsgálattal. Sár a penész RacB dsRMS-sel transzformáit sejtekben elsődleges csiracsövet és appresszóriumos csiracsövet fejleszt, nem fejlődik ki hausztórium, A hausztória kifejlődése a másodlagos hifa megjelenését megelőző állapot.

A relatív penetrációs hatékonyságot (R?£~t) a RacS-dsRNS-sel transzformált sejtek penetrációs hatékonysága és a kontroll dsBNS-sel transz formált sejtek penetrációs hatékonysága közötti eltérés alapján, az alábbiak szerint számítottuk (itt: átlagos penetrációs hatékonyság 57%). A. százalékos BBS. számítása: (BBE-1)*100.

RacB-dsRNS-sel transz!orrnál t sejtek PB RRB - ' kontroll dsRNS-sel transzformált sejtek PB

RPE % - (RPE-1)*100

Az. BEE % érték (eltérés a kontroll átlagos penetrációs hatékonyságátől) szolgái a RaoS dsRRS-sei transzformált sejtek érzékenységének maghatározására (4. ábra).

7«.358/BS/ZSZ .1

J .1

Jl·

A kontroll dsRRS esetében nincs különbség a kontroll dsRNSsel és vízzel transzformált sejtek viselkedése között, ezt találtuk 5 egymástól független kísérletben a Bgh-val szembeni penetrációs hatékonyság vonatkozáséban.

Tanulmányoztuk a PE. eltéréseket különböző genotípusokban. is. Az Mlo génnel való működőképes kapcsolódás bemutatására rnioS genotípust - AS9, mlo5_z rorl, háttér: Ingrid - alkalmaztunk, amely mutációt rejtve az Rorl génben, csak mérsékelt érzékenységet mutat Sgh támadással szemben [Preialdenhoven et al.. Plánt Cell 8, 5-14 (1996)]. Ebben a kettős mutáns genotípusban tanulmányoztuk a RacB dsRNS hatékonyságát összehasonlítva azt a vad típusú Hlo genotípussal. öt egymástól független kísérlet egyikében sem tapasztaltuk azonban hausztőría kifejlődésének gátlását A89 törzsben, míg a Pailas és Ingrid fajtákkal végzett párhuzamos kísérletekben a PS jelentősen csökkent (5. ábra), Érdekes módon, a RacB dsRNS hatása kifejezettebb volt a Pailas fajtánál, mint az Ingridnél (5, ábra; 1, és 2. kísérletek összevetve a 3., 4.

és 5. kísérletekkel).

A dsRNS-nek a megtámadott sejtek transzformációs arányára vagy túlélési arányára gyakorolt hatása kiküszöböléséhez GFP-t kifejező sejtek számát hasonlítottuk össze kontroll és RacB dsRNS kísérletekben (7. táblázat), A RacB dsRNS nem gyakorolt hatást a GFP-t kifejező sejtek teljes számára vagy a xsegtámadott sejtek számára.

/8.3“?8 K&2 '1, táblázati

Árpa levelek transzformációs arányai dsRNS-sei való bombázást követően

Vonal	GFR-t kifejező sejtek száma/bombázás	rr
Teljes (Kontroll dsRNS)	Megtámadott (Kontroli dsRNS)	Teljes (Rs cB dsRNS)	Megtámadott (RacB dsBMS)
Pailas (Aló Rorl)	34,3±4,6	16,0±2,2	33,914,8	15,5+1,4	6 (21)
Ingrid (Aló Bori)	51_f 0±3f 9	27,6±S,7	49,9±5,6	31,5+7,8	3 (11)
A 8 9 (rioő rorl)	34,4±5,4	18,1+4,0	34,1+5,5	16,7+3, 8	5 (22)

*; bombázásonként 4 levelet bombáztunk a bemutatott adatok középértékek és standard hiba egymástól független kísérletek száma (n bombázás mindenesetben kontroll és RacB dsRNS}

Konstitutívon aktív RACB mutáns

Feltételezetten konstitutívon aktív árpa RACB mutánst (G —>V szubsztitúció a 15. pozícióban; RacB-V15) hoztunk létre és túlzottan kifejeztük Ballas fajtájú árpában annak érdekében, hogy pozitívan azonosítsuk RACB-t, mint érzékenységi faktort. Először teljes hosszúságú RACB~t szintetizáltunk RT-i?CR-rel, A következő oligonukleotid prímeteket alkalmaztuk erre a célra:

RacBS'BaiaHI : 5' -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3^? (31. számú szekv.)

RacB3+3aíi : 5'-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-S' (32. számú szekv.)

A cDRE-t pGEM-T vektorba klónoztuk és ezt követően kivágtuk ?3.353/8E/RA2 * .4 a primer hasítási helyén keresztül és pGY-1 piazmidba [Schweizer st al,, Mól. Plánt Microbe Intéract. 12, 647-654 (1999)] klónoztuk (7. ábra) a BamHl/SalI hasítási helyek mentén. Szt az összeállítást pGYl-RacB jelöléssel láttuk el.

