JP2020518618A - ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む神経疾患または心血管疾患の予防または治療用薬学組成物 - Google Patents

Abstract

ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）およびそのパーキンソン病などの退行性神経疾患および／または心血管疾患の予防および／または治療のための用途が提供される【選択図】図４

Description

ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）およびその神経疾患および／または心血管疾患の予防および／または治療のための用途が提供される。

パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）は、毒性薬物で誘発される散発的要因または遺伝的要因のような多様な因子によって誘発される代表的な神経退行性疾患の一つである。ＰＤ患者は慢性的な進行性神経系破壊による運動障害を有する。このような運動障害は硬直、運動緩慢（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、震え（ｔｒｅｍｏｒ）、および姿勢不安定などの特徴を有し、生活の質を低める要因になるので、ＰＤの効果的な治療はＰＤ患者らにより良い生活の質を提供するという面で非常に重要である。

ＰＤの原因を明らかにするための多くの研究が行われた。例えば、遺伝的研究によれば、ＰＤ患者でＳＮＣＡ、ＰＡＲＫ２、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１などのような特定遺伝子に突然変異が起こると確認された。これら遺伝子は大部分がレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）の主要成分であるアルファ−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）と関連ある。レビー小体が黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ、ＳＮ）で形成されればドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ、ＤＡ）が自殺死するようになる。また、黒質部位のＤＡが慢性的な影響で損傷を受け、活性化された小膠細胞が神経細胞死滅に重要な役割を果たすということが確認された。慢性ＰＤ条件が脳、特に、黒質で誘発される時、ドーパミン神経細胞はサイトカインを信号分子として分泌する。

黒質と線条体（ｃｏｒｐｕｓ ｓｔｒｉａｔｕｍ、ＣＳ）が共に連結されているため、ＳＮ内のＤＡ細胞はドーパミンを生成してＣＳに信号を送る。したがって、ＳＮ領域周辺のＤＡ細胞で細胞自殺死が発生すれば、ＳＮからドーパミンが生成されずＣＳはそれ以上運動に反応する信号を有さなくなり、このような問題が続けば不使用萎縮（ｄｉｓｕｓｅ ａｔｒｏｐｈｙ）による損傷を有するようになる。

多くの研究でＰＤの多様な原因が報告されているが、ＰＤでＣＳ領域が損傷される理由を示す確実な証拠を提示できずにいる。ＰＤの原因を理解するためにＳＮの神経退化が集中的に研究されたが、ＣＳでの神経細胞死滅のメカニズムは依然として明確に確認されていない。

このように、現在まで明らかになったＰＤの原因に対する研究結果が制限的であるため、ＰＤ治療に限界がある。

一方、アルブミンは多機能特性を有する最も豊富な血漿タンパク質であって、肝細胞で主に合成され、間質液（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、リンパ液および脳脊髄液を含む大部分の細胞外液の主な成分である。生体内でアルブミンが減少すれば肝機能低下および栄養状態が不良になるので、臨床学的にアルブミンは重患者および肝硬変患者の血管虚脱（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｌｌａｐｓｅ）を含む危篤状態で広範囲に使用されている。

また、最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ；ＡＧＥ）は、人体内で絶え間なく発生する複合物質であって主に炭水化物と遊離アミノ酸の反応によって発生し、化学的に非常に不安定であり反応性が強い物質であるため神経細胞の死滅を促進させる分子と知られている。また、最終糖化産物は老人や老化した動物の脳で増加すると報告されており、全ての細胞と生体分子に影響を及ぼして老化および老化関連慢性疾患の原因になる。即ち、最終糖化産物は血管透過性増加、酸化窒素妨害による血管拡張抑制、ＬＤＬ酸化、大食細胞または内皮細胞などで様々な種類のサイトカイン分泌、および酸化ストレスを増加させることによって、老化、アルツハイマー病、腎臓疾患、糖尿病、糖尿病性血管合併症、糖尿病性網膜異常および糖尿病性神経異常などのような成人病と関連があると知られている。

前記のように、ＡＧＥは老人や老化した動物の組織で増加すると知られており、大部分の細胞に影響を及ぼして老化および老化関連慢性疾患の原因になると知られているので、細胞の死滅を促進して退行性疾患または虚血性疾患などに影響を及ぼすことがあると多くの研究者らによって提案されてきた。最近、様々な疾患でＡＧＥ−ａｌｂｕｍｉｎがＡＧＥの大部分を占め直接的に疾患を起こす原因と知られ、これを阻害する技術の開発が切実に要求されている。

一例は、ｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を分泌する幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を提供する。一例で、前記ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞は、ｓＲＡＧＥを分泌するヒト幹細胞であってもよい。他の例は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が幹細胞のゲノム内に挿入された、例えば、幹細胞のゲノム中のＡＡＶＳ１などのようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）部位に挿入されたｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を提供する。前記幹細胞は間葉系幹細胞であってもよく、例えば、臍帯血などに由来する間葉系幹細胞であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ；最終糖化産物）−アルブミンの分泌抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、ＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制方法を提供する。前記ＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制は、単核食細胞系細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）内でのＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死（アポトーシス）の抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制方法を提供する。前記ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制は、単核食細胞系細胞内でのＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制であってもよい。

他の例は、有効成分としてｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、神経疾患患者、例えば、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）などのような退行性神経疾患患者での細胞死滅（アポトーシス）阻害用薬学組成物を提供する。前記組成物は、単核食細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）の末梢細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の細胞死滅を阻害するものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記単核食細胞の末梢細胞は神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）であってもよく、前記神経細胞は星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、ニューロン、ドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）、などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、有効成分としてｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、神経疾患の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ）−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅（アポトーシス）抑制、および／または神経疾患の予防および／または治療方法を提供し、前記方法は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅抑制、および／または神経疾患の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含むことができる。前記方法は、前記投与する工程以前に、ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅抑制、および／または退行性神経疾患の予防および／または治療を必要とする対象を確認する工程を追加的に含むことができる。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の（１）ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の阻害、神経疾患患者での細胞死滅阻害、および／または神経疾患の予防および／または治療、または（２）ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の阻害、神経疾患患者での細胞死滅阻害、および／または神経疾患の予防および／または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。

前記神経疾患（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）は、神経系、即ち、脳、脊髄、および／または神経に構造的および／または機能的損傷（障害）、退行、および／または停止が生じた全ての疾患を意味するものであってもよく、例えば、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ＦＴＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ；ＤＬＢ）、皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＤ）などの退行性神経疾患；脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）；アルコール中毒（例えば、アルコール性小脳変性症、アルコール性末梢神経病症など）；脳卒中などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を有効成分として含む、心血管疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の薬学的有効量を心血管疾患の予防または治療を必要とする個体に投与する工程を含む、心血管疾患の予防または治療方法を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の心血管疾患の予防または治療、または心血管疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。

前記心血管疾患は心血管異常で発病する病気であって、全ての虚血性心血管疾患のうちから選択でき、例えば、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、不整脈などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、幹細胞のゲノムにｓＲＡＧＥ遺伝子を導入させる工程を含む、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞の製造方法を提供する。前記幹細胞のゲノムにｓＲＡＧＥ遺伝子を導入させる工程は、エンドヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれをコードする核酸分子）の複合体によって行われるものであってもよい。前記エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＡ Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＲＧＥＮ）であってもよい。

他の例は、前記製造方法によって製造されたｓＲＡＧＥ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、前記ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞の製作に使用するためのエンドヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれをコードする核酸分子）の複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを提供する。

一例は、ｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を分泌する幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を提供する。一例で、前記ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞は、ｓＲＡＧＥを分泌するヒト幹細胞であってもよい。他の例は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が幹細胞のゲノム内に挿入された、例えば、幹細胞のゲノム中のＡＡＶＳ１などのようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）部位に挿入されたｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を提供する。前記幹細胞は間葉系幹細胞であってもよく、例えば、臍帯血などに由来する間葉系幹細胞であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ；最終糖化産物）−アルブミンの分泌抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、ＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制方法を提供する。前記ＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制は、単核食細胞系細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）内でのＡＧＥ−アルブミンの分泌抑制であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死（アポトーシス）の抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制方法を提供する。前記ＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制は、単核食細胞系細胞内でのＡＧＥ−アルブミンによる細胞死の抑制であってもよい。

他の例は、有効成分としてｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、神経疾患患者での細胞死滅（アポトーシス）阻害用薬学組成物を提供する。前記組成物は、単核食細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）の末梢細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の細胞死滅を阻害するものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記単核食細胞の末梢細胞は神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）であってもよく、前記神経疾患患者はパーキンソン病患者であってもよく、前記神経細胞は星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、ニューロン、ドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）、などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、有効成分としてｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を含む、神経疾患の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ）−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅（アポトーシス）抑制、および／または神経疾患の予防および／または治療方法を提供し、前記方法は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物をＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅抑制、および／または神経疾患の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含むことができる。前記方法は、前記投与する工程以前に、ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の抑制、神経疾患患者での細胞死滅抑制、および／または神経疾患の予防および／または治療を必要とする対象を確認する工程を追加的に含むことができる。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の（１）ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の阻害、神経疾患患者での細胞死滅阻害、および／または神経疾患の予防および／または治療、または（２）ＡＧＥ−アルブミンおよび／またはＲＡＧＥの合成および／または分泌の阻害、神経疾患患者での細胞死滅阻害、および／または神経疾患の予防および／または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。

前記神経疾患（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）は神経系、即ち、脳、脊髄、および／または神経に構造的および／または機能的損傷（障害）、退行、および／または停止が生じた全ての疾患を意味するものであってもよく、例えば、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ＦＴＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ；ＤＬＢ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＤ）などの退行性神経疾患；脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）；アルコール中毒（例えば、アルコール性小脳変性症、アルコール性末梢神経病症など）；脳卒中などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物を有効成分として含む、心血管疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の薬学的有効量を心血管疾患の予防または治療を必要とする個体に投与する工程を含む、心血管疾患の予防または治療方法を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞またはｓＲＡＧＥ分泌幹細胞培養物の心血管疾患の予防または治療、または心血管疾患の予防または治療のための薬学組成物の製造に使用するための用途を提供する。

前記心血管疾患は心血管異常で発病する病気であって、全ての虚血性心血管疾患のうちから選択でき、例えば、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、不整脈などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、幹細胞のゲノムにｓＲＡＧＥ遺伝子を導入させる工程を含む、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞の製造方法を提供する。前記幹細胞のゲノムにｓＲＡＧＥ遺伝子を導入させる工程は、エンドヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれをコードする核酸分子）の複合体によって行われるものであってもよい。前記エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＡ Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＲＧＥＮ）であってもよい。

他の例は、前記製造方法によって製造されたｓＲＡＧＥ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、前記ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞の製作に使用するためのエンドヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれをコードする核酸分子）の複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣの同時投与される幹細胞保護用途を提供する（実施例１４および図２１ａおよび２１ｂ参照）。前記幹細胞は、ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣと共に投与される、生体から分離された他の幹細胞であってもよい。より具体的に、ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣを含む幹細胞保護用組成物を提供する。他の例は、分離されたｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣを分離された幹細胞と共培養する工程を含む幹細胞保護方法を提供する。前記共培養は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものであってもよい。他の例は、通常の幹細胞治療剤およびｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣを含む併用投与用組成物を提供する。他の例は、幹細胞治療を必要とする患者に前記幹細胞治療剤とｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣと共に投与する工程を含む、幹細胞治療方法を提供する。前記幹細胞治療剤とｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣは、同時にまたは順序と関係なく順次に投与されてもよい。前記幹細胞保護効果は、ＡＧＥ−アルブミン蓄積による損傷から幹細胞を保護する効果であってもよい。

以下、本発明をより詳しく説明する：
前記患者は、退行性神経疾患および／または心血管疾患を患っているヒト、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物または前記哺乳動物から分離された細胞（脳細胞または、心筋または心血管細胞）または組織（脳組織または心臓組織）またはこれらの培養物のうちから選択でき、例えば、退行性神経疾患および／または心血管疾患を患っているヒトまたはこれから分離された脳細胞、脳組織、心筋または心血管細胞、心臓組織、またはこれらの培養物のうちから選択できる。

