CN114438103A - 调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用。本发明提供了一个NAC转录因子基因OsNAC15，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，该基因编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。所述基因在参与水稻对干旱和盐胁迫耐受性中发挥作用。通过在水稻植株中超量表达实现调控水稻对干旱和盐胁迫的耐受性，从而可应用于水稻耐旱和耐盐品系的培育，同时可作为耐旱和耐盐性水稻的标记基因。

Description

调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因的功能鉴定及应用。

背景技术

随着全球气候变暖以及环境污染的日益严重，极端天气出现的强度和频次逐年增加，对农业生产的稳定性和可持续性带了极大的威胁，干旱成为限制水稻稳定增收的主要因素。每年因干旱导致水稻减产的量达到总产量的13.1％，这严重威胁着国家粮食安全(Guo H,Wang R,Garfin GM,et al.Rice drought risk assessment under climatechange:Based on physical vulnerability a quantitative assessment method.SciTotal Environ,2021,751:141481)。我国也是盐碱地大国，在盐碱地面积排前10名的国家中位居第三，盐碱荒地和影响耕地的盐碱地总面积超过5亿亩，其中具有农业发展潜力的占中国耕地总面积的10％以上(Shi Lin Wang,Wen Xia Cao,Xiao Jun Wang,etal.Distribution of soil moisture and salt of Tamarix ramosissima plantationin desert saline-alkali land of Hexi Corridor Region,China.Ying Yong ShengTai Xue Bao.2019,30(8):2531-2540)。实践证明选育并推广具有抗旱性和耐盐性的水稻品种是抵御干旱胁迫和利用盐碱地最有效的方法，植物在漫长的进化过程中，形成了各种抵御逆境胁迫的机制，其中转录因子所调控的抗逆机制发挥着重要作用，转录因子主要在细胞核中发挥功能，通过与所调控基因的启动子识别并结合，从而驱使或抑制相关基因的表达(Feng K,Hou XL,Xing GM,et al.Advances in AP2/ERF super-familytranscription factors in plant.Crit Rev Biotechnol,2020,40:750-776；XiangZhang,Yan Long,Jingjing Huang,et al.OsNAC45 is Involved in ABA Response andSalt Tolerance in Rice.Rice,2020,13(1):79-92)。因此，挖掘转录因子基因的功能，利用基因工程育种方法，培育抗旱和耐盐水稻品种对抵御非生物逆境胁迫和农业生产有着十分重要的实践意义。

植物中转录因子种类较多，高等植物中已发现有60多类转录因子家族,根据转录因子保守结构域的差异，将植物转录因子分为NAC、MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF和Dof等转录因子家族(Edoardo Salladini,Maria L M

Frederik F Theisen,et al.IntrinsicDisorder in Plant Transcription Factor Systems:Functional Implications.Int JMol Sci,2020,21(24):9755-9790)。Souer等在矮牵牛中发现了NAM突变体抑制根尖分生组织的生长，Aide等发现拟南芥中与ATAF1(含NAM结构域)同源性较高的基因CUC1/CUC2能影响花的生长的发育，并将这类蛋白N端保守的结构域命名为NAC(NAM、ATAF1、CUC1/CUC2)(E Souer,A van Houwelingen,D Kloos,et al.The no apical meristem gene of Petuniais required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed atmeristem and primordia boundaries.Cell,1996,85(2):159-170；M Aida 1,T Ishida,H Fukaki,et al.Genes involved in organ separation in Arabidopsis:an analysis ofthe cup-shaped cotyledon mutant.Plant Cell,1997,9(6):841-857)。NAC转录因子家族是成员数量较多的转录因子家族之一，NAC转录因子由N端保守的NAC结构域和C端的转录激活结构域组成。NAC结构域能与所调控基因的DNA序列结合，根据其同源性，将NAC结构域进一步分为A、B、C、D、E共5个亚结构域。其中A、C、D高度保守，B、E的保守性相对较低，NAC结构域功能的差异性可能与B、E序列保守性有关NAC转录因子的C端与转录激活活性或转录抑制激活活性有关，在氨基酸序列上有较大的差异性(Hisako Ooka,Kouji Satoh,Koji Doi,etal.Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsisthaliana.DNA Res,2003,10(6):239-247)。

