JP2003274969A - 低温発現型フルクタン合成酵素遺伝子 - Google Patents
低温発現型フルクタン合成酵素遺伝子Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 植物に環境ストレス耐性を付与する遺伝子を
提供する。 【解決手段】 コムギにおいて低温下で発現されるフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子を単離し、塩基配列を確定した。該遺伝子産物で
あるフルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼは、低温条件下でフルクタンを合成する活性を
有した。該遺伝子を含む組換えベクター、形質転換体お
よびトランスジェニック植物を提供する。
提供する。 【解決手段】 コムギにおいて低温下で発現されるフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子を単離し、塩基配列を確定した。該遺伝子産物で
あるフルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼは、低温条件下でフルクタンを合成する活性を
有した。該遺伝子を含む組換えベクター、形質転換体お
よびトランスジェニック植物を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物に耐寒性を付
与するフルクタンの合成活性を有する、低温耐性酵素フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子に関する。
与するフルクタンの合成活性を有する、低温耐性酵素フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】コムギにおいては高度耐凍性、耐雪性を
もった品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来
の交雑にもとづいた育種では、既存の品種を超える能力
を有する植物を作出するのは困難である。そのため近年
では、遺伝子工学的手段による、より効果的な環境スト
レス耐性を有する改良品種の作出が求められている。
もった品種の開発が北方圏諸国で行われているが、従来
の交雑にもとづいた育種では、既存の品種を超える能力
を有する植物を作出するのは困難である。そのため近年
では、遺伝子工学的手段による、より効果的な環境スト
レス耐性を有する改良品種の作出が求められている。
【０００３】越冬作物のうち麦類、イネ科牧草は秋期〜
冬期のエネルギー源として多糖類のフルクタンを液胞内
に蓄積する。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で
栽培されるため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬
性があることが知られている。秋期〜冬期の上記植物
は、低温順化（以下、ハードニングという）の過程でフ
ルクタン合成酵素を発現することにより、フルクタンを
生成・蓄積している。このフルクタンは、越冬時のエネ
ルギー源としてだけではなく凍結保護や浸透圧調整物質
としても働き、植物の耐寒性、耐凍性、及び乾燥耐性等
の環境ストレス耐性において主要な役割を果たしてい
る。
冬期のエネルギー源として多糖類のフルクタンを液胞内
に蓄積する。厳寒地帯の越冬作物は主に長期積雪地帯で
栽培されるため、フルクタン蓄積量の多い品種ほど越冬
性があることが知られている。秋期〜冬期の上記植物
は、低温順化（以下、ハードニングという）の過程でフ
ルクタン合成酵素を発現することにより、フルクタンを
生成・蓄積している。このフルクタンは、越冬時のエネ
ルギー源としてだけではなく凍結保護や浸透圧調整物質
としても働き、植物の耐寒性、耐凍性、及び乾燥耐性等
の環境ストレス耐性において主要な役割を果たしてい
る。
【０００４】フルクタンの代謝に関わる遺伝子として
は、フルクタンの合成・分解等に働く各種フルクトシル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子が、細菌、真菌
類及び植物から単離されている。フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子には、スクロースから他のスクロース
にフルクトシル基を転移する活性を有するスクロース：
スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ、スクロ
ースからフルクタンにフルクトシル基を転移する活性を
有するスクロース：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ、フルクタンから他のフルクタンへフルクト
シル基を転移する活性を有するフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼの３種類に分類され
る酵素をコードする多くの種類の遺伝子が存在してい
る。異なる属に由来する数種の細菌から各種のフルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子が単離されているが、こ
れらの遺伝子にコードされるアミノ酸配列間の相同性
は、低いことが知られている（Irma Vijn and Sjef Sme
ekens, Plant Physiol. (1999)Vol 120, pp351-35
9）。また植物でも、これまでに上記フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子がいくつか単離されている（Irma
Vijn and Sjef Smeekens, Plant Physiol. (1999) Vo
l 120, pp351-359）。
は、フルクタンの合成・分解等に働く各種フルクトシル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子が、細菌、真菌
類及び植物から単離されている。フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子には、スクロースから他のスクロース
にフルクトシル基を転移する活性を有するスクロース：
スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ、スクロ
ースからフルクタンにフルクトシル基を転移する活性を
有するスクロース：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ、フルクタンから他のフルクタンへフルクト
シル基を転移する活性を有するフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼの３種類に分類され
る酵素をコードする多くの種類の遺伝子が存在してい
る。異なる属に由来する数種の細菌から各種のフルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子が単離されているが、こ
れらの遺伝子にコードされるアミノ酸配列間の相同性
は、低いことが知られている（Irma Vijn and Sjef Sme
ekens, Plant Physiol. (1999)Vol 120, pp351-35
9）。また植物でも、これまでに上記フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子がいくつか単離されている（Irma
Vijn and Sjef Smeekens, Plant Physiol. (1999) Vo
l 120, pp351-359）。
【０００５】一方、フルクタンはまた、食品工業におけ
る機能性食品、製薬業における賦形剤、化学工業におけ
る生分解性ポリマー材料、及び飼料添加物等の、幅広い
有用な用途を有している。フルクタンに含まれる各種オ
リゴ糖は、例えば天然低カロリー甘味料として有用に用
いられる。フルクトオリゴ糖は虫歯予防効果・腸内ビフ
ィズス菌増殖作用などの人間の健康に有用な機能性オリ
ゴ糖であり、このフルクトオリゴ糖生産の工業的利用に
おいてもフルクタン合成遺伝子は注目されている。
る機能性食品、製薬業における賦形剤、化学工業におけ
る生分解性ポリマー材料、及び飼料添加物等の、幅広い
有用な用途を有している。フルクタンに含まれる各種オ
リゴ糖は、例えば天然低カロリー甘味料として有用に用
いられる。フルクトオリゴ糖は虫歯予防効果・腸内ビフ
ィズス菌増殖作用などの人間の健康に有用な機能性オリ
ゴ糖であり、このフルクトオリゴ糖生産の工業的利用に
おいてもフルクタン合成遺伝子は注目されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物に対し
て環境ストレス耐性を付与する遺伝子、及び植物への環
境ストレス耐性を提供することを目的とする。
て環境ストレス耐性を付与する遺伝子、及び植物への環
境ストレス耐性を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コムギにおいて低
温下で発現されるフルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することに成功し
た。そして本発明者らは、この遺伝子産物であるフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
が、フルクタンを低温条件下で合成する活性を有するこ
とを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以
下の通りである。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コムギにおいて低
温下で発現されるフルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することに成功し
た。そして本発明者らは、この遺伝子産物であるフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
が、フルクタンを低温条件下で合成する活性を有するこ
とを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以
下の通りである。
【０００８】[1] 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質
ドする遺伝子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質
【０００９】[2] 以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝
子。 (a) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNA (b) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
子。 (a) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNA (b) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１０】[3] 以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝
子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNA (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列か
らなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする
DNA 但し、上記[1]〜[3]に記載の遺伝子は、コムギのゲノム
中で０℃〜１０℃で発現することが特徴であり得る。ま
た、上記[1]〜[3]に記載のタンパク質は、０℃〜５０
℃、特に０℃〜１０℃で生成フルクタン合成能を有する
ものであり得る。さらに、上記[1]〜[3]に記載のタンパ
ク質は、重合度５〜１０のフルクタンを基質として用い
て重合度２０〜５０の生成フルクタンを合成することが
できるものであり得る。
子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNA (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列か
らなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする
DNA 但し、上記[1]〜[3]に記載の遺伝子は、コムギのゲノム
中で０℃〜１０℃で発現することが特徴であり得る。ま
た、上記[1]〜[3]に記載のタンパク質は、０℃〜５０
℃、特に０℃〜１０℃で生成フルクタン合成能を有する
ものであり得る。さらに、上記[1]〜[3]に記載のタンパ
ク質は、重合度５〜１０のフルクタンを基質として用い
て重合度２０〜５０の生成フルクタンを合成することが
できるものであり得る。
【００１１】[4] 上記[1]〜[3]記載の遺伝子を含む組換
えベクター。 [5] 上記[4]記載の組換えベクターを含む形質転換体。 [6] 上記[1]〜[3]記載の遺伝子を含むトランスジェニッ
ク植物。 [7] 上記[1]〜[3]記載の遺伝子を植物に導入することを
特徴とする、植物へのストレス耐性付与方法。但し、そ
のストレス耐性は、耐寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐
性、貧栄養耐性、耐霜性及び耐病性からなる群から選択
される少なくとも１つであり得る。 [8] 上記[5]記載の形質転換体を培養し、得られる培養
物からフルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特
徴とする該タンパク質の製造方法。
えベクター。 [5] 上記[4]記載の組換えベクターを含む形質転換体。 [6] 上記[1]〜[3]記載の遺伝子を含むトランスジェニッ
ク植物。 [7] 上記[1]〜[3]記載の遺伝子を植物に導入することを
特徴とする、植物へのストレス耐性付与方法。但し、そ
のストレス耐性は、耐寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐
性、貧栄養耐性、耐霜性及び耐病性からなる群から選択
される少なくとも１つであり得る。 [8] 上記[5]記載の形質転換体を培養し、得られる培養
物からフルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特
徴とする該タンパク質の製造方法。
【００１２】[9] 以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質 但しこのタンパク質は、０℃〜５０℃、特に０℃〜１０
℃で生成フルクタン合成能を有するものであり得る。さ
らにこのタンパク質は、重合度５〜１０のフルクタンを
基質として用いて重合度２０〜５０の生成フルクタンを
合成することができるものであり得る。
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質 但しこのタンパク質は、０℃〜５０℃、特に０℃〜１０
℃で生成フルクタン合成能を有するものであり得る。さ
らにこのタンパク質は、重合度５〜１０のフルクタンを
基質として用いて重合度２０〜５０の生成フルクタンを
合成することができるものであり得る。
【００１３】[10] 植物にストレス耐性を付与する、上
記[1]記載のタンパク質。但しそのストレス耐性は、耐
寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐性、貧栄養耐性、耐霜性
及び耐病性からなる群から選択される少なくとも１つで
あり得る。 [11] 上記[1]又は[2]のタンパク質をフルクタンと反応
させて、生成フルクタンを製造する方法。 [12] 上記[6]記載のトランスジェニック植物を培養又は
栽培し、得られる植物から、生成フルクタンを抽出する
ことを特徴とする、生成フルクタンの製造方法。
記[1]記載のタンパク質。但しそのストレス耐性は、耐
寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐性、貧栄養耐性、耐霜性
及び耐病性からなる群から選択される少なくとも１つで
あり得る。 [11] 上記[1]又は[2]のタンパク質をフルクタンと反応
させて、生成フルクタンを製造する方法。 [12] 上記[6]記載のトランスジェニック植物を培養又は
栽培し、得られる植物から、生成フルクタンを抽出する
ことを特徴とする、生成フルクタンの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
フルクタン合成に関する酵素には、その反応の段階と結
合様式によって分類される幾つかの種類の酵素及びその
アイソザイムが存在する。そのうち、フルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼは、主に１-
ケストース（３糖）以上のフルクタンを基質としてより
長鎖のフルクタンの合成を触媒するものである。これま
でにフルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼに関して、アーティチョーク、キクイモ等の双
子葉植物から、該酵素をコードする遺伝子が報告されて
いるが（Ingrid M.van der Meer, et al., Plant J. (1
998) 15(4), pp489-500; Elke M.Hellwege, et al., FE
BS Lett. (1998) 427, pp25-28）、それらはすべて常温
発現条件下で単離されたものである。
フルクタン合成に関する酵素には、その反応の段階と結
合様式によって分類される幾つかの種類の酵素及びその
アイソザイムが存在する。そのうち、フルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼは、主に１-
ケストース（３糖）以上のフルクタンを基質としてより
長鎖のフルクタンの合成を触媒するものである。これま
でにフルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼに関して、アーティチョーク、キクイモ等の双
子葉植物から、該酵素をコードする遺伝子が報告されて
いるが（Ingrid M.van der Meer, et al., Plant J. (1
998) 15(4), pp489-500; Elke M.Hellwege, et al., FE
BS Lett. (1998) 427, pp25-28）、それらはすべて常温
発現条件下で単離されたものである。
【００１５】本発明者らは、植物ゲノム中において低温
条件下で発現されるフルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することができれ
ば、所望のタンパク質合成が低温条件下でも生じるよう
に植物を遺伝子工学的に操作することができ、非常に有
用であろうとの着想を得た。また、一般に酵素は、反応
の場となる環境の物理的条件、すなわち温度、pH及び他
の化学物質の存在等によって、反応効率が大きく左右さ
れる。そこで、低温条件下でも有効な活性を有するフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子を単離することができれば、フルク
タンを低温条件下で効率良く製造することができ、さら
に有用であろうとの着想を得た。そして、そのような低
温発現型フルクタン：フルクタン フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を植物に導入することにより、低温
条件下の植物体内でフルクタンを効率良く生産させて、
植物の耐寒性を含む環境ストレス耐性をより有効に付与
することができるであろうと考えた。本発明は、このよ
うな発想に基づいて完成されたものである。
条件下で発現されるフルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することができれ
ば、所望のタンパク質合成が低温条件下でも生じるよう
に植物を遺伝子工学的に操作することができ、非常に有
用であろうとの着想を得た。また、一般に酵素は、反応
の場となる環境の物理的条件、すなわち温度、pH及び他
の化学物質の存在等によって、反応効率が大きく左右さ
れる。そこで、低温条件下でも有効な活性を有するフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子を単離することができれば、フルク
タンを低温条件下で効率良く製造することができ、さら
に有用であろうとの着想を得た。そして、そのような低
温発現型フルクタン：フルクタン フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を植物に導入することにより、低温
条件下の植物体内でフルクタンを効率良く生産させて、
植物の耐寒性を含む環境ストレス耐性をより有効に付与
することができるであろうと考えた。本発明は、このよ
うな発想に基づいて完成されたものである。
【００１６】しかしながら、本発明のフルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離
は、実際には困難が伴うものであった。植物において
は、これまでにいくつかのフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離されてお
り、それらの遺伝子は、互いに50％前後のアミノ酸配列
相同性を示すことが判明している（Irma Vijn and Sjef
Smeekens, Plant Physiol. (1999) Vol 120, pp351-3
59）。例えばアーティチョーク、キクイモ等の双子葉植
物において、スクロース：スクロース フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子（Elka M.Hellwege, et al., P
lant J. (1997) 12, pp1057-1065; Elke M.Hellwege, e
t al., FEBS Lett. (1998) 427, pp25-28）、及びフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子が報告されている（Ingrid M.van der Meer, et
al., Plant J. (1998) 15(4), pp489-500; Elke M.Hell
wege, et al., FEBS Lett. (1998) 427, pp25-28）が、
同種内でのこれらの遺伝子間のアミノ酸配列相同性はお
よそ55％である。このように、フルクトシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子は、異なる機能を有する酵素間で、アミ
ノ酸配列相同性が互いにほぼ同程度（50％程度）である
ため、あるフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にコ
ードされる酵素がどのような活性を有するかということ
を、既知の関連酵素との間のアミノ酸配列相同性に基づ
いて判断することは、困難である。さらに、フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子には、それぞれ異なる機能
を有する酵素をコードする多くの種類の遺伝子が包含さ
れるため、目的とするフルクタン：フルクタン フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することは多大
な労力を伴うものである。本発明は、このような困難性
の下で研究を重ねた結果として、低温条件下の秋播小麦
に由来するcDNAライブラリーから、本発明のフルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子を単離することに成功したものである。
クタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離
は、実際には困難が伴うものであった。植物において
は、これまでにいくつかのフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離されてお
り、それらの遺伝子は、互いに50％前後のアミノ酸配列
相同性を示すことが判明している（Irma Vijn and Sjef
Smeekens, Plant Physiol. (1999) Vol 120, pp351-3
59）。例えばアーティチョーク、キクイモ等の双子葉植
物において、スクロース：スクロース フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子（Elka M.Hellwege, et al., P
lant J. (1997) 12, pp1057-1065; Elke M.Hellwege, e
t al., FEBS Lett. (1998) 427, pp25-28）、及びフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子が報告されている（Ingrid M.van der Meer, et
al., Plant J. (1998) 15(4), pp489-500; Elke M.Hell
wege, et al., FEBS Lett. (1998) 427, pp25-28）が、
同種内でのこれらの遺伝子間のアミノ酸配列相同性はお
よそ55％である。このように、フルクトシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子は、異なる機能を有する酵素間で、アミ
ノ酸配列相同性が互いにほぼ同程度（50％程度）である
ため、あるフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にコ
ードされる酵素がどのような活性を有するかということ
を、既知の関連酵素との間のアミノ酸配列相同性に基づ
いて判断することは、困難である。さらに、フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子には、それぞれ異なる機能
を有する酵素をコードする多くの種類の遺伝子が包含さ