A RacB-715 konstitutivan aktív RacB mutánst kódoló nukleinsav-szekvenciát a „Transfo-rm-er® Site-Dírecteö Mutagenesis Kit {Clo.netech, Heideíberg) alkalmazásával hoztuk létre, a gyártó utasításai szerint. Az alkalmazott kiindulási vektor p-GYl-RacSvolt, A következő; oiigonukleotidot használtuk fel mutagenezis primerként:

VI5 : 5^Z-AGCGTGGGGGACGTCGGCGTCGGGAAGAC~3^f (33. számú szekv.}

Ezután Rac3-V15-öt átmenetileg túlzottan kifejeztük 5 egymástól független kísérletben a. Pallas típusú árpában a CaMV 35S promóter kontrollja alatt. A kísérieteket Schultheiss és munkatársai leírása [Plánt Physíol.. 128, 1447-1454 (2002)} alapján végeztük kivéve, hogy a részecske bombázást követően 4 óra helyett 24 óra telt el az ínckuláciőt megelőzően. A részecskék bevonását Schweizer és munkatársai által leírtak [Mól. Plánt Mícrobe Intéract. 12, 647-654 (19991 } szerint végeztük.

A konstitutív RacB mutáns kifejezése jelentős érzékenység növekedést eredményez az árpa. lágyrothadását okozó patogén támadásával szemben a kontrollal összehasonlítva. Ezek az eredmények ismét megerősítik RacB kulcs-szerepét a patogénekkei szembeni védekezésben. A RacB—V15 hatásai (6-A/S. ábra) szignifikánsnak bizonyultak a t-próbában, amikor két-végű páros vizsgálatot végeztünk. A relatív érzékenység a penészgomba patogénnel szemben minden esetben, megnőtt (6B« ábra) .

?S.35S/£S/?AZ

9. példa:

További HvRac homológok

Minden teljes hosszúságú szekvenciát specifikus primerek segítségével izoláltunk RNS-foől és klónoztuk pGEM-T vektorba, majd szekvenáltuk [Schultheiss et al., Plánt Physioi. 128, 1447-1454 •(2:002); Rückelhoven et al., Plánt Mc-1« Bioi, (2001)]. Néhány esetben a szekvenciák nagyon hasonlítottak RacB-re.

a) HvRop6:

BAL PRIMER 5^f-GTGGAGGCGCGGCGAGA~3^?

JOBB PRIMER 5' -CCATGCTTGATCTCCATAGTCA-l^ bj HvRacD;

(25. számú szekv.) (2 6. s z ámú sze k v.)

BAL PRIMER 5^f-ggatocCGATTCCATCAGGAAAGCAT-5^f (27 JOBB PRIMER 5'-gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3^í (28 ej HvRopA:

BAL PRIMER 5'-GGATCCttctcgtccatttagecggc-3' (29 számú szekv.) számú szekv.) számú szekv.)

JOBB PRIMER 5^Z-GTGGACtgatoacttgaagcatgocag-3' (30. számú szekv.)

A&RacB~t tartalmazó szánsz és antiszensa szerkezetek összeállítása Arabidúpsis höalíana-fean történő kifejezéshez

Az Arabídopsís RacB homológ (MIPS kód; AT4g35S50,- 53. számú szekvencia, lentebb AtRacB) egy fragmentumát PCR segítségével izoláltak Arabictopsis thaiiana cDNS könyvtárból. A felhasznált primer szekvenciák a kővetkezők voltak:

Eta 186: 5'~ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA~3^? (71. számú szekvencia)

Fra 187: 5'-ATCAAACACGCCCTTCACGTT~3'' (72, számú szekvencia))

Az ampiífikáció T3 höciklizálóban (Biométra) történt a következő hőfok lefutásokkal:

78.35S/SS/KAZ perc 95 °C 0,5 perc 59 °C perc 72 ’C 5 perc 72. °c ciklus {exrenzio)

A PCR termékeket a pCR2. ,1 vektorba, klónoztuk (a pCR Script Cloning Kit, Stratagene, Heideiberg) a gyártó utasításai szerint, Fragmentumot vágtunk ki a vektor szerkezetből SooRl restrikciós enzimes (Roche, Mannheira) hasítással. A fragmentum izolálható géieiektroforézissel és azt kővetően anioncserélő oszlopon {QIAex Purification Kit, Qiagen, Rilden) történő tisztítással. Eszerint a pSüH3-Nit bináris vektort Xraal és AcoRT. enzimes emésztéssel felnyitjuk és gélelektroforézísas tisztítási lépésnek vetjük alá, amelyet anioncseréiő oszlopon {QIAex Purífíoatíon Kit, Qiagen, HíIdén) történő elúciő követ.

Mivel az ínszertum és az 5*-Gverhang-geí rendelkező vektor klónozásához tompa végeket kell kialakítani, mind az eiuáit AtBacB fragmentumot, mind az élűéit pSUNS-Nit fragmentumot kezeljük 2 μΐ dNTP 1 keverékkel (dATP, dCTP, dGTP, dTTP mindegyikéből 10 mM; Pharmacia, Freiburg) és 1,6 pl Klenow fragmentummal (ÜSB/Amersham, Sraunschweig, 2 Ε/μί) az overhang feltöltéséhez és 30 percig 37 °C~on ínkubáijük. Az újra ligáiás elkerülése végett a vektorokat először QIAquick Spin Column (Qiagen, Hűden) oszlopon tisztítjuk, CIAF-pal (Caif Intéstinai Aikaiine Phosphatase - borjú vékonybél alakali.kns foszfatáz? Gifoco BRL, Eggenstein, 1 Ε/μί) kezeljük és végül 0,8%-os agaróz gélen tisztítjuk,

A következő Iigáciős keverék elkészítéséhez 50· μί teljes térfogatban 34 pi vizet, 5 ul iigáciős puffért és 1 μΐ T4 iigázt ?·3,3 ♦ >

