CN112079919B - 一种h7n9病毒特异性识别抗体p52h12及检测试剂盒 - Google Patents

一种h7n9病毒特异性识别抗体p52h12及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种H7N9病毒特异性识别抗体P52H12及检测试剂盒，所述抗体的氨基酸序列中，重链CDR1:GGTFSNYA，CDR2:IIPIFGTA，CDR3:ALPCSSTSCYLVVQGAYYYGMDV，轻链CDR1:QSLLHSNGYNY，CDR2:LGS，CDR3:MQALQTPPT。该抗体能够特异性识别H7N9流感病毒抗原，具有高亲和力和高特异性，可有效解决目前临床诊断上普遍存在的假阳性情况，为流感病毒的防控提供准确的检测结果。

Description

一种H7N9病毒特异性识别抗体P52H12及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒诊断技术领域，具体涉及一种H7N9型禽流感病毒的特异性识别抗体P52H12及该病毒的检测试剂盒。
背景技术
急性呼吸道感染是人类最普遍的感染性疾病。多数呼吸道感染是由病毒引起的，临床上常见的病原体有腺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒和鼻病毒，而支原体和衣原体均为呼吸道致病细菌。由于针对不同细菌和病毒感染采取的治疗方案有所不同，所以在感染后就需要尽快做出诊断。同时由于高致病性流感病毒的强传播性和高致死性，需对其进行严格的隔离与防护。由于一般的临床诊断方法不能鉴别病原体的差别，因此就需要采取准确可靠的实验室方法进行病原体的鉴别诊断。
为实现针对流感病毒抗原的检测，需要得到针对流感病毒的高亲和力抗体，目前市场上的检测抗体多为动物来源，例如：杂交瘤技术发展出的鼠源抗体和兔源抗体。但由于人血清成分的复杂性，因此很容易产生假阳性的检测情况，即未感染病毒的血清仍可能存在针对鼠源或兔源抗体的抗体，这时的血清学诊断结果即为假阳性。这将为临床未发病的疑似病例诊断带来很大的困难。为了解决这一问题，目前已有方案是对得到的鼠源抗体或兔源抗体进行种属改变，即对其进行人源化，但在这过程中，将大概率会导致抗体的亲和力和特异性的严重丢失，最终得到的人源化抗体也失去了其应用的价值。因此我们利用噬菌体展示技术，筛选针对流感病毒抗原的人源的高亲和力和高特异性的单克隆抗体用于临床的诊断。
发明内容
本研究通过构建人源抗体的噬菌体展示文库，筛选针对流感病毒H7N9抗原的高亲和力和高特异性的人源单克隆抗体，用于临床的诊断，以解决目前临床诊断上普遍存在的假阳性情况，为流感病毒的防控提供准确的检测结果。
下面详述本发明的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种H7N9病毒特异性识别抗体P52H12，重链及轻链的决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)氨基酸序列如下：
Figure BDA0002660984730000021
决定簇互补区为高变区，是抗体与抗原的结合位置，CDR3具有更高的高变程度，重链在于抗原结合中起重要的作用。
优选的，上述抗体P52H12中，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了上述抗体P52H12的编码基因。
优选的，上述编码基因中，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第三方面，本发明提供了含上述编码基因的载体。
第四方面，本发明提供了含上述编码基因的宿主细胞。
第五方面，本发明提供了上述抗体P52H12在制备H7N9病毒的诊断试剂中的应用。
第六方面，本发明提供了一种H7N9病毒特异性检测试剂盒，含有上述抗体P52H12。
优选的，上述检测试剂盒中，还含有包被有抗体P52H12的微孔板、经修饰的抗体P52H12作为二抗、缓冲溶液、样品稀释液、显色液、阴性对照血清和阳性对照液。缓冲溶液、样品稀释液、显色液和阳性对照液等均采用本领域常规试剂即可，无特殊成分要求。例如，缓冲溶液和样品稀释液可使用PBS，酶标二抗可以采用HRP标记，使用TMB显色液或ABTS显色液。阳性对照液中含有H7N9灭活抗原和PBS。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的抗体P52H12为人源单克隆抗体，能够特异性识别H7N9流感病毒抗原，具有高亲和力和高特异性，抗原抗体结合的EC50值较小，远高于目前的大部分抗体(EC50值一般在五十至几百纳摩尔)，亲和力非常高，而且相比于现有的RT-PCR检测方法，使用该抗体直接进行免疫检测更加简单快速、低成本，可有效解决目前临床诊断上普遍存在的假阳性情况，为流感病毒的防控提供准确的检测结果。
另外，使用本发明的抗体进行免疫检测，相较于以往的RT-PCR方法检测，更加简单快速。
附图说明
图1为P52H12蛋白表达产物电泳图。
图2为通过ELISA对P52H12IgG形式抗体进行亲和力测定结果。
图3为恢复期病人血清与SH02HA毒株(A/Shanghai/2/2013 H7N9)、17SF HA毒株(A/Guangdong/17SF003/2016)、human H5 rHA单体蛋白(SH02 MONO,17SF MONO,human H5MONO)结合验证实验结果，BSA为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1H7N9病毒特异性识别抗体的筛选
(1)构建人源Fab抗体的噬菌体展示文库
以感染H7N9病毒后恢复期的病人血清与SH02 HA、17SF HA、human H5rHA单体蛋白(SH02 MONO、17SF MONO、human H5 MONO)进行结合实验，实验结果如图3所示，说明恢复期病人血清中含有能H7或H5抗原结合的抗体，BSA作为阴性对照，没有非特异性结合。选用有特异性结合的病人血液作为建库样本。
以能够与上述病毒蛋白进行特异性结合的病人血液为样本，分离淋巴细胞，提取总RNA，经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用特异性引物对抗体的Fab片段进行扩增。将得到的片段连接到噬菌粒载体上，电转化到商业化的TG1感受态中，加入辅助噬菌体以产生人源Fab抗体噬菌体展示文库。
(2)针对H7N9的HA抗原进行初步筛选
将流感病毒的HA基因构建在杆状病毒表达载体上，经SF9细胞表达得到H7N9的囊膜蛋白HA，并以此为靶标(靶蛋白)进行筛选，得到若干候选抗体。对这些候选抗体进行亲和力测定(ELISA，生物传感器)和表位鉴定，综合考虑多种因素后确定若干候选克隆做进一步优化。
(3)候选克隆的亲和力成熟
