CZ2004298A3 - Název neuveden - Google Patents

Description

Nové sekvence kyseliny nukleové a jejich použití k dosažení patogenní rezistence na rostlinách

Oblast techniky

Vynález se týká nových RacB cDNA sekvencí z ječmene, jakož i expresních kazet a vektorů, které tyto sekvence zahrnují. Vynález se rovněž týká s těmito expresními kazetami nebo vektory transformovaných transgenních rostlin, z nich odvozených kultur, částí, nebo transgenních částí určených k množení, jakož i jejich použití k výrobě potravin a krmiv, osev, farmaceutik, nebo čistých chemikálií. Vynález se rovněž týká způsobu zajištění nebo zvýšení rezistence proti patogenům v rostlinách použitím exprese RacB proteinu nebo funkčního ekvivalentu.

Dosavadní stav techniky

Cílem biotechnologických prací na rostlinách je zajistit, aby rostliny měly výhodné nové vlastnosti, například pro zvýšení hospodářské produktivity, pro růst kvality u potravin, nebo pro výrobu stanovených chemikálií nebo farmaceutik (Duwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96). Často jsou přírodní obranné mechanismy rostlin proti patogenům nedostatečné. Všechna houbovitá onemocnění vedou ke ztrátám na úrodě ve výši mnoha miliard US-$ ročně. Zavedení cizích genů z rostlin, zvířat nebo mikrobiolockých zdrojů může tuto obranu posílit. Příklady jsou ochrana proti požírání tabáku hmyzem expresí edogenních toxinů Bacillus thuringiensis za kontroly 35 S CaMV promotoru (Vaeck a kolektiv (1987) Nátuře 328: 33-37) nebo ochrana tabáku proti napadení houbou expresí chitinasy z fazolí za kontroly CaMV promotoru (Broglie a kolektiv (1991) Science 254: 1194-1197). Většina popsaných formulací však poskytuje jen rezistenci proti jednotlivým patogenům nebo proti úzkému spektru patogenů.

Existuje jen málo formulací, které propůjčují rostlinám rezistenci proti širokému spektru patogenů, především všem houbovitým patogenům. Systematicky získaná rezistence („systemic acquired resisatnce“, SAR) - ochranný mechanismus při různých interakcích mezi rostlinou a patogenem - se může zprostředkovat aplikací edogenních látek jako jasmonat (JA) nebo kyselina salicylová (SA) (Ward a kolektiv (1991) Planí Cell 3: 1085-1094, Uknes a kolektiv (1992) Plant Cell 4 (6): 645-656). Podobné účinky mohou být dosaženy také syntetickými sloučeninami jako kyselina 2,6-dichlorisonikotinová (INA) nebo S-methylester kyseliny benzo(l,2,3)thiadiazol-7-thiokarboxylové (BTH, Bion®) (Friedrich a kolektiv (1996) Plant J 10(1(:61-70, Lawton a kolektiv (1996) Plant J. 10:7182). Také exprese SAR regulovaného „pathogenesis related“ proteinu zčásti umožňuje docílit rezistenci proti nemocem.

V ječmeni je již delší dobu popsán Mlo-lokus jako negativní regulátor ochrany proti patogenům. Ztráta Mlo-genu nebo ztráta jeho funkce („loss-of-function“) podmiňuje zvýšenou a především druhově nespecifikovanou rezistenci například proti početným druhům práškové plísně (Buschges R a kolektiv (1997) Cell 88: 695-705, Jorgensen JH (1977) Euphytica 26: 55-62, Lyngkjaer MF a kolektiv (1995) Plant Pathol 44: 786-790). Mlo typ je rovněž rezesivní, což rovněž hovoří pro funkci jako susceptibilitní gen. Klasickým šlechtěním získané z hlediska Mlo deficitní druhy ječmene se používají v zemědělství již ve velké šíři. Zřejmě na základě rezesivity se přes intenzivní pěstování tato rezistence jevila jako mimořádně stálá. Prolomení rezistence dosud nenastalo. Mlo podobné rezistence nejsou v jiných rostlinách popsány, ačkoliv také pšenice, žito a jiné obilí jsou napadány patogeny srovnatelnými s práškovou plísní. Příčinou u ječmene může být například existence hexaploidního genomu, což extrémně ztěžuje identifikaci mutantů, u nichž byla inaktivována každá ze šesti kopií genu.

Mlo gen byl klonován teprve před nedávném (Buschges R a kolektiv (1997) Cell 88: 695-705, WO 98/04586, Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant sci. 5: 343348). V důsledku různých homologů byl izolován z jiných druhů obilí. K docílení rezistence proti patogenům jsou popsány různé způsoby použití těchto genů (WO 98/04586, WO 00/01722, WO 99/47552).

Mlo podmíněná rezistence rostliny proti práškové plísni se projevuje ve dvou podstatných jevech, které oba způsobují rezistenci proti vzniku: tvorba papil („cell wall apposition“, CWA) pod místem penetrace patogenu a epidermální stěna buňky. Rozšíření houbovitého patogenu zůstává omezeno téměř výlučně na tuto subcelulární strukturu

(Jorgensen JH a Mortensen K (1977) Phytopathology 67: 678-685, Freialdenhoven A a kolektiv (1996) Plant Cell 8: 5-14). Tato reakce je podmíněna pro účinnost Mlo potřebnými geny Rorl a Ror2 (Peterhánsel C a kolektiv (1997) 9: 1397-1409.

U Mlo podmíněných rezistencí je nevýhodné, že Mlo definované rostliny - také v nepřítomnosti patogenů- iniciují ochranný mechanismus, který se projevuje například v odumírání listových buněk (Wolter M a kolektiv (1993) Mol Gen Genet 239: 122-128). Nevýhodné rovněž je, že Mlo definované typy genu vykazují hypersusceptibilitu proti hemibiotropním patogenům jako Magnaporte grisea (M. grisea), jakož i Cochliobolus sativus (Bipolarit sorokiniana) (Jarosch B a kolektiv (1999) Mol Plant Mikrobe Interact 12: 508-514, Kumar J a kolektiv (2001) Phytopathology 91: 127-133). Mlo gen se jeví jako negativní regulátor smrti buňky. Důvodem je snad indukce smrti buňky při nepřítomnosti Mlo genu, což zvyšuje susceptibilitu vzhledem k těmto spíše nekrotropním patogenům. Tento ambivalentní účinek, který limituje biologické použití Mlo, je snad založen na tom, že nekrotropní houby mohou využít silnější HR Mlo definované hostitelské rostliny pro svůj infekční proces. Žádoucí by byla s Mlo srovnatelná rezistence, které však chybí znak indukce smrti buňky.

Proteiny Rho, Rac a Cdc42 jsou články rodiny malých GTP(guánosintrifosforečnanových) vazebných proteinů a regulují jako „molekulární spínač“ množství intracelulárních procesů, jak v rostlinných, tak i v živočišných organismech. Mají jako stavební kámen signální transdukce důležitou roli při přeměně extracelulámích stimulí. Regulují například NADPH oxidasy a tím uvolňování reakční kyslíkové molekuly („oxidative burst“). Zvířecí, nebo rostlinné RaCl je základem pro vznik aktivního NADPH komplexu oxidasy, který je opět důležitý pro vznik superoxidu, a tím poskytuje příspěvek k patogenní ochraně (Irani K a Goldschnidt-Clermont PJ (1998) Biochem Pharmacol 55: 1339-1346). Funkce patogenní ochrany je analogická v rostlinách a ve zvířatech (Kwong a kolektiv (1995) J Biol Chem 270 (34): 19868-19872, Duši a kolektiv (1996) Biochem J 314: 409-412, Diekmann a kolektiv (1994) Science 265: 531-533, Purgin a kolektiv (1997) The Plant Cell 9: 2077-2091, Kleinberg a kolektiv (1994) Biochemistry 33: 2490-2495, Prigmore a kolektiv (1995) Journal of Biol Chem 27 (18): 10717-10722, Irani a kolektiv (1997) Science 275: 1649-1652, Low a kolektiv (1994) Advances in Molecular Genetics of

Plant-Microbe Interactions 3: 361-369 (1994) eds. MJ Daniels, Kluwer Acadmic Publisher, Nizozemsko, Mehdy a kolektiv (1994) Plant Physiol 105: 467-472, Sundaresan a kolektiv (1996) Biochem J 318: 379-382). Kromě toho mají GTP-vazební proteiny funkci při změně struktury cytoskeletu a transformaci buňky (Simon M. (1996) TIBS 21: 178-181), jakož i při aktivaci transkripce (Hill a kolektiv (1995) Cell 81: 1159-1170, Chandra a kolektiv (1996) proč Nati Acad Sci USA 93: 13393-13397).

V rostlinách existuje větší rodina Rac podobných proteinů (Winge a kolektiv (1997) Plant Mol. Biol 35: 483-495), které jsou také označovány jako Rop rodina (Lin a kolektiv (1997) The Plant Cell 9: 1647-1659). V rostlinách se Rac proteiny zdají mít funkci při uvolňování reaktivní kyslíkové molekuly z důvodu patogenního škůdce (Groom QJ a kolektiv (1996) Plant J 10: 515-522, Hassanain HH a kolektiv (2000) Biochem Biophys Res Commun 272 (3): 783-788, Ono a kolektiv (2001) Proč Nati Acad Sci USA 98: 759-764). Rac moduluje mimo jiné stěnu buňky, signální transdukci v meristemu a ochranu před patogeny (Valster AH a kolektiv (2000) Trends Cell Biol 10 (4): 141-146). Raci z rýže umožňuje při přeměně exprese konstitutivně aktivní formy indukovat hypersensitivní odpověď („hypersensitive response“, HR) na místech napadení M. grisea a dosáhnout tak patogenní rezistence. Analogicky způsobuje exprese dominantně negativní formy Raci zvýšenou susceptibilitu propti M. grisea (Kawasaki T a kolektiv (1999) Proč Nati Acad Sci USA 98: 759-764). Tato zjištění svědčí o tom, že se změnou exprese Rac proteinu mohou v rostlinách vykonat výhodné efekty z hlediska patogenní ochrany.

WO 00/15815 popisuje pět Rac genů na kukuřici. Ačkoliv je popsán jak způsob regulace Rac proteinů a spekulativně uveden do souvislosti s docílením patogenní rezistence (str. 55, řádky 25 a následující), je jednotlivý technický poznatek, který konkrétně popisuje použití, obecně nasměrován na změnu exprese nárokovaných Rac genů k docílení patogenní rezistence (str. 60, řádky 21a následující). Zcela jednoznačně - a v souladu s věcným stavem popsaným ve stavu techniky - se zde uvádí závěr (str. 60, řádky 31 a následující): „Vynález je nutný z toho důvodu, aby byly rostliny chráněny před patogeny. Jakmile je rostlina transformována s polynukleotidem kódovaným pro Rac polypeptid, způsobí exprese polypeptidu v rostlině rezistenci proti rostlinným patogenům“. Za touto hypotézou stojící závěr (patogenní ochrana přes reaktivní kyslíkovou molekulu) je vysvětlen v následujícím a je podepřen početnou literaturou. Kromě se neprovádí žádná diferenciace mezi pěti nárokovanými Rac geny.

Podstata vynálezu

Předložený vynález spočívá v úkolu připravit nový způsob patogenní ochrany v rostlinách, který dovoluje efektivní ochranu před co možná nej širším spektrem patogenů v co možná největším počtu rozdílných druhů rostlin, přednostně v zemědělství používaných kulturních rostlin. Tento úkol se vyřeší způsobem podle vynálezu.

První předmět vynálezu zahrnuje způsob dosažení nebo zvýšení rezistence proti alespoň jednomu patogenů v rostlinách, vyznačující se tím, že zahrnuje následující pracovní kroky:

a) zmenšení množství proteinu, aktivity nebo funkce RacB proteinu v rostlině nebo její tkáni, jejím orgánu, její části nebo její buňce a

b) výběr rostlin, u nichž - na rozdíl nebo ve srovnání s výchozí rostlinou - existuje nebo se zvýší rezistence proti alespoň jednomu patogenů.

Překvapivě vykazuje Rac homolog RacB z ječmene (Hordeum vulgare) (SEQ Π) NO: 1) (pro: hvRacB) - přes zvýšenou podobnost sRacl z rýže - v protikladu sním negativní kontrolní funkci při napadení práškovou plísní Blumera (syn. Erysíphe) graminis speciálně hordei (Bgh): zmenšení hvRacB exprese v epidermální buňce interferencí pro sekvenci specifické RNA za použití dvou řetězce hvRacB-dsRNA („Gene-Silencing“), signifikatně znemožňující vznik haustoria pro Bgh infekci. Další experimenty ukazují (viz příklad 7), že tento fenomén není možné pozorovat vmlo5-rorl mutantním genotypu v ječmeni A89. Toto naznačuje, že RacB leží ve funkční vazbě kMlo nebo Rorl nebo k oběma, tedy snad působí v signálním řetězci.

Podobně jako ztráta funkce Mlo poskytuje širokou rezistenci proti různým extraktům Blumeria graminis speciálně hordei ztráta funkce HvRacB. V transientních

experimentech „Gene-Silencing“ redukuje HvRacB efektivitu průniku (vznik haustoria) Bgho o 44 % (viz příklad 7) - účinek, který ve své šíři odpovídá účinku dosaženému pomocí Mlo-dsRNA (Schweizer a kolektiv (2000) Plant J 24: 895-903). V ječmeni druhu Ingrid vede penetrace cca 60 % houby ke vzniku haustoria, naproti tomu proniknutí v BCIngrid -mlo5 činí téměř 0 %. Ječmen druhu A89 (mlo-rorl-mutanty) vykazuje penetrační efektivitu cca 20 až 35 %. V žádné z těchto variant nebyla pozorována změněná RacB exprese z důvodu Bgh inokulace (viz příklad 7, obr. 3. Skutečnost, že se také v patogenně citlivých druzích jako Pallas nebo Ingrid může pozorovat jen průnik cca 50 %, je odvozena z neustále existující bazální rezistence.

Zajímavě zesiluje „gene-silencing“ hv RacB jen vznik papil, ale jak se zdá na rozdíl od Mlo nikoliv spontánní smrt buněk rostliny. Tím se liší HvRacB od OsRacl, rýžového homologu Raci (Ono E a kolektiv (2001) proč Nati Acad Sci USA 98: 759-764). HvRacB působí převážně jako negativní regulátor vzniku papil. Pro použití k dosažení patogenní rezistence v rostlinách má tento rozdíl podstatný význam. Jak již bylo shora popsáno, mlo rezistence proti biotropní houbě je sice také podmíněna zesílenou tvorbou papil, je však draze vykoupena vyšší náchylností na nekrotropní houby (Jarosch B a kolektiv (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 508-514, Kumar J a kolektiv (2001) Phytopathology 91: 127-133). Poněvadž HvRacB ovlivňuje jen tvorbu papil, může tento problém ambivalence obejít.

RacB je na základě shora uvedených zjištění chápán jako klíčový prvek pro úspěšné vniknutí patogenu jako Bgh do rostlinné buňky. Způsob podle vynálezu potom nabízí všechny přednosti Mlo, aniž má jeho největší nevýhodu - zvýšené odumírání buněk.

Kromě toho způsob uvažuje všechny způsoby, u nichž se realizuje patogenně rezistentní fenomén změnou exprese proteinu zprostředkujícího rezistenci. Vyřazení genu lze realizovat bez exprese (cizího) proteinu. V ideálním případě se deaktivuje pouze edogenní gen. Toto má nezanedbatelné výhody pro registraci a pro přijetí uživatelem, který často přijímá rostliny s cizími proteiny s výhradami. Zvláště výhodné je v této souvislosti použití indukovatelných promotorů ke snížení množství RacB proteinů, aktivity nebo • · • · · • · * • · · · funkce, což například při použití patogenem indukovatelných promotorů umožňuje expresi jen v případě potřeby (to znamená při napadení patogenem).

Parciální sekvence ječmene RacB cDNA (HvRacB-cDNA) je popsána (GenBank Acc.-č.: AJ290240), konzerována na rýžovém RacB (GenBank Acc.-č.: AF250327) a kukuřičném RacB (GenBank Acc.-č.: AF126053) a je velmi podobná rýžovému Raci. Kukuřičný RacB je také jedním z pěti Rac genů ve shora uvedené přihlášce WO 00/15815 (sekvence č. 3). Zcela kódovaná sekvence HvRacB proteinu není dosud popsána (viz příklad 1). Ječmenný RacB má homologii s 95 % identitou s rýžovým RacB a kukuřičným RacB a je více než z 55 % identický s lidským RACI nebo RAC2 (Hassanain a kolektiv 2000, obr. 1). HvRacB se konstitutivně exprimuje v primárních listech ječmene a jeho expresní šířka není podstatně ovlivněna Bgh, a to do té míry, že k expresi dochází ve tkáni, která reaguje s Bgh patogeny.

Způsob podle vynálezu lze v principu použít na všech druzích rostlin. Přednostně na takových, na nichž se ovšem exprimuje RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent. Poněvadž funkce RacB je v úzké funkční souvislosti sMlo genem a byl identifikován v mnoha rostlinách - také ve dvouděložných (Devoto A a kolektiv (1999) J Biol Chem 274 (49): 34993-5004), je podobně široké rozdělení předpokládáno také pro RacB a jeho homology. Sekvence z jiných rostlin (například z Arabidopsis thaliana) homologické s v rámci tohoto vynálezu zveřejněnými RacB sekvencemi se mohou snadno vyhledat- za použití RacB sekvencí - například hledáním v datové bance.

Rostlinami se v rámci vynálezu míní všechny druhy vyšších a nižších rostlin rostlinné říše. Pod tento pojem jsou zahrnuty dospělé rostliny, osivo, výhonky a zárodky, jakož i od nich oddělené části, rouby, rostlinné orgány, tkáně, protoplasty, a jiné kultury, například buněčné kultury, jakož i všechny jiné druhy seskupení rostlinných buněk do funkčních nebo strukturních jednotek. Dospělými rostlinami se míní rostliny všechna libovolná stádia vývoje zárodku. Zárodkem se míní mladá nedospělá rostlina v časném stádiu vývoje. Pojem „rostlina“ zahrnuje všechny jednoroční a víceroční, jednoděložné a víceděložní rostliny, například takové druhy jako Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, • ·* ·· 9 · ·· · · · · • · · 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 999 99999

9 9 9 9 9 9 9 9 ·

999 9 9 99 99 99 ·

Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solárium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea a Populus.

Pojem „rostlina“ zahrnuje přednostně jednoděložní kulturní rostliny jako například obilí jako pšenice, ječmen, proso, žito, triticale, kukuřice, rýže, sorgum nebo oves, jakož i cukrová třtina.

Rovněž tento pojem zahrnuje dvouděložní kulturní rostliny, jako například

- brassicacae jako řepka olejná, canola, kresse, arabidopsis, leguminosae jako sója, vojtěška, hrách, fazole nebo podzemnice olejná,

- solanaceae jako mrkev, tabák, rajské jablíčko, aubergine nebo paprika, asteracaea nebo slunečnice, tagetes, salát nebo calendula,

- cucurbitaceae jako meloun, tykev nebo cuketa, jakož i len, bavlna, konopí, jetel, špenát, červený pepř, mrkev, karotka, řepa, ředkev, cukrovka, sladké brambory, okurka, skořice, květák, brokolice, špargl, cibule, česnek, celer, jahody, malina, ostružina, ananas, avokádo a druhy stromů, keřů, ořechů a vína. Stromové druhy zahrnují přednostně švestky, třešně, broskve, nektarinky, meruňky, banány, papaya, mango, jablko, hruška, kdoule.

Rovněž jsou zahrnuty ozdobné rostliny, užitkové nebo okrasné stromy, květiny, řezané květiny, křoví nebo trávník jako například rodu Rosaceae jako růže, Ericaceae jako rododendron nebo azalka, Euphorbiaceae jako vánoční hvězdy a kroton, caryophyllaceae jako karafiáty, Solanaceae jako petúnie, Gesneriaceae jako usamabaraveilchen, Blasaminaceae jako chrást, Orchideaceae jako orchideje, Iridaceae jako gladioly, iris, • » · * · · · · ·· · • · « · · · · · ·· ·· · · · · * • · · · · ··· · · · · · frésie a krokus, Compositae jako měsíček, Geraniaceae jako geranie, Liliaceae jako dračí strom, Moracceae jako fíkus, Araceae jako filodendron a mnoho jiných.

V rámci vynálezu jsou přednostní takové rostliny, které se mohou použít jako potraviny nebo krmivo, zvláště přednostní jsou jednoděložní druhy, jako popsané druhy obilí.

Zvláště přednostně se způsob používá na jednoděložních rostlinách, především na rostlinách s hospodářským významem jako pšenice, oves , ječmen, žito, kukuřice, rýže, pohanka, čirok, triticale, semeno lnu nebo cukrová třtina.

Patogenní rezistencí se míní zmenšení nebo zúžení symptomů onemocnění rostliny z důvodu napadení patogenem. Symptomy mohou být různého druhu, zahrnují ale přednostně takové symptomy, které přímo nebo nepřímo vedou k ovlivnění kvality rostliny, kvantity sklizně, vhodnosti pro použití jako krmivo nebo potravina, nebo také ztěžují výsev, pěstování, sklizeň nebo zpracování úrody.

„Propůjčením“, „existencí“, „vytvořením“ nebo „zvýšením“ patologické rezistence se míní, že ochranný mechanismus stanoveného druhu rostliny použitím způsobu podle vynálezu ve srovnání se zralou rostlinou („výchozí rostlinou“), na které se nepoužíval způsob podle vynálezu, má za jinak shodných podmínek (jako jsou například klimatické nebo pěstební podmínky) zvýšenou rezistenci proti jednomu nebo více patogenům. Zvýšená rezistence se přitom přednostně vyjadřuje zmenšením výskytu symptomů onemocnění, přičemž symptomy onemocnění vedle shora uvedených poškození zahrnují také například efektivitu průniku patogenu do rostliny nebo do rostlinných buněk nebo efektivitu proliferace v nich nebo na nich. Přitom je přednostní snížit symptomy onemocnění přednostně o alespoň 10 % nebo alespoň 20 %, zvláště přednostně o alespoň 40 % nebo 60 % , zejména o alespoň 70 % nebo 80 % a nejvíce přednostně o 90 % až 95 %.

„Výběrem“ se ve vztahu k rostlinám, u nichž - na rozdíl nebo ve srovnání s výchozí rostlinou - existuje nebo se zvýší rezistence proti alespoň jednomu patogenu, • 4

4

4 · 4

44444

44 4 4 míní všechny způsoby, které jsou vhodné ke zjištění propůjčené nebo zvýšené patogenní rezistence. Mohou to být symptomy patogenní infekce (například vznik haustoria u houbovité infekce), ale také shora popsané symptomy, které se týkají kvality rostlin, kvality sklizně, vhodnosti použití jako krmivo nebo potravina a podobně.

„Patogenem“ se v rámci vynálezu míní například viry nebo viroidy, bakterie, houby zvířecí škůdci, jako například hmyz nebo nematody. Zvláště přednostně se jedná o houby. Domníváme se však, že zmenšení exprese RacB proteinu, jeho aktivity nebo funkce způsobuje rezistenci proti dalším patogenům. Změny ve struktuře buněčné stěny mohou představovat základní mechanismus patogenní rezistence.

Například se uvádí následující patogeny:

1. Houbovité patogeny nebo houbám podobné patogeny:

Houbovité patogeny nebo houbám podobné patogeny (jako například Chromista) pocházejí přednostně ze skupiny zahrnující plasmodiophoramycotu, oomycotu, ascomycotu, chytridiomyceten, zugomyceten, basidiomycotu a deuteromyceten (Fungi imperfecti). V tabulkách 1 a 2 jsou příkladně uvedeny patogeny a s nimi související onemocnění.