(Roche, Mannheim) adunk még a hasított DNS 10 ui-éhez. Ezt a keveréket egy éjszakán keresztül 16 ⁰C-on inkubáijuk. A ligázt ezt követően lö percig 65 ^vC-on iánkéivá!juk. A ligációt 0,1 térfogat nátrium-aeetát (pH 5,2) és 2,5 térfogat et.anoll.al történő kicsapás követi. Centrífugálás (30 perc, 15000 g, 4 °C-on) után a pelletet 70%-os etanolban szárítjuk és lö pl vízben újra szuszpendáljuk. Ennek a peiietnek 2 μΙ-ét elektroporációval (S. coli Pulser, Sio-Rad) Esekériobia coli DH5« baktériumokba transzformáljuk. A DNS-sei kezeit baktériumokat ampicülinnel (50 m.g/1) kiegészített LB lemezekre szélesztjük. 16 órás 3? ^vC-on történt ínkubálás után a baktériumokat lekaparjuk a kifejlődött telepekről és 3 ml LB-Amp folyékony tápkő reget tartalmazó csövekbe visszük át. 16 órás 37 ü-on történt in.kubálás után a nagyon sűrű tenyészeteket centrifugáljuk. Plazmid. DNS-t izolálunk a baktérium perietekből a QiAprep DNS mínipreparáló kit (Qiagen, Hűden) segítségével a gyártó utasításait követve és különböző enzimkombinációkkai történő emésztésnek vetjük alá. Ezek a kontroll emésztések teszik lehetővé olyan szerkezetek izolálását, amelyekben az AtRacB gén szensz vagy antiszensz orientációban klónozva van az A. th&liazta nitriláz-1 (nitl) génje mögött, amely növényekben konstitutivan aktív a gén (GenBank, ¥07648.2, 24564340. nukleotidok) (Billebrand et ai., Gene 170, 197-200 (1996)]. Ezek a szerkezetek a pSÖN3NlT__AtRacB_s (73. számú szekvencia) és pSUN3NIT AtEacB_as (74. számú szekvencia) jelöléseket kapják és felhasználjuk azokat Arabidc>p,sis^v növények transzformálására. Ezek az összeállítások az AtRacB teljes szekvenciáját oly módon tartalmazzák, hogy a fragmentumot szensz orientációban tartalmazó pSUN3NlT AtRacB__s expressziós vektor képes funkcionális

78.3S8/B£/RkZ χ V *«*

AtRacB fehérje kifejezésére. A vektor elsődlegesen negatív kontrollként működik és a legtöbb esetben csökkent patogén-rezísztenciát eredményez, de néhány esetben (lásd az alábbiakban) megnövekedett patogén-rezisztenciához is vezethet, vélhetően együttes szupresszios hatás révén.

11. példa:

HvRacB gént tartalmasé sssasx és antiszensz összeállítások Arabidopsis fcbaliana~ban történő kifejeséshez

A HvRacB gén különböző nem-funkcionális fragmentumát készítjük el Arabidopsis növényekben történd kifejezéshez. Ehhez a HvRacS gént a pGEM-T bakteriális vektorba szubklönozva tartalmazó plazmidot a B«.mHI/Hindi II. (Roehe, Mannheim} enzimkombi nációval emésztjük. Függelékként 5^f-egyedi szálakat töltünk fel Klenow poiimerázos kezeléssel a fenti nukleotid keverék jelenlétében. Az eredményül kapott, ezekkel a tompa végekkel rendelkező HvB.acB fragmentumot, közvetlenül a pSüN3NTT vektorba kiónozzuk, amelyet előzőleg ennek többszörös klónozó helyén a Bgill és Spel restrikciós enzimekkel (Roche, Mannheim) felnyitottunk és amelynek 5'-függelékeit Riencw poiimerázos kezeléssel feltöltöttük (a fent leírtak szerint). A ligácíős reakciók öszszeáilításánál mindegyiknél 50 μΐ teljes térfogatban 34 μΐ vizet, 5 μΐ ligácíős puffért és 1 μ.Ι T4 ligázt (Roehe, Mannheim.) adunk még a hasított DKS 10 μΐ-éhez. Ezt a keveréket egy éjszakán keresztül 16 °C-on inkubáíjuk. A ligázt ezt követően 10 percig 65 ^uC~on ianktíváljuk. A ligáciőt 0,1 térfogat nátrium-acetát. (pH 5,2) és 2,5 térfogat etanolfal történő kícsapás követi. Centrifugáién (30 perc, 15000 g, 4 ^vC-on) után a pelletet 70%-os etanolban szárítjuk és 10 pl vízben újra szuszpendáljuk. Ennek a •?e.358/SS/S>.S

Hussr

Sió-Rád) pelletnek 2 pl-ét elektroporációval Escherichia coli DHSa baktériumokba transzformáljuk, A DNS-sei kezelt baktériumokat ampicillínnel (50 mg/i) kiegészített LB lemezekre széleset jük. 16 órás 37 ''C-on történt inkubálás után a baktériumokat lekaparjuk a kifejlődött telepekről és 3 ml LB-Amp folyékony tápközeget tartalmazó csövekbe visszük át. 16 órás 37 A?-on történt inkubálás után a nagyon sűrű tenyészeteket centrifugáljuk, Plazmád DNS-t izolálunk a baktérium melletekből a QIAprep DNS mínipreparálő kit (Qiagen, Silden} segítségévei a gyártó utasításait követve és különböző enzímkombínációkkai történő emésztésnek vetjük alá. Ezek a kontroll emésztések teszik lehetővé olyan szerkezetek izolálását, amelyekben a megfelelő gén szensz vagy antíszensz orientációban klónozva van az A, thaliana nitríléz-1 (nini) génje mögött, amely növényekben konstitutivan aktív a gén (lásd fent). Ezek a szerkezetek a 'pSUN3-NIT__HvRacB__s (?S, számú szekvencia.) és pSDN3NIT__HvRacB__as (76, számú szekvencia) jelöléseket kapják és felhasználjuk azokat Arab.idopsls növények transzformálására. Ezek az összeállítások HvRacB csonkolt fragmentumát tartalmazzák úgy, hogy még a fragmentumot szensz orientációban tartalmazó pSUN3NlT__RvRacB s expressziós vektor sem képes működőképes HvRacB fehérje kifejezésére, A vektor elsődlegesen negatív kontroliként működik, de néhány esetben (lásd az. alábbiakban) megnövekedett patogén-rezísztenciához is vezethet, vélhetően együttes szupresszíós hatás revén.