本明細書で提供される有効成分であるｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはこれを含む薬学組成物は経口投与または非経口投与の多様な投与経路で投与対象に投与でき、例えば、退行性神経疾患患者の病変部位（例えば、脳、心臓（心筋、心血管など）など）に注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、輸血（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）、挿入（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のような、任意の便利な方式で投与されるか、血管投与（静脈投与または動脈投与）、などの投与経路で投与できるが、これに制限されるのではない。

本明細書で提供される薬学組成物は、通常の方法によって剤形化された、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、または懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液、移植用製剤などの非経口用剤形などに剤形化して使用できる。

本発明の組成物使用量は治療対象の年齢、性別、体重によって異にすることができ、何よりも、治療対象個体の状態、治療対象癌の特定のカテゴリーまたは種類、投与経路、使用される治療剤の属性、および前記特定の治療剤に対する感受性に依存的であり、これを考慮して適切に処方できる。例えば、前記幹細胞は退行性神経疾患患者の体重１ｋｇ当り１×１０^３〜１×１０^９個、例えば、１×１０^４〜１×１０^９個、１×１０^４〜１×１０^８個、１×１０^５〜１×１０^７個または１×１０^５〜１×１０^６個の量で投与できるが、これに制限されるのではない。

前記ｓＲＡＧＥは、ヒト、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類などを含む哺乳動物由来のｓＲＡＧＥであってもよく、一例で、ヒトｓＲＡＧＥタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１１２７．１（遺伝子：ＮＭ＿００１１３６．４）［Ｑ１５１０９−１］、ＮＰ＿００１１９３８５８．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９２９．１）［Ｑ１５１０９−６］、ＮＰ＿００１１９３８６１．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３２．１）［Ｑ１５１０９−７］、ＮＰ＿００１１９３８６３．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３４．１）［Ｑ１５１０９−４］、ＮＰ＿００１１９３８６５．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３６．１）［Ｑ１５１０９−９］、ＮＰ＿００１１９３８６９．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９４０．１）［Ｑ１５１０９−３］、ＮＰ＿００１１９３８８３．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９５４．１）［Ｑ１５１０９−８］、ＮＰ＿００１１９３８９５．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９６６．１）［Ｑ１５１０９−３］、ＮＰ＿７５１９４７．１（遺伝子：ＮＭ＿１７２１９７．２）［Ｑ１５１０９−２］など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記幹細胞は胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を全て包括する意味として使用でき、例えば、前記幹細胞は胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、および前駆細胞からなる群より選択された１種以上であってもよい。

胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は受精卵に由来する幹細胞であって、全ての組織の細胞に分化できる特性を有する幹細胞である。

人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）は逆分化幹細胞とも呼ばれ、分化が終わった体細胞に細胞分化関連遺伝子を注入して分化以前の細胞段階に戻すことによって、胚性幹細胞のように万能性を誘導した細胞を意味する。

前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は幹細胞と同様に特定類型の細胞に分化できる能力を有するが、幹細胞より特異的であり標的化されており、幹細胞とは異なり分裂回数が有限である。前記前駆細胞は間葉系由来の前駆細胞であってもよいが、これに制限されるのではない。本明細書で、前駆細胞は幹細胞範疇に含まれ、特別な言及がない限り‘幹細胞’は前駆細胞も含む概念として解釈される。

成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は臍帯（へその緒）、臍帯血（へその緒血液）または成人の骨髄、血液、神経などから抽出した幹細胞であって、具体的臓器の細胞に分化する直前の原始細胞を意味する。前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。成体幹細胞は、増殖が難しくて容易に分化される傾向が強いが、その代わり様々な種類の成体幹細胞を使用して実際医学で必要とする多様な臓器再生をすることができるだけでなく、移植された後に各臓器の特性に合うように分化できる特性を有していて、難治の病／不治の病の治療に有利に適用できる。

一例で、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）であってもよい。間葉系幹細胞は間葉系基質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）とも呼ばれ、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）などのような多様な形態の細胞に分化できる多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）を意味する。間葉系幹細胞は、胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）、臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、成体筋肉（ａｄｕｌｔ ｍｕｓｃｌｅ）、角膜基質（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ）、乳歯の歯髄（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ）などのような非骨髄組織（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ ｔｉｓｓｕｅｓ）などに由来する多能性細胞の中から選択されたものであってもよい。

前記ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（以下、ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞）は、ヒト由来のｓＲＡＧＥ−分泌間葉系幹細胞（以下、ヒトｓＲＡＧＥ−分泌間葉系幹細胞（ＭＳＣ））、ヒト由来のｓＲＡＧＥ−分泌人工多能性幹細胞（以下、ヒトｓＲＡＧＥ−分泌人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））などからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例で、前記間葉系幹細胞はヒト由来のものであってもよく、例えば、ヒト臍帯間葉系幹細胞または臍帯血間葉系幹細胞であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が幹細胞のゲノムに挿入された幹細胞、例えば間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞であってもよい。

一例で、前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子は、前記幹細胞のゲノム中のセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位に挿入されたものであってもよい。セーフハーバー遺伝子はこの部分のＤＮＡが損傷（切断、および／またはヌクレオチドの欠失、置換、または挿入など）されても細胞損傷を誘発しない安全な遺伝子部位を意味するものであって、例えば、ＡＡＶＳ１（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ；例えば、ヒト染色体１９（１９ｑ１３）に位置するＡＡＶＳ１など）などであってもよいが、これに制限されるのではない。

前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、動物細胞のゲノム内への遺伝子導入に通常使用される全ての遺伝子操作技術を通じて行うことができる。一例で、前記遺伝子操作技術は、標的特異的ヌクレアーゼを使用するものであってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、先に説明したようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位を標的にするものであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝子はさみ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）とも呼ばれ、目的とするゲノムＤＮＡ上の特定位置を認識して切断（単一鎖切断または二重鎖切断）することができる全ての形態のヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）をひっくるめて称する。前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法で非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、真核細胞の核内伝達のために通常使用される要素（例えば、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）など）を追加的に含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記標的特異的ヌクレアーゼは精製されたタンパク質形態で使用されるか、これをコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含む組換えベクターの形態で使用できる。

例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、
ゲノム上の特定標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来したＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断ドメインが融合されたＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）；
微生物免疫機構であるＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１、など）；
ＡＧＯホモログ（Ａｇｏ ｈｏｍｏｌｏｇ、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）
などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、原核細胞、および／またはヒト細胞をはじめとする動植物細胞（例えば、真核細胞）のゲノムで特定塩基配列を認識して二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を起こすことができる。前記二重鎖切断はＤＮＡの二重鎖を切断して、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）または粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生成させることができる。ＤＳＢは細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構によって効率的に修復でき、この過程に所望の変異を標的位置に導入することができる。

前記メガヌクレアーゼは、これに制限されるのではないが、自然発生メガヌクレアーゼであってもよく、これらは１５〜４０個の塩基対の切断部位を認識し、これは通常４個のファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリー。例示的なメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。

自然発生メガヌクレアーゼ、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに由来するＤＮＡ結合ドメインを用いて植物、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物細胞およびマウスで位置特異的ゲノム変形が促進されたが、このような接近法はメガヌクレアーゼ標的配列が保存された相同性遺伝子の変形（Ｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）であって、標的配列が導入される事前操作されたゲノムの変形には限界があった。したがって、医学的にも生命工学的にも関連する部位で新規な結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みがあった。また、メガヌクレアーゼに由来する自然発生されたまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインが異種性ヌクレアーゼ（例、ＦｏｋＩ）に由来する切断ドメインに作動可能に連結された。

前記ＺＦＮは、選択された遺伝子、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインの標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質を含む。前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含む人工的な制限酵素であってもよい。ここで、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されたものであってもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６が本明細書参考資料として含まれ得る。自然発生されたジンクフィンガータンパク質と比較して、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは新規な結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計および多様なタイプの選択を含むが、これに限定されない。合理的設計は、例えば三重（または四重）ヌクレオチド配列、および個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの利用を含み、この時、各三重または四重ヌクレオチド配列は特定三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの一つ以上の配列と連合される。

標的配列の選択、融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構成は当業者に公知されており、参考資料として米国特許出願公開２００５／００６４４７４および２００６／０１８８９８７の全文に詳しく説明され、前記公開特許の全文が本発明の参考資料として本明細書に含まれる。また、このような参考文献および当業界の他の文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／または多重フィンガージンクフィンガータンパク質が任意の適切なリンカー配列、例えば５個以上のアミノ酸長さのリンカーを含むリンカーによって共に連結できる。６個以上のアミノ酸長さのリンカー配列の例は米国登録特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；７，１５３，９４９を参照する。ここに説明されたタンパク質はタンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。

また、ＺＦＮのようなヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性部分（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含む。周知の通り、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼやエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来できる例示的なエンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。

同様に、切断ハーフドメインは、前記提示されたように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはそれの一部に由来できる。融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、一般に２個の融合タンパク質が切断に必要である。代案として、２個の切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が用いられてもよい。２個の切断ハーフドメインは同一なエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来することも可能であり、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来することも可能である。また、２個の融合タンパク質の標的部位は、２個の融合タンパク質とその各標的部位の結合によって切断ハーフドメインが互いに対して空間的に配向されて位置することによって、切断ハーフドメインが、例えば二量体化によって機能性切断ドメインを形成することができるようにする関係で配置されるのが好ましい。したがって、一実施形態で、３〜８個のヌクレオチドまたは１４〜１８個のヌクレオチドによって標的部位の隣接の縁が分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２個の標的部位の間に介されてもよい（例、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合して（標的部位で）、直ちに結合部位やその近所でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ）は認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドで、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドでＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。したがって、一実施形態で、融合タンパク質は少なくとも１個のＴｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と一つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメイン（操作されてもよく、そうでなくてもよい）を含む。

“ＴＡＬＥＮ”は、ＤＮＡのターゲット領域を認識および切断することができるヌクレアーゼを示す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥドメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を示す。本発明で、“ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ”および“ＴＡＬＥＮ”という用語は互換が可能である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）バクテリアが多様な植物種に感染する時にこれらのタイプＩＩＩ分泌システムを通じて分泌されるタンパク質として知られている。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列と結合してバクテリア感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の多様な数のアミノ酸反復で構成された中心反復ドメインを通じて植物ＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥは、ゲノムエンジニアリングのツールのための新規プラットフォームになり得るとされる。但し、ゲノム編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するために次のように現在まで知られなかった少数の主要媒介変数が定義されなければならない。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン、ｉｉ）一つのターゲット領域を構成する２個の半分−位置の間のスペーサの長さ、およびｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリンカーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）。

本発明のＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ反復モジュールを通じて配列特異的方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを指す。前記ＴＡＬＥドメインは少なくとも一つのＴＡＬＥ反復モジュール、より具体的には１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含むが、これに限定されない。本発明で、“ＴＡＬエフェクタードメイン”および“ＴＡＬＥドメイン”という用語は互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの半分を含むことができる。前記ＴＡＬＥＮに関連して国際公開特許ＷＯ／２０１２／０９３８３３号または米国公開特許２０１３−０２１７１３１号に開示された内容全文が本明細書に参考資料として含まれる。

一例で、前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、標的特異的ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ）を使用して行うことができる。前記標的特異的ヌクレアーゼは、
（１）ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（またはそのコーディングＤＮＡ、または前記コーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および
（２）標的遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）位置）の標的部位（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子内の連続する１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２個のヌクレオチド長さの核酸部位）とハイブリダイズ可能な（または相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡ（またはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）
を含むものであってもよい。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識しヌクレオチド切断活性を有し標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができる全てのヌクレアーゼより選択された１種以上であってもよい。

