CN101671661B

CN101671661B - 固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法

Info

Publication number: CN101671661B
Application number: CN2009100939358A
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 薛培俭; 穆晓玲; 尚海涛; 李维理
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2029-09-23
Also published as: CN101671661A

Abstract

本发明涉及一种固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法，采用绿色木霉、黑曲霉为生产菌种，分别培养得到绿色木霉液体种子和黑曲霉麸曲种子，然后将绿色木霉液体种子接入固体发酵培养基培养3-8天后，再将黑曲霉、麸曲种子的孢子洗下后接入正在培养的固体发酵培养基中继续培养8-12天，得同时含有纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的固体复合酶。该方法生产的固体复合酶活力高、组分配比合理、生产周期短、成本低、质量稳定。

Description

固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法

技术领域

本发明涉及一种利用廉价固体原料通过固体发酵生产固体纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶复合酶的方法。

背景技术

纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30-40％、15-30％、10-20％。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。然而，目前约80％纤维素未被开发利用，具有极为诱人的前景。

木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种。木聚糖是由D-木糖主链(以β-1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(a-1，2和a-1，3相连)所组成的聚合物。半纤维素木聚糖在木质组织中占总量的50％，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。这种坚硬的网络阻碍了纤维素酶对纤维素吸附，从而影响了纤维素的降解速率。

在天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠3种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄糖。由于高浓度的纤维二糖对C1酶和Cx酶活力有强烈的抑制作用，而在低浓度时则是纤维素酶的诱导物，如果纤维素酶复合组分中缺乏纤维二糖酶组分就会严重影响纤维素的降解速率。

由于所使用的黑曲霉是高产木聚糖酶和纤维二糖酶的菌株，而绿色木霉生产木聚糖酶和纤维二糖酶的能力较弱。故在发酵过程中，通过木聚糖酶对木聚糖的水解可以降低其和纤维素的连接，从而增加了纤维素酶对纤维素吸附。而纤维二糖酶则水解产生的纤维二糖，使纤维二糖的含量在发酵过程中处于低浓度水平，从而诱导纤维素酶降解纤维素。

发明内容

本发明的目的是针对纤维质原料发酵时利用率低、酶组成单一的不足，提供一种操作简便，成本低，酶活力高，酶组分配比合理的固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶的固体复合酶的方法。

一种固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法，采用绿色木霉、黑曲霉为生产菌种，分别培养得到绿色木霉液体种子和黑曲霉麸曲种子，然后将绿色木霉液体种子接入固体发酵培养基培养3-8天后，再将黑曲霉麸曲种子的孢子洗下后接入正在培养的固体发酵培养基中继续培养8-12天，得同时含有纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的固体复合酶。

本发明所用绿色木霉(Trichoderma viride)，优选保藏号为ACCC30206的绿色木霉，可从中国农业微生物菌种保藏管理中心获得；也可以使用其它产纤维素酶的绿色木霉或里氏木霉；黑曲霉(Aspergillusniger)优选保藏号为CGMCC 3.3147的黑曲霉，也可以使用其它产木聚糖酶和纤维二糖酶的黑曲霉。以绿色木霉菌株在玉米芯等农林废弃物上进行培养，一段时间后接入黑曲霉进行混菌培养。

本发明的方法，其中用于培养所述绿色木霉液体种子的种子培养基按重量计为葡萄糖1-3％、玉米浆1-3％、尿素1-3％、硫酸铵0.5-2％、磷酸二氢钾0.2-2％，硫酸镁0.2-1％，其余为水；用于培养所述黑曲霉麸曲种子的麸曲瓶培养基按重量计为麸皮35-45％、玉米芯50-65％、尿素1-3％、硝酸铵1-3％、磷酸二氢钾0.5-2％。

本发明的方法，其中所述固体发酵培养基含麸皮、玉米芯、尿素、硝酸铵或硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钴。优选配方为：重量百分比的玉米芯60-70％；麸皮25-40％；硫酸铵1-8％；尿素1-5％；磷酸二氢钾1-5％；碳酸钙1-5％；硫酸镁0.1-0.5％；氯化钴0.01-0.1％；初始pH5.0-7.0。

本发明的方法，其中将绿色木霉先接入种子培养基中，在20-30℃下条件培养48小时，再接入固体发酵培养基；将黑曲霉先接入麸曲瓶中，在20-30℃下条件培养4-8天，待绿色木霉接种培养3-8天时再以营养盐水洗下孢子接入正在培养的固体发酵培养基中继续培养8-12天。

本发明的方法，其中用于洗黑曲霉孢子的营养盐水为重量百分比的硫酸铵5～15％；尿素1～10％；磷酸二氢钾1～10％；硝酸钠1～10％；硫酸镁0.1～5％；其余为水。

本发明充分利用了廉价固体原料如麸皮、玉米芯作为菌种的碳源来源，变废为宝，降低生产成本，同时采用绿色木霉、黑曲霉混菌固态发酵，两种菌的发酵产物之间互相制约，并有协同作用，使得本方法对纤维质原料发酵时利用率高、所得酶系丰富，各酶之间相互协同作用，促进酶活增加。该方法生产的固体复合酶活力高、组分配比合理、生产周期短、成本低、质量稳定。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下面实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规实验方法。

