TWI829223B - 重組抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種對PEDV具有結合親和力及/或中和活性的重組抗體。依據本揭示內容某些實施方式，該PEDV是基因型1 (G1)或基因型2b (G2b) PEDV。本揭示內容亦關於利用所述重組抗體來診斷及治療PEDV感染的方法。

Description

重組抗體及其用途
本揭示內容是關於診斷及治療病毒感染的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種新穎的重組抗體，以及該重組抗體於診斷及治療豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染的用途。
PEDV是一種具有傳染性的豬腸道病毒，會使新生仔豬及哺乳仔豬產生豬流行性下痢(porcine epidemic diarrhea, PED)，進而影響全球養豬產業。歷史較為悠久的基因型1 (G1；亦稱為低致病基因型) PEDV首次於1970年代晚期在比利時確認，之後數十年成為一種偶發於歐洲及亞洲的地方流行疾病。藉由親緣比對分析，一種屬於基因型2 (G2；亦稱為高致病基因型，包含局部流行的G2a，以及全球流行的G2b)的新PEDV變異株於2010年在中國首次出現，之後快速遍佈北美及亞洲地區。此種新的PEDV變異株造成新生仔豬的高發病率及高死亡率。直到今日，相關領域仍無有效治療及控制新生仔豬季節性爆發PED的藥劑。
有鑑於此，相關領域亟需一種新穎之用以治療PEDV感染的藥劑，據以降低PEDV感染對豬隻健康及相關產業的影響。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以診斷及/或治療PEDV感染的重組抗體。所述重組抗體包含一輕鏈變異(light chain variable, VL)域及一重鏈變異(variable heavy chain, VH)域，其中VL域包含一第一輕鏈互補決定區(complementarity determining region) (CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)，且VH域包含一第一重鏈CDR (CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)及一第三重鏈CDR (CDR-H3)。
依據本揭示內容某些實施方式，CDR-L1包含「ENVGTY」(序列編號：1)的胺基酸序列，CDR-L2包含「GTF」的胺基酸序列，且CDR-L3包含「GQSYNYPFT」(序列編號：2)的胺基酸序列。在該些實施方式中，CDR-H1包含「GYTFTNYM」(序列編號：3)的胺基酸序列，CDR-H2包含「INPSTGYT」(序列編號：4)的胺基酸序列，且CDR-H3包含「ATSTLITGDY」(序列編號：5)的胺基酸序列。
依據某些較佳的實施方式，VL域包含與序列編號：6具有至少85%序列相似度的胺基酸序列，且VH域包含與序列編號：7具有至少85%序列相似度的胺基酸序列。在一特定實施例中，VL域包含與序列編號：6具有100%序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：7具有100%序列相似度的胺基酸序列。
依據某些實施方式，所述重組抗體是一單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)。較佳地，所述重組抗體更包含一連接VL域及VH域的連接子。依據某些實施方式，該連接子包含 (GGGGS) 3(序列編號：8)的胺基酸序列。
本揭示內容的第二態樣是關於一種藉由一個體之生物檢體來診斷該個體是否遭受PEDV感染的方法。本發明方法包含利用本揭示內容所述之重組抗體來偵測該生物檢體中是否存在PEDV的棘(spike, S)蛋白，其中S蛋白存在代表該個體遭受PEDV的感染。
依據某些實施方式，該PEDV是G1 PEDV。依據某些實施方式，該PEDV是G2b PEDV。
依據所需目的不同，生物檢體可以是血液檢體(例如，全血檢體、血清檢體或血漿檢體)、口腔檢體、腸道檢體、直腸檢體或糞便檢體。
本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療一個體之PEDV感染的方法。本發明方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容所述的重組抗體。
本揭示內容提供一種本發明重組抗體於製備一藥物的用途，其中該藥物是用以治療一個體之PEDV感染。
依據某些實施方式，該PEDV是G2b PEDV。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
Ｉ . 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容泛指單株抗體(monoclonal antibody；包含全長單株抗體)、多株抗體(polyclonal antibody)、多效抗體(multi-specific antibody；例如雙效抗體)、人源化抗體、嵌合型抗體及能產生特定生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment)一詞在本揭示內容中包含全長抗體的一部分，該部分通常為抗體中與抗原結合的位置或變異區域(例如VL及VH域)。例示性的抗體片段包含抗原結合片段(fragment antigen-binding, Fab)、Fab’、F(ab’)2、單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule)及由抗體片段形成的多效抗體。依據某些實施方式，抗體為scFv。
