CN106701781A - 杂交杨抗锈菌的erf转录调控因子基因及其引物和应用 - Google Patents

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王志英
王峰
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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明公开一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因及其引物和应用，其序列如序列表SEQ No.1所示，用于的引物组，如序列表SEQ No.2和3所示，以及该基因在杂交杨对锈病的抗性育种中的应用。本发明的基因在锈菌接种后表达上调，表明该基因在杨树抗锈菌侵染过程中起作用。通过对该基因的研究，在杨树抗病育种中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。

Description

杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因及其引物和应用
技术领域
本发明涉及一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因及其引物和应用。
背景技术
AP2/ERF转录因子家族广泛参与植物体生长发育和对外界刺激的反应，对各种逆境和发育信号做出反应，在植物的生理活动中发挥着重要的作用。AP2/ERF家族转录因子通过参与乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等信号转导途径，调控下游基因的表达，从而综合提高植物的抗逆性。ERF(Ethylene responsive transcription factors)转录因子即乙烯应答因子，又称为乙烯应答件结合蛋白(Ethylene-responsive element binding protein，EREBP)是AP2/ERF家族的一个重要的亚族，为植物所特有。这类亚家族的成员与AP2/ERF家族其它成员一样，都有一个58-59氨基酸的保守序列，即为该类转录因子的DNA结合域，它可以特异地结合DNA序列中的靶序列，从而调控基因的表达。目前为止，在拟南芥中已经发现65个ERF家族的基因，水稻中发现79个，近些年来，又相继从烟草、大豆、葡萄、棉花、辣椒、杨树等多种植物中发现该类转录因子。目前，在拟南芥、烟草等模式植物中，利用过量表达和插入突变体材料，已经研究明确一些ERF转录因子在植物抗病反应中的功能。大部分ERF基因过量表达后，能增强对某一种病害的抗性，或具有一定的广谱抗病性。
杨树是重要的用材林树种，具有较大的经济效益和生态效益。由落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)引起的杨锈病是杨树的主要病害之一。近年来，其危害日趋严重。利用基因工程技术培育抗锈病杨树品种是重要的防病手段，该技术依赖于对杨树抗病相关基因及其调控元件的认识。杨树抗病反应是多种生理过程相互调控的综合反应，ERF类转录因子基因受多种植物激素和生物与非生物胁迫诱导，参与植物体内多种信号转导，在植物体的抗逆性调控中发挥着不可替代的作用；不仅如此，ERF转录因子在调控植物的生长发育中也发挥着一定的作用。植物体内与生长发育有关的信号，以及外界干旱、高盐、激素、病害等信号通过一系列的传递，激发转录因子，通过转录因子与顺式作用元件的相互作用，调控相应基因的表达，最后通过基因产物的作用调节植物的生长发育以及对外界环境的应答反应。因此，转录因子的主要作用是直接或者间接的参与调控基因的表达。正因为该类转录因子与植物的抗逆性密切相关，所以对其调控过程进入深入研究，或可揭示杨树基因在锈菌侵染过程中的表达调控模式，为杨树抗锈菌研究应用于生产实践开辟新道路。
发明内容
基于以上不足之处，本发明提供一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因及其引物和应用。
本发明所采用的技术如下：一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31，其序列如序列表SEQ No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种用于构建杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31的引物组，如下：
上游引物ERF31-F：如序列表SEQ No.2所示，
下游引物ERF31-R：如序列表SEQ No.3所示。
2、如上所述的一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31在杂交杨对锈病的抗性育种中的应用。
本发明的该基因在锈菌接种后表达上调，表明该基因在杨树抗锈菌侵染过程中起作用。通过对该基因的研究，在杨树抗病育种中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中杂交杨叶片总RNA的电泳图；
图2为实施例1中Q-PCR技术检验锈菌接种后pe-ERF31基因表达量变化图；
具体实施方式
本发明提供的调控杂交杨抗锈菌侵染基因表达的转录调控因子基因pe-ERF31来源于杂交杨，命名为pe-ERF31，其长度为679bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的ERF结构域。
实施例1：
调控杂交杨抗锈菌侵染基因表达的ERF转录调控因子基因pe-ERF31的获得及其功能验证。
(一)RNA文库构建及高通量测序：
