CN102283118A

CN102283118A - 一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法

Info

Publication number: CN102283118A
Application number: CN2011101882886A
Authority: CN
Inventors: 徐玲玲; 陶贵荣; 郭斌; 付洪冰
Original assignee: Xian University
Current assignee: Xian University
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，其步骤为：1）采集植物材料，获得无任何病害的植物脱毒移栽苗；2）从植物中分离内生真菌；3）将分离到的各株内生真菌制备成内生真菌孢子悬液，不产生孢子的内生真菌制成菌丝悬液；4）接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗，以不接种内生真菌的移栽苗作为对照；5）用病原真菌感染接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗，一个月后观察其防治效果，防治效果大于80%的内生真菌是能够提高该种农作物抗真菌病害能力的内生真菌。

Description

一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法。

背景技术

农作物指农业上栽培的各种植物。包括粮食作物、经济作物（油料作物、蔬菜作物）、工业原料作物、饲料作物，药用作物等，因而与人类的衣食住行息息相关。但是，由于农作物是单一品种的大规模种植，因而很容易感染各种植物病害，其中主要是真菌病害（陈宏波，王伟，2009），如灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病和锈病等。真菌病害危害性十分巨大，其中，有的真菌病害发病率很高，范围很广，危害也很大，严重时会对农作物造成毁灭性打击，严重影响其产量甚至是大面积死亡。又因其多数可以靠风雨传播且其菌丝体或孢子可以在病枝、病叶、病落叶甚至是土壤中过冬（谭鹏等，2006），因此传染性、潜伏性强，杀灭难度大。由于目前对农作物真菌病害尚无非常行之有效的杀灭方法，所以主要以预防为主，一旦发病也主要采取及时剪除病枝病叶、甚至是病株，集中销毁，冬春季彻底清除枯枝落叶这类消极方法。化学防治也只能作为辅助手段，且在连续使用化学药剂的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，预防效果逐年下降。科学家们也尝试了许多非农药的防治方法，如用大蒜、辣椒和生姜防治黑斑病，几丁聚糖控制霜霉病（孙彤，2002），小苏打和高锰酸钾防治白粉病等方法，但效果都一般且防治效果不稳定，更重要的是其成本太高，不宜于大规模的推广应用。

内生真菌是指在其生活史中某一段时期内，生活于植物组织内部，而对宿主没有引起明显伤害的一类真菌（Petrini，1991）。自1898年Vogl从黑麦草（Lolium temulentum L.）种子内分离出第一株内生真菌至今，关于内生真菌的研究已有一百多年的历史（Wilson，1996），但是只有近二十多年来，内生真菌的研究才被广泛地开展起来，主要的研究工作大都集中在具有重要经济价值的植物上（Bacon and White，2000）。内生真菌广泛存在于不同地域、不同种类的植物组织内，从目前的研究报道结果看，所有被研究过的植物都有内生真菌的存在（Redlin and Carris，1996；Bacon and White，2000）。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共生关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用（郭良栋，2001）。例如，增强植物对氮元素的吸收，促进植物生长，增强植物对不利环境的耐受能力和抗病虫害能力等（Mei and Flinn，2010）。因为内生真菌在植物生长发育过程中的重要角色和相对于化学药剂其对环境的友好性，正越来越多地用于解决农作物生产中的各种问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，该方法通过病原真菌感染接种特定内生真菌的农作物脱毒苗并评价该内生真菌对该种真菌病害的防治效果，以达到筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）采集生长健康的植物根、茎或叶，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行表面消毒处理，在解剖镜下切成组织块或取其芽源基部分，然后接种在含6-BA和 NAA的MS半固体培养基上培养，所述的6-BA 的浓度的范围是1-3 mg/L，NAA的浓度的范围是0.1-1 mg/L，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含 IBA的1/2MS固体培养基上培养，所述IBA的浓度的范围是0.2-1 mg/L，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养，得到无任何病害的植物脱毒移栽苗；

2）将采集的植物材料每部分切成直径约5mm组织块，表面消毒，然后把消毒的植物组织放到有麦芽汁固体培养基的平皿内培养，在25℃，自然光照条件下，定期观察，将从植物组织内长出的真菌菌株转接至斜面保存；

3）将分离到的各株内生真菌制备成内生真菌孢子悬液，不产生孢子的内生真菌制成菌丝悬液；

4）接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗，以不接种内生真菌的移栽苗作为对照；

5）用病原真菌感染接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗，一个月后观察其防治效果，防治效果大于80%的内生真菌是能够提高该种农作物抗真菌病害能力的内生真菌。