在本揭示內容中，「單鏈變異片段」(single-chain variable fragment或scFv)是指包含一免疫球蛋白之重鏈變異域(variable domain of the heavy chain, VH)及輕鏈變異域(variable doamin of the light chain, VL)的融合蛋白，其中該VH及VL是共價鍵結以形成一VH::VL異二聚體(heterodimer)。該VH及VL可直接連結或透過一由胜肽編碼之連接子連結，其中該連接子可連接VH的N端及VL的C端，或是連接VH的C端及VL的N端。連接子通常為包含多個能增加可撓性之甘胺酸(glycine)及多個能增加溶解性之絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)的片段。即使移除抗體之恒定域且插入連接子，scFv蛋白仍保有原免疫球蛋白的專一性。可由包含用以編碼VH及VL序列的核酸來表現單鏈Fv多肽抗體。
一抗體的「變異區域」(variable region)或「變異域」(variable domain)係指該抗體重鏈或輕鏈的胺基末端域。該些位置為抗體最易變動的部分，且包含抗原結合位點。「變異」(variable)一詞係指變異域中某些部分在抗體間序列差異廣泛且用於每種特定抗體對其特定抗原的結合及專一性的實情。然而，變異性並非均勻分佈於抗體的整個變異域。其主要集中於輕鏈及重鏈變異域中3個CDR或高度變異區域。變異域中更加高度保守的部分稱作框架區域(framework region, FR)。天然重鏈和輕鏈的變異域各自包含四個FR，它們大多採取β-折疊片構形，通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結構一部分的三個CDR連接。每條抗體鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合位點的形成。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但具有不同的作用功效，例如抗體於抗體相關細胞毒殺(antibody-dependent cellular toxicity)的作用。
「互補性決定區域」(complementarity determining region, CDR)在本說明書是指一抗體分子的高變異區域，其可與結合抗原之三維立體表面形成互補表面。由N端到C端，各抗體的重鏈及輕鏈皆包含三個CDR (即，CDR-1、CDR-2及CDR-3)。因此，一抗原結合位點共包含6個CDR，其分別為位於重鏈變異區域的3個CDR (即CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，以及位於輕鏈變異區域的3個CDR (即CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)。
本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含抗體之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少85%序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變抗體的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及／或刪除某些胺基酸而不影響本發明抗體的生理活性(即，決定或治療PEDV感染的能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似／相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於框架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測抗體衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的抗體。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備抗體片段或類似物。片段或類似物之較佳的胺基及羧基末端是鄰近功能域的邊界。在一實施例中，是對本發明抗體的一胺基酸殘基(例如纈胺酸)進行保留性置換(例如以白胺酸進行置換)。在其他實施例中，是以其他適合的胺基酸殘基來對本發明抗體的二個胺基酸殘基進行保留性置換；舉例來說，可以例示性之甲硫胺酸(M)及 離胺酸(K)、離胺酸(K)及脯胺酸(P)、色胺酸(W)及異白胺酸(I)、異白胺酸(I)及脯胺酸(P)、天門冬醯胺(N)及纈胺酸(V)，以及麩醯胺酸(G)及離胺酸(K)等胺基酸對來置換纈胺酸(V)及精胺酸(R)。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比」(Percentage (%) amino acid sequence identity)係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information, NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下： 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥劑的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本發明重組抗體)的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。
在本揭示內容中，「治療」(treat)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理PEDV感染相關的症狀、次要疾病或病徵。「治療」(treat)一詞於此說明書中亦指應用或投予本揭示內容之重組抗體至一個體，其患有與PEDV感染相關的症狀、次要疾病或病徵，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個與PEDV感染相關的症狀、次要疾病或病徵的發生。與PEDV感染相關之症狀、次要疾病或病徵包含，但不限於，腹瀉、嘔吐、脫水、食慾不振、厭食及抑鬱。「治療」亦可以是投予至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降與PEDV感染相關之症狀、次要疾病或病徵的發生。當一或多症狀或臨床標記降低時，則該治療為「有效的」(effective)。或者是，當一症狀、次要疾病或病徵的進程減緩或中止時，則該治療為「有效的」(effective)。