将落叶松-杨栅锈菌接种于杂交杨叶片，分别取接种落叶松-杨栅锈菌2h、6h、12h、24h、48h、96h和168h共七组健康且新鲜的杂交杨叶片，液氮研磨，CTAB法提取总RNA，并等量均匀混合各组RNA。以相同方法提取未接种落叶松-杨栅锈菌的杂交杨叶片总RNA，并等量均匀混合各组RNA。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，结果如图1所示，图1中Rust+表示接种落叶松-杨栅锈菌后的杂交杨叶片总RNA，Rust-表示未接种落叶松-杨栅锈菌的杂交杨叶片总RNA，电泳条带清晰，28S条带亮度大于18S条带，亮度比值接近2:1，无拖尾模糊现象。分别取2μl RNA样品用Eppendorf分光光度计测定OD 280、OD 260和OD 230值，OD 260/280比值均在1.8-2.0之间，OD 260/230比值均﹥1.8。说明所提取RNA质量较好。根据Illumina/Solexa标准步骤构建Rust+和Rust-文库，构建好的文库送生物公司进行测序。
(二)RNA生物信息学分析
筛选毛果杨(Populus trichocarpa)和拟南芥基因组中的ERF31，结合测序结果，构建本地数据库，进行BLASTP比对(E值<1e-10)，筛选出杂交杨pe-ERF31。比较接种前后的RNA文库测序结果可知，该ERF：pe-ERF31在锈菌接种后比接种前表达量显著上调(log2表达量＝3.84)。
(三)荧光定量Q-PCR验证
选取接种落叶松-杨栅锈菌2h、6h、12h、24h、48h、96h和168h后杂交杨叶片，液氮研磨后CTAB法提取总RNA。应用GoTaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)试剂盒进行第一链cDNA反转录。
根据测序结果合成杂交杨pe-ERF31引物组，
ERF31-F：5`-TCT CTG TGG AGA TGG TGA GAG AA-3`，
ERF31-R：5`-CAG CTC CCA AAT CCT CCA A-3`。
杂交杨18s rRNA基因作为内参基因，
18S-F：5`-CGA AGA CGA TCA GAT ACC GTC CTA-3`，
18S-R：5`-TTT CTC ATA AGG TGC TGG CGG AGT-3`。
应用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCRSystem试剂盒进行Q-PCR扩增。使用2步法PCR，第一步：预变性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40个循环。融解曲线测定从55℃到95℃。对Q-PCR扩增采用相对定量法计算次重复试验初始模板量比值，两配对样本t检验p<0.01，差异显著。结果如图2所示，pe-ERF31基因在落叶松-杨栅锈菌E4菌株接种后24h，96h以及168h时均有显著上调，证实pe-ERF31基因在E4侵染过程中起到一定抗性作用。
<110> 东北林业大学
<120> 杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因及其引物和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 679
<212> DNA
<213> pe-ERF31
<400> 1
atggaaccct cttgttttac cataatcaat acctaaattc agatctctcc cctgaatctt 60
cttttggttc tttagattca tttccatggg atgatctttt tcagagcagt tcccttcctt 120
ttaacaccag tgactcaggg gagatggtac tgtttaatga tttaggcgcc gatggtgcca 180
aggagtcctc ggaatctaat tcctcgagtg gaattaagga agaggaagtg acttcaaatg 240
ccaaagaaga ggagccaaag aaagagaaat cctacagagg ggttaggagg cggccatggg 300
gtaaatatgc tgcagagata agggattcta caagaaatgg cgtccgggtt tggctaggaa 360
cctttgatag tgcagaggcg gctgctttgg ttatgatcaa gcagcatttt ccatgcgggg 420
ttcgatggct gtactaaatt tctctgtgga gatggtgaga gaatcacttg aagacatgaa 480
gtatagatgt gaagatgggt gttcgcctgt ggtggcactt aagaggagac actccgtgag 540
aagaaaatca acaagtagga aaagtaaagt gaatcaagta gctaatacta gacaacaaaa 600
tgtggtggtt ttggaccatt tgggagctga ctaccttgaa gagcttctga attcatgtga 660
gagctctagt tcttggtga 679
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> ERF31-F
<400> 2
tctctgtgga gatggtgaga gaa 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> ERF31-R
<400> 3
cagctcccaa atcctccaa 19

Claims (3)

1.一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31，其特征在于，其序列如序列表SEQ No.1所示。
2.一种用于构建杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31的引物组，其特征在于，如下所示：
上游引物ERF31-F：如序列表SEQ No.2所示，
下游引物ERF31-R：如序列表SEQ No.3所示。
3.如权利要求1所述的一种杂交杨抗锈菌的ERF转录调控因子基因pe-ERF31的应用，其特征在于，该基因在杂交杨对锈病的抗性育种中的应用。
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