Tabulka 1: Houbovitá onemocnění rostlin

Onemocnění	Patogen
Hnědavé reznutí	Puccinia recondita
Žlutavé reznutí	P. striiformis
Pravá prášková plíseň	Erysiphe graminis/Blumeria graminis
Hnědá skrvna	Septoria nodorum
Uschlý list	Septoria tritici
Fuzariová hniloba klasu	Fusarium spp.
Zlomení stébla	Pseudocercosporella herpotrichoides
Sněť	Ustilago spp.
Pšeničná sněť	Tilletia caries
Černé kostnatění	Gaeumannomyces graminis

4« 44 • 4 4

4 4

4 4 4

4 4*44

4 4

4

Anthrocnose leaf blight Anthracnose stalk rot	Colletotrichum graminicola (teleomorph: Glomerella graminicola Politis); Glomerella tucumanensis (anamorph: Glomerella falcatum Went)
Aspergillus ear and kemel rot	Aspergillus flavus
Banded leaf and s heath spot odumírání kořenů	Rhizoctonia solani Kuhn = Rhizoctonia microsclerotia J. Matz (telomorph: Thanatephorus cucumeris)
Black bundle disease	Acremonium strictum W. Gams = Cephalosporium acremonium Auct. Non Corda
Black kemel rot	Lasiodiplodia theobromae = Botryodiplodia theobromae
Borde blanco	Marasmiellus sp.
Brown spot (black spot, stalk rot)	Physoderma maydis
Cephalosporium kernel rot	Acremonium strictum - Cephalosporium acremonium
Charcoal rot	Macrophomina phaseolina
Corticium ear rot	Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii
Curvularia leaf spot	Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorph: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorph: Cochliobolus intermedius), Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus), Curvularia pallescens (teleomorph: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorph: Cochliobolus tuberculatus)
Didymella leaf spot	Didymella exitalis
Diplodia ear rot and stalk rot	Diplodia frumenti (teleomorph: Botryosphaeria festucae)
Diplodia ear rot, stalk rot, seed rot and seedling blight	Diplodia maydis = Stenocarpella maydis
Diplodia leaf spot or streak	Stenocarpella macrospora = Diplodialeaf macrospora

Tabulka 2: Nepravá prášková plíseň

Onemocnění	Patogen
Brown stripe downy mildew	Sclerophthora rayssiae var. Zeae

·· ····

0· · • · * · • · · · · • ♦ · · >··· • · ♦ · • ** ·

Crazy top downy mildew	Sclerophthora macrospora = Sclerospora macrospora
Green ear downy mildew (graminicola downy mildew)	Sclerospora graminicola
Java downy mildew	Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis
Philippine downy mildew	Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis
Sorghum downy mildew	Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi
Spontaneum downy mildew	Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea
Sugarcane downy mildew	Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari
Dry ear rot (cob, kemel and stalk rot)	Nigrospora oryzae (teleomorph: Khuskia oryzae)
Ear rots, minor	Alternaria alternata = A. tenuis, Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Botrytis cinerea (teleomorph: Botryotinia fuckeliana), Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus Tiegh., R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii
Ergot(horse’s tooth)	Claviceps gigantea (anamorph: Sphacelia sp.)
Eyespot	Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae
Fusarium ear and stalk rot	Fusarium subglutinans = F. moniliforme var. subglutinans
Fusarium kemel, root and stalk rot, seed rot and seedling blight	Fusarium moniliforme (teleomorph: Gibberella fujikuroi)
Fusarium stalk rot, seedling root rot	Fusarium avenaceum (teleomorph: Gibberlla avenacea)
Gibberella ear and stalk rot	Gibberella zeae (anamorph: Fusarium graminearum)
Gray ear rot	Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae (anamorph: Macrophoma zeae)

Gray leaf spot (Cercospora leaf spot)	Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeaemaydis
Helminthosporium root rot	Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum (teleomorph: Setosphaeria pedicellata)
Hormodendrum ear rot (Cladosporium rot)	Cladosporium cladosporioides = Hormodendrum cladosporioides, C. herbářům (teleomorph: Mycosphaerella tassiana)
Hyalothyridium leaf spot	Hyalothyridium maydis
Latě wilt	Cephalosporium maydis
Leaf spots, minor	Alternaria altemata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae (teleomorph: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorph: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrům, Exserohilum prolatum = Drechslera prolata (teleomorph: Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, (anamorph: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. Zeina
Northern corn leaf blight (white blast, crown stalk rot, stripe)	Setosphaeria turcica (anarnorph: Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum)
Northern corn leaf spot Helminthosporium ear rot (race 1)	Cochliobolus carbonum (anamorph: Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum)
Penicillium ear rot (blue eye, blue mold)	Penicillium spp., P. chrysogenum, P. expansum, P. Oxalicum
Phaeocytostroma stalk rot and root rot	Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocytosporella zeae
Phaeosphaeria leaf spot	Phaeosphaeria maydis = Sphaerulina maydis
Physalospora ear rot (Botryosphaeria ear rot)	Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola (anamorph: Diplodia ffumenti)
Purple leaf sheath	Hemiparasitic bacteria and fungi
Pyrenochaeta stalk rot and root rot	Phoma terrestris = Pyrenochaeta terrestris
Pythium root rot	Pythium spp., P. arrhenomanes, P. Graminicola

Pythium stalk rot	Pythium aphanidermatum = P. butleri L.
Red kemel disease (ear mold, leaf and seed rot)	Epicoccum nigrům
Rhizoctonia ear rot (sclerotial rot)	Rhizoctonia zeae (teleomorph: Waitea circinata)
Rhizoctonia root rot and stalk rot	Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae
Root rots, minor	Altemaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorph: Gibberella acuminata), F. equiseti (teleomorph: G. intrieans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, G. cyanogena, (anamorph: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus
Rostratum leaf spot (Helminthosporium leaf disease, ear and stalk rot)	Setosphaeria rostrata, (anamorph: Exserohilum rostratum = He/minthosporium rostratum)
Růst, common com	Puccinia sorghi
Růst, Southern com	Puccinia polysora
Růst, tropical com	Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae
Sclerotium ear rot (southem blight)	Sclerotium rolfsii Sace. (teleomorph: Athelia rolfsii)
Seed rot-seedling blight	Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorph: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp.
Selenophoma leaf spot	Selenophoma sp.
Sheath rot	Gaeumannomyces graminis
Shuck rot	Myrothecium gramineum
Silage mold	Monascus purpureus, M ruber
Smut, common	Ustilago zeae = U. Maydis
Smut, falše	Ustilaginoidea virens
Smut, head	Sphacelotheca reiliana - Sporisorium holcisorghi
Southem com leaf blight and	Cochliobolus heterostrophus (anamorph: Bipolaris

• ·· ······ ··· ···· · · · ··· • · · ·· · · · · · • · ··· · · · · · · · · · ····· ·· ·· ·· ·

stalk rot	maydis = Helminthosporium maydis)
Southern leaf spot	Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora
Stalk rots, minor	Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysporum Schlechtend, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorph: Nectria haematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria sp.
Storage rots	Aspergillus spp., Penicillium spp. and other fungi
Tar spot	Phyllachora maydis
Trichoderma ear rot and root rot	Trichoderma viride = T. lignorum teleomorph: Hypocrea sp.
White ear rot, root and stalk rot	Stenocarpella maydis = Diplodia zeae
Yellow leaf blight	Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorph: Mycosphaerella zeae-maydis)
Zonate leaf spot	Gloeocercospora sorghi

Zvláště přednostní jsou:

Plasmodiophoromycota jako Plasmodiophora brassicae (clubroot of crucifers), Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers), Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses),

Oomycota jako Bremia lactucae (nepravá prášková plíseň na salátu), Peronospora (prášková plíseň) u snapdragonu (P. antirrhini), cibule (P. destructor), špenát (P. effiisa), sojové boby (P. manchurica), tabák (“blue mold”; P. tabacina) vojtěška a jetel (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (downy mildew of hops), Plasmopara (nepravá prášková plíseň na hroznu) (P. viticola) a slunečnice (P. halstedii), Sclerophtohra macrospora (prášková plíseň na celeru a trávě), Pythium (seed rot, seedling damping-off, and root rot and all types of plants, například sněť na hlíze řepy vlivem P. debaryanum), Phytophthora infestans (sněť na bramborách, hnědnutí rajčat a podobně), Albugo spec. (white růst on cruciferous plants).

Ascomycota jako Microdochium nivale (sněhová plíseň žitě a pšenici), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (sněť na klasu u pšenice), Fusarium oxysporum (fuzariové vadnutí na rajčeti), Blumeria graminis (nepravá prášková plíseň na

• · · · · • · · · • 9 9 9 9

999 99999 ječmeni (f.sp. hordei) a pšenici (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (hrachová prášková plíseň), Nectria galligena (rakovina ovocného stromu), Unicnula necator (pravá prášková plíseň na vinné révě), Pseudopeziza tracheiphila (červené výpaly na vinné révě), Claviceps purpurea (námel například na žitě a ječmeni), Gaeumannomyces graminis (černé kostnatění pšenici, žitě a mezi jiným trávě), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Pyrenophora graminea (proužkovitost ječmene), Pyrenophora teres (síťovitá skvrnitost ječmene), Pyrenophora tritici-repentis (uschlé listy na pšenici), Venturia inaequalis (jablečná strupovitost), Sclerotinia sclerotium (bílá lodyha, řepková rakovina), Pseudopeziza medicaginis (listová bradavičnatost na vojtěžce, bílý a červený klas).

Basidiomycetes such as Typhula incarnata (typhulová sněť na ječmeni, žitě a pšenici), Ustilago maydis (puchýřovitá skvrna na kukuřici), Ustilago nuda (řídká skrvna na ječmeni), Ustilago tritici (řídká skvrna na pšenici), Ustilago avenae (řídká skvrna na ovsu), Rhizoctonia solani (odumíraní kořenů na bramborách), Sphacelotheca spp. (head smut of sorghum), Melampsora líni (růst of flax), Puccinia graminis (černá rez na pšenici, ječmeni, žitu a ovsu), Puccinia recondita (hnědá rez na pšenici), Puccinia dispersa (hnědá rez na žitě), Puccinia hordei (hnědá rez na ječmeni), Puccinia coronata (korfunová rez na ovsu), Puccinia striiformis (žlutá rez na pšenici, ječmeni, žitu a jakož mnoha travách), Uromyces appendiculatus (fazolová rez), Sclerotium rolfsii (root and stem rots of many plants).

Deuteromycetes (Fungi imperfecti) such as Septoria nodorum (hnědá skrvna) na pšenici (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (zlomení stébla na pšenici, ječmeni, žitě), Rynchosporium secalis (skvrnitost na žitě a ječmeni), Altemaria solani (vyschlé fleky na bramborách, rajčatech), Phoma betae (kořenová sněť na beta cukrovce), Cercospora beticola (listová skvrnitost na beta cukrovce), Alternaria brassicae (řepková čematost na řepce, kapustě a podobně, křížovitost květů), Verticillium dahliae (řepkové vadnutí a hniloba), Colletotrichum lindemuthianum (beán anthracnose), Phoma lingam (pálivé skvrny na fazoli), Botrytis cinerea (šedá plíseň grey na vině révě, jahodách, rajčatech, ovsu a

podobně).

Nejvíce přednostní jsou Phytophthora infestans (plíseň na zelí a hlíze, hnědá plíseň u rajčat a podobně), Microdochium nivale (dříve Fusarium nivale; sněhová plíseň na žitě a pšenici), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (hniloba klasu u pšenice), Fusarium oxysporum (íuzariové vadnutí rajčat), Blumeria graminis (pravá prášková plíseň na ječmeni (f. sp. hordei) a pšenici (f. sp. tritici)), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Sclerotinia sclerotium (lámání lodyhy, řepková rakovina), Septoria nodorum and Septoria tritici (hnědé plevy u přenice), Alternaria brassicae (řepková čerň na řepce, kapustě a podobně, křížovitost květů), Phoma lingam (černé kostnatění na kapustě, hliloba kořene a lodyhy na řepce).

2. Bakteriální patogeny:

Příkladně, avšak nikoliv omezující cm způsobem, jsou patogeny a s souvislosti s nimi vznikající onemocnění uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3: Bakteriální onemocnění

Onemocnění	Patogen
Bacterial leaf blight and stalk rot	Pseudomonas avenae subsp. Avenae
Bacterial leaf spot	Xanthomonas campestris pv. holcicola
Bacterial stalk rot	Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens
Bacterial stalk and top rot	Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv. Zeae
Bacterial stripe	Pseudomonas andropogonis
Chocolate spot	Pseudomonas syringae pv. coronafaciens
Goss’s bacterial wilt and blight (leaf freckles and wilt)	Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = Corynebacterium michiganense

• ·· ······ · · · • · · · ·· · · · * • · · · · · · · · · ·· ··· · · · · · · · · · • · · · · · · · · · ····· ·· · · · · ·

	pv. andnebraskense
Holcus spot	Pseudomonas syringae pv. Syringae
Purple leaf sheath	Hemiparasitic bacteria
Seed rot-seedling blight	Bacillus subtilis
Stewart’s disease (bacterial wilt)	Pantoea stewartii = Erwinia stewartii
Com stunt (achapparramiento, maize stunt, Mesa Central or Rio Grande maize stunt)	Spiroplasma kunkelii

Zvláště přednostní jsou následující patogenní bakterie: Corynebacterium sepedonicum (bacteriální prstencová plíseň na bramborech), Erwinia carotovora (černé kostnatění na bramborech), Erwinia amylovora (pálivá sně't na hrušce, jablku, kdouli), Streptomyces scabies (bramborová prašivina), Pseudomonas syringae pv. tabaci (blízkavost na tabáku), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (grease spot of dwarf beán), Pseudomonas syringae pv. tomato (“bacterial speck” na rajčatech), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (skvrnitost listů na bavlně) and Xanthomonas campestris pv. oryzae (bacterialní sněť na rýži a jiných travách).

3. Viralní patogeny:

“Viralní patogeny” zahrnují veškeré rostlinné viry, jako například tabákové viry nebo cucumber mosaic viry, ringspot-viry, nekrozní virus, kukuřičné dwarf mosaic viry a podobně.

Příkladně, avšak nikoliv omezujícím způsobem, jsou patogeny a v souvislosti s nimi vznikající onemocnění uvedeny v tabulce 4.

• ·* ······ ·· · • · · · · · · ··· • · · · · · · · · · • · · · · · · * · ····· ··· · · · · · · · • · · · · ·· ·· ·· «

Tabulka 4: Viralní onemocnění

Onemocnění	Patogen
American wheat striate (wheat striate mosaic)	American wheat striate mosaic virus (AWSMV)
Barley stripe mosaic	Barley stripe mosaic virus (BSMV)
Barley yellow dwarf	Barley yellow dwarf virus (BYDV)
Brome mosaic	Brome mosaic virus (BMV)
Cereal chlorotic mottle	Cereal chlorotic mottle virus (CCMV)
Corn chlorotic vein banding (Brazilian maize mosaic)	Corn chlorotic vein banding virus (CCVBV)
Corn lethal necrosis	Virus complex of Maize chlorotic mottle virus (MCMV) and Maize dwarf mosaic virus (MDMV) A or B or Wheat streak mosaic virus(WSMV)
Cucumber mosaic	Cucumber mosaic virus (CMV)
Cynodon chlorotic streak	Cynodon chlorotic streak virus (CCSV)
Johnsongrass mosaic	Johnsongrass mosaic virus (JGMV)
Maize bushy stunt	Mycoplasma-like organism (MLO) associated
Maize chlorotic dwarf	Maize chlorotic dwarf virus (MCDV)
Maize chlorotic mottle	Maize chlorotic mottle virus (MCMV)
Maize dwarf mosaic	Maize dwarf mosaic virus (MDMV) strains A, D, E andF
Maize leaf fleck	Maize leaf fleck virus (MLFV)
Maize line	Maize line virus (MLV)
Maize mosaic (corn leaf stripe, enanismo rayado)	Maize mosaic virus (MMV)
Maize mottle and chlorotic stunt	Maize mottle and chlorotic stunt virus

• ·· ·· · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · ··· · · ·· · ·

Maize pellucid ringspot	Maize pellucid ringspot virus (MPRV)
Maize raya gruesa	Maize raya gruesa virus (MRGV)
Maize rayado fino (fine striping disease)	Maize rayado fino virus (MRFV)
Maize red leaf and red stripe	Mollicute
Maize red stripe	Maize red stripe virus (MRSV)
Maize ring mottle	Maize ring mottle virus (MRMV)
Maize rio IV	Maize rio cuarto virus (MRCV)
Maize rough dwarf (nanismo ruvido)	Maize rough dwarf virus (MRDV) (Cereal tillering disease virus)
Maize sterile stunt	Maize sterile stunt virus (strains ofbarley yellow striate virus)
Maize streak	Maize streak virus (MSV)
Maize stripe (maize chlorotic stripe, maize hoj a blanca)	Maize stripe virus
Maize stunting	Maize stunting virus
Maize tassel abortion	Maize tassel abortion virus (MTAV)
Maize vein enation	Maize vein enation virus (MVEV)
Maize wallaby ear	Maize wallaby ear virus (MWEV)
Maize white leaf	Maize white leaf virus
Maize white line mosaic	Maize white line mosaic virus (MWLMV)
Millet red leaf	Millet red leaf virus (MRLV)
Northern cereal mosaic	Northern cereal mosaic virus (NCMV)
Oat pseudorosette (zakuklivanie)	Oat pseudorosette virus
Oat sterile dwarf	Oat sterile dwarf virus (OSDV)
Rice black-streaked dwarf	Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV)

Rice stripe	Rice stripe virus (RSV)
Sorghum mosaic	Sorghum mosaic virus (SrMV) (auch: sugarcane mosaic virus (SCMV) Stámme Η, I and M)
Sugarcane Fiji disease	Sugarcane Fiji disease virus (FDV)
Sugarcane mosaic	Sugarcane mosaic virus (SCMV) strains A, B, D, E, SC, BC, Sabi and MB (formerly MDMV-B)
Wheat spot mosaic	Wheat spot mosaic virus (WSMV)

4. Zvířecí škůdci

4.1 Hmyzí patogeny:

Příkladně, avšak nikoliv omezujícím způsobem, je uveden hmyz, jako například brouci, housenky, mšice nebo roztoči. Přednost ní je hmyz rodu Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, a tak dále. Zvláště přednostní je hmyz coleopteran and lepidopteran, jako například kukuřičný zavíječ (European com borer (ECB)), Diabrotica barberi (northem com rootworm), Diabrotica undecimpunctata (southem com rootworm), Diabrotica virgifera (Western com rootworm), Agrotis ip silon (black cutworm), Crymodes devastator (glassy cutworm), Feltia ducens (dingy cutworm), Agrotis gladiaria (claybacked cutworm), Melanotus spp., Aeolus mellillus (wireworm), Aeolus mancus (wheat wireworm), Horistonotus uhlerii (sand wireworm), Sphenophorus maidis (maize billbug), Sphenophorus zeae (timothy billbug), Sphenophorus parvulus (bluegrass billbug), Sphenophorus callosus (southem com billbug), Phyllogphaga spp.(white grubs), Anuraphis maidiradicis (corn root aphid), Delia platura (seedcom maggot), Colaspis brunnea (grape colaspis), Stenolophus lecontei (seedcorn beetle) and Clivinia impressifrons (lender seedcom beetle).

Rovněž se uvádí: Oulema melanopus, Oscinella frit, drátovec (Agrotis lineatus) a mšice (jako například mšice ovesná Rhopalosiphum padi, velká obilná mšice Sitobion

avenae).

4.2 Nematody:

Příkladně, avšak nikoliv omezujícím způsobem, jsou v tabulce 6 uvedeny patogeny a s nimi spojená onemocnění.

Table 6: Parazitní nematody

Poškození	Patogení nematod
Awl	Dolichodorus spp., D. heterocephalus
Bulb and stem nematode disease; Europe	Ditylenchus dipsaci
Burrowing	Radopholus similis
Cyst nematode disease	Heterodera avenae, H. zeae, Punctodera chalcoensis
Dagger	Xiphinema spp., X. americanum, X. mediterraneum
Falše root-knot	Nacobbus dorsalis
Laňce, Columbia	Hoplolaimus columbus
Laňce	Hoplolaimus spp., H. galeatus
Lesion	Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. crenatus, P. hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thomei, P. zeae
Needle	Longidorus spp., L. breviannulatus
Ring	Criconemella spp., C. omata
Root-knot disease	Meloidogyne spp., M. chitwoodi, M. incognita, M. javanica

·· ····

• · · · • · * · · • · · « · · · « • * ♦ · • ·· ·

Spirál	Helicotylenchus spp.
Sting	Belonolaimus spp., B. longieaudatus
Stubby-root	Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp.
Stunt	Tylenchorhynchus dubius

Zvláště přednostní jsou Globodera rostochiensis a G. pallida (na bramborách, rajčatech a jiných potato, tomato a jiných rostlinách), Heterodera schachtii (na řepě cukrovce a krmné řepě, řepce, kapustě a podobně), Heterodera avenae (na ovsi a podbných druzích obilí), Ditylenchus dipsaci (na žitě, ovsu, kukuřici, jetelů, tabáku a řepě), Anguina tritici (koukol na pšenici (žitě), Meloidogyne hapla (na karotce, okurkách, salátu, rajčatech, bramborách, cukrové řepě, vojtěšce).

Jako pro jednotlivé druhy rostlin přednostní houbovité nebo virové patogeny se příkladně uvádí;

1. Ječmen:

Houbovité, bakteriální a viroví patogeny: Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem růst), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei (barley powdery mildew), barley yellow dwarf virus (BYDV),

Patogenní hmyz/nematody: Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Schizaphis graminum (greenbug); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Acrostemum hilare (green stink bug); Euschistus servus (brown stink bug); Deliaplatura (seedcom maggot); Mayetiola destructor (Hessian fly); Petrobia latens (brown wheat mite).

Sója

• · · ·· *«·· • · • · · • ···· • ·

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, soybean mosaic virus, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus, Heterodera glycines Fusarium solani.

Patogenní hmyz/nematody: Pseudoplusia includens (soybean looper); Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar); Plathypena scabra (green cloverworm); Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Spodoptera exigua (beet armyworm); Heliothis virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Epilachna varivestis (Mexičan beán beetle); Myzus persicae (green peach aphid); Empoasca fabae (potato leaf hopper); Acrostemum hilare (green stink bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Hylemya platura (seedcom maggot); Sericothrips variabilis (soybean thrips); Thrips tabaci (onion thrips); Tetranychus turkestani (strawberry spider mite); Tetranychus urticae (two-spotted spider mite).

3. Canola:

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum.

Alternaria alternata.

· 4 ····· ··· • 4 4 4 ·· 4 4 4 4

4 4 · · 4 4 4 4 4 •4 4>4 4 444 44444 • 44 4444 44 4

4444· 44 44 44 4

4. Vojtěška:

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.

5. Pšenice:

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley YellowDwarf Virus, Brome Mosaic Virus, soil bome wheat mosaic virus, wheat streak mosaic virus, wheat spindle streak virus, American wheat striate virus, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, high plains virus, European wheat striate virus, Puccinia graminis f.sp. tritici (wheat stem růst), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (wheat powdery mildew).

Pathgenní hmyz/nematody: Pseudaletia unipunctata (armyworm);

Spodoptera,frugiperda (fall armyworm); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer); Agrotis orthogonia (western cutworm); Elasmopalpus Zignosellus (lesser cornstalk borer); Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Hypera punctata (clover

• · · · » · • · ·

9 9

9 9 9 • · · · ·« · · ·

• · ·

9 9 9 • · 9999 • 99

9 leaf weevil); Diabrotica undecimpunctata howardi (southem com rootworm); Russian wheat aphid; Schizaphis graminum (greenbug); Macrosiphum avenae (English grain aphid); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential grasshopper); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper); Mayetiola destructor (Hessian fly); Sitodiplosis mosellana (wheat midge); Meromyza americana (wheat stem maggot); Hylemya coarctata (wheat bulb fly); Frankliniella fusca (tobacco thrips); Cephus cinctus (wheat stem sawfly); Aceria tulipae (wheat curi mite).

6. Slunečnice:

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, aster yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Altemaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Patogenní hmyz/nematody: Suleima helianthana (sunflower bud moth); Homoeosoma electellum (sunflower moth); zygogramma exclamationis (sunflower beetle); Bothyrus gibbosus (carrot beetle); Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge).

7. Kukuřice:

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), • to toto toto·· toto · · ·· · • · · toto · • to · · · · · • to · · · · · • toto toto to* ·«

Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, maize dwarf mosaic virus A & B, wheat streak mosaic virus, maize chlorotic dwarf virus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, comstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, maize chlorotic mottle virus, high plains virus, maize mosaic virus, maize rayado fino virus, maize streak virus (MSV), maize stripe virus, maize rough dwarf virus.

Patogenní hmyz/nematody: Ostrinia nubilalis (European com borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Helicoverpa zea (corn earworm); Spodoptera fřugiperda (fall armyworm); Diatraea grandiosella (Southwestem com borer); Elasmopalpus lignosellus (lesser comstalk borer); Diatraea saccharalis (surgarcane borer); Diabrotica virgifera (Western com rootworm); Diabrotica longicomis barberi (Northern com rootworm); Diabrotica undecimpunctata howardi (Southern com rootworm); Melanotus spp. (wireworms); Cyclocephala borealis (Northern masked chafer; white grub); Cyclocephala immaculata (Southern masked chafer; white grub); Popillia japonica (Japanese beetle); Chaetocnema pulicaria (com flea beetle); Sphenophorus maidis (maize billbug); Rhopalosiphum maidis (com leaf aphid); Anuraphis maidiradicis (com root aphid); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Melanoplus femur-rubrum (red-legged grasshopper); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper); Hylemva platura (seedcom maggot); Agromyza parvicomis (com blot leafminer); Anaphothrips obscrurus (grass thrips); Solenopsis milesta (thief ant); Tetranychus urticae (two-spotted spider mite).

8. Čirok:

Φ ΦΦ • βτ

Φ Φ • Φ Φ • Φ • · ** φφφφ • Φ Φ • · Φ • Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ

Φ • ·

Φ Φ ·

Φ ΦΦΦΦ Φ Φ α

Houbovité, bakteriální a virové patogeny: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Altemaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, sugarcane mosaic H, maize dwarf mosaic virus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.

Patogenní hmyz/nematody: Chilo partellus (sorghum borer); Spodoptera fřugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (com ear-worm); Elasmopalpus lignosellus (lesser cornstalk borer); Feltia subterranea (granuláte cutworm); Phvllophaga crinita (white grub); Eleodes, Conoderus and Aeolus spp. (wireworm); Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Chaetocnema pulicaria (com flea beetle); Sphenophorus maidis (maize billbug); Rhopalosiphum maidis (com leaf aphid); Siphaflava (yellow sugarcane aphid); Blissus leucopterus leucopterus (ehinch bug); Contarinia sorghicola (sorghum midge); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus urticae (two-spotted spider mite).

9. Bavlna:

Patogenní hmyz/nematody: Heliothis virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Spodoptera exigua (beet armyworm); Pectinophora gossypiella (pink bollworm); Anthonomus grandis grandis (bolí weevil); Aphis gossypii (cotton aphid); Pseudatomoscelis seriatus (cotton fleahopper); Trialeurodes abutilonea (banded-winged whitefly); Lygus lineolaris (tamished plant bug); Melanoplus femurrubrum (red-legged grasshopper); Melanoplus dififerentialis (differential grasshopper); Thrips tabaci (onion thrips); Franklinkiella fusca (tobacco thrips); Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus urticae (two-spotted spider mite).

10. Rýže:

Patogenní hmyz/nematody: Diatraea saccharalis (sugarcane borer); Spodoptera ířugiperda (fall armyworm); Helicoverpa zea (corn earworm); Colaspis brunnea (grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil); Nephotettix nigropictus (rice leafhopper); Blissus Ieucopterus leucopterus (chinch bug); Acrostemum hilare (green stink bug).

11. Řepka:

Patogenní hmyz/nematody: Brevicoryne brassicae (cabbage aphid); Phyilotreta cruciferae (flea beetle); Mamestra conjgurata (bertha armyworm); Plutella xylostella (diamond-back moth); Delia ssp. (root maggots).

„RacB proteinem“ se v rámci vynálezu míní RacB-protein z ječmene podle SEQ ID NO: 2, jakož i jeho homology z rýže (Oryza sative) podle SEQ ID NO: 4 a kukuřice (Zea mays) podle SEQ ID NO: 6, jakož také funkční ekvivalenty vpředu uvedeného.

„Množstvím proteinu“ se míní množství RacB polypetidu v organismu, tkáni, buňce nebo buněčné části. „Snížením“ množství proteinu se míní snížení množství RacB proteinu v organismu, tkáni, buňce nebo buněčné části - například jedním z dále popsaných způsobů _ ve srovnání s týmž zralým druhem, na kterém nebyl použit tento způsob, za jinak shodných rámcových podmínek (jako například stáří rostliny a podobně). Snížení činí přitom alespoň 10 %, přednostně alespoň 10 % nebo alespoň 20 %, zejména přednostně o alespoň 40 % nebo 60 %, zvláště přednostně o alespoň 70 % nebo 80 %, nejlépe zejména o alespoň 90 % nebo 95 %.

„Aktivitou“ se míní přednostně GTP aktivita RacB polypeptidu v organismu, tkáni, buňce nebo buněčné části. „Snížením“ aktivity se míní snížení celkové aktivity RacB proteinu v organismu, tkáni, buňce, nebo buněčné části - například pomocí jednoho z dole popsaných způsobů - ve srovnání se zralým druhem rostliny, na níž nebyl tento způsob použit, za jinak shodných rámcových podmínek (jako například stáří rostliny a podobně). Snížení činí přitom alespoň 10 %, přednostně alespoň 10 % nebo alespoň 20 %, zejména přednostně o alespoň 40 % nebo 60 %, zvláště přednostně o alespoň 70 % nebo 80 %, nejlépe zejména o alespoň 90 % nebo 95 %.

„Funkcí“ se přednostně míní vazební kapacita RacB polypeptidu na substrát v organismu, tkáni, buňce, nebo buněčné části. Jako substráty přichází do úvahy nízkomolekulární sloučeniny jako GTP, ale také interaktivní partner RacB proteinu. „Snížením“ funkce se míní například zmenšení vazební kapacity nebo intenzity vazby RacB proteinu k alespoň jednomu substrátu v organismu, tkáni, buňce, nebo buněčné části - například pomocí jednoho z dole popsaných způsobů - ve srovnání se zralým druhem rostliny, na níž nebyl tento způsob použit, za jinak shodných rámcových podmínek (jako například stáří rostliny a podobně). Pod snížením se rozumí také změna specifiky substrátu, která se může projevit například pomocí hodnoty kcat/Km. Snížení činí přitom alespoň 10 %, přednostně alespoň 10 % nebo alespoň 20 %, zejména přednostně o alespoň 40 % nebo 60 %, zvláště přednostně o alespoň 70 % nebo 80 %, nejlépe zejména o alespoň 90 % nebo 95 %. Vazební partner se identifikuje například pomocí kvasnicového hybridního systému pro odborníka běžným způsobem.

Způsoby pro stanovení množství proteinu, aktivity GTP nebo vazební kapacity na substrát jsou odborníkovi známé a pro GTP, jakož také pro Rac proteiny z různých druhů rostlin jsou mnohokrát popsány (mezi jiným Benard V a kolektiv (1999) J Biol Chem 274(19): 13198-204, Burstein ES (1998) Oncogene 17 (12): 1617-23).

„Funkčním ekvivalentem“ RacB proteinu se přednostně míní takové sekvence, které jsou odvozeny od RacB proteinu popsaného pomocí SEQ ID NO: 2, 4 nebo 6, nebo jsou s ním homologované a mají v podstatě shodné vlastnosti.