12, példa:

Arabidopsis zisztencia vizsgálata fcranssforsnálása és a re

8.3SS/SS/PAS

5,Q

Vad típusú Arabidcpsis thaiiana növényeket (Columbia) fertőzünk Agrobactericm tumefaciens törzzsel (SHA10S) a Bechtold és munkatársai által leírt vákuum infiltrácíős módszer [GR Acad Sci.

Paris, Life Sciences 3.16, 11.94-1199 (1993) ] módosított változata alapján. [Clough and Bent, Plánt J. 16 (6) , 735-743 (1998)].

A felhasznált A. fcüsrefacien.s sejteket előzőleg a következő piazmidokkal transzformáltuk: pSUNÓNlT AtRacB s (73. számú szekvencia) , pSUN3NIT__AtRacB_as (74. számú szekvencia), pSnN3NIT__HvRacö_s (75. számú szekvencia) és pSUN3NÍT__HvRacB__as (76. számú szekvencia) . Az .Agrobacterium-mai transzformált elsődleges transzé'ormátárnok magjait kanamicin rezisztenciajuk alapján válogatjuk ki. Antibiotikum rezisztens magoncokat ültetünk talajba és amikor elérik a teljesen kifejlődött növényi állapotot, biokémiai analízisnek vetjük alá azokat.

A t.ranszgén Arabidopsís növények patogén penészekkel szembeni rezisztenciájának vizsgálatához a Peronospora parsaitíca és Grysiphe cíchoraceam biotröí penészgombákkal végzünk beoltásokat..

5-3 hetes növényeket permetezünk be körülbelül lö' spóra/mi konidiospöra szuszpenzióval. A beoltott növényeket egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk, körülbelül 16 °C-on sötétben és párás körülmények között, műanyag zacskóval letakarva. Egy nap elteltével kissé kinyitjuk a műanyag zacskót, majd később teljesen eltávolítjuk. A beoltás után 6 nappal a növényeket egy éjszakára megint letakarjuk a műanyag zacskóval, ezáltal sporulációt indukálva. A következő napon megvizsgáljuk a leveleket konídíospórák megjelenése szempontjából. A következő naptól kezdve a penész•?8.3S8/88/KM gomba intracei'luláris növekedése a levelekben gyenge klorózistői (sápkórosságtői) súlyos nekrőzíslg (elhalásig) terjedő elváltozásokhoz vezet. Ezeket a tüneteket meghatározzuk és szignlfikanoia vizsgálatokat végzünk.

A biotröf penészgombát Arabídopsís növényeken szaporítjuk, A 4 hetes, RacB-t kifejező transzgén Ttrabidopsia növények beoltásához finom, kefével konidíofórokat távolítunk el a levelek felüt-

letérői	és 3	transzgén növények	leveleire visszük át. A	novénye-
kot 7 na	pig 2	0 ^wG - on í n k ub á i j u k.	A beoltás után 7 nappal	a revé-
lek falú	létén	megjelennek a kon;	zdio fórok és a következő	na pókban
klorózis	és n	ekrózís figyelhető	meg. Ezeket, a tüneteket	megható-
rázzuk é	S S 21 <	jnifikancia vizsgál	afokafc végzünk.

c) Eredmények

Az antiszensz AtRacB vagy HvRacS szekvenciákat kifejező transzgén Arabidopsis növények szignifikánsan ellenállóbbak Peronospo.ra párásifcioa és Erysipbe ciohoracearum penész-gombákkal szemben, mint a nem-transzgén, vad típusú növények.

A teljes AtRacB szensz szekvenciát kifejező transzgén Arabidcgtísis növények a legtöbb esetben szignifikánsan érzékenyebbek mind Peronospora psrasitíca, mind Erysiphe cíchoraceurum penészgombákkal szemben, mint a nem-transzgén, vad típusú növények. Néhány esetben azonban megnövekedett rezisztencia is megfigyelhető (vélhetően együttes szupresszíős hatás révén).

RvRacB fragmentum szensz szekvenciaját kifejező transzgén Araöidopsi,s növények a néhány esetben szignífikánsan ellenállóbbak mind Reronospora parsai ti ca, mind Rrysíphe dchorsceanss penészgombákkal szemben, mint a nem-transzgén, vad típusú növények.