「個體」(subject)在本揭示內容係指可接受本發明重組抗體及/或方法治療的豬隻。除非另有所指，否則「個體」(subject)一詞同時意指雄性及雌性。
II. 發明詳細說明
本揭示內容旨在提供一種用以偵測及/或治療PEDV感染的重組抗體，據以減少該疾病對相關產業造成的影響。據此，本揭示內容的第一態樣是關於一種重組抗體，其對PEDV (例如， G1 PEDV或G2b PEDV)具有結合及中和活性。依據本揭示內容的實施方式，所述重組抗體包含一VL域及一VH域，其中該VL域包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且該VH域包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在該些實施方式中，重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含「ENVGTY」(序列編號：1)、「GTF」及「GQSYNYPFT」(序列編號：2)的胺基酸序列，而重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3則分別包含「GYTFTNYM」(序列編號：3)、「INPSTGYT」(序列編號：4)及「ATSTLITGDY」(序列編號：5)的胺基酸序列。
較佳地，重組抗體的VL域包含與序列編號：6具有至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列相似度的胺基酸序列，且重組抗體的VH域包含與序列編號：7具有至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列相似度的胺基酸序列。當可想見，該VL及VH域的框架序列可有所變異(例如以保留性或非保留性胺基酸殘基進行置換)，而不會影響本發明抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，以一或多具有相似特性的胺基酸殘基來保留性置換框架區域的序列；舉例來說，以異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(一非極性胺基酸殘基)來取代白胺酸(另一非極性胺基酸殘基)；以麩胺酸(一酸性胺基酸殘基)取代天門冬胺酸(另一酸性胺基酸殘基)；或是以精胺酸或組胺酸(一鹼性胺基酸殘基)來取代離胺酸(另一鹼性胺基酸殘基)。依據較佳的實施方式，所述VL及VH域分別包含與序列編號：6及7具有至少90%序列相似度的胺基酸序列。更佳地，所述VL及VH域分別包含與序列編號：6及7具有至少95%序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作實施例中，所述VL域包含與序列編號：6具有100%序列相似度的胺基酸序列(即，包含序列編號：6的胺基酸序列)，且所述VH域包含與序列編號：7具有100%序列相似度的胺基酸序列(即，包含序列編號：7的胺基酸序列)。
依據本揭示內容某些實施方式，重組抗體是製備為scFv的形式，其非必要地更包含一用以連接VL及VH域的連接子。依據某些實施方式，重組抗體由N端到C端依序包含VL域、連接子及VH域。依據替代性的實施方式，重組抗體由N端到C端依序包含VH域、連接子及VL域。較佳地，連接子包含甘胺酸(glycine, G)及/或絲胺酸(serine, S)殘基。更佳地，連接子是由G及/或S殘基所組成。在一特定實施例中，連接子包含 (GGGGS) 3(序列編號：8)的胺基酸序列。
依據某些實施方式，本發明重組抗體是源自一單株抗體，其係由傳統免疫法所製備，即，利用適當的抗原免疫化(immunizing)動物，使動物產生免疫反應(產生對應抗體)所製備。
利用免疫化動物來製備抗體的方法為本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的技藝。一般來說，先將作為免疫原的病毒顆粒(例如，PEDV病毒顆粒)以腹腔或皮下注射等方式投予至宿主動物(例如小鼠、大鼠或兔子)體內，以刺激宿主動物產生免疫反應。依據本揭示內容某些實施方式，用以產生單株抗體的宿主動物是小鼠。可依據習知流程來免疫化宿主動物。抗原注射的時間間隔並無特定限定。抗原注射的間隔時間可為數天至數週，較佳是每週注射1次，共注射2-10次，直到產生特定的抗體效價。舉例來說，可每週對宿主動物皮下注射病毒顆粒，連續注射8週。
注射抗原後，定期採取血液檢體並將之離心處理以分離血清。可利用任何適合的方法來檢測所得血清中的抗體效價，例如酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)。在一較佳的實施例中，是利用ELISA來測定抗體之效價。之後，對產生高抗體效價的動物注射最終劑病毒顆粒。由分離之脾臟細胞及區域淋巴結製備可產生抗體的細胞。在製備可產生抗體的細胞時，宜先盡可能移出組織殘渣及紅血球。在此步驟可使用商業購買之紅血球去除劑。或者是，可以使用包含氯化銨及三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris)的緩衝液。立即將可產生抗體的細胞與永生細胞(例如骨髓瘤細胞)進行融合，以製得融合瘤細胞；融合瘤細胞為一種可持續生長繁殖，並產生抗體的半永生細胞。可以使用由動物(例如小鼠)取得之常用的細胞株。較適用於本發明的細胞株為可有效融合、持續產生高量抗體、對次黃嘌呤-胺蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT)培養液具有敏感性，且唯有在與可產生抗體之細胞融合後方可存活的細胞株。適合的骨髓瘤細胞包含，但不限於，小鼠骨髓瘤細胞株(例如骨髓瘤FO細胞)及人類骨髓瘤細胞株(例如Karpas 707H)。細胞融合通常是將脾臟細胞或淋巴結細胞與商業取得之骨髓瘤細胞在一促進細胞融合因子的作用下，進行融合反應，例如平均分子量約為200至20,000 kDa的聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)或其他類似物。或者是，細胞融合可以利用商業細胞融合儀，藉由電刺激(例如電融合)來進行融合反應。融合後，將所得細胞稀釋並培養於HAT培養液中。