到目前为止，在水稻、拟南芥和棉花中分别发现了151、117和145个NAC成员。植物中不同NAC转录因子发挥的功能各有差异，在植物生长发育、生物和非生物逆境胁迫响应等方面都发挥着重要功能。OsNAC45基因功能缺失后，水稻中ABA含量积累增加，提高了水稻的耐盐性(hang X,Long Y,Huang J,Xia J.OsNAC45 is Involved in ABA Response andSalt Tolerance in Rice.Rice,2020,13(1):79)。在拟南芥中异源超表达来源于小麦的NAC29基因，转基因拟南芥的抽薹和开花时间延迟，并通过抑制ABA响应过程提高拟南芥的耐旱能力；进一步研究发现，TaNAC29过表达材料中SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶的活性增加，H₂O₂的含量减少，增强小麦对盐的耐受性(Huang Q,Wang Y,Li B,et al.TaNAC29,aNACtranscription factor from wheat,enhances salt and drought tolerance intransgenic Arabidopsis.BMC Plant Biol,2015,15:268；Xu Z,Gongbuzhaxi,Wang C,etal.Wheat NAC transcription factor TaNAC29 is involved inresponse to saltstress.Plant Physiol Biochem,2015,96:356-363)。玉米NAC49进行过表达后，与气孔形成相关基因ZmTMM、ZmSDD1、ZmMUTE、ZmFAMA的表达受到影响，叶片上气孔的密度减小，在干旱情况下植株水分的散失量减小，最终提高玉米对干旱的抗性(Xiang Y,Sun X,Bian X,etal.The transcriptionfactor ZmNAC49 reduces stomatal density and improvesdrought tolerance in maize.J Exp Bot,2021,72:1399-1410)。现有研究结果表明，NAC转录因子可能参与植物对干旱和盐胁迫响应的调节。

迄今为止，尚未见有关OsNAC15基因通过正调控在水稻干旱和盐胁迫耐受性中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个水稻抗旱性和耐盐性相关NAC转录因子基因OsNAC15。该基因是基于与拟南芥的亲缘进化关系和非生物逆境胁迫分析，在水稻基因中克隆得到。申请人将该基因命名为OsNAC15基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或至少为50％同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

本发明的另一个目的提供了一个NAC转录因子OsNAC15在参与水稻对干旱和盐胁迫耐受性中的作用。通过遗传转化，使SEQ ID NO：1所示的序列或与其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表达。本发明基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列，来表达到调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的目的，从而应用于水稻耐旱和耐盐品系的培育，同时可作为耐旱和耐盐性水稻的标记基因。

本发明通过对水稻OsNAC15基因进行非生物逆境胁迫表达模式分析，发现OsNAC15的表达量受到脱水胁迫和盐胁迫的诱导。利用农杆菌介导的遗传转化方法在水稻中超量表达或敲除该基因，发现超量表达该基因的转基因材料对干旱和盐胁迫的耐受性增强，而突变体材料则对干旱和盐胁迫更加敏感。由此表明，OsNAC15基因是水稻对干旱和盐胁迫耐受性响应的正调控因子。此外本发明涉及含有该基因或者同源基因片段的载体和设计该基因或者功能类似增强植物对干旱和盐胁迫耐受性在农业育种中的应用。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人克隆得到一种调控水稻干旱和盐胁迫耐受性的水稻NAC转录因子OsNAC15基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述调控水稻干旱和盐胁迫耐受性的水稻NAC转录因子OsNAC15基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还涉及到OsNAC15基因在调控水稻干旱和盐胁迫耐受性中的应用。

更详细的技术方案如下所述：

申请人前期的研究是利用RT-qPCR方法分析水稻OsNAC15基因受非生物逆境胁迫诱导的表达模式，根据基因诱导表达情况，最终确定研究目的基因OsNAC15(见图1中的A图)。

从粳稻品种“日本晴”中提取叶片RNA，利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司,美国)，将其反转录合成cDNA。PCR反应条件：65℃5min，50℃60min，70℃10min。利用水稻基因组信息，合成扩增引物正向引物OsNAC15-full-F(5’ATGTCGGAGTCGGAGGTGTCGG3’)和反向引物OsNAC15-full-R(5’TCAGGCCTTCCATATGTAGGAG3’),扩增出OsNAC15基因的cDNA全长(906bp)。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃2min 50sec，28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码301个氨基酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。对氨基酸序列进行同源比对分析发现，OsNAC15基因与水稻CUC1基因同源度最高，其次是OsNAC2(见图1中的B图)。

本发明分别构建了OsNAC15基因的超量表达载体pU1301-3×Flag-OsNAC15(见图2中的A图)和CRISPR/Cas9-OsNAC15基因敲除载体(图2中的B图)，申请人利用农杆菌介导的转化方法将这两个载体分别转化到粳稻品种“日本晴”中，得到该基因的超表达的阳性株系和CRISPR/Cas9阳性株系，检测其表达量并选取表达量符合的2个T1代超表达株系(编号为OE-NAC15-2、OE-NAC15-25，见图3中的A图)及2个CRISPR/Cas9转化株系(在靶位点上下游设计检测引物，扩增出相应的片段并进行测序，筛选靶标位点发生基因编辑，造成大片段缺失或者翻译提前终止的材料进行后续实验，最终选择编号为osnac15-1和osnac15-8两个提前终止的株系,见图3中的B图)，作为后续试验材料。

