CN103323591B - 检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法。本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液，其中，所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQ？ID？No.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒具有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点。利用本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒检测牛血清特异性强、灵敏度高、重复性好、适于大批量检测，可用于牛分枝杆菌抗体的临床检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
牛结核病（Bovinetuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）引起的一种慢性传染病，它可以传染给人，人饮用消毒不彻底的受结核病菌污染的牛奶或直接接触患结核病的病牛，使人感染患结核病。近十几年来，世界各国都采取了各种措施来控制和消灭牛结核病，目前只在少数发达国家已消灭了牛结核病，在大多数发展中国家仍然有牛结核病的发生，我国也不例外,虽然我国一直采用“检疫和捕杀阳性牛”的防制办法，但至今仍未能消灭牛结核病。因此，控制和消灭牛结核病是我国当今的一件大事，具有重要的经济和公共卫生意义。一直以来，检测牛结核病的方法用得最多的方法是牛结核菌素皮内变态反应(purifiedproteinderivative,PPD)检测法，其缺点是费时、费力，结果易受人为和其它因素如怀孕等的影响，虽然其结果不是很准确，但是在我国还是作为检测牛结核病的标准。目前急需快速、准确、简便的检测牛结核病的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于临床大批量检测的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，以便于牛分枝杆菌抗体的临床检测。
本发明所提供的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液，其中，所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。
其中，SEQIDNo.2由100个氨基酸残基组成。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述固相载体可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。在本发明的一个实施例中，所述固相载体具体为聚苯乙烯。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述包被酶标板可按照包括如下步骤的方法制备：将氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，每升所述包被缓冲液可按照如下方法配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQIDNo.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。
其中，SEQIDNo.1由100个核苷酸组成。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a（+）中的EcoRI和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。
上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述抗牛IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；
所述阴性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清；
所述阳性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；
所述洗涤液是含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；每升所述含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液由NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，吐温-20500uL，加蒸水定容至1000mL，调pH值到7.4制成；
所述稀释液是1%小牛血清白蛋白（BSA）溶液；
所述封闭液是5%脱脂奶粉溶液；
所述底物液是TMB-H2O2溶液；每升所述TMB-H2O2溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H2O232ul组成；所述TMB缓冲液由Na2HPO418.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调pH至5.5，加水至1000mL制成；所述TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB10mg制成；
所述终止液是2MH2SO4溶液。
本发明还提供了制备上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的方法。
本发明所提供的制备检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的方法，包括如下制备包被酶标板的步骤：将氨基酸序列是SEQIDNo.1的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板；
上述方法中，每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。
上述方法中，所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQIDNo.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。
上述方法中，所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a（+）中的EcoRI和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。
本发明的实验证明，本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒具有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点。利用本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒检测牛血清特异性强、灵敏度高、重复性好、适于大批量检测，可用于牛分枝杆菌抗体的临床检测。
附图说明
图1是牛分枝杆菌抗原MBA的SDS-PAGE图。
图中：M.蛋白质分子量标准；1.DH5α/pET32a未诱导，2.DH5α/pET32a诱导表达；3.DH5α/pET32a-MBA未诱导；4.IPTG诱导DH5α/pET32a-MBA1hr；5.IPTG诱导DH5α/pET32a-MBA2hrs；6.IPTG诱导DH5α/pET32a-MBA3hrs；7.IPTG诱导DH5α/pET32a-MBA4hrs.