れるため、目的とするフルクタン：フルクタン フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することは多大
な労力を伴うものである。本発明は、このような困難性
の下で研究を重ねた結果として、低温条件下の秋播小麦
に由来するcDNAライブラリーから、本発明のフルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子を単離することに成功したものである。
【００１７】１．フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の単離 本発明者は、札幌市の自然条件下で１１月中旬までハー
ドニングさせた耐雪性秋播小麦PI173438から抽出した全
mRNAをもとに、常法によりcDNAライブラリーを作製し
た。ついで上記のcDNAライブラリーをブロットしたフィ
ルターに対し、本発明者が既に単離しているコムギ由来
スクロース：スクロース 1-フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子に対応するcDNA（塩基配列５）をアイソト
ープで標識したプローブを用いてハイブリダイゼーショ
ンを行い、該スクロース：スクロース 1-フルクトシル
トランスフェラーゼ遺伝子と低い相同性を有する遺伝子
の全長を含むcDNAクローンを同定した。この際に使用し
た方法は、所望の塩基配列相同性に応じた反応条件を調
整することによって、プローブとするDNA断片とcDNAラ
イブラリーに含まれる各cDNAクローンとの結合性を、所
望の塩基配列相同性に応じて決定することができるとい
う原理を利用するものであった。より具体的には、ハイ
ブリダイゼーション反応において、厳しい条件下では、
プローブ断片の塩基配列との相同性が極めて高い塩基配
列を有するクローンだけがプローブと結合して陽性クロ
ーンとして検出される一方、緩やかな条件下では、プロ
ーブ断片の塩基配列との相同性が相対的に低い塩基配列
を有するクローンも、プローブと結合して陽性クローン
として検出され得ることに基づいて、緩やかな条件下で
検出されるが厳しい条件下では検出されないcDNAクロー
ンを、プローブとした遺伝子断片との間で低い塩基配列
相同性を有するものとして同定した。そのようにして、
目的とするフルクタン：フルクタン フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の全長を含むcDNAクローンの候補
を同定した。次いで、得られた陽性クローンについて、
それぞれDNAシーケンサーを用いて塩基配列を決定し
た。そして各々決定した塩基配列について、コードされ
ているアミノ酸配列を推定した。このようにして得た推
定アミノ酸配列を、コムギ由来のスクロース：スクロー
ス 1-フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にコード
されるアミノ酸配列（配列番号６）と比較し、各々のア
ミノ酸配列相同性を算出した。
ルトランスフェラーゼ遺伝子の単離 本発明者は、札幌市の自然条件下で１１月中旬までハー
ドニングさせた耐雪性秋播小麦PI173438から抽出した全
mRNAをもとに、常法によりcDNAライブラリーを作製し
た。ついで上記のcDNAライブラリーをブロットしたフィ
ルターに対し、本発明者が既に単離しているコムギ由来
スクロース：スクロース 1-フルクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子に対応するcDNA（塩基配列５）をアイソト
ープで標識したプローブを用いてハイブリダイゼーショ
ンを行い、該スクロース：スクロース 1-フルクトシル
トランスフェラーゼ遺伝子と低い相同性を有する遺伝子
の全長を含むcDNAクローンを同定した。この際に使用し
た方法は、所望の塩基配列相同性に応じた反応条件を調
整することによって、プローブとするDNA断片とcDNAラ
イブラリーに含まれる各cDNAクローンとの結合性を、所
望の塩基配列相同性に応じて決定することができるとい
う原理を利用するものであった。より具体的には、ハイ
ブリダイゼーション反応において、厳しい条件下では、
プローブ断片の塩基配列との相同性が極めて高い塩基配
列を有するクローンだけがプローブと結合して陽性クロ
ーンとして検出される一方、緩やかな条件下では、プロ
ーブ断片の塩基配列との相同性が相対的に低い塩基配列
を有するクローンも、プローブと結合して陽性クローン
として検出され得ることに基づいて、緩やかな条件下で
検出されるが厳しい条件下では検出されないcDNAクロー
ンを、プローブとした遺伝子断片との間で低い塩基配列
相同性を有するものとして同定した。そのようにして、
目的とするフルクタン：フルクタン フルクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の全長を含むcDNAクローンの候補
を同定した。次いで、得られた陽性クローンについて、
それぞれDNAシーケンサーを用いて塩基配列を決定し
た。そして各々決定した塩基配列について、コードされ
ているアミノ酸配列を推定した。このようにして得た推
定アミノ酸配列を、コムギ由来のスクロース：スクロー
ス 1-フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にコード
されるアミノ酸配列（配列番号６）と比較し、各々のア
ミノ酸配列相同性を算出した。
【００１８】２．本発明のフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子 上記１において、本発明のフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子として単離された
cDNAクローンは、それぞれ配列番号１及び３に示される
塩基配列からなるcDNAを含むものであった。配列番号１
に示される塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配
列番号２に示す。また配列番号３に示される塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を、配列番号４に示す。さら
に、それらの配列番号１及び３に示される塩基配列、並
びに配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列を、公共
データベース（EMBL/GenBank/DDBJ 国際DNAデータバン
ク等）において検索したところ、相当する配列は見出さ
れなかったことから、これらの２種類のcDNAに対応する
コムギ由来遺伝子は新規なものであると判断された。
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子 上記１において、本発明のフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子として単離された
cDNAクローンは、それぞれ配列番号１及び３に示される
塩基配列からなるcDNAを含むものであった。配列番号１
に示される塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配
列番号２に示す。また配列番号３に示される塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を、配列番号４に示す。さら
に、それらの配列番号１及び３に示される塩基配列、並
びに配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列を、公共
データベース（EMBL/GenBank/DDBJ 国際DNAデータバン
ク等）において検索したところ、相当する配列は見出さ
れなかったことから、これらの２種類のcDNAに対応する
コムギ由来遺伝子は新規なものであると判断された。
【００１９】これら２種類の遺伝子については、その遺
伝子産物が低温耐性フルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼであることが確認された。その
確認は、「４．フルクタン：フルクタン フルクトシル
トランスフェラーゼ活性の確認」に記載されたように酵
母による組換えタンパク発現系を利用して行った。した
がって、本発明の１つの実施形態では、本発明のフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子は、配列番号１又は３に示される塩基配列からなる
DNAである。このDNAは、例えば、上記cDNAクローンから
適当な制限酵素により切断し、そのDNA断片を常法によ
り抽出・精製することにより取得することができる。
伝子産物が低温耐性フルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼであることが確認された。その
確認は、「４．フルクタン：フルクタン フルクトシル
トランスフェラーゼ活性の確認」に記載されたように酵
母による組換えタンパク発現系を利用して行った。した
がって、本発明の１つの実施形態では、本発明のフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子は、配列番号１又は３に示される塩基配列からなる
DNAである。このDNAは、例えば、上記cDNAクローンから
適当な制限酵素により切断し、そのDNA断片を常法によ
り抽出・精製することにより取得することができる。
【００２０】本明細書において、「フルクタン：フルク
タン フルクトシルトランスフェラーゼ」とは、フルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活
性を有するタンパク質をいう。本明細書において、「フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼ活性」とは、フルクタンから他のフルクタンへフルク
トシル基を転移する活性を意味する。また、この「フル
クタン：フルクタンフルクトシルトランスフェラーゼ」
は、スクロースのみを基質として与えた場合フルクトシ
ル基の転移活性が見られないという性質を示す。また本
明細書において「フルクタン合成能」とは、フルクタン
を基質として、より長鎖のフルクタン、具体的には４糖
フルクタン（ニストース）又はそれ以上の重合度のフル
クタンを生成することができる能力を意味する。本明細
書において、「生成フルクタン」とは、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼの酵素活性
によって触媒される合成反応によって生成されたフルク
タンの集合物を意味する。フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼが触媒する酵素反応を、
以下、図１を用いてさらに説明する。
タン フルクトシルトランスフェラーゼ」とは、フルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活
性を有するタンパク質をいう。本明細書において、「フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼ活性」とは、フルクタンから他のフルクタンへフルク
トシル基を転移する活性を意味する。また、この「フル
クタン：フルクタンフルクトシルトランスフェラーゼ」
は、スクロースのみを基質として与えた場合フルクトシ
ル基の転移活性が見られないという性質を示す。また本
明細書において「フルクタン合成能」とは、フルクタン
を基質として、より長鎖のフルクタン、具体的には４糖
フルクタン（ニストース）又はそれ以上の重合度のフル
クタンを生成することができる能力を意味する。本明細
書において、「生成フルクタン」とは、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼの酵素活性
によって触媒される合成反応によって生成されたフルク
タンの集合物を意味する。フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼが触媒する酵素反応を、
以下、図１を用いてさらに説明する。
【００２１】本発明のタンパク質の「フルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼ」はフルクト
シル基転移酵素である。この名称の『フルクタン：フル
クタン』の部分は、フルクトシル基の転移様式を表して
おり、この酵素が基質とするフルクタンから別のフルク
タンへフルクトシル基を転移するものであることを意味
している。図１では便宜上、『フルクタン：フルクタ
ン』の２つのフルクタンを区別するために、本発明のタ
ンパク質を「フルクタンG-F(n)：フルクタンG-F(m) フ
ルクトシルトランスフェラーゼ」と称して説明する。図
１に示す通り、本発明のフルクタンG-F(n)：フルクタン
G-F(m) フルクトシルトランスフェラーゼは、任意のフ
ルクタンG-F(n)（ここではグルコース「Ｇ」が一位にあ
るものを例示している）に由来するフルクトシル基（図
中、「Ｆ」で表す）を別のフルクタンG-F(m)へ転移する
活性を有し、その結果、フルクタンG-F(m)はフルクトシ
ル基を１個余分に付加されてフルクタンG-F(m+1)とな
る。すなわちこのフルクタンG-F(m+1)は、フルクタンG-
F(m)よりも重合度が１つ高いフルクタンである。フルク
タンG-F(m+1)はさらに、本発明のフルクタン：フルクタ
ン フルクトシルトランスフェラーゼによって同様に別
のフルクタンからフルクトシル基を転移されて、重合度
がさらに１つ高いフルクタンとなり得る。このような反
応が反応液中で連鎖的に繰り返される結果、フルクタン
G-F(m+1)は次々とより長鎖のフルクタンへと合成され
る。このようにして合成されるより長鎖のフルクタン
は、最終的にはある一定の最大重合度を有するフルクタ
ンとなり得る。この最大重合度は、基質として添加する
フルクタンの重合度等によって決定されるが、本発明の
フルクタン：フルクタン トランスフェラーゼの場合、
最大重合度は添加する基質フルクタンの重合度の２〜５
倍、又は２〜４倍、特に２〜３倍の重合度であり、より
詳細には、例えば重合度５〜１０のフルクタンを基質と
して用いる場合に、最大重合度は２０〜５０、好ましく
は２０〜３０、より好ましくは２０〜２３である。１つ
の実施形態においては、本発明のフルクタン：フルクタ
ン フルクトシルトランスフェラーゼは、基質として重
合度３のケストースを用いた場合に重合度６の生成フル
クタンを合成することができる。さらに１つの実施形態
においては、基質として重合度５〜１０のフルクトース
を用いた場合に重合度２０〜２３の生成フルクタンを合
成することができる。ここで最大重合度とは、生成フル
クタンに含まれる最も高い重合度を有するフルクタンの
重合度を意味する。本発明におけるフルクタンの重合度
とは、当該フルクタンを構成している単糖の合計数を意
味する。なお、図１における「フルクタンG-F(n)」及び
「フルクタンG-F(m)」を酵素反応系に添加した最初の基
質フルクタンとする場合、上記の「フルクタンG-F(m+
1)」及び「より長鎖のフルクタン」が、本発明のフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼの
酵素反応による生成物である。本発明では、これらの
「フルクタンG-F(m+1)」及び「より長鎖のフルクタン」
の集合物が、「生成フルクタン」であるものとする。な
お、スクロース等の他の基質を用いるフルクトシルトラ
ンスフェラーゼについても、上述の説明と同様に、その
活性を名称に基づいて理解することができる。
クタン フルクトシルトランスフェラーゼ」はフルクト
シル基転移酵素である。この名称の『フルクタン：フル
クタン』の部分は、フルクトシル基の転移様式を表して
おり、この酵素が基質とするフルクタンから別のフルク
タンへフルクトシル基を転移するものであることを意味
している。図１では便宜上、『フルクタン：フルクタ
ン』の２つのフルクタンを区別するために、本発明のタ
ンパク質を「フルクタンG-F(n)：フルクタンG-F(m) フ
ルクトシルトランスフェラーゼ」と称して説明する。図
１に示す通り、本発明のフルクタンG-F(n)：フルクタン
G-F(m) フルクトシルトランスフェラーゼは、任意のフ
ルクタンG-F(n)（ここではグルコース「Ｇ」が一位にあ
るものを例示している）に由来するフルクトシル基（図
中、「Ｆ」で表す）を別のフルクタンG-F(m)へ転移する
活性を有し、その結果、フルクタンG-F(m)はフルクトシ
ル基を１個余分に付加されてフルクタンG-F(m+1)とな
る。すなわちこのフルクタンG-F(m+1)は、フルクタンG-
F(m)よりも重合度が１つ高いフルクタンである。フルク
タンG-F(m+1)はさらに、本発明のフルクタン：フルクタ
ン フルクトシルトランスフェラーゼによって同様に別
のフルクタンからフルクトシル基を転移されて、重合度
がさらに１つ高いフルクタンとなり得る。このような反
応が反応液中で連鎖的に繰り返される結果、フルクタン
G-F(m+1)は次々とより長鎖のフルクタンへと合成され
る。このようにして合成されるより長鎖のフルクタン
は、最終的にはある一定の最大重合度を有するフルクタ
ンとなり得る。この最大重合度は、基質として添加する
フルクタンの重合度等によって決定されるが、本発明の
フルクタン：フルクタン トランスフェラーゼの場合、
最大重合度は添加する基質フルクタンの重合度の２〜５
倍、又は２〜４倍、特に２〜３倍の重合度であり、より
詳細には、例えば重合度５〜１０のフルクタンを基質と
して用いる場合に、最大重合度は２０〜５０、好ましく
は２０〜３０、より好ましくは２０〜２３である。１つ
の実施形態においては、本発明のフルクタン：フルクタ
ン フルクトシルトランスフェラーゼは、基質として重
合度３のケストースを用いた場合に重合度６の生成フル
クタンを合成することができる。さらに１つの実施形態
においては、基質として重合度５〜１０のフルクトース
を用いた場合に重合度２０〜２３の生成フルクタンを合
成することができる。ここで最大重合度とは、生成フル
クタンに含まれる最も高い重合度を有するフルクタンの
重合度を意味する。本発明におけるフルクタンの重合度
とは、当該フルクタンを構成している単糖の合計数を意
味する。なお、図１における「フルクタンG-F(n)」及び
「フルクタンG-F(m)」を酵素反応系に添加した最初の基
質フルクタンとする場合、上記の「フルクタンG-F(m+
1)」及び「より長鎖のフルクタン」が、本発明のフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼの
酵素反応による生成物である。本発明では、これらの
「フルクタンG-F(m+1)」及び「より長鎖のフルクタン」
の集合物が、「生成フルクタン」であるものとする。な
お、スクロース等の他の基質を用いるフルクトシルトラ
ンスフェラーゼについても、上述の説明と同様に、その
活性を名称に基づいて理解することができる。
【００２２】また、本明細書において「低温耐性」と
は、０℃〜１０℃、特に０℃の低温条件下において、タ
ンパク質がその酵素活性を示すことを意味する。また本
明細書では、「低温発現型」遺伝子とは、その遺伝子が
由来する生物ゲノム中で、０℃〜１０℃の低温条件下に
おいて発現される遺伝子であり、かつ、その遺伝子の発
現により得られる該遺伝子産物が、そのような低温条件
下において活性を示すことを特徴とする前記遺伝子を意
味する。これらの酵素活性については、本明細書の
「４．フルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性の確認」を参照されたい。
は、０℃〜１０℃、特に０℃の低温条件下において、タ
ンパク質がその酵素活性を示すことを意味する。また本
明細書では、「低温発現型」遺伝子とは、その遺伝子が
由来する生物ゲノム中で、０℃〜１０℃の低温条件下に
おいて発現される遺伝子であり、かつ、その遺伝子の発
現により得られる該遺伝子産物が、そのような低温条件
下において活性を示すことを特徴とする前記遺伝子を意
味する。これらの酵素活性については、本明細書の
「４．フルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性の確認」を参照されたい。
【００２３】本発明のフルクタン：フルクタン フルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子は、より一般的には、
フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する低温耐性タンパク質をコードするもの
である。本発明のフルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記の配列番号１及び
３に示される塩基配列からなるDNAに限定されない。本
発明の遺伝子は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードするものであってもよ
い。さらに本発明の遺伝子は、フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する限り、
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１若
しくは複数個（好ましくは１〜10個、より好ましくは数
個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなるタンパク質をコードするものであっても
よい。
トシルトランスフェラーゼ遺伝子は、より一般的には、
フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する低温耐性タンパク質をコードするもの
である。本発明のフルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記の配列番号１及び
３に示される塩基配列からなるDNAに限定されない。本
発明の遺伝子は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードするものであってもよ
い。さらに本発明の遺伝子は、フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する限り、
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１若
しくは複数個（好ましくは１〜10個、より好ましくは数
個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなるタンパク質をコードするものであっても
よい。
【００２４】また、配列番号１若しくは３に示される塩
基配列又はその一部、に相補的な配列からなるDNAと、
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが
できるDNAであって、上記フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。同様
に、配列番号２若しくは４で表されるアミノ酸配列をコ
ードするDNA又はその一部、に相補的な配列からなるDNA
と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするこ
とができるDNAであって、上記フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。ス
トリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核
酸同士、すなわち90％以上、好ましくは95％以上の相同
性を有するDNAであって、フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
をコードするDNA同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げ
られる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が15〜750m
M、好ましくは50〜750mM、より好ましくは300〜750mM、
温度が25〜70℃、好ましくは50℃〜70℃、より好ましく
は55〜65℃、ホルムアミド濃度0〜50％、好ましくは20
〜50％、より好ましくは35〜45％での条件をいう。さら
にハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件
が、ナトリウム塩濃度が15〜600mM、好ましくは50〜600
mM、より好ましくは300〜600mM、温度が50〜70℃、好ま
しくは55〜70℃、より好ましくは60〜65℃での条件であ
る場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」
に含めることができる。
基配列又はその一部、に相補的な配列からなるDNAと、
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが
できるDNAであって、上記フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。同様
に、配列番号２若しくは４で表されるアミノ酸配列をコ
ードするDNA又はその一部、に相補的な配列からなるDNA
と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするこ
とができるDNAであって、上記フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするものも本発明の遺伝子に含まれる。ス
トリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核
酸同士、すなわち90％以上、好ましくは95％以上の相同
性を有するDNAであって、フルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
をコードするDNA同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げ
られる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が15〜750m
M、好ましくは50〜750mM、より好ましくは300〜750mM、
温度が25〜70℃、好ましくは50℃〜70℃、より好ましく
は55〜65℃、ホルムアミド濃度0〜50％、好ましくは20