一具体例で、前記標的特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９））、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）などのようなタイプＩＩおよび／またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。この場合、前記標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡを追加的に含む。前記ガイドＲＮＡは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、例えば、オリゴヌクレオチド二重鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。前記標的特異的ヌクレアーゼは、生体（細胞）外でまたは生体（細胞）内伝達後、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸−タンパク質複合体を形成（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形態で作用できる。

Ｃａｓタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。

Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、
ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））；
カンピロバクター属、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）またはストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質；
フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質
などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

一例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＧＧ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２０ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）は任意に包含可能な配列を意味する）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

Ｃｐｆ１タンパク質は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新たなＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さくてｔｒａｃｒＲＮＡが必要なく、単一ガイドＲＮＡによって作用できる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を認識しＤＮＡの二重鎖を切断して粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生成する。

例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダツスメタノプラズマ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであってもよく、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであってもよいが、これに制限されるのではない。

エンドヌクレアーゼとしてＣｐｆ１タンパク質が使用される場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＴＴＮ−３’（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＴＴＮ−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で使用できる。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）によって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＡＮは、多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させて標的特異的ヌクレアーゼを生産（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコーディングするコドンのうちから前記有機体に発現するに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであってもよい。

本明細書で使用された前記標的特異的ヌクレアーゼは、変異された形態の変異標的特異的ヌクレアーゼであってもよい。前記変異標的特異的ヌクレアーゼはＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味することができ、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼのうちから選択された１種以上であってもよい。このような標的特異的ヌクレアーゼの変異（例えば、アミノ酸置換など）は、少なくともヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こるものであってもよい。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）；配列番号４）である場合、前記変異は、触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；例えば、配列番号４の場合、１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、配列番号４の７６２番目位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群より選択された一つ以上任意の他のアミノ酸で置換された突然変異を含むことができる。この時、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

他の例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するように変異されたものであってもよい。例えば、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の１１３５番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、および１３３７番目位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうちの一つ以上、例えば、３個が全て他のアミノ酸で置換されて、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と異なるＮＧＡ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣのうちから選択された任意の塩基である）を認識するように変異されたものであってもよい。

一例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）中、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、またはＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；または
（３）（１）と（２）残基全て
でアミノ酸置換が起こったものであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、ライシン、前記アミノ酸の公知された全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元来変異位置に有するアミノ酸を除いたアミノ酸の中から選択されたアミノ酸を意味する。一例で、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、バリン、グルタミン、またはアルギニンであってもよい。

本発明で、用語“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）”は、標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）にハイブリダイズ可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または細胞）内でＣａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（または標的部位）に導く役割を果たす。

前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列とハイブリダイズ可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；および
前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位およびヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）
からなる群より選択された１種以上であってもよく、
具体的に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これをＳｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどとも命名する）およびＣａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことができる。より具体的に、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのｈａｉｒｐｉｎ構造、およびＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列を含むことができる。前述の構造は５’から３’の順に順次に存在するものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分および標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、いかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用できる。

例えば、Ｃａｓ９タンパク質は標的遺伝子編集のために二つのガイドＲＮＡ、即ち、標的遺伝子の標的部位とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質と相互作用するｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する）を必要とし、これらｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体形態、またはリンカーを通じて連結されて単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）形態で使用できる。一例で、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは少なくとも前記ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ一部または全部と前記Ｃａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９タンパク質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡ一部または全部がヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、ヌクレオチドリンカーがループ構造に該当するものであり得る）。

前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアップストリーム部位、具体的にｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上、例えば、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例で、前記ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むものであってもよく、複合体を形成するＣｐｆ１タンパク質種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

前記ガイドＲＮＡの具体的配列はヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）の種類（即ち、由来微生物）によって適切に選択することができ、これはこの発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に分かる事項である。

一例で、標的特異的ヌクレアーゼとしてストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは次の一般式１で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘ_ｃａｓ９）_ｍ−３’（一般式１）
上記一般式１で、
Ｎ_ｃａｓ９は標的化配列、即ち、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）の配列によって決定される部位（標的部位の標的配列とハイブリダイズ可能）であり、ｌは前記標的化配列に含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２の整数、例えば２０であってもよく、
前記標的化配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）（配列番号１）を含む部位はｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｘ_ｃａｓ９はｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（即ち、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｍは８〜１２の整数、例えば、１１であってもよく、前記ｍ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、それぞれ独立してＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群より選択できる。

一例で、前記Ｘ_ｃａｓ９はＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）を含むことができるが、これに制限されない。

また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、次の一般式２で表現できる：
５’−（Ｙ_ｃａｓ９）_ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）
上記一般式２で、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）（配列番号３）で表された部位は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｙ_ｃａｓ９は前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｐは６〜２０の整数、例えば、８〜１９の整数であってもよく、前記ｐ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

また、ｓｇＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個ヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分がオリゴヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に該当する）。より具体的に、前記ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分が互いに結合された二重鎖ＲＮＡ分子で、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを通じて連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。

一例で、ｓｇＲＮＡは、次の一般式３で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）
上記一般式３で、（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌは標的化配列であって、先に一般式１で説明したとおりである。

前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは３〜５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであってもよく、前記ヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含むことができる。

前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の５’に隣接して位置する約１７個〜約２３個または約１８個〜約２２個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列とハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

他の例で、標的特異的ヌクレアーゼがＣｐｆ１システムである場合、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は次の一般式４で表現できる：
５’−ｎ１−ｎ２−Ａ−Ｕ−ｎ３−Ｕ−Ｃ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｕ−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−Ｇ−Ｕ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ−（Ｎｃｐｆ１）ｑ−３’（一般式４）。

上記一般式４で、
ｎ１は存在しないか、Ｕ、Ａ、またはＧであり、ｎ２はＡまたはＧであり、ｎ３はＵ、Ａ、またはＣであり、ｎ４は存在しないかＧ、Ｃ、またはＡであり、ｎ５はＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、または存在せず、ｎ６はＵ、ＧまたはＣであり、ｎ７はＵまたはＧであり、
Ｎｃｐｆ１は遺伝子標的部位とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むターゲッティング配列であって標的遺伝子の標的配列によって決定され、ｑは含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０の整数であってもよい。前記標的遺伝子の標的配列（ｃｒＲＮＡとハイブリダイズする配列）はＰＡＭ配列（５’−ＴＴＮ−３’または５’−ＴＴＴＮ−３’；Ｎは任意のヌクレオチドであって、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの塩基を有するヌクレオチドである）の３’方向に隣接して位置する（例えば、連続する）１５〜３０個の標的遺伝子の標的部位のヌクレオチド配列である。

前記一般式４で、５’末端からカウンティングして６番目から１０番目までの５個のヌクレオチド（５’末端ステム部位）と１５番目（ｎ４が存在する場合、１６番目）から１９番目（ｎ４が存在する場合、２０番目）までの５個ヌクレオチド（３’末端ステム部位）は互いに逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）なように相補的ヌクレオチドからなって二重鎖構造（ステム構造）を形成し、前記５’末端ステム部位と３’末端ステム部位の間の３〜５個ヌクレオチドがループ構造を形成することができる。

前記Ｃｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ（例えば、一般式４で表現される）は、５’末端に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

Ｃｐｆ１由来微生物によって使用可能なＣｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ配列の５’末端部位配列（ターゲッティング配列部位除いた部分）を表１に例示的に記載した：

本明細書で、遺伝子標的部位とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、遺伝子標的部位のヌクレオチド配列（標的配列）と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味する（以下、特別な言及がない限り、同一な意味として使用され、前記配列相同性は通常の配列比較手段（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して確認できる）。

前記方法で、前記ガイドＲＮＡとＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の細胞内への形質導入は、前記ガイドＲＮＡとＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼを通常の方法（例えば、電気穿孔など）で直接細胞に導入するか、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子とＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（またはこれと８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の塩基配列相同性を有する遺伝子）を一つのベクターまたはそれぞれ別個のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）に含まれている状態で細胞に導入するか、ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙを通じて行うことができる。

一例で、前記ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶ））、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）のような陰性鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（例えば、狂犬病および小胞性口炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹およびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）およびピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）のような陽性鎖ＲＮＡウイルス、およびヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１および２、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）−バー（Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、アデノウイルスを含む二重鎖のＤＮＡウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、牛痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）およびカナリア痘瘡（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））などからなる群より選択されたものであってもよい。

前記Ｃａｓ９タンパク質コード核酸分子、ガイドＲＮＡコード核酸分子、またはこれらのうちの一つ以上を含むベクターは、それぞれ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、ウィルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）だけでなくＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法など当業界に公知された多様な方法を使用して細胞内に伝達でき、細胞の核内伝達のために、前記Ｃａｓ９タンパク質および／またはガイドＲＮＡは適切な核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を追加的に含むことができる。

本明細書に使用された標的部位の“切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）”は、ポリヌクレオチドのｃｏｖａｌｅｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅの破損（ｂｒｅａｋａｇｅ）を意味する。切断はホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これに制限されず、以外の多様な多様な方法によって行うことができる。単一鎖の切断および二重鎖の切断が全て可能であり、二重鎖の切断は二つの区別される（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）単一鎖の切断の結果として発生できる。二重鎖の切断は、ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｓまたはｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄを生成することができる。

パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）は神経系の進行性退行性疾患であり、神経細胞死滅に関するメカニズムはよく知られていない。本明細書ではＰＤでの神経細胞死滅のメカニズムを明らかにして、ＰＤ動物モデルでｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（例えば、ヒト臍帯血由来幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｈＵＣＢ−ＭＳＣｓ））が神経細胞死滅および行動障害回復に対して効果を有するのを確認した。本明細書で提供される一実施形態で、ｓＲＡＧＥを分泌するｈＵＣＢ−ＭＳＣｓをロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）によって誘導されたＰＤ動物モデルの線条体（Ｃｏｒｐｕｓ ｓｔｒｉａｔｕｍ）に移植した後、行動検査、形態学的分析、および免疫組織化学的実験を通じて神経細胞死滅減少および運動回復効果を確認して本発明を完成した。このような結果はｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のＰＤを含む神経退行性疾患に対する症状緩和（改善）、進行抑制、および／または治療効果を提案するのである。ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞はｓＲＡＧＥの持続的な分泌による効果と、これに加えて幹細胞（例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣ）自体の脳領域（例えば、線条体領域）での神経細胞死滅抑制（神経細胞保護）効果が互いに上昇作用を示して、より優れた神経退行性疾患治療効果を得ることができる。

ｓＲＡＧＥは、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を除いてＲＡＧＥと同一なタンパク質の可溶性形態である。ｓＲＡＧＥの活性部位はＲＡＧＥと同一であるため、ｓＲＡＧＥはＡＧＥまたはＳ１００などのような特定リガンドに結合することができ、標的細胞でのリガンドとの結合においてＲＡＧＥと競争することができる。

ＡＧＥ−ＲＡＧＥ関連性
多くの文献で、ＲＡＧＥのリガンドが標的細胞のＲＡＧＥに結合すればａｐｏｐｔｏｓｉｓ状態になって細胞死滅が行われるという報告がある。ＡＧＥ−アルブミンがＲＡＧＥと結合すればＲＡＧＥが活性化され細胞死滅に関連する遺伝子発現が増加する。これは脳だけでなく他の臓器でも起こる。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合は、多様な細胞類型で細胞死滅に決定的原因になる。したがって、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合を防止して細胞を細胞死滅から保護することができる。

ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣの製作
ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣ、ｉＰＳＣなど）は、多くの長所を有する。ｓＲＡＧＥタンパク質が細胞で分泌される場合、その分泌水準が持続的に維持され、注入部位の正常組換えタンパク質と比較して持続期間が長くなる。また、このようにｓＲＡＧＥタンパク質を分泌する細胞として幹細胞を採用する場合、分泌されたｓＲＡＧＥは注入部の周辺部位で幹細胞と共に上昇効果を発揮してより多い利点を示すことができる。したがって、幹細胞はｓＲＡＧＥ分泌細胞に適用するに最も適した候補細胞の一つである。

