CN114574388B - 一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解α‑茄碱的藤黄色单胞菌LuteimonaschenhongjianiiLC202103菌株及其制备方法和应用，本发明的一种降解α‑茄碱的LC202103菌株，该菌株为LC202103，保藏名称为藤黄色单胞菌LuteimonaschenhongjianiiLC202103；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCCNo.NO22639。本发明的菌株是一种能用于降解α‑茄碱的细菌，具有对α‑茄碱的降解能力强、环境安全的特点，可以用于生物降解α‑茄碱和食品安全。

Description

一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其制备方法和应用。
背景技术
茄碱(Solanine)，又名龙葵碱、龙葵素、马铃薯毒素等，是一种主要分布于茄科植物中的次生代谢物糖苷生物碱(Steroidal Glycoalkaloids，SGAs)类，广泛存在于马铃薯、番茄和茄子的根、茎、叶、果实和芽等植物组织中，其中在马铃薯中含量尤为丰富(Friedmanand McDonald，1997；赵雪淞等，2007)。马铃薯中α-茄碱具有良好的杀虫活性(Zheng etal.，2020)，对人畜具有较高的毒性，难引起呕吐、腹泻、丧失知觉、麻痹、休克等症状，若抢救不及时会造成死亡，还有较强的致畸和生殖毒性(季宇彬，2009；谭继君，2018)。
对于α-茄碱等生物碱的降解方法一直是国内外普遍关注的科学问题，目前对α-茄碱的降解主要还是通过酸水解或活性酶水解法(Friedman et al.，1993；Weltring etal.，1997)，如有些马铃薯中含有对α-茄碱具有降解活性的酶(Nikolic and Stankovic，2005；Dahlin et al.，2017)，这些酶可通过逐步脱去碳水化合物的方式起到一定的降解作用。然而，酸水解或植物酶类进行的茄碱的降解或去除，操作过程繁琐、费时费力、成本高，还存在着污染环境的潜在风险。因此，筛选新颖、高效的茄碱降解菌是马铃薯食品领域茄碱降解和清除的重要途径。至目前，国外一些学者从一些特殊环境中发现了一些茄碱降解菌，如Jensen et al.(2009)从地下水中发现了能使α-茄碱发生水解、毒性降低的微生物，但遗憾的是对那些具有降解作用的微生物的分类地位还不明确；Hennessy et al.(2018，2020)先后从绿皮马铃薯周围土壤中分离获得了对马铃薯中的糖苷生物碱α-茄碱具有高效降解作用的节杆菌属Arthrobacter和沙雷氏菌属Serratia的细菌。然而，目前国内外尚未见有藤黄色单胞菌Luteimonas chenhongjianii降解α-茄碱的研究报道，尤其是国内关于茄碱降解菌的资源的挖掘的研究报道还鲜见。
藤黄色单胞菌Luteimonas chenhongjianii属于变形菌门Proteobacteria黄单胞菌科Xanthomonadaceae的藤黄色单胞菌属Luteimonas。据报道，该菌可产生碱性磷酸酶、亮氨酸芳基酰胺酶和胰蛋白酶，D-木糖和D-塔格糖是其产酸来源。此外，同属的一些菌株，如Luteimonas sp.CW574对黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)具有降解作用(刘长宇，2019)；Luteimonas wenzhouensis sp.Nov.可降解几丁质(Zhou et al.,2020)。由此可见，该属的菌株对一些毒素及大分子物质具有降解作用，然而目前国内外关于该菌的其他功能方面的报道还很少见。而本研究从马铃薯块茎蛾分离到的藤黄色单胞菌Luteimonaschenhongjianii对α-茄碱具有高效降解作用，其降解效率高达99.75％。
马铃薯块茎蛾Phthorimaea operculell(Zeller)，隶属于鳞翅目双孔亚麦蛾总科麦蛾科块茎蛾属昆虫，是一种世界性分布的危害马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物的重要害虫。马铃薯块茎蛾中肠内含有丰富的共生细菌，这些细菌在马铃薯块茎蛾寄主适应、营养物质消化及代谢中发挥着重要作用。昆虫肠道共生细菌对寄主植物体内生物碱的降解作用已引起了国内外的关注，我们前期研究发现马铃薯块茎蛾中肠中内共生的藤黄色单胞菌具有降解马铃薯糖苷生物碱α-茄碱的作用。由此，利用从马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离获得的藤黄色单胞菌LC202103菌株降解α-茄碱，这对以马铃薯为原料开发的食品中茄碱的降解，保障食品安全，提供可供选择的菌株，具有重要的实际应用价值。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明提供一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其应用。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌Luteimonas chenhongjianii LC202103菌株，该菌株为藤黄色单胞菌Luteimonas chenhongjianii，保藏名称为Luteimonas chenhongjianii；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.22639。