〜50％、より好ましくは35〜45％での条件をいう。さら
にハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件
が、ナトリウム塩濃度が15〜600mM、好ましくは50〜600
mM、より好ましくは300〜600mM、温度が50〜70℃、好ま
しくは55〜70℃、より好ましくは60〜65℃での条件であ
る場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」
に含めることができる。
【００２５】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又はクローニングさ
れたcDNA、cDNAライブラリー若しくはゲノムDNAライブ
ラリーを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列
を有するDNA断片をプローブとしてcDNAライブラリー若
しくはゲノムDNAライブラリーに対してハイブリダイズ
させることによって、本発明の遺伝子を得ることができ
る。cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー等が
由来する生物は、特に限定されるものではないが、例え
ば細菌、真菌類又は植物に属する生物である。由来生物
としては、フルクタンを蓄積し得る植物が好ましく、例
としては、温帯性のイネ科植物（コムギ、オオムギ、オ
ーチャードグラスを含む牧草類等）、キク科植物（ダリ
ア、アザミ、アーティチョーク、タンポポ、チコリー
等）、及びユリ科植物（キクイモ等）が挙げられる。よ
り好ましいのはコムギ（Triticum aestivum L.）であ
る。
ると、その後は化学合成によって、又はクローニングさ
れたcDNA、cDNAライブラリー若しくはゲノムDNAライブ
ラリーを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列
を有するDNA断片をプローブとしてcDNAライブラリー若
しくはゲノムDNAライブラリーに対してハイブリダイズ
させることによって、本発明の遺伝子を得ることができ
る。cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー等が
由来する生物は、特に限定されるものではないが、例え
ば細菌、真菌類又は植物に属する生物である。由来生物
としては、フルクタンを蓄積し得る植物が好ましく、例
としては、温帯性のイネ科植物（コムギ、オオムギ、オ
ーチャードグラスを含む牧草類等）、キク科植物（ダリ
ア、アザミ、アーティチョーク、タンポポ、チコリー
等）、及びユリ科植物（キクイモ等）が挙げられる。よ
り好ましいのはコムギ（Triticum aestivum L.）であ
る。
【００２６】さらに、部位特異的突然変異誘発法等によ
って、本発明の遺伝子の変異型であってフルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るものをコードする遺伝子を合成することもできる。ま
た部位特異的突然変異誘発法等により、本発明の遺伝子
の変異型であって、フルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ低温耐性を示
すものをコードする遺伝子を合成することもできる。
って、本発明の遺伝子の変異型であってフルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るものをコードする遺伝子を合成することもできる。ま
た部位特異的突然変異誘発法等により、本発明の遺伝子
の変異型であって、フルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ低温耐性を示
すものをコードする遺伝子を合成することもできる。
【００２７】遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、
Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法
を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘
発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAK
ARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あ
るいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリ
ーズキットを用いて変異の導入が行われる。
Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法
を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘
発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAK
ARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あ
るいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリ
ーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００２８】３．組換えベクターの作製
上記１及び２で取得した本発明の遺伝子は、続く操作の
ために、ベクター中にクローニングして組換えベクター
を作製する。本発明の組換えベクターは、適当なベクタ
ーに本発明のフルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子を連結(挿入)することにより得
ることができる。フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。
ために、ベクター中にクローニングして組換えベクター
を作製する。本発明の組換えベクターは、適当なベクタ
ーに本発明のフルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子を連結(挿入)することにより得
ることができる。フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。
【００２９】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pU
C18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド
（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNA
としてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EM
BL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さら
に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物
ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクタ
ーを用いることもできる。
ラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pU
C18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド
（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNA
としてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EM
BL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さら
に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物
ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクタ
ーを用いることもできる。
【００３０】ベクターにフルクタン：フルクタン フル
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子を挿入するには、ま
ず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当な
ベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサ
イトに挿入してベクターに連結する方法などが採用され
る。
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子を挿入するには、ま
ず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当な
ベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサ
イトに挿入してベクターに連結する方法などが採用され
る。
【００３１】フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮さ
れるように、ベクターに組み込まれることが必要であ
る。特に、本発明の組換えベクターは、宿主内で良好な
活性を有するタンパク質として発現されるようにフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子をベクターに組み込んだ、組換え発現ベクターとし
て作製することが好ましい。このために、本発明のベク
ターとしては、数多くの宿主生物に対応した市販の各種
発現ベクターを用いることができる。それらの発現ベク
ターには、通常、転写プロモーター、ターミネーター、
リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須
な各種エレメントの他、ベクターが細胞内に保持されて
いることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正し
い向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー、エンハ
ンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナ
ル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配
列）、分泌因子配列等の有用な配列が必要に応じて連結
されている。組換え発現ベクターを用いて形質転換体を
作製し、それを培養することによって組換えタンパク質
を産生させる場合には、宿主生物に適合した分泌因子配
列を含む発現ベクターを用いることにより、組換えタン
パク質を培地中に分泌させることができる。この手法
は、培養上清から直接組換えタンパク質を精製すること
ができるため、有用である。さらに、この分泌因子配列
は、培養上清への分泌後に、ベクターに組み込んだ遺伝
子にコードされるタンパク質から、特定のプロテアーゼ
等で特異的に切断して除去することができるものであっ
てもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子等が挙げられる。以上のようなベク
ターに、フルクタン：フルクタン フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を、適切に発現されるような位置及
び向きで連結する。
ランスフェラーゼ遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮さ
れるように、ベクターに組み込まれることが必要であ
る。特に、本発明の組換えベクターは、宿主内で良好な
活性を有するタンパク質として発現されるようにフルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子をベクターに組み込んだ、組換え発現ベクターとし
て作製することが好ましい。このために、本発明のベク
ターとしては、数多くの宿主生物に対応した市販の各種
発現ベクターを用いることができる。それらの発現ベク
ターには、通常、転写プロモーター、ターミネーター、
リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須
な各種エレメントの他、ベクターが細胞内に保持されて
いることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正し
い向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー、エンハ
ンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナ
ル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配
列）、分泌因子配列等の有用な配列が必要に応じて連結
されている。組換え発現ベクターを用いて形質転換体を
作製し、それを培養することによって組換えタンパク質
を産生させる場合には、宿主生物に適合した分泌因子配
列を含む発現ベクターを用いることにより、組換えタン
パク質を培地中に分泌させることができる。この手法
は、培養上清から直接組換えタンパク質を精製すること
ができるため、有用である。さらに、この分泌因子配列
は、培養上清への分泌後に、ベクターに組み込んだ遺伝
子にコードされるタンパク質から、特定のプロテアーゼ
等で特異的に切断して除去することができるものであっ
てもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子等が挙げられる。以上のようなベク
ターに、フルクタン：フルクタン フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を、適切に発現されるような位置及
び向きで連結する。
【００３２】さらに、本発明の遺伝子は、相同組換え法
により宿主生物ゲノムに直接導入することもできる。そ
の場合には、本発明の遺伝子を組み込んだ適当なターゲ
ティングベクターを作製する。このために使用可能なベ
クターとしては、例えばCre-loxP等の公知のジーンター
ゲティング用ベクターを用いることができる。本明細書
においては、このような本発明の遺伝子を組み込んだタ
ーゲティングベクターも、本発明の組換えベクターに包
含されるものとする。
により宿主生物ゲノムに直接導入することもできる。そ
の場合には、本発明の遺伝子を組み込んだ適当なターゲ
ティングベクターを作製する。このために使用可能なベ
クターとしては、例えばCre-loxP等の公知のジーンター
ゲティング用ベクターを用いることができる。本明細書
においては、このような本発明の遺伝子を組み込んだタ
ーゲティングベクターも、本発明の組換えベクターに包
含されるものとする。
【００３３】４．フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ活性の確認 ３に記載の通り、発現ベクター中に組み込んだ上記１及
び２に記載の本発明の遺伝子は、その遺伝子産物につい
て、フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼ活性の確認を行うことができる。フルクタン：
フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性は、
調べるべき酵素を含む反応液中に、最も重合度の低いフ
ルクタンである1-ケストース（G-F-F; Gはグルコースを
表し、Fはフルクトースを表す。以下の表記も同様であ
る。）のみを基質として与えるとき、反応物中に４糖以
上の重合度のフルクタンが生成されること（すなわち、
ニストース（G-F-F-F）以上の重合度のフルクタンが生
成されること）、かつ、スクロース（G-F）のみを基質
として与えるとき、フルクタン合成反応が起こらない
（すなわち、反応物中に３糖フルクタン（ケストース）
以上の重合度のフルクタンが実質的に存在しないこと）
を示すことによって、確認することができる。したがっ
て、本明細書では、本発明のタンパク質に関して「活性
を有する」「活性を示す」と言った場合、具体的には、
該タンパク質を用いた反応系において、1-ケストースの
みを基質とした場合に反応物中に４糖以上の重合度のフ
ルクタンが生成され、かつ、スクロースのみを基質とし
た場合には反応物中に３糖以上の重合度のフルクタンが
実質的に生成されないことを指すものとする。
ルトランスフェラーゼ活性の確認 ３に記載の通り、発現ベクター中に組み込んだ上記１及
び２に記載の本発明の遺伝子は、その遺伝子産物につい
て、フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼ活性の確認を行うことができる。フルクタン：
フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性は、
調べるべき酵素を含む反応液中に、最も重合度の低いフ
ルクタンである1-ケストース（G-F-F; Gはグルコースを
表し、Fはフルクトースを表す。以下の表記も同様であ
る。）のみを基質として与えるとき、反応物中に４糖以
上の重合度のフルクタンが生成されること（すなわち、
ニストース（G-F-F-F）以上の重合度のフルクタンが生
成されること）、かつ、スクロース（G-F）のみを基質
として与えるとき、フルクタン合成反応が起こらない
（すなわち、反応物中に３糖フルクタン（ケストース）
以上の重合度のフルクタンが実質的に存在しないこと）
を示すことによって、確認することができる。したがっ
て、本明細書では、本発明のタンパク質に関して「活性
を有する」「活性を示す」と言った場合、具体的には、
該タンパク質を用いた反応系において、1-ケストースの
みを基質とした場合に反応物中に４糖以上の重合度のフ
ルクタンが生成され、かつ、スクロースのみを基質とし
た場合には反応物中に３糖以上の重合度のフルクタンが
実質的に生成されないことを指すものとする。
【００３４】上記の確認を行う手順としては、まず組換
え発現ベクター中に導入された遺伝子をin vitro又はin
vivoで発現させてその遺伝子産物を取得し、次いでそ
の遺伝子産物を1-ケストースのみと反応させ、その反応
生成物をHPLC等の公知のタンパク質分析法により分析し
て、生成フルクタン中にニストースが存在することを示
す。さらにまた、上記遺伝子産物をスクロース（G-F）
のみと反応させて、その反応生成物をHPLC等の公知のタ
ンパク質分析法により分析し、反応物中にケストースを
含む生成フルクタンが存在しないことを示す。遺伝子産
物をケストースと反応させる際、０℃〜１０℃、例えば
０℃の低温条件下とすれば、その低温条件下で生成フル
クタン中にニストースが含まれるかどうかを調べること
によって、該遺伝子産物がその低温条件下で上記活性を
有するかどうかも確認することができる。限定するもの
ではないが、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ活性の確認は、例えば以下の通りに行
うことができる。
え発現ベクター中に導入された遺伝子をin vitro又はin
vivoで発現させてその遺伝子産物を取得し、次いでそ
の遺伝子産物を1-ケストースのみと反応させ、その反応
生成物をHPLC等の公知のタンパク質分析法により分析し
て、生成フルクタン中にニストースが存在することを示
す。さらにまた、上記遺伝子産物をスクロース（G-F）
のみと反応させて、その反応生成物をHPLC等の公知のタ
ンパク質分析法により分析し、反応物中にケストースを
含む生成フルクタンが存在しないことを示す。遺伝子産
物をケストースと反応させる際、０℃〜１０℃、例えば
０℃の低温条件下とすれば、その低温条件下で生成フル
クタン中にニストースが含まれるかどうかを調べること
によって、該遺伝子産物がその低温条件下で上記活性を
有するかどうかも確認することができる。限定するもの
ではないが、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ活性の確認は、例えば以下の通りに行
うことができる。
【００３５】まず、本発明のDNAを組み込んだ発現ベク
ターを、エレクトロポレーション法、パーティクルガン
法、PEG法等の公知の形質転換法により酵母に導入す
る。細胞外分泌型組換えタンパク発現ベクターで形質転
換した上記酵母を培養（例えば４日間）後、その培養上
清を分離すると、この上清には組換えタンパク質が含ま
れているはずである。又は、細胞内在型組換えタンパク
発現ベクターで形質転換した上記酵母を培養後（例えば
４日間）、酵母細胞を分離しその抽出液を分離すること
により、その抽出液中には組換えタンパクが含まれてい
るはずである。そこで、培養上清又は酵母細胞抽出液か
ら上記酵素を取得し（例えば培養上清の濃縮液を粗酵素
液として）、基質となる1-ケストースと混合し、反応さ
せる。その反応物をHPLCに掛け、反応生成物を分析し、
各反応生成物のピークが現れるリテンションタイム（保
持時間）を調べることにより、そのリテンションタイム
の差異から反応物にスクロース、ケストース、ニストー
ス及び重合度のより高いフルクタンがそれぞれ含まれる
か否かを判断する。1-ケストースを基質として与えた場
合に反応物中にニストースの存在が確認され、かつ、ス
クロースを基質として与えた場合に反応物中にケストー
スが存在しなければ、上記酵母を形質転換した組換え発
現ベクターに組み込まれていた遺伝子にコードされてい
るタンパク質は、フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ活性を有すると判断される。この
酵素反応を例えば０℃の低温条件下で行った場合に上記
活性が確認されれば、上記遺伝子にコードされるタンパ
ク質は、低温耐性であると判断することができる。以上
により、本発明の遺伝子について、その遺伝子産物が低
温耐性フルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性を有するものであることを確認すること
ができる。
ターを、エレクトロポレーション法、パーティクルガン
法、PEG法等の公知の形質転換法により酵母に導入す
る。細胞外分泌型組換えタンパク発現ベクターで形質転
換した上記酵母を培養（例えば４日間）後、その培養上
清を分離すると、この上清には組換えタンパク質が含ま
れているはずである。又は、細胞内在型組換えタンパク
発現ベクターで形質転換した上記酵母を培養後（例えば
４日間）、酵母細胞を分離しその抽出液を分離すること
により、その抽出液中には組換えタンパクが含まれてい
るはずである。そこで、培養上清又は酵母細胞抽出液か
ら上記酵素を取得し（例えば培養上清の濃縮液を粗酵素
液として）、基質となる1-ケストースと混合し、反応さ
せる。その反応物をHPLCに掛け、反応生成物を分析し、
各反応生成物のピークが現れるリテンションタイム（保
持時間）を調べることにより、そのリテンションタイム
の差異から反応物にスクロース、ケストース、ニストー
ス及び重合度のより高いフルクタンがそれぞれ含まれる
か否かを判断する。1-ケストースを基質として与えた場
合に反応物中にニストースの存在が確認され、かつ、ス
クロースを基質として与えた場合に反応物中にケストー
スが存在しなければ、上記酵母を形質転換した組換え発
現ベクターに組み込まれていた遺伝子にコードされてい
るタンパク質は、フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ活性を有すると判断される。この
酵素反応を例えば０℃の低温条件下で行った場合に上記
活性が確認されれば、上記遺伝子にコードされるタンパ
ク質は、低温耐性であると判断することができる。以上
により、本発明の遺伝子について、その遺伝子産物が低
温耐性フルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ活性を有するものであることを確認すること
ができる。
【００３６】５．フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の植物への導入 上記３に記載の通り作製した組換えベクターを植物に導
入することにより、トランスジェニック植物を得ること
ができる。
ルトランスフェラーゼ遺伝子の植物への導入 上記３に記載の通り作製した組換えベクターを植物に導
入することにより、トランスジェニック植物を得ること
ができる。
【００３７】本発明において形質転換の対象となる植物
は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、
維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞
（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。形
質転換に用いられる植物としては、フルクタンの蓄積が
見られる植物であることが好ましいが、それらに限定す
るものではない。形質転換に用いられる植物として、例
えば以下のようなものが考えられる。
は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、
維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞
（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。形
質転換に用いられる植物としては、フルクタンの蓄積が
見られる植物であることが好ましいが、それらに限定す
るものではない。形質転換に用いられる植物として、例
えば以下のようなものが考えられる。
【００３８】ナス科：ナス(Solanum melongena L.)、ト
マト(Lycopersicon esculentum Mill)、ピーマン(Capsi
cum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ(C
apsicum annuum L.)、タバコ(Nicotiana tabacum L.) アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、
アブラナ(Brassica campestris L.)、ハクサイ(Brassic
a pekinensis Rupr.)、キャベツ(Brassica oleracea L.