一具体例で、ＰＤ治療のために、ｓＲＡＧＥ分泌する幹細胞はｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣまたはｉＰＳＣなどであってもよく、この場合、ｓＲＡＧＥ分泌水準が最も高い、ｓＲＡＧＥコード遺伝子としてトランスフェクション後一番目継代（ｐａｓｓａｇｅ）のＵＣＢ−ＭＳＣまたはｉＰＳＣなどを使用することができるが、これに制限されるのではない。

Ｔｈｅ ＡＧＥ−ＲＡＧＥ関連性；アルツハイマー病（ＡＤ）、アルコール中毒、およびＰＤ
ＰＤ動物モデルはＣＳ領域で高いＡＧＥ形成水準を示し、このような高いＡＧＥ形成はＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合による細胞死滅を誘発することができる。本明細書では、ｓＲＡＧＥまたはｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ（またはｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣ）を処理した動物モデルの行動試験（ｒｏｔａｒｏｄおよびｔｈｅ ｐｏｌｅ ｔｅｓｔｓ）で回復結果を確認した。特に、ｓＲＡＧＥまたはｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ投与群でＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合遮断効果が優れ、これによってｓＲＡＧＥまたはｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣは細胞自殺死から神経細胞を保護する効果を有すると確認された。特に、ｓＲＡＧＥまたはｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣを投与したＰＤ動物モデルのＣＳおよびＳＮ領域での神経細胞の数が対照群ＰＤ動物モデル（ｓＲＡＧＥまたはｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ非投与群）より多いのを確認して、神経細胞自殺死に対する保護効果を確認した。

神経細胞死滅に対する保護効果の基礎になるメカニズム
マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）
マイトジェン−活性タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）は真核生物のみで発見されるタンパク質キナーゼであって、基本状態である不活性状態に維持されていて、活性化する必要がある時、活性化ループでリン酸化される。ＰＤ背後の主要信号経路を確認するために次のような典型的なＭＡＰＫを観察した：ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ｐ３８およびこれらのリン酸化された形態。観察の結果、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２およびＪＮＫタンパク質は細胞死滅メカニズムに寄与すると確認され、したがって、これらタンパク質はＰＤ進行経路に関与すると推定することができる。

Ｂａｘ
ＡＧＥ−ＲＡＧＥ依存経路に対するｓＲＡＧＥの効果を試験するために、Ｂａｘを観察した。細胞にＡＧＥ−アルブミンを処理時、Ｂａｘの発現が増加した。しかし、ｓＲＡＧＥがＡＧＥ−アルブミンと共に処理された場合、Ｂａｘの発現水準は若干減少し、これはｓＲＡＧＥがＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合を遮断することによって細胞を細胞死滅（アポトーシス）から保護するのを意味する。

一方、ｓＲＡＧＥタンパク質は、体内半減期があるためパーキンソン病の治療に限界を有する。このような問題を克服するために、本発明ではｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣまたはｉＰＳＣなど）を使用して持続的な分泌が可能であるようにする。

トランスフェクションされたＵＣＢ−ＭＳＣからのｓＲＡＧＥ分泌水準は一番目継代で最も高く示され、それ以後継代で多少減少する傾向を示した。ＰＤ動物モデルでの細胞移植は定位手術（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ）によって行われた。ＰＤ動物モデルの行動能力はロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）およびポールテスト（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）で試験した。このような行動能力試験の結果、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞投与群で未投与ＰＤ群と比較して運動能力が有意に改善されたのを確認した。また、組織学的分析の結果、ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞が線条体の線条細胞の細胞死に対する保護効果を有するのを確認した。

このような保護活性に関連するメカニズムを確認するために、ＰＤの主要信号伝達経路でタンパク質発現水準を観察した。特に、ＭＡＰＫタンパク質とそのリン酸化された形態の発現水準を観察した。その結果、神経細胞死滅の主要経路がＭＡＰＫ経路中のｐ３８、Ｅｒｋ１／２、およびＪＮＫに関連することが明らかになった。

また、本発明による心筋または筋肉細胞死誘導阻害は単核食細胞系細胞内でＡＧＥ−アルブミンの合成または分泌を阻害して単核食細胞系細胞周辺にある細胞の細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）誘導を阻害することを特徴とする。

前記細胞死は、大きく壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に分けられる。壊死は、火傷、打撲、毒劇物などの刺激によって起こる細胞の死であって、一名細胞の事故死と言える。壊死の場合には細胞外から水分が流入することによって細胞が膨張して破壊される。従来は、細胞の死を全て壊死と考えた。しかし、最近、３０年余りの間に細胞には自発的な死を起こす誘発因子があるという事実が知られた。遺伝子に制御されるこのような能動的な細胞の死がアポトーシスである。壊死が長時間にかけて無秩序に起こるのに反して、アポトーシスは短時間に秩序正しく起こる。アポトーシスは細胞が縮小されながら始まる。その後、隣接する細胞の間にスキ間が生じ、細胞内ではＤＮＡが規則的に切断されて断片化される。最後に細胞全体も断片化されてアポトーシス小体になった後、近くにある細胞に貪食されることによって死に至るようになる。アポトーシスは、発生過程で身体の形態作りを担当し、成体では正常的な細胞を更新するか異常が生じた細胞を除去することを担当している。動物の体内で起こる発生、分化の過程で遺伝的なプログラムによって起こる細胞死を予定された細胞死（ＰＣＤ；ｐｒｏｇｒａｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）という。予定された細胞死は、発生のある段階で致死遺伝子が動き始めてその細胞が死んだ場合などである。人の場合には、胎児の初期に手や足は杓文字形状をしていて足指や手指の間が離れておらず、後期にその間に該当する部分にあった細胞が予定された細胞死段階を経ることによって手指や足指の形態が生じる。退行性疾患は、前記２種類形態の細胞を伴うと知られている。

前記細胞死は、細胞は単核食細胞系細胞の周辺にある細胞が好ましく、前記単核食細胞系細胞の周辺にある細胞は心筋細胞などを含むが、これに限定されない。

前記ＡＧＥ−アルブミンの合成阻害または分泌阻害は、アルブミンｓｉＲＮＡ、アルブミン抗体、ＡＧＥ抗体、ＡＧＥ−アルブミン抗体およびＡＧＥ−アルブミン合成阻害剤からなる群より選択された１種を用いて阻害できる。

本発明は、抗体の一種類であるｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＡＧＥ）が持続的に分泌されて、ＡＧＥ−アルブミンの毒性機能を阻害させることができるｓＲＡＧＥ分泌幹細胞を製作し、これを用いて心筋または筋肉細胞の死滅を予防し心筋梗塞などの心血管疾患を治療することを特徴とする。

慢性状態が持続される時、ＣＳでのＡＧＥ−ＲＡＧＥ依存的細胞死滅がＰＤの神経退化に寄与する。ｓＲＡＧＥはＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合を防止して神経細胞の細胞死滅を防止する。したがって、本発明で提供されるｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞は、ＰＤなどの退行性神経疾患に対する非常に有効な治療方法の一つであり得る。

また、ＡＧＥ−アルブミンは心筋梗塞または下肢虚血モデルの大食細胞で合成および分泌され、ＡＧＥ−アルブミンの合成および分泌が酸化的ストレスによるものであり、細胞死を誘導する。したがって、本発明のｓＲＡＧＥ分泌幹細胞は、心筋梗塞、下肢虚血などの心血管疾患の予防および治療に有用に使用することができる。

ｐＺＤｏｎｏｒ−ＡＡＶＳ１ピューロマイシンベクターの開裂地図（Ａ）およびｓＲＡＧＥコーディング配列の挿入状態を例示的に示す模式図（Ｂ）である。 標的遺伝子トランスフェクションとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを用いた遺伝子挿入メカニズムを示す模式図である。 ＵＣＢ−ＭＳＣからのｓＲＡＧＥタンパク質分泌を確認したウェスタンブロッティング分析結果であって、ＡはｓＲＡＧＥ（Ｆｌａｇで標識される）でトランスフェクションされたＵＣＢ−ＭＳＣ細胞株の馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を回収してＦｌａｇ抗体で確認した結果であり、ＢはＡで測定された強度をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅで定量した結果を示すグラフである。 対照群（正常未処理群）、ＰＤ群（未処理ＰＤ動物モデル）、ｓＲＡＧＥ処理群（ｓＲＡＧＥ処理されたＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ処理群（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）に対して、動物行動を試験するためのＲｏｔａｒｏｄテストで測定した維持時間（ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｍｅ、単位：秒）結果を示す（ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ−ｔｅｓｔ（ｐ＜０．０５））。 対照群（正常未処理群）、ＰＤ（未処理ＰＤ動物モデル）、ｓＲＡＧＥ処理群（ｓＲＡＧＥ処理されたＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ処理群（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）に対して、動物行動を試験するためのｐｏｌｅ ｔｅｓｔで測定した維持時間（ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｍｅ、単位：秒）結果を示す（ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ−ｔｅｓｔ（ｐ＜０．０５））。 Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色によって対照群（正常未処理群）、ＰＤ群（未処理ＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ処理群（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）のＳＮ領域での神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ変化を示すものであって、ＡはＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色結果を示すイメージであり（Ｂａｒ＝１００ｕｍ）、Ｂはｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅで計数された神経細胞の個数を示すグラフである。 Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色によって対照群（正常未処理群）、ＰＤ群（未処理ＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ処理群（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）のＣＳ領域での神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ変化を示すものであって、ＡはＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色結果を示すイメージであり（Ｂａｒ＝１００ｕｍ）、Ｂはｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅで計数された神経細胞の個数を示すグラフである。 対照群（正常未処理群）、ＰＤ（未処理ＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）の線状体（Ｓｔｒｉａｔｕｍ）でのＡＧＥ（ｇｒｅｅｎ）およびＩｂａ−１（ｒｅｄ、ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）の二重免疫染色によってＡＧＥおよび活性化された小膠細胞の分布を示す蛍光イメージであって、ＡＧＥおよび活性化された小膠細胞の共局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示し、併合されたイメージはＡＧＥおよびＩｂａ１が主にＰＤ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ）の線状体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）領域に位置するのを示す（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：Ｗｈｉｔｅ＝５０ｕｍ、Ｙｅｌｌｏｗ＝２０ｕｍ）。 ＨＴ２２細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）にＡＧＥ−アルブミン処理群（ＡＡ）、ＡＧＥ−アルブミン／ｓＲＡＧＥ同時処理群（ＡＡ−ｓＲＡＧＥ）、および未処理群（対照群）の細胞生存率をＭＴＴ分析で測定した結果を示す結果であって、ｓＲＡＧＥ処理によってＡＧＥ−アルブミン結合が阻害されるのを示す（細胞の生存率は対照群の結果を１００％にした相対値で示す；ＭＴＴ分析は５７０ｎｍ波長で行われた）。 対照群（正常未処理群）、ＰＤ群（未処理ＰＤ動物モデル）、ｓＲＡＧＥ処理群（ｓＲＡＧＥ処理されたＰＤ動物モデル）、およびｓＲＡＧＥ ＵＣＢ−ＭＳＣ処理群（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理されたＰＤ動物モデル）のＣＳ領域から収集されたＭＡＰＫタンパク質の水準をウェスタンブロッティングで分析した結果を示す（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ベータ−アクチン）。 心筋梗塞動物ラットモデルで大食細胞の増加と心筋細胞の死滅が同時に増加するのを確認した結果を示すものであって、１ａは大食細胞増加を示す写真（上）とこれを定量化したグラフ（下）であり、１ｂは心筋細胞の死滅程度を示す写真（上）とこれを定量化したグラフ（下）である。 図１１ａの続きである。 心筋梗塞動物ラットモデルの心臓組織で大食細胞の周辺でＡＧＥ−アルブミンの合成および分泌量の変化を抗体を用いて免疫組織化学染色を施行した後に確認した結果である。 ヒト大食細胞でＡＧＥ−アルブミンの合成と分泌が低酸素環境の刺激を受けて増加するのをＥＬＩＳＡを通じて確認した図である。 一次ヒト心筋細胞でＡＧＥ−アルブミンを投与した後、その受容体であるＲＡＧＥの増加を確認し、ここにｓＲＡＧＥを同時に投与した時にＲＡＧＥが減少するのを示す蛍光イメージである。 免疫ブロッティング結果であり、この時、ＭＡＰＫ信号伝達系の中のｐＳＡＰＫ／ＪＮＫとｐ３８の反応が関与するのを示すグラフである。 図１４ｂの続きである。 ｓＲＡＧＥ分泌間葉系幹細胞を作るためのベクター構成図である。 ｓＲＡＧＥ分泌間葉系幹細胞のｓＲＡＧＥの分泌をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡで確認した結果である。 蛍光染色結果を示す蛍光イメージである。 ｓＲＡＧＥ分泌細胞製作用ベクターを伝達するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを製作してＪｕｒｋａｔ細胞で移入率の増加を確認した結果を示す。 心筋梗塞モデルと心筋梗塞モデルにｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを共に処理したラットの心臓組織で線維化程度を確認する染色を施行した後に観察した結果を示した図である。 下肢虚血モデルで、筋肉細胞でＲＡＧＥが増加し細胞死が増加するのを確認し、ｓＲＡＧＥを投与後、回復を確認した結果を示す。 下肢虚血モデルで、筋肉細胞でＲＡＧＥが増加し細胞死が増加するのを確認し、ｓＲＡＧＥを投与後、回復を確認した結果を示す。 ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣの特性を示すものであって、図１９ａはｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣの製作に使用された発現ベクターを模式的に示し、図１９ｂはｓＲＡＧＥコード遺伝子挿入されたｐＺＤｏｎｏｒ−ＡＡＶＳ１ベクターでトランスフェクションされたｉＰＳＣのＰＣＲ結果を示す電気泳動イメージであり、図１９ｃはｓＲＡＧＥの発現および分泌水準をウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで確認した結果である。 図１９ａの続きである。 図１９ｂの続きである。 ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣ（ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ）の急性心筋梗塞に対する保護効果を示すものであって、２０ａはＭａｓｓｏｎ’ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色結果を可視化した結果であり、２０ｂはＬＶ断面積での線維化領域およびｉｎｆａｒｃｔｅｄ壁厚さの百分率を計算した結果を示し（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１）、２０ｃはＧＦＰ、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ１またはｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ処理された心臓組織でのＲＡＧＥ発現を免疫組織化学的方法で測定した結果を示す蛍光イメージである。 図２０ａの続きである。 図２０ｂの続きである。 ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣの幹細胞保護効果を示すものであって、２１ａはＡＧＥ−ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＡ）およびｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣの共培養後のＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）変化を示す結果であり、２１ｂはＰＢＳ処理、ＡＡ処理、およびＡＧＥ−ａｌｂｕｍｉｎ処理後、ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣの幹細胞と共培養されたｉＰＳＣｓでのＲＡＧＥ発現水準をウェスタンブロッティングで確認した結果である。 図２１ａの続きである。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明しようとするが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。