进一步地，所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株的16S rDNA的基因序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株经革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，经LB平板划线纯化培养发现，菌落圆形，边缘整齐，淡黄色，略透明，湿润，低凸面。
本发明所述的降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株制备的藤黄色单胞菌LC202103菌株菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株的发酵液初提物；
(b)权利要求1所得藤黄色单胞菌LC202103菌株细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得藤黄色单胞菌LC202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)从马铃薯块茎蛾幼虫的中肠中分离获得藤黄色单胞菌LC202103菌株，采用LB培养基培养；
(2)然后在LB培养基上纯化，得到纯化的藤黄色单胞菌LC202103；
(3)采用高效降解菌株菌液进行α-茄碱降解能力的测定，菌液对α-茄碱的降解率达99.75％。
本发明所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株在制备α-茄碱降解制剂中的应用。
有益效果：本发明提供的藤黄色单胞菌LC202103是一种能用于降解茄科植物有毒的α-茄碱的降解菌，具有降解能力强、环境安全的优点，可以用于生物降解α-茄碱。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)分离获得的藤黄色单胞菌LC202103菌株是对α-茄碱具有强降解作用的细菌菌株。
(2)藤黄色单胞菌LC202103菌株培养简单，生长快速，易于在室内大量培养繁殖。
(3)本发明提供的藤黄色单胞菌LC202103是一种能用于绿色降解α-茄碱的害虫肠道细菌，不仅能提高马铃薯块茎蛾等害虫对富含茄碱茄科植物的适应性，还能高效降解α-茄碱，具有降解作用强、环境无污染的特点，可以广泛用于α-茄碱的生物降解，起到有效减少化学降解带来的环境污染。
附图说明
图1为本发明的藤黄色单胞菌LC202103的细胞形态图。
图2为本发明的藤黄色单胞菌LC202103生长曲线图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
本发明的一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株，该菌株为藤黄色单胞菌Luteimonas chenhongjianii，保藏名称为Luteimonas chenhongjianii；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.22639。
所述的降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株的16S rDNA的基因序列为SEQID No.1所示的核苷酸序列。
该菌株经LB平板划线纯化培养发现，藤黄色单胞菌LC202103菌株菌落圆形，边缘整齐，淡黄色，略透明，湿润，低凸面。
本发明所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株制备的藤黄色单胞菌LC202103菌株菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的藤黄色单胞菌LC202103菌株的发酵液初提物；
(b)所得藤黄色单胞菌LC202103菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得藤黄色单胞菌LC202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的藤黄色单胞菌LC202103菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)从田间马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离获得野生型藤黄色单胞菌LC202103菌株，在LB培养基上培养，将菌体转接到新配制的LB培养基上进行纯化；
(2)然后纯化培养获得纯化的藤黄色单胞菌LC202103；
(3)采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，藤黄色单胞菌LC202103菌株胞外酶对α-茄碱的降解率达99.75％。
本发明所述的藤黄色单胞菌LC202103菌剂在α-茄碱降解方面的应用。
实施例1
藤黄色单胞菌LC202103的分离及鉴定
本发明发明人于2021年3月25日从马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离到藤黄色单胞菌LC202103菌株。本发明发明人发现该菌对α-茄碱具有较强降解作用。