var. capitata L.)、ダイコン(Raphanus sativus
L.)、ナタネ(Brassica campestris L., B. napus L.) イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativ
a)、コムギ(Triticum aestivum L.)、オオムギ(Hordeum
vulgare L.) マメ科：ダイズ(Glycine max)、アズキ(Vigna angulari
s Willd.)、インゲン(Phaseolus vulgaris L.)、ソラマ
メ(Vicia faba L.) ウリ科：キュウリ(Cucumis sativus L.)、メロン(Cucum
is melo L.)、スイカ(Citrullus vulgaris Schrad.)、
カボチャ(C. moschata Duch., C. maxima Duch.) ヒルガオ科：サツマイモ(Ipomoea batatas) ユリ科：ネギ(Allium fistulosum L.)、タマネギ(Alliu
m cepa L.)、ニラ(Allium tuberosum Rottl.)、ニンニ
ク(Allium sativum L.)、アスパラガス(Asparagus offi
cinalis L.) シソ科：シソ(Perilla frutescens Britt. var. crisp
a) キク科：キク(Chrysanthemum morifolium)、シュンギク
(Chrysanthemum coronarium L.)、レタス(Lactuca sati
va L. var. capitata L.） バラ科：バラ(Rose hybrida Hort.)、イチゴ(Fragaria
x ananassa Duch.) ミカン科：ミカン(Citras unshiu)、サンショウ(Zantho
xylum piperitum DC.) フトモモ科：ユーカリ(Eucalyptus globulus Labill) ヤナギ科：ポプラ(Populas nigra L. var. italica Koe
hne) アカザ科：ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.)、テン
サイ（Beta vulgarisL.） リンドウ科：リンドウ(Gentiana scabra Bunge var. bu
ergeri Maxim.) ナデシコ科：カーネーション(Dianthus caryophyllus
L.) ただし、フルクタンを自ら合成しない植物では、基質と
なるケストースを植物体内で合成するために同時にスク
ロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子を導入することにより、重合度４以上のフルクタ
ンが合成可能となる。
マト(Lycopersicon esculentum Mill)、ピーマン(Capsi
cum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ(C
apsicum annuum L.)、タバコ(Nicotiana tabacum L.) アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、
アブラナ(Brassica campestris L.)、ハクサイ(Brassic
a pekinensis Rupr.)、キャベツ(Brassica oleracea L.
var. capitata L.)、ダイコン(Raphanus sativus
L.)、ナタネ(Brassica campestris L., B. napus L.) イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativ
a)、コムギ(Triticum aestivum L.)、オオムギ(Hordeum
vulgare L.) マメ科：ダイズ(Glycine max)、アズキ(Vigna angulari
s Willd.)、インゲン(Phaseolus vulgaris L.)、ソラマ
メ(Vicia faba L.) ウリ科：キュウリ(Cucumis sativus L.)、メロン(Cucum
is melo L.)、スイカ(Citrullus vulgaris Schrad.)、
カボチャ(C. moschata Duch., C. maxima Duch.) ヒルガオ科：サツマイモ(Ipomoea batatas) ユリ科：ネギ(Allium fistulosum L.)、タマネギ(Alliu
m cepa L.)、ニラ(Allium tuberosum Rottl.)、ニンニ
ク(Allium sativum L.)、アスパラガス(Asparagus offi
cinalis L.) シソ科：シソ(Perilla frutescens Britt. var. crisp
a) キク科：キク(Chrysanthemum morifolium)、シュンギク
(Chrysanthemum coronarium L.)、レタス(Lactuca sati
va L. var. capitata L.） バラ科：バラ(Rose hybrida Hort.)、イチゴ(Fragaria
x ananassa Duch.) ミカン科：ミカン(Citras unshiu)、サンショウ(Zantho
xylum piperitum DC.) フトモモ科：ユーカリ(Eucalyptus globulus Labill) ヤナギ科：ポプラ(Populas nigra L. var. italica Koe
hne) アカザ科：ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.)、テン
サイ（Beta vulgarisL.） リンドウ科：リンドウ(Gentiana scabra Bunge var. bu
ergeri Maxim.) ナデシコ科：カーネーション(Dianthus caryophyllus
L.) ただし、フルクタンを自ら合成しない植物では、基質と
なるケストースを植物体内で合成するために同時にスク
ロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子を導入することにより、重合度４以上のフルクタ
ンが合成可能となる。
【００３９】上記組換えベクターは、通常の形質転換方
法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン
法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物
中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム
法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当
なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入
し、この菌株をイネのカルスに接種して感染させ、トラ
ンスジェニック植物を得ることができる。
法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン
法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物
中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム
法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当
なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入
し、この菌株をイネのカルスに接種して感染させ、トラ
ンスジェニック植物を得ることができる。
【００４０】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)
等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又
は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧
力、4〜12cm程度の距離で行う。
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)
等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又
は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧
力、4〜12cm程度の距離で行う。
【００４１】植物培養細胞を宿主として用いる場合は、
形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エ
レクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。この
際ターゲティングベクターを用いて、植物ゲノムに対し
相同組換えを引き起こすことも可能であり得る。
形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エ
レクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。この
際ターゲティングベクターを用いて、植物ゲノムに対し
相同組換えを引き起こすことも可能であり得る。
【００４２】形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュー
ト、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器
官培養に用いることが可能であり、また従来知られてい
る植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン
（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジ
ン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより
植物体に再生させることができる。
ト、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器
官培養に用いることが可能であり、また従来知られてい
る植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン
（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジ
ン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより
植物体に再生させることができる。
【００４３】遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、トランスジェニック植物からDNAを調製
し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCR
は、組換えベクターに挿入したcDNA断片を増幅するため
に使用した条件と同様の条件で行うことができる。その
後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動
等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色
し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出すること
により、形質転換されたことを確認することができる。
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用い
てPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さら
に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、
蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採
用することができる。以上記載の通りにして作製した本
発明のフルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物
は、植物体内でフルクタンが生成されることによって、
ストレス耐性が強化され得る。
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、トランスジェニック植物からDNAを調製
し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCR
は、組換えベクターに挿入したcDNA断片を増幅するため
に使用した条件と同様の条件で行うことができる。その
後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動
等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色
し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出すること
により、形質転換されたことを確認することができる。
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用い
てPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さら
に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、
蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採
用することができる。以上記載の通りにして作製した本
発明のフルクタン：フルクタン フルクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物
は、植物体内でフルクタンが生成されることによって、
ストレス耐性が強化され得る。
【００４４】本発明におけるストレス耐性は、植物にお
いてフルクタンが大きな役割を担っている耐性を指し、
例えば、耐寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐性、貧栄養耐
性、耐霜性及び耐病性が挙げられる。本発明のフルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子を導入したトランスジェニック植物は、それらのスト
レス耐性のうち少なくとも１つを示す。本発明のトラン
スジェニック植物が示すストレス耐性は、好ましくは耐
寒性である。ここで、上記のストレス耐性は、以下のよ
うに定義される。
いてフルクタンが大きな役割を担っている耐性を指し、
例えば、耐寒性、耐凍性、耐雪性、乾燥耐性、貧栄養耐
性、耐霜性及び耐病性が挙げられる。本発明のフルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子を導入したトランスジェニック植物は、それらのスト
レス耐性のうち少なくとも１つを示す。本発明のトラン
スジェニック植物が示すストレス耐性は、好ましくは耐
寒性である。ここで、上記のストレス耐性は、以下のよ
うに定義される。
【００４５】「耐寒性」とは、植物が凍結する寒さに対
して生存できる性質を意味する。「耐凍性」とは、植物
が氷点下の低温による凍結に耐える性質を意味する。
「耐雪性」とは、積雪下（暗黒、０℃、多湿環境）で越
冬する能力の強さを意味する。「乾燥耐性」とは、植物
が水分欠乏に耐える性質を意味する。「貧栄養耐性」と
は、植物が養分の乏しい土壌で生育する能力の強さを意
味する。「耐霜性」とは、初霜や晩霜時の低温に対する
植物の耐性を意味する。「耐病性」とは、細菌、糸状菌
などの病原体の植物への感染増殖を阻害する能力を意味
する。
して生存できる性質を意味する。「耐凍性」とは、植物
が氷点下の低温による凍結に耐える性質を意味する。
「耐雪性」とは、積雪下（暗黒、０℃、多湿環境）で越
冬する能力の強さを意味する。「乾燥耐性」とは、植物
が水分欠乏に耐える性質を意味する。「貧栄養耐性」と
は、植物が養分の乏しい土壌で生育する能力の強さを意
味する。「耐霜性」とは、初霜や晩霜時の低温に対する
植物の耐性を意味する。「耐病性」とは、細菌、糸状菌
などの病原体の植物への感染増殖を阻害する能力を意味
する。
【００４６】ストレス耐性植物としての使用開始時期
は、耐性を示す植物を選抜した後であればいつでもよ
い。上記の形質転換植物のストレス耐性は、ストレス条
件下に放置した後の生存率を上記記載に従って評価する
ことによって、判断することができる。
は、耐性を示す植物を選抜した後であればいつでもよ
い。上記の形質転換植物のストレス耐性は、ストレス条
件下に放置した後の生存率を上記記載に従って評価する
ことによって、判断することができる。
【００４７】６．フルクタン：フルクタン フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を利用した生成フルクタン
の製造 上記３に記載の通り作製した、本発明の遺伝子を含む組
換え発現ベクターを用いて、フルクタンを製造すること
ができる。本発明の遺伝子を発現させて得られる本発明
の遺伝子産物であるフルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼは、フルクタンを基質とした酵
素反応によって４糖以上のフルクタンを生成することが
できる。また、本発明の遺伝子を利用した生成フルクタ
ンの製造は、低温条件下でも行うことができる。このよ
うな生成フルクタンの製造のために、本発明ではまず、
本発明の遺伝子を発現させて、フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼを生産する。
ルトランスフェラーゼ遺伝子を利用した生成フルクタン
の製造 上記３に記載の通り作製した、本発明の遺伝子を含む組
換え発現ベクターを用いて、フルクタンを製造すること
ができる。本発明の遺伝子を発現させて得られる本発明
の遺伝子産物であるフルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼは、フルクタンを基質とした酵
素反応によって４糖以上のフルクタンを生成することが
できる。また、本発明の遺伝子を利用した生成フルクタ
ンの製造は、低温条件下でも行うことができる。このよ
うな生成フルクタンの製造のために、本発明ではまず、
本発明の遺伝子を発現させて、フルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼを生産する。
【００４８】a.フルクタン：フルクタン フルクトシル
トランスフェラーゼの生産 本発明では、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼを生産するための第１の方法として、
本発明の遺伝子を導入した形質転換体を作製し、それを
培養することによりそれを生産する。本発明は、このよ
うな形質転換体にも関する。
トランスフェラーゼの生産 本発明では、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼを生産するための第１の方法として、
本発明の遺伝子を導入した形質転換体を作製し、それを
培養することによりそれを生産する。本発明は、このよ
うな形質転換体にも関する。
【００４９】形質転換に使用可能な細胞としては、大腸
菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞
（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等、いずれを使用
してもよい。また、形質転換には、一般的に行われてい
る手法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン
法、PEG法等を適用することができる。形質転換体の選
択は、定法に従って行うことができるが、通常は使用し
た組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用し
て行う。
菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞
（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等、いずれを使用
してもよい。また、形質転換には、一般的に行われてい
る手法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン
法、PEG法等を適用することができる。形質転換体の選
択は、定法に従って行うことができるが、通常は使用し
た組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用し
て行う。
【００５０】本発明の形質転換体を培養する方法は、宿
主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われ
る。例えば、大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物
が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形
質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要
に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質
を添加してもよい。
主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われ
る。例えば、大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物
が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形
質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要
に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質
を添加してもよい。
【００５１】プロモーターとして誘導性のものを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-１-チ
オ-β-Ｄ-ガラクトシド(IPTG)等を、trpプロモーターを
用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養すると
きにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加してもよ
い。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転
換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。
発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-１-チ
オ-β-Ｄ-ガラクトシド(IPTG)等を、trpプロモーターを
用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養すると
きにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加してもよ
い。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転
換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。
【００５２】培養後、フルクタン：フルクタン フルク
トシルトランスフェラーゼが菌体内又は細胞内に生産さ
れる場合には菌体又は細胞を破砕する。一方、目的のタ
ンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培
養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は
細胞を除去し、上清を得る。得られた液中に、フルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼが含
まれる。本発明では、形質転換を行う代わりに、第２の
方法として、無細胞翻訳系を使用してフルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼを生産するこ
ともできる。
トシルトランスフェラーゼが菌体内又は細胞内に生産さ
れる場合には菌体又は細胞を破砕する。一方、目的のタ
ンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培
養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は
細胞を除去し、上清を得る。得られた液中に、フルクタ
ン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼが含
まれる。本発明では、形質転換を行う代わりに、第２の
方法として、無細胞翻訳系を使用してフルクタン：フル
クタン フルクトシルトランスフェラーゼを生産するこ
ともできる。
【００５３】「無細胞翻訳系」とは、宿主生物の細胞の
構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なア
ミノ酸などの試薬を加え、試験管中などのin vitro転写
翻訳系またはin vitro翻訳系を構成したものである。無
細胞翻訳系としては、有利に使用可能なキットが市販さ
れている。
構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なア
ミノ酸などの試薬を加え、試験管中などのin vitro転写
翻訳系またはin vitro翻訳系を構成したものである。無
細胞翻訳系としては、有利に使用可能なキットが市販さ
れている。
【００５４】生産されたフルクタン：フルクタン フル
クトシルトランスフェラーゼは、タンパク質の単離精製
に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモ
ニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、上記
培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清中）
あるいは無細胞翻訳系の溶液中から単離精製することが
できる。しかしながら、場合により、例えば培養上清を
限外濾過型フィルターで濃縮しただけの濃縮液等の粗酵
素液を、次の生成フルクタンの製造に用いることもあり
得る。
クトシルトランスフェラーゼは、タンパク質の単離精製
に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモ
ニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、上記
培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清中）
あるいは無細胞翻訳系の溶液中から単離精製することが
できる。しかしながら、場合により、例えば培養上清を
限外濾過型フィルターで濃縮しただけの濃縮液等の粗酵
素液を、次の生成フルクタンの製造に用いることもあり
得る。
【００５５】b.生成フルクタンの製造
以上のようにして得られたフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼを、次に基質とするフル
クタン（例えば1-ケストース）と反応させて、フルクタ
ンを合成させる。この酵素活性においては通常は20℃〜
30℃が適温であるが、本発明のフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼは、0〜50℃で活性
を有し、特に、0℃〜10℃の低温条件下で50％以上の活
性を有する低温耐性を示す。したがって、本発明のフル
クタン合成反応は、0℃〜50℃、好ましくは0〜30℃の、
低温条件を含む温度範囲で実施することができ、特に0
℃〜10℃の温度範囲でも実施することができる。反応時
間は、通常は1〜24時間、好ましくは8時間である。反応
物からは、クロマト分離工程を用いて、３糖以上のフル
クタン、例えば生成フルクタンを精製することができ
る。分離剤としてはカチオンイオン交換樹脂を用いるこ
とで、フルクタン分画を得ることができる。具体的には
公知の特開２０００-２３２８７８号公報に開示された
方法が好適に利用できる。
ルクトシルトランスフェラーゼを、次に基質とするフル
クタン（例えば1-ケストース）と反応させて、フルクタ
ンを合成させる。この酵素活性においては通常は20℃〜
30℃が適温であるが、本発明のフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼは、0〜50℃で活性
を有し、特に、0℃〜10℃の低温条件下で50％以上の活
性を有する低温耐性を示す。したがって、本発明のフル
クタン合成反応は、0℃〜50℃、好ましくは0〜30℃の、
低温条件を含む温度範囲で実施することができ、特に0
℃〜10℃の温度範囲でも実施することができる。反応時
間は、通常は1〜24時間、好ましくは8時間である。反応
物からは、クロマト分離工程を用いて、３糖以上のフル
クタン、例えば生成フルクタンを精製することができ
る。分離剤としてはカチオンイオン交換樹脂を用いるこ
とで、フルクタン分画を得ることができる。具体的には
公知の特開２０００-２３２８７８号公報に開示された
方法が好適に利用できる。
【００５６】本発明の生成フルクタンはまた、常法のタ
ンパク質及びペプチド抽出・精製手順に従って、上記５
に記載のようなトランスジェニック植物体から直接抽出
及び／又は精製して取得することも可能である。本発明
の生成フルクタンを製造する際には、その後の使用目的
に応じて基質として添加したフルクタンを共に含む形で
生成フルクタンを取得してもよいし、必要であれば生成
フルクタンのみを分離するように精製して取得すること
もできる。
ンパク質及びペプチド抽出・精製手順に従って、上記５
に記載のようなトランスジェニック植物体から直接抽出
及び／又は精製して取得することも可能である。本発明
の生成フルクタンを製造する際には、その後の使用目的
に応じて基質として添加したフルクタンを共に含む形で
生成フルクタンを取得してもよいし、必要であれば生成
フルクタンのみを分離するように精製して取得すること
もできる。
【００５７】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。 〔実施例１〕フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子の単離低温条件下のコムギに由来するcDNAライブラリーの作製 ９月下旬にバットに播種し、札幌市の自然条件下で１１
月２２日まで生育させることによりハードニングさせた
耐雪性秋播小麦（Triticum astivum L.）の系統PI17343
8 のクラウン部分より、常法に従って全RNAを抽出した
（例えば、Sambrookら, 1989,「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」第２版, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照さ
れたい）。この全RNAより、mRNAをOligotexTM-dT30 <Su
per>(TAKARA社製)を用いて単離した。得られたmRNA 5μ
gを鋳型として用いて、cDNA合成キット（STRATAGENE社
製）を利用してRT-PCRを行い、cDNAを合成した。具体的
方法は、cDNA合成キット添付のマニュアルにしたがっ
た。上記のようにして得られたcDNAの両末端に、アダプ
ターを接続後、λZAP Expression vector (STRATAGENE
社製) に組み込み、約６×106 pfuのcDNA ライブラリー
を作製した。
に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。 〔実施例１〕フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子の単離低温条件下のコムギに由来するcDNAライブラリーの作製 ９月下旬にバットに播種し、札幌市の自然条件下で１１
月２２日まで生育させることによりハードニングさせた
耐雪性秋播小麦（Triticum astivum L.）の系統PI17343
8 のクラウン部分より、常法に従って全RNAを抽出した
（例えば、Sambrookら, 1989,「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」第２版, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照さ
れたい）。この全RNAより、mRNAをOligotexTM-dT30 <Su
per>(TAKARA社製)を用いて単離した。得られたmRNA 5μ
gを鋳型として用いて、cDNA合成キット（STRATAGENE社
製）を利用してRT-PCRを行い、cDNAを合成した。具体的
方法は、cDNA合成キット添付のマニュアルにしたがっ
た。上記のようにして得られたcDNAの両末端に、アダプ
ターを接続後、λZAP Expression vector (STRATAGENE
社製) に組み込み、約６×106 pfuのcDNA ライブラリー
を作製した。
【００５８】フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼをコードするcDNAの単離 上記により得られたcDNA ライブラリーのうち、およそ
１０万プラークを、ナイロンフィルター上に標準法によ
りブロットしたものを２セット用意した。次いで、既に
本発明者により単離されているコムギ由来スクロース：
スクロース １-フルクトシルトランスフェラーゼcDNA
に対応するDNA断片を32Pで標識したものをプローブとし
て利用して、上記フィルターと緩やかな条件（低ストリ
ンジェンシー条件）及び厳しい条件（高ストリンジェン
シー条件）下でのプラークハイブリダイゼーションを行
い、既知フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と低い
相同性を有するcDNAをスクリーニングした。
ランスフェラーゼをコードするcDNAの単離 上記により得られたcDNA ライブラリーのうち、およそ
１０万プラークを、ナイロンフィルター上に標準法によ
りブロットしたものを２セット用意した。次いで、既に
本発明者により単離されているコムギ由来スクロース：
スクロース １-フルクトシルトランスフェラーゼcDNA
に対応するDNA断片を32Pで標識したものをプローブとし
て利用して、上記フィルターと緩やかな条件（低ストリ
ンジェンシー条件）及び厳しい条件（高ストリンジェン
シー条件）下でのプラークハイブリダイゼーションを行
い、既知フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と低い
相同性を有するcDNAをスクリーニングした。
【００５９】該スクリーニングではまず、緩やかな条件
でのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーション反応は、上記フィルターのうち１セットを利用
して、コムギ由来スクロース：スクロース 1-フルクト
シルトランスフェラーゼcDNA（配列番号５）の32P標識D
NA断片をプローブとして加え、50％ホルムアミド、5×S
SPE液、5×デンハルト液、0.5％SDS、0.2mg/mlのサケ精
子DNAを加えた条件下で、27℃にて16時間行った。その
後、該フィルターに対して、4×SSC、0.1％SDSを用いる
50℃条件下で10分間の洗浄を２度、ついで2×SSC液、0.
1％SDSを用いる50℃条件下で10分間の洗浄を２度行っ
た。続いて、もう一方の用意したフィルターセットにつ
いて、厳しい条件でのハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション反応は、上記フィルターに
ついて、コムギ由来スクロース：スクロース 1-フルク
トシルトランスフェラーゼcDNA（配列番号５）の32P標
識DNA断片をプローブとして加え、50％ホルムアミド、5
×SSPE液、5×デンハルト液、0.5％SDS、0.2mg/mlのサ
ケ精子DNAを加えた条件下で、42℃にて16時間行った。
その後、該フィルターに対して、2×SSC、0.1％SDSを用
いる50℃条件下で10分間の洗浄を２度、ついで0.1×SSC
液、0.1％SDSを用いる65℃条件下で10分間の洗浄を２度
行った。両条件でそれぞれハイブリダイゼーション・洗
浄作業を行ったフィルターをＸ線フィルムに曝露し、32
P標識プローブとの結合により陽性クローンが示された
オートラジオグラフを取得した。次に、緩やかな条件及
び厳しい条件のそれぞれにおいて得られたオートラジオ
グラフを比較して、新規のフルクトシルトランスフェラ
ーゼをコードする候補cDNAクローンをスクリーニングし
た。厳しい条件下で陽性反応を示したクローンは、明ら
かにスクロース：スクロース1-フルクトシルトランスフ
ェラーゼをコードするcDNAクローンであるため、上記候
補からは除外した。そして、緩やかな条件でのみ陽性を
示したクローン、すなわちプローブであるスクロース：
スクロース 1-フルクトシルトランスフェラーゼcDNAの
DNA断片と結合し得るが、該cDNAプローブとの塩基配列
相同性が相対的に低いクローンのみを分離した。得られ
た約70個の陽性クローンについて、Thermo SequenaseII
Dyeterminator Cycle sequencing キット（Amersham P
harmaciaBiotech 社製）を用いて、ABI社製DNAシーケン
サーによりそれぞれのcDNA挿入断片の塩基配列を決定し
た。その結果、配列番号１に示される塩基配列（1944塩
基）を有するcDNAのクローン、及び配列番号３に示され
る塩基配列（1932塩基）を有するcDNAのクローンが、上
記で得られた候補cDNAクローン中に存在することが見出
された。
でのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーション反応は、上記フィルターのうち１セットを利用
して、コムギ由来スクロース：スクロース 1-フルクト
シルトランスフェラーゼcDNA（配列番号５）の32P標識D
NA断片をプローブとして加え、50％ホルムアミド、5×S
SPE液、5×デンハルト液、0.5％SDS、0.2mg/mlのサケ精
子DNAを加えた条件下で、27℃にて16時間行った。その
後、該フィルターに対して、4×SSC、0.1％SDSを用いる
50℃条件下で10分間の洗浄を２度、ついで2×SSC液、0.