由該些融合細胞中挑選出適合的融合瘤細胞。於HAT培養液中存活的融合細胞會形成聚集群落。收集各培養液的上清液，且以病毒顆粒來檢測是否具有抗體效價。如上所述，可以使用ELISA、EIA或RIA來進行檢測。一旦確認可產生抗體的孔洞，即可將其中的細胞轉移至不含胺蝶呤的次黃嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine, HT)培養液中培養。經過培養，再次確認培養上清液中的抗體效價。由最終篩選出的細胞中，分離出單一顆細胞。待單一顆細胞生長繁殖成一聚集群落後，篩選對病毒顆粒具有高度專一性的聚集群落，並使其持續生長繁殖以製成融合瘤細胞株。
依據本揭示內容某些實施方式，先以核酸萃取方法(例如有機萃取法)來分離融合瘤細胞株的核酸後，將分離的核酸作為模板，利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)及密碼子優化引子(即表1所列示的引子)來擴增重組抗體的VL及VH域序列。將擴增序列轉殖至表現載體，接著將表現載體轉染至宿主細胞(例如大腸桿菌細胞，或是人類293T細胞或中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞等哺乳動物細胞)，以製備本揭示內容的重組抗體。依據較佳的實施方式，是以哺乳動物細胞來製備本發明重組抗體。在一特定實施例中，是以人類293T細胞來製備本發明重組抗體。
可利用習知的技術來純化製得的重組抗體，例如交叉流過濾(cross-flow filtration)、親和管柱層析及凝膠過濾等。
依據本揭示內容某些實施方式，可利用任何本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的偵測技術，以本發明重組抗體來偵測生物檢體的PEDV感染，例如免疫染色(舉例來說，ICC及IFA)、ELISA、西方墨點法及流式細胞儀分析。
本揭示內容的第二態樣因此是關於一種利用重組抗體來偵測一個體之生物檢體，以診斷該個體是否感染PEDV的方法。本發明方法包含利用重組抗體來偵測生物檢體中是否存在PEDV的S蛋白，其中S蛋白存在代表該個體感染PEDV。
依據某些實施方式，PEDV是G1 PEDV。依據某些實施方式，PEDV是G2b PEDV。
依據實施目的之不同，生物檢體可以是血液檢體(例如，全血檢體、血清檢體或血漿檢體)、口腔檢體(例如口腔液或口腔拭子)、腸道檢體、直腸檢體或糞便檢體。
本揭示內容亦提供一種用以預防及/或治療一個體之PEDV感染的方法。本發明方法包含對該個體投予一治療有效量之本揭示內容的重組抗體。
投予至個體的有效量約為每公斤個體體重0.01到1,000毫克，例如每公斤個體體重0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000毫克；較佳地，約為每公斤個體體重0.1到100毫克。該有效量可以單次等分劑量(aliquot)投予，或多次等分劑量投予。習知技藝人士可依據個體的生理狀況或疾病的嚴重程度來調整劑量或療程。
可藉由適當的路徑對個體投予本發明重組抗體；舉例來說，口服、腸內、鼻腔、局部、經黏膜及腸胃外投予(例如，靜脈內、腹腔內或動脈內注射)。依據某些較佳的實施方式，是以口服方式對個體投予本發明重組抗體。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例
材料及方法
製備本發明重組 scFv
為製備本發明重組scFv，依據本領域習知技藝人士所知的免疫化程流以PEDV病毒顆粒來免疫化小鼠，並據以製得融合瘤細胞株。在確認由融合瘤細胞株製備之抗體對PEDV具有結合親和力及專一性後，由對應的融合瘤細胞株萃取mRNA，並以該mRNA作為模板，利用通用定製正向引子(ISPCR)及特定反向引子(表1)擴增抗體之VL及VH域的序列。在各反應中，加入2微升之cDNA、10微升之PCR混合物、1微升之10 mM通用正向引子、1微升之10 mM特定反向引子，以及6微升之PCR等級的水。熱循環的條件如下：(1) 94°C反應3分鐘；(2) 95°C反應30秒、60°C反應30秒(-0.5°C各循環)及72°C反應1分鐘，共循環12次；(3) 95°C反應30秒、56°C反應30秒及72°C反應1分鐘，共循環18次。最後於72°C反應5分鐘。擴增產物的預期大小約為550-600 bp。分析序列以確認輕、重鏈的框架區域(framework region, FR)及互補決定區域(complementarity determining region)。
表1  用以擴增重組scFv之VL及VH域的引子
名稱 引子序列(由5’端到3’端) 序列編號
ISPCR AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 9
mIgK反向引子 ACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAG 10
mIgL反向引子 ATCGTACACACCAGTGTGGC 11
mIgHG反向引子 GGGATCCAGAGTTCCAGGTC 12
* ISPCR：通用正向引子；mIgK：變異κ (kappa)輕鏈；mIgL：變異λ (lambda)輕鏈；mIgHG：變異重鏈。