„V podstatě shodnými vlastnostmi“ funkčního ekvivalentu se myslí především propůjčení fenoménu patogenní rezistence, nebo propůjčení nebo nárůst patogenní rezistence proti alespoň jednomu patogenu při snížení množství proteinu, aktivity nebo funkce uvedeného RacB ekvivalentu v rostlině, případně v tkáni, části nebo jejich buňkách. Jako podstatná vlastnost se rovněž rozumí absence spontánně indukovaného úmrtí buňky při uvedeném snížení množství proteinu, aktivity nebo funkce funkčního ekvivalentu.

Efektivita patogenní rezistence se přitom může ve srovnání s hodnotou získanou při minimalizaci RacB protenů podle SEQ ID NO: 2, 4 nebo 6 odchylovat jak dolu tak také nahoru. Přednostní jsou takové funkční ekvivalenty, u nichž se efektivita patogenní rezistence - měřená například na efektivitě penetrace patogenu (vznik haustormia) - liší o ne více jak 50 %, přednostně 25 %, zvláště přednostně 10 % od srovnávací hodnoty za snížení RacB proteinu podle NO: 2, 4, nebo 6. Zvláště přednostní jsou takové sekvence, u nichž snížení efektivity patogenní rezistence kvantitativně překračuje srovnávací hodnotu, získanou při snížení jednoho RacB proteinu podle SEQ ID NO: 2, 4 nebo 6, o ne více jak 50 %, přednostně 100 %, zvláště přednostně 500 %, zejména 1000 %.

Srovnání se přednostně provádí za analogických podmínek. „Analogické podmínky“ vyjadřují, že všechny rámcové podmínky, jako například pěstební podmínky, zkušební podmínky (jako pufr, teplota, substráty, patogenní koncentrace) jsou mezi srovnatelnými pokusy udržovány identické a vsázky se liší pouze sekvencí srovnávaných RacB polypeptidů, organismem svého původu a případně patogenem. Při volbě patogenu pro srovnání je volen patogen, který je nejbližší.

„Funkčními ekvivalenty“ se míní zejména přírodní nebo umělé mutanty RacB polypeptidů podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6, jakož i homologické polypeptidy z jiných rostlin, které dále mají v podstatě stejné vlastnosti. Přednostně jsou homologické polypeptidy ze shora popsaných přednostních rostlin. Sekvence z jiných rostlin (například Arabidopsis thaliana) homologické k RacB sekvencím zveřejněným v rámci vynálezu se mohou snadno vyhledat například průzkumem genové banky za použití RacB sekvence.

Mutace zahrnují substituce, adice, deletace, inverze nebo inserce jednoho nebo více radikálů aminokyseliny. Tím se pomocí vynálezu například obdrží také takové polypeptidy, které se získají modifikací polypeptidu podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6.

Pod homologií mezi dvěma sekvencemi kyseliny nukleové se rozumí identita sekvence kyseliny nukleové po celé délce sekvence, která se vypočítá porovnáním s pomocí programového algoritmu GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA, Altschul a kolektiv (1997) Nucletic Acids Res. 25: 3389 a následující) při nastavení následujících parametrů:

Gap Weight: 50 Length Weight: 3

Average Match: 10 Average Mismatch: 0

Například pod sekvencí, která má homologii alespoň 80 % na základě kyseliny nukleové se sekvencí SEQ ID NO: 1, se rozumí sekvence, která ve srovnání se sekvencí SEQ ID NO:1 má podle shora uvedeného programového algoritmu se shora uvedenou sadou parametrů homologii alespoň 80 %.

Pod homologií mezi dvěma polypeptidy se rozumí identita sekvence aminokyseliny po celé délce sekvence, která se vypočítá porovnáním s pomocí programového algoritmu GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) při nastavení následujících parametrů:

Gap Weight: 8 Length Weight: 2

Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2,003

Například pod sekvencí, která má homologii alespoň 80 % na proteinové bázi se sekvencí SEQ ID NO: 2, se rozumí sekvence, která ve srovnání se sekvencí SEQ ID NO: 2 má podle shora uvedeného programového algoritmu se shora uvedenou sadou parametrů homologii alespoň 80 %.

• ·· ······ ··· ···· » · · · · · • « · ·· · ···· ·· « · · · ··· ····· • · · · · · · · · ··

Funkční ekvivalenty odvozené od polypeptidu podle vynálezu podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6 pomocí substituce, inserce nebo deletace mají homologii alespoň 60 %, zejména alespoň 80 %, přednostně alespoň 90 %, zvláště přednostně alespoň 95 % a výhodně alespoň 98 % k polypeptidu podle vynálezu podle SQE ED NO: 2, 4, nebo 6 a vyznačují se v podstatě stejnými vlastnostmi jako polypeptid podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6.

Funkční ekvivalenty odvozené od sekvence kyseliny nukleové podle vynálezu podle SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5 pomocí substituce, inserce nebo deletace mají homologii alespoň 60 %, zejména alespoň 80 %, přednostně alespoň 90 %, zvláště přednostně alespoň 95 % a výhodně alespoň 98 % k polypeptidu podle vynálezu podle SQE ID NO: 1, 3, nebo 5 a kódují pro polypeptidy s v podstatě stejnými vlastnostmi jako polypeptidy podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6.

Přednostně mají jako funkční ekvivalenty obsažené racB proteiny alespoň jeden z následujících sekvenčních motivů:

a) G1 prvek GXXXGKS/T přednostně v dusíkem terminované oblasti. Zvláště přednostně prvek se sekvencí GDGAVGKT, zpravidla přednostně prvek se sekvencí

KCVTVGDGAVGKTC.

b) G2 část obsahující sekvenční motiv sPTVFDN, zvláště přednostně

NTFPTDYVPTVFDNFSANVV.

c) G3 prvek obsahující LWDTAGQ, zvláště přednostně NLGLWDTAGQEDYN.

d) G4 prvek TKXD, zvláště přednostně TKLD, zejména LVGTKLDLRDDKQ.

e) G5 prvek EXS, přednostně ECSS, zvláště přednostně ECSSKTG.

• · ·· ···· ·· · • · · · · · · · • · · · · · · · · • ··· · ··· ···· ·«· ·* ·· ·· ··

f) C terminálový motiv isoprenylace (CXXX, Hassanain HH a kolektiv (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272 (3): 783-8), zvláště přednostně CSIL.

Ve funkčním ekvivalentním RacB proteinu se zvláště přednostně vyskytují alespoň 2 nebo 3 tyto motivy (a) až f)), zejména alespoň 4 nebo 5, zvláště všechny motivy

a) až f). Další RacB typické sekvenční motivy, zejména také motivy k vymezení vzhledem k Raci proteinům, může odborník bez obtíží odvodit ze sekvenčního srovnání známých RacB (případně Raci) proteinů, jak je znázorněno na obr. 1.

Příklady pro ve způsobu vynálezu minimalizované funkční ekvivalenty kRacB proteinům podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6 lze z různých organismů, jejichž genomická sekvence je známá, jako například zArabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotina tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, nalézt pomocí homologového srovnávání v datových bankách.

Také prověřování cDNA nebo genomických registrů jiných organismů, přednostně dalších dole uvedených druhů rostlin vhodných jako hostitel k transformaci, za použití pod SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5 popsaných sekvencí nukleové kyseliny nebo jejich částí jako sondy, je pro odborníka běžným postupem k identifikaci homologů v jiných druzích. Přitom od sekvencí nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5 odvozené sondy mají délku alespoň 20 bp, přednostně alespoň 50 bp, zvláště přednostně alespoň 100 bp, zejména 200 bp a nejlépe alespoň 400 bp. Pro prověřování registrů se také může použít DNA řetězec komplementární se sekvencemi popsanými pod SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5.

Funkční ekvivalenty podle toho zahrnují DNA sekvence, které se za standardních podmínek dělí s RacB sekvencí kyseliny nukleové popsanou pomocí SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5, kní komplementární sekvencí kyseliny nukleové a kódují vpředu uvedené hybridizované sekvence jako úplné sekvence proteiny, které mají stejné vlastnosti jako proteiny popsané pod SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6.

„Standardními podmínkami hybridizace“ se rozumí podmínky pro kogentní nebo méně kogentní hybridizaci. Takové podmínky hybridizace jsou mezi jiným popsány u

Sambrooka J, Fritsche EF, Maniatise T a kolektivu, v Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, strany 9.31-9.57) nebo v Current Protocols v Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Například podmínky během praní se mohou volit v rozsahu podmínek pro malou kogentnost (s přibližně 2X SSC při 50 °C) a pro velkou kogentnost (s připbližně 0.2X SSC při 50 °C, přednostně při 65 °C) (20X SSC: 0,3 M citrát sodný, SM NaCl, pH 7.0). Kromě toho se může teplota během praní z málo kogentních podmínek za teploty okolí, přibližně 22 °C, zvyšovat k silně kogentním podmínkám při teplotě přibližně 65 °C. Oba parametry, koncentrace soli a teplota, se mohou měnit současně, také však jeden z obou parametrů může zůstat konstantní a mění se jen druhý parametr. Během hybridizace se mohou použít také denaturizující agencie, jako například formamid nebo SDS. V přítomnosti 50 % formamidu se hybridizace provádí přednostně při 42 °C. Jednotlivé příkladné podmínky pro hybridizaci a praní jsou uvedeny v následujícím:

(1) Hybridizační podmínky jsou například zvoleny z následujících podmínek:

a) 4X SSC při 65 °C,

b) 6X SSC při 45 °C,

c) 6X SSC, 100 gg/ml denaturované fragmentované DNA rybího spermatu při 68 °C,

d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 pg/ml denaturované DNA lososího spermatu při 68 °C,

e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 pg/ml denaturované, fragmentované DNA lososího spermatu, 50 % formamidu při 42 °C,

f) 50 % formamidu, 4X SSC při 42 °C, nebo

g) 50 % (vol/vol) formamidu, 0,1% albuminového séra skotu, 0,1% ficollu, 0,1% polyvinylpyrrolidonu, 50 mM pufru fosforečnanu sodného s pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM citrátu sodného při 42 °C, nebo

h) 2x nebo 4x SSC při 50 °C (úzce kohentní podmínka),

i) 30 až 40 % formamidu, 2X nebo 4X SSC při 42 °C (úzce kohentní podmínka).

(2) Podmínky praní se mohou například zvolit z následujících podmínek:

a) 0,015 M NaCl/0,0015 M citrátu sodného(0,l % SDS při 50 °C.

b) 0, IX SSC při 65 °C.

c) 0,IX SSC, 0,5 % SDS při 68 °C.

d) 0, IX SSC, 0,5 % SDS, 50 % formamidu při 42 °C.

e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS při 42 °C.

f) 2X SSC při 65 °C (úzce kohentní podmínka).

Funkční ekvivalenty odvozené od polypeptidu podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6 zahrnují zejména také proteiny se SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 nebo 70. Zejména se míní funkční ekvivalenty proteinů, které se kódují pomocí sekvence nukleové kyseliny se SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, nebo 69.

Zmenšení exprese RacB proteinu, RacB aktivity, nebo Rac funkce se může realizovat mnoha cestami.

„Zmenšení“ je v souvislosti s RacB proteinem, RacB aktivitou, nebo RacB funkcí vykládáno šířeji a zahrnuje částečné nebo v podstatě úplné, na různých buněčných biologických mechanismech založené zamezení nebo blokování funkčnosti RacB proteinu v rostlinách, nebo v z nich oddělených částech, tkáních, orgánech, buňkách nebo semenech. Zmenšení ve smyslu vynálezu zahrnuje také množstevní zmenšení RacB proteinu až po v podstatě úplnou absenci RacB proteinu (to znamená chybějící dokazatelnost RacB aktivity, případně RacB funkce, nebo chybějící imunologickou dokazatelnost RacB proteinu). Přitom se exprese stanoveného RacB proteinu nebo RacB aktivity, případně RacB v buňce nebo organismu přednostně sníží o více než 50 %, zvláště přednostně o více než 80 %, zejména o více než 90 %.

Vynález zahrnuje různé strategie ke zmenšení exprese RacB proteinu, RacB aktivity nebo RacB funkce. Odborníkovi je zřejmé, že existuje řada postupů k ovlivnění exprese RacB proteinů, RacB aktivity nebo RacB funkce požadovaným způsobem.

Zmenšení RacB aktivity nebo RacB funkce se přednostně docílí pomocí zmenšené exprese endogenního RacB proteinu.

Zmenšení množství RacB proteinu, RacB aktivity, nebo RacB funkce se může realizovat za použití následujícího postupu:

a) Vnesení dvou řetězcové RacB sekvence RNA nukleové kyseliny (RacBdsRNA) nebo expresní kazety zajišťující její expresi,

b) Vnesení RacB antisensní sekvence nukleové kyseliny, nebo expresní kazety, zajišťující její expresi. Zahrnuje takové postupy, u nichž je antisensní sekvence kyseliny nukleové nasměrována proti RacB genu (tedy genomickým DNA sekvencím), nebo RacB gentranskriptu (tedy RNA sekvencím). Jsou zahrnuty také α-anomerní sekvence nukleové kyseliny.

c) Vnesení RacB antisensních sekvencí nukleové kyseliny kombinovaných s ribozymem nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi.

• ·· ·· ···· ·· · « · · · · · 9 9 · 9

9 9 9 9 · 9 9 9 9

999 9 999 99999

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 ·

d) Vnesení RacB sensních sekvencí nukleové kyseliny k indukci potlačení nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi.

e) Vnesení sekvence nukleové kyseliny kódující pro dominantně negativní RacB protein nebo expresní kazety zajištující její expresi.

f) Vnesení na DNA nebo protein vázaných faktorů proti RacB genům, RacBRNAs nebo RacB proteinům nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi.

g) Vnesení RacB RNA odbourání způsobujících virálních sekvencí nukleové kyseliny a expresních konstruktů nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi.

h) Vnesení konstruktů k indukci homologové rekombinace na endogenních RacB genech například k vytvoření knockout-mutantů.

i) Zavedení mutantů do endogenních RacB genů k vytvoření funkčního deficitu (například generace stopp-kodonů, posunutí ve sběrném rastru a podobně).

Přitom každý jednotlivý z těchto způsobů může způsobit snížení RacB exprese, RacB aktivity nebo RacB funkce ve smyslu vynálezu. Také je možné kombinované použití. Odborníkovi jsou známé i další postupy, které mohou zahrnovat zabránění nebo zamezení procesionování RacB proteinu, transportu RacB proteinu nebo jeho mRNA inhibici ukládání ribosomň, inhibici štěpení RNA, indukci RacB-RNA odbouratelného enzymu a/nebo zbrždění elongace nebo terminace translace.

Jednotlivé přednostní způsoby jsou krátce popsány v následujícím:

a) Uložení dvou řetězcové RacB RNA sekvence kyseliny nukleové (RacB-dsRNA) ·© ····

9 · 9

9 9 9

9 9 99999

Mnohokrát byl na zvířecích a rostlinných organismech popsán způsob genové regulace pomocí dvou řetězcové DNA („double-stranded RNA interference“, dsRNAi) (například Matzke MA a kolektiv (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415, Fire A. a kolektiv (1998) Nátuře 391: 806-811, WO 99/32619, WO 99/53050, WO 00/68374, WO 0044914, WO 00/44895, WO 00/49035, WO 00/63364). Výslovně se odkazuje na v uvedených dokumentech popsané způsoby a postupy. Efektivní genová suprese se může projevit také při přechodné expresi nebo přechodné transformaci například následkem biologické transformace (Schweizer P a kolektiv (2000) Plant J 2000 24, 895-903). DsRNAi způsob je založen na skutečnosti, že současným uložením komplementární řetězce a protilehlého řetězce genové transkripce se způsobí vysoce efektivní zamezení exprese příslušného genu. Účinný fenotyp vede k příslušným knock-out mutantům nebo podobně (Waterhouse PM a kolektiv (1998) Proč Nati Acad Sci USA 95: 13959-64).

DsRNAi způsob se osvědčil jako zvláště efektivní a výhodný při zmenšování RacB exprese. Jak je mezi jiným popsáno ve WO 99/32619 dsRNAi vklady jsou zřetelně převažující nad klasickými anisensními vklady.

Další předmět vynálezu se proto vztahuje na dvou řetězcové RNA molekuly (dsRNA molekuly), které způsobují při zavedení do rostlin (nebo jejich buňky, tkáně, orgánu nebo semene) zmenšení RacB.

Dvou řetězcová RNA molekula ke zmenšení exprese RacB proteinu je charakterizována tím, že

a) jeden z obou RNA řetězců je v podstatě identický s alespoň částí RacB sekvence kyseliny nukleové a

b) zbývající RNA řetězec je v podstatě identický s částí komplementárního řetězce RacB sekvence kyseliny nukleové.

V další přednostní variantě provedení zahrnuje dvou řetězcová RNA molekula ke zmenšení exprese RacB proteinu • ·' ·· »·»· ·· · ·· ♦ · ·· · · · « • · · ·· · ···· • · · · · · ··· ·«··· ····« ·· · · ·· ·

a) „sensní“ RNA řetězec zahrnující alespoň jednu sekvenci rybonukleotidu, která je v podstatě identická s alespoň částí „sensního“ RNA transkriptu sekvence nukleové kyseliny kódované pro RacB protein a

b) „antisensní“ RNA řetězec, který je v podstatě, přednostně zcela, komplementární k sensnímu RNA řetězci pod bodem a).

Ve vztahu k dvou řetězcové RNA molekule se RacB sekvencí nukleové kyseliny míní sekvence podle SEQ ID NO: 1, 3 nebo 5 nebo její funkční ekvivalent podle SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 nebo 69.

Pojmem „v podstatě identický“ se míní, že dsRNA sekvence a také inserce, delatace, jakož i jednotlivé bodové mutace mohou mít ve srovnaní RacB cílovou sekvencí funkční ekvivalentní cílovou sekvenci a přes to způsobují efektivní zmenšení exprese. Přednostně činí homologie podle uvedené definice alespoň 75, zejména alespoň 80 %, zvláště přednostně alespoň 90 %, zejména přednostně 100 % mezi „sensním“ řetězcem inhibičního ds RNA a alespoň částí „sensní“ RNA transkripce sekvence kyseliny nukleové kódované pro RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent (případně mezi „antisensním“ řetězcem a komplementárním řetězcem sekvence kyseliny nukleové kódované pro RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent.

Délka dílčího úseku činí alespoň 10 bází, přednostně alespoň 25 bází, zejména alespoň 50 bází, zvláště alespoň 100 bází, zvláště zejména alespoň 200 bází, nebo alespoň 300 bází.

Alternativně se může pojem „v podstatě identická“ dsRNA také definovat jako sekvence nukleové kyseliny, která je způsobilá hybridizovat s částí paměťového proteinu genového transkriptu (například ve 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA při 50 °C nebo 70 °C po dobu 12 až 16 h).

·· · ···· · · · · · · • · · · · · · · · · • · · * · · ♦ · · ····· «·· · · · · ·· · ··· ·» ·· ·· ·· »

Pod pojmem „v podstatě komplementární“ se míní, že „antisensní“ RNA řetězec může mít ve srovnání s komplementem „sensního“ RNA řetězce také inserci, deletaci, jakož i jednotlivé bodové mutace. Homologie mezi „anitisením“ RNA řetězcem a komplementem „sensního“ RNA řetězce přednostně činí alespoň 80 %, přednostně alespoň 90 %, zvláště přednostně alespoň 95 %, zejména alespoň 100 %.

Pod pojmem „část „sensního“ RNA transkriptu“ sekvence nukleové kyseliny kódované pro RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent se míní fragmenty RNA nebo mRNA transkribované od sekvence nukleové kyseliny kódované pro RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent, přednostně od RacB genu. Přitom mají fragmenty přednostně sekvenční délku alespoň 20 bp, přednostně alespoň 50 bp, zvláště přednostně alespoň 100 bází, zejména alespoň 200 bp, zejména 500 bp. Zahrnuje také zcela transkribované RNA nebo mRNA.

Zahrnuje také použití dsRNA molekuly ve způsobu podle vynálezu k vytvoření patogenní rezistence v rostlinách.

DsRNA může sestávat z jednoho nebo více řetězců polymerizovaných ribonukleotidů. Mohou se používat rovněž modifikace, a to i cukr fosforečnanové kostry, jakož také nukleotidy. Například být mohou fosfodinesterové vazby přírodního RNA modifikovány, takže obsahují atom dusíku nebo síry. Báze mohou být modifikovány tak, že se omezí aktivita například adenosidenaminasy. Tyto a další modifikace jsou dále popsány u způsobu stabilizace antisensní RNA.

Přirozeně se mohou, aby se docílilo stejného účinku, vnést do buňky nebo organismu také více individuální dsRNA molekuly, které obsahují jeden ze shora definovaných úseků sekvence rybonukleoidu.

DsRNA se může získat enzymaticky nebo zcela nebo částečně chemicky.

• 4 ·444

Dvou řetězcová dsRNA struktura se může vytvořit, když se vychází ze dvou komplementárních separátních RNA řetězců, nebo přednostně jednotlivého samokomplementámího RNA řetězce.

U jednotlivého, samokomplementámího řetězce mohou být „sensní“ a „antisensní“ sekvence vázány pomocí vazební sekvence a vytvářet vlásničkovitou strukturu. Přednostně může být vazební sekvence intronem, který se po syntéze dsRNA vyplétá.

Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro dsRNA může obsahovat další prvky, jako například transkripci terminující signály nebo signály polyadenylizace.

Jestliže se mají spolu vnést do buňky nebo rostliny dva řetězce dsRNA, tak se to může provést různými způsoby:

a) transformace buňky nebo rostliny s vektorem, kteiý zahrnuje obě expresní kazety,

b) kotransformace buňky nebo rostliny se dvěma vektory, přičemž zahrnuje jednu z expresních kazet se „sensním“ vektorem, druhou expresní kazetu s „antisensním“ řetězcem.

c) Křížení dvou rostlin, které byly transformovány s jedním vektorem, přičemž jedna z expresních kazet obsahuje „sensní“ řetězec, druhá „antisensní“ řetězec.

Vznik RNA duplexu se může iniciovat buď mimo, nebo uvnitř buňky. Jako ve

WO 99/53050 může dsRNA obsahovat také vlásničkovitou strukturu, tím že se „sensní“ a „antisenzní“ řetězec spojí pomocí linkeru (například intronu). Samokomplementámí dsRNA struktury jsou přednostní, poněvadž vyžadují pouze expresi konstruktu a komplementární řetězce obsahují obvykle v ekvimolárním poměru.

Expresní kasety kódované pro „antisensní“, nebo „sensní“ řetězec dsRNA nebo pro samokomplementámí řetězec dsRNA se přednostně inserují ve vektoru a s dole popsaným postupem stabilně (například za použití selekčních znaků) inserují do genomu rostliny, aby se zajistila dlouhodobá exprese.

4444 · 4 · ·

4 4 · ·

4 · · · « • · · 4 · ··· ·· ·· ·

• 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 444«

4 4 4 4

44 4

DsRNA se může zavést za použití množství, které umožňuje alespoň jednu kopii na buňku. Vyšší množství (například alespoň 5, 10, 100, 500 nebo 1000 kopií na buňku) může způsobit případně efektivní snížení.

Jak již bylo popsáno, není 100 %ní sekvencidentita mezi dsRNA a RacB genovým transkriptem nebo genovým transkriptem funkčního ekvivalentu genu, aby se dosáhlo efektivního snížení RacB exprese, nezbytně potřebná. V důsledku toho existuje výhoda, že je způsob tolerantní vzhledem k sekvenčním odchylkám, jaké mohou existovat v důsledku genetických mutací, polymorfísmů nebo evolučních divergencí. Tak je například možné s dsRNA, která byla generována z RacB sekvence organismu, potlačit RacB expresi v jiném organismu. Vysokou sekvenční homologie mezi RacB sekvencemi z rýže, kukuřice a ječmene lze vysvětlit na vysokém konzervačním stupni tohoto proteinu uvnitř rostlin, takže exprese dsRNA odvozená od jedné ze zveřejněných RacB sekvencí podle ESEQ ID NO: 1, 3, nebo 5 by mohla mít výhodný účinek také v jiných druzích rostlin.

Také je na základě vyšší homologie mezi jednotlivými RacB proteiny a jejich funkčními ekvivalenty možné s jednotlivou dsRNA, která byla generována ze stanovené RacB sekvence organismu, potlačit expresi dalších homologických RacB proteinů a/nebo jejich funkčních ekvivalentů stejného organismu nebo ale také expresi RacB proteinů v jiných používaných druzích. Za tímto účelem dsRNA přednostně zahrnuje sekvenční oblast RacB genových transkriptů, které odpovídají uchovávaným oblastem. Uvedené uchovávané oblasti lze snadno odvodit ze sekvenčních srovnání.

DsRNA se může syntetizovat in vivo nebo in vitro. Ktomu se může DNA sekvence kódovaná pro ds RNA vnést do expresní kazety za kontroly alespoň jednoho genetického kontrolního prvku (jako například promotor, enhancer, silencer, splice-donor, nebo akceptor, signál polyadenylizace). Odpovídající výhodné konstrukce jsou popsány dále. Polyadenylizace není potřebná, rovněž nemusí být k dispozici žádné prvky k iniciaci translace.

DsRNA se může syntetizovat chemicky nebo enzymaticky. Ktomu se mohou používat buněčné RNA polymerasy nebo bakteriologické RNA polymerasy (jako například T3-, T7, nebo SP6 RNA polymerasy). Příslušné způsoby k in vitro expresy RNA jsou popsány (WO 97/32016, US 5,593,874, US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Chemicky nebo enzymaticky in vitro syntetizovaná dsRNA se může před zavedením do buňky, tkáně nebo organismu z reakční směsi zcela nebo částečně vyčistit například exktrakcí, precipitací, elektroforézou, chromatografií nebo kombinací těchto postupů. DsRNA se může zavést bezprostředně do buňky, nebo ale také extracelulárně (například do intersticiálního prostoru).

Přednostně se však rostlina stabilně transformuje s expresním konstruktem, který realizuje expresi dsRNA. Příslušné postupy jsou popsány dále.

b) Vnesení RacB antisensní sekvence nukleové kyseliny

Způsobů k potlačení stanoveného proteinu zabráněním akumulace jeho mRNA pomocí „anitisensní“ technologie je mnoho a jsou popsány také na rostlinách (Sheehy a kolektiv (1988) Proč Nati Acad Sci USA 85, 8805-8809, US 4,801,340, Mol JN a kolektiv (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). Antisensní molekula nukleové kyseliny se hybridizuje, případně váže s buněčnou mRNA a/nebo genomickou DNA kódovanou pro suprimovaný cílový RacB protein. Tím se potlačí transkripce a/nebo translace cílového proteinu. Hybridizace může nastat konvenčním způsobem přes vazbu antisensní molekuly nukleové kyseliny s duplexem genomické DNA specifickou interakcí ve velkém zářezu v DNA spirále.