1％SDSを用いる50℃条件下で10分間の洗浄を２度行っ
た。続いて、もう一方の用意したフィルターセットにつ
いて、厳しい条件でのハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション反応は、上記フィルターに
ついて、コムギ由来スクロース：スクロース 1-フルク
トシルトランスフェラーゼcDNA（配列番号５）の32P標
識DNA断片をプローブとして加え、50％ホルムアミド、5
×SSPE液、5×デンハルト液、0.5％SDS、0.2mg/mlのサ
ケ精子DNAを加えた条件下で、42℃にて16時間行った。
その後、該フィルターに対して、2×SSC、0.1％SDSを用
いる50℃条件下で10分間の洗浄を２度、ついで0.1×SSC
液、0.1％SDSを用いる65℃条件下で10分間の洗浄を２度
行った。両条件でそれぞれハイブリダイゼーション・洗
浄作業を行ったフィルターをＸ線フィルムに曝露し、32
P標識プローブとの結合により陽性クローンが示された
オートラジオグラフを取得した。次に、緩やかな条件及
び厳しい条件のそれぞれにおいて得られたオートラジオ
グラフを比較して、新規のフルクトシルトランスフェラ
ーゼをコードする候補cDNAクローンをスクリーニングし
た。厳しい条件下で陽性反応を示したクローンは、明ら
かにスクロース：スクロース1-フルクトシルトランスフ
ェラーゼをコードするcDNAクローンであるため、上記候
補からは除外した。そして、緩やかな条件でのみ陽性を
示したクローン、すなわちプローブであるスクロース：
スクロース 1-フルクトシルトランスフェラーゼcDNAの
DNA断片と結合し得るが、該cDNAプローブとの塩基配列
相同性が相対的に低いクローンのみを分離した。得られ
た約70個の陽性クローンについて、Thermo SequenaseII
Dyeterminator Cycle sequencing キット（Amersham P
harmaciaBiotech 社製）を用いて、ABI社製DNAシーケン
サーによりそれぞれのcDNA挿入断片の塩基配列を決定し
た。その結果、配列番号１に示される塩基配列（1944塩
基）を有するcDNAのクローン、及び配列番号３に示され
る塩基配列（1932塩基）を有するcDNAのクローンが、上
記で得られた候補cDNAクローン中に存在することが見出
された。
【００６０】配列解析により、配列番号１に示される塩
基配列を有するcDNAは、648アミノ酸からなるタンパク
質をコードすることが推定された。このタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号２）は、プローブに用いたコムギ
由来のスクロース：スクロース 1-フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子の推定上のアミノ酸配列との間で７
９％のアミノ酸配列相同性を有していた。したがって、
配列番号１に示される塩基配列を有するcDNAは、コムギ
由来の１つのフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の
全長を含むものと考えられた。同様に、配列番号３に示
される塩基配列を有するcDNAは、644アミノ酸からなる
タンパク質をコードすることが推定された。このタンパ
ク質のアミノ酸配列（配列番号４）は、プローブに用い
たコムギ由来のスクロース：スクロース 1-フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の推定上のアミノ酸配列と
の間で８１％のアミノ酸配列相同性を有していた。した
がって、配列番号３に示される塩基配列を有するcDNA
は、コムギ由来の１つのフルクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子の全長を含むものと考えられた。またこれらの
遺伝子間では、アミノ酸配列の相同性が９４％であるこ
とが示された。このようにして、この配列番号１及び３
のcDNAに対応する遺伝子が、コムギ由来の新規のフルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子として同定された。続
いて、この両遺伝子は、以下の実施例に基づき、フルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼを
コードする遺伝子であることが確認された。
基配列を有するcDNAは、648アミノ酸からなるタンパク
質をコードすることが推定された。このタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号２）は、プローブに用いたコムギ
由来のスクロース：スクロース 1-フルクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子の推定上のアミノ酸配列との間で７
９％のアミノ酸配列相同性を有していた。したがって、
配列番号１に示される塩基配列を有するcDNAは、コムギ
由来の１つのフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の
全長を含むものと考えられた。同様に、配列番号３に示
される塩基配列を有するcDNAは、644アミノ酸からなる
タンパク質をコードすることが推定された。このタンパ
ク質のアミノ酸配列（配列番号４）は、プローブに用い
たコムギ由来のスクロース：スクロース 1-フルクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の推定上のアミノ酸配列と
の間で８１％のアミノ酸配列相同性を有していた。した
がって、配列番号３に示される塩基配列を有するcDNA
は、コムギ由来の１つのフルクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子の全長を含むものと考えられた。またこれらの
遺伝子間では、アミノ酸配列の相同性が９４％であるこ
とが示された。このようにして、この配列番号１及び３
のcDNAに対応する遺伝子が、コムギ由来の新規のフルク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子として同定された。続
いて、この両遺伝子は、以下の実施例に基づき、フルク
タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼを
コードする遺伝子であることが確認された。
【００６１】〔実施例２〕酵母による組換えタンパク発
現系を利用した、遺伝子産物のフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性の確認酵母形質転換体の作製 実施例１で示した２種類のcDNAクローンの成熟型タンパ
ク質と予想される領域を、それぞれ酵母用発現ベクター
pPICZαB（Invitrogen社製、EasySelect Pichia Expre
ssion Kit）のマルチクローニングサイトに組み込み、
組換え発現ベクターを作製した。このようにして作製し
た２種類の組換え発現ベクターを、それぞれ、エレクト
ロポレーション法により酵母（Pichia pastoris）中に
導入した。
現系を利用した、遺伝子産物のフルクタン：フルクタン
フルクトシルトランスフェラーゼ活性の確認酵母形質転換体の作製 実施例１で示した２種類のcDNAクローンの成熟型タンパ
ク質と予想される領域を、それぞれ酵母用発現ベクター
pPICZαB（Invitrogen社製、EasySelect Pichia Expre
ssion Kit）のマルチクローニングサイトに組み込み、
組換え発現ベクターを作製した。このようにして作製し
た２種類の組換え発現ベクターを、それぞれ、エレクト
ロポレーション法により酵母（Pichia pastoris）中に
導入した。
【００６２】この発現ベクターpPICZαＢは、AOX1プロ
モーター配列、及びαファクターと呼ばれる分泌因子配
列を含んでいる。AOX1プロモーター配列は、酵母用液体
培地中のメタノールに特異的に反応して当該ベクターに
クローニングされた遺伝子の発現を誘導する働きをする
配列であり、分泌因子配列は、クローニングされた遺伝
子と融合して発現されることによって、酵母内で産生さ
れたそのような組換えタンパク質が酵母外つまり培地中
に分泌されるようにする働きをする配列である。ここ
で、形質転換を行った酵母(Pichia pastoris)は、メタ
ノールを炭素源として利用できる酵母であるため、上記
組換え発現ベクターで形質転換した酵母をエタノールを
炭素源とした培地で液体培養すれば、酵母内で組換え発
現ベクター中の遺伝子が発現され、さらに組換えタンパ
ク質が酵母から培地中に分泌されることになる。
モーター配列、及びαファクターと呼ばれる分泌因子配
列を含んでいる。AOX1プロモーター配列は、酵母用液体
培地中のメタノールに特異的に反応して当該ベクターに
クローニングされた遺伝子の発現を誘導する働きをする
配列であり、分泌因子配列は、クローニングされた遺伝
子と融合して発現されることによって、酵母内で産生さ
れたそのような組換えタンパク質が酵母外つまり培地中
に分泌されるようにする働きをする配列である。ここ
で、形質転換を行った酵母(Pichia pastoris)は、メタ
ノールを炭素源として利用できる酵母であるため、上記
組換え発現ベクターで形質転換した酵母をエタノールを
炭素源とした培地で液体培養すれば、酵母内で組換え発
現ベクター中の遺伝子が発現され、さらに組換えタンパ
ク質が酵母から培地中に分泌されることになる。
【００６３】酵母形質転換体における導入遺伝子の発現
及び遺伝子産物のフルクタン合成能の確認 上記の２種類の組換え発現ベクターにより形質転換した
酵母を、メタノールを炭素源とした液体培地中で29℃に
て４日間培養した。使用した培地の組成は、1%Yeast Ex
tract,2 % Peptone,1.34% YNB(yeast Nitrogen base ),
0.5% メタノール,100mM リン酸カリウムバッファー pH
6.0であった。
及び遺伝子産物のフルクタン合成能の確認 上記の２種類の組換え発現ベクターにより形質転換した
酵母を、メタノールを炭素源とした液体培地中で29℃に
て４日間培養した。使用した培地の組成は、1%Yeast Ex
tract,2 % Peptone,1.34% YNB(yeast Nitrogen base ),
0.5% メタノール,100mM リン酸カリウムバッファー pH
6.0であった。
【００６４】次いで、培地中に分泌された遺伝子産物に
ついて、フルクタン合成能を確認した。培養物を4℃に
て8000rpm、20分遠心分離することにより培養上清を分
離し、これを限外濾過型フィルターにより約２０倍に濃
縮した。この濃縮液を粗酵素液として、100mM 1-ケスト
ースまたは100mM スクロースを含む20mM クエン酸リン
酸緩衝液（pH 5.0）と本粗酵素液を等量混合して0℃、
８時間反応させた。
ついて、フルクタン合成能を確認した。培養物を4℃に
て8000rpm、20分遠心分離することにより培養上清を分
離し、これを限外濾過型フィルターにより約２０倍に濃
縮した。この濃縮液を粗酵素液として、100mM 1-ケスト
ースまたは100mM スクロースを含む20mM クエン酸リン
酸緩衝液（pH 5.0）と本粗酵素液を等量混合して0℃、
８時間反応させた。
【００６５】次いで反応産物１０μlをHPLC分析にかけ
た。 HPLC分析条件 検出器：RI検出器 分離カラム：Shodex sugar KS-802 とKS-803の連結 分離溶液：蒸留水 流速： 毎分0.8ml 分離温度：５０℃
た。 HPLC分析条件 検出器：RI検出器 分離カラム：Shodex sugar KS-802 とKS-803の連結 分離溶液：蒸留水 流速： 毎分0.8ml 分離温度：５０℃
【００６６】以上のHPLC分析において、酵母によりそれ
ぞれ生産された上記２種類の組み換えタンパク質は、1-
ケストース（３糖）を基質として添加した場合にどちら
もニストース（４糖）並びに５及び６糖フルクタンを生
産することが確認された。また、スクロースのみを基質
として添加した場合には、どちらのタンパク質の反応液
にも３糖以上のフルクタンは検出されなかった。すなわ
ち、両タンパク質はフルクタンを基質としてフルクトシ
ル基を転移するフルクタン：フルクタン フルクトシル
トランスフェラーゼ活性を有することが示された。さら
に、これらの遺伝子産物が０℃という低温でも上記活性
を有していたことから、上記２種類の酵素は低温耐性で
あることが確認された。
ぞれ生産された上記２種類の組み換えタンパク質は、1-
ケストース（３糖）を基質として添加した場合にどちら
もニストース（４糖）並びに５及び６糖フルクタンを生
産することが確認された。また、スクロースのみを基質
として添加した場合には、どちらのタンパク質の反応液
にも３糖以上のフルクタンは検出されなかった。すなわ
ち、両タンパク質はフルクタンを基質としてフルクトシ
ル基を転移するフルクタン：フルクタン フルクトシル
トランスフェラーゼ活性を有することが示された。さら
に、これらの遺伝子産物が０℃という低温でも上記活性
を有していたことから、上記２種類の酵素は低温耐性で
あることが確認された。
【００６７】以上の分析に基づき、配列番号１又は３に
示される塩基配列からなるDNAはどちらも、低温耐性フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼをコードすることが確認された。また、この酵母形質
転換体を用いた実験において、添加する基質として1-ケ
ストースの代わりに重合度５〜１０のフルクタンを用い
て同様に生成フルクタンを生産させた結果、最大で重合
度２０〜２３の生成フルクタンが含まれることが確認さ
れた。
示される塩基配列からなるDNAはどちらも、低温耐性フ
ルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラー
ゼをコードすることが確認された。また、この酵母形質
転換体を用いた実験において、添加する基質として1-ケ
ストースの代わりに重合度５〜１０のフルクタンを用い
て同様に生成フルクタンを生産させた結果、最大で重合
度２０〜２３の生成フルクタンが含まれることが確認さ
れた。
【００６８】
【発明の効果】本発明により、低温耐性フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子が提供される。この遺伝子から産生されるフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
は、低温条件下でのフルクタン製造に有利に使用でき
る。また、この遺伝子を植物に導入し、フルクタンを植
物体内で産生させることにより、植物にストレス耐性を
付与することができる。
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子が提供される。この遺伝子から産生されるフル
クタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
は、低温条件下でのフルクタン製造に有利に使用でき
る。また、この遺伝子を植物に導入し、フルクタンを植
物体内で産生させることにより、植物にストレス耐性を
付与することができる。
【００６９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Agricultural Research Center for Hokkaido Region
<120> Low Temperature Expression Gene Encoding Fructan:Fructan Fructosyl
transferase
<130> P02-0054
<140>
<141>
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 1947
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1947)
<400> 1
atg gag tcg tca cgc ggc atc ctc atc ccc ggc acg ccg ccg ctg ccc 48
Met Glu Ser Ser Arg Gly Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
tac gcg tac gag ccg ctg ccc tcc tcc tcc gcc gac gcc aac ggc cag 96
Tyr Ala Tyr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Gly Gln
20 25 30
gag gac cgg cgg atc acc ggc ggc gtg agg tgg cgc gcg tgg gcc gcc 144
Glu Asp Arg Arg Ile Thr Gly Gly Val Arg Trp Arg Ala Trp Ala Ala
35 40 45
gtg ctg gcc gtg ggg gcg ctc gtc gtc gcc gcc gcg gtc ttt ggg gcc 192
Val Leu Ala Val Gly Ala Leu Val Val Ala Ala Ala Val Phe Gly Ala
50 55 60
agc agg gtc gac cgg gac gcg gtg gcc tcc tcc gta ccg gct aca gcg 240
Ser Arg Val Asp Arg Asp Ala Val Ala Ser Ser Val Pro Ala Thr Ala
65 70 75 80
gaa cat ggc gtg ctg gag aag gcg tcc ggg cca tac tcc gcc agc ggc 288
Glu His Gly Val Leu Glu Lys Ala Ser Gly Pro Tyr Ser Ala Ser Gly
85 90 95
ggc ttc ccg tgg agc aac gcc atg ctg cag tgg cag cgc acc ggc tac 336
Gly Phe Pro Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr
100 105 110
cat ttc cag ccg gag aag aac tac cag aac gat ccc aac ggt ccg gtg 384
His Phe Gln Pro Glu Lys Asn Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val
115 120 125
tac tac aaa gga tgg tac cac ttc ttc tac cag cac aat ccg ggg ggc 432
Tyr Tyr Lys Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln His Asn Pro Gly Gly
130 135 140
acc ggg tgg ggc aac atc tca tgg ggc cat gcc gtg tcg cgg gac atg 480
Thr Gly Trp Gly Asn Ile Ser Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asp Met
145 150 155 160
gtc cac tgg cgt cac cta ccg ctc gcc atg gtg ccc gag cac tgg tac 528
Val His Trp Arg His Leu Pro Leu Ala Met Val Pro Glu His Trp Tyr
165 170 175
gac atc gag ggt gtc ctc acc gga tcc atc acc gtg ctc ccc gat agc 576
Asp Ile Glu Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Ser
180 185 190
agg gtc atc ctg ctc tac aca ggg aac acc gag acg ttc gcg cag gtg 624
Arg Val Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val
195 200 205
acc tgc ctc gcg gag gcc gcc gac cca agc gac ccc ctc ctc cgc gag 672
Thr Cys Leu Ala Glu Ala Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu
210 215 220
tgg gtc aag cac ccc gcc aac ccc gtc gtg tac ccg ccc cct ggc atc 720
Trp Val Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Tyr Pro Pro Pro Gly Ile
225 230 235 240
ggc atg aag gac tac cgc gac ccc acc acg gcg tgg ttc gac aac tcc 768
Gly Met Lys Asp Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Asn Ser
245 250 255
gac aac acg tgg cgc atc atc att ggc tcc aag aat gat acc gac cac 816
Asp Asn Thr Trp Arg Ile Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Thr Asp His
260 265 270
tcc ggc att gta ttc acg tac aag acc aag gac ttc gtc agc tac gag 864
Ser Gly Ile Val Phe Thr Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Val Ser Tyr Glu
275 280 285
atg ata ccg ggg tac ctg tac cgc ggc ccc gcc ggc acc ggc atg tac 912
Met Ile Pro Gly Tyr Leu Tyr Arg Gly Pro Ala Gly Thr Gly Met Tyr
290 295 300
gag tgc atc gac ctg tac gcc gtt ggc ggt ggc cgc aag gcc agc gac 960
Glu Cys Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp
305 310 315 320
atg tac aac tcg acc gcc aag gat gtg ttg tac gtg ctc aag gag agc 1008
Met Tyr Asn Ser Thr Ala Lys Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser
325 330 335
agc gac gat gac cgg cgc gac tat tac gcg ctc ggg agg ttc gac gca 1056
Ser Asp Asp Asp Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Arg Phe Asp Ala
340 345 350
gcg gcc aac aca tgg acg ccg atc gac acc gag cag gaa ctc ggc gtc 1104
Ala Ala Asn Thr Trp Thr Pro Ile Asp Thr Glu Gln Glu Leu Gly Val
355 360 365
gcg ctg cgg tac gac tat ggc agg tac gac gcg tcc aag tcc ttc tac 1152
Ala Leu Arg Tyr Asp Tyr Gly Arg Tyr Asp Ala Ser Lys Ser Phe Tyr
370 375 380
gac ccc gtg aag cag cgg cgg atc gtc tgg ggg tac gtt gtc gag acc 1200
Asp Pro Val Lys Gln Arg Arg Ile Val Trp Gly Tyr Val Val Glu Thr
385 390 395 400
gac tcc tgg agc gcc gac gcc gcc aag ggg tgg gcc aac ctc cag tcg 1248
Asp Ser Trp Ser Ala Asp Ala Ala Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser
405 410 415
att ccg aga acg gtg gag ctt gac gag aag acc cgg acg aac ctc atc 1296
Ile Pro Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Ile
420 425 430
caa tgg ccg gtg gag gag ctc gat acc ctc cgc atc aac acc acc gat 1344
Gln Trp Pro Val Glu Glu Leu Asp Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp
435 440 445
ttc agc ggt atc act gtc ggt gcc gga tcc gtc gtc tcc ctc ccc ctc 1392
Phe Ser Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Val Ser Leu Pro Leu
450 455 460
cac cag acc tcc caa ctc gac atc gag gca tcc ttc cgc atc aac gcc 1440
His Gln Thr Ser Gln Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Arg Ile Asn Ala
465 470 475 480
tcc gcc att gag gcc ctc aat gag gtt gac gtc ggc tac aac tgc acc 1488
Ser Ala Ile Glu Ala Leu Asn Glu Val Asp Val Gly Tyr Asn Cys Thr
485 490 495
ctg acc agc ggc gcc gcc acc cgc ggc gcg ctc ggc ccc ttc ggc att 1536
Leu Thr Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Ile
500 505 510
ctt gtc ctc gcc aat gtc gcc ctg aca gaa cgg acg gcg gtg tac ttt 1584
Leu Val Leu Ala Asn Val Ala Leu Thr Glu Arg Thr Ala Val Tyr Phe
515 520 525
tat gtg tcc aag gga ctg gat ggt ggt ctt cgg acg cac ttc tgc cac 1632
Tyr Val Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His
530 535 540
gat gag ttg cgg tcg aca cat gct acc gat gtg gcg aag gag gta gtt 1680
Asp Glu Leu Arg Ser Thr His Ala Thr Asp Val Ala Lys Glu Val Val
545 550 555 560
ggt agc acg gta ccg gtg ctc gac ggc gag gat ttt tcc gtt agg gtg 1728
Gly Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val
565 570 575
ctc gtg gac cac tcc atc gtg cag agc ttc gtg atg ggc ggg agg atg 1776
Leu Val Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Val Met Gly Gly Arg Met
580 585 590
acg gcg aca tca agg gcc tac ccg acg gag gcc att tac gcg gcg gcg 1824
Thr Ala Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala
595 600 605
ggg gtc tac ctg ttc aac aat gcc acc ggc gcc agc atc acc gct gag 1872
Gly Val Tyr Leu Phe Asn Asn Ala Thr Gly Ala Ser Ile Thr Ala Glu
610 615 620
aag ctc gtc gtg cac gac atg gat tcg tcg tac aac cgg ata ttc aca 1920
Lys Leu Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn Arg Ile Phe Thr
625 630 635 640
gac gaa gac ttg tta gtc ctt gat tag 1947
Asp Glu Asp Leu Leu Val Leu Asp
645
<210> 2
<211> 648
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 2