以筛选到的候选抗体为模板做随机突变，构建亲和力成熟的噬菌体展示文库。继续利用上述靶蛋白进行筛选，经过几轮筛选-突变，得到针对HA亲和力较高的克隆。
(4)人源抗体亲和力和特异性分析
挑取若干候选克隆，将它们连入真核表达载体中，在293 F细胞表达并纯化IgG形式的候选克隆。对这些克隆进行亲和力测定(ELISA，生物传感器)、特异性分析(双抗夹心法验证不同HA抗原和其他无关抗原)。
最终筛选获得特异性、灵敏度高的抗体片段，命名为P52H12，其重链和轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，其重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。IgG蛋白表达电泳结果如图1所示，P52H12蛋白约在55KD左右。
实施例2抗体P52H12性质检测
参见图2，为通过ELISA对P52H12 IgG抗体进行亲和力测定的结果，其中●表示17SFHA毒株(A/Guangdong/17SF003/2016)，■表示SH02 HA毒株(A/Shanghai/2/2013H7N9)，▲表示BSA阴性对照。
结果显示，P52H12对H7N9的两个毒株SH02 HA以及17SF HA蛋白的EC50值分别为7.67nM和34.4nM，具有较高的亲和力，对H7亚型的HA蛋白具有一定的交叉活性；同时ELISA结果显示该抗体与对照BSA没有结合，没有非特异性。该抗体无中和抑制活性。
Figure BDA0002660984730000041
Figure BDA0002660984730000051
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 武汉珈创生物技术有限公司
<120> 一种H7N9病毒特异性识别抗体P52H12及检测试剂盒
<130> WH2006143-1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Pro Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Leu Val Val Gln Gly Ala
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
130 135 140
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser
225 230 235
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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180 185 190
Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc aactatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc actaccttgt 300
agtagtacca gctgctattt ggttgtacaa ggagcttact actacggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 420
ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 480
gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540
cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600
gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactag t 711
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<211> 660
<212> DNA
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tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagta aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaactcta cgcctgcgaa 600
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<211> 8
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<210> 6
<211> 8
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<400> 6
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1 5
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<211> 9
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<400> 9
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Thr
1 5

Claims (9)

1.一种H7N9病毒特异性识别抗体P52H12，其特征在于，重链及轻链的决定簇互补区氨基酸序列如下：
Figure FDA0002985930710000011
2.根据权利要求1所述的特异性识别抗体P52H12，其特征在于，重链氨基酸序列如SEQID NO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求2所述抗体P52H12的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.含权利要求3或4所述编码基因的载体。
6.含权利要求3或4所述编码基因的宿主细胞。
7.权利要求1或2所述抗体P52H12在制备H7N9病毒的诊断试剂中的应用。
8.一种H7N9病毒特异性检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述抗体P52H12。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，还含有包被有抗体P52H12的微孔板、经修饰的抗体P52H12作为二抗、缓冲溶液、样品稀释液、显色液、阴性对照血清和阳性对照液。
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