下面给出的是本发明提供的藤黄色单胞菌LC202103及其在α-茄碱降解方面的应用的实施例。
1.1材料
1.1.1供试菌株
菌株于2021年3月25日分离自云南省昆明市黑龙潭云南农业大学马铃薯块蛾幼虫中肠。
1.1.2菌株的分离培养
取大小一致、健康的马铃薯块茎蛾3龄幼虫50头，重复3次，共计150头，在无菌培养皿中饥饿处理8h。用75％酒精先将超净工作台台面清洗干净，用75％酒精对所有解剖器具进行消毒，再用紫外灯照射处理30min以上，完成对超净工作台的消毒。再将经饥饿处理后的马铃薯块茎蛾幼虫于-20℃冷冻2-3min，待其麻痹后，用无菌水冲洗2次，每次1min，75％酒精消毒90s，最后用无菌水冲洗2次，每次1min。取出后放置于无菌洁净的培养皿中，用无菌镊子从虫体尾部取出中肠，将内容物溶于装有1mL无菌PBS缓冲液的离心管中，充分匀浆。纯化的菌株采用LB斜面培养基保存于4℃冰箱。
1.1.3种类鉴定
形态鉴定：挑取上述筛选获得的高效降解菌株单菌落在LB培养基上进行划线，于25℃下培养72h，观察并记录单菌落的形态、颜色、隆起度、边缘形状、干湿等特征。并用革兰氏染色法对菌株进行染色，观察细胞形态和颜色，紫色代表阳性菌，红色代表阴性菌。参照按《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》的方法进行鉴定。
分子鉴定：第一，采用冻溶法提取细菌DNA。具体操作步骤如下：将菌株分别接种于LB液体培养基中，放置于25℃、180r/min摇床中振荡培养48h。取2mL菌液置于离心管中，在12000r/min离心2min，弃上清。在上述沉淀中加入500μL无菌水，涡旋振荡1min，使其菌体完全悬浮混匀。然后用液氮冰冻10min，沸水浴5min，12000r/min离心2min，取上清液作为PCR模板DNA备用。第二，运用细菌通用引物27f和1492r扩增16S rRNA基因。反应体系为25μL：引物各1μL，模板DNA 1μL，2
Figure BDA0003530435380000061
Taq PCR master mix 12.5μL，dd H2O 9.5μL。反应条件:94℃热变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。取3μLPCR产物进行凝胶电泳检测。第三，将鉴定好的PCR产物送生工生物工程(昆明)股份有限公司测序。第四，运用Contigexpress软件对测序结果进行拼接，将拼接好的16S rDNA序列，通过NCBI Blast程序与NCBI数据库中数据进行比对，查找相似性最高的典型菌株并下载序列(如下)。第五，运用MEGA7软件，采用国际通用的邻接法(Neighbor-Joining)和Kimura双参数矫正模型构建系统进化树。以重复抽样1000次进行Bootstrap验证，分析评估系统进化树拓扑结构的稳定性。
加藤黄色单胞菌LC202103菌株的16S序列号：
GTGGTCACGTGGCAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCCGATCTCTACGCATTTCACTGCTACACCGGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTTGTCCAGTTTCCACTGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACAGACTTAAACAACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCT。
1.2结果
经LB平板划线纯化培养发现，菌株LC202103菌落圆形，边缘整齐，淡黄色，略透明，湿润，低凸面。经革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状(图1)。
该藤黄色单胞菌LC202103菌株的培养的生长曲线结果表明，未发现迟缓期，0-6h为对数生长期，其中2-4h生长最快；6-28h为稳定期，22h到达最大生长量后缓慢下降；28-48h为衰亡期(图2为本发明的藤黄色单胞菌LC202103生长曲线)。
实施例2
藤黄色单胞菌LC202103对α-茄碱的降解作用测定
1材料
利用藤黄色单胞菌LC202103菌株。挑取5mL藤黄色单胞菌单克隆菌落接入配制好的LB液体培养基中，于25℃、180rpm条件下振荡培养，使OD600nm＝1.0。
诱导：采用100mL体积的三角瓶，取1mL藤黄色单胞菌培养液添加到9mL的LB培养基中，使最终OD600nm＝0.1；补充酸性磷酸盐缓冲液(对照)或5μg/mLα-茄碱，在180rpm、25℃条件下震荡培养20h。将藤黄色单胞菌菌液在25℃4000×g离心20min，上清液即为藤黄色单胞菌胞外酶粗提液。重复3次。
胞外酶降解体系：取100μL pH 5.5的50mM醋酸钠缓冲液，400μL pH 5.0 100mM醋酸钠缓冲液(0.2mM的α-茄碱)底物，450μL胞外粗提液，共计950μL，25℃孵育35h。于90℃下加热10min终止酶反应，然后在17000×g离心10min，转移上清液。用于LC-MS分析降解过程中产生的中间代谢物。
2.结果
采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，结果表明，藤黄色单胞菌LC202103菌株对降解率达99.75％。藤黄色单胞菌LC202103菌株对α-茄碱的降解作用如表1所示：