Met Glu Ser Ser Arg Gly Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Gly Gln
20 25 30
Glu Asp Arg Arg Ile Thr Gly Gly Val Arg Trp Arg Ala Trp Ala Ala
35 40 45
Val Leu Ala Val Gly Ala Leu Val Val Ala Ala Ala Val Phe Gly Ala
50 55 60
Ser Arg Val Asp Arg Asp Ala Val Ala Ser Ser Val Pro Ala Thr Ala
65 70 75 80
Glu His Gly Val Leu Glu Lys Ala Ser Gly Pro Tyr Ser Ala Ser Gly
85 90 95
Gly Phe Pro Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr
100 105 110
His Phe Gln Pro Glu Lys Asn Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val
115 120 125
Tyr Tyr Lys Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln His Asn Pro Gly Gly
130 135 140
Thr Gly Trp Gly Asn Ile Ser Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asp Met
145 150 155 160
Val His Trp Arg His Leu Pro Leu Ala Met Val Pro Glu His Trp Tyr
165 170 175
Asp Ile Glu Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Ser
180 185 190
Arg Val Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val
195 200 205
Thr Cys Leu Ala Glu Ala Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu
210 215 220
Trp Val Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Tyr Pro Pro Pro Gly Ile
225 230 235 240
Gly Met Lys Asp Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Asn Ser
245 250 255
Asp Asn Thr Trp Arg Ile Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Thr Asp His
260 265 270
Ser Gly Ile Val Phe Thr Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Val Ser Tyr Glu
275 280 285
Met Ile Pro Gly Tyr Leu Tyr Arg Gly Pro Ala Gly Thr Gly Met Tyr
290 295 300
Glu Cys Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp
305 310 315 320
Met Tyr Asn Ser Thr Ala Lys Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser
325 330 335
Ser Asp Asp Asp Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Arg Phe Asp Ala
340 345 350
Ala Ala Asn Thr Trp Thr Pro Ile Asp Thr Glu Gln Glu Leu Gly Val
355 360 365
Ala Leu Arg Tyr Asp Tyr Gly Arg Tyr Asp Ala Ser Lys Ser Phe Tyr
370 375 380
Asp Pro Val Lys Gln Arg Arg Ile Val Trp Gly Tyr Val Val Glu Thr
385 390 395 400
Asp Ser Trp Ser Ala Asp Ala Ala Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser
405 410 415
Ile Pro Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Ile
420 425 430
Gln Trp Pro Val Glu Glu Leu Asp Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp
435 440 445
Phe Ser Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Val Ser Leu Pro Leu
450 455 460
His Gln Thr Ser Gln Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Arg Ile Asn Ala
465 470 475 480
Ser Ala Ile Glu Ala Leu Asn Glu Val Asp Val Gly Tyr Asn Cys Thr
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Ile
500 505 510
Leu Val Leu Ala Asn Val Ala Leu Thr Glu Arg Thr Ala Val Tyr Phe
515 520 525
Tyr Val Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His
530 535 540
Asp Glu Leu Arg Ser Thr His Ala Thr Asp Val Ala Lys Glu Val Val
545 550 555 560
Gly Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val
565 570 575
Leu Val Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Val Met Gly Gly Arg Met
580 585 590
Thr Ala Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala
595 600 605
Gly Val Tyr Leu Phe Asn Asn Ala Thr Gly Ala Ser Ile Thr Ala Glu
610 615 620
Lys Leu Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn Arg Ile Phe Thr
625 630 635 640
Asp Glu Asp Leu Leu Val Leu Asp
645
<210> 3
<211> 1935
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1935)
<400> 3
atg gag tcc tca cgc ggc atc ctc atc ccc ggc acg ccg ccg ctg ccc 48
Met Glu Ser Ser Arg Gly Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
tac gcg tac gag ccg ctg ccc tcc tcc tct gcc gac gcc aac ggc cag 96
Tyr Ala Tyr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Gly Gln
20 25 30
gag gac cgg cga acc agc ggc ggc gtc agg tgg cgc tcg tgg gcc acc 144
Glu Asp Arg Arg Thr Ser Gly Gly Val Arg Trp Arg Ser Trp Ala Thr
35 40 45
gtg ctg gcc gtg gtg gcg ctc gtc gtc gtc gcc gcg gtc ttt ggg gcc 192
Val Leu Ala Val Val Ala Leu Val Val Val Ala Ala Val Phe Gly Ala
50 55 60
agc agg gtc gac cgg gac gcg gtg gtc tcc tcc gcg tcg gct acg gcg 240
Ser Arg Val Asp Arg Asp Ala Val Val Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ala
65 70 75 80
gtc cac ggc gtg tcc ggg gca tat tcc tcc cac ggc ggc ttc ccg tgg 288
Val His Gly Val Ser Gly Ala Tyr Ser Ser His Gly Gly Phe Pro Trp
85 90 95
agc aac gcc atg ctg ggg tgg cag cgc acc ggc tac cat ttc cag ccg 336
Ser Asn Ala Met Leu Gly Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln Pro
100 105 110
gag aag aac tac cag aac gat ccc aac ggt ccg gtg tac tac aaa gga 384
Glu Lys Asn Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Lys Gly
115 120 125
tgg tac cac ttc ttc tac cag cac aac ccg ggg ggc acc ggg tgg ggc 432
Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln His Asn Pro Gly Gly Thr Gly Trp Gly
130 135 140
aac atc tca tgg ggc cat gcc gtg tcg cgg gac atg gtc cac tgg cgt 480
Asn Ile Ser Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asp Met Val His Trp Arg
145 150 155 160
cac cta ccg ctc gcc atg gtg ccc gag cac tgg tac gac atc gag ggc 528
His Leu Pro Leu Ala Met Val Pro Glu His Trp Tyr Asp Ile Glu Gly
165 170 175
gtc ctc acc gga tcc atc acc gtg ctc ccc gac ggc agg gtc atc ctg 576
Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Arg Val Ile Leu
180 185 190
ctc tac acg ggg aac acc gag acg ttt gcg cag gtg acc tgc ctc gcg 624
Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys Leu Ala
195 200 205
gag gcc gcc gac cca agc gac ccc ctc ctc cgt gag tgg gtc aag cac 672
Glu Ala Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val Lys His
210 215 220
ccc gcc aac ccc gtc gtg tac ccg ccc cct ggc atc ggc atg aag gac 720
Pro Ala Asn Pro Val Val Tyr Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met Lys Asp
225 230 235 240
tac cgt gac cca acc acg gcg tgg ttc gac aac tcc gac aac acg tgg 768
Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Asn Ser Asp Asn Thr Trp
245 250 255
cgc atc atc att ggc tcc aag aac gac acg gac cac tcc ggc atc gtc 816
Arg Ile Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Thr Asp His Ser Gly Ile Val
260 265 270
ttc acg tac aag acc aag gac ttc gtc agc tac gag ttg ata ccg ggg 864
Phe Thr Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Val Ser Tyr Glu Leu Ile Pro Gly
275 280 285
tac ttg tac cgc ggg ccc gcc ggc acc ggc atg tac gag tgc atc gac 912
Tyr Leu Tyr Arg Gly Pro Ala Gly Thr Gly Met Tyr Glu Cys Ile Asp
290 295 300
atg ttc gcc gtc ggc ggt ggc cgc aag gcc agc gac atg tac aat tcg 960
Met Phe Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr Asn Ser
305 310 315 320
acg gcc aag gac gtg ctg tac gtg ctc aag gag agc agc gac gac gac 1008
Thr Ala Lys Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp Asp Asp
325 330 335
cgg cgc gac tat tac gcg ctc ggg agg ttc gac gcg gcg gcc aac aca 1056
Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala Asn Thr
340 345 350
tgg acg ccg atc gac acc gag cgg gaa ctc ggc gtc gcg ctg cgg tac 1104
Trp Thr Pro Ile Asp Thr Glu Arg Glu Leu Gly Val Ala Leu Arg Tyr
355 360 365
gac tat ggc agg tac gac gcg tcc aag tcc ttc tac gac ccc gtg aag 1152
Asp Tyr Gly Arg Tyr Asp Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro Val Lys
370 375 380
gag cgg cgg atc gtc tgg ggg tac gtc gtc gag acc gac tcc tgg agt 1200
Glu Arg Arg Ile Val Trp Gly Tyr Val Val Glu Thr Asp Ser Trp Ser
385 390 395 400
gcc gat gcg gcc aag ggg tgg gcc aac ctt cag tcg att ccg aga acg 1248
Ala Asp Ala Ala Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro Arg Thr
405 410 415
gtg gag ctt gac gag aag acc cgg aca aac ctc atc caa tgg ccg gtg 1296
Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Val
420 425 430
gag gag ctc gat acc ctc cgc atc aac acc acc gat ctc agc ggt atc 1344
Glu Glu Leu Asp Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser Gly Ile
435 440 445
act gtc ggt gcc gga tcc gtc gtc tcc ctc ccc ctc cac cag acc tcc 1392
Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Val Ser Leu Pro Leu His Gln Thr Ser
450 455 460
caa ctc gac atc gag gca tcc ttc cgc atc aac gcc tcc gtc atc gag 1440
Gln Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Arg Ile Asn Ala Ser Val Ile Glu
465 470 475 480
gcc ctc aat gag gtc gac gtc agc tac aac tgc acc atg acc agc ggc 1488
Ala Leu Asn Glu Val Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Met Thr Ser Gly
485 490 495
gcc gcc acc cgc ggc gcg ctc ggc ccc ttc ggc att ctc gtc ctc gcc 1536
Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Ile Leu Val Leu Ala
500 505 510
aac gcc gcc ctg ata gaa cag acg gcg gtg tac ttt tat gtg tcc aag 1584
Asn Ala Ala Leu Ile Glu Gln Thr Ala Val Tyr Phe Tyr Val Ser Lys
515 520 525
ggc ctc gac ggc gtt ctt cga acg cac ttc tgc cac gat gag ttg cgg 1632
Gly Leu Asp Gly Val Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu Leu Arg
530 535 540
tcg acg cat gcc act gat gtg gcg aag gag gtg gtg ggt agc acg gtg 1680
Ser Thr His Ala Thr Asp Val Ala Lys Glu Val Val Gly Ser Thr Val
545 550 555 560
ccg gtg ctc gac ggc gag gat ttt tcc gtt agg gtg ctc gtg gac cac 1728
Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val Asp His
565 570 575
tcc atc gtg cag agc ttc gtc atg ggc ggg agg atg acg gcg acg tcg 1776
Ser Ile Val Gln Ser Phe Val Met Gly Gly Arg Met Thr Ala Thr Ser
580 585 590
agg gcg tac ccg acg gag gcc att tac gcg gcg gcg ggg gtc tac ctg 1824
Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val Tyr Leu
595 600 605
ttc aac aat gcc acc agc gcc acc atc acc gct gag aag ctc att gtg 1872
Phe Asn Asn Ala Thr Ser Ala Thr Ile Thr Ala Glu Lys Leu Ile Val
610 615 620
cac gac atg gat tcg tcg tac aac cgg ata ttc acg gac gcc gac ttg 1920
His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn Arg Ile Phe Thr Asp Ala Asp Leu
625 630 635 640
gta gtc ctc gat tag 1935
Val Val Leu Asp
645
<210> 4
<211> 644
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 4
Met Glu Ser Ser Arg Gly Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Gly Gln
20 25 30
Glu Asp Arg Arg Thr Ser Gly Gly Val Arg Trp Arg Ser Trp Ala Thr
35 40 45
Val Leu Ala Val Val Ala Leu Val Val Val Ala Ala Val Phe Gly Ala
50 55 60
Ser Arg Val Asp Arg Asp Ala Val Val Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ala
65 70 75 80
Val His Gly Val Ser Gly Ala Tyr Ser Ser His Gly Gly Phe Pro Trp
85 90 95
Ser Asn Ala Met Leu Gly Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln Pro
100 105 110
Glu Lys Asn Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Lys Gly
115 120 125
Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln His Asn Pro Gly Gly Thr Gly Trp Gly
130 135 140
Asn Ile Ser Trp Gly His Ala Val Ser Arg Asp Met Val His Trp Arg
145 150 155 160
His Leu Pro Leu Ala Met Val Pro Glu His Trp Tyr Asp Ile Glu Gly
165 170 175
Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Arg Val Ile Leu
180 185 190
Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys Leu Ala
195 200 205
Glu Ala Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val Lys His
210 215 220
Pro Ala Asn Pro Val Val Tyr Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met Lys Asp
225 230 235 240
Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Asn Ser Asp Asn Thr Trp
245 250 255
Arg Ile Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Thr Asp His Ser Gly Ile Val
260 265 270
Phe Thr Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Val Ser Tyr Glu Leu Ile Pro Gly
275 280 285
Tyr Leu Tyr Arg Gly Pro Ala Gly Thr Gly Met Tyr Glu Cys Ile Asp
290 295 300
Met Phe Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Ala Lys Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp Asp Asp
325 330 335
Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala Asn Thr
340 345 350
Trp Thr Pro Ile Asp Thr Glu Arg Glu Leu Gly Val Ala Leu Arg Tyr
355 360 365
Asp Tyr Gly Arg Tyr Asp Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro Val Lys
370 375 380
Glu Arg Arg Ile Val Trp Gly Tyr Val Val Glu Thr Asp Ser Trp Ser
385 390 395 400
Ala Asp Ala Ala Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro Arg Thr
405 410 415
Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Val
420 425 430
Glu Glu Leu Asp Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser Gly Ile
435 440 445
Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Val Ser Leu Pro Leu His Gln Thr Ser
450 455 460
Gln Leu Asp Ile Glu Ala Ser Phe Arg Ile Asn Ala Ser Val Ile Glu
465 470 475 480
Ala Leu Asn Glu Val Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Met Thr Ser Gly
485 490 495
Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Ile Leu Val Leu Ala
500 505 510
Asn Ala Ala Leu Ile Glu Gln Thr Ala Val Tyr Phe Tyr Val Ser Lys
515 520 525
Gly Leu Asp Gly Val Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu Leu Arg
530 535 540
Ser Thr His Ala Thr Asp Val Ala Lys Glu Val Val Gly Ser Thr Val
545 550 555 560
Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val Asp His
565 570 575
Ser Ile Val Gln Ser Phe Val Met Gly Gly Arg Met Thr Ala Thr Ser
580 585 590
Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val Tyr Leu
595 600 605
Phe Asn Asn Ala Thr Ser Ala Thr Ile Thr Ala Glu Lys Leu Ile Val
610 615 620
His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn Arg Ile Phe Thr Asp Ala Asp Leu
625 630 635 640
Val Val Leu Asp
<210> 5
<211> 1989
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1989)
<400> 5
atg gat tcg tct cgc gtc ata ctc atc ccc ggc acg ccg ccg ctg ccg 48
Met Asp Ser Ser Arg Val Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
tac gcc tac gag cag ctg ccg tcc tcc tcc gcg gac gcc aag ggc atc 96