实施例1

选择长势良好的生产用黑曲霉菌种CGMCC 3.3147斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有麸皮35％、玉米芯50％、尿素1％、硝酸铵1％、磷酸二氢钾0.5％的麸曲瓶培养基中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置30℃下培养。待7天后孢子长满整个培养基时移入冷藏室备用。选择长势良好的生产用绿色木霉菌种ACCC 30206斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含葡萄糖1％、玉米浆1％、尿素1％、硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.2％的液体种子瓶中，扎好8层纱布，30℃下190转经48h摇床培养。将培养结束后的绿色木霉液体种子按100％接种量接入121℃高压灭菌60分钟的浅盘固体发酵培养基中，其培养基为玉米芯60％；麸皮25％；硫酸铵1％；尿素1％；磷酸二氢钾1％；碳酸钙1％；硫酸镁0.1％；氯化钴0.01％，搅拌均匀，4天后用营养盐：硫酸铵5％；尿素1％；磷酸二氢钾1％；硝酸钠1％；硫酸镁0.1％，其余为水，洗下黑曲霉孢子，均匀接入正在培养的固体发酵培养基中。30℃培养10天。得到纤维素酶活为230IU/g，木聚糖酶酶活为8000IU/g，纤维二糖酶酶活为800IU/g。

实施例2

选择长势良好的生产用黑曲霉菌种CGMCC 3.3147斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有麸皮40％、玉米芯55％、尿素1.1％、硝酸铵1.1％、磷酸二氢钾0.6％的麸曲瓶培养基中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置30℃下培养。待7天后孢子长满整个培养基时移入冷藏室备用。选择长势良好的生产用绿色木霉菌种ACCC 30206斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含葡萄糖2％、玉米浆2％、尿素2％、硫酸铵0.6％、磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.3％的液体种子瓶中，扎好8层纱布，30℃下190转经48h摇床培养。将培养结束后的绿色木霉液体种子按100％接种量接入121℃高压灭菌60分钟的浅盘固体发酵培养基中，其培养基为玉米芯62％；麸皮32％；硫酸铵3％；尿素3％；磷酸二氢钾3％；碳酸钙3％；硫酸镁0.3％；氯化钴0.02％，搅拌均匀，4天后用营养盐：硫酸铵10％；尿素3％；磷酸二氢钾3％；硝酸钠3％；硫酸镁1％，其余为水，洗下黑曲霉孢子，均匀接入正在培养的固体发酵培养基中。30℃培养10天。得到纤维素酶活为240IU/g，木聚糖酶酶活为8500IU/g，纤维二糖酶酶活为850IU/g。

实施例3

选择长势良好的生产用黑曲霉菌种CGMCC 3.3147斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有麸皮45％、玉米芯65％、尿素1.1％、硝酸铵1.1％、磷酸二氢钾0.6％的麸曲瓶培养基中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置30℃下培养。待7天后孢子长满整个培养基时移入冷藏室备用。选择长势良好的生产用绿色木霉菌种ACCC 30206斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含葡萄糖2％、玉米浆2％、尿素2％、硫酸铵0.6％、磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.3％的液体种子瓶中，扎好8层纱布，31℃下190转经48h摇床培养。将培养结束后的绿色木霉液体种子按100％接种量接入121℃高压灭菌60分钟的浅盘固体发酵培养基中，其培养基为玉米芯65％；麸皮30％；硫酸铵5％；尿素5％；磷酸二氢钾5％；碳酸钙5％；硫酸镁0.5％；氯化钴0.08％，搅拌均匀，4天后用营养盐：硫酸铵15％；尿素9％；磷酸二氢钾9％；硝酸钠9％；硫酸镁4％，其余为水，洗下黑曲霉孢子，均匀接入正在培养的固体发酵培养基中。30℃培养10天。得到纤维素酶活为250IU/g，木聚糖酶酶活为9000IU/g，纤维二糖酶酶活为900IU/g。

Claims

1.一种固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法，其特征在于采用绿色木霉、黑曲霉为生产菌种，分别培养得到绿色木霉液体种子和黑曲霉麸曲种子，然后将绿色木霉先接入种子培养基中，在20-30℃下条件培养48小时，再接入固体发酵培养基；将黑曲霉先接入麸曲瓶中，在20-30℃下条件培养4-8天，待绿色木霉接种培养3-8天时再以营养盐水洗下孢子接入正在培养的固体发酵培养基中继续培养8-12天，得同时含有纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的固体复合酶；其中所述固体发酵培养基为重量百分比的玉米芯60-70％；麸皮25-40％；硫酸铵1-8％；尿素1-5％；磷酸二氢钾1-5％；碳酸钙1-5％；硫酸镁0.1-0.5％；氯化钴0.01-0.1％；初始pH5.0-7.0；其中用于培养所述绿色木霉液体种子的种子培养基按重量计为葡萄糖1-3％、玉米浆1-3％、尿素1-3％、硫酸铵0.5-2％、磷酸二氢钾0.2-2％，硫酸镁0.2-1％，其余为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于用于洗黑曲霉孢子的营养盐水为重量百分比的硫酸铵5～15％；尿素1～10％；磷酸二氢钾1～10％；硝酸钠1～10％；硫酸镁0.1～5％；其余为水。