本发明对OsNAC15转基因材料(超量表达株系和CRISPR/Cas9突变株系)(CRISPR/Cas9突变株系的培育方法和选择标准是公知的方法，是水稻转基因的方法之一，该突变体并非偶然得到，而是利用CRISPR/Cas9技术创造的，CRISPR/Cas9是目前进行基因编辑的常用技术，实际上也是通过转基因获得的生物材料)进行干旱和盐胁迫鉴定，发现与对照材料相比，OsNAC15超量表达材料对干旱和盐胁迫耐受性明显提高，osnac15突变体对干旱和盐胁迫更加敏感(图4)。在干旱胁迫处理10d后，脱落酸(ABA)合成(OsNCED1、OsNCED2)和响应相关基因(OsAREB8、OsEREB1B、OsRD22)的表达量在超表达材料中的表达量显著高于野生型(即非转基因材料)和突变体材料(参见：图5中的A图、图5中的B图)；盐胁迫处理12d时，ABA合成基因(OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3)和ABA响应相关基因(OsAREB8、OsEREB1G、OsRD22)的表达量在突变体材料中显著下调，在超表达材料中显著升高(参见：图5中的C图、图5中的D图)。由此可见，OsNAC15正调控水稻对干旱和盐胁迫的耐受性。

本发明的优点在于：

(1)本发明通过对水稻NAC15基因在非生物逆境胁迫下的表达模式进行分析，该基因的表达量在脱水和盐胁迫下显著升高，同时发现OsNAC15是水稻干旱和盐胁迫耐受性的正调控因子。通过遗传转化，超量表达该基因获得耐盐和抗旱的水稻新品系，也可以作为水稻抗性材料的标志基因。

(2)虽然在拟南芥和水稻中已经克隆了多个NAC基因，并对其进行了功能验证，但目前对水稻中NAC基因的研究报道还很少，本发明克隆的OsNAC15基因丰富了水稻中对这类功能基因的研究。

(3)超量表达OsNAC15的水稻对干旱和盐胁迫的耐受性显著增强，而osnac15突变体则对干旱和盐胁迫更加敏感。这表明OsNAC15基因参与了水稻对干旱和盐胁迫的抗性响应，并扮演着重要的角色。通过提高OsNAC15基因的表达量能够调节水稻体内ABA含量的积累，从而提高水稻对干旱和盐胁迫的抗性。

(4)选育抗旱和耐盐的水稻材料一直为水稻育种家所重视，OsNAC15的发现和利用将有助于解决生产上水稻抗旱和耐盐品种难获得的问题。由于目前生产上干旱和盐胁迫造成的水稻产量损失巨大，选育抗旱和耐盐品种显得尤为重要，应用OsNAC15基因将有助于培育抗旱和耐盐的水稻新品种。

附图说明

图1：OsNAC15诱导表达模式以及NAM/CUC3亚家族进化树分析图。附图标记说明：图1中的A图和图1中的B图为OsNAC15在野生型“日本晴”水稻在脱水和盐胁迫处理9h的表达模式分析，与对照相比，受到明显的诱导表达。图1中的C图为NAM/CUC3亚家族进化树分析。选取拟南芥NAC家族成员进行进化树分析和生物信息学分析，结果表明OsNAC15基因与水稻(Oryza sativa L.)OsCUC1基因的序列同源性最高，其次是OsNAC2基因的序列。

图2：OsNAC15超表达载体和CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建(技术路线)。附图标记说明：图2中的A图是pU1301-3×Flag-OsNAC15超量表达载体的图谱。图2中的B图是CRISPR/Cas9-OsNAC15基因被敲除后的载体图谱。

图3：转基因后代的检测结果。附图标记说明：图3中的A图是OsNAC15超量表达材料(T1代)表达量的检测结果。附图标记说明：选择OE-NAC15-2(中等表达水平)和OE-NAC15-25(高表达水平)的两个水稻转基因株系进行后续研究。图3中的B图和C图是osnac15突变体基因编辑类型检测。选择osnac15-1和osnac15-8两个翻译提前终止的突变体株系进行后续的研究。

图4：对照材料与转基因材料干旱和盐胁迫的抗性鉴定。附图标记说明：图4中的A图为正常条件下对照材料和转基因材料的生长状态。图4中的B图为对照材料和转基因材料进行干旱胁迫处理10d的表型观察。图4中的C图为对照材料和转基因材料进行盐胁迫胁迫处理12d的表型观察。结果表明，与对照材料相比，OsNAC15超量表达更抗旱和耐盐，而osnac15突变体则对干旱和盐胁迫十分敏感。

图5：对照材料与转基因材料干旱和盐胁迫处理后ABA合成及响应相关基因表达分析。附图标记说明：图5是干旱和盐胁迫处理后，ABA合成和响应相关基因OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3、OsAREB8、OsRD22、OsDREB1A、OsDREB1F等在超表达、突变体和野生型中表达水平的检测结果。在干旱胁迫下，突变体材料中ABA合成途径中OsNCED1、OsNCED2的表达量显著下调，而在过表达材料中表达量显著增加(见图5中的A图)。OsAREB8、OsEREB1B、OsRD22等ABA响应基因的表达量在超表达材料中上调表达，而在突变体材料中的表达量降低(见图5中的图B)。在MgCl₂胁迫下，ABA合成关键基因OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3的表达量在敲除材料中降低，而在超表达材料中显著升高(见图5中的C图)。osnac15-1和osnac15-8中响应ABA的关键基因(OsAREB8、OsDREB1A、OsDREB1F)的表达量显著下降，但在超表达中表达量增加(见图5中的D图)