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中牛结核菌素皮内变态反应检测的方法如下：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，三个月以内的犊牛，也可在肩肿部进行，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。不论大小牛只，一律皮内注射0.1mL(含2000IU)牛型提纯结核菌素（牛PPD，哈药集团生物疫苗有限公司，批号为08007,规格为5mL/瓶,冻干型），皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。判断标准：牛分枝杆菌阳性：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm；疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm且小于4.0mm；牛分枝杆菌阴性：无炎性反应，皮厚差在2.0mm以下。
下述实施例中的γ-干扰素ELISA检测的方法如下：采用牛分枝杆菌IFN-γ试剂盒（购自北京测迪科技有限公司，为进口产品，批号为63319）进行检测，检测方法：牛血浆的制备：采集牛的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，每头牛抗凝血加入24孔组织培养板三孔，各1.5mL，分别无菌加入100μLPBS(阴性抗原对照)（试剂盒自带）、禽PPD（试剂盒自带）、牛PPD（试剂盒自带）至相应的孔，37℃湿温培养箱中孵育16-24小时，用可调移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。牛γ-干扰素酶免疫试验：加入50μL稀释液（试剂盒自带）至所需孔；加入50μL待测样品和对照样品至含有稀释液的相应孔中，室温（22±5℃）孵育60±5min，洗涤6次；每孔加入100μL新鲜配制的酶标结合物（试剂盒自带），室温孵育60±5min,洗涤6次，每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液（试剂盒自带），室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，终止后5min内读出OD450nm。判断标准：牛PPD的OD450nm－阴性抗原的OD450nm≥0.1且牛PPD的OD450nm－禽PPD的OD450nm≥0.1为牛分枝杆菌阳性；牛PPD的OD450nm－阴性抗原的OD450nm<0.1或牛PPD的OD450nm－禽PPD的OD450nm<0.1为牛分枝杆菌阴性。
下述实施例中经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清是对先按照上述牛结核菌素皮内变态反应方法检测结果为牛分枝杆菌阴性的牛过一个月后再采血按照上述γ-干扰素ELISA检测方法仍为牛分枝杆菌阴性的牛的血清。
下述实施例中经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清是对先按照上述牛结核菌素皮内变态反应方法检测结果为牛分枝杆菌阳性的牛过一个月后再采血按照上述γ-干扰素ELISA检测方法仍为牛分枝杆菌阳性的牛的血清。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其使用方法
本实施例制备的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液。其中包被酶标板是用氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。各部分的具体制备方法如下：
一、检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的制备
（一）包被酶标板的制备
用氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原MBA包被96孔酶标板（由聚苯乙烯制成）得到包被酶标板，具体方法如下：
1、牛分枝杆菌抗原MBA的制备
制备SEQIDNo.1的牛分枝杆菌抗原MBA基因。SEQIDNo.1的第32-334位为编码序列，编码SEQIDNo.2所示的牛分枝杆菌抗原MBA。SEQIDNo.2由100个氨基酸残基组成。
用限制内切酶EcoRI和HindⅢ酶切牛分枝杆菌抗原MBA基因，同时用EcoRI和HindⅢ双酶切pET32a（+）（购自美国Novagen公司，货号：69015-3），回收pET32a（+）的酶切大片段，并利用T4连接酶将回收的牛分枝杆菌抗原MBA基因片段与pET32a（+）的酶切大片段连接，转化到E.coli菌株DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆并测序，得到将pET32a（+）的EcoRI和HindⅢ识别位点之间的小片段取代为SEQIDNo.1的第32-334位核苷酸所示的牛分枝杆菌抗原MBA基因的重组表达载体pET32a-MBA。将导入pET32a-MBA的E.coli菌株DH5α命名为DH5α/pET32a-MBA。培养DH5α/pET32a-MBA，经IPTG诱导表达牛分枝杆菌抗原MBA蛋白，12,000r/min离心5min收集诱导表达的菌体，以原培养液1/50体积的PBS悬浮菌体，加入溶菌酶溶液至终浓度为100μg/mL，冰浴中超声裂解，每次裂解2s，间隔2s，共3min；重复以上裂解步骤三次，最后4℃12，000r/min离心10min，收集分离上清液，舍弃沉淀。上清即为表达的牛分枝杆菌抗原MBA蛋白。同时按照上述方法将pET32a（+）导入E.coli菌株DH5α得到含有pET32a（+）的空载体对照菌DH5α/pET32a，按照上述方法进行诱导表达。图1为牛分枝杆菌抗原MBA蛋白的表达检测结果，表明DH5α/pET32a-MBA表达的牛分枝杆菌抗原MBA蛋白的大小为30kDa，而空载体对照菌DH5α/pET32a不表达牛分枝杆菌抗原MBA蛋白。用镍柱（购自美国通用公司的high-affinityNi-NTARasin产品）进行纯化，将镍柱预处理，加入表达的牛分枝杆菌抗原MBA蛋白，然后加入含咪唑洗脱液（50mMNaH2PO4,300mMNaCl，250mMimidazole，pH8.0）4℃作用10min，3000rpm离心1min收集洗脱液，重复洗脱一次，收集的洗脱液即为纯化的牛分枝杆菌抗原MBA作为试剂盒中包被酶标板的包被抗原。
纯化的牛分枝杆菌抗原MBA的序列测定结果表明其N末端的15个氨基酸为SEQIDNo.2的第1-15位氨基酸残基。
2、用牛分枝杆菌抗原MBA包被96孔酶标板