Antisensní sekvence nukleové kyseliny vhodná ke snížení RacB proteinu se může za použití pro tento protein kódované sekvence nukleové kyseliny, například sekvence nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5, nebo sekvence nukleové kyseliny kódované pro její funkční ekvivalent, například sekvence podle SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, nebo 69, odvodit podle regulací páru báse od Watsona a Cricka. Antisensní sekvence nukleové kyseliny může být komplementární k veškeré transkribované mRNA uvedeného proteinu, omezuje se na • ·

kódovaný region, nebo sestává jen z oligonukleotidu, který je komplementární k části kódované nebo nekódované sekvence. Tak může být oligonukleotid například komplementární k regionu, který zahrnuje start translace pro uvedený protein. Antisensní sekvence nukleové kyseliny mohou mít délku například 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, nebo 50, mohou však být také delší a mohou zahrnovat alespoň 100, 200, 500, 1000, 2000, nebo 5000 nukleotidů. Antisensní sekvence nukleové kyseliny se mohou rekombinovaně exprimovat, nebo se mohou chemicky nebo enzymaticky syntetizovat za použití odborníkovi známých postupů. Při chemické syntéze se mohou použít přírodní nebo modifikované nukleotidy. Modifikované nukleotidy mohou anitsensní sekvenci nukleové kyseliny propůjčit zvýšenou biochemickou stabilitu a vést ke zvýšené fyzikální stabilitě duplexu vytvořeného z antisensní sekvence nukleové kyseliny a cílové sensní sekvence. Mohou se použít například deriváty fosforothioatu a akridinem substituovaných nukleotidů, jako 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouraeil, 5-iodouracil, hypoxanthin, xanthin, 4-acetylcytosin, 5-(carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-carboxymethylaminomethyl2-thiouridin, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, b-D-galactosylqueosin, inosin, N6-isopentenyladenin, 1-methylguanin, 1-methylinosin, 2,2-—dimethylguanin, 2methyladenin, 2-methylguanin, 3-methylcytosin, 5-methylcytosin, N6-adenin, 7methylguanin, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, b-Dmannosylqueosin, 5’-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6isopentenyladenin, kyselina uracil-5-oxyoctová, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosin, 5methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methylester kyseliny uracil-5-oxyoctové, kyselina uracil-5-oxyoctová, 5-methyl-2-thiouracil, 3-(3-amino-3-N-2carboxypropyl)uracil a 2,6-diaminopurin.

V další přednostní variantě provedení se může exprese RacB proteinu inhibovat sekvencemi nukleotidu, které jsou komplementární k regulujícímu regionu RacB genu (například k RacB promotéru a/nebo enhanceru) a vytváří trojčlenné spirálové struktury se zdejší DNA dvojitou spirálou, takže se zmenšuje transkripce RacB genu. Příslušné způsoby jsou popsány (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6 (6): 569-84, Helene C a kolektiv (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36, Maher LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807815).

• · · · · · • · · · • · · · • · · · ·

V další variantě provedení může být antisesní molekulou nukleové kyseliny aanomerová nukleová kyselina. Takovéto molekuly α-anomerové nukleové kyseliny tvoří specifické dvou řetězcové hybridy s komplementární RNA, v nichž - na rozdíl ke konvenční β-nukleové kyselině - probíhají oba řetězce navzájem rovnoběžně (Gautier G a kolektiv (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641). Molekula antisensní nukleové kyseliny může rovněž obsahovat také 2'-O-methylribonukleotidy (Inoue a kolektiv (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641), nebo křížené RNA-DNA analogy (Inoue a kolektiv (1987) FEBS Lett 215: 327-330).

c) Vnesení antisensní RacB sekvence nukleové kyseliny kombinované s ribozymem.

Výhodně může být shora popsaná antisesní strategie vázána sribozymovým postupem. Katalytická RNA molekula nebo ribozymy se mohou přizpůsobit na každé cílové RNA a štěpí fosfodiesterovou kostru ve specifických polohách, čímž se funkčně deaktivuje cílová RNA (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3): 257-275). Ribozym se tím sám nemodifikuje, nýbrž je schopen analogicky štěpit další molekuly cílového RNA, čímž se obdrží vlastnosti enzymu. Vestavba ribozymových sekvencí do antisesní RNAs propůjčuje rovněž právě těmto „antisesním“ RNAs tuto enzymu podobnou vlastnost štěpení RNA a roste tak jejich efektivita při inaktivaci cílového RNA. Vytvoření a použití příslušné molekuly ribozymu a „antisesní“ RNA jsou například popsány Haseloffem a kolektivem (1988) Nátuře 334: 585-591.

Tímto způsobem se mohou ribozymy používat (například „Hammerhead“Rybozyme, Haselhoff a Gerlach (1988) Nátuře 334:585-591), aby se katalyticky odštěpila mRNA suprimováného enzymu - například RacB - a zabránilo se translaci. Ribozymová technologie může zvýšit efektivitu antisesní strategie. Způsoby exprese ribozymů ke snížení stanovených proteinů jsou popsány v EP 0 291 533, EP 0 321 201 a EP 0 360 257. V rostlinných buňkách je rovněž popsána exprese ribozymu (Steinecke P a kolektiv (1992) EMBO J 11(4): 1525-1530, de Feyter R a kolektiv (1996) Mol Gen Genet 250 (3): 329338). Vhodné cílové sekvence a ribozymy se mohou například, jak je popsáno u „Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith a kolektiv, Acadmic Press, lne. (1995) str. 449-460“, určit propočty sekundárních struktur RNA ribozymu a

cílového ribozymu, jakož i jejich interakcí (Bayley CC a kolektiv (1992) Plant Mol. Biol. 18 (2): 353-361, Loyd AM a Davis RW a kolektiv (1994) Mol Gen Genet. 242 (6): 653657). Například se mohou konstruovat deriváty tetrahymena L-19 IVS RNA, které mají komplementární oblasti kmRNA suprimierovaného RacB proteinu (viz také US 4,987,071 a US 5,116,742). Alternativně se mohou takové ribozymy identifikovat také prostřednictvím selekčního procesu z registru různých ribozymů (Bartel D a Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).

d) Vnesení RacB sekvence sensní nukleové kyseliny k indukci kosuprese

Exprese RacB sekvence nukleové kyseliny v sensní orientaci může vést ke kosupresi příslušných homologových, endogenních genů. Exprese sensní RNA s homologií k endogennímu genu může jeho expresi snížit nebo vyloučit, podobně jak to bylo popsáno pro antisensní případy (Jorgensen a kolektiv (1996) Plant Mol Biol 31 (5): 957-973, Gorint a kolektiv (1991) Proč Nati Acad Sci USA 88: 1770-1774, Smith a kolektiv (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481, Napoli a kolektiv (1990) Plant Cell 2: 279-289, Van der Krol a kolektiv (1990) Plant Cell 2: 291-99). Přitom může zavedený konstrukt zcela nebo jen zčásti representovat snižující, homologenní gen. Možnost translace není potřebná. Použití této technologie na rostliny je například popsáno Napolim a kolektivem (1990) The Plant Cell 2: 279-289 a v US 5,034,323.

Přednostně se kosuprese realizuje za použití sekvence, která je v podstatě identická s alespoň částí sekvence nukleové kyseliny, kódované pro RacB protein nebo jeho funkční ekvivalent, například sekvence nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5, nebo sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro její funkční ekvivalent, například sekvence podle SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 61, 63, 65, 67, nebo 69.

e) Vnesení sekvencí nukleové kyseliny kódovaných pro dominantně negativní RacB protein.

Funkce nebo aktivita RacB proteinu se může účinně realizovat také pomocí exprese dominantně negativní varianty tohoto RacB proteinu. Způsoby snížení produkce, případně aktivity proteinu pomocí koexprese jeho dominantně negativní podoby jsou odborníkovi známé (Lagna G a Memmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental B iology 36: 75-98, Perlmutter RM a Alberola-Ua J (1996) Current Opinion in Immunology 8 (2): 285-90, Sheppard D (1994) American Jour nal of Respirátory Cell & Molecular Biology 11(1): 1-6, Herskowitz I (1987) Nátuře 329(6136): 219-22).

Dominantně negativní RacB varianta se může realizovat například změnou aminokyseliny threonin v poloze 20 u RacB proteinů z kukuřice, rýže, nebo ječmene přednostně v kyselině asparagové. Přednostně mutovaný threonin, nebo případně také serin (analog k threoninu v poloze 20 v RacB z kukuřice, rýže, nebo ječmenu), v RacB homologách z jiných druhů se může vypočítat například pomocí počítačového porovnání („alignment“). Tyto mutace k dosažení dominantně negativní RacB varianty se přednostně provádí na rovině sekvence nukleové kyseliny, kódované pro RacB protein. Příslušná mutace se může realizovat například pomocí PCR zprostředkované in vitro mutagenese za použití oligonukleotidu, kterou se zavede požadovaná mutace. K tomu odborník používá běžné způsoby. Například se za tím účelem může použít „LA PCR in vitro Mutagenesis Kit“ (Takara Shuzo, Kyoto). Způsob vytvoření dominantně negativní varianty RacB proteinu z kukuřice je také popsán ve WO 00/15815 (příklad 4, str. 69).

Zvláště přednostní jsou dominantně negativní varianty RacB proteinů z ječmene, rýže, nebo kukuřice popsané pod SEQ ID NO: 7, 8 a 9.

f) Vnesení na DNA nebo protein vázaných faktorů proti RacB genům, -RNAs nebo proteinům.

Snížení RacB genové exprese je také možné se specifickými na DNA vázanými faktory, například s faktory typu jako transkripční faktory.Tyto faktory se uloží na genomickou sekvenci endogenního cílového genu, přednostně do regulačních oblastí a způsobují represi endogenního genu. Použití takového způsobu umožňuje snížení exprese • ·· · · ···· ·· · ···· ·· · · · · • · · · « · · · · · • · · · · · ··· ····· ····· · · · · · · * endogenního RacB genu, aniž se musí manipulovat sjeho sekvencí. Příslušné způsoby k vytvoření příslušných faktorů jsou popsány (Dreier B a kolektiv (2001) J Biol Chem 276 (31): 29466-78, Dreier B a kolektiv (2000) J mol Biol 303 (4): 489-502, Beerli RR a kolektiv (2000) Proč Nati Acad Sci USA 97 (4): 1495-1500, Beerli RR a kolektiv (2000) J Biol Chem 275 (42): 32617-32627, Segal DJ a Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4 (1): 34-39, Kang JS a Kim JS (2000) J Biol Chem 275 (12): 8742-8748, Beerli RR a kolektiv (1998) Proč Nati Acad Sci USA 95 (25): 14628-14633, Kim JS a kolektiv (1997) Proč Mátl Acad Sci USA 94 (8): 3616-3620, Klug A (1999) J Mol Biol 293 (2): 215-218, Tsai SY a kolektiv (1998) Adv Drug Deliv Rev 30 (1-3): 23-31, Mapp AK a kolektiv (200) Proč Nati Acad Sci USA 97 (8): 3930-3935, Sharrocks AD a kolektiv (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12): 1371-1387, Zhang L a kolektiv (2000) J Biol Chem 175 (43): 33850-33860).

Selekce těchto faktorů se může provést za použití libovolného kusu RacB genu. Přednostně leží tento úsek v oblasti regionu promotoru. Pro podporu genu může také ale ležet v oblasti kódovaného exonu nebo intronu. Příslušné úseky může odborník získat pomocí dotazu z genové banky, nebo, když se vychází z Rach cDNA, jejichž gen není v genové bance k dispozici, prozkoumáním genového registru podle korespondujících genových klonů. K tomu potřebné postupy jsou pro odborníka běžné.

Do buňky se rovněž mohou uložit faktory, které sami inhibují RacB buněčný protein. Protein inhibujícími faktory mohou být například aptamer (famulok M a Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243: 123-36) nebo protilátky, případně fragmenty protilátek, nebo jednotlivé řetezce protilátky. Získání těchto faktorů je popsáno a odborníkovi je známé. Například by se může použít cytoplasmatická scFv protilátka, aby se modulovala aktivita fytochromu A proteinu v genovou technikou změněných rostlinách tabáku (Owen M a kolektiv (1992) Biotechnology (N Y) 10 (7): 790-794. Franken E a kolektiv (1997) Curr opin Biotechnol 8 (4): 411-416, Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1: 286-272).

Genová exprese se může podpořit také pomocí speciálních, nízkomolekulárních syntetických sloučenin, například polyamidového typu ( Dervan PB a Biirli RW (1999) • · · · ···· · · · • « ·· · · ♦ · • · ·· · · · · ♦ • ··· · · · · ····· •a ·· ··

Current Opinion in Chemical Biology 3: 688-693, Gottesfeld JM a kolektiv (200) gene Expr 9 (1-2): 77-91). Tyto oligomery sestávají ze základních prvků: 3(dimethylamino)propylamin, N-methyl-3-hydroxyparrol, N-methylimidazol a Nmethylpyrroly a mohou se přizpůsobit každé části dvou řetězcové DNA tak, že se váží specificky podle sekvence do velkého zářezu a blokují zdejší genové sekvence. Příslušné způsoby jsou popsány (viz mezi jiným Bremer RE a kolektiv (2001) Bioorg Med Chem. 9 (8): 2093-103, Ansari AZ a kolektiv (2001) Chem Biol. 8 (6): 583-92, Gottesfeld JM a kolektiv (2001) J Mol Biol. 309 (3): 615-29, Wurtz NR a kolektiv (2001) Org Lett 3 (8): 1201-3, Wang CC a kolektiv (2001) Bioorg Med Chem 9 (3): 653-7, Urbach AR a Dervan PB (2001) Proč Nati Acad Sci USA 98 (8): 4343-8, Chiang SY a kolektiv (2000) J Biol Chem. 275 (32): 24246-54).

g) Vnesení RacB RNA odbourání způsobujících virových sekvencí nukleové kyseliny a konstruktů exprese.

RacB exprese se může účinně provádět také pomocí indukce odbourání RacB RNA prostřednictvím rostliny s pomocí virového expresního systému (amplikon) (Angell, SM a kolektiv (1999) Plant J. 20 (3): 357-362). Tento systém, označovaný také jako „VIGS“ (viral induced gene silencing), vnáší do rostliny sekvence nukleové kyseliny shomologií k suprimováným transkriptům pomoci virových vektorů. Transkripce se potom vyřadí, snad pomocí rostlinného ochranného mechanismu proti virům. Příslušné postupy jsou popsány (Ratcliff F a kolektiv (2001) Plant J 25 (2): 237-45, Fagard M a Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43 (2-3): 285-93, Anandalakshmi R a kolektiv (1998) Proč Nati Acad Sci USA 95 (22): 13079-84, Ruitz MT (1998) Plant Cell 10 (6): 937-46).

h) Vnesení konstruktů k indukci homologové rekombinace na endogenní RacB geny, například k vytvoření knockout mutantů.

K vytvoření homologicky rekombinovaného organismu se sníženou RacB aktivitou se použije například konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň část endogenního RacB genu, který se pomocí deletace, adice, nebo substituce alespoň jednoho nukleotidu mění tak, že se mírně, nebo zcela zvýší funkčnost. Změna se může týkat také

regulačních prvků (například promotoru) genu, takže kódovaná sekvence zůstává nezměněná, exprese (transkripce a/nebo translace) však přestává a snižuje se.

Při konvenční homologové rekombinaci je změněný region na svých 5 - a 3'koncích lemován dalšími sekvencemi nukleové kyseliny, které musí mít dostatečnou délku pro umožnění rekombinace. Délka leží zpravidla v rozsahu několika stovek baží až několika kilobazí (Thomas KR a Capecchi MR (1987) Cell 51: 503, Strepp a kolektiv (1998) Proč Nati Acad Sci USA 95 (8): 4368-4373). Pro homologové rekombinace se hostitelský organismus, například rostlina, transformuje za použití dole popsaného postupu s rekombinačním konstruktem a úspěšně rekombinované klony se za použití například antibiotické nebo herbicidní resistence selektují.

Homologická rekombinace je především v rostlinách relativně vzácný jev. Převládají neočekávané integrace na hostitelský genom. Možnost odstranit neočekávaně integrované sekvence a obohatit tak buněčný klon se správnou homologickou rekombinaci, spočívá v použití rekombinačního systému, jaký je popsán v US 6,110,736, pomocí kterého se mohou znovu deletovat nespecificky integrované sekvence, což účinně ulehčuje selekci pomocí homologové rekombinace integrovaných jevů. Může se používat větší počet rekombinačních systémů, například se uvádí Cre/lox systém rekombinace bakteriofágu Pl, FLP/FRT systém kvasnic, gin rekombinace Mu fágu, pin rekombinace z E. coli a R/RS systém pSRl plasmidu. Přednostní jsou Cre/lox systém rekombinace bakteriofágu Pia kvasnicový FLP/FRT systém. FLP/FRT a cre/lox rekombinační systémy byly použity již v rostlinném systému (Oděli a kolektiv (1990 Mol Gen Genet 223: 369378).

i) Zavedení mutací v endogenním RacB genu k vytvoření funkčního deficitu (například generace stop kodonu, posunutí ve sběrném rastru a podobně).

Dalším vhodným postupem ke snížení RacB aktivity je zavedení nonsensních mutací do endogenních genů, například pomocí zavedení RNA/DNA oligonukleotidů v rostlinách (Zhu a kolektiv (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 555-558), jakož i generace knockaut mutantů s pomocí například T-DNA-mutagenese (Koncz a kolektiv (1992) Plant • · · ·

Mol Biol 20 (5): 963-976), ENU-(N-ethyl-N-nitrosomočovina) -mutagenese nebo homologovou rekombinací (Hohn B a Puchta (1999) H Proč Nati Acad Sci USA 96: 83218323). Bodové mutace se mohou vytvořit pomocí DNA-RNA hybridů, které jsou také známé jako „chimeraplasty“ (Cole-Strauss a kolektiv (1999) Nucl Acids Res 27(5): 13231330, Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3): 240-247).

Metody dsRNAi, kosuprese pomocí sensní RNA a „VIGS“ (virus induced gene silencing“) se také označují jako „post-trancriptional gene silencing“ (PTGS). PTGS způsoby, jakož také snížení RacB funkce nebo aktivity s dominantně negativními RacB variantami jsou zvláště výhodné, protože požadavky na homologii mezi suprimováným endogenním genem a transgenní exprimovanou sensní nebo dsRNA sekvencí nukleové kyseliny (případně mezi endogenním genem a jeho dominantně negativní variantou) jsou menší než například u klasického antisensního případu. Příslušná kriteria homologie jsou uvedena u popisu dsRNAi způsobu a lze je obecně přenést pro PTGS způsoby nebo dominantně negativní případy. Na základě vysoké homologie mezi RacB proteiny z kukuřice, rýže a ječmene se může usuzovat na vysoký konservační stupeň tohoto proteinu u rostlin. Tak lze za použití RacB sekvencí nukleové kyseliny z ječmene, kukuřice nebo rýže efektivně suprimo vat také expresi homologických RacB proteinů v jiných druzích, aniž by byla nutně potřebná izolace a objasnění struktury zde se vyskytujících RacB homologů. Toto zřetelně snižuje pracovní náklady. Analogicky se může za použití dominantně negativních variant RacB proteinu z rýže, kukuřice, nebo ječmenu účinně snížit nebo potlačit funkce/aktivita jeho homologů v jiných druzích rostlin.

Všechny substance a sloučeniny, které přímo nebo nepřímo způsobují snížení množství proteinu, množství RNA, aktivitu genu nebo aktivitu RacB proteinu, jsou shrnuty pod označení „anti-RacB“ sloučeniny. Pojem „anti-RacB“ sloučeniny explicitně zahrnuje ve shora popsaném způsobu používané sekvence nukleové kyseliny, peptidy, proteiny, nebo jejich faktory.

„Uložení“ zahrnuje v rámci vynálezu všechny způsoby, které jsou vhodné k zavedení „anti-RacB“ sloučeniny přímo nebo nepřímo do rostliny, nebo buňky, části, tkáně, orgánu nebo semene, nebo aby zde generovala. Jsou zde zahrnuty přímé i nepřímé ·· 444444 ·· · · · 4 4 · ···

4·· · · · 4··· •4 4 · · 4 444 44444

444 · 4 44 44 44 · způsoby. Uložení může vést k přechodné, nebo také k dlouhodobé (stabilní) přítomnosti „anti-RacB“ sloučeniny (například dsRNA).

Podle rozdílné povahy shora popsaných materiálů může „anti-RacB“ sloučenina přímo vykonat svojí funkci (například insercí do endogenního RacB genu). Funkce se může ale také vykonat nepřímo po transkripci do RNA (například u antisensních materiálů), nebo po transkripci a translaci do proteinu (například u vazebních faktorů). Jak přímo, tak i nepřímo působící „anti-RacB“ sloučeniny jsou součástí vynálezu.

Zavedení zahrnuje například způsoby jako transfekce, transdukce, nebo transformace.

„Anti-RacB“ sloučeniny tím také zahrnují například nekombinované expresní konstrukty, které podmiňují expresi (to znamená transkripci a případně translaci) například RacB-dsRNA nebo RacB „antisesní“-RNA přednostně v rostlině, nebo její části, tkáni, orgánu, nebo semenu.

V uvedených expresních konstruktech je molekula nukleové kyseliny, jejíž exprese (transkripce a případně translace) generují „anti-RacB“ sloučeninu, přednostně ve funkční vazbě s alespoň jedním genetickým kontrolním prvkem (například promotorem), který zajišťuje expresi v organismu, přednostně v rostlinách. Jestliže se má expresní konstrukt zavést přímo do rostliny a „anti-RacB sloučenina (například RacB dsRNA) se zde má vytvořit v plantae, pak jsou přednostní pro rostliny specifické genetické kontrolní prvky (například promotory). „Anti-RacB“ sloučenina se však může vytvořit také v jiných organismech, nebo in vitro a potom se do rostliny uloží (jako je popsáno v příkladu 6 a 7). V nich jsou přednostní všechny prokaryotické nebo eukarotické genetické kontrolní prvky například promotory), které dovolují expresi v organismu zvoleném pro vytvoření.

Pod funkční vazbou se rozumí například sekvenční uspořádání promotoru s exprimovanou sekvencí nukleové kyseliny (například „anti-RacB“ sloučeninou) a případně dalšími regulačními prvky jako například terminátorem tak, že každý z regulačních prvků může plnit svojí funkci při transgenní expresi sekvence nukleové •9 9999

9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

9 99

9 9 9

9 9 9

999 99··· • · · · ·

kyseliny, podle uspořádání sekvencí nukleové kyseliny k sensní nebo antisesní RNA. Ktomu není nezbytně potřebná přímá vazba v chemickém smyslu.. Genetické kontrolní sekvence, jako například enhancer-sekvence, mohou vykonávat navíc svoji funkcí na cílovou sekvenci také od další vzdálené sekvence nebo dokonce od jiných DNA molekul. Přednostní jsou uspořádání, v nichž se transgenně exprimovatelná sekvence nukleové kyseliny polohuje za jako promotér sloužící sekvence, takže obě sekvence jsou navzájem kovalentě vázány. Přednostně je přitom odstup mezi sekvencí promotoru a transgenně exprimovatelnou sekvencí méně než 200 bp, přednostně méně než 100 bp, zejména méně než 50 bp.

Vytvoření funkční vazby, jakož také vytvoření expresní kazety se může realizovat pomocí běžných postupů rekombinace a klonování, jaké jsou popsány například v materiálech Maniatis T, Fritsch EP a Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manua, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), Šilhavý TJ, Berman ML a Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), Ausubel FM a kolektiv (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience a Gelvin a kolektiv (1990) In: Plant Molecular Biology. Mezi oběma sekvencemi se ale také mohou polohovat další sekvence, které například mají funkci linkeru se stanovenými rozhraními restričního enzymu nebo signálního peptidu. Také inserce sekvencí může vést k expresi roztoku proteinů. Přednostně může být k dispozici expresní kazeta, sestávající z vazby promotoru a exprimovatelné sekvence nukleové kyseliny, integrované do vektoru a může se inserovat do rostlinného genomu pomocí například transformace.

Pod expresní kasetou se ale také rozumí takové složení, u něhož se prmoter, například pomocí homologové rekombinace, umístí za edogenní RacB gen a způsobuje pomocí exprese antisensní RacB RNA snížení RacB proteinu podle vynálezu. Analogicky se může také „anti-RacB“ sloučenina (například sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB dsRNA nebo Racb antisensní RNA) umístit za endogenní promotor tak, že nastává stejný účinek. Oba případy vedou k expresním kazetám ve smyslu vynálezu.

·· 9«·9 99 9

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 •9 9 999 9 9999

Pro rostliny specifickými promotory se v zásadě rozumí každý promotor, který může řídit expresi genů, zejména cizích genů v rostlinách nebo částech rostlin, rostlinných buňkách, rostlinných tkáních a rostlinných kulturách. Exprese přitom může být například konstitutivní, indukční nebo vývojová.

Přednostní jsou:

a) Konstitutivní promotory

Přednostní jsou vektory, které umožňují konstitutivní expresi v rostlinách (Benfey a kolektiv (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Konstitutivním promotorem se míní takový promotr, který zajišťuje expresi v početných, přednostně všech tkáních ve vyšším intervalu vývoje rostlin, přednostně ve všech intervalech vývoje rostlin. Přednostně se používá zejména rostlinný promotor, nebo promotor, který pochází z rostlinného viru. Zejména je přednostní promotor transkriptu 35S květákového viru CaMV (Franck a kolektiv (1980) Cell 21: 285-294, Oděli a kolektiv (1985) Nátuře 313: 810-812, Shewmaker a kolektiv (1985) Virology 140: 281-288, Gardner a kolektiv (1986) Plant Mol. Biol 6: 221-228), nebo promotor 19S C aMV (US 5,352, 605, WO 84/02913, Benfey a kolektiv (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Dalšími vhodnými konstitutivními promotory jsou promotor „Rubisco smáli subunit (SSU)“ (US 4,962,028), promotor LeguminB (genová banka Accč. X03677), promotor nopalinsythase z Agrobacteria, promotor TR, OCS (Octopin Synthase), promotor z Agrobacteria, promotor Ubiquitin (Holtorf S a kolektiv (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), promotor Ubiqutin 1 (Christensen a kolektiv (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689, Bruče a kolektiv (1989) Proč Nati Acad Sci USA 86: 9692-9696), promotor Smas, promotor cínamylalkoholové dehydrogenasy (US 5,683,439), promotory vakuolárních ATPase jednotek, nebo promotor na prolin dostatečného proteinu z pšenice (WO 91/13991), jakož i další promotory genů, jejichž konstitutivní exprese v rostlinách je odborníkovi známa. Jako konstitutivní promotor je zejména přednostní promotor nitrilasy1 (niti) genu z A. thaliany (genová banka Acc.-č.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand a kolektiv (1996) Gene 170: 197-200).

b) Tkáňově specifické promotory.

• · · · ··· · · · * • · ·· · ·«· • · · · · · · · · • · « · · ··· ····· ·· ···· ·· · • ·· ·« ·· ·· ·

Rovněž jsou přednostní promotory s specifikou pro prašníky, vaječníky, květy, listy, stonky, kořeny a semena.

Promotory specifické pro semena

Příkladem promotoru je promotor faseolinu (US 5,504,200, Bustos MM a kolektiv (1989) Plant Cell 1 (9(: 839-53), 2S albumingenu (Joseffsin LG a kolektiv (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), leguminu (Shirsat A a kolektiv (1989) Mol gen Genet 215 (2): 326-331), USP (unknown seed protein, Báumlein H a kolektiv (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459-67), napin genu (US 5,608,152, Stahlberg K a kolektiv (1996) L Planta 199: 515519), proteinu vázajícího cukr (WO 00/26388) , nebo promotor legumin B4 (LeB4, Báumlein H a kolektiv (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128, Báumlein a kolektiv (1992) Plant Journal 2 (2): 233-9, Fiedler U a kolektiv (1995) Biotechnology (NY) 13 (10): 1090 a následující), promotor oleosin z arabidopsisu (WO 98/45461), promotor Bce4 zbrassica (WO 91/13980). Dalšími vhodnými promotory specifickými pro semena jsou promotory genů kódovaných pro „High Molecular Weig ht Glutenin“ (HMWG), gliadin, růstový enzym, ADP glukózová pyrofosfatáze (AGPase), nebo škrobová syntaze. Přednostní jsou rovněž promotory, které dovolují pro semena specifickou expresi vjednoděložných rostlinách jako kukuřice, ječmen, pšenice, žito, rýže a podobně. Výhodně se mohou používat promotor lpt2, nebo lptl genu (WO 95/15389, WO 95/23230), nebo promotory popsané ve WO 99/16890 (promotory hordeinového genu, glutelinového genu, oryzinového genu, prolaminového genu, gliadinového genu, glutelinového genu, zeinového genu, kasirinového genu, nebo secalinového genu).