具体实施方式

对序列表的序列的说明：

SEQ ID NO：1是本发明克隆的OsNAC15基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是OsNAC15基因编码的蛋白质序列。

实施例1：OsNAC15基因的分离与克隆

1、水稻RNA提取与反转录

从野生型粳稻品种“日本晴”(一个公开使用的水稻材料)水稻新鲜叶片中提取总RNA，采用植物RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取总RNA，使用方法参照TaKaRa PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书。将获得的RNA样品首先进行消除基因组DNA反应，去除DNA反应液体系：2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser,1.0μg RNA,6.0μL RNase free ddH₂O，混匀后，在42℃干浴锅中反应2min；取出消化后的混合液进行反转录反应。反应体系：1.0μL Prime Script RT EnzymeMix I，4.0μL RT Primer Mix，4.0μL 5×Prime Script Buffer 2，1.0μL RNase-FreeddH₂O，10.0μL消化后混合液。反转录反应条件：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保存。

2、OsNAC15基因受脱水和盐胁迫诱导表达模式分析

为了探究OsNAC15基因是否参与了水稻的抗旱和耐盐过程，本发明利用RT-qPCR的方法检测野生型水稻和干旱和盐胁迫处理后OsNAC15基因转录水平上的相对表达量变化，结果表明OsNAC15基因极显著受到脱水和盐胁迫诱导上调表达。野生型日本晴水稻属于粳型常规水稻，在温室长至4叶期时，进行干旱和盐胁迫处理。干旱胁迫是水稻在温室自然干旱处理，处理期间不灌溉水；盐胁迫分为NaCl和MgCl₂胁迫，NaCl胁迫是用200mm NaCl替换营养液进行灌溉，MgCl₂胁迫是用150mm MgCl₂灌溉水稻幼苗。在胁迫处理不同时间点取叶片抽提总RNA，反转录成cDNA作为模板。设计OsNAC15特异引物正向引物qOsNAC15-F(5’CGACGGGGATGAGGACGAAC3’)和反向引物qOsNAC15-R(5’GCGGCATTTGGGCAATCTTT3’)，用水稻内源肌动蛋白Actin(基因登录号AK101613)作为内参基因Actin-F(正向引物5’GAGACCTTCAACACCCCTGCTA-3’)和反向引物Actin-R(5’ATCACCAGAGTCCAACACATTACCT3’)。采用实时定量RT-qPCR分析试剂盒(

Geeen PCR Master Mix，参照试剂盒使用说明书操作)，在BIO-Rad CFX Connect(BIO-Rad公司制造)荧光定量PCR仪上进行反应。结果显示，在OsNAC15极显著收到脱水和盐胁迫诱导上调表达，暗示OsNAC15可能参与水稻对干旱和盐胁迫的抗性响应。

3、OsNAC15基因序列获得

利用正向引物OsNAC15-full-F(5’ATGTCGGAGTCGGAGGTGTCGG3’)和反向引物OsNAC15-full-R(5’TCAGGCCTTCCATATGTAGGAG3’)，用粳稻“日本晴”的cDNA作模板克隆得到OsNAC15的全长序列。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃2min50sec，30个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，将阳性菌株保存在-80℃。获得所需的OsNAC15基因的开放阅读框(ORF)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过BlastX(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)确定OsNAC15基因的开放阅读框(ORF)所对应的301个氨基酸，推测OsNAC15基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