经测定步骤1纯化的牛分枝杆菌抗原MBA的浓度为144μg/mL，用包被缓冲液将步骤1纯化的牛分枝杆菌抗原MBA稀释至8μg/mL，作为包被液加入96孔酶标板（由聚苯乙烯制成，购自加拿大JET公司），100μL/孔，置于37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对得到的酶标板按照如下方法进行封闭得到包被酶标板：用PBST洗板3次，拍干，每孔加入5%的脱脂奶粉溶液200μL，置于37℃封闭1小时，用PBST洗板3次，拍干，得到包被酶标板。保存于4℃待用。
其中，每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6。
每升PBST（含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液）由NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，吐温-20500uL，加蒸水定容至1000mL，调pH值到7.4制成。
每100mL5%的脱脂奶粉溶液按照如下方法配制：将5g脱脂奶粉用PBST定容至100mL。
（二）检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中其它试剂的配制
1、阴性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清；
2、阳性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；
3、抗牛IgG酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG，购自KPL公司；
4、洗涤液：为上述PBST（含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液）。
5、稀释液：为1%BSA溶液。每100mL1%BSA溶液按照如下方法配制：1g牛血清白蛋白BSA用PBST定容至100mL。
6、封闭液：为上述5%的脱脂奶粉溶液。
7、底物液：是TMB-H2O2溶液；所述TMB-H2O2溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H2O232ul组成；其中，每升TMB缓冲液由Na2HPO418.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调pH至5.5，加水至1000mL制成；TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB10mg制成。
8、终止液：2MH2SO4溶液：21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中。
二、检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的使用方法
用步骤一的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒检测待检血清样品的方法如下：
1、与血清结合：在步骤一的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的包被酶标板中各设1个阴性标准孔和阳性标准孔，阴性标准孔每孔加入100μL阴性标准血清，阳性标准孔每孔加入100μL阳性标准血清，其余孔加入待检血清样品100μL/孔，每份待检血清样品各设3个孔，于37℃温育1h后，用PBST洗板3次，拍干。
2、与酶标二抗结合：抗牛IgG酶标二抗用稀释液以1:500倍稀释，100μL/孔，置于37℃温育1h后，用PBST洗板3次，拍干；
3、显色：每孔加入100uL底物液，于37℃避光作用10min；
4、终止：每孔加入50uL终止液，酶标仪读出OD450nm值；
5、结果判定：
用步骤一的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒按照上述方法检测50份牛分枝杆菌阴性血清，计算50份牛分枝杆菌阴性血清OD450nm的平均值(X)为0.152，标准差（SD）为0.043，按照公式：X+3SD确定此ELISA方法的阴阳临界值为0.281，即确定步骤一的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒按照上述方法检测时，若待检血清样品OD450nm值≥0.281为阳性，若待检血清样品OD450nm值＜0.281则为阴性。
其中，50份牛分枝杆菌阴性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清。
实施例2、实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的特异性
用实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒按照实施例1的使用方法检测4份牛布鲁氏杆菌病阳性血清（Bru阳性血清）的10倍稀释液、4份牛口蹄疫阳性血清（FMD阳性血清）的10倍稀释液、4份牛分枝杆菌阳性血清（M.bovis阳性血清）的10倍稀释液和4份牛分枝杆菌阴性血清（M.bovis阴性血清）的10倍稀释液这些待检血清样品，结果表明牛布鲁氏杆菌病阳性血清、牛口蹄疫阳性血清和牛分枝杆菌阴性血清的OD450nm的值均小于0.281，均为阴性，即实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒与牛常见的病原体没有发生交叉反应，结果见表1。
其中，牛分枝杆菌阳性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；
牛分枝杆菌阴性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清。
表1间接ELISA检测方法的特异性试验
注：“＋”为阳性；“－”为阴性。
实施例3、实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的敏感性
用实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒按照实施例1的使用方法检测牛分枝杆菌阳性血清的1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280倍稀释液这六种待检测血清样品，检测结果显示，血清稀释至1:320的OD450nm为0.301，大于阳性判定值0.281，判为阳性，检测到1:640倍稀释的血清时，其OD450nm值为0.242，小于阳性判定值0.281，判为阴性，其检测敏感性为1:320的血清稀释。
其中，牛分枝杆菌阳性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清。
实施例4、实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的重复性