•yc: _r 7^: /£«:£ /p.AZ

J * « *·«·

A ^í; «•χ $ l··-: .1

-nek szabad szövege <12O> Öj nukleinsav-szekvenciák és alkalmazásuk növényekben pa togén-rezisztencia kialakítására szolgáló eljárásokban <210> 1 <211> 857 <212> DNS <213> Kordeum valsara (árpa:

<210> 2 <211> 197 <212> PROTEIN <213> H.ordeum vulgare (árpa) <210> 3 <211 > 1113 <212> DNS <213> Oryza sativa (rizs) <210> 1 <211> 1.97 <212> PROTEIN <213> Oryza sativa (rizs) <210> 5 <21.1> 1.3 33 <212> DNS <213> Zea mays (kukorica) <210> 6 <211> 157 «Uíí/BE/RZí <212> PROTEIN <213> Zea rnays (kukorica) <211> 197 s Ί ·Ύ χ τχτηζ~·.ΓΓ m τ \γ χ X. X X. .0' i<λ.? X χ iν <213> Mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása;

az árpa 'RacB: protein dominans-negatív mutál <zz0>

<221> HELYZET <222> (20j <223> Thr/Asn mutáció a domináns-negatíve fenotíous esetéber <212> PROTEIN <213á Mesterséges szekvencia <220 a rizs RacB protein domináns-negativ mutánsa <221> HELY2El <222> (201 <223> Thr/Asn mutáció ináns-negative fenolieus esetébe;

<2T0> 9 <210 197 <212> BRŐTEIN ascss/sa/Raz <213> Mesterséges szekvencia <22Ö>

<221> HELYSET <222> (20) <223> Thr/Asn mutáció a domináns-nogative fenotípus esetében <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása; a kukorica RacB protein domínáns-negatív mutánsa <210 10 <211> 2Í <2i2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220 <2.23> A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid primer <210 11 <211> 26 <210 DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid primer <210 12 <210 26 <210 DNS <2l.3> Mesterséges szekvencia <220

3.353/

Ez R&.2 **·£ « <

<223> A mesterséges szekvencia, leírása: oiígenukleofid primer <212> DNS <2I3> Mesterséges szskvencí <223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukíectid prime;

<211> 26 <213.> Mesterséges szerver <:· ·> p_} \_v <223> A mesterséges szekvencia leírása: clIge tnuKlectid errmer <21Ö> 15 <2;.1> 22 •V Z. Z'•k Z í .5 6' •''íÍtí 3 T..fö 3 S 33 3 KV 3 ΠΟΙ3 <223> A mesterséges szekvencia, leírása: oligcnukleotid prime;

<210> 16 <211> 23 dn;

3> Mesterséges szekvencia <.zz u,>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: ollgcnuklectid primer

78.358/BB/8O * ♦ < ζ.·. ζ a íjjN &

< 213 7 Ms s t es é g e s zeke uU <ZZÍP <223> A mesterséges szekvencia

J,k <211> 21 <21z> DNS <213> Mesterséges s z e k v en c i a

4.5 ?ása: oliqonukleotia or:

<220>

<223> A mesterséges szekvencia ie-irása: oligonukleotid primer <·' v Q ’1 C>

<211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges :eavencza <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása

... g ο í i^: k j. e o \ v* y ΐγι ·:> £ <2H>

> DNS <213> Mesterséges szekvencia

C Z z u >

<223> A mesterséges szekvencia leírása; o-ligonukleo

i ö « <211> '21 <212> DNS <2'13> Mesterséges szexvéneia ;2'23> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid prímé:

<21Q> 22 <212> DNS <213> Mesterséges szekve fíCia ;z2ü>

<2:23> A mesterséges szekvencia leírása: old gonukleotid. primer <210 23 <211> 13 <212> DNS <213> Mesterséges szekver

X3.

<22 3> A mesterséges szekvencia leírása; oligonukleotid prímé·:

<210 2 4 < 211> 19 <212> DNS <213> Mestersége:

szekvencia <22 Q:

<22A m mesterséges szekvencia leírása; oligonukleotid primer

8,3S8ZB2/W <210> 25 <211. > 17 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22Ö>

<223> A mesterséges szekvencia leírása; ciigonukleotid prime:

<2il> 22 <212> DNS <213>

Mesterseaes szexwncxa <22 0 <223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonufciectid primer <211> 26 <212> DNS <:213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotíd prime <210 26 <211> 26 <212> DNS <zi3> Mesterséges szekvencia <22 O <22 3>

A mesterséges szekvencia leírása: clígonukleotíd primer

ΦΦφ Φ X « φ » -a ν* * * <21 ΰ> 2 9 ·<211> 26 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22ΰ>

<223> A mesterséges szekvencia leírása.: oiígonukleotid oríme;

<211> 27 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia

A χ •'νώ ζ.. V -A <223> A mesterséges szekvencia leírása: oiígonukleotid primer <210> 31 <211> 24 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.

/•o ·-> n v,

X xi i. S <223> A mesterséges szekvencia leírása: cligonukleotid prime;

<210> 32 <212> DNS <213> Mestersége:

szekvencia <220>

<223> A mesterséaes szekvencia leírása: cligonukleotid orrver

78.. 83¾ /&£ / R& 2 φ« «

<210>	33
<211>	<·< X. y

<212> DNS

<213>

Me s t e r s é g e s s z e k v e π c í a

<220>

<223>

A mesterséges szekvencia leírása; oiigonukieotid primer

<210	4
<211>	í X -1
<2T2>	DNS
<213>	Hordeu® vulgare (árpa)

<22 Ο

<221>
<2:22>	(38 ) .(673)
<223>	Rop6 RacB homoiogot kodoio

.x O -Í: fi x '••Ή ± V A	„s «.d
<211>	/•y Ο X xl
<212>	PROTEIN
<223>	Hordeum vaigare (árpa)

<21ö>	3 6
<·- 0 *·: 1 \C Λ 1	692
<212>	DNa
<213>	Hordeum vaigare (árpa)