Pro hlízu, nebo kořen:

specifické promotory, jako například patatinový promotor třídy I (B33), promotor catehepsinu D inhibitoru z brambor.

Pro listy specifické promotory:

Jako promotor cytosolické FBPase z brambor (WO 97/05900), SSU promotor (smáli subunit) rubisca (ribulose-l,5-bisfosfatkarboxylasa), nebo ST-LST promotor z brambor (Stockhaus a kolektiv (1989) EMBO J 8: 2445-2451). Zvláště přednostní jsou epídermálně ···· • · • · · • ·« · · specifické promotory, jako například promotor OXLP genu („Oxalat-Oxidase like protein“, Wei a kolektiv (1998) Plant Mol. Biol. 36: 101-112).

Pro květy specifické promotory

Jako například promotor fytoensyntaze (WO 92/16635), nebo promotor P-rr genu (WO 98/22593).

Pro prašník specifické promotory jako 5126 promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), promotor glób-1 a promotor γ-Zein.

c) Chemicky indukovatelné promotory

Expresní kazety mohou také obsahovat chemicky indukovatelný promotor (Gatz a kolektiv (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), pomocí kterého se může ve stanoveném okamžiku řídit exprese exogenního genu v rostlině. Mohou se rovněž použít takové promotory, jako například promotor PRP1 (Ward a kolektiv (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), pomocí kyseliny salicylové indukovatelný promotor (WO 95/19443), pomocí benzolsulfonamidu indukovatelný promotor (EP 0 388 186), tetracyklinem indukovatelný promotor (Gatz a kolektiv (1992) Plant J 2: 397-404), pomocí abscisinové kyseliny indukovatelný promotor (EP 0 335 528), případně pomocí ethanolnebo cyklohexanonu indukovatelný promotor (WO 93/21334).

d) Stresem nebo patogenem indukovatelné promotory

Rovněž jsou přednostní promotory, které se indukují biotickým nebo abiotickým stresem jako například patogenem indukovatelný promotor PRP1 genu (případně gstl promotor) například z brambor (WO 96/28561, Ward a kolektiv (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), teplem indukovatelný hsp 70, nebo hsp80 promotor z rajčat (US 5,187,267), chladem indukovatelný alfa-amylasový promotor z brambor (WO 96/12814), světlem indukovatelný PPDK promotor, nebo použitím indukovatelný pinii promotor (EP-A 0 375 091).

« ·» ·« ···· ·· * ·<··· · · · · · · • 4 · · · · ♦ · · · • » » · · · · · · «»···

999 9 9 ·< ·· ·· ·

Další patogenem indukovatelné promotory zahrnují flachs Fisl promotor, Vstl promotor (Schubert a kolektiv (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426), jakož i EAS4 sequiterpenový cyclasový promotor z tabáku (US 6,100,451).

Patogenem indukovatelné promotory zahrnují promotory genů, které se indukují napadením patogenem, jako například geny PR proteinů, SAR proteinů, p-l,3-glukanasa, chitinasa a podobně (například Redolfi a kolektiv (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254, Uknes a kolektiv (1992) Plant Cell 4: 645-656, Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111116, Marineau a kolektiv (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342, Matton a kolektiv (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 352-342, Somssich a kolektiv (1986) Proč Nati Acad Sci USA 83: 2427-2430, Somssich a kolektiv (1986 Mol Gen Genetics 2: 93-98, Chen a kolektiv (1996) Plant J 10: 955-966, Zhang a Sing (1994) Proč Nati Acad Sci USA 91: 2507-2511, Warner a kolektiv (1993) Plant J 3: 191-201, Siebertz a kolektiv (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).

Zahrnuty jsou také použitím indukovatelné promotory jako promotor pinii genu (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449, Duan a kolektiv (1996) Nat Bitoech 14: 494-498), wunl a wun2 genu (US 5,428,148), winl a win2 genu (Stanford a kolektiv (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), systeminu (McGurl a kolektiv (1992) Science 225: 1570-1573), WIP1 genu (Rohmeier a kolektiv (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792, Eckelkamp a kolektiv (1993) FEBS Letters 323: 73-76), MPI genu (Corderok a kolektiv (1994) Plant J 6 (2): 141-150) a podobně.

Zdroj pro další patogenem idukovatelné promotory představuje rodina PR genu. Řada prvků v těchto promotorech se jeví jako výhodná. Tak region -364 až -288 zprostředkovává v promotoru salicylátovou specifikaci (Buchel a kolektiv (1996) Plant Mol Biol 30, 439-504). Sekvence 5-TCATCTTCTT-3' se znovu objevuje v promotoru ječmene p-l,3-glukanase a ve více než 30 dalších stresem indukovaných genech. Tento region vytváří v tabáku nukleární protein, jehož abundace se zvýší pomocí salicylátu. PR1 promotory z tabáku a arabidopsisu (EP-A 0 332 104, WO 98/035536) jsou vhodné jako patogenem indukovatelné promotory. Přednostní jsou „acidic PR-5 ”-(aPR5)-promotory z ječmene (Schweizer a kolektiv (1997) Plant Physiol 114: 79-88) a pšenice (Reimann a ·» ···· • » • · · · • · · · • · · · · • · · · · • · · ··

9 • · · · « · · « • 9 9 9 9999

9 9 9

9 kolektiv (1991) Plant Mol Biol 16: 329-331). Proteiny aPR5 akumulují během 4 až 6 hodin po napadení patogenem a vykazují jen velmi malou expresi pozadí (WO 99/66057). Zvýšenou patogenem indukovanou specifikaci lze získat vytvořením syntetických promotorů z kombinací patogenem responzivních prvků (Rushton a kolektiv (2002) Plant Cell 14, 749-762, WO 00/01830, WO 99/66057). Odborníkovi jsou známé i další patogenem indukovatelné promotory různých druhů (EP-A 1 062 356, EP-A 1 041 148, EP-A 1 032 684).

e) Na vývoji závislé promotory

Dalšími vhodnými promotory jsou například promotory specifické podle zrání ovoce, jako například promotor z rajčat (WO 94/21794, EP 409 625). Na vývoji závislé promotory náleží k části tkání specifikovaných promotorů, poněvadž vytváření jednotlivých tkání nastává přirozeně v závislosti na vývoji.

Zvláště přednostní jsou konstitutivní, jakož i listem a/nebo lodyhou specifikované, patogen indukovatelné a epidermis specifikované promotory, přičemž zejména přednostní jsou patogenem indukovatelné a epidermis specifické promotory.

Rovněž další promotory mohou být funkčně vázány s exprimovatelnou sekvencí nukleové kyseliny, která umožňuje expresi do dalších rostlinných tkání nebo jiných organismů, jako například bakterie E. coli. Jako rostlinné promotory přichází do úvahy všechny shora popsané promotory.

V expresních kazetách podle vynálezu a vektorech obsažené sekvence nukleové kyseliny mohou být funkčně vázány vedle promotoru s dalšími genetickými kontrolními sekvencemi. Pojem genetické kontrolní sekvence se rozumí široce a zahrnuje všechny takové sekvence, které mají vliv na provedení, nebo funkci expresních kazet podle vynálezu. Genetické kontrolní sekvence modifikují například transkripci a translaci v prokaryotických nebo eukaryotických organismech. Přednostně zahrnují expresní kazety 5'- transgenní exprimovatelné sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu promotor se specifikací pro embryonální epidermis a/nebo květy a 3' sekvenci terminátoru, jako • ·· ·· ···· ·* » • 4 4 4 4 · 4 »44 • 44 44 ♦ 444· ······ ···· ···· ··· ···· ·· · ··· ·· ·· ·· 44 4 přídavnou genetickou kontrolní sekvenci, jakož i případně další zbývající regulační prvky, a to funkčně vázané s transgenní exprimovatelnou sekvencí nukleové kyseliny.

Genetické kontrolní sekvence zahrnují také další promotory, prvky promotoru, nebo minimální promotory, které mohou modifikovat expresi řídící vlastnosti. Tak může pomocí genetických kontrolních sekvencí například nastat z hlediska tkáně specifická exprese přídavně závislá na stanovených stresových faktorech. Příslušné prvky jsou například popsány pro stres způsobený vodou, nebo kyselinu abscisinovou (Lam E a Chua NH, J Biol Chem 1991, 2žž (26): 17131-17135) a stres způsobený teplem (Schoffl F a kolektiv, Molecular & General Genetics 217 (2-3): 246-53, 1989).

Dalšími výhodnými kontrolními sekvencemi jsou například v Gram positivních promotorech amy a SPO2, v kvasinkových nebo houbových promotorech ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

V principu se mohou pro způsob podle vynálezu jako shora uvedené promotory použít všechny přírodní promotory se svými regulačními sekvencemi. Kromě toho se mohou s výhodou použít také syntetické promotory.

Genetické kontrolní sekvence zahrnují rovněž také 5'- netranslované regiony, introns nebo nekódovaný 3' region genů, jako například acetin-1 intron, nebo Adhl-S intronů 1, 2 a 6 (obecně: The Maize Handbook, kapitola 116, Freeling a Walbot, Eds., Springer, Nese York (1994)). Ukázalo se, že tyto signifikantní funkce mohou hrát roli při regulaci expresi genu. Tak se ukázalo, že 5' netranslované sekvence mohou posílit transientní expresi heterologických genů. Například pro posílení translace se uvádí 5'leadersekvence z tabákového mosaikového viru (Gallie a kolektiv (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) a podobně. Mohou rovněž vyžadovat speciální tkáň (Rouster J a kolektiv (1998) Plant J 15: 435-440).

Expresní kazeta může výhodně funkčně vázat jednu nebo více tak zvaných „enhancer sekvencí“ s promotorem, který umožňuje zvýšenou transgenní expresi sekvence nukleové kyseliny. Také na 3-konci transgenních exprimovatelných sekvencí nukleové • · · ·

kyseliny se mohou inzerovat přídavně výhodné sekvence, jako další regulační prvky nebo terminátory. Transgenně exprimovatelné sekvence nukleové kyseliny mohou být obsaženy v jedné nebo více kopiích v genovém konstruktu.

Jako kontrolní sekvence vhodné signály polyadenylizace jsou rostlinné signály polyadenylizace, přednostně takové, které v podstatě odpovídají T-DNA signálu polyadenylizace z Agrobacterium tumefaciens, zejména genu 3 T-DNA (octopin syntaze) Ti plastidu pTiACHS (Gielen a kolektiv (1984) EMBO J 3: 835 a následující) nebo jejich funkční ekvivalenty. Příkladem pro zvláště vhodné sekvence terminátoru jsou OCS (octopin-syntazový) terminátor a Nos (nopalin syntazový) terminátor.

Jako kontrolní sekvence se dále rozumí takové, které umožňují homolovou rekombinaci, případně inserci do genomu hostitelského organismu, nebo dovolují oddělení z geonomu. U homologové rekombinace se může například přírodní promotor stanoveného genu vyměnit za promotor speciálně pro embryonální epidermis a/nebo květ. Metody jako cre/lox technologie dovolují z hlediska tkáně specifické, podle okolností indukovatelné oddělování expresní kazety z geonomu hostitelského organismu (Sauer B (1998) Methods. 14 (4): 381-92). Zde stanovené sekvence se připojují k cílovému genu (lox sekvence) a později umožňují oddělení pomocí cre rekombinace.

Expresní kazety a z nich odvozené vektory mohou obsahovat další funkční prvky. Pojem funkční prvek se rozumí široce jako všechny takové prvky, které mají vliv na tvorbu, rozmnožení a funkci expresních kazet podle vynálezu, vektorů nebo transgenních organismů. Například, nikoliv však ve vymezujícím rozsahu, se uvádí:

a) Selekční markéry, které propůjčují rezistenci proti metabolickému inhibitoru, jako 2desoxyglukóza-6-fosforečnanu (WO 98/45456), antibiotikům nebo bioxidům, například herbicidům, jako například kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, nebo fosfmotricin a podobně. Zvláště přednostní jsou takové, které propůjčují rezistenci proti herbicidům. Například se uvádí: DNA sekvence, které kódují pro fosfintricinacetylové transferasy (PAT) a inaktivují inhibitory glutaminové syntaze (bar a pat gen), 5—enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntazové geny (EPSP synthasové • · • ·

geny), které propůjčují rezistenci proti Glykophosatu® (N-(fosfonomethyl)glycin), pro Glykophosat® degradující enzymy kódující gox gen (glyfosfatoxidoreduktaza), deh gen (kódující pro dehalogenazu, která inaktivuje dalapon), sulfonylurea- a imidazolin inaktivující acetolaktatsyntazy, jakož i bxn geny, které kódují pro bromoxynil degradující nitrilazové enzymy, aasa gen, který propůjčuje rezistenci proti antibiotiku apectinomycin, streptomycinfosfotranserazový (SPT) gen, který zajišťuje rezistenci proti streptomycinu, neomycinfosfotransferazový gen , který propůjčuje rezistenci proti kanamycinu nebo geneticidinu, hygromycinfosfotranserazový (HPT) gen, který zprostředkovává rezistenci proti hygromycinu, acetolaktasyntazový (ALS) gen, který propůjčuje rezistenci proti sulfonylmočovinovým herbicidům (například mutované ALS varianty s například S4 a/nebo Hra mutacemi).

b) Ohlašovací geny (reportergene), které jsou kódovány pro snadno kvantifíkovatelné protéiny a zajišťují prostřednictvím vlastní barvy nebo enzymové aktivity vyhodnocení efektivity transformace, nebo místa, nebo okamžiku exprese. Zvláště přednostní jsou přitom proteiny (Schebom E, Groskreutz D, Mol Biotechnik. 1999, 13 (1): 29-44), jako „green fluorescence protein“ (gfp) (Sheen a kolektiv (1995) Plant Journal 8(5): 777-784, Haseloff a kolektiv (1997) Proč Nati Acad Sci UASA 94 (6): 2122-2127, Reichel a kolektiv (1996) Proč Nati Acad Sci USA 93(12): 5888-5893, Tian a kolektiv (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271, WO 97/41228, Chui WL a kolektiv (1996) Curr Biol 6: 325-330, Leffel SM a kolektiv (1997) Biotechniques 23 (5): 9128), chloremphenicoltranferaza, luciferaza (Ow a kolektiv (1986) Science 234: 856859, Miller a kolektiv (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414), aequoringen (Prasher a kolektiv (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268), βgalactosidaza, R-locus gen (kódující protein, který v rostlinné tkáni reguluje produkci anthokyaninových pigmentů (červené zabarvení) a tak umožňují přímou analýzu aktivity promotoru bez přídavku přídavných pomocných látek, nebo chromogenních substrátů, Dellaporta a kolektiv, In: Chromosome Struktuře and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988), zvláště přednostní je β-glucuronidaza (Jefferson a kolektiv, EMBO J. 1987,6,3901-3907).

• ·

c) Prvky replikačního původu, které zajišťují rozmnožení expresních kazet podle vynálezu, nebo vektorů v například E.coli. Například se uvádí ORI (orign of DNA replication), pBR322 ori, nebo P15A ori (Sambrook a kolektiv: Molecular Cioning A Laboratory Manual, druhé vydání Cold Spring Barbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Prvky, které jsou potřebné pro agrobakterií zprostředkovanou transformaci rostlin, jako například pravé, nebo levé ohraničení T-DNA nebo regionu viru.

K selekci úspěšně homologicky rekombinovaných, nebo také transformovaných buněk je zpravidla potřebné přídavně přivést selekční markér, který propůjčuje nekombinovaným buňkám rezistenci proti biocidu (například herbicidu), inhibitoru metabolismu, jako 2-desoxyglukoza-6-fosforečnan (WO 98/45456), nebo antibiotiku. Selekční markér dovoluje selekci transformovaných buněk od netransformovaných (McCormik a kolektiv (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).

Zavedení expresní kazety podle vynálezu do organismu, nebo buňky, tkání, orgánů, částí, případně semen (přednostně do rostlin, případně rostlinných buněk, tkání, orgánů, částí a semen) se může s výhodou realizovat za použití vektorů, v nichž jsou expresní kazety obsaženy. Expresní kazeta se může do vektoru (například plastidu) zavést pomocí vhodné restrikČní aplikace. Vzniklý plasmid se nejprve zavede do E.coli. Správně transformovaná E.coli se selektuje, pěstuje a rekombinovaný plastid se získá pro odborníka běžnými postupy. K prověření jednotlivých kroků klonování mohou sloužit restrikční analýza a sekvencování.

Vektory mohou být například plasmidy, cosmidy, phageny, víry, nebo také agrobakterie. Ve výhodné variantě provedení se zavedení expresní kazety realizuje pomocí plasmidových vektorů. Přednostní jsou takové vektory, které umožňují stabilní integraci expresní kazety do hostitelského geonomu.

Vytvoření transformovaného organismu (případně transformované buňky, nebo tkáně) vyžaduje, aby se do příslušné hostitelské buňky vložila příslušná DNA, RNA, nebo protein.

Pro tento postup, který se označuje jako transformace (nebo transdukce, případně transfekce), se používá množství postupů (Keown a kolektiv (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). Tak se může DNA nebo RNA zavést například přímo pomocí mikroínjekce, nebo bombardováním sDNA překrytými mikročásticemi. Buňka se také může permeabilizovat chemicky například s polyethylenglykolem, takže DNA může pokračovat do buňky pomocí difúze. DNA může vzniknout také pomocí protoplastové fuze s jinými DNA obsahujícími jednotkami, jako minicely, buňky, lysosom, nebo liposom. Dalším vhodným postupem k zavedení DNA je elektroporace, u níž se buňky permeabilizují reversibilně pomocí elektrického impulsu. Příslušné postupy jsou popsány (například Bilang a kolektiv (1991) Gene 100: 247-250, Scheid a kolektiv (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112, Guerche a kolektiv (1987) Plant Science 52: 111-116, Neuhause a kolektiv (1987) Tudor Appl Gent 75: 30-36, Klein a kolektiv (1987) Nátuře 327: 70-73, Howell a kolektiv (1980) Science 208: 1265, Horsch a kolektiv (1985) Science 227: 12291231, DeBlock a kolektiv (1989) Plant Physiology 91: 694-701, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weisbach, eds.) Academie Press lne. (1988) a Methods in Plant Molecular Biology (Schuler a Zielinski, Academie Press lne. (1989)).

U rostlin se přitom popsané postupy k transformaci a regeneraci rostlin z rostlinných tkání nebo rostlinných buněk používají k dočasné nebo stabilní transformaci. Vhodnými postupy jsou především protoplastenová transformace pomocí příjmu DNA indukovaného polyethylenglykolem, způsob s genovým kanónem, tak zvaný „particle bombardement“ postup, elektroporace, inkubace sušených embryí v DNA obsahujícím roztoku a mikroínjekce.

Vedle těchto „přímých“ transformačních postupů se může transformace provádět také pomocí bakteriální infekce prostřednictvím agrobakterie tumefaciens nebo agrobakterie rhizogenes. Agrobakterií zprostředkovaná transformace je nejvíce vhodná

pro buňky dvouděložných rostlin. Způsoby jsou například popsány v materiálu od Horsche RB a kolektivu (1985) Science 225: 1229 a následující.

Jestliže se používají akrobakterie, pak je expresní kazeta integrována do speciálního plastidu, buď do přechodového vektoru (anglicky: shuttíe or intermediate vector) nebo binárního vektoru. Jestliže se má použít k transformaci Ti nebo Ri plasmid, je alespoň pravá hranice, zpravidla však pravá a levá hranice T-DNA Ti nebo Ri plasmidu spojena se zaváděnou expresní kazetou.

Přednostně se používají binární vektory. Binární vektory mohou replikovat jak v E.coli, tak také v agrobakterii. Obsahují zpravidla gen selekčního markéru a linker nebo polylinker překrývající se s pravou a levou T-DNA hraniční sekvencí. Mohou se přímo transformovat do agrobakterie (Holsters a kolektiv (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Gen selekčního markéru dovoluje selekci transformované agrobakterie a je tvbořen například nptll genem, který propůjčuje rezistenci proti kanamycinu. V tomto případě jako hostitelský organismus fungující agrobakterie by již měla obsahovat plasmid s virovým regionem. To je potřebné pro přenos T-DNA na rostlinnou buňku. Takto transformovaná agrobakterie se může použít k transformaci rostlinných buněk. Použití T-DNA k transformaci rostlinných buněk je intenzivně zkoumáno a popisováno (EP 120516, Hoekema, In: The Bojary Plant Vector Systém, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Albasserdam, kapitola V, An a kolektiv (1985) EMBO J 4: 272-287). Různé binární vektory jsou známé a lze je zčásti získat komerčně, jako například pBI101.2, nebo pBIN19 (Lontech Laboratoriem, lne. USA).

Jsou popsány i další k expresi v rostlinách vhodné promotory (Rogers a kolektiv (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277, Schardl a kolektiv (1987) Gene 61: 1-11, Berger a kolektiv (1989) Proč Nati Acad Sci USA 86: 8402-8406).

Přímé postupy transformace jsou vhodné pro každý organismus a všechny druhy buněk.

9

9999

9

V případě injekce, nebo elektroporace DNA, případně RNA do rostlinných buněk nejsou stanoveny pro používaný plastid žádné zvláštní podmínky. Mohou se použít jednoduché plastidy, jako plastidy pUC řady. Jestliže se mají z transformovaných buněk regenerovat celé rostliny, pak je potřebné, aby se na plastidu nalézaly přídavné selekční markéry.

Stabilně transformované buňky, to znamená takové, které obsahují zavedenou DNA integrovanou do DNA hostitelského organismu, se mohou netransformované selektovat, když je selekční markér součástí zavedené DNA. Jako markér může například sloužit každý gen tím, že může propůjčit rezistenci proti antibiotiku nebo herbicidům (jako kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin nebo fosfinotricin a podoně). Transformované buňky, které exprimují takový gen marekeru, jsou schopny přežít za přítomnosti koncentrací příslušného antibiotika nebo herbicidu, které umrtvují netransformovaný zralý druh. Příklady jsou shora uvedeny a zahrnují především bar gen, který propůjčuje rezistenci proti herbicidu fosfinotricin (Rathore KS a kolektiv (1993) Plant Mol Biol 21 (5): 871-884), nptn gen, který propůjčuje rezistenci proti kanamycínu, hpt gen, který propůjčuje rezistenci proti hygromycinu, nebo EPSP gen, který propůjčuje rezistenci proti herbicidu glyphosat. Selekční markér dovoluje selekci transformovaných buněk od netransformovaných (McCormick a kolektiv (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Získané rostliny se mohou pěstovat a křížit obvyklým způsobem. Dvě nebo více generací se má kultivovat, aby se zabezpečilo, že genomická integrace je stabilní a dědičná.

Shora uvedené způsoby jsou například popsány v Jenesovi B a kolektivu (1993) Techniques for Gene Transfer, v Trangenic Plants, svazek 1, Engineering and Utilization, vybráno od SD Kunga a R Wu, Academie Press, str. 128-143, jakož i vPotrykusovi (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225). Přednostně se exprimovaný konstrukt klonuje do vektoru, který je vhodný k transformování agrobakterie tumefaciens, například pBinl9 (Bevan a kolektiv (1984) Nucl Acids Res 12: 8711 a následující).

Jakmile byla vytvořena transformovaná rostlinná buňka, může se obdržet úplná rostlina za použití odborníkovy známých postupů. Z dosud nediferencované buněčné • 4444 hmoty se může známým způsobem indukovat vznik výhonku a kořene. Získané výhonky mohou růst a pěstovat se.

Odborníkovi jsou známé postupy k regeneraci celých rostlin z rostlinných buněk a rostlinných částí. Příslušné postupy jsou k tomu popsány Fennellem a kolektivem (1992) Plant Cell Rep. 11. 567-570, Stoeger a kolektiv (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278, Jahne a kolektiv (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533.

Způsob podle vynálezu se může s výhodou kombinovat s dalšími způsoby, které způsobují rezistenci proti patogenům (například proti hmyzu, houbám, bakteriím, nematodům a podobně), rezistenci proti stresu, nebo jiné zlepšení rostlinných vlastností. Příklady jsou uvedeny v Dunwelloví JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000, 51 spec. č., str. 487-96.

Další předmět vynálezu se týká RacB proteinu z ječmene podle SEQ ID NO: 2, jakož i jeho dominantně negativní varianty, například popsané pomocí SEQ Π) NO: 7.

Další předmět vynálezu se týká sekvencí nukleové kyseliny kódované pro RacB protein z ječmene, přednostně sekvence nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 1, kní komplementární sekvence nukleové kyseliny a prostřednictví degenerace genetického kódu odvozených sekvencí.

Další předmět vynálezu se týká polypeptidů kódovaných pro funkční ekvivalenty RacB proteinu z ječmene podle SEQ ID NO: 35, 37, nebo 39.

Další předmět vynálezu se týká sekvencí nukleové kyseliny kódovaných pro funkční ekvivalenty RacB proteinu z ječmene, přednostně sekvence nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 34, 36, nebo 38, k ní komplementární sekvence nukleové kyseliny a sekvencí odvozených degenerací genetického kódu.

Další předmět vynálezu se týká transgenních expresních kazet, které obsahují sekvence nukleové kyseliny podfle vynálezu. V transgenních expresních kazetách podle • « · ·

I · · · ·

,.. ·»··· • · · · > ·· · vynálezu je sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z ječmene s alespoň jedním genetickým kontrolním prvkem podle shora uvedené definice vázána tak, že se může realizovat exprese (transkripce a případně translace) v libovolném organismu, přednostně v rostlinách. Pro to vhodné genetické kontrolní prvky jsou popsány shora. Transgenní expresní kazety mohou také obsahovat další shora definované funkční prvky. Inzerovaná sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z ječmene může být v expresní kazetě izerována vsensní, nebo v antisensní orientaci a tím vést k expresi sensní, nebo antisensní RNA. Podle vynálezu jsou také transgenní vektory, které obsahují transgenní expresní kazety.

Pod pojmem „trangenní“ se míní vzhledem k například sekvenci nukleové kyseliny, expresní kazetě, nebo vektoru obsahujícímu uvedenou sekvenci nukleové kyseliny, nebo organismu transformovanému s uvedenou sekvencí nukleové kyseliny, expresní kazetou, nebo vektorem všechny takové postupy genového inženýrství realizované konstrukce, v nichž se nachází buď

a) RacB sekvence nukleové kyseliny, nebo

b) genetická kontrolní sekvence funkčně vázaná sRacB sekvencí nukleové kyseliny, například promotor, nebo

c) a) a b) nikoliv ve své přirozeném, genetickém prostředí, nebo byly modifikovány postupy genetického inženýrství, přičemž modifikací může být například substituce, adice, deletace, inverse, nebo inzerce jedné nebo více nukleotidových skupin. Přirozeným genetickým prostředím se míní přirozený chromozomální lokus v původním organismu, nebo v genomickém registru. U genomického registru je přirozené genetické prostředí přednostně alespoň ještě zčásti zachováno. Prostředí se alespoň na jedné straně kryje se sekvencí nukleové kyseliny a má sekvenční délku alespoň 50 bp, přednostně alespoň 500 bp, zvláště přednostně alespoň 1000 bp, zejména 5000 bp. Přírodně se vyskytující expresní kazeta, například přírodně se vyskytující kombinace RacB promotoru s příslušným RacB ·« ··♦·

genem, bude transgenní expresní kazetou, když se tato změní nikoliv přírodním, ale syntetickým („umělým“) postupem, jako například mutací. Příslušné způsoby jsou popsány (US 5,565,350, WO 00/15815, viz také shora uvedené).