［退行性神経疾患（パーキンソン病）に対する効果］
参考例
１．ＰＤマウスモデルの製作
動物実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０〜２２ｇｍ）を使用して行った。８週齢の雄マウスを無作為に分けて食べ物と水を自由に摂取することができるようにして１２時間の明周期／暗周期の温度−調節環境下で各ケージ当り５匹ずつ飼育した。本明細書で行われた全ての動物実験は、ＣＡＣＵ動物センター倫理委員会の承認を受けて行った。適したＰＤモデルを確立するために、二カ月間０．５％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）に懸濁させたｒｏｔｅｎｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を３０ｍｇ／ｋｇの量で１日１回経口投与した。マウスの体重は毎週モニタリングした。

２．幹細胞培養
ＰＤ動物モデルに処理される幹細胞として臍帯血由来間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ、Ｍｅｄｉ−ｐｏｓｔ）を選択した。ＵＣＢ−ＭＳＣを１０％（ｗ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ^（Ｒ） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）および１％（ｗ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたアルファ−ＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ^（Ｒ） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）で育てた。この細胞を５％ ＣＯ_２、および加湿大気条件下の３７℃に維持させた。ＵＣＢ−ＭＳＣ培養のために１００ｍｍ^２ディッシュを使用し、細胞を８０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅに移した。細胞をＴｒｙｐｓｉｎ ＥＴＤＡ（Ｔｙｐｓｉｎ ＥＴＤＡ、Ｇｉｂｃｏ^（Ｒ） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ）と共に３７℃で５分間培養して分離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）した。

３．可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）分泌ＵＣＢ−ＭＳＣの製作
ｓＲＡＧＥを分泌するＵＣＢ−ＭＳＣを製作するために、ＡＡＶＳ１のｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ部位を標的にするように設計されたｍＲＮＡ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＵＣＢ−ＭＳＣのトランスフェクションを行った。ＵＣＢ−ＭＳＣのトランスフェクションは、次の条件でｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを使用して行った：ｔｗｏ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｓｈｏｃｋ ｏｆ １０００Ｖ、３０ｍｓ ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ。細胞を６個のウェルプレートに各プレート当り８×１０^５個ずつ含むようにシーディングした。トランスフェクションされた細胞を３７℃で７日間培養してこれら細胞を安定化させた。培地は７日間毎日交替した。

４．定位手術（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ）および組織準備
Ｒｏｔｅｎｏｎｅの経口投与後３０日目に、動物を無作為に５個群に分けた：対照群（正常マウス未投与群）、ＰＤマウスアルファ−ＭＥＭ投与群、ＰＤマウスｓＲＡＧＥ投与群、ＰＤマウスＵＣＢ−ＭＳＣ投与群、およびＰＤマウスｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ投与群。動物の手術前にＺｏｌｅｔｉｌ ５０（Ｖｉｒｂａｃ）とＲｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ Ｋｏｒｅａ）が３：１比率で混合された混合物を１ｍｌ／ｋｇ量で腹腔内投与して麻酔させた。マウスを定位装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ）の上に置いた。薬物をａｔｌａｓ ｏｆ Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ（Ａｔｌａｓ）によって、右側ＣＳ（ａｎｔｅｒｉｏｒ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ０．４、ｍｅｄｉａｌ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ １．８、ｄｏｒｓａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｒｏｍ Ｂｒｅｇｍａ ３．５ｍｍ）内に一方注入した。薬物注入は、自動化ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｃ）に付着された２６ゲージＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して行った。１０ｕＭ（マイクロモル）ｓＲＡＧＥ３μｌを自動化ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒを使用して分当り１ｕＬの速度で徐々に注入した。その後、注射器を徐々に除去し手術傷口を縫合した後、抗生剤を局所的に処理した。ＦＢＳおよび抗生剤を含まないａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地３μｌで１×１０^６細胞を製作した。神経細胞に対する薬物投与効果を確認するために、５０ｍｌ １ｘＰＢＳで心臓を通じて麻酔した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む冷却固定液５０ｍｌで灌流した。灌流後、脳を除去し、４％ＰＦＡで５時間固定させた後、２０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液で一晩保存した。凍害防止された（Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）脳ブロックを低温維持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ）で１０μｍスライスに切断した。

５．免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）
マウス脳の冷凍切片を１ｘＰＢＳで５回洗浄し、タンパク質特異的抗体と共に培養した。正常ヤギ、ウサギまたは馬血清（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して抗体の非特異的結合を遮断した。４℃で一次抗体と一晩培養後、試料を１ｘＰＢＳで洗浄し、室温で１時間二次抗体培養を行った。核の対照染色のために、試料をＤＡＰＩ（４’６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｉｌｉｎｄｏｌｅ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２０秒間培養した。１ｘＰＢＳで洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓをガラススライドの上にマウンティングし、ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。

免疫染色に使用された一次抗体を下記の表２に列挙した：

免疫染色に使用された二次抗体を下記の表３に列挙した：

６．クレシルバイオレット染色（Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
マウス脳の冷凍切片を室温で５分間乾燥させ、１ｘＰＢＳで１０分間５回洗浄した後、多段階エタノールで培養した（９５％エタノール１５分、７０％エタノール１分、および５０％エタノール１分）。蒸留水で洗浄した後、脳組織を０．５％ Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ａｃｅｔａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液で１２分間染色し、蒸留水（１分）、５０％エタノール（１分）、７０％エタノール（２分）、９５％エタノール（２回２分）、１００％エタノール（１分）および最後にｘｙｌｅｎｅ（５分）で洗浄した。染色されたスライドを組織学的分析のためのＤＰＸ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でマウンティングした。

７．ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
脳組織をＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＡＭＲＥＳＣＯ）で準備し、１ｘ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＯＣＨＥ）を添加した後、超音波処理した。このように準備された組織を４℃で２０分間１４，０００ｘｇで遠心分離した。総タンパク質濃度は、ＢＣＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造会社の方法によって測定した。１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で同量（２０μｇ）のタンパク質を分離してＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に移した。タンパク質特異的抗体でタンパク質を検出した。ＥＣＬ（Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）検出試薬を使用してメンブレン上の免疫反応性タンパク質を可視化させた。

ウェスタンブロッティングに使用された一次抗体を表４に列挙した：

ウェスタンブロッティングに使用された二次抗体を表５に列挙した：

８．ＭＴＴ分析
ＨＴ２２細胞（ＡＴＣＣ）を２×１０^３個の量で各９６ウェルプレートにシーディングした。シーディング後、細胞をＡＧＥ−アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（５０ｎＭ）で１２時間処理した。前記細胞をＡＧＥ−アルブミン処理前に１時間ｓＲＡＧＥ（ｃａｔ．ＲＤ１７２１１６１００、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ；配列番号６）（５０ｎＭ）と共に培養した後、１２時間培養した。ＭＴＴ分析（３−２，５−ｄｉｐｈｅｎｉｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって細胞死滅を評価した。黄色ＭＴＴ化合物は、生きている細胞によってジメチルスルホキシド（Ｍｅ_２ＳＯ）に溶解される青色ｆｏｒｍａｚｅｎに変換される。０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを各ウェルに添加して２時間培養し、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。培養培地での青色染色強度は分光光度計で５４０および５７０ｎｍで測定し、生存細胞の比例量（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ａｍｏｕｎｔ）で示した。

９．行動試験（Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｔｅｓｔ）
９．１．ロータロッド試験（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）
加速化ロータロッド（ＵＧＯ Ｂａｓｉｌｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｒｏｔａｒｏｄ）を使用するロータロッドテストは、マウスを回転ドラム（直径３ｃｍ）に置き、各動物がロッド上で均衡を維持することができる持続時間を測定して行った。ロータロッドの速度は１５〜１６ｒｐｍにした。

９．２．ポールテスト（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）
ポールテストはＦｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ３；１４２（４）：１２４５〜１２５３）を参照して行った。スティックを地面に垂直に付着した（直径１ｃｍ、高さ３５ｃｍ）。マウスを床に面するスティック上端に置いて、フロアに到達した時に時間を測定した。時間測定前に二回のｔｒａｉｎｉｎｇ ｔｒｉａｌ施行後、３番目ｔｒｉａｌ時の時間を測定した。

統計分析
全ての実験データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。統計的有意性はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを使用して評価し、Ｐ≦０．０５を有意であると見なした。