<220>

<221>	CDS
<222>	(67) . . (657)
<223>	RacB RacD homológot kódoló

78.388/8' * * 4 * ♦ *» * * *

s Ο 1 fix	3
< ? R fi ó	ι αχ
^< x .1 »<. x*	PROTEIN

<213> Hordeura vulgare (árpa

</ 0 Ί fi· ‘x	38
<211>	í-\ <*7 í \s !
<212>	DNS
<213>	Hordeura valgare (árpa)

<221>	CDS
<222>	(27),,(665)
<22 3>	Rop4 RacB homológot kódoló
<2.10>	3.9
<211>	< fi fi
<212>	PROTEIN
<213>	.Hordoum vulgars (árpa)

0> 40

<211>	.9 4 P
<212>	DNS
<213>	Zea mays (kukorica)

<220>

<222 >	CDS
<222.>	(37 í .> (672)

<223> Rop6· RacB homológot kódoló <210> 41 <211> 212 ?S. 35S/KE/RM * <

*. *

,.. .. »’ 4 « * * ** * oi

<212>	PROTEIN
<210	Zea mavs (kukorica)

<210	Λ
<210	352
<212>	DNS
<2I3>	Oryza satíva. (rizs·

<220

<220	CDS
<222>	<1121..(702)
<223>	(RACDP Z RACD) RacB homológot kódoló

<2I0>

<212>	PROTEIN
<213>	ÜX?V2Ici S3tLXVcH (X'ÍZS'í

<210	4 4
<210	1169
<212>	DNS
,s ··.·> ’! -5	\ΛΤ V Z S S 3 ο. z V 3 í, <? .3. Z S ?

\ZZ .3. X
<222>	(169) . , (813)
<22 3>	Rco4 RacB homológot kódoló

<210	/1 t O
,02 -[	21S
<212>	PROTEIN
<21 3>	O.Y?yZ3 S4tlVi.3 ,)
IS .O;	E /RS Z.

·* * <212> DNS

Tea maya (kukorica;

<22 0>

<222> (190)..(831) <223> RácA RacB homológot kódoló <212 > PROTEIN <213 > lea maya (kukorica) <213> Hordeum vulgar \ 1.Λ ... Ci / <221> misc___fcaturc <222> Cl)..(301) <223> RacA

RacB homológot kódol :2L2> DNS

<220>

<221> Cl <222> (1)..(591) <223> RacA RacB homo l ógó t kódoló <210> 50 <2I1> 197 <212> PROTEIN <213> Arabido?

s-is thaliata.

oi a q <

:213> Arabidopoís thallana <.ZZi> Utó < / ? ·? s ; ρ f

X 4v.fr, Vr. · Y ,· ? ♦ \ Ά »·· »» f <223> RacB homológot kódol:

<21.1> 197 <212> PROTEIN <213> Arabidoosis thallana <213> Arabidonst ,ian<

<222> (1).. (591) <223> Racő homológot kódoló

Ά0 Zrp./χ>·Λ ?

>5 Í‘\

<210	54
<211>	197
<212>	PROTEIN
<213>	Arabídopsis thaliana
<21O>	55
<210	581
<212>	DNS
<213 >	Arabídopsís thaliana
<220 >

<22 0	CDS
<222>	(1) . . (588)
<22 3>	RacB homológot kódoló
<210>	58
<21O	128
<210	PROTEIN
<210	Arabldopsis thaliana
<21 Q>	57
<210	597
<212>	DNS
<213>	Arabídopsís thaliana
<2 20
<220	CDS
<222>	•1:.. (594)
<223>	EaoB homológot kódoló

<210> 58 <211> 198

78.3S8/EE/BA2

X* *♦**

<212>	PROTEIN
<21 3>	Arabidonsis thaliana

,/η.ι Λ\ V£,i V	5^:9
<211>	£> 3 8·
<2Ϊ2>	DNS
<213>	Arabi.dops·’s t.haliana

< 2 2 π >
< 3* Ί '> ^Χ-C- 4V ·'	Ο θ' £'
<222>	< ΐ V { < η: b>; ί
<223 >	RacB homológot kódoló

<21ö>	6:0
<211 >	195
<212>	PROTEIN
\ ώ i d ··’*	Arabidonsis thaliana

< a i v v
<211>	£ f': <
<212>	DNS

<213>

Arab idoρ ais th a1lana

<220
<221>
<2£2>	(1) . .. (603)
<223>	RacB homológot kódoló

,· a ί n u s. <-· ,X V ’

62

<2il>	201
<212>	PROTEIN
<213 >	Arabídopais thaliana

<211>	201
<212>	PROTEIN
<213 >	Arabídopais thaliana
78.3 58 /15

, V ->» itt »_A *^νϊ *· <210> 63 <21.1> 606 <212> DNS <213> Arahidopsis thallaoa <220>

<221> CDS <22 3> RacB homológot kódoló <210> 64 <211> 201 <212> PROTEIN <.213> Araóidopsis tha.l 1 ana <210> 65 <211> 648 <212> DNS <213> Arahidopsis thaitana <22Q>

<221> CDS <222> (1)-.(645) <223> RacB homológot kódoló <210> 66 <211> 215 <212> PROTEIN <213> Arahidopsis thaliana <210> 67 <211> 630 <212> DNS

78x358 /SO/O2U *» ”**' <

. $ Ό, ” Λ, ' ϊ- '»