实施例2：OsNAC15的超量表达以及CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

1、超量表达载体的构建

为了验证OsNAC15的基因功能，申请人构建了超量表达载体来转化粳稻品种“日本晴”的胚性愈伤组织。以实施例1中得到的OsNAC15阳性克隆的质粒为模板，设计超表达引物，在引物两端分别加pU1301-3×Flag载体同源区段，将所述的引物分别命名正向引物OsNAC15-Flag-F(5’GAACGATAGCCGGTACCATGTCGGAGTCGGAGGTGTC3’)和反向引物OsNAC15-Flag-R(5’CTTTGTAATCGGATCCGGCCTTCCATATGTAGGAG3’)，进行PCR扩增。将所得的PCR产物进行琼脂糖电泳及纯化回收(购自天根生化科技(北京)有限公司)，琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存备用。在液体LB培养基中(添加50mg/L卡那霉素)活化pU1301-3×Flag质粒(质粒来自华中农业大学谢卡宾教授团队)菌株，提取质粒后，用BamH I和KpnI行双酶切，将酶切产物纯化回收后于-20℃保存备用。将上述酶切回收的OsNAC15目的片段与线性化载体pU1301-3×Flag进行连接反应，具体的反应体系为：1.0μL ExnaseⅡ，2μL 10×T4 ligaseBuffer，100ng OsNAC15酶切产物，80ng线性化pU1301-3×Flag载体，用无菌ddH₂O补足体积至5.0μL。25℃反应1h后，进行大肠杆菌热激转化，所用菌株为大肠杆菌DH5α。具体转化流程为：将-80℃保藏的大肠杆菌DH5α感受态细胞冰浴溶化，向5μL连接反应中加入50μL感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置15-30min；冰浴结束后，42℃水浴90sec，然后迅速置于冰上3min；加入400μL LB液体培养基，于37℃，200rpm，复苏培养45min；复苏完成后，5000rpm，离心2min，弃上清300μL，用剩余上清重悬菌体；将菌液均匀涂在LB的固体培养基(添加50mg/L卡那霉素)上，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，选择2-3个阳性克隆测序，保存没有任何突变的菌株及相应质粒，命名为重组质粒pU1301-3×Flag-OsNAC15。将测序正确的重组质粒pU1301-3×Flag-OsNAC15通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105感受态，挑取单菌落于YEP液体培养基(YEP液体培养基为常用培养基，本实施例中添加了30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素),28℃振荡培养36-48h，PCR检测后，阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。

2、CRISPR/Cas9基因敲除载体构建

利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室开发的CRISPR-P 1.0系统(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)设计OsNAC15的guide RNA(gRNA)。依据OsNAC15DNA序列以及基因结构，设计了两个gRNA(即：gRNA1：5’AATGCACGAGGGCATGATCG 3’；gRNA2：5’GTGTTCACATTGCCAGGAAC3’)。合成接头引物NAC15-gRNA1-F(5’GCAGTTGTTGAGGTTCACGTGTTTTAGAGCTAGAAATA3’)，NAC15-gRNA1-R(5’ACGTGAACCTCAACAACTGCTGCACCAGCCGGGAAT3’)，NAC15-gRNA2-F(5’TACATGGGCCGCGCCCCCCGGTTTTAGAGCTAGAAATA3’),NAC15-gRNA2-R(5’CGGGGGGCGCGGCCCATGTATGCACCAGCCGGGAAT 3’)，以及gRNA连入表达载体pRGEB32所需的接头引物S5AD5-F(5’CAGATGATCCGTGGCAACAAAG3’)和S5AD5-R(5’TTTCTAGCTCTAAAACAAAA3’)；L5AD5-F(5’CAGATGATCCGTGGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAG3’)和L5AD5-R(5’TTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG3’)。以pGTR质粒为模板，用L5AD5-F/NAC15-gRNA1-R、NAC15-gRNA1-F/NAC15-gRNA2-R、NAC15-gRNA2-F/L5AD5-R三对引物进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃30sec，26个循环；72℃延伸7min。将得到的3个RCR产稀释20-50倍后，等体积混匀。取1μL上述混合物为模板，用S5AD5-F/S5AD5-R引物对进行扩增。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃45sec，26个循环；72℃延伸7min。将所得的产物(即串联两个gRNA的DNA片段)进行纯化回收，并测定浓度；将CRISPR/Cas9表达载体pRGEB32用BsaI进行酶切，将酶切产物进行纯化回收，得到线性化的pRGEB32载体。利用infusion重组的方法，将纯化的PCR产物连入到线性化的pRGEB32载体中。具体反应条件：PCR产物100ng,线性化的pRGEB32载体50-80ng，infusion酶(购自takara公司)1μL，10×infusion Buffer 1μL，加ddH₂O至10μL，50℃反应30min。将上述反应产物热激转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆进行阳性检测并测序，保存阳性菌株和质粒，并将阳性质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态。挑取单菌落于YEP液体培养基(YEP液体培养基为常用培养基，本实施例中添加了30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素),28℃振荡培养36-48h，PCR检测后，阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。本实施例中涉及的载体pGTR和pRGEB32由华中农业大学谢卡斌教授惠赠。

实施例3：水稻的遗传转化

1.诱导愈伤组织：提前准备无菌的愈伤组织诱导培养基(见后所示的培养基配方和制备方法)，100mL的三角瓶中倒入40-50mL的诱导培养基。将水稻种子(粳稻品种为“日本晴”，同前)剥掉颖壳，在超净工作台中进行无菌操作，先用75％乙醇溶液浸泡种子1min，再用0.1％HgCl₂溶液浸泡种子15-20min，最后用无菌水洗涤5-10次。每瓶培养基接种8-12粒种子，28℃暗培养，40-50天诱导愈伤组织的产生；

2.继代：提前2-3天配制继代培养基(见后所示的培养基配方和制备方法)，继代培养基配方同愈伤组织诱导培养基。按常规方法对培养基进行灭菌，使培养基适当干燥(湿度太大的培养基不利于愈伤组织的生长)。从诱导的愈伤组织中，挑选淡黄色，颗粒状，干燥，活力强的愈伤组织转入继代培养基中，28℃暗培养20d；