將擴增後的VL及VH序列轉殖到表現載體pcDNA™3.1/V5-His TOPO。為了於哺乳動物細胞中表現，將(G 4S) 3連接子(序列編號：8)導入VL及VH序列之間，並於編碼序列的5’端加入一組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator, tPA)訊息肽序列，以促進細胞分泌。連接後，利用勝任大腸桿菌(competent Escherichia coli( E. coli))來擴增質體，之後以質體萃取套組萃取質體。為轉染1公升之EXPI293F™細胞(濃度為每毫升3×10 6個細胞)，將2.7毫升的轉染試劑預稀釋於50毫升的OPTI-MEM ®中，接著與1毫克之預稀釋於50毫升之OPTI-MEM ®的DNA質體混合。轉染前將混合液置於室溫反應20分鐘。加入轉染混合液後，將EXPI293F™細胞培養於37°C之具有8% CO 2的環境中，並以125 rpm的轉速搖晃細胞。轉染表現4天後，收集EXPI293F™細胞的上清液及細胞裂解物進行SDS-PAGE及西方墨點法分析，以確認本發明scFv的表現量。
得到的重組scFv包含VL及VH域。如表2所總結，該VL及VH域分別包含序列編號：6及7的胺基酸序列，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含「ENVGTY」(序列編號：1)、「GTF」及「GQSYNYPFT」(序列編號：2)的胺基酸序列，而CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3則分別包含「GYTFTNYM」(序列編號：3)、「INPSTGYT」(序列編號：4)及「ATSTLITGDY」(序列編號：5)的胺基酸序列。
表2  重組scFv之VL及VH域的胺基酸序列
域 胺基酸序列 序列編號
VL MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSASNIVLTQSPKSMSMSVGERVTLSCKAS ENVGTYVSWYQQKPKQSPKLLIY GTFNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHC GQSYNYPFTFGSGTKLEIK 6
VH QVQLQQSGAELARPGTSVKMSCKAS GYTFTNYMMHWIKQRPGQGLEWIGY INPSTGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYVQLNILTSEDSAVYYC ATSTLITGDYWGQGTTLTVSSKGQDNSAG 7
* 以粗體標示CDR序列，包含三個位於VL域的CDR (即，由N端到C端依序為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，以及三個位於VH域的CDR (即，由N端到C端依序為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。
以固定化金屬親合層析 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 及粒徑篩析層析法 (size exclusion chromatography, SEC) 來純化重組 scFv
以0.22微米的濾杯過濾後，以10:1的比例混合上清液及結合緩衝液(500 mM Tris-HCl、1.5 M氯化鈉及50 mM咪唑，pH 7.8)。以無菌水及TBA緩衝液(50 mM Tris-HCl、150 mM氯化鈉、0.02%疊氮化鈉，pH7.6)預洗樹脂後，以1:100的比例加至結合緩衝液中的上清液。於4°C規律攪拌至隔日後，以管柱收集樹脂，並以洗滌緩衝液(20 mM Tris-HCl、300 mM氯化鈉及10 mM咪唑，pH7.6)洗滌。利用沖提緩衝液(20 mM Tris-HCl、300 mM氯化鈉及150 mM咪唑，pH7.8)沖提標的蛋白。利用與FPLC系統連接的SUPERDEX™ 75增加柱，將沖提液濃縮至0.5毫升，以進一步於PBS中進行純化。
以免疫細胞化學染色法 (immunocytochemical staining, ICC) 及免疫螢光法 (immunofluorescence assay, IFA) 來確認 重組 scFv
於病毒感染前一天，將Vero細胞種植於96孔洞盤。將PEDV-PT第5代(G2b PEDV)或PEDV-CV777 (G1 PEDV)稀釋於TPA培養液(一種以DMEM為基底的培養液，包含0.3%胰醣磷酸鹽培養基、0.02%酵母萃取物及每毫升10微克的胰蛋白酶)中，以杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, dPBS)洗滌細胞後，將細胞與100微升之每毫升500 TCID 50的PEDV-PT第5代(G2b PEDV)或PEDV-CV777 (G1 PEDV)共同培養。待觀察到CPE後，以80%丙酮固定細胞20分鐘，並風乾30分鐘。以PBS洗滌三次後，利用PBS將純化的scFv稀釋為每毫升5微克，之後加至細胞反應1小時。為驗證分析結果，將僅含有PBS的空白孔洞作為背景對照組。以PBS洗滌三次後，加入1,000倍稀釋之抗-V5抗體反應1小時，以偵測重組scFv上的V5標籤。利用與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)或螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate, FITC)鍵結的山羊-抗-小鼠IgG作為二級抗體，加入培養盤反應1小時。之後，偵測由HRP或FITC鍵結之二級抗體產生的訊號。
以間接 ELISA 分析重組 scFv 對同源 (homogenous) 及異源 (heterogeneous) PEDV 病毒體的結合親和力
以塗佈緩衝液將純化的PEDV-PT及PEDV-CV777病毒體稀釋至每毫升2微克後，分別塗佈於試驗片並放置於4°C至隔日。以200微升的洗滌緩衝液洗滌試驗片6次後，加入300微升的阻斷緩衝液反應1小時。將每毫升20微克的重組scFv連續二倍稀釋至每毫升1.25微克，接著於每孔洞加入100微升的重組scFv，並將試驗片置於室溫反應1小時。以200微升的洗滌緩衝液洗滌6次後，將1,000倍稀釋的抗-V5抗體加至試驗片反應1小時，以偵測scFv上的V5標籤。如上述步驟洗滌6次後，將1,000倍稀釋的山羊-抗-小鼠IgG HRP加至試驗片反應1小時。完全洗滌試驗片後，加入50微升的ABTS ®過氧化酶受質，之後加入50微升的中止溶液來中止呈色步驟。利用微盤讀取器來偵測405奈米波長的訊號。