Další předmět vynálezu se týká transgenního organismu transformovaného s alespoň jednou sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu, expresní kazety, nebo vektoru podle vynálezu, jakož i buněk, buněčných kultur, tkáně a částí, jako například u rostlinných organismů listů, kořenů a podobně, nebo výhonků z těchto organismů. Organismus je míněn široce a zahrnuje prokaryotické a eurokaryotické organismy, přednostně bakterie, kvasinky, houby a zvířecí a rostlinné organismy.

Přednostně se uvádí

a) houby jako Aspergillus, Eremothecium, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, nebo další v Indián Chem Eng Section B Vol 37, No 1, 2 (1995) na straně 15, v tabulce 6 popsané houby. Přednostní je vláknitá Hemiascomycet Ashbya gossypii nebo Eremothecium ashbyii.

b) Kvasinky jako Candida, Saccharomyces, Hansenula, nebo Pichia, zvláště přednostní jsou Sacharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris (ATCC Accession č. 201178).

c) Rostliny podle shora uvedené definice pro rostliny.

d) Zvláště přednostní jsou zvířecí savci jako pes, kočka, ovce, koza, slepice, myš, krysa, hovězí, nebo kůň. Přednostní zvířecí buňky jsou CHO, COS, HEK293. Přednostní buňky hmyzu jsou Drosophíla S2 a Spodoptera Sf9, nebo Sí21.

e) Prokaryonické organismy jako Gram-positivní, nebo Gram-negativní bakterie, jako Acetobacter, Gluconobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia (především Escherichia coli), Serratia, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, nebo Klebsiella.

·· ···· ·« · • · · • · · · • · ··· • ♦ · • · *

Jako hostitelské nebo výchozí organismy, které jsou přednostními transgenními organismy, se uvádí především rostliny podle shora uvedené definice. V rámci vynálezu jsou všechny druhy vyšších a nižších rostlin rostlinné říše. Patří sem rovněž zralé rostliny, semena, výhonky a klíčky, jakož i z nich odvozené části, rozmnožovací štěpy a kultury, například buněčné kultury. Zralými rostlinami se míní rostliny v každém libovolném vývojovém stádiu klíčku. Klíčkem se míní mladá nezralá rostlina v časném vývojovém stádiu. Zejména jako hostitelské organismy přednostní rostliny jsou rostliny, na které se může použít způsob podle vynálezu k docílení patogenní rezistence podle shora uvedených kriterií. Zvláště přednostní jsou jednoděložní rostliny jako pšenice, oves, proso, ječmen, žito, kukuřice, rýže, pohanka, sorgum, triticala, lněná semena, cukrová třtina, než dvouděložní kulturní rostliny jako řepka, kanola, řeřicha, arabidopsis, kapusta, sója, vojtěška, hrách, rostliny fazolí, podzemnice, brambory, tabák, rajče, paprika, slunečnice, salát, kalendula, meloun, tykev, nebo cuketa.

Vytvoření transgenních organismů se může realizovat shora popsaným způsobem pro transformaci nebo transfekci organismů.

Další předmět vynálezu se týká použití transgenních organismů podle vynálezu a z nich odvozených buněk, buněčných kultur, částí, jako například kořenů a listů transgenních organismů, a transgenních množících prostředků jako osiva, nebo plodů k výrobě potravin, nebo krmivá, farmaceutik, nebo čistých chemikálií.

Přednostní je rovněž způsob rekombinantní výroby farmaceutika nebo čistých chemikálií v hostitelských organismech, přičemž se hostitelský organismus transformuje s jednou ze shora popsaných expresních kazet, která obsahuje jeden nebo více strukturních genů, které kódují pro požadovanou čistou chemikálii, nebo katalyzují biosyntézu požadované jemné chemikálie, načež se transformovaný hostitelský organismus pěstuje a následně se z něho izoluje požadovaná čistá chemikálie. Tento způsob je široce použitelný pro čisté chemikálie jako enzymy, vitamíny, aminokyseliyn, cukr, mastné kyseliny, přírodní a syntetické pochutiny, aromatické látky a barviva. Zvláště přednostní je produkce tokoferolů a tokotrinolů, jakož i karotenoidů. Pěstování transformovaných hostitelských organismů, jakož i izolace z hostitelských organismů se provádí pro odborníka známými ····

♦ ·*.

·· · · • · · * • 9 · · • · 9

999 99

9

9 9

9 9 9

9 ···· • · * ·· * způsoby. Výroba farmaceutka, jako například protilátek nebo vakcín, je popsána u Hooda EE a Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnik 10 (4): 382-6 a Ma JK, Vinea ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92.

Sekvence

1. SEQIDNO: 1: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z ječmene (Hordeum vulgare).

2. SEQIDNO: 2: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB protein z ječmene (Hordeum vulgare).

3. SEQ ID NO: 3: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z rýže (Oryza sativa).

4. SEQ ID NO: 4: Sekvence aminokyseliny kódovaná RacB protein z rýže (Oryza sativa).

5. SEQ ID NO: 5: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z kukuřice (Zea mays).

6. SEQ ID NO. 6: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB protein z kukuřice (Zea mays).

7. SEQIDNO: 7: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro dominantně negativní variantu

RacB proteinu z ječmene (Horedeum vulgare).

8. SEQIDNO: 8: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro dominantně negativní variantu

RacB proteinu z rýže (Oryza sativa).

9. SEQ ID NO: 9: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro dominantně negativní variantu

RacB proteinu z kukuřice (Zea mays).

10. SEQ ID NO: 10: Oligonukleotidprimer ONP-1

-GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3'

11. SEQ ID NO: 11: Oliginukleotidprimer ONP-2

-GTCG ACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3’

12. SEQ ID NO: 12: RACE-RacB primer

-gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3'

13. SEQ ID NO: 13: GeneRacer™ 5-primer:

-CGACTGGAGC ACGAGGAC ACTGA-3

14. SEQ ID NO: 14: GeneRacer™ 5'-nested primer

-GGAC ACTGAC ATGGACTGAAGGAGT A-3

15. SEQ ID NO: 15: RacB-sensní primer

-gttcatcaagtgcgtcaccgtg-3'

16. SEQ ID NO: 16: RacB-antisesní primer '-ttagcttcctcagttcttccctg-3'

17. SEQ ID NO: 17: BAS-sensní primer

-cgcgccgcagccgagtacgac-3'

18. SEQ ID NO: 18: BAS-antisensní primer

-gtcacaaaaacacatgtaacc-3'

19. SEQ ID NO: 19: OXLP-sensní primer '-ggccgacatgcattcaccag-3'

20. SEQ ID NO: 20: OXLP-antisesní primer '-catctgatattgctgggtctg-3 ’ • · ·· ··· · · · · ·· ·· · · · · • · · · · · · · · • ··· · ··· ···· • · · ·· ·· ·· *

21. SEQ ID NO: 21: UBI-sensní primer

5'-ccaagatgcagatcttcgtga-3'

22. SEQ ID NO: 22: UBI-antisensní primer

-ttcgcgataggtaaaagagca-3'

23. SEQ ID NO: 23: M13-fwd primer

-GT AAAACGACGGCC AGTG-3'

24. SEQ ID NO: 24: M13-Rev primer

-GGAAACAGCTATGACCATG-3’

25. SEQ ID NO: 25: HvRopÓ LEFT primer

-GTGGAGGCGCGGCGAGA-3 ’

26. SEQ ID NO: 26: HvRopÓ RIGHT primer

-CCATGCTTCATCTCCATAGTCA-3 ’

TJ. SEQ ID NO: 27: HvRacD LEFT primer

-ggatccCGATTCC ATC AGGAAAGCTAT-3'

28. SEQ ID NO: 28: HvRacD RIGHT primer

-gtcgacGCGAGACACTGCAAAACAAA-3'

29. SEQ ID NO: 29: HvRop4 LEFT primer

-GGATCCttctcgtccatttagccggc-3'

30. SEQ ID NO: 30. HvRop4 RIGHT primer '-GTCGACtgatcacttgaagcatgccag-3'

31. SEQ ID NO . 31: RacBS BamHI primer

-GGATCCG ATGAGCGCGTCCAGGTT-3 ’

32. SEQ ID NO: 32: RacB3 Sáli primer

-GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3'

33. SEQ ID NO: 33: VI5 mutagenesní primer

5-ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3'

34. SEQ ID NO: 34: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRopó z ječmene (Hordeum vulgare).

35. SEQ ID NO: 35: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRopó z ječmene (Horderum vulgare).

36. SEQ ID NO: 36: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRacD z ječmene (Hordeum vulgare).

37. SEQ ID NO: 37: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRacD z ječmene (Horderum vulgare).

38. SEQ ED NO: 38: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRop4 z ječmene (Hordeum vulgare).

39. SEQ ID NO: 39: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog HvRop4 z ječmene (Horderum vulgare).

40. SEQ ID NO: 40: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog Zea mays

ROP 6 (GenBank Acc.-No.:AJ278665).

41. SEQ ID NO: 41: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog Zea mays

ROP6.

• ·· ·· ·· · · ·· ···· ·· · · • · · · · · · · · · · · · ··· •·· ·· ·· ·· ··

42. SEQ ID NO: 42:	Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog Oryza sativa subsp. japonica RACDP (RACD) (GenBank Acc.-No.: AF218381).
43. SEQ ID NO: 43:	Aminosekvence kódovaná pro RacB homolog Oryza sativa subsp. japonica RACDP.
44. SEQ ID NO: 44:	Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog Oryza sativa ROP4 (GenBank Acc.-No.: AF380335).
45. SEQ ID NO: 45:	Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog Oryza sativa ROP4.
46. SEQ ID NO: 46:	Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog Zea mays RACA(GenBank Acc.-No.: AF126052).
47. SEQ ID NO: 47:	Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog Zea mays RACA.
48. SEQ ID NO: 48:	Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Hoderum vulgare (GenBank Acc.-No.: BM816965).
49. SEQ ID NO: 49:	Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At3g513OO).
50. SEQ ID NO: 50:	Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At3g51300).

51. SEQ ID NO: 51: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At2g17800).

52. SEQ ID NO: 52: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At2g17800).

53. SEQ ID NO: 53: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At4g35950).

54. SEQ ID NO: 54: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At4g35950).

55. SEQ ID NO: 55: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (Atlg75840).

56. SEQ ID NO: 56: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (Atlg75840).

57. SEQ ID NO: 57: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At4g35020).

58. SEQ ID NO: 58: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At3g35020).

59. SEQ ID NO: 59: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (Atlg20090).

60. SEQ ID NO: 60: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (Atlg20090).

61. SEQ ID NO: 61: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thalia (At5g45970).

62. SEQ ID NO: 62: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At5g45970).

63. SEQ ID NO: 63: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At3g48040).

64. SEQ ID NO: 64: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At3g48040).

65. SEQ ID NO: 65: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At5g62880).

66. SEQ ID NO. 66: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At5g62880).

67. SEQ ID NO: 67: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At4g28950).

68. SEQ ID NO: 68: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At4g28950).

69. SEQ ID NO: 69: Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At2g44690).

70. SEQ ID NO: 70: Sekvence aminokyseliny kódovaná pro RacB homolog z Arabidopsis thaliana (At2g44690).

71. SEQ ID NO: 71: Oligonukleotidprimer Fra 186

-ATGAGCGCGTCC AGGTTCATA-3'

72. SEQ ID NO: 72: Oligonukleotidprimer Fra 187

-ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3'

73. SEQ ID NO: 73: Trangenní expresní vektor pSUN3NIT_AtRacB_s pro expresi

Arbidopsis thaliana RacB v sensní orientaci.

• · • · · ·

74. SEQ ID NO: 74: Transgenní expresní vektor pSUN3NIT_AtRacB_as pro expresi

Arbidopsis thaliana RacB v antisesní orientaci.

75. SEQ ID NO: 75: Transgenní expresní vektor pSUN3NIT_HvRacB_s pro expresi RacB fragmentu ječmene v sensní orientaci.

76. SEQ ID NO: 76: Transgenní expresní vektor pSUN3NIT_HvRacB_s pro expresi RacB fragmentu ječmen v antisensní orientaci.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je dále blíže objasněn pomocí výkresů.

Obr. 1 znázorňuje srovnání sekvencí aminikyselin ječmene RacB, iýže Racb, kukuřice RacB, jakož i lidských Raci a Rac2 proteinů.

Obr. 2 znázorňuje expresi RacB v epidermální tkáni,

Obr. 3 RacB se konstitutivně exprimuje ve srovnání s rezistentní linií u ječmene.

Obr. 4 „RNA interference „ s RacB-dsRNA snižuje penetrační efektivitu práškové plísně BghA6 v ječmeni.

Obr. 5 znázorňuje vliv genetického pozadí na funkci RacB.

Obr. 6 znázorňuje změnu exprese konstitutivně aktivního RacB mutantu v ječmeni rodu Pallas.

Obr. 7 znázorňuje pasmidovou kartu k expresnímu vektoru pGY-1 (Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54, Shinshi H a kolektiv (1990) Plant Mol Biol 14: 357-368).

• · · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Oblasti se šedým základem ukazují na obr. 1 polohu G1 prvku (GXXXXGKS/T, aminokyseliny 13 až 20), G2 účinného regionu (aminokyselina 29 až 45), G3 prvek (LWDTAGQ, aminokyselina 58 až 64), G4 prvku (TKXD, aminokyselina 118 až 121), prvek (EXS) a C terminálového motivu isoprenylace (CXX, Hassanain HH a kolektiv (2000) Biochem Biophys Res Commun. 272(3): 783-8). Spojovací čárky ukazují sekvenční mezery. Hvězdičky představují identické aminokyseliny ve všech homologách. Aminokyseliny, které jsou jednak mezi ječmenem a jednak kukuřicí a rýží rozdílné, jsou znázorněny bíle na černém základu. Poloha, která se k přijetí dominantně negativní RacB varianty změní, je označena nad sekvencí černým trojúhelníkem.

Na obr. 2 je znázorněna RT-PCR z RNA z ječmene Pallas a BCPMlal2 (P10) 24 hodin po inokulaci („hai“ hours after inoculation“) sBghA6. K extrakci RNA byly odděleny abaxiálně epidermální pásy (E, z inokulovaných míst na listě) od mesofylu a adaxialního epidermisu (M). Ubiquitin 1 (Ubi) funguje jako markér pro z hlediska tkáně specifickou expresi, OXLP jako positivní kontrola pro genovou expresi v epidermisu, Bas jako positivní kontrola pro genovou expresi v mesophylových buňkách. PT-PCR byla provedena, jak je popsáno dole, s25 amplifikačními cykly. PT-PCR produkty byly denaturovány v gelu a pomocí antisesní RNA sondy za přísných podmínek detekovány.

K obr. 3 se uvádí, že RNA byla z druhu Ingrid (mlo, Rorl, Bgh susceptibelní), BCIngrid mlo5 (mlo5, Rorl, Bgh resistentní) a A89 (mlo5, rorl, BghA6 středně susceptibelní) izolována bezprostředně před inokulaci (0 0), případně 8, 15 a 24 hodin po inokulaci s Bg h, jakož i 24 hodin potom z neinokulovaných kontrolních rostlin (24 0). Ubiquitin 1 (Ubi) se použil jako markér pro konstitutivní expresi, OXLP jako posivní kontrola pro Bgh indukovanou genovou expresi v epidermální vrstvě. RT-PCR pro RacB a Ubi byla provedena, jak je popsáno, s 25 amplifikačními cykly. PCR produkty byly denaturovány v gelu a detekovány pomocí antisesních zkoušek za přísných podmínek.

K obr. 4 se uvádí, že relativní penetrační efektivita (RPE) byla stanovena v šesti individuálních pokusech při inokulaci sBgh z ječmene cv Pallas. RPE se vypočítá jako ···· rozdíl penetrační efektivity u RacB-dsRNA transformovaných buněk a penetrační efektivity u kontrolních dsRNA transformovaných buněk (zde je průměrná penetrační efektivita 57%). Procentuální RPE (%-RPE) se vypočítá z RPE mínus 1 a násobeno 100.

(PE u RacB-dsRNA transformovaných buněk)

RPE =---(PE u kontrolních dsRNA transformovaných buněk) %-RPE= 100x(RPE-l)

Černé sloupce představují %-RPE při evaluaci alespoň 100 interakčních míst pro nezávislý pokus. Bílý sloupec představuje průměrné %-RPE z experimentů s RacB-dsRNA („RACB-dsRNA“).

Část označená „Control“ představuje souběžné experimenty s kontrolní dsRNA.

%-RPE byla v buňkách, které byly ukončeny Racb-dsRNA, zřetelně nižší ve srovnání s buňkami, které byly bombardovány s kontrolní dsRNA (TR: lidský thyroidreceptor dsRNA).

%-RPE byly v 5 nezávislých experimentech podrobeny inokulaci ječmene cv Pallas, Ingrid nebo A89 s BghA6, který byl předtím transformován s RacB-dsRNA.

%-RPE je v ječmeni Pallas (Mlo Rorl, černé sloupce, experiment 1 a 2), nebo Ingrid (Mlo Rorl, černé sloupce, experiment 3, 4 a 5) zřetelně redukováno. %-RPE susceptibilních mutantů A89 (mlo5 rorl, černé sloupce, experimenty 1 až 5) se však nesnížilo. Bíle sloupce udávají střední hodnotu.

K obr. 6 se uvádí, že konstitutivně aktivní mutanty ječemene RACB (výměna G>V na poloze 15, RacB-V125) byly přechodně přeexperimovány za použití expresního konstruktu pGY-RacBV15 v 5 nezávislých experimentech do ječmene Pallas. Ke srovnání byly provedeny příslušné pokusy s vektorem bez RacB insertu (pGY).

Exprese konstitučních Racb mutantů způsobuje signifikantně zvýšenou náchylnost k napadení patogeny ve srovnání s kontrolními vzorky (obr. 6A). Relativní susceptibilita proti houbovým patogenům je ve všech případech zvýšená (obr. 6B). Také tyto výsledky dokládají klíčovou íunkci racB při patogenní ochraně.

Příklady

Obecné postupy:

Chemická syntéza oligonukleotidu se například může provést známým způsobem podle fosfoamiditového postupu (Voet, Voet, 2. vydání, Wiley Press New York, str. 896897). V rámci vynálezu prováděné klonovací kroky, jako například restrikční štěpení, elektroporeza v agarosovém gelu, čištění DNA fragmentů, přenos nukleových kyselin na nitrocelulózu a nylonové membrány, vazba DNA fragmentů, transformace E.coli buněk, pěstování bakterií, množení fagenem a sekvenční analýzou rekombinovaně DNA se provádí, jak je popsáno u Sambrooka a kolektivu (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6. Sekvencováním rekombinovaná DNA molekula vznikne pomocí laserového fluorescenčního zařízení od firmy MWG-Licor postupem podle Sangera (Sanger a kolektiv (1977) Proč Nati Acad Sci USA 74: 5463-5467).

Příklad 1: Rostliny, patogeny a inokulace

Ječmen Ingrid pochází od Jamese McKeye, University of Uppsala, Švédsko. Ječmen Pallas a křížená BCJngrid-mlo5 byla připravena k použití Lisa Munkem, Department od Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Dánsko. Je popsána jeho příprava (kolster P a kolektiv (1986) Crop Sci 26: 903-907). Linie A89 byla připravena Paulem Schulze-Lefertem (Max-Plank-Institut fur Zůchtungsforschung, Kóln, Německo).

až 36 hodin v temnu na vlhkém filtračním papíře předklíčené semeno, pokud není popsáno jinak, je cca 5 zrn položeno na okraji čtyřhranné misky (8x8 cm) v půdě ·· ···· • to · typu P, je zakryto zeminou a pravidelně zeléváno vodou z vodovodu. Všechny rostliny byly kultivovány v klimatizované komoře při teplotě 16 až 18 °C, relativní vlhkosti vzduchu 50 až 60 % a při cyklu 16 hodin osvitu s 3000, respektive 5000 luxy (hustaota světelného toku 50, respektive 60 pmols⁴nť²) a 8 hodin temna po dobu 5 až 8 dnů a ve stádiu klíčků se použily v pokusech. U experimentů, u nichž se provádí aplikace na primárních listech, byly tyto listy plně vyvinuty.

Před provedením transfekčních pokusů byly rostliny kultivovány v klimatizované komoře přes den při teplotě 24 °C, přes noc při 20 °C, relativní vlhkosti vzduchu 50 až 60 % a při cyklu 16 hodin osvitu s 30000 luxy a 8 hodin tmy.

Pro inokulaci rostlin ječmene byla použita Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. hordei Em. Marchal plemene A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6). Tato byla připravena Institutem fór Biometri, JLU GieBen. Pozdější chov inokulumu se prováděl v klimatizovanéých komorách za stejných podmínek, pomocí přenosu konidií napadeného rostlinného materiálu na 7 dní staré rostliny ječmene cv. Golden Promise při hustotě 100 konidií/mm².

Inokulace s BghA6 nastala za použití 7 dní starých klíčků prostřednictvím zásypu konidiem již napadených rostlin se 100 konidiemi na mm² (pokud se neuvádí něco jiného).

Příklad 2: RNA extrakce

Veškerá RNA byla extrahována z 8 až 10 primárních listových segmentů (délka 5 cm) pomocí „RNA Extraction Buffer“ (AGS, Heidelberg, Německo).

Ktomu byl sklizen centrální segment primárního listu o délce 5 cm a homogenizován v tekutém dusíku ve hmoždíři. Homogenizovaná hmota byla uložena až k RNA extrakci při -70 °C.

Z hluboko mraženého listového materiálu byla s pomocí RNA extrakční sady (AGS, Heidelberg) extrahována veškerá RNA. K tomu bylo 200 mg hluboko mraženého ·· ···· • · • 9 9

9

9 9

9 9 9

9 9 9999

9 9

9 listového materiálu převrstveno v mikroodstřeďovacích trubicích 1,7 ml RNA extrakčním pufrem (AGS) a obsah byl ihned rychle míchán. Po přídavku 200 μΐ chloroformu se znovu dobře míchalo a při teplotě okolí se 45 min třepalo pomocí horizontálního třepacího zařízení při 200 ot./min. Následně se k oddělení fází 15 min odstřeďovalo při 20000 g a 4 °C, homí vodná fáze se převedla do nových mikroodstřeďovacích trubiček a spodní se odložila. Vodná fáze se znovu čistila 900 μΐ chloroformu, potom se 3 krát 10 sekund homogenizovala a znovu odstřeďovala a odebrala se. K vysrážení RNA bylo potom přidáno 850 μΐ 2-propanolu, vodná fáze se homogenizovala a odstavila se na 30 až 60 min. na led.. V návaznosti na byla tato fáze odstřeďována, opatrně byl dekantován přesah, byly pipetovány 2 ml 70 %ního etanolu (-20 °C), fáze se promíchala a znovu se 10 min. odstřeďovala. Přesah byl potom znovu dekantován a peleta byla opatrně pomocí pipety, předtím než se usuší v proudu čistého vzduchu, uvolněna ze zbytků tekutiny. Potom byla RNA rozpuštěna v 50 μΐ DEPC vody na ledu, promíchala se a 5 minut se odstřeďovala. 40 μΐ přesahu bylo převedo jako RNA roztok do mikroodstřeďovacích trubiček a uloženo při -70 °C.

Koncentrace RNA byla stanovena fotometricky. K tomu byl RNA roztok zředěn v poměru 1:99 destilovanou vodou a změřena při 260 nm (fotometr DU 7400, Beckman) extinkce (E260 nm “ 1 při 40 pg RNA/ml). Podle zjištěného obsahu RNA byly koncentrace RNA roztoků následně vyrovnány DEPC vodou na 1 pg/μΐ a překontrolovány v agaroselovém gelu.

K přezkoušení RNA koncentrací v horizontálním agaroselovém gelu (1% agarosy v 1 x MOSS pufru s 0,2pg/ml ethidiumbromidu) se rozpustilo 1 μΐ RNA roztoku s 1 μΐ 10 x MOPS, 1 μΐ barevného markéru a 7 μΐ DEPC vody, podle své velikosti se 1,5 hodiny odděluje při napětí 120 V v gelu v 1 x MOPS v běžném pufru a fotografuje v UV světle. Případné rozdíly koncentrace RNA extraktů se vyrovnají pomocí DEPC vody a přizpůsobení se znovu přezkouší v gelu.

Příklad 3: Klonování RacB cDNA sekvence z ječmene ·· ····

Fragmenty cDNA, potřebné k izolaci HvRacB cDNA, jejímu klonování, sekvencování a přípravě sond, byly získány prostřednictvím RT-PCR za použití postupu „one step RT-PCR Kit“ (Life Technologies, Karlsruhe, Německo, nebo Qiagen, Hilden, Německo). Ktomu se použilo veškeré RNA ze semena ječmene jako matrice. RNA byla izolována z ječmene Pallas 3, 5 a 7 dní po klíčení. Kromě toho byla RNA z ječmene Pallas a zpětně zkřížených linií s mlo5, Mlg nebo Mlal2 1, 2 a 5 dnů po inokulaci s BghA6 7 den po klíčení. Pro RT-PCR se použije následující primer:

ONP-1 5 -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3' (SEQ ID NO: 10) a

ONP-2 5 -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3' (SEQ ID NO: 11)

Pro reakci (vsázka 25 μΐ) se použije 1000 ng veškeré RNA, 0,4 mM dNTPs, 0,6 mM OPN-1 a OPN-2 primer, 10 μΐ Rase inhibitoru a 1 μΐ enzymmixu v lx RT pufru (one step RT-PCR Kit, Qiagen, Hilden).

Používá se následující teplotní program (PCT-100TM Modell 96V, MJ Research, lne, Watertown, Massachussetts):

cyklus po dobu 30 min při 50 °C 1 cyklus po dobu 150 s při 94 °C cyklů při 94 °C po dobu 45 s, 55 °C po dobu 1 min a 72 °C po dobu 2 min cyklus při 72 °C po dobu 7 minut.

PCR produkt byl oddělen pomocí 2 % w/v elektroporezy v agaroselovém gelu. Obdržel se RT-PCR produkt o vesměs 642 bp, přičemž sestával z RacB sekvence (SEQ ID NO: 1) a terminálních sekvencí kódovaných pro rozhraní restrikčních endonukleaz. Fragment kóduje pro otevřený čtecí rastr 591 bp kódované pro polypeptid ze 197 aminokyselin. Příslušná cDNA byla izolována z agaroselového gelu a byla prostřednictvím převisu T ligatace klonována na pGEM-T vektor (Promega, Mannheim, Německo). cDNA byly sekvencovány, přičemž se vycházelo z plastidu DNA za použití postupu „Thermo Sequence Fluorescent Label Primer Cycle Sequencing Kit“ (Amersham, Freiburg, Německo).