通过查新，尚未见有本发明的方法大规模筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的报道。

具体实施方式

申请人发现用病原真菌感染接种特定内生真菌的农作物脱毒苗能够有效的检测该内生真菌是否能够提高该农作物的抗真菌病害能力。

本申请所使用的术语“农作物” 是指农业上栽培的各种植物。所述的“内生真菌”是指其生活史中某一段时期内，生活于植物组织内部，而对宿主没有引起明显伤害的一类真菌。所述的“病原真菌”是指寄生于植物并引致病害的真菌。农作物可以是粮食作物﹑经济作物（油料作物、蔬菜作物）、工业原料作物、饲料作物和药用作物等。例如小麦、苹果、油菜、咖啡、金银花等等。

本发明的筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，按以下步骤进行：

1）采集生长健康的植物根、茎或叶，用75%乙醇（质量浓度）和3.5%次氯酸钠（质量浓度）进行表面消毒处理，在解剖镜下切成组织块或取其芽源基部分，然后接种在含6-BA和 NAA的MS半固体培养基上培养，所述的6-BA 的浓度的范围是1-3 mg/L，NAA的浓度的范围是0.1-1mg/L，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含 IBA的1/2MS固体培养基上培养，所述IBA的浓度的范围是0.2-1 mg/L，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养，得到无任何病害的植物脱毒移栽苗；

在具体实施中，内生真菌孢子悬液的浓度是10⁶/ml。

在具体实施中，内生真菌制成菌丝悬液是通过称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成悬液。

在各种具体实施中，接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗是挑选健康的移栽两个月的植物脱毒移栽苗，于晚上7点左右，用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养。次日早上8点去除保鲜袋，将植株于温室内25℃，光照14小时每日，培养一个月。一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种该种内生真菌。

在具体实施中，病原真菌可以是灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病和锈病等。

在具体实施中，防治效果按下列公式计算：

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数。

病情指数按下列公式计算：

病情指数（%）=Σ（病情等级代表数值×该等级株数）/（各级株数总和×最重一级的代表数值）。

病情等级是将发病情况分为以下五级：

0级：无病害；

1级：病斑面积占整个叶或根面积10%以下；

2级：病斑面积占整个叶或根面积11%-20%；

3级：病斑面积占整个叶或根面积21%-50%；

4级：病斑面积占整个叶或根面积50%以上。

在具体实施中，6-BA浓度范围是1-3 mg/L。在各种实施方式中，NAA的浓度的范围是0.1-1 mg/L。

在具体实施中，IBA浓度范围是0.2-1 mg/L。

以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，这些实施例是较优的实例，主要用于对本发明进一步理解，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

采集健康月季带叶的茎，在实验室用75%乙醇（质量浓度）和3.5%次氯酸钠（质量浓度）进行表面消毒处理，取枝条顶芽，在解剖镜下切取约2mm的芽源基部分，然后接种在含3mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS半固体培养基上培养，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含有0.5mg/L的 IBA的1/2MS固体培养基上培养，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养。

同时，将采集的月季带叶的茎切成直径约5mm组织块，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行植物组织表面消毒，然后把消毒的植物组织块放到有麦芽汁固体培养基的平皿内培养（25℃，自然光照），定期观察，从植物组织内长出的真菌菌株分离到斜面中保存。将分离到的内生真菌用PDA培养基培养两周后，用无菌水冲洗培养基表面的内生真菌培养物获得孢子，将冲洗液用8层纱布过滤后，8000rpm离心10min，用0.5 ml无菌水重新悬浮孢子，用血球计数板计数孢子浓度，将孢子悬液的浓度调整为10⁶/ml。不产孢的菌株称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成菌丝悬液。

挑选健康的移栽两个月的月季脱毒移栽苗，于晚上7点左右，用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷洒在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养。次日早上8点去除保鲜袋，25℃，光照14小时每日，培养一个月。一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种内生真菌。

用10⁶/ml的月季白粉病病原真菌蔷薇单囊壳菌（Sphaerotheca rosae）的孢子感染接种各种月季内生真菌的移栽苗。方法是用喷雾器把上述病原孢子悬液均匀喷在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，选取每种接种内生真菌的10个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的接种内生真菌的移栽苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋，并进行暗培养。24h后去除保鲜袋，将植株于温室内25℃、光照14小时培养一个月。其中，接种内生真菌Fusarium sp.防治效果为86%，是能够提高月季抗真菌病害能力的内生真菌。

实施例2：

采集健康小麦带叶的茎，在实验室用75%乙醇（质量浓度）和3.5%次氯酸钠（质量浓度）进行表面消毒处理，取枝条顶芽，在解剖镜下切取约2mm的芽源基部分，然后接种在含3mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS半固体培养基上培养，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含有0.5mg/L的 IBA的1/2MS固体培养基上培养，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养。