以免疫沉澱法來分析重組 scFv 對純化 PEDV S 蛋白的結合親和力
建構PEDV (GeneBank序號：HC070225-S)之S蛋白的胞外域(ectodomain) (以下簡稱為「PEDV S蛋白」)後，以HEK293細胞進行表現，之後由細胞培養液純化分泌蛋白。在進行免疫沉澱下拉試驗(immunoprecipitation pull-down assay)時，是將25微微莫耳(pmol)的PEDV S蛋白(同源三聚體的分子量約為700 kDa)與125微微莫耳的scFv (分子量約為30 kDa)混合，置於37°C規律搖晃3小時。以僅加入scFv而無PEDV S蛋白的組別作為負對照組。反應後，利用100 kDa分子量截留離心管柱以11,000 g的轉速過濾混合物5分鐘。丟棄過濾液，並以10個管柱體積的dPBS洗滌管柱(每次洗滌400微升，共洗滌10次)，以移除未結合的scFv。洗滌後將混合物濃縮至100微升，之後以SDS-PAGE進行分析。將13微升的濃縮混合物與2微升的10倍還原劑及5微升的5倍檢體緩衝液混合，於95°C熱變性5分鐘，再以10% SDS-PAGE及考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)染色分析。
以 SEC 評估重組 scFv 與 PEDV S 蛋白之間的結合親和力
利用SEC來評估scFv對PEDV S蛋白的結合親和力。簡單來說，將380微微克的PEDV S蛋白與830微微克的scFv混合後，置於室溫反應1小時。以0.22微米離心管柱過濾混合物後，利用與FPLC系統連接的SUPEROSE ®6 10/300 GL管柱於TBA緩衝液中分離混合物。以280奈米的UV吸光度(UV 280)測量蛋白檢體，其中每餾分(fraction)為0.5毫升。以西方墨點法來分析具有顯著UV 280吸光度的餾分。加入2微升之10倍還原劑及5微升之5倍檢體緩衝液後，於95°C煮沸5分鐘，使蛋白變性。以10% SDS-PAGE分離凝膠分離蛋白檢體後，轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜。加入5%脫脂牛奶反應30分鐘，接著加入1:5,000稀釋之抗-V5標籤抗體於室溫反應1小時。徹底洗滌後，加入1:10,000稀釋之與HRP鍵結的抗-小鼠IgG抗體。反應1小時並充分洗滌後，加入西方墨點法受質，並以顯影系統偵測具有V5標籤表現之蛋白的訊號。
中和試驗
將培養於含有10% FBS及抗生素-抗黴菌劑(antimycotic)之DMEM培養液的Vero細胞種植於96孔洞細胞培養盤，次日達到90%的滿度。以TPA培養液將每毫升25微克的scFv連續二倍稀釋至每毫升0.78微克，之後與每毫升200 TCID 50的PEDV-PT-第5代或PEDV-CV777病毒株混合。以未加入scFv (僅含有稀釋的病毒)及未處理的細胞(正常培養於TPA培養液的細胞)作為實驗對照組。將病毒-抗體混合物置於37°C培養2小時。之後，以200微升的TPA培養液輕輕洗滌Vero細胞二次，將病毒-抗體混合物或對照組分別加至細胞。於培養24、48及72小時後，觀察由PEDV造成的CPE (其預期為合體細胞(syncytial cells))。
實施例 1 確認重組 scFv
利用西方墨點法以抗-V5標籤抗體來確認由EXPI293F™表現的scFv，其中可觀察到高量表現的scFv (結果未顯示)。以IMAC及SEC純化重組scFv (結果未顯示)後，利用SDS-PAGE及考馬斯亮藍進行分析(結果未顯示)。SEC分析顯示某些由重組scFv形成的聚集體(結果未顯示)，收集對應於scFv主沖提峰的餾分以進行後續實驗。
實施例 2 以免疫染色法及 ELISA 分析重組 scFv 對同源及異源 PEDV 病毒體的結合親和力
以ICC及IFA來分析純化scFv對PEDV病毒體的結合親和力。依據材料及方法所述流程，以G1 PEDV (PEDV-CV777，歷史悠久的疫苗株)及G2b PEDV (PEDV-PT第5代病毒株)分別感染Vero細胞，接著加入重組scFv共同培養。結果指出，重組scFv可用以偵測經PEDV感染且具有明顯CPE的細胞，以及周圍散佈的感染細胞(結果未顯示)。即使以相同的病毒量感染細胞，由PEDV-CV777或PEDV-PT病毒株造成的CPE形態仍有很大的差異，其中PEDV-PT會形成小而分散的融合細胞，而PEDV-CV777則會形成巨型融合細胞(結果未顯示)。無論細胞形態為何，本發明scFv皆能辨識G1及G2b病毒(結果未顯示)。
進一步以ELISA來分析本發明scFv對同源及異源PEDV的結合親和力。如材料及方法所述之流程，將PEDV-PT及PEDV-CV777病毒體塗佈於培養盤後，與不同量的重組scFv混合培養。以另一種已知會辨識PEDV的IgG作為本實驗的正對照組，據以計算檢體陽性比值(sample-to-positive ratio, S/P比值)，其定義為： 二種病毒(即，PEDV-PT及PEDV-CV777)的S/P比值皆與scFv的濃度呈正相關性，此結果指出本發明scFv具有交叉反應性(第1圖)。
實施例 3 以下拉試驗及 SEC 來分析重組 scFv 對純化 PEDV S 蛋白的結合親和力
本實施例以結合下拉試驗的免疫沉澱法及SEC分析來確認PEDV S蛋白是否包含可為本發明scFv辨識的表位(epitope)。在進行免疫沉澱試驗時，將純化的三聚體PEDV S醣蛋白(含有一V5標籤及一His 6標籤)與重組scFv共同培養3小時，之後利用 100 kDa分子量截留(molecular weight cut-off, MWCO)離心管柱過濾反應物。在未加入PEDV S蛋白的情況下，對照組中所有scFv皆可通過100 kDa MWCO離心管柱，因此於SDS-PAGE分析結果中未觀察到任何蛋白帶(結果未顯示)。加入PEDV S蛋白在100 kDa MWCO過濾後會保留scFv (結果未顯示)。含有過量scFv之PEDV S蛋白於SEC分析時具有與不含scFv之PEDV S蛋白相似的沖提體積，推測可能是由於與scFv結合時，PEDV S蛋白的分子大小變化相對較小所致(結果未顯示)。為確認進行SEC時，scFv確實會與PEDV S蛋白共同沖提出，以西方墨點法分析對應PEDV S蛋白的沖提餾分。結果確認本發明scFv與PEDV S蛋白之間的結合(結果未顯示)。