3.预培养：提前用500mL三角瓶分装无菌预培养培养基，试验前每250mL培养基中加入300μL 100Mm乙酰丁香酮，5mL 40％葡萄糖，混匀后，每瓶装8-10皿培养基；从继代的愈伤组织中，挑取外观为淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入预培养培养基的培养皿中，每个皿接种60-80块左右，绿豆大小的愈伤组织，愈伤组织较大可用无菌镊子夹碎，2于8℃暗培养3d；

4.侵染与共培养：试验前2d，将含有目的基因(OsNAC15)的农杆菌菌株在含有抗生素(30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的平皿上划线，活化。准备悬浮培养基(100mL/菌株)，共培养基(250mL/菌株)，大平皿，小平皿(里面垫有吸水纸和滤纸，使用前灭菌并烘干)，准备250mL无菌三角瓶若干。将划线培养的农杆菌刮入1/2N6悬浮培养基中(N6培养基是常用植物组织培养基，加入100μL乙酰丁香酮(AS)+2mL 50％葡萄糖)，于28℃，200rpm，培养30min。摇菌同时将预培养的愈伤组织收集到250mL无菌三角瓶中。将农杆菌菌液倒入愈伤组织中，浸泡30min。倒去菌液，先将装有愈伤组织的三角瓶倒置于无菌小皿上，吸干菌液，再把愈伤组织铺在无菌大皿的滤纸上，上面盖一张滤纸，用灭菌镊子轻压愈伤组织，吸干表面菌液，自然干燥3-4h。将充分干燥的愈伤组织用灭菌的勺子均匀的铺到共培养基上(铺上之后最好不要再挪动，以减少培养基与愈伤组织表面的接触，防止农杆菌的过度生长)，于19℃暗培养3d。

5.水洗与筛选(简称S1培养基)：准备无菌水，大皿，小皿(含有吸水纸和滤纸)，250mL三角瓶若干，筛选培养基；将共培养后的愈伤组织转移至水洗杯中，倒入灭菌蒸馏水至完浸没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30sec，倒掉灭菌蒸馏水。如此重复2-3次。加入灭菌蒸馏水至完全浸没愈伤组织，盖上盖子摇晃混匀，振荡20-30sec，静置5min，倒掉灭菌蒸馏水。加入灭菌蒸馏水至完全浸没愈伤组织，盖上盖子摇晃混匀，振荡20-30sec，静置10min。最后倒掉灭菌蒸馏水，加入含500mg/L羧苄青霉素的灭菌蒸馏水，200rpm摇晃30min。倒掉蒸馏水，自然干燥愈伤。将处理后愈伤组织转移至筛选培养基中，28℃暗培养20d；

6.筛选(简称培养基S2)：准备筛选培养基S2，每250mL培养基中加入300μL羧苄青霉素，250μL潮霉素，5mL 50％葡萄糖，倒皿后应在超净工作台上开盖用无菌风吹1.5-2h，筛选培养基表面不宜太湿，否则筛选时不利于农杆菌的抑制和抗性愈伤组织的生长；从S1培养基上挑选干燥的、没有农杆菌污染的愈伤，摆放在S2培养基上(每皿接种25到30块愈伤组织)，28℃暗培养20d；

7.愈伤组织分化：提前3-4d准备分化培养基。挑选淡黄色，致密，干燥的抗性愈伤组织小块，接种到分化培养基中，于28℃光照(光照强度3000Lux)培养40d，在培养后期会分化出幼苗。

8.生根：提前2-3d准备生根培养基。准备灭菌空皿4-5个；将分化出的苗子从分化培养基中拔出，一块愈伤只取一棵，用剪刀剪去过长的叶子和根，接入生根管内，每根管内接入1-2株幼苗；在光培养室(光照强度3000Lux)培养15-20d，等根生长充分后，炼苗4-7d，然后移栽到温室。

本发明的实施例中涉及的水稻遗传转化的专用培养基配方及其配制：

母液配方：

1.MSmax储备液(10X)

逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL。

2.MSmin储备液(100X)

注：Na₂MoO₄必须单独溶解，再与其它组分混合，加蒸馏水定容到1000mL，室温保存。

3.N6max储备液(10X)

逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL。

4.N6min储备液(100X)

用蒸馏水定容到1000mL，室温保存。

5.Fe²⁺-EDTA储备液(100X)

往一个试剂瓶中加入300mL蒸馏水和FeSO₄·7H₂O 2.78g；

往另一试剂瓶中加入300mL蒸馏水，并加热到70℃，然后加入Na2EDTA·2H₂O3.73g，溶解好后，将两个试剂瓶中的溶液混合，在70℃保温2小时，然后加蒸馏水定容到1000mL，4℃避光保存。

6.Vitamin储备液(100X)

加蒸馏水定容到1000mL，4℃保存。

7.AAmax储备液(10X)