·· ····

• · · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ··· • · · ♦ · ·

Poněvadž jako výchozí primer OPN-1 byl odvozen primer RacB sekvence z rýže (GenBank Acc.-No.: AF250327), byla tato oblast (to znamená 5-konec) RacB-cDNA z ječmene ještě několikrát verifikována pomocí RACE technologie za použití „GeneRacer Kit“ (1NVITR0GENE Life Technologies). Ktomu bylo zpracováno 100 ng póly-A mRNA, 1 μΐ lOxCIP pufru, 10 jednotek RNAse inhibitoru, 10 jednotek CIP („calf intestinal phosphatase“) a DEPC zpracované vody až do celkového objemu 10 μΐ po dobu 1 hodiny, při teplotě 50 °C. K precipitaci RNA se přidalo dalších 90 μΐ DEPC vody a 100 μΐ fenolu s chloroformem a intěnzivně se 30 s míchalo. Po 5 min. odstřeďování při 20 000 g bylo k horní fázi přidány 2 μΐ 10 mg musselu v 1 ml glycogenu, 10 μΐ 3 M octanu sodného (pH 5,2) v nové mikroreakční nádobě. Bylo přidáno 220 μΐ 95 %ního etanolu a směs se inkubovala na ledě. Následně byla RNA precipována pomocí odstředivky po dobu 20 min. při 20 000 g a 4 °C. Byl odstraněn přesah, přidalo se 500 μΐ 75 %ního etanolu a opět se 2 min. odstřeďovalo (20000 g). Přesah byl opět odstraněn, precipitát byl 2 min. sušen při teplotě okolí na vzduchu a následně se suspendovalo v 6 μΐ DEPC vody. Struktury mRNA CAP byly odstraněn pomocí přídavku 1 μΐ ΙΟχΤΑΡ pufru, 10 jednotek RNAsin a 1 jednotky TAP („tobacco acid pyrophosphatase“). Směs byla 1 h inkubována při teplotě 37 °C a následně se chladila na ledu. RNA byla opět, jak je popsáno shora, precipována a do reakční nádoby s0,25 pg GeneRaceru převeden oligonukleotidový primer. Oligonukleotidový primer byl resuspendován v RNA roztoku, směs byla inkubována 5 min. při teplotě 70 °C a potom ochlazena ledu. Bylo přidáno 1 μΐ lOx ligasového pufru, 10 mM ATP, 1 jednotka RNAsinu a 5 jednotek T4 RNA ligasy a reakční vsázka inkubována po dobu 1 h při 37 °C. RNA byla opět, jak je shora popsáno, precipována a resuspendována ve 13 μΐ DECP vody. K RNA bylo přidáno 10 pMol oligodT primeru, směs se rychle ohřála na 70 °C a opět se ochlazovala na ledu. Bylo přidáno 1 μΐ každého dNTP roztoku (25 mM), 2 μΐ lOxRT pufru, 5 jednotek (1 μΐ) AMV reversní transkriptasy a 20 jednotek RNAsinu a reakční roztok byl inkubován 1 hodinu při 42 °C a následně 15 min. při teplotě 85 °C. Takto získaný primární řetězec cDNA byl uložen při teplotě -20 °C.

K amplifikaci 5'-cDNA konce se použil následující primer:

• ·« ··«· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· • · · · · · · ·· *· ·· ·

RACE-RacB primer:

-gtgggcacatagtcggtggggaaggt-3 (SEQ ID NO: 12)

GeneRacer™ 5-primer:

-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 (SEQ ID NO: 13)

GeneRacer™ 5'- nested primer:

-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 (SEQ ID NO: 14)

Vsázka (celkový objem 25 μΐ) měla následující složení:

μΐ primeru RACE-RacB (5pmol/pl)

0,5 μ1 GeneRaceru 5-primer (10 pmol/μΐ)

2,5 μΐ lOx pufř Qiagen

2,5 μΐ dNTPs (2mM)

0,5 μΐ cDNA

0,2 μΐ QiagenTAG (5 jednotek/μΐ)

17,8μ1Η₂0

Byly nastaveny následující PCR podmínky:

°C 5 min denaturace cyklů se 70 °C 30 s (annealing) °C 1 min (extense) °C 30 s (denaturace) cyklů se 68 °C 30 s (anneling) °C 1 min (extense) °C 30 s (denaturace) cyklů se 66 °C 30 s (annealing) ·· ··· · ·· t °C 1 min (extense) °C 30 s (denaturace) °C 10 min závěrečná extense 4 °C chlazení až k dalšímu zpracování

Pomocí PCR se obdržel produkt s cca 400 bp. Na základě toho byla provedena „nested“ PCR s RacB specifickým olígonukleotidovým primerem a „GeneRacerNested 5 primerem“:

°C 5 min denaturace cyklů se 64 °C 30 s (annealing) °C 1 min (extense) °C 30 s (denaturace) °C 10 min závarečná extense 4 °C ochlazování až do dalšího zpracování.

Obdržený PCR produkt byl ilozován prostřednictvím gelu, extrahoval se z gelu a klonoval se v pGEM.T prostřednictvím převisu T-lígace a sekvencoval se. Sekvence byla v oblasti primeru OPN-1 zcela identická se sekvencí racB z rýže, takže prostřednictvím primeru nevznikaly žádné bodové mutace. Pod SEQ ID NO: 1 uvedená sekvence je tedy identická s RacB sekvencí z ječmene.

Příklad 4: Reversní transkripce - reakce polymerasových řetězců (RT-PCR)

Pro semikvantitavní RT-PCR byl použit „OneStep RT-PCR Kit“ (Qiagen, Hilden, Německo). Přitom se RNA nejprve přeložila na cDNA (Reverse Transkription) a v následné PCR reakci se hledaná cDNA aplifikovala se specifickými primery. K vyhodnocení výchozího množství na matriční RNA byla amplifikace během exponenciální fáze přerušena, aby byly zachyceny rozdíly v cílové RNA. PCR produkty byly odděleny pomocí agaroselového gelu, denaturovány, odsáty na nylonovou membránu • ·« ·· ···· »· · · · · * • · · · · · • · · · · · · • · · · • ♦ ··· • 9 · ·· · ··· ·♦ ·· ·· a detekovány pomocí specifických, neradioaktivně značkující sond za přísných standardních podmínek. Hybridizace, praní a detekce byly provedeny tak, je popsáno pod „Northern Blot“.

Pro jednotlivé reakce (vsázka 25 μΐ) bylo za použití „One Step RT-PCR Kit“ (Qiagen, Hilden, Německo) použito:

1000 ng veškeré RNA ze stanovené zkoušky

0,4 mM dNTPs

0,6 μΜ sensního a antisensního primeru

0,1 μΐ Rnase inhibitoru μΐ enzymmixu v lx RT pufru.

Syntéza cDNA (reversní transkripce) byla prováděna během 30 min. při teplotě 50 °C. Následně se reverzní transkripce během 15 minut při 95 °C inaktivovala, což zároveň způsobilo aktivaci DNA polymerasy a denaturaci cDNA. Následně následuje PCR podle následujícího programu:

min 94 °C denaturace cyklů s 1 min 54 °C hromadění primeru 1 min 72 °C prodloužení primeru min 72 °C kompletace DNA dvojřetězců na závěr: 4°C přerušení reakce.

PCR produkty byly odděleny v lxTBE agaroselovém gelu s ethidiumbromidem.

Jednotlivé vsázky byly aplifikovány následujícími páry oligonukleotidových primerů:

a) amplifikace 387 bp fragmentu ječmene RacB cDNA φ

··’ ·* φφ φφφφ • · • · • · ·· • φ • φ • φ φ φ ♦ · •φ φ* φφ φ φ · φ > φ φ >

φ φ φ φ··· φ φ φ φφ >

RacB sensní 5 -gttcatcaagtgcgtcaecgtg-3' (SEQ ID NQ: 15)

RacB antisensní 5 -ttagcttcctcagttcttccctg-3' (SEQ ID NO: 16)

d) amplifíkace 674bp fragmentu ječmene BAS cDNA (GenBank Acc.-No Z34917)

BAS sensní 5'-cgcgccgcagccgagtacgac-3' (SEQ ID NO: 17)

BAS antisesní 5'-gtcacaaaaacacatgtaacc-3' (SEQ ID NO: 18)

e) amplifíkace 506 bk OXLP cDNA fragmentu (GenBank Acc.-No. X93171)

OXLP sensní 5 '-ggccgacatgcattcaccag-3' (SEQ ID NO: 19)

OXLP antisensní 5'-catctgatattgctgggtctg-3' (SEQ ID NO: 20)

f) amplifíkace 513 bp Ubi cDNA fragmentu (GenBank Acc.-No. M60175)

UBI sensní 5 -ccaagatgcagatcttcgtga-3' (SEQ ID NO: 21)

UBI antisensní 5 '-ttcgcgataggtaaaagagca-3' (SEQ ID NO: 22).

Všechny záskané fragmenty byly mimo to pomocí převisu T íigace převedeny do vektoru pGET-7 a sloužily jako výchozí plasmidy pro přípravu sond (například pro northem-blot), případně dsRNA. Jednotlivé konstrukty nesou označení pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

Příklad 5: Northem-blot analýza

K přípravě northem-blottingu byly RNA v agaroselovém gelu rozděleny za denaturačních podmínek. Část RNA roztoku (odpovídající 5 pg RNA) byla ktomu smíchána se stejným objemem zkušebního pufru (s ethidiumbromidem), 5 min při 94 °C denaturována, 5 min odstavena na ledu, krátce odstřeďována a uložena do gelu. 1 x MOPS gel (1,5 % agarosy, ultračisté) obsahoval 5 objemových % koncentrovaného roztoku formaldehydu (36,5 %). RNA byla pomalu oddělována při 100 V 2 h a následně odsáta.

Northerm blotting nastal jako nahoru směřující RNA transfer v kapilárním toku. Gel se proto nejprve 30 min. míchal ve 25 mM pufřu z hydro/dihydrofosforečnanu sodného (pH 6,5) a rozkrájel se. Whatmanův papír byl připraven tak, že byl položen na horizontální desku a vyčníval na dvou stranách do vany s 25 mM pufřu z hydro/dihydrofosforečnanu (pH 6,5). Na tento papír byl nanesen gel, přičemž nepokryté části Whatmanova papíru byly zakryty plastikovou fólií. Gel byl potom bez bublin zakryt positivně nabitou nylonovou membránou (Boehringer-Mannheim), načež byla membrána ve více vrstvách do výšky 5 cm znovu zakryta sacím papírem. Sací papír byl zatížen šklebenou deskou a závažím 100 g. Bloting se prováděl přes noc při teplotě okolí. Membrána byla krátce otočena do A. bidest, a k fixaci RNA ozářena Uv zářením se světelnou energií 125 mJ. Bylo prověřen stejnoměrný transfér RNA na membránu.

K detekci mRNA ječmene bylo z každé zkoušky přes agaroselový gel odděleno 10 pg veškeré RNA a pomocí kapilárního transféru odsáto na positivně nabitou nylonovou membránu. Detekce se provedla pomocí DIG systému.

K hybridizaci s detekovanými mRNAs byly vytvořeny s digogygeninem, nebo fluoreszeinem markirované RNA sondy. Tyto byly zhotoveny pomocí in vitro transkripce PCR produktu pomocí T7 nebo SP6 RNA polymerasy s markirovaným UTPs. Jako předloha pro PCR podpořenou amplifíkaci sloužily shora popsané plasmidové vektory pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMT-UBI.

Podle orientace insertu byly k vytvoření antisensního řetězce přibrány různé RNA polymerasy. T7-RNA polymerasy byly použity pro pGEMT-BAS a pGEMT-OXLP, SP6RNA polymerasy byly použity pro pGEMT-RACl a pGEMT-UBI.

Insert jednotlivých vektorů byl amplifikován přes PCR s z boku se kryjícími standardními primery (M13 fwd a rev). Reakce přitom probíhala s následujícími koncovými koncentracemi v celkovém objemu 50 μΐ PCR pufru (silverstar):

Ml3-fwd: 5 -GTAAAACGACGGCCAGTTG-3' (SEQ ID NO: 23) Ml3-Rev: 5 -GGAAACAGTCTATGACC ATG-3' (SEQ ID NO: 24) • · ·· · ···· • 9·· · ··· ···· % dimethylsulfoxíd po 2 ng/μΐ primem (Ml3 forward a reversed) l,5mMMgCl₂

0,2 mM dNTPS jednotky Taq polymerasy (silverstar ng/μΐ plasmidu DNA

Amplifikace probíhala v termocyklem (Perkin-Elmar 2400) s řízenou teplotou:

°C 3 minuty denaturace cyklů s 94 °C 30 s (denaturace) °C 30 s (annealing) °C 1,2 min (extense) °C 5 min závěrečná extense 4 °C ochlazování až k dalšímu zpracování.

Výsledek reakce byl přezkoušen v 1 %ním agaroseolovém gelu. Produkty byly následně čištěny pomocí „High Pure PCR-Product Purification Kit“ (BoehringerMannheim). Obdrželo se 40 μΐ eluatu, který se znovu přezkoušel v gelu a byl uložen při teplotě -20 °C.

RNA polymerizace, hybridizace a imunodetekce byly provedeny podle údajů výrobce k neradioaktivní detekci RNA (DIG Systém Userš Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel a kolektiv (1994) Plant Physiol 106: 12641277). Ke 4 μΐ čistého PCR produktu se přidaly 2 μΐ transkripčního pufiu, 2 μΐ NTP markyrovacího mixu, 2 μΐ NTP mixu a 10 μΐ DEPC vody. Následně se pipetovaly 2 μΐ roztoku T7-RNA polymerasy. Reakce se potom prováděla 2 hodiny při 37 °C a následně se reakční směs doplnila DEPC vodou na 100 μΐ. RNA sonda byla detekována v ethidiumbromidovém gelu a uložena při -20 °C.

K přípravě hybridizace se membránami nejprve 1 h při 68 °C pohybovalo ve 2 x SSC (sůl citrát sodný) a 0,1 % SDS pufru (dodekylsulfat sodný), přičemž pufr byl 2 až 3 krát obnoven. Membrány byly následně položeny vnitřní stěnou na na teplotu 68 °C předehřátou hybridizační trubici a 30 min inkubovány s 10 ml Dig-Easy-hybridizačním pufru v předehřáté hybridizační peci. Během toho se 10 μΐ roztoku sondy denaturovalo v 80 μΐ hybridizačního pufru při 94 °C po dobu 5 min, následně se roztok odstavil na led a krátce se odstřeďoval. Khybridizaci se potom sonda přivedla v 10 ml 68 °C teplého hybridizačního pufru a pufr v hybridizační trubici byl nahrazen tímto pufrem sondy. Hybridizace potom probíhala rovněž při teplotě 68 °C přes noc.

Před imunodetekcí RNA-RNA hybridů se odsátý materiál dvakrát 20 min. pral v 0,1 % (w/v) SDS, 0,1 x SSC při teplotě 68 °C.

K imunodetekci se odsátým materiálem nejprve dvakrát 5 min za teploty okolí otáčelo ve 2 x SSC, 0,1 % SDS. Následně se dvakrát provedlo po dobu 15 min praní při 68 °C v 0,1 x SSC, 0,1 % SDS. Roztok byl následně nahrazen pracím pufrem bez tweenu. Roztok se 1 min. protřepával a nahradil se blokovacím činidlem. Po dalších 30 minutách protřepávání se přidalo 10 μΐ roztoku antifluorezcenční protilátky a dalších 60 min. se protřepávalo. Provedly se dva 15 minutové prací kroky v pracím pufru s tweenem. Membrána byla následně 2 min. ekvilibrována v živném pufru a po odkápání přenesena na kopírovací fólii. Na „RNA stranu“ membrány potom byla rovnoměrná rozdělena směs z 20 μΐ CDP-Star™ a 2ml živného puifru. Na závěr byla membrána zakryta druhou kopírovací fólií a na okrajích s ní byla teplem vzduchotěsně a vodotěsně svařena. Membrána potom byla v temné komoře po dobu 10 minut zakryta roentgenovým filmem a tento byl následně vyvolán. Podle intenzity luminiscenční reakce se měnila doba osvícení.

Pokud není vyznačeno něco jiného, jsou používány roztoky v rozsahu kits (DIG-Luminiscence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Všechny ostatní roztoky byly připraveny z následujících kmenových roztoků zředěním s autoklávovou, destilovanou vodou. Všechny kmenové roztoky byly, pokud není uvedeno něco jiného, použity s DEPC (jako DEPC voda) a následně umístěny v autoklávu.

• ·· · · ···· ·· · • · · · · · · 9 9 9 • · · · · 9 · · · · •9 999 9 999 99999

999 99 99

- DEPC voda: destilovaná voda ošetřená přes noc při 37 °C diethylpyrokarbonátem (DPC, 0,1 %, w/v) a následně umístěná v autoklávu

- 10 x MOPS pufř: 0,2 M MOPS (morfolin-3-propansulfonová kyselina ), 0,05 M octanu sodného, 0,01 M EDTA, pH se nastaví pomocí 10 M NaOH na pH 7,0

- 20 x SSC (chlorid sodný-citran sodný, salt-sodiumcitrate): 3M NaClo, 0,3 M trojcitranu sodného x 2 H2O, pH se nastaví pomocí 4 M HC1 na pH 7,0

1% SDS (dodekylsulfat sodný, sodiumdodecylsulfate) dodekylsulfat sodný (w/v) bez DEPC

- RNA zkušební pufr: 760 pl formamidu, 260 μΐ formaldehydu, 100 μΐ ethidiumbromidu (10 mg/ml), 80 μΐ glycerolu, 80 μΐ bromfenolové modři (nasycené), 160 μΐ 10 x MOPS, 100 μΐ vody

- 10 x prací pufer bez tweenu: 1,0 M kyseliny maleinové, 1,5 M NaCl, bez DEPC, s NaOH (tuhý, cca 77 g) a 10 M NaOH nastaveno na pH 7,5

- prací pufr s tweenem: z pracího pufru bez tweenu a tweenem (0,3 % v/v)

- lOx blokovací činidlo: 50 g blokovacího pufru (Boehringer-Mannheim) suspendováno v 500 ml pracího pufru bez tweenu

- živný pufr: 100 mM tris (trishydroxymethylamino-methan), 150 mM NaCl se 4 M HC1 nastaveno na pH 9,5 barvící markér: 50 % glycerolu (v/v), 1,0 mM EDTA ph 8,0, 0,25 % bromfenolové modře (w/v), 0,25 % xylenkyanolu (w/v).

Příklad 6: In vitro syntéza RacB dsRNA

Všechny plasmidy (pGEMT-RACl, pGEMT-BAS, pGEMT-OXLP, pGEMTUBI), které byly použity pro in vitro transkripci, obsahovaly T7 a SP6 promotor (pGEM-T, promega) na koncích inzerované sekvence nukleové kyseliny, což umožňuje syntézu sensní, případně antisensní RNA. Plasmidy mohou být linearizovány pomocí vhodných restričních enzymů, aby se zajistila správná transkripce inzerované sekvence nukleové kyseliny a zabránilo se pročtení do vektoriálních sekvencí.

Ktomu bylo nakrájeno 10 μΐ DNA plasmidu.. Nakrájené plasmidy se extrahovaly ve 200 μΐ vody se stejným obsahem fenolu nebo chloformu nebo isoamylalkoholu, tranformovaly v nové Eppendorferově reakční nádobě a 5 minut se odstřeďovaly při 20000 g. 180 pm plasmidového roztoku se rozpustilo se 420 pl ethanolu, roztok se odstavil se na led a následně se odstřeďováním po dobu 30 min při 20000 g a teplotě -4 °C precipoval. Precipát se odebral v 10 pl TE pufru.

K přípravě RacB-dsKNA se plasmid pGEMT-Racl strávil se Spěl a sensní RNA se transkribovala sT7-RNA polymersou. Plasmid pGEMT-Racl byl rovněž stráven s Ncol a antisensní RNA byla transkribována s SP6-RNA polymerasou. RNA polymerasy byly odebrány od Roche Molecular Biology, Mannheim, Německo.

Každá transkripční vsázka obsahovala ve 40 pl objemu:

pl linearizovaného plasmidu DNA (lpg), pl NTP s (25 mM) (1,25 mM z každého NTP).

pl 10 x reakční ho pufru (Roche Molecular Biology), pl RNAsin RNAsin (27 jednotek, Roche Molecular Biology), pl RNA polymerasy (40 jednotek) pl DEPC vody.

Po inkubaci po dobu 2 h při teplotě 37 °C byla promíchána část reakční vsázky z transkripce „sensního“, případně „antisensního“ řetězce, směs se 5 minut při 95 °C denaturovala, a následně se ochlazováním po dobu 30 min na koncovou teplotu 37 °C hybridizovala („annealing“). Alternativně se může po denaturaci směs ze „sesního“ a „antisensního“ řetězce také 30 minut ochlazovat při -20 °C. Proteinový precipitát, který se vytvořil během denaturace a hybridizace, se oddělil krátkým odstřeďováním při 20800 g a přesah se přímo používá k převrstvení wolframových částic (viz dole). K analýze se oddělil 1 pl každého RNA řtězce a dsRNA na nedenaturovaném agaroselovém gelu. Uspokojivá hybridizace se projeví pásovým posunem k vyšší molekulární hmotnosti ve srovnání s jednotlivými řětězci.

· · · 4 4 · • · · · · • * 4 · 4 4

4 « 4 44444 μΐ dsRNA bylo precipováno ethanolem (přídavkem 6 μΐ vody, 1 μΐ 3M roztoku octanui sodného a 25 μΐ ethanolu, jakož i odstřeďováním po dobu alespoň 5 min při 20000 g a teplotě 4 °C) a resuspendovalo se v 500 μΐ vody. Absorpční spektrum bylo změřeno mezi 230 a 300 nm, pro stanovení čistoty a koncentrace dsRNA byla stanovena absorpce 280 a 260 nm. Zpravidla se získalo 80 až 100 pg dsRNA s poměrem OD260/OD280 1,80 až 1,95. Trávení se může optimálně provést s Dnase I, následující výsledky to však ovlivňuje nepodstatně.

Použila se jako kontrolní dsRNA fungující dsRNA lidského thyroidového receptoru (výchozí vektor pT7betaSal (Norman C a kolektiv (1988) Celí 55 (6): 989-1003) od Dr. Baniahmada, Institut tur Genetik, Giepen, Německo, sekvence inzertu je popsána pod GenBank Acc.-No.: NM 000461). Pro přípravu sensního RNA byl plasmid stráven sPvuII, pro přípravu antisensního RNA byl stráven sHindin a RNA potom byla transkribována sT7, respektive SP6 RNA polymerasou. Jednotlivé postupové kroky k přípravě kontrolního dsRNA se provádí analogicky, jak je shora popsáno pro RacBdsRNA.

Příklad 7: Transientní transformace, RNAi a evaluace vývoje houbovitých patogenů

Listové segmenty ječmene cv Pallas byly transformovány sRacB-dsRNA společně s GFP expresním vektorem. Následně se listy inokulovaly s Bgh a výsledek se po 48 h analyzoval pomocí světelné a fluorescenční mikroskopie. Penetrace v GFP exprimovaných buňkách byla posuzována pomocí detekce haustorií v žijících buňkách a vyhodnocením výhoje houby na právě těchto buňkách. Ve všech šesti experimentech vedlo bombardování ječmene cv Pallas sRacB-dsRBNA ke sníženému počtu úspěšně Bgh penetrovaných buněk ve srovnání s buňkami, které byly bombardovány s cizími dsRNA (lidský receptor thyroidhormonu dsRNA, TR). Rezistenci indukující účinek RacB-dsRNA podmiňoval průměrné snížení penetračního účinku vlivem Bgh o 44 % (obr. 4).

Byl použit způsob transientní transformace, který již byl pro biologické zavedení dsRNA do epidermálních buněk listů ječmene popsán (Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Microbe Internet 12: 647-54, Schweizer P a kolektiv (2000) Plant J 2000 24: 89596

4 4 44 4 · · · * · · · · • · 4 · · · • · · · 4····

903). Wolframové částice s průměrem 1,1 pm (hustota částic 25 mg/ml) byly pokryty společně s dsRNA (přípravu viz shora) sDNA plasmidem vektoru pGFP (GFP pod kontrolou CaMV 35S promotoru) jako transformačním markérem. Ktomu se k pokrytí použila následující množství dsRNA, případně reporterplasmidu: lpg pGFP a 2 pg dsRNA. Douřtězcová RNA byla syntetizována in vitro pomocí syntézy „sensní“ a „antisensní“ RNA.

Pro preparaci se 55 mg wolframových částic (M 17, průměr 1,1 pm, Bio-Rad, Mnichov) pralo dvakrát s 1 ml autoklávové destilované vody a jednou s 1 ml čistého ethanolu, částice se sušily a absorbovaly se v 1 ml 50 %ního glycerinu (cca 50 mg/ml kmenového roztoku). Roztok se zředil 50 %ním glycerinem na 25 mg/ml, před použitím se dobře promíchal a suspendoval se v ultrazvukové lázni. K převrstvení se za neustálého míchání společně přikapal 1 pg plastidu, 2 pg dsRNA (1 pl), 12,5 pl suspenze wolframových částic (25 mg/ml), 12,5 pl 1 M roztoku Ca(NO₃)2 (pH 10), na 10 min se odstavilo při teplotě okolí, krátce se odstřeďovalo a od přesahu se odebralo20 pl. Zbytek s wolframovými částicemi se resuspendoval (ultrazvukovou lázní) a použil se v experimentu.

Byly použity 4 cm dlouhé segmenty primárních listů ječmene. Tkáně byly položeny na 0,5 % fytagaru (GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) s20 pg/ml benzimidazolu v Petříkových miskách a přímo před bombardováním částicemi se na okrajích zakryly šablonou s pravoúhlým vybráním 2,2 x 2,3 cm. Misky byly postaveny za sebou na dno vakuové komory (Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Mikrobe Interact 12: 647-54), přes které byla nasunuta nylonová síť (velikost oka 0,2 mm, Millipore, Eschbom) jako difusor na děrované desce (5 cm nad dnem, 11 cm pod makrocarrierem) k rozbití hrudek z částic a odbrždění proudu částic. Nahoře na komoře umístěný makrocarrier (plastikový úchyt sterilního filtru, 13 mm, Gólman Science, Swinney, Velká Britanie) byla založena střela s8,5 pl DNA převrstvenými wolframovými částicemi. S membránovým vakuovým čerpadlem (Vacuumbrand, Wertheim) byl tlak v komoře redukován o 0,9 bar a wolframové částice vystřeleny tlakem heliového plynu 9 bar na povrch rostlinné tkáně. Kmarkýrování transformovaných buněk byly listy ostřelovány plastidem (pGFP, vektor na pUC18 bázi, CaMV 35S promoter/terminatová kazeta

s izerovaným GFP genem, Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Mikrobe Interact 12: 647-54, použitá Dr. P Schweizerem, Institut fur Pflanzengentechnik IPK, Gatersleben, Německo). Před střílením jiného plasmidu byl makrocarrier důkladně vyčištěn vodou. Po čtyřhodinové inkubaci po bombardování při mírně otevřených Petriho miskách, teplotě okolí a denním světle byly listy inokulovány se 100 konidiemi na mm² houby pravé práškové plísně (rodu A6) a konidie byly po dalších 36 až 48 h za stejných podmínek inkubovány.

Listové segmenty byly bombardovány převrstvenými částicemi za použití „particle ínflow gun“ Na výstřel se aplikovalo 312 pg wolframových částic. 4 hodiny po bombardování byly inokulovány inokulacemi s Blumeria graminis f.sp, hordei a po dalších 40 hodinách byly vyhodnoceny z hlediska výskytu infekce. Výsledek (například penetrační efektivita definovaná jako procentní podíl napadených buněk s čistým haustoriem a sekundárním hyphem („secondary elongating hyphae“)) byl analyzován pomocí světelné a fluorescenční mikroskopie. Inokulace se 100 konidii na mm² poskytuje frekvenci napadení cca 50 % transformovaných buněk. Pro každý jednotlivý experiment byl vyhodnocen minimální počet 100 interakčních míst. Transformované (GFP exprimované) buňky byly identifikovány za impulsu modrým světlem. Tři různé kategorie transformovaných buněk se mohou lišit:

1. Penetrované buňky, které obsahují snadno zjistitelné haustorium. Buňka svíce než jedním haustoriem je vyhodnocena jako jedna buňka.

2. Buňky, které sice byly napadeny houbovým agresorem, ale neobsahují žádné haustorium. Buňka, která byla vícekrát napadena od Bgh, ale neobsahuje žádné haustorium, byla vyhodnocena jako jedna buňka.

3. Buňky nejsou napadeny Bgh.

Stomatické buňky a vedlejší stomatické buňky byly z vyhodnocení vyloučeny.