實施例 4 中和試驗
利用中和試驗及終點細胞存活試驗來評估scFv對致病性G2b PEDV (PEDV-PT)及G1 PEDV (PEDV-CV777)的中和能力。結果指出，重組scFv可完全阻斷感染，以及PEDV-PT感染之Vero細胞產生CPE，其中每毫升6.25微克的scFv即足以於感染後24小時(24 hpi)阻斷PEDV造成CPE，每毫升12.5微克的scFv即足以於感染後48小時(48 hpi)阻斷PEDV造成CPE，而每毫升25微克的scFv所產生的保護效力更可持續至感染後72小時(72 hpi) (第2圖，表3)。如第2圖結果所示，於感染後72小時，相較於病毒感染對照組產生嚴重的CPE (圖B)，在未經病毒感染的對照組(圖C)以及投予每毫升25微克scFv的組別(圖A)並未觀察到明顯的CPE。未觀察到本發明scFv對PEDV-CV777具有可偵測的中和能力。
表3  重組scFv對G2b PEDV的中和能力
感染後時間(小時) scFv的濃度(微克/毫升) 保護
24 6.25 無CPE
12.5 無CPE
25 無CPE
48 6.25 少量CPE
12.5 無CPE
25 無CPE
72 6.25 CPE
12.5 少量CPE
25 無CPE
總結上述，本揭示內容確認了一種重組scFv，其可辨識G1及G2b PEDV的S蛋白，且對G2b PEDV具有中和活性。基於此結合及中和活性，本發明scFv可用以偵測PEDV感染(例如，G1或G2b PEDV感染)，並用以治療PEDV感染(例如，G2b PEDV感染)。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖是依據本揭示內容實施例2所繪示的線性圖，用以闡述重組scFv與PEDV病毒體(virion)的結合。將PEDV-PT (G2b PEDV)及PEDV-CV777 (G1 PEDV)的病毒體作為抗原塗佈於培養盤後，以連續稀釋的scFv進行偵測。利用酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)來分析結果。將S/P比值繪製為scFv濃度的函數。
第2圖是依據本揭示內容實施例4所繪示的照片，其係關於中和試驗觀察到的細胞病變作用(cytopathic effect, CPE)。將重組scFv與每毫升400 TCID 50的PEDV-PT (G2b PEDV)共同培養2小時後，加至Vero細胞。每24小時觀察一次CPE，據以決定本發明scFv的中和能力。於結束時間點(72小時)拍攝照片。圖A：經病毒感染及投予每毫升25微克之重組scFv的細胞。圖B：經病毒感染而未投予重組scFv處理的細胞，作為感染對照組。圖C：僅投予磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline, PBS)的細胞，即未經病毒感染且未投予重組scFv處理的細胞，作為未感染對照組。黑色線條表示長度為100微米。
無
 
               序列表
          <![CDATA[<110> 中央研究院]]>
          <![CDATA[<120> 重組抗體及其用途]]>
          <![CDATA[<130> P4203-TW]]>
          <![CDATA[<150> US63219363]]>
          <![CDATA[<151> 2021-07-08]]>
          <![CDATA[<160> 12]]>
          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CDR-L1]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Glu Asn Val Gly Thr Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CDR-H1]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Met 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CDR-H2]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Ala Thr Ser Thr Leu Ile Thr Gly Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 132]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_VL域]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ala Ser Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Lys Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Phe Asn Arg Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His 
                      100                 105                 110         
          Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Ile Lys 
              130         