実施例１：ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣｓの特性分析
１−１．ｄｏｎｏｒ ｓＲＡＧＥ ｖｅｃｔｏｒの構築
ｓＲＡＧＥ（ｃａｔ．ＲＤ１７２１１６１００、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ；配列番号６）コーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２０６９４０．１）を準備し、ＡＡＶＳ１ ｐＺＤｏｎｏｒベクター（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；図１のＡ）内に統合させた。前記ベクターの長さは５６３７ｂｐであり、ＨＡ−ＬおよびＨＡ−Ｒは相同組換えのために準備された。これらはＡＡＶＳ１部位と正確に同一な配列であるので、二重鎖切断発生後自然復旧システム（相同組換え）を促進する。Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｓｅｒｔは特定遺伝子配列（ｓＲＡＧＥコーディング配列）をｋｎｏｃｋｉｎｇ ｉｎするためにＵＣＢ−ＭＳＣの染色体に統合できる。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ（ＭＣＳ）は、ｓＲＡＧＥコーディング配列をＡＡＶＳ１−ｐＺＤｏｎｏｒベクターに挿入するための多様な制限酵素部位を有する。

１−２．ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣｓの製作のためのプラスミド準備
ｓＲＡＧＥを分泌するＵＣＢ−ＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣｓ）を製作するためのｉｎｓｅｒｔは、ヒトＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーター、ｓＲＡＧＥ（配列番号６；ｓＲＡＧＥの分析を容易にするためにＦｌａｇ標識された形態で使用される）コーディング配列、およびｐｏｌｙＡ信号から構成した（図１のＢおよび図１５ａ参照）。ヒトＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーターとｐｏｌｙＡ信号はそれぞれＥＦ１−ａｌｐｈａ−ＡｃＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅させた。前記ｉｎｓｅｒｔは、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ）を使用してＡＡＶＳ１−ｐＺＤｏｎｏｒプラスミド内のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入した。

図１は、ｐＺＤｏｎｏｒ−ＡＡＶＳ１ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎおよびｓＲＡＧＥコーディング配列の挿入情報を示す。

１−３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを用いたｓＲＡＧＥコーディング遺伝子のＵＣＢ−ＭＳＣｓの標的遺伝子内導入
ＡＡＳ１遺伝子を標的とするｍＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（ＴｏｏｌＧｅｎ，Ｉｎｃ；Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（配列番号４）、およびｓｇＲＮＡのＡＡＶＳ１標的部位：５’−ｇｔｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔａｇ−３’（配列番号７））をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用してヒトＵＣＢ−ＭＳＣｓ細胞（ＣＥＦＯｂｉｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）内に導入した。細胞内に導入されたｍＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰタンパク質になる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰによる遺伝子編集技術を図２に模式的に示した。前記ｓｇＲＮＡは、次のヌクレオチド配列を有する：
５’−（標的配列）−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；配列番号１）−（ヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ；配列番号３）−３’
（上記標的配列は配列番号７のＡＡＶＳ１標的部位配列で“Ｔ”を“Ｕ”に変換した配列であり、上記ヌクレオチドリンカーはＧＡＡＡのヌクレオチド配列を有する）。

ここに、１０μｌのｓＲＡＧＥ配列（実施例１−２で準備されたベクター形態で使用される）およびトランスフェクション基質（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を使用して次の条件下でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを行った；１０５０ ｖｏｌｔｓ、ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ ３０、ｐｕｌｓｅ ｎｕｍｂｅｒ ２、ＮＥＯＮ Ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）使用。１０^６細胞を６０ｍｍ培養皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に接種した後、注射前７日間３７℃の５％ＣＯ_２培養器で安定化させた。培地は毎日交替した。

前記のように準備されたＡＡＳ１遺伝子内にｓＲＡＧＥコーディング遺伝子が導入されたＵＣＢ−ＭＳＣｓを継代培養して１〜４世代細胞（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４）を準備した：トランスフェクション後の第１世代（Ｔ１）、トランスフェクション後の第２世代（Ｔ２）、トランスフェクション後の第３世代（Ｔ３）、およびトランスフェクション後の第４世代（Ｔ４）。

１−４．ｓＲＡＧＥ分泌ヒトＵＣＢ−ＭＳＣの特性分析
ｓＲＡＧＥタンパク質がｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ外に分泌されるため、ｓＲＡＧＥ分泌水準を細胞を培養したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍに対してウェスタンブロッティング（参考例７）を行って測定した。前記細胞から分泌されたｓＲＡＧＥタンパク質はＦｌａｇ抗体を使用して測定した。

対照群（ｓＲＡＧＥコーディング遺伝子が未導入ＵＣＢ−ＭＳＣ）、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、およびＴ４に対するウェスタンブロッティング結果およびバンド強度をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅで定量化した結果を図３に示した。各バンドの強度はＣｏｎｔｒｏｌ、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４でそれぞれ０、３０１７４．４１、１０６１．７、０および０と測定された。Ｔ１強度はＴ２バンド強度より２８．４倍さらに高かった。

実施例２．ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣの神経細胞保護効果および運動改善効果
２−１．ロータロッドテスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）
ＰＤマウスの運動能力の変化を調査するためにロータロッドテストを行った（参考例９．１）。その結果を図４に示した。対照群（正常マウス）、ＰＤマウス（未処理群）、ｓＲＡＧＥ処理ＰＤマウス、およびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウスでの平均維持時間はそれぞれ６５．５４±１０．７３、２９．３０±１３．４８、４７．６５±１７．６８および５８．１９±１８．７０秒であった。図４で確認されるように、運動能力はｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ処理マウスで顕著に増加し、特にｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣを処理した場合、正常マウスと類似の程度までの運動能力回復を示した。

２−２．ポールテスト（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）
動物行動回復をポールテストで検査して（参考例９．２）、その結果を図５に示した。対照群（正常マウス）、ＰＤマウス（未処理群）、ｓＲＡＧＥ処理ＰＤマウス、およびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウス（各グループ当り１０匹）での平均維持時間はそれぞれ５．００±１．２０、６．０６±１．４０、４．５２±１．７９および３．５６±０．４４と示された。図５で確認されるように、行動能力回復はｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ処理マウスで顕著に増加し、特にこれらグループは対照群より上昇した行動能力を示した。

２−３．マウス脳の組織学的分析
脳の多様な領域での細胞死滅を調査するために、次の３個グループのマウスのＳＮ領域およびＣＳ領域に対してＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ（参考例６）を行って得られた染色イメージおよび神経細胞をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅで計数した結果を図６（ＳＮ領域）および図７（ＣＳ領域）に示した：対照群（正常マウス）、ＰＤマウス（未処理群）、およびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウス。

図６（ＳＮ領域結果）のＡで神経細胞は紫色で染色され、各単一点は単一神経細胞を示す。ドーパミン性ニューロンは大部分ＳＮ領域に存在し、対照群の細胞数は４５３個である反面、ＰＤマウスでは細胞数が１２７個に減少し、ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウスでは４８９個に劇的に増加した。このような結果は、ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣがＳＮ領域で顕著な神経細胞保護効果を有するのを示す。

図７（ＣＳ領域結果）のＡで神経細胞は紫色で染色され、各単一点は単一神経細胞を示す。対照群の細胞数は３９４９個である反面、ＰＤマウスでは細胞数が３３２９個に減少し、ｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウスでは３８２２個に劇的に増加した。このような結果はｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣがＣＳ領域で顕著な神経細胞保護効果を有するのを示す。

２−４．ＰＤマウス脳のＣＳでの小膠細胞活性化試験
ＡＧＥ形成と小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）活性化を確認するために次の３個グループのマウス脳のＣＳ（Ｃｏｒｐｕｓ ｓｔｒｉａｔｕｍ）領域に免疫組織化学染色を行った（参考例５）：対照群（正常マウス）、ＰＤマウス（未処理群）、およびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣ処理ＰＤマウス。前記得られた結果を図８に示した。図８に示されているように、対照群のマウス脳ではＡＧＥ（緑色）がほとんど発見されなかったが、ＰＤ脳ではＡＧＥ信号が主にＣＳ領域（線条体領域）で観察され、Ｉｂａ１（赤色、活性化された小膠細胞マーカー）もＰＤマウスの脳で主に観察され、ＰＤマウスの脳は線状体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）の全体領域で対照群マウスの脳より高い信号を示した。このような結果は、ＰＤ条件でさらに多くのＡＧＥが形成され多くの小膠細胞が活性化されているのを示すと言える。図８の併合されたイメージは、Ｉｂａ１がＰＤマウス脳の線状体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）領域でＡＧＥと共に共局在化するのを示す。

２−５．ｓＲＡＧＥおよびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣのＡＧＥ−アルブミンによる神経細胞死滅に対する保護効果試験
神経細胞死滅に対するｓＲＡＧＥおよびｓＲＡＧＥ分泌ＵＣＢ−ＭＳＣの保護効果を示すためにＭＴＴ分析を行った（参考例８）。ＣＳ領域は主に神経細胞から構成されるため海馬の神経細胞（ＨＴ２２）を次の３個の群に準備して神経細胞保護効果を試験した：対照群（未処理群）、ＡＧＥ−アルブミン（５０ｎＭ）処理群（ＡＡ）、およびＡＧＥ−アルブミン（５０ｎＭ）＋ｓＲＡＧＥ（５０ｎＭ）処理群（ＡＡ＋ｓＲＡＧＥ）。前記得られたＭＴＴ分析結果を図９に示した。図９に示されているように、ＡＧＥ−アルブミンが処理されたＨＴ２２細胞（ＡＡ）では細胞死滅が誘発され細胞の生存率が顕著に減少した反面、ＡＧＥ−アルブミンをｓＲＡＧＥと共に処理した場合（ＡＡ＋ｓＲＡＧＥ）、細胞生存率（１００．９６％）が対照群（１００％）と同等以上であると示された。このような結果は、ｓＲＡＧＥタンパク質がＡＧＥ−アルブミンによる損傷から神経細胞を保護するのを示す。

実施例３：神経細胞死滅に対する保護効果の機構確認
３−１．ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ試験−ｐ３８、Ｅｒｋ１／２およびＪＮＫタンパク質がＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙで細胞死滅に寄与する主要タンパク質である
ＰＤ動物モデルで起こった全般的な機構をタンパク質発現水準の変化によって調査した。ＰＤマウスのＣＳ領域から脳組織を分離しＡＧＥ−アルブミン（５０ｎＭ）（ＡＡ）またはＡＧＥ−アルブミン（５０ｎＭ）＋ｓＲＡＧＥ（５０ｎＭ）を処理した後、ウェスタンブロッティングでＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ関与タンパク質発現を試験した（参考例７）。得られた結果を図１０に示した。図１０に示されているように、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ１／２およびこれらのリン酸化形態が検出され、ｐ３８、ＥｒｋおよびＪＮＫの発現水準で変化を確認した。このような結果は、ＰＤマウスでのこれら三つのタンパク質（ｐ３８、ＥｒｋおよびＪＮＫ）が神経細胞死滅に寄与して神経退行を誘導するのを示す。

３−２．Ｂａｘ試験
ＡＧＥ−ＲＡＧＥ依存経路に対するｓＲＡＧＥの効果を試験するために、ウェスタンブロッティングを行って（参考例７）、その結果を図１０に示した。図１０に確認されるように、Ｂａｘ（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が観察され、ＡＧＥ−アルブミンが処理された細胞でＢａｘの発現が増加した。しかし、ｓＲＡＧＥを共に処理した場合、Ｂａｘの発現水準が減少した。

［心血管疾患に対する効果］
実施例４：心臓疾患患者の大食細胞でＡＧＥ−アルブミンの合成および分泌
心筋梗塞または下肢虚血モデルの大食細胞でＡＧＥ−アルブミンの合成および分泌量を確認するためにＥＬＩＳＡを用いてＡＧＥ−アルブミンの発現量を測定した。

４−１．細胞培養
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために、不滅化ヒトｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ（ＲＡＷ２６４．７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。大食細胞を１０％熱−不活性化されたＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）および２０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された高濃度のグルコースを含有したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）で成長させ、大食細胞を５％ＣＯ_２、３７℃に維持させた。その後、大食細胞をｈｙｐｏｘｉａ状態で培養した。