表1藤黄色单胞菌LC202103菌株对α-茄碱的降解作用
Figure BDA0003530435380000091
根据藤黄色单胞菌LC202103菌株胞外酶对α-茄碱降解能力测定，获得藤黄色单胞菌LC202103菌株胞外酶对α-茄碱降解率达99.75％。由此表明，藤黄色单胞菌LC202103菌株对α-茄碱具有很强的降解能力。
综上所述，本发明的藤黄色单胞菌LC202103菌株是一种能用于降解α-茄碱的昆虫中肠共生菌，具有降解作用强、无环境污染的优点，可以用于α-茄碱的生物降解实践。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌 LC202103菌株及其应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(加藤黄色单胞菌LC202103菌株的16S核苷酸序列)
<400> 1
gtggtcacgt ggcagcgccc tcccgaaggt taagctacct gcttctggtg caacaaactc 60
ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca gcaatgctga 120
tctgcgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggactg 180
agatagggtt tctgggattg gcttaccgtc gccggcttgc agccctctgt ccctaccatt 240
gtagtacgtg tgtagccctg gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc 300
ctccggtttg tcaccggcgg tctccttaga gttcccacca ttacgtgctg gcaactaagg 360
acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag 420
ccatgcagca cctgtgttcg agttcccgaa ggcaccaatc catctctgga aagttctcga 480
catgtcaagg ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat actccaccgc 540
ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg 600
cgaacttaac gcgttagctt cgatactgcg tgccaaattg cacccaacat ccagttcgca 660
tcgtttaggg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgtgcc 720
tcagtgtcag tgttggtcca ggtagctgcc ttcgccatgg atgttcctcc cgatctctac 780
gcatttcact gctacaccgg gaattccgct accctctacc acactctagt tgtccagttt 840
ccactgcagt tcccaggttg agcccagggc tttcacaaca gacttaaaca accacctacg 900
cacgctttac gcccagtaat tccgagtaac gcttgcaccc ttcgtattac cgcggctgct 960
ggcacgaagt tagccggtgc t 981

Claims (4)

1.一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株，其特征在于：该菌株为藤黄色单胞菌（Luteimonas chenhongjianii），保藏名称为Luteimonas chenhongjianii；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No. 22639。
2.权利要求1所述的降解α-茄碱的藤黄色单胞菌 LC202103菌株制备的藤黄色单胞菌LC202103菌株菌剂。
3.根据权利要求2所述的藤黄色单胞菌 LC202103菌株菌剂，其活性成分为如下（a）（b）中的至少一种：
（a）权利要求1所述的藤黄色单胞菌 LC202103菌株的发酵液初提物；
（b）权利要求1所得藤黄色单胞菌 LC202103菌株细胞的超声裂解上清。
4.权利要求1所述的藤黄色单胞菌 LC202103菌株在制备α-茄碱降解制剂中的应用。
CN202210203316.5A 2022-03-03 2022-03-03 一种降解α-茄碱的藤黄色单胞菌LC202103菌株及其制备方法和应用 Active CN114574388B (zh)

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WO1999043837A1 (en) * 1998-02-25 1999-09-02 Coöperatieve Verkoop- En Productievereniging Van Aardappelmeel En Derivaten Avebe B.A. Conversion and removal of steroid glycoalkaloids
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