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 125]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_VH域]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Met Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Val Gln Leu Asn Ile Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Ser Thr Leu Ile Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln Asp Asn Ser Ala Gly 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_ISPCR]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          aagcagtggt atcaacgcag ag                                             22
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_mIgK反向引子]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          acattgatgt ctttggggta gaag                                           24
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_mIgL反向引子]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          atcgtacaca ccagtgtggc                                                20
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_mIgHG反向引子]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          gggatccaga gttccaggtc                                                20
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (10)

  1. 一種重組抗體，包含一輕鏈變異(light chain variable, VL)域及一重鏈變異(variable heavy chain, VH)域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(complementarity determining region) (CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)，且該VH域包含一第一重鏈CDR (CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)及一第三重鏈CDR (CDR-H3)，其中 該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含ENVGTY (序列編號：1)、GTF及GQSYNYPFT (序列編號：2)的胺基酸序列；以及 該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含GYTFTNYM (序列編號：3)、INPSTGYT (序列編號：4)及ATSTLITGDY (序列編號：5)的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述之重組抗體，其中該VL域包含與序列編號：6具有至少85%序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：7具有至少85%序列相似度的胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述之重組抗體，其中該VL域包含與序列編號：6具有100%序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：7具有100%序列相似度的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所述之重組抗體，其中該重組抗體為一單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)。
  5. 如請求項4所述之重組抗體，更包含一連接該VL域及該VH域的連接子，其中該連接子包含(GGGGS) 3(序列編號：8)的胺基酸序列。
  6. 一種藉由一個體之生物檢體來診斷該個體是否遭受豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染的方法，包含利用請求項1所述之重組抗體來偵測該生物檢體中是否存在PEDV的棘(spike, S)蛋白，其中S蛋白存在代表該個體遭受PEDV的感染。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該PEDV是基因型1 (G1)或基因型2b (G2b) PEDV。
  8. 如請求項6所述之方法，其中該生物檢體是血液檢體、口腔檢體、腸道檢體、直腸檢體或糞便檢體。
  9. 一種如請求項1所述之重組抗體於製備一藥物的用途，其中該藥物是用以治療一個體之豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染。
  10. 如請求項9所述之用途，其中該PEDV是基因型2b (G2b) PEDV。
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