４−２．細胞内と培養培地に分泌されたＡＧＥ−アルブミンの発現量測定（ＥＬＩＳＡ）
既に合成されたアルブミンをアルブミン抗体で除去した後、細胞内と培養培地に分泌されたＡＧＥ−アルブミンの発現量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。具体的には、ヒト大食細胞にｈｙｐｏｘｉａ処理した後、細胞溶解物（０．５μｇタンパク質）および培養培地（０．１ｍｇタンパク質）を用いて測定した。ＡＧＥ−アルブミンの量は、ウサギ抗−ＡＧＥ抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ）およびマウス抗−ヒトアルブミン抗体（１：８００、Ａｂｃａｍ）で測定した。ＨＲＰ結合された抗−マウス二次抗体（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加した。各ウェルにＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を加えて発色させ、同じ体積の２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させた。その後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。

実施例５：ヒト大食細胞で心筋梗塞時ＡＧＥ−アルブミンの合成と分泌増加
心筋梗塞は長期間の酸化的ストレスによって蓄積されると知られている。したがって、本実験ではヒト大食細胞でＡＧＥ−アルブミンの合成と分泌が酸化的ストレスによるものか確認するために、ヒト大食細胞に酸化的ストレス誘導物質である０〜１０００μＭの過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を処理した後、細胞溶解物を用いて免疫ブロッティング分析を行った。また、ヒト大食細胞に抗酸化剤を処理してＡＧＥ−アルブミンの発現量が減少するかをＥＬＩＳＡ分析を通じて確認した。

結果は図１３に示した。

図１３に示されているように、前記結果によって、ヒト大食細胞でＡＧＥ−アルブミンの合成と分泌が増加されるのを確認することができた。

実施例６：ラットの心筋梗塞または下肢虚血モデルでＡＧＥ−アルブミンの分布および発現位置
６−１．動物モデル
重量が２５０〜３００ｇの白ネズミ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を準備してＫｅｔａｍｉｎｅ（５０ｍｇ／ｋｇ）、ｘｙｌａｚｉｎｅ（４ｍｇ／ｋｇ）を混合して麻酔した。実験動物の気管に１６ｇａｕｇｅのｃａｔｈｅｔｅｒを挿入して人工呼吸器と連結し、平らな板に横たえてテープで腕と脚と尾を固定した後に胸骨の左側で１〜１．５ｃｍ程度皮膚を縦に切開し大胸筋（ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ ｍａｊｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）と小胸筋の間を広げて五番目肋骨間空間を確認し、注意して肋間筋を横に１ｃｍ程度切開した。五番目、六番目肋骨の間にｒｅｔｒａｃｔｏｒを入れて上下に広げた後、通常白ネズミで胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）が心臓上部を覆って視野を遮るのでａｎｇｌｅ ｈｏｏｋなどを用いて頭側に胸腺を引いた。左心臓動脈（ｌｅｆｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）の形態を観察してどの範囲の血管枝を縛るか決定した後に肺動脈円錐（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｏｎｕｓ）と左心耳（ｌｅｆｔ ａｔｒｉａｌ ａｐｐｅｎｄａｇｅ）の尖った部分が交差する線の２〜３ｍｍの下に位置するＬＡＤ（Ｌｅｆｔ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｒｔｅｒｙ）を６−０ ｓｉｌｋで縛った。広げられた五番目、六番目肋骨を再び集め、切開した肋間筋をＭＡＸＯＮ ４−０ ｆｉｌａｍｅｎｔで縛った後、胸腔に残っている空気を２３ Ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅ注射器で抜いて肺が完全に広がるようにした。皮膚をＭＡＸＯＮ ４−０ ｆｉｌａｍｅｎｔを用いて縫合し、気管挿管したチューブを取り出して咽頭についている粘液を除去した。手術後に鎮痛剤（（Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ０．０２５ｍｇ／ｋｇ）を１２時間ごとに皮膚注射した。

６−２．免疫組織化学検査（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）
正常（ｎｏｒｍａｌ）または心筋梗塞（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ；ＡＭＩ）ラットの心臓組織で免疫組織化学を行った［Ｓ．Ｍ．Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３、ｅ２８２９（２００８）］。正常または心筋梗塞ラットの心臓組織を０．１Ｍ中性リン酸塩緩衝溶液内４％パラホルムアルデヒドで固定させ、３０％スクロース溶液で一晩冷凍保管した後、低温維持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９００）で１０μｍ切片を準備した。パラフィン包埋組織を１０μｍ厚さの切片に切断し、キシレンで脱パラフィンさせた後、一連の等級エタノールで再水和した。正常ヤギ血清（１０％）を使用して非特異的タンパク質結合を遮断した。組織切片を下記抗体のうちの一つと共に４℃で一晩培養した：ウサギ抗−ＡＧＥ抗体（Ａｂｃａｍ）、マウス抗−ヒトアルブミン抗体（１：２００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、ヤギ抗−Ｉｂａ１抗体（１：５００、Ａｂｃａｍ）。前記培養された組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ６３３ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ５５５ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間培養した。二次抗体をＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してガラススライドの上に設置し、レーザー共焦点蛍光顕微鏡（ＬＳＭ−７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。

結果は図１２に示した。

図１２に示されているように、心筋梗塞前または後のラットの心臓細胞でアルブミン（緑色）とＡＧＥ（赤色）が同じ位置で染色されるのを確認した。また、心筋梗塞ラットの血液単核細胞でアルブミンとＡＧＥが広く分布されており、ＡＧＥ−アルブミンの発現量が正常ラットより増加することを観察した。

実施例７：心筋梗塞モデルでの水溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）のＡＧＥ−アルブミン合成抑制効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
心筋梗塞細胞モデルでＲＡＧＥの増加とｓＲＡＧＥによるＲＡＧＥ減少効果を確認するために、ＲＡＧＥ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）染色して、これらの分布および発現位置をレーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察した。

結果は図１４に示した。

図１４に示されているように、心筋梗塞モデルでｓＲＡＧＥタンパク質を投与する前または後の細胞でＲＡＧＥが増加または減少するのを示した。また、これはＭＡＰＫ信号伝達系のｐＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐｐ３８の影響が最も大きいと確認された。

実施例８：心筋細胞でＡＧＥ−アルブミンによる細胞死誘導
ストレスによって活性化されたＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）が神経細胞死を誘導すると報告されている。したがって、本実験では一次ヒト神経細胞でＡＧＥ−アルブミンが直接的に細胞死を誘導するかを確認するために、下記のような実験を行った。

８．１．ヒト心筋細胞培養
心筋細胞を５％ＦＢＳ、５％ＨＳ（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢが添加されたＤＭＥＭ（培養培地）に懸濁させ、１０ｃｍ培養皿に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１０ｍｌ）でプレートした後、５％ＣＯ_２／９５％大気下の培養器で３７℃に維持した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養２〜３週後、ＡＧＥ−アルブミンで処理した後にアポトーシス−関連特性のために使用した。

８．２．細胞生存率（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）測定
ヒト心筋細胞を９６−ウェル培養プレートにウェル当り２×１０^３細胞で接種した。８０％融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達した後、一次ヒト神経細胞を様々な濃度（０、０．０１、０．１、１、１０、２０μｇ／ｍｌ）のＡＧＥ−アルブミンまたは様々な濃度（０、０．５、１、５、１０ｍｇ／ｍｌ）のアルブミンで処理した。処理２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞生存率をＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］ａｓｓａｙを用いて測定した。各ウェルの吸光度は９６−ウェルプレートリーダー（ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて５４０ｎｍで測定した。

結果は図１４に示した。

図１４に示されているように、ヒト心筋細胞にＡＧＥ−アルブミンを処理した場合、ＡＧＥ−アルブミンの濃度が増加するほど細胞生存率が減少して細胞死が誘導されるのを確認した。反面、一次ヒト心臓細胞にアルブミンを処理した場合、アルブミンの濃度に関係なく細胞生存率がほとんど変化がなくて細胞死が誘導されないのを確認した。

また、心臓細胞死に対する水溶性ｓＲＡＧＥの保護効果を確認するために、ヒト心筋細胞にｓＲＡＧＥ単独、ＡＧＥ−アルブミン単独、またはｓＲＡＧＥ／ＡＧＥ−アルブミンを共に処理した後に測定した。

結果は図１４に示した。

図１４に示されているように、ヒト心筋細胞にｓＲＡＧＥとＡＧＥ−アルブミンを同時に処理した場合、細胞生存率が増加して細胞死が減少されるのを確認した。したがって、ｓＲＡＧＥが心筋細胞死に対して保護効果を有するということが分かる。

実施例９：人に適用可能な成長因子分泌幹細胞製作技術確立
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを用いたｓＲＡＧＥ分泌細胞製作技術確立
−ｓＲＡＧＥ分泌細胞製作
まず、ｐＺＤｏｎｏｒ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にｓＲＡＧＥの遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２０６９４０．１）が挿入されたｓＲＡＧＥ遺伝子を含むｐＺＤｏｎｏｒベクターを製作した（図１５ａ参照）。また、ＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（（株）ＴｏｏｌＧｅｎ）を準備した（Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質；ＡＡＶＳ１を標的とするｓｇＲＮＡのターゲッティング配列：ｇｕｃａｃｃａａｕｃｃｕｇｕｃｃｃｕａｇ；全体配列は先に記載された一般式３参照）。

前記準備されたＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを含むベクターとｓＲＡＧＥの遺伝子を含むｐＺＤｏｎｏｒベクターを人の臍帯間葉系幹細胞（メディポスト）に共にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは細胞ゲノム遺伝子中でＡＡＶＳ ｓｉｔｅを切断することによって所望の遺伝子（即ち、ｓＲＡＧＥ遺伝子）を前記切断部位の間に挿入するようになり、これによってｓＲＡＧＥを分泌する細胞が作られるようになる。前記製作された細胞のｓＲＡＧＥ分泌有無をウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および蛍光免疫染色（Ｆｌａｇ）で試験し、その結果をそれぞれ図５ｂおよび図５ｃに示した。

また、前記準備されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰの遺伝子編集（Ｉｎｄｅｌ：挿入および／または欠失）効率をＪｕｒｋａｔ細胞で試験してその結果を図６に示した（ｎｏｎｅ：何もなくｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ進行；ｓｇＲＮＡ＃１：１番配列ｔａｒｇｅｔするガイドＲＮＡのみ入れて進行；ｓｇＲＮＡ＃２：２番配列ｔａｒｇｅｔするガイドＲＮＡのみ入れて進行；Ｓｐ．ｃａｓ９ ｏｎｌｙ：ｃａｓ９タンパク質のみ入れて進行；ａＲＧＥＮ１：１番ｔａｒｇｅｔするｇＲＮＡとｃａｓ９タンパク質を入れて進行；ａＲＧＥＮ２：２番ｔａｒｇｅｔするｇＲＮＡとｃａｓ９タンパク質を入れて進行；ｄＲＧＥＮ１：１番ｔａｒｇｅｔするｇＲＮＡとｃａｓ９をコードするプラスミドを使用して進行；ｄＲＧＥＮ２：２番配列をｔａｒｇｅｔするｇＲＮＡとｃａｓ９をコードするプラスミドを使用して進行）
前記図１５および１６に示された結果は下記の方法で得た：
幹細胞および特定物質分泌細胞の標準化分析
−ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｔｒｉｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した後、ｏｌｉｇ−ｄＴ ｐｒｉｍｅｒと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は４２℃で１時間行い、９５℃で１０分間反応して酵素活性を停止させた。確認しようとする遺伝子のｐｒｉｍｅｒを製作した後、ＰＣＲを行った（プライマー：Ｆｗｄ：５’−ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ−３’；Ｒｅｖ：５’−ｔｇａｇｇａａｇａｇｔｔｃｔｔｇｃａｇｃｔ−３’）。

−Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
分離されたタンパク質溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法で確認した後、一定量のタンパク質溶液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて電気泳動した後、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅでｔｒａｎｓｆｅｒした。１次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１２時間反応させ、反応が終わると１次抗体を洗浄した後、ＨＲＰが結合された２次抗体（ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と常温で１時間反応させた。反応が終わるとＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でタンパク質発現有無を分析した。