<213>

Ar&foidons'i.s th&ΙΙηπη

<220>
<220-	,·~ί J-. V·ΜΟ
.·-<> ο	{!>,.(627)
<223>	RacB homológot kódoló

<210	68
<’ 0' 1 \	? Q q
<212>	PROTEIN
<2.1.3>	Arabidopsis thallana

<21 O	89
<210	600
<212>	DNS
<213>	Arabidonsis thaliana

<22-G>
<22 i>	CDS
<222>	(1)..(5 97)
<22 >	2 <.orr^;c< onoti· Kőclc<ő

< »·' l u <
<210	i gg
<212>	PROTEIN
<2 Ί Ό	Arabidocsis thaitana

<2TQ>	71
<211>
<212>	DNS
<213>	Me s tér s é oe s sze kver; c la

73< 353/íí

E / EAZ

Υ &

Φ A <2.2 3> A mesterséges szekvencia leírása;· oiigonükleofid primer *

<2IQ> 72 <211> 21 <2'12> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása::

oligonuklectid primer <210 > 73 <211> 10828 <2i2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220 >

<2'23> .A mesterséges szekvencia leírása: pSüN3NI?__AtRacB__s transzgenikus expressziős vektor az A-fchaliánén. Rac.3 szensz RNS kifejezésére <21ö> 74 <211> 10828 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása: pSUN3N.IT__AtRacB__as transzgenikus expressziős vektor az A-thaiianan RacB antiszensz RNS kifejezésére <210> 75 <211> 10036 n,.sO;3\;

« φ <212>

<213>

DNS

Mesterséges szekve ne is <220>

<2.23> A mesterséges szekvencia leírása: pSDN3NlT_HvRacB__s transzgenikus expressziós vektor az. árpa RacB szensz RNS fragmentum kifejezésére <210> 76 <21i> 1GÖ36 <21.2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22 0>

<22 3> A mesterséges szekvencia leírása: pSüN3NXT HvRacB _a.s transzgenikus expressziős vektor az árpa RacB antíszensz RNS kifejezésére

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás legalább egy patogénnel szembeni rezisztencia létrehozására vagy növelésére növényekben, azzal jellemezve, hogy:

a) csökkentjük egy RacB fehérje mennyiségét, aktivitását í?

vagy működését egy növényben. vagy annak szövetében, szervében, részében vagy sejtjében; és

b) kiválogatjuk azokat a növényeket, amelyekben az eredeti növényhez képest legalább egy patogénnel szerben rezisztencia létezik vagy fokozódott.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vaoy 6. számé szekvenciában bemutatott oolipepCL a RacB fehérje ci í El tidet, és

b) a 2., 4, vagy 6. számé szekvenciában bemutatott poiipeptíd funkcionális ekvivalensét tartalmazó fehérjék csoportjából választott.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkcionális ekvivalens legalább 64%-ban homológ a 2., 4. vagy

δ. számú szekvenciában bemutatott poiipeptidek valamelyikével.
4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hoov a funkcionál is ekvivalenst a 35., 37., 39., 41., 43.,

47., 50., 52., 54, , 56., 58., 66., 62., 64 ., öt·., ös , vagy

70, számú szekvenciával rendelkező polípeptiddel Írjuk le.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a RacB fehérje csökkentését a következők közül választott módszer alkalmazásával biztosítjuk:

73.353/3Ζ/ΚΤ2 ** *

a) kettős-szálú RacB RNS nukieinsav-szekveneia (RacB dsRNS) ás expressziós kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

b) RacB antiszensz nukieinsav-szekveneia és expressziós kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

c) RacB antiszensz nukieinsav-szekveneia bevezetése rlbozimmai és expressziős kazettával kombinálva, biztosítva annak kifed) RacB szensz nukíeinsav-szekvencíák bevezetése együttes szupresszió kiváltására és expressziós kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

e) domináns-negatív RacR fehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia és expressziós kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését ;

f) RacB gének, RacB RNS-ek vagy RacB fehérjék elleni DNSvagy fehérje-kötő faktorok és expressziős kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

g) RacB RNS degradációját okozó vírus nukleínsav-szekveneiák vagy expressziős szerkezetek és expressziós kazetta bevezetése, biztosítva annak kifejeződését;

h) endogén RacB génekkel homológ rekombinációt indukáló szerkezetek' bevezetése, és

i) mutációk bevezetése endogén RacB génbe, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal tartalmazza:

stabil transzformálását :áiü RacB RNS nukieínsav-szekvenciát, vagy bj RacB antiszensz nukieínsav-szekvenciát, vagy c) RacB antiszensz nukleinsav-szekvenciát ribo-zimraal kombi78.358/8K/K&2

Az 1-5

jel lemezve, ho (a) növényi se a) két tős

• * * .ιν&, vagy

ό) együttes szupressziő kiváltására RacB szensz nukleinsavs z e kvénei á t, vagy

e) domináns-negatív RacB fehérjét, vagy

f) RacB gének, RacB RRS-ek vagy RacB fehérjék elleni DNSvagy fehérje-kötő faktorokat, vagy

g) RacB RNS lebontását okozó vírus nukleinsav-szekvencíákat kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns expressziós kazettával, amely működőképesen kapcsolódik növényekben aktív promőterrel;

(b) a nővény regenerálását a növényi sejtből; és (c) : nevezett nukleinsav-szekvencía kifejezését olyan mennyiségben és időtartam alatt, amely elegendő nevezett növény patogénrezisztenciájának létrehozására vagy növelésére.

?, Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti el járás, azzal jellemezve, hogy a patogéut baktériumokat, penészgombákat, rovarokat, vírusokat és némát ódákat tartalmazó csoportból választjuk..
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a patogéneket a Plasmodiophoramyeofa, Oomyoota, Aseomyoota, Chyt ridíomycetes, kygomyestes, Basidiomycota és Deuteromycetes penészgombák közül választjuk.
9. Az 1-8, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényt egyszikűek és kétszikűek közűi választjuk.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényt a búzát, zabot, kölest, árpát, rozsot, kukoricát., rizst, tönfcölybúzát, cirokot, tritikálét, hajdinát, lencsét vagy cukornádat tartalmazó egyszikűek közöl ?8.3-S.S /SE/R&2 *

...

választjuk.
11. A 2. számú szekvenciában bemutatott árpa RacB fehérje.
12. Az árpa RacB fehérje funkcionális ekvivalensét kódoló, a

35., 37. vagy 39. számú szekvenciákban bemutatott polipeptid.
13. A 11. igénypont szerinti árpct RaoB fehérje dominánsnegatív változata.
14. A 13. Igénypont szerint definiált, a 7. számú szekvenciában leírt domínáns-negativ változat.
15. A 11. igénypont szerinti árpa RacB fehérjét kódoló nuk™ leinsav-szekvencla.
16. A 15. igénypont szerinti, az 1. számú szekvenciában leírt nukieínsav-szekvencia, az ezzel komplementer nukieinsavszekvencia és a genetikai kód. degeneráltsága folytán ebből származtatható szekveneíák.
17. Az árpa RacB fehérje 12. igénypont szerinti funkcionális ekvivalensét kódoló nukleínsav-szekvencia.
18. A 17. igénypont szerinti, a 34., 36. vagy 38. számú szekvenciában leirt nukleínsav-szekvencia, az ezzel komplementer nukieinsav-szefcvecía és a genetikai kód degeneráltsága folytán ebből származtatható szekvenciák.
19«. Az árpa RacB fehérje 13. vagy 14. igénypont szerinti domináns-negatív változatát kódoló nukleínsav-szekvencia.

2:0. A RacB fehérje kifejezésének csökkentésére bevezetett kettős-szálú RNS molekula, ahol

a) a két RNS szál közül az egyik lényegében, azonos a RacB nnkleinsav-szekvenoiának legalább egy részletével, és b; a megfelelő másik RNS szál lényegében azonos a RaoB nukleinsav-szekvenoia komplementer szálának legalább egy részletével.

?«.3δ8·/δΕ/ΡΛ3 « * db Ί: ζ η
21. A RacB fehérje kifejezésének csökkentésére bevezetett kettős-szálú RNS molekula tartalmaz

a) szensz RNS szálat, amely a RacB fehérjét kódoló nukleínsav-szekvencia szensz RNS transzkriptumanak legalább egy részletével lényegében azonos, legalább egy ribonukleotid-szekvenciát tartalmaz, és bi antiszensz RNS szálat, amely lényegében komplementer az

a) szerinti RNS szensz szállal.
22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti dsRNS molekula, ahol a két RNS szál kovalensen kapcsolódik egymással.
23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti dsRNS molekula, ahol az RNS egyik szálát az 1., 3. vagy 5. számú szekvenciában leirt RacB fehérjét vagy annak a 34., 36., 38., 40., 42., 44.,

49., 51., 53.

65., 67. vagy 69 <

számú szekvenciákban leírt funkcionális ekvivalensét kódoló nukleinsav-szekvenciának legalább egy része kódolja.
24. Transzgén expressziós kazetta, amely a 15-19. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvenciát vagy a 20-23. igénypontok bármelyike szerinti dsRNS molekulát kódoló nukieinsav-szefcvéneiét promóterrei működőképesen összekapcsolva tartalmazza, ranszgén expressziós kazetta, amely az 1., 3. vagy 5.

venciában leirt RacB fehérjét vagy annak a 34., 36., s Z . , 44 . , 4 6. , S 3 . , 4 9 . , 51., oá,, ο ο. , o / . , o r . , 63, , agy 69. számú szekvenciákban leirt funkcionális ekviődcló nukieinsav-szekvenciának legalább egy részletét a, ahol nevezett nukleinsav-szekvencia működőképesen és antiszensz orientációban kapcsolódik promóterrei..
26. A 24, vagy 25. igénypont szerinti transzgén expressziős

38, , 40. /·· £* 67. V w ♦ < vale nsét tart alma

?8.3S8/BS/m <·» kazetta, ahol a rekombinánsan kifejezendő nukleinsav-szekvencía olyan orom©tarral kapcsolódik működőképesen, amely növényekben funkcionális,
27. A 26. igénypont szerinti iranszgén expresszlós kazetta, ahol a növényekben funkcionális promoter patogénnel indukálható promóter.
28. A 24-27, igénypontok bármelyike szerinti expresszlós kazettát tartalmazó transzgén vektor.
29. Növény, amely tartalmazza a 15-19. igénypontok bármelyike szerinti nnkleínsav-szekvencíát, a 20-28. igénypontok bármelyike szerinti dsRdS-t, a 24-27, igénypontok bármelyike szerinti expresszlós kazettát vagy a 23, igénypont szerinti vektort.
30. Az l-lö, igénypontok bármelyike szerint létrehozható növény .
31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti növény, amelyet a búzát, zabot, kölest, árpát, rozsot, kukoricát, rizst, tönköiybüzát, cirokot, tritikálét, hajdinát, lencsét, cukornádat, repcét, canciát, zsázsát, Arabiöops.is~t, káposztát, szójababot, lucernát, borsót, babot, földimogyorót, burgonyát, dohányt, paradicsomot, padlizsánt, paprikát, napraforgót, Tagetest, salátát, körömvirágot (caienduia), dinnyét, tököt és cukkinit tartalmazó: növények csoportjából választunk,