Povrchové struktury Bgh byly analyzovány pomocí světelné mikroskopie nebo fluorescenčního zabarvení houby s calcofluorem (ve vodě) po dobu 30 s. Vývoj houby se může snadno zjistit fluorescenční mikroskopií po zabarvení s calcofluorem. VRacBdsRNA transformovaných buňkách se vyvine houba, a to primární a apresoriální zárodek • ·· ······ ·· · • · · · ·· « · · · • · · · · · »··' • · · · · · ··· ····· • ·» · · ·· · · »· · („germ-tube“), nikoliv však haustorium. Vznik haustoria je předpokladem pro vznik sekundární hyphae.

Relativní penetrační efektivita (RPE) se vypočítá jako podíl penetrační efektivity u transformovaných buněk (transformace sRacB- nebo kontrolní dsRNA) a penetrační efektivity u netransformovaných buněk (zde je průměrná penetrační efektivita 57 %. Procentuální RPE (% RPE) se vypočítá z RPE minus 1 a vynásobením 100.

(PE u RacB-dsRNA transformovaných buněk)

RPE=-'(PE u kontrolní dsRNA transformovaných buněk) %-RPE=100 x (RPE-1)

Hodnota %-RPE (odchylka od průměrné penetrační efektivity kontroly) slouží ke stanovení susceptibility buněk, které jsou tranfikovány s RcB-dsRNA (obr. 4).

U kontrolní dsRNA nebyl mezi pěti nezávislými pokusy pozorován u transfekce s kontrolní dsRNA a vodou žádný rozdíl ve vztahu k penetrační efektivitě Bgh.

Rovněž byly zjištěny odchylky PE v různých genotypech. K demonstraci funkční vazby ke Mlo genu se použil genotyp mlo5 (A89, mlo5, rorl, podklad: Ingrid), který je na základě mutace Rorl genu modelově náchylný vzhledem k napadení Bgh (Freialdenhoven A a kolektiv (1996) Plant Cell 8: 5-14). V tomto dvojmutantním genotypu byla zjištěna efektivita RacB-dsRNA ve srovnání s hostitelským Mlo genotypem. V pěti nezávislých pokusech však nebylo pozorováno zabránění vzniku haustoria v A89. Naproti tomu PE u souběžných experimentů s ječmenem Pallas a Ingrid bylo zřetelně redukováno (obr. 5). Zajímavé je, že efekt RacB-dsRNA byl v ječmeni Pallas výraznější než v ječmeni Ingrid (obr. 5, pokusy 1 a 2 ve srovnání s pokusy 3, 4 a 5).

K vyloučení vlivu dsRNA na transformovanou partii, nebo na přežívající partii napadených buněk, byl porovnán počet GFP exprimovaných buněk mezi kontrolními a RacB-dsRNA experimenty (tabulka 7). RacB-RNA neměla žádný vliv na celkový počet exprimovaných buněk nebo na počet GFP napadených exprimovaných buněk.

Tabulka 7: Transformační partie na listech ječmene po bombardovaní dsRNA

Počet GFP exprimovaných buněk po jednom výstřelu⁸

Linie	Celkem	Napadeno	Celkem	Napadeno	nc
	(kontrolní	(kontrolní	(RacB-	(RacB-
	dsRNA)	dsRNA)	-dsRNA)	-dsRNA)
Pallas	34,3±4,6	16,0±2,2	33,9±4,8	15,5±1,4	6(21)
(Mlo Rorl)
Ingrid	51,0±8,9	27,6±8,7	49,9±5,6	31,5±7,8	3(11)
(Mlo Rorl)
A89	34,4±5,4	18,l±4,0	34,1±5,5	16,7±3,8	5(22)

(mlo5 rorl) ^a): výstřelem byly bombardovány 4 listy údaje představují střední hodnotu včetně standardní chyby ^c): počet nezávislých pokusů (n výstřelů pro kontrolní dsRNA a RacB-dsRNA)

Příklad 8: Konstitutivně aktivní mutant RACB

K positivní identifikaci RACB jako faktoru susceptibility byl určen putativně konstitutivně aktivní mutant RACB ječmene (výměna G—>V v poloze 15, RacB-V15) a přeexprimován do ječmene druhu Pallas. Nejprve byl zobrazen full-lenght RACB prostřednictvím RT-PCR. K tomu byl použit následující oligonukleotidový primer:

RacB5 BamHI: 5 -GGATCCGATGAGCGCGTCCAGGTT-3' (SEQ Π> NO: 31)

RacB3 Sáli: 5 -GTCGACCTTCGCCCTTGTTCTTTGTC-3' (SEQ ID NO: 32) ·· ·« ···· ·· ·

100 • · · · · ♦ · · · • · · · · · · · ····· •»· *« · · ·· ·· · cDNA byly klonována v pGEM-T a následně vyříznuta přes rozhraní primeru a klonována do pGY-1 (Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Mikrobe Interact 12: 64754, obr. 7) přes rozhraní BamHI/SalI. Konstrukt nese označení pGYl-RacB.

Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro konstitutivně aktivní RacB mutant RACB-V15 byla připravena s „Transformer®Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Clonetech, Heidelberg) podle návodu výrobce. Jako výchozí vektor se použil vektor pGYl-RacB. Jako primer metagenese se použil následující oligonukleotid:

VI5: 5 -ACCGTGGGGGACGTCGCCGTCGGCAAGAC-3 (SEQ ID NO: 33)

RACB-V15 byl potom v 5 nezávislých pokusech transientně přeexprimován do ječmene druhu Pallas za kontroly 35S CamV promotoru. Pokusy byly provedeny, jak je popsáno v Schultheissovi a kolektivu (Schultheiss H a kolektiv (2002) Plant Physiol 128: 1447-1454), jen se Čekalo po bombardování částicemi před inokulací 24 hodin místo 4 hodin. Povlak částic byl jak je popsáno ve Schweizerovi a kolektivu (Schweizer P a kolektiv (1999) Mol Plant Mikrobe Interact 12: 647-54)

Exprese konstitutivního RacB mutantu způsobuje ve srovnání s kontrolami signifikantně zvýšenou náchylnost k patogenímu napadení práškovou plísní u ječmene. Také tento výsledek dokládá klíčovou funkci RacB při patogenní ochraně. RACB-V15 účinky (viz obr. 6-A/B) jsou signifikantní v T-testu, když se dělá dvoustranný párový test. Relativní susceptibilita proti houbovitým patogenům se ve všech případech zvýší (obr. 6B).

Příklad 9: Další HvRac homology

Všechny sekvence s plnou délkou byly izolovány se specifickými primery z RNA a kolonovány na pGEM-T a sekvencovány (Hůckelhoven a kolektiv (2001) Plant Mol Biol, Schultheiss a kolektiv (2002) Plant Physiol 128: 1447-1454). Sekvence jsou RacB zčásti podobné.

101 • ·« ·· · · · · 9 9 9

9 9 9 9 · · 9 · • · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 999 99999

99 9 9

99 99 ·

a) HvRopó:

LEFT PRIMER 5 -GTGGAGGCGCGGCG AGA-3' (SEQ ID NO: 25)

RIGHT PRIMER 5 -CC ATGCTTCATCTCCATAGTC A-3' (SEQ ID NO: 26)

b) HvRacD:

LEFT PRIMER 5'-ggatccCGATTCCATCAGGAAAGCAT-3 (SEQ ID NO: 27) RIGHT PRIMER 5 -gtcgacGCGAG ACACTGCAAA AC AAA-3' (SEQ ID NO:28)

c) HvRop4:

LEFT PRIMER 5'-GGATCCttctcgtccattagccggc-3' (SEQ ID NO: 29)

RIGHT PRIMER 5 -GTCGACgatcacttgaagcatgccag-3' (SEQ ID NO: 30)

Příklad 10: Příprava sensní ch a antisensních konstruktů s genem AtRacB k expresi do Arabidopsis thaliana

Fragment RacB homologu z Arabidopsis (MlPS-Code: ATg35950, SEQ ID NO: 53, pro Strach) se izoluje přes PCR z Arabidopsis thaliana z cDNA registru. Použité sekvence primeru jsou následující:

Fra 186: 5 -ATGAGCGCGTCCAGGTTCATA-3' (SEQ ID NO: 71)

Fra 187:5 -ATCAAACACGCCCTTCACGTT-3’ (SEQ ID NO: 72)

Amplifíkace probíhá v termocykléru T3 firmy Biometra teplotně řízené.

cyklů po dobu 1 min. při 95 °C, 0,5 min. při 59 °C a 3 min. při 72 °C. Následná extence probíhala 5 min. při 72 °C.

102 • *· ·« * · « 4 ·· · ···· ♦ e · « · * ··· ·♦ ♦ · t · 4 • · » 4 · · 4 · 4 · 4444 • · · 4 · · · «4 t • 4 · · 4 4 4 · 4 44 ·

PCR produkty jsou podle údajů výrobce klonovány do vektoru pCR2.1 (podle pCR Skript Cloning Kit, firma Stratagene, Heidelberg). Přes restrikční enzym EcoRI (firma Roche, Mannheim) se řeže fragment z vektorového konstruktu. Fragment lze izolovat prostřednictvím gelové elektroporezy s následujícím čištěním pomocí ionexových sloupců (QIAex Purification Kit, firma Qiagen, Hilden). Binární vektor pSUN3-Nit se příslušně rozřízne přes enzymy Xmal a EcoRI a podrobí se čištění pomocí elektroporezy s následující eluací přes ionexové sloupce (QIAex Purification Kit, firma Qiagen, Hilden).

Poněvadž pro klonování musí být generován insert a vektor s 5'- hladké konce („blut ends“) přesahujícími konci, je jak eluovaný AtRacB fragment, tak také eluovaný pSUN3-Nit fragment k vyplnění přesahu ošetřen 2 pm DTP-Mixu 1(10 mM dATP, DTP, dGTP, dTTP, firma Pharmacia, Freiburg) a 1,6 pl Klenow fragmentu (firma USB/Amersham, Braunschweig, 2 jednotky/pl) a inkubován 30 minut při 37 °C. K zabránění relegaci se vektory nejprve čistí pomocí QIQquick Spin Column (firma Qiagen, Hilden), ošetří se s CIAP (Calf Intestina Alkaline Phospahtase, firma GibcoBRL, Eggenstein, 1 jednotka/pl) a následně se vyčistí pomocí 0,8 %ního agaroselového gelu.

Pro následující legační vsázku se v celkovém objemu 50 pl k 10 pl DNA přidá ještě 34 pl H2O, 5 pl legačního pufru a 1 pl ligasy T4 (firma Roche Mannheim). Tato vsázka se přes noc při 16 °C inkubuje. Následně se při 65 °C po dobu 10 min. inaktivuje ligasa. Na ligaci navazuje srážení s 0,1 objemem octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemy ethanolu. Po odstředění (30 min, 15000 g, 4 °C) se peleta suší v 70 % ethanolu a resuspenduje v 10 pl H₂O. 2 pl této pelety se transformovaly elektroporací (E. coli-pulser, firma Bio-Rad) do kmene DH5a bakterie Escherichia coli. S DNA ošetřené bakterie se plátovaly na LB desky, které obsahovaly antibiotikum ampicilin (50 mg/1). Po inkubaci po dobu 16 hodin při 37 °C se pěstované kolonie bakterií setřely a přenesly se do skleněné reakční nádobky s 3 ml tekutiny LB-Amp, Po inkubaci po dobu 16 hodin při 37 °C se hustě pěstované kultury odstředily. Z bakteriové pelety se pomocí QIAprep DNAminipráparationskitu (firma Qiagen, Hilden) podle údajů výrobce izoloval plasmid DNA a podrobil se analytickému strávení s různými kombinacemi enzymů. Pomocí tohoto kontrolního strávení lze izolovat konstrukty, u nichž existuje gen AtRacB v sensní ·♦ • · · · · ·

103 • · · • « · • · · • · * · ·· · · • · · • · · · • · ····♦ • · · • φ · orientaci, případně antisesní orientaci za v rostlinách konstitutivně aktivní nitrilasy-1 (niti) genu z A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand a kolektiv (1996) Gene 170: 197-200). Tyto konstrukty jsou označovány označením pSUN3NTT_AtRacB_s (SEQ ID NO: 73) a pSUN3NIT_atRacB_as (SEQ ID NO.74) a používají se pro transformaci rostlin rodu Arabidopsis. Konstrukty obsahují úplnou sekvenci AtRacB, takže expresní vektor pSUN3NIT_HvRacB s, který obsahuje fragment vsensní orientaci, je způsobilý exprimovat funkční AtRacB protein. Vektor slouží primárně jako negativní kontrola a způsobuje v mnoha případech sníženou patogenní rezistenci, v některých případech (viz níže) však, jak se zdá z účinku cosuprese, také zvýšení patogenní rezistence.

Příklad 11: Příprava sensních a antisensních konstruktů s genem HvRacB k expresi v Arabidopsis thaliana

Z genu HvRacB se musí připravit různé nefunkční fragmenty k expresi do rostlin rodu Arabidopsis. Ktomu se plasmid, který obsahuje HvRacb gen subklonovaný do bakteriálního vektoru pGEM-T, stráví kombinací enzymů BamHI a HindlII (firma Roche, Mannheim). Zpracováním sKlenow polymerasou za přítomnosti směsi nukleotidů se vyplní přečnívající jednotlivé 5'-řetězce. Vznikající HcRacB fragment s tímto způsobem vyhlazenými konci se přímo klonuje na pSUN3NIT vektor, který je otevřen do své Multiple Cloning Site enzymem BglII a Spěl (firma Roche, Mannheim) a jeho přečnívající 5 - konce se vyplní pomocí zpracování s Klenow polymerazou (jak je popsáno shora). Pro ligační vsázky s celkovým objemem 50 μΐ se k 10 μΐ DNA přidá ještě 34 μΐ H₂O, 5 μΐ ligačního pufru a 1 μΐ T4 ligasy (firma Roche, Mannheim). Tato vsázka se přes noc inkubuje při teplotě 16 °C. Následně se ligasa 10 minut inaktivuje při teplotě 65 °C. Na ligaci navazuje srážení 0,1 objemem octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemy ethanolu. Po odstřeďování (30 min., 15000 g, 4 °C) se peleta suší v 70 % ethanolu a resuspenduje v 10 μΐ H₂O. 2 μΐ této pelety se transformovaly elektroporací (E. coli-pulser, firma Bio-Rad) do kmene DH5a bakterie Eseherichia coli. S DNA ošetřené bakterie se plátovaly na LB desky, které obsahovaly antibiotikum ampicilin (50 mg/1). Po inkubaci po dobu 16 hodin při 37 °C se pěstované kolonie bakterií setřely a přenesly se do skleněné reakční nádobky s 3 ml tekutiny LB-Amp. Po inkubaci po dobu 16 hodin při 37 °C se hustě pěstované φφ ··»· • φφ ·· · · φ φ · φ φ · φ φ φ

104 ··· *· ·· · φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ • · · · φ · φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ ·♦ φφ ·· ♦ kultury odstředily. Z bakteriové pelety se pomocí QIAprep DNA-minipráparationskitu (firma Qiagen, Hilden) podle údajů výrobce izoloval plasmid DNA a podrobil se analytickému strávení sráznými kombinacemi enzymů. Pomocí tohoto kontrolního strávení lze identifikovat konstrukty, u nichž existuje příslušný konstrukt genu v sensní orientaci, případně antisesní orientaci za v rostlinách konstitutivně aktivního promotoru nitrilasy-1 genu z A. thaliana. Tyto konstrukty jsou označovány označením pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO: 75) a pSUN3NÍTHvRacB_as (SEQ ID NO:76) a používají se pro transformaci rostlin rodu Arabidopsis. Konstrukty obsahují zkrácený fragment hvRacB, takže také expresní vektor pSUN3NIT_HvRacB_s, který obsahuje fragment v sensní orientaci, není způsobilý exprimovat funkční HvRacB protein. Vektor slouží primárně jako negativní kontrola a v některých případech (viz níže) však, jak se zdá z účinku cosuprese, poskytuje také zvýšení patogenní rezistence.

Příklad 12: Transformace Arabidopsis thaliana a analýza rezistence proti houbě

Hostitelské rostliny A. thaliana (Columbia) se infikují s kmenem Agrabacterium tumefaciens (EHA105) na základě modifikovaného postupu infiltrace ve vakuu (Steve Clough a Andrew Bent (1998) Plant J 16 (6): 735-743, Bechtold N a kolektiv (1993) CR Acad Sci Paris, Life Science 316: 1194-1199).

Použité buňky A. tumefaciens se transformují s plasmidy pSUN3NIT_AtRacB_s (SEQ ID NO: 73), _PSUN3NIT_atRacB_as (SEQ ID NO: 74), pSUN3NIT_HvRacB_s (SEQ ID NO: 75) a pSUN3NIT HvRacB as (SEQ ID NO:76).

Primární transformandy transformující agrobakterii se selektují na základě kanamycinové rezistence. Rezistentní klíčky se pěstují v půdě a zcela vyvinuté rostliny se používají k biochemické analýze.

K analýze rezistence transgenních rostlin Arabidopsis proti patogenním houbám se využívá inokulací s biotropními houbami Peronospora parasitica a Erysiphe cichoracearum.

a) Peronospora parasitica

105 ·· ··«·

·· · • · · · · • · · · · · • · · · · ··· • · · · · · • · · · » až 8 týdnů staré rostliny se postříkají suspenzí konidiových spor (cca 10⁶ spor/ml). Inokulované rostliny se přes noc v chladničce při cca 16 °C překryjí plastikovým sáčkem a udržují se v temnu a vlhké. Po jednom dni se plastikový sáček otevře a později zcela odstraní. Šest dní po inokulaci se rostliny přes noc opět zakryjí plastikovým sáčkem, čímž se indukuje sporulace. Následující den se listy zkoumají z hlediska výskyt konidofor. Intracelulámí růst vede v následujících dnech na listech k indukci slabých chloros až silných nekros. Tyto symptomy se kvantifikují a testují z hlediska významnosti.

b) Erysiphe cichoracearum

Biotropní houba se kultivuje na rostlinách Arabidopsis. K infekci 4 týdny starých RacB exprimovaných rostlin Arabidopsis se jemnou pinzetou nanesly na povrch listů nosiče konidií. Rostliny 7 dní při 20 °C inkubovaly. 7 dní po inokulaci jsou na listech patrné nosiče konidií a v následujících dnech se objeví chlorosy a nekrosy. Tyto symptomy se kvantifikují a testují z hlediska významnosti.

c) Výsledky

Transgenní rostliny Arabidopsis, které exprimují antisesní sekvence pro AtRacB nebo HvRacB, vykazují ve srovnání s netransgenním hostitelským typem rostlin významně zvýšenou rezistenci jak proti Peronospora parasitica, tak i proti Erysiphe cichoracearum.

Transgenní rostliny Arabidopsis, které exprimují sensní sekvence pro úplný AtRacB, vykazují ve srovnání s netransgenním hostitelským typem rostlin ve většině případech významně zvýšenou náchylnost jak na Peronospora parasitica, tak i na Erysiphe cichoracearum. V některých případech je však také pozorována zvýšená rezistence (jak se zdá přes účinek kosuprese).

Transgenní rostliny Arabidopsis, které exprimují sensní sekvence pro fragment HvRacB, vykazují ve srovnání s netransgenním hostitelským typem rostlin v některých případech významně zvýšenou rezistenci jak proti Peronospora parasitica, tak i proti Erysiphe cichoracearum.

Claims (31)

1. Způsob dosažení nebo zvýšení rezistence proti alespoň jednomu patogenu v rostlinách, vyznačující se tím, že zahrnuje následující pracovní kroky:

a) zmenšení množství proteinu, aktivity nebo funkce RacB proteinu v rostlině nebo její tkáni, jejím orgánu, její části nebo její buňce a

b) výběr rostlin, u nichž - na rozdíl nebo ve srovnání s výchozí rostlinou - existuje nebo se zvýší rezistence proti alespoň jednomu patogenu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že RacB protein je zvolen ze skupiny proteinů sestávající z

a) polypeptidů podle SEQ ID NO: 2,4, nebo 6 a

b) funkčního ekvivalentu polypeptidů podle SEQ ID NO: 2, 4, nebo 6.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tun, že funkční ekvivalent má homologii alespoň 64 % k jednomu z polypeptidů podle SEQ ID NO: 2,4, nebo 6.

4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, přičemž funkční ekvivalent je popsán pomocí polypeptidů podle SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, nebo 70.

5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se snížení RacB proteinu zajišťuje použitím způsobu vybraného ze skupiny sestávající z následujících kroků:

a) vnesení dvou řetězcové RacB sekvence RNA nukleové kyseliny (RacB-dsRNA) nebo expresní kazety zajišťující její expresi,

b) vnesení RacB antisensní sekvence nukleové kyseliny, nebo expresní kazety, zajišťující jejich expresi,

c) vnesení RacB antisensní sekvence nukleové kyseliny kombinované sribozymem nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi

d) vnesení RacB sensních sekvencí nukleové kyseliny k indukci kosuprese nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi,

107 ··♦·

9· · • · · · 9 9 9 · • · · · · 9 9 9 9 • «·· · 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · 9 9 9 9 9

e) vnesení sekvence nukleové kyseliny kódující pro dominantně negativní RacB protein nebo expresní kazety zajištující její expresi,

ť) vnesení na DNA nebo protein vázaných faktorů proti RacB genům, RacB-RNAs nebo RacB proteinům nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi,

g) vnesení RacB RNA odbourání způsobujících virálních sekvencí nukleové kyseliny a expresních konstruktů nebo expresní kazety zajišťující jejich expresi,

h) vnesení konstruktů k indukci homologové rekombinace na endogenních RacB genech,

i) zavedení mutace do endogenního RacB genu.

6. Způsob podle jednoho nároků 1 až 5, zahrnující (a) stabilní transformace rostlinných buněk s rekombinantní expresní kazetou obsahující ve funkční vazbě s v rostlinách aktivním promotorem sekvenci nukleové kyseliny, kódovanou pro

a) dvou řetězcovou RacB sekvenci RNA nukleové kyseliny nebo

b) RacB antisensní sekvenci kyseliny nukleové nebo

c) RacB antisensní sekvenci nukleové kyseliny kombinované s ribozymem nebo

d) RacB sensní sekvenci nukleové kyseliny k indukci kosuprese nebo

e) dominantně negativní RacB protein,

ť) na DNA nebo protein vázané faktory proti RacB genům, Racb RNA, nebo RacB proteinům,

g) RacB RNA odbourání způsobující virové sekvence nukleové kyseliny, (b) regeneraci rostliny z rostlinné buňky a (c) expresi uvedené sekvence nukleové kyseliny v množství a v čase dostatečném pro vytvoření nebo zvýšeni patogenní rezistence v uvedené rostlině.

7. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že patogen je zvolen ze skupiny sestávající z bakterií, hub, hmyzu, virů a nematodů.

8. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že patogen je zvolen ze skupiny hub sestávající z plasmodiophoramycota, oomycota, ascomycota, chytridiomyceten, zygomyceten, basidiomycota a deuteromyceten.

108 ·· » • · • · • · • 9 » • 9 9 9 • 9 9999

99 9

9. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že rostliny jsou zvoleny z jednoděložných a dvouděložných rostlin.

10. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že rostlina je zvolena ze skupiny jednoděložních rostlin, sestávající z pšenice, ovsa, prosa, ječemen, žita, kukuřice, rýže, pohanky, čiroku, triticale, dinkelu, lněného semena, cukrové třiny.

11. RacB protein z ječmene podle SEQ ID NO: 2.

12. Polypetid kódovaný pro funkční ekvivalent Racb proteinu z ječmene podle SEQ ID NO: 35, 37 nebo 39.

13. Dominantně negativní varianta Racb proteinu z ječmene podle nároku 11.

14. Dominantně negativní varianta podle nároku 13, popsaná SEQ ID NO: 7.

15. Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro RacB protein z ječmene podle nároku 11.

16. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 15, popsaná SEQ ID NO: 1, k ní komplementární sekvence nukleové kyseliny a degenerací geneového kódu odvozené sekvence.

17. Sekvence nukleové kyseliny kódovaná pro funkční ekvivalent RacB proteinu z ječmene podle nároku 12.

18. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 17, popsaná SEQ ID NO: 34, 36, nebo 38, kní komplementární sekvence nukleové kyseliny, a degenerací genetického kódu odvozené sekvence.

19. Sekvence nukleové kyseliny kódované pro dominantně negativní variantu Racb proteinu podle jednoho z nároků 13, nebo 14.

109 • 4 ···· ·· · • · · · 4 • 4 4 · 4 ·

4 4 4 4 4 44*4

4 4 4 4 4 « ·· 44 44 ·

20. Dvouřetězcová RNA molekula k zabránění expresi Racb proteinu, vyznačující se tím, že

a) jeden z obou RNA řetězců je v podstatě identický s alespoň částí RacB sekvence nukleové kyseliny a

b) druhý RNA řetězec je v podstatě identický s alespoň částí komplementárního řetězce RacB sekvence nukleové kyseliny.

21. Dvouřetězcová RNA molekula k zabránění expresi RacB proteinu, zahrnující

a) „sensní“ RNA řetězec zahrnující alespoň jednu rybonukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická s alespoň částí „sensního“ RNA transkriptů sekvence nukleové kyseliny, kódované pro RacB protein a

b) „antisensní“ RNA řetězec, který je v podstatě komplementární sRNA sensním řetězcem uvedeným pod písmenem a).

22. dsRNA molekula podle nároku 20 nebo 21, vyznačující se tím, že oba RNA řetězce jsou navzájem spojeny kovalentně.

23. dsRNA molekula podle jednoho z nároků 20 až 22, přičemž jeden z obou RNA řetězců je kódován alespoň jednou částí sekvence nukleové kyseliny, kódované pro RacB protein podle SEQ Π> NO: 1, 3, nebo 5, nebo jejího funkčního ekvivalentu podle SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, nebo 69.

24. Transgenní expresní kazeta obsahující ve funkční vazbě s promotorem sekvenci nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 15 až 19, nebo sekvenci nukleové kyseliny, kódovanou pro dsRNA molekulu podle jednoho z nároků 20 až 23.

25. Transgenní expresní kazeta obsahující alespoň část sekvence nukleové kyseliny kódované pro RacB protein podle SEQ ID NO: 1, 3, nebo 5, nebo jejího funkčního ekvivalentu podle SEQ ID NO: 34, 36, 38,40,42,44, 46,48,49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, nebo 69, přičemž uvedená sekvence nukleové kyseliny v antisensní orientaci je ve funkční vazbě s promotorem.

110 • 9«

99 9 9 • · 9 • · 9 9

9 9 9

999 99

9» 9999 • 9 9 • 99 •9 9«

9 9 9 9

99 «9

99 9 • 9 9 • 9 9 9 • 9 9···

9 9 9 • 9 9

26. Transgenní expresní kazeta podle jednoho z nároků 24 nebo 25, přičemž transgenní exprimovaná sekvence nukleové kyseliny je ve funkční vazbě s promotorem funkčním v rostlinách.

27. Transgenní expresní kazeta podle nároku 26, přičemž v rostlinách funkční promor je patogenem indukovatelný promotor.

28. Transgenní vektor obsahující expresní kazetu podle jednoho z nároků 24 až 27.

29. Transgenní organismus obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 15 až 19, dsRNA podle jednoho z nároků 20 až 23, expresní kazetu podle jednoho z nároků 24 až 27 nebo vektor podle nároku 28.

30. Transgenní organismus podle nároku 29, zvolený ze skupiny sestávající z bakterií kvasinek, zvířat a rostlin.

31. Transgenní organismus podle nároku 29 nebo 30, zvolený ze skupiny rostlin sestávající z pšenice, ovsa, prosa, ječmene, žita, kukuřice, rýže, pohanky, čiroku, triticaly, dinkelu, lněných semen, cukrové třtiny, řepky, kanoly, řeřichy, arabidopsis, kapusty, sójy, vojtěšky, hráchu, rostlin fazolí, podzemnice, brambor, tabáku, rajče, papriky, slunečnice, salátu, kalenduly, melounu, tykve, nebo cukety.