Tyr Ala Tyr Glu Gln Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Lys Gly Ile
20 25 30
gag gag gag cgg gcc ggc ggc ggt ggc ctg agg tgg cgc gcg tgc gcc 144
Glu Glu Glu Arg Ala Gly Gly Gly Gly Leu Arg Trp Arg Ala Cys Ala
35 40 45
gcc gtg ctg gcc gcc tcg gcc gtg gtg gcg ctc gtc gtc gcc gcc gcg 192
Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Val Val Ala Leu Val Val Ala Ala Ala
50 55 60
gtc ttc ggg gcc agc ggg gcg ggc tgg gac gcg gtg gcc gcc tcc gtg 240
Val Phe Gly Ala Ser Gly Ala Gly Trp Asp Ala Val Ala Ala Ser Val
65 70 75 80
ccg gcg acc ccg gcg acg gag ttc ccg agg agc agg ggc aag gag cac 288
Pro Ala Thr Pro Ala Thr Glu Phe Pro Arg Ser Arg Gly Lys Glu His
85 90 95
ggc gtg tcg gag aag acg tcg ggg gcc tac tcc gcc aac gcg ttc ccg 336
Gly Val Ser Glu Lys Thr Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Asn Ala Phe Pro
100 105 110
tgg agc aac gcc atg ctg cag tgg cag cgc acc ggc tac cat ttc cag 384
Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln
115 120 125
ccg gac aag tac tac cag aac gat ccc aac ggt ccg gtt tac tat ggc 432
Pro Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Gly
130 135 140
gga tgg tac cac ttc ttc tac cag tac aac ccg tcg ggc tcc gtg tgg 480
Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Ser Val Trp
145 150 155 160
gag ccc caa atc gtg tgg ggc cac gcc gtg tcc aag gac ctc att cac 528
Glu Pro Gln Ile Val Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu Ile His
165 170 175
tgg cgc cac ctc ccg ccg gcc ttg gtg ccc gac cag tgg tac gac atc 576
Trp Arg His Leu Pro Pro Ala Leu Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile
180 185 190
aag ggc gtc ctc acc ggc tcc atc acc gtg ctc ccc gac ggc aag gtc 624
Lys Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Lys Val
195 200 205
atc ctc ctc tac acg ggg aac acc gag acc ttt gcg cag gtg acc tgc 672
Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys
210 215 220
ctc gcg gag ccc gcc gac ccg agc gat ccc ctc ctc cgc gag tgg gtc 720
Leu Ala Glu Pro Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val
225 230 235 240
aag cac ccc gcc aac ccc gtc gtg ttc ccg ccc ccc ggc atc ggc atg 768
Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Phe Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met
245 250 255
aag gac ttc cgc gac ccc acc acc gcg tgg ttc gac gag tcc gac ggc 816
Lys Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Glu Ser Asp Gly
260 265 270
acg tgg cgc acc atc atc ggc tcc aag aac gac tcg gac cac tcc ggc 864
Thr Trp Arg Thr Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Ser Asp His Ser Gly
275 280 285
atc gtc ttc tcc tac aag acc aag gac ttc ctc agc tac gag ctg atg 912
Ile Val Phe Ser Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Met
290 295 300
ccg ggg tac atg tac cgc ggc ccc aag ggc acc ggc gag tac gag tgc 960
Pro Gly Tyr Met Tyr Arg Gly Pro Lys Gly Thr Gly Glu Tyr Glu Cys
305 310 315 320
atc gac ctc tac gcc gtc ggc ggg ggc cgc aag gcc agc gac atg tac 1008
Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr
325 330 335
aac tcg acg gcc gag gac gtg ctg tac gtg ctc aag gag agc agc gac 1056
Asn Ser Thr Ala Glu Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp
340 345 350
gac gac cgg cac gac tgg tac tcg ctg ggc cgg ttc gac gcc gcc gcc 1104
Asp Asp Arg His Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala
355 360 365
aac aag tgg acg ccg atc gac gag gag ctg gag ctc ggc gtc ggg ctg 1152
Asn Lys Trp Thr Pro Ile Asp Glu Glu Leu Glu Leu Gly Val Gly Leu
370 375 380
cgg tac gac tgg ggc aag tac tac gcg tcc aag tcc ttc tac gac ccc 1200
Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro
385 390 395 400
gtg aag aag cgg cgc gtc gtg tgg gcg tac gtc ggc gag acc gac tcg 1248
Val Lys Lys Arg Arg Val Val Trp Ala Tyr Val Gly Glu Thr Asp Ser
405 410 415
gag cgc gcc gac atc acc aag ggg tgg gcc aac ctc cag tcg att ccg 1296
Glu Arg Ala Asp Ile Thr Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro
420 425 430
agg aca gtg gag ctt gac gag aag acc cgg acg aac ctc gtc caa tgg 1344
Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Val Gln Trp
435 440 445
cct gtg gag gag ctc gat gcc ctc cgc atc aac acc acc gat ctc agc 1392
Pro Val Glu Glu Leu Asp Ala Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser
450 455 460
ggc atc acc gtc ggc gcc ggc tcc gtt gcc ttc ctc ccc ctc cat cag 1440
Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Ala Phe Leu Pro Leu His Gln
465 470 475 480
acc gct cag ctc gac atc gag gca acc ttc cgc atc gat gcc tcc gcc 1488
Thr Ala Gln Leu Asp Ile Glu Ala Thr Phe Arg Ile Asp Ala Ser Ala
485 490 495
att gag gcc ctc aac gag gcc gat gtt agc tac aac tgc acc acc agc 1536
Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Thr Ser
500 505 510
agc ggg gct gcc acc cgc ggc gcg ctt ggc ccc ttc ggc ctc ctt gtc 1584
Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val
515 520 525
ctc gcc aac cgc gcc ctg acc gaa cag acg gga gtg tac ttc tat gtg 1632
Leu Ala Asn Arg Ala Leu Thr Glu Gln Thr Gly Val Tyr Phe Tyr Val
530 535 540
tcc aag ggc ctc gac ggt ggt ctt cgg act cac ttc tgc cac gac gag 1680
Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu
545 550 555 560
ttg cgc tcg tcg cat gct agt gac gtg gtg aag cgg gtg gtg ggt agc 1728
Leu Arg Ser Ser His Ala Ser Asp Val Val Lys Arg Val Val Gly Ser
565 570 575
acg gtg cca gtg ctc gac ggc gaa gat ttt tcc gtt agg gtg ctc gtg 1776
Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val
580 585 590
gac cac tcc att gtg cag agc ttc gcg atg ggc ggg agg ttg aca gca 1824
Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Ala Met Gly Gly Arg Leu Thr Ala
595 600 605
acg tcg agg gcg tac ccg acc gag gcc atc tac gcg gca gcg ggg gtc 1872
Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val
610 615 620
tac atg ttc aac aac gcc acc ggc act agc gtc acc gcc gag aag ctt 1920
Tyr Met Phe Asn Asn Ala Thr Gly Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys Leu
625 630 635 640
gtc gtg cat gat atg gac tcg tcg tac aac cat ata tac aca gat gat 1968
Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn His Ile Tyr Thr Asp Asp
645 650 655
gac ttg gta gtc gtc gat tag 1989
Asp Leu Val Val Val Asp
660
<210> 6
<211> 662
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 6
Met Asp Ser Ser Arg Val Ile Leu Ile Pro Gly Thr Pro Pro Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Glu Gln Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Lys Gly Ile
20 25 30
Glu Glu Glu Arg Ala Gly Gly Gly Gly Leu Arg Trp Arg Ala Cys Ala
35 40 45
Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Val Val Ala Leu Val Val Ala Ala Ala
50 55 60
Val Phe Gly Ala Ser Gly Ala Gly Trp Asp Ala Val Ala Ala Ser Val
65 70 75 80
Pro Ala Thr Pro Ala Thr Glu Phe Pro Arg Ser Arg Gly Lys Glu His
85 90 95
Gly Val Ser Glu Lys Thr Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Asn Ala Phe Pro
100 105 110
Trp Ser Asn Ala Met Leu Gln Trp Gln Arg Thr Gly Tyr His Phe Gln
115 120 125
Pro Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Asp Pro Asn Gly Pro Val Tyr Tyr Gly
130 135 140
Gly Trp Tyr His Phe Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Ser Val Trp
145 150 155 160
Glu Pro Gln Ile Val Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu Ile His
165 170 175
Trp Arg His Leu Pro Pro Ala Leu Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile
180 185 190
Lys Gly Val Leu Thr Gly Ser Ile Thr Val Leu Pro Asp Gly Lys Val
195 200 205
Ile Leu Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Glu Thr Phe Ala Gln Val Thr Cys
210 215 220
Leu Ala Glu Pro Ala Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val
225 230 235 240
Lys His Pro Ala Asn Pro Val Val Phe Pro Pro Pro Gly Ile Gly Met
245 250 255
Lys Asp Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Phe Asp Glu Ser Asp Gly
260 265 270
Thr Trp Arg Thr Ile Ile Gly Ser Lys Asn Asp Ser Asp His Ser Gly
275 280 285
Ile Val Phe Ser Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Met
290 295 300
Pro Gly Tyr Met Tyr Arg Gly Pro Lys Gly Thr Gly Glu Tyr Glu Cys
305 310 315 320
Ile Asp Leu Tyr Ala Val Gly Gly Gly Arg Lys Ala Ser Asp Met Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Ala Glu Asp Val Leu Tyr Val Leu Lys Glu Ser Ser Asp
340 345 350
Asp Asp Arg His Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg Phe Asp Ala Ala Ala
355 360 365
Asn Lys Trp Thr Pro Ile Asp Glu Glu Leu Glu Leu Gly Val Gly Leu
370 375 380
Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Pro
385 390 395 400
Val Lys Lys Arg Arg Val Val Trp Ala Tyr Val Gly Glu Thr Asp Ser
405 410 415
Glu Arg Ala Asp Ile Thr Lys Gly Trp Ala Asn Leu Gln Ser Ile Pro
420 425 430
Arg Thr Val Glu Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn Leu Val Gln Trp
435 440 445
Pro Val Glu Glu Leu Asp Ala Leu Arg Ile Asn Thr Thr Asp Leu Ser
450 455 460
Gly Ile Thr Val Gly Ala Gly Ser Val Ala Phe Leu Pro Leu His Gln
465 470 475 480
Thr Ala Gln Leu Asp Ile Glu Ala Thr Phe Arg Ile Asp Ala Ser Ala
485 490 495
Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Asp Val Ser Tyr Asn Cys Thr Thr Ser
500 505 510
Ser Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe Gly Leu Leu Val
515 520 525
Leu Ala Asn Arg Ala Leu Thr Glu Gln Thr Gly Val Tyr Phe Tyr Val
530 535 540
Ser Lys Gly Leu Asp Gly Gly Leu Arg Thr His Phe Cys His Asp Glu
545 550 555 560
Leu Arg Ser Ser His Ala Ser Asp Val Val Lys Arg Val Val Gly Ser
565 570 575
Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asp Phe Ser Val Arg Val Leu Val
580 585 590
Asp His Ser Ile Val Gln Ser Phe Ala Met Gly Gly Arg Leu Thr Ala
595 600 605
Thr Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Ala Gly Val
610 615 620
Tyr Met Phe Asn Asn Ala Thr Gly Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys Leu
625 630 635 640
Val Val His Asp Met Asp Ser Ser Tyr Asn His Ile Tyr Thr Asp Asp
645 650 655
Asp Leu Val Val Val Asp
660
【図１】図１は、本発明のフルクタン：フルクタン フ
ルクトシルトランスフェラーゼの酵素反応を説明する図
である。図中、「n」及び「m」は、2以上の整数を表
す。
ルクトシルトランスフェラーゼの酵素反応を説明する図
である。図中、「n」及び「m」は、2以上の整数を表
す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ
9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 19/04 5/00 Ａ
(72)発明者 吉田 みどり
北海道札幌市豊平区月寒東３条17丁目３−
１ アベニューオチ Ａ201号
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA07 AB03 AD08 AD20
CA06 CA17 CA19 CB03 CD03
CD07 CD09
4B024 AA08 BA10 CA04 HA03
4B050 CC01 CC03 DD13 LL05
4B064 AF11 CA19 CA21 CC24 DA11
4B065 AB01 BA02 CA29 CA53
Claims (21)
- 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質 - 【請求項２】 以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝
子。 (a) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNA (b) 配列番号１若しくは３に示される塩基配列からなる
DNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA - 【請求項３】 以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝
子。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNA (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列をコ
ードするDNAの全部若しくは一部に相補的な塩基配列か
らなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、フルクタン：フルクタン フルクトシルト
ランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする
DNA - 【請求項４】 コムギのゲノム中で０℃〜１０℃で発現
することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記
載の遺伝子。 - 【請求項５】 タンパク質が、０℃〜５０℃で生成フル
クタン合成能を有するものである、請求項１〜４のいず
れか１項記載の遺伝子。 - 【請求項６】 タンパク質が、０℃〜１０℃で生成フル
クタン合成能を有するものである、請求項１〜４のいず
れか１項記載の遺伝子。 - 【請求項７】 タンパク質が、重合度５〜１０のフルク
タンを基質として用いて重合度２０〜５０の生成フルク
タンを合成することができるものである、請求項１〜６
のいずれか１項記載の遺伝子。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項記載の遺伝
子を含む組換えベクター。 - 【請求項９】 請求項８記載の組換えベクターを含む形
質転換体。 - 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれか１項記載の遺
伝子を含むトランスジェニック植物。 - 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれか１項記載の遺
伝子を植物に導入することを特徴とする、植物へのスト
レス耐性付与方法。 - 【請求項１２】 ストレス耐性が、耐寒性、耐凍性、耐
雪性、乾燥耐性、貧栄養耐性、耐霜性及び耐病性からな
る群から選択される少なくとも１つである、請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項９記載の形質転換体を培養し、
得られる培養物からフルクタン：フルクタン フルクト
シルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取
することを特徴とする該タンパク質の製造方法。 - 【請求項１４】 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列から
なるタンパク質 (b) 配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクタン：フ
ルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質 - 【請求項１５】 ０℃〜５０℃で生成フルクタン合成能
を有するものである、請求項１４項記載のタンパク質。 - 【請求項１６】 ０℃〜１０℃で生成フルクタン合成能
を有するものである、請求項１４項記載のタンパク質。 - 【請求項１７】 重合度５〜１０のフルクタンを基質と
して用いて重合度２０〜５０の生成フルクタンを合成す
ることができる、請求項１４〜１６のいずれか１項記載
のタンパク質。 - 【請求項１８】 植物にストレス耐性を付与する、請求
項１４〜１７のいずれか１項記載のタンパク質。 - 【請求項１９】 ストレス耐性が、耐寒性、耐凍性、耐
雪性、乾燥耐性、貧栄養耐性、耐霜性、耐病性からなる
群から選択される少なくとも１つである、請求項１８記
載のタンパク質。 - 【請求項２０】 請求項１４〜１９のいずれか１項記載
のタンパク質をフルクタンと反応させて、生成フルクタ
ンを製造する方法。 - 【請求項２１】 請求項１０記載のトランスジェニック
植物を培養又は栽培し、得られる植物から、生成フルク
タンを抽出することを特徴とする、生成フルクタンの製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002086389A JP2003274969A (ja) | 2002-03-26 | 2002-03-26 | 低温発現型フルクタン合成酵素遺伝子 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002086389A JP2003274969A (ja) | 2002-03-26 | 2002-03-26 | 低温発現型フルクタン合成酵素遺伝子 |
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Family Applications (1)
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| JP2002086389A Pending JP2003274969A (ja) | 2002-03-26 | 2002-03-26 | 低温発現型フルクタン合成酵素遺伝子 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438103A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-05-06 | 湖北大学 | 调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用 |
-
2002
- 2002-03-26 JP JP2002086389A patent/JP2003274969A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438103A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-05-06 | 湖北大学 | 调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用 |
| CN114438103B (zh) * | 2022-03-15 | 2023-05-26 | 湖北大学 | 调控水稻对干旱和盐胁迫耐受性的转录因子OsNAC15基因及应用 |
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