加蒸馏水定容到1000mL，室温避光保存。

8.AAmin储备液(100X)

Na₂MoO₄单独溶解，然后与其它组分混合并加蒸馏水定容到1000mL，室温避光保存。

9. 6-BA储备液(即6-苄基氨基嘌呤，1mg/mL)

6-BA 100mg，加入1.0mL 1M KOH振摇至6-BA溶解，然后加蒸馏水定容到100mL，室温保存。

10.KT储备液(1mg/mL)

KT 100mg；加入1.0ml 1M KOH振摇至KT溶解，然后加蒸馏水定容到100mL，室温保存。

11. 2,4-D储备液(1mg/mL)

2,4-D 100mg，加入1.0ml 1M KOH振摇5min，然后加10mL蒸馏水并振摇至2,4-D溶解，用蒸馏水定容到100mL，室温保存。

12. 100μM AS储备液

AS 0.196g；

DMSO(二甲亚砜) 10mL；

用1.5mL离心管分装，4℃保存。

13.IAA储备液(即吲哚乙酸，1mg/mL)

IAA 100mg，加入1.0ml 1N KOH振摇至IAA溶解，然后用dH₂O定容到100ml，室温避光保存。

14.NAA储备液(即萘乙酸1mg/mL)

NAA 100mg，加入1.0mL 1M KOH振摇至NAA溶解，再用蒸馏水定容到100mL，室温避光保存。

培养基配方：

1.诱导培养基

加蒸馏水定容至1000mL。

2.继代培养基

加蒸馏水定容至1000mL。

3.预培养培养基

加蒸馏水定容至250mL。

4.共培养培养基

加蒸馏水定容至250mL。

5.悬浮培养基

加蒸馏水定容至100mL。

6.筛选培养基

加蒸馏水定容至250Ml

7.分化培养基

加蒸馏水定容至1000mL。

8.生根培养基

加蒸馏水定容至1000mL。

实施例4：对转基因水稻材料进行干旱和盐胁迫的抗性鉴定试验

干旱胁迫试验：将水稻野生型和遗传转化水稻材料在蛭石中用水稻营养液(常规，报道的营养液)培养至四叶期时，倒掉托盘中多余水稻营养液，然后进行自然干旱处理。

盐胁迫试验：NaCl胁迫处理是利用200mm NaCl溶液代替水稻营养液灌溉四叶期水稻幼苗，MgCl₂胁迫是用150mm MgCl₂溶液对水稻材料进行浇灌。

正常条件下，osnac15-1、osnac15-8、OE-2和OE-8的生长无明显差异。但在干旱处理下，osnac15-1、osnac15-8的叶片全部卷曲枯萎，植株死亡；而OE-2和OE-8的有少许叶片枯死，大部分叶片持绿、舒展，生长状态正常。NaCl胁迫处理10d时，osnac15-1、osnac15-8、OE-2、OE-8和野生型材料之间无明显的表型差异。当用150mmol/L MgCl₂溶液处理12d时，osnac15-1全部枯黄死亡，osnac15-8材料大部分枯死；而过表达材料有少量植株死亡。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用

<141> 2022-03-15

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> 水稻(oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(906)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(906)

<400> 1

atg tcg gag tcg gag gtg tcg gtg atc aac cag ctg gag gag gag gag 48

Met Ser Glu Ser Glu Val Ser Val Ile Asn Gln Leu Glu Glu Glu Glu

1 5 10 15

act cgg ctg gag ctg ccg ccg ggg ttc cgg ttc cac ccc acc gac gag 96

Thr Arg Leu Glu Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu

20 25 30

gag gtg gtg acc cac tac ctc acc cgc aag gcc cag gac cgg agc ttc 144

Glu Val Val Thr His Tyr Leu Thr Arg Lys Ala Gln Asp Arg Ser Phe

35 40 45

tcc tgc gtc gtc atc gcc gac gtg aac ctc aac aac tgc gag cca tgg 192

Ser Cys Val Val Ile Ala Asp Val Asn Leu Asn Asn Cys Glu Pro Trp

50 55 60

gac ctc cca agc aag gcg aag atg ggg gag aag gag tgg ttc ttc ttc 240

Asp Leu Pro Ser Lys Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe

65 70 75 80

tgc cac aag gac cgc aag tac ccg acg ggg atg agg acg aac cgg gcg 288

Cys His Lys Asp Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Met Arg Thr Asn Arg Ala

85 90 95

acg gcc agc ggg tac tgg aag gcc acc ggg aag gac aag gag atc ttc 336

Thr Ala Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe

100 105 110

cgc ggc cgc ggc ctc ctc gtc ggc atg aag aag acg ctc gtc ttc tac 384

Arg Gly Arg Gly Leu Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr

115 120 125

atg ggc cgc gcc ccc cgc ggc gag aag acc ccc tgg gtc atg cac gaa 432

Met Gly Arg Ala Pro Arg Gly Glu Lys Thr Pro Trp Val Met His Glu

130 135 140

tac cgc ctc gac ggc aag ctt ccc ccc aac ctc ccc cgc tcc gca aag 480

Tyr Arg Leu Asp Gly Lys Leu Pro Pro Asn Leu Pro Arg Ser Ala Lys

145 150 155 160

gag gaa tgg gcg gtt tgc cgg gtg ttc aac aaa gac ttg gcg gca aag 528

Glu Glu Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys Asp Leu Ala Ala Lys