同时，将采集的小麦带叶的茎切成直径约5mm组织块，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行植物组织表面消毒，然后把消毒的植物组织块放到有麦芽汁固体培养基的平皿内培养（25℃，自然光照），定期观察，从植物组织内长出的真菌菌株分离到斜面中保存。将分离到的内生真菌用PDA培养基培养两周后，用无菌水冲洗培养基表面的内生真菌培养物获得孢子，将冲洗液用8层纱布过滤后，8000rpm离心10min，用0.5 ml无菌水重新悬浮孢子，用血球计数板计数孢子浓度，将孢子悬液的浓度调整为10⁶/ml。不产孢的菌株称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成菌丝悬液。

挑选健康的移栽两个月的小麦脱毒移栽苗，于晚上7点左右，用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷洒在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养。次日早上8点去除保鲜袋，25 ^oC，光照14小时每日，培养一个月。一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种内生真菌。

用10⁶/ml的小麦黑斑病病原小麦链格孢菌（Alternaria triticina）的孢子感染接种了各种小麦内生真菌的移栽苗。方法是用喷雾器把上述病原孢子悬液均匀喷在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，选取每种接种内生真菌的10个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的接种内生真菌的移栽苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋，并进行暗培养。24h后去除保鲜袋，将植株于温室内25 ^oC、光照14小时培养一个月。其中，接种内生真菌Neotyphodium sp.防治效果为80%，是能够提高小麦抗真菌病害能力的内生真菌。

实施例3：

采集健康雪莲叶片，在实验室用75%乙醇（质量浓度）和3.5%次氯酸钠（质量浓度）进行表面消毒处理，在解剖镜将叶片切成约0.5cm×0.5cm的组织块，然后接种在含3mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS半固体培养基上培养，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含有0.2mg/L的 IBA的1/2MS固体培养基上培养，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养。

同时，将采集的雪莲带叶的茎切成直径约5mm组织块，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行植物组织表面消毒，然后把消毒的植物组织块放到有麦芽汁固体培养基的平皿内培养（25 ^oC，自然光照），定期观察，从植物组织内长出的真菌菌株分离到斜面中保存。将分离到的内生真菌用PDA培养基培养两周后，用无菌水冲洗培养基表面的内生真菌培养物获得孢子，将冲洗液用8层纱布过滤后，8000rpm离心10min，用0.5 ml无菌水重新悬浮孢子，用血球计数板计数孢子浓度，将孢子悬液的浓度调整为10⁶/ml。不产孢的菌株称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成菌丝悬液。

挑选健康的移栽两个月的雪莲脱毒移栽苗，于晚上7点左右，用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷洒在雪莲植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养。次日早上8点去除保鲜袋，25℃，光照14小时每日，培养一个月。一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种内生真菌。

用10⁶/ml的雪莲白粉病病原的孢子感染接种了各种雪莲内生真菌的移栽苗。方法是用喷雾器把上述病原孢子悬液均匀喷在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，选取每种接种内生真菌的10个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的接种内生真菌的移栽苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋，并进行暗培养。24h后去除保鲜袋，将植株于温室内25℃、光照14小时培养一个月。其中，接种内生真菌Alternaria sp.防治效果为80%，能够提高雪莲抗真菌病害能力的内生真菌。

Claims

1.一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）采集生长健康的植物根、茎或叶，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行表面消毒处理，在解剖镜下切成组织块或取其芽源基部分，然后接种在含6-BA和 NAA的MS半固体培养基上培养，所述的6-BA 的浓度的范围是1-3 mg/L，NAA的浓度的范围是0.1-1mg/L，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含 IBA的1/2MS固体培养基上培养，所述IBA的浓度的范围是0.2-1 mg/L，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养，得到无任何病害的植物脱毒移栽苗；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料是农业上栽培的各种植物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的各种植物为粮食作物﹑油料作物、蔬菜作物、工业原料作物、饲料作物或药用作物的植物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不产生孢子的内生真菌制成菌丝悬液是称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成悬液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗是挑选健康的移栽两个月的月季脱毒移栽苗，于晚上7点用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷洒在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养，次日早上8点去除保鲜袋，将植株于25℃条件下，每日光照14小时，培养一个月；一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种该种内生真菌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌感染接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗的方法是，用喷雾器将上述病原孢子悬液均匀喷洒在接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有10个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的接种内生真菌的移栽苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋，并进行暗培养，24h后去除保鲜袋，将植株于25℃条件下、光照14小时，培养一个月。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌是指寄生于植物并引致病害的真菌，包括灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病或锈病。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防治效果按下列公式计算：

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数；

所述病情指数按下列公式计算：

病情指数（%）=Σ（病情等级代表数值×该等级株数）/（各级株数总和×最重一级的代表数值）；

所述病情等级是将发病情况分为以下五级：

0级：无病害；

1级：病斑面积占整个叶或根面积10%以下；

2级：病斑面积占整个叶或根面积11%-20%；

3级：病斑面积占整个叶或根面积21%-50%；

4级：病斑面积占整个叶或根面积50%以上。