−免疫細胞化学−蛍光染色
固定された細胞を４℃で１２時間１次抗体と反応させた後に洗浄し常温で１時間ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧと反応させた。このように染色された細胞はｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅの上に置いた後、Ｚｅｉｓｓ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで観察した。

製作されたヒト臍帯由来成長因子分泌幹細胞の特性分析
−製作された血管成長因子分泌機能性幹細胞を培養した後、幹細胞特性分析法で増殖能と細胞標識マーカー（免疫表現型）および多分化能力、そして移動能および分泌能などに対する検証を経た後、所定の基準によって優れた高効能ｓＲＡＧＥ分泌幹細胞を選定した。前記選定されたｓＲＡＧＥ分泌幹細胞をｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣと称した。

実施例１０：心筋梗塞モデル心筋細胞死に対するｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣの保護効果：
ｉｎ ｖｉｖｏ実験
心筋梗塞モデルで心筋細胞死に対するｓＲＡＧＥの保護効果を確認するために、ラットの心筋梗塞モデルを製作し組織に前記実施例６で選定されたｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣを注入した後（注入量：１０ｕｌ＊３回 総３０ｕｌ、３０ｕｌ内の総細胞数は１×１０^６個である）、心筋細胞の数をクレシルバイオレット（Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ）で染色した後に顕微鏡で観察した。

結果は図１７に示した。

図１７に示されているように、ラットの心臓組織にｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣを処理した場合、心筋梗塞領域が小さくなり線維化範囲が減った。

実施例１１：下肢虚血モデル筋肉細胞死に対するｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣの保護効果
ｉｎ ｖｉｖｏ実験：動物モデル製作（Ｒａｔ ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｄｅｌ）
動物は、ｍａｌｅ Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕマウスを使用した。動物モデル製作時、全ての環境は清潔で滅菌された場所で施行し、Ｎ_２Ｏ：Ｏ_２＝１：１（ｖ：ｖ）、フォラン痲酔剤吸入によって麻酔させて行った。

麻酔後、約２ｃｍほど皮膚を切開後、３−０ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｉｌｋで正確な部位に結紮（ｉｌｉａｃ ａｒｔｅｒｉｅｓあるいはｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓとｉｎｇｕｉｎａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔで５〜６ｍｍ下）した後、Ｓｋｉｎ ｃｌｉｐを用いて皮膚を閉じた。

下肢虚血モデルで下肢筋肉細胞死に対するｓＲＡＧＥの保護効果を確認するために、ラットの下肢虚血モデルを製作し、組織にｓＲＡＧＥ（タンパク質）を注入した後（注入量：０．８ｕｇのｓＲＡＧＥ タンパク質が含まれている総８ｕｌ注入）、筋肉細胞をＲＡＧＥ、ＴＵＮＥＬおよびａ−ａｃｔｉｎｉｎで染色した後に共焦点顕微鏡で観察した。

結果は図１８ａおよび１８ｂに示した。図８ａ（Ａ、Ｃ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ；Ｂ、Ｄ：ｉｎ ｖｉｖｏ）および１８ｂで、ＡＡはＡｇｅ−アルブミン投与群、ＩＲは虚血−再灌流（Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）モデル群、ｓＲＡＧＥはｓＲＡＧＥ（タンパク質）投与群をそれぞれ意味する。

図１８ａおよび１８ｂに示されているように、マウスの下肢組織にｓＲＡＧＥ−ＵＣ−ＭＳＣを処理した場合、ＲＡＧＥとＴＵＮＥＬの発現が減った。また、これはｐｐ３８が関与するのを確認した。

実施例１２．ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣの製造および特性試験
ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣを生成するために、ｐＺＤｏｎｏｒベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にヒトＥＦ１−αプロモーター、ｓＲＡＧＥコーディング配列、およびｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌをクローニング方法で挿入して製作したｓＲＡＧＥドナーベクター（図１のＡおよび１９ａ参照）およびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ＲＮＰシステムを使用してｉＰＳＣのトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。ガイドＲＮＡは１９番染色体でＡＡＶＳ１と知られたｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｓｉｔｅを標的にするように設計した（Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（配列番号４）、ｓｇＲＮＡの標的部位：ｇｔｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔａｇ（配列番号７））。トランスフェクションは４Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（（Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。トランスフェクション条件はウェブサイト上のＬｏｎｚａプロトコル（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ‘ｈＥＳ／Ｈ９’）に提供されている条件に従った。Ｐ３ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ４Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ−３０２４）を使用してｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った。２×１０＾５個のヒトｉＰＳＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）をｃａｓ９タンパク質１５ｕｇ、ｇＲＮＡ２０ｕｇおよびｓＲＡＧＥドナーベクター１ｕｇでトランスフェクションさせて、ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣを製造した。

トランスフェクション３日後に、トランスフェクションしたｉＰＳＣからゲノムＤＮＡを分離して、ｉＰＳＣのゲノムＤＮＡでｓＲＡＧＥのＫＩ（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）有無を決定した。ＰＣＲプライマ−はＡＡＶＳ１ Ｆｗｄ（ｉＰＳＣ自体配列）およびＰｕｒｏ ｒｅｖ（挿入配列）（ＡＡＶＳ１ ＦＷＤ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＴＣ ＴＡＡ ＣＧ；Ｐｕｒｏ Ｒｅｖ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＣＴ）で準備した。

ＰＣＲは５６℃および３０ｃｙｃｌｅｓ条件で行い、電気泳動後、ＵＶ光下でバンドを観察した。前記得られた結果を図１９ｂに示した。図９ｂはｓＲＡＧＥの遺伝子が成功的にＡＡＶＳ１サイトに統合されたのを示す。

ｓＲＡＧＥの発現および分泌水準を免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡで確認した。

まず、免疫ブロッティングは次のように行った：全体細胞溶解物をＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＡＴＴＡ、ＷＳＥ７４２０）およびｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＡＴＴＡ、ＷＳＥ７４２０）で準備した後、超音波処理した。前記準備された細胞溶解物を４℃で２０分間１７，０００ｘｇで遠心分離し、上澄液を収集した。１０％ポリアクリルアミドゲル上で同量（３０μｇ）のタンパク質を分離し２００ｍＡで２時間ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。５％ｎｏｎ−ｆａｔｓｋｉｍ ｍｉｌｋを使用して室温で１時間非特異的抗体結合を遮断した。前記準備されたメンブレンを１次タンパク質特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ−７４２５）およびｂ−アクチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２２７）と共に４℃で一晩インキュベーティングし、２次抗体と共に室温で１時間インキュベーティングした。数回洗浄後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）を使用してタンパク質を検出した。

ＥＬＩＳＡは次のように行った：ｈｕｍａｎ ｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｖｉｓｃｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳＫ００１１２−０２）を使用して全体分泌された溶解性ＲＡＧＥを定量した。ヒトｓＲＡＧＥ抗体が予めコーティングされており、稀釈緩衝液１００μｌが含まれている９６−ウェルマイクロプレートに試料と標準溶液１００μｌ（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎの逆順に）を添加した。その後、プレートを密封剤（ｓｅａｌ）で覆って室温でマイクロプレートシェーカー上で２時間インキュベーティングした。インキュベーション後、溶液を全て吸引し洗浄液で４回洗浄した。ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎに希釈された検出抗体１００μｌを各ウェルに添加した後、プレートを密封剤で覆って室温でマイクロプレートシェーカー上で２時間インキュベーティングした後、吸引および洗浄工程を繰り返して行った。ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−接合された２次抗体１００μｌを各ウェルに添加し、光が遮断された室温条件でマイクロプレートシェーカー上で１時間インキュベーティングした後、吸引および洗浄工程を繰り返して行った。最後に、基質溶液１００μｌを各ウェルに添加し５〜８分間反応させた後、停止溶液１００μｌを加えて反応を終了させた。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレート判読機を使用して光学密度を測定した。

前記免疫ブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）およびＥＬＩＳＡを行って得られた結果を図１９ｃに示した。図１９ｃのウェスタンブロット結果から確認できるように、ｐｚＤｏｎｏｒベクターがトランスフェクションされたｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣでＦｌａｇの発現が観察された。図１９ｃの培地で全体ｓＲＡＧＥの分泌水準を示すＥＬＩＳＡ結果で示されているように、ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣの培養培地で１５．６ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥが検出され、これは、ｍｏｃｋ−ｉＰＳＣの培地で０．８ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥが検出されたのと比較して、顕著に高い水準である。

実施例１３．心筋梗塞（ＭＹＯＣＡＲＤＩＡＬ ＩＮＦＡＲＣＴＩＯＮ；ＭＩ）モデリングおよびｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ移植
体重２９０〜３３０ｇ（８〜９週齢）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに対してＭＩおよび再灌流過程を行って心筋梗塞を誘導した。簡単に説明すれば、ラットに挿管（ｉｎｔｕｂａｔｅｄ）およびｖｏｌｕｍｅ−ｃｙｃｌｅｄ ｓｍａｌｌ−ａｎｉｍａｌ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒを使用して換気（ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ）を行った。手術の間に５％ ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅで麻酔を維持させた。ｌｅｆｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ（ＬＡＤ）を確認した後、４０分間６〜０ポリプロピレンで血管を連結させた。再灌流後、ハミルトン注射器を使用してＰＢＳ１０ｕｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）をＧＦＰ−ｉＰＳＣまたはｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ細胞（１×１０^６）と共にまたは単独で梗塞周囲および梗塞領域に注入した。筋肉層と皮膚を縫合した後、回復するように置いた。虚偽手術群（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）は前記と同一な実験手順を経たが、ｌｉｇａｔｉｏｎおよび細胞移植は行わなかった。移植拒否反応を予防するために、細胞移植を受けたラットにｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与した。全ての動物実験はＧａｃｈｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｅｅ Ｇｉｌ Ｙａ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を受けて行った（＃ＬＣＤＩ−２０１４−００２０）。

細胞移植４週後に動物を犠牲にした。心臓を切除し、ＰＢＳと氷−冷却された４％パラホルムアルデヒドで右側頸動脈を通じて灌流させた。組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５８１２７）に４℃で一晩固定した後、脱水過程に移した。脱水後、組織をｘｙｌｅｎｅで２回それぞれ１．５時間クリアし、６０℃でパラフィンに含浸させた。パラフィン含浸された（Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ）心臓組織を７μｍ厚さに切断した。

Ｈ＆ＥとＭａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を施行して梗塞大きさ、前壁（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｗａｌｌ）厚さおよび線維化の比率を測定した。Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎ’ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ−ｓｔａｉｎｅｄ切片を光学顕微鏡で観察し、ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｄｅｌｅｇａｔｅｄ梗塞比率をｂｌｉｎｄｅｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒによって計算および分析した。梗塞部位の大きさと他の媒介変数はｌｉｇａｔｉｏｎ地点と心臓の頂点の間の中間水平断面で測定した。梗塞大きさは次の式で計算した：
％ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ＝（ｉｎｆａｒｃｔ ａｒｅａｓ／ｔｏｔａｌ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（ＬＶ ａｒｅａ））Ｘ１００
％ ｉｎｆａｒｃｔ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｗａｌｌ（ｉｎｆａｒｃｔ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）／ｓｅｐｔａｌ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）Ｘ１００
Ｖｉａｂｌｅ ＬＶ ａｒｅａ＝ｔｏｔａｌ ＬＶ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｒｅａ−ｉｎｆａｒｃｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｒｅａ
前記得られた結果を図２０ａ〜２０ｃに示し、これら結果はｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣ処理によってラットの虚血性再灌流損傷された心臓（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｅｄ ｈｅａｒｔ）の心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）死滅が抑制されるのを確認することができる。より具体的に、図２０ａは心筋梗塞部位の大きさを評価するために、手術およびＧＦＰ−ｉＰＳＣまたはｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ移植後２８日目にＭａｓｓｏｎ’ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した結果を示す。図２０ａで青色はｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｄａｍａｇｅによる線維化部位を示