165 170 175

att gcc caa atg ccg ccg cct ccc ttc ccg cgc aac gac tcc ttc gac 576

Ile Ala Gln Met Pro Pro Pro Pro Phe Pro Arg Asn Asp Ser Phe Asp

180 185 190

ctc gac ctc gac gac ttc ctc cac ctc gac gcc gac ctg ccg ccg ctc 624

Leu Asp Leu Asp Asp Phe Leu His Leu Asp Ala Asp Leu Pro Pro Leu

195 200 205

atc gac gac ccc ttc gcc tcc acc tcc acg ctc aag acg gag cca cct 672

Ile Asp Asp Pro Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Lys Thr Glu Pro Pro

210 215 220

ccg ccg gcc aac ctg atg cac aac cac tac ggc tac ttc tcc ctc ccg 720

Pro Pro Ala Asn Leu Met His Asn His Tyr Gly Tyr Phe Ser Leu Pro

225 230 235 240

gcg tca gcg acc aat tat aac cac agc tcc ggc gcc atg gcg gac cag 768

Ala Ser Ala Thr Asn Tyr Asn His Ser Ser Gly Ala Met Ala Asp Gln

245 250 255

gcg att cgg agg ttc tgc aag gcg gag gcg tcg acg gcg tgc ttc tcc 816

Ala Ile Arg Arg Phe Cys Lys Ala Glu Ala Ser Thr Ala Cys Phe Ser

260 265 270

ggc gcc gac gct gac gtg gat ccg gtg gtg gac gag ctg ctc tcc ttc 864

Gly Ala Asp Ala Asp Val Asp Pro Val Val Asp Glu Leu Leu Ser Phe

275 280 285

ccg gac tcc atc acg gac tac tcc tac ata tgg aag gcc tga 906

Pro Asp Ser Ile Thr Asp Tyr Ser Tyr Ile Trp Lys Ala

290 295 300

<210> 2

<211> 301

<212> PRT

<213> 水稻(oryza sativa)

<400> 2

Met Ser Glu Ser Glu Val Ser Val Ile Asn Gln Leu Glu Glu Glu Glu

1 5 10 15

Thr Arg Leu Glu Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu

20 25 30

Glu Val Val Thr His Tyr Leu Thr Arg Lys Ala Gln Asp Arg Ser Phe

35 40 45

Ser Cys Val Val Ile Ala Asp Val Asn Leu Asn Asn Cys Glu Pro Trp

50 55 60

Asp Leu Pro Ser Lys Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe

65 70 75 80

Cys His Lys Asp Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Met Arg Thr Asn Arg Ala

85 90 95

Thr Ala Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe

100 105 110

Arg Gly Arg Gly Leu Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr

115 120 125

Met Gly Arg Ala Pro Arg Gly Glu Lys Thr Pro Trp Val Met His Glu

130 135 140

Tyr Arg Leu Asp Gly Lys Leu Pro Pro Asn Leu Pro Arg Ser Ala Lys

145 150 155 160

Glu Glu Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys Asp Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Ile Ala Gln Met Pro Pro Pro Pro Phe Pro Arg Asn Asp Ser Phe Asp

180 185 190

Leu Asp Leu Asp Asp Phe Leu His Leu Asp Ala Asp Leu Pro Pro Leu

195 200 205

Ile Asp Asp Pro Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Lys Thr Glu Pro Pro

210 215 220

Pro Pro Ala Asn Leu Met His Asn His Tyr Gly Tyr Phe Ser Leu Pro

225 230 235 240

Ala Ser Ala Thr Asn Tyr Asn His Ser Ser Gly Ala Met Ala Asp Gln

245 250 255

Ala Ile Arg Arg Phe Cys Lys Ala Glu Ala Ser Thr Ala Cys Phe Ser

260 265 270

Gly Ala Asp Ala Asp Val Asp Pro Val Val Asp Glu Leu Leu Ser Phe

275 280 285

Pro Asp Ser Ile Thr Asp Tyr Ser Tyr Ile Trp Lys Ala

290 295 300

Claims (4)

1.一种调控水稻干旱和盐胁迫耐受性的NAC转录因子OsNAC15基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种调控水稻干旱和盐胁迫耐受性的NAC转录因子OsNAC15基因，其特征在于，所述基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的NAC转录因子OsNAC15基因在调控干旱和盐胁迫耐受性中的应用。

4.一种适用于调控干旱和盐胁迫耐受性的过量表达载体pU1301-3×Flag-OsNAC15，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。

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