用实施例1的同批次和不同批次纯化的牛分枝杆菌抗原MBA作包被抗原，制备实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒并按照实施例1的使用方法检测牛分枝杆菌阳性血清的10倍稀释液分别进行批内和批间重复检测，结果如表2所示，批内3次检测的变异系数在0.3%-3.0%之间，小于5%；批间的变异系数在0.7%-2.4%之间，也小于5%。
表2.重复性试验结果
实施例5、实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的实际应用
随机采集30份临床样品，从牛颈静脉或牛尾巴动脉采集牛血液10mL，凝固析出的血清为待检血清样品。用实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒按照实施例1的使用方法检测。结果如表3所示，结果有1份血清为牛分枝杆菌阳性，29份血清为牛分枝杆菌阴性。这一结果与用上述牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测结果一致。
表3ELISA检测30份牛血清结果（OD450nm值）
其中，上述实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中的包被酶标板中的牛分枝杆菌抗原MBA的包被浓度（8μg/mL）是按照如下方法优化得到的：
经测定实施例1纯化的牛分枝杆菌抗原MBA的浓度为144μg/mL，分别用实施例1的包被缓冲液进行倍比稀释，稀释后的浓度分别为32、16、8和4μg/mL，分别作为包被液，按照实施例1的方法制备得到包被酶标板。按照实施例1的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的使用方法测定牛分枝杆菌阳性血清和牛分枝杆菌阴性血清的OD450nm。实验结果如表4所示，OD450nm的值接近1时，对应的牛分枝杆菌抗原MBA浓度为8μg/mL，血清稀释度为1:200，即为最佳的包被抗原浓度和血清稀释度。
通过对间接ELISA其他反应条件的优化，间接ELISA优化程序如下：包被抗原的包被条件为37℃作用1h；封闭液为5%脱脂奶粉溶液，时间为1h；与血清结合时间为60min，最佳酶标二抗浓度1:500倍稀释，作用时间为1h。
表4抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度的确定
注：“＋”为阳性；“－”为阴性。
其中，牛分枝杆菌阳性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；牛分枝杆菌阴性血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清。
Claims (10)
1.检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板按照包括如下步骤的方法制备：将氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。
3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQIDNo.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a(+)中的EcoRI和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。
6.根据权利要求1至5中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗牛IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；
所述阴性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清；
所述阳性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；
所述洗涤液是含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；每升所述含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液由NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，吐温-20500uL，加蒸水定容至1000mL，调pH值到7.4制成；
所述稀释液是1％BSA溶液；
所述封闭液是5％脱脂奶粉溶液；
所述底物液是TMB-H2O2溶液；每升所述TMB-H2O2溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H2O232ul组成；所述TMB缓冲液由Na2HPO418.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调pH至5.5，加水至1000mL制成；所述TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB10mg制成；
所述终止液是2MH2SO4溶液。
7.制备检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的方法，包括如下制备包被酶标板的步骤：将氨基酸序列是SEQIDNo.2的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQIDNo.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a(+)中的EcoRI和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。
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| CN102445548A (zh) * | 2011-11-15 | 2012-05-09 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 基于五邻体蛋白的favi抗体间接elisa检测试剂盒 |
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| 结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究;李红霞;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20080415;E060-3 * |
| 重组结核分枝杆菌CFP10蛋白的表达、纯化和复性及其免疫特性的研究;罗垲炜等;《中国预防医学杂志》;20090430;第10卷(第4期);第1.4、1.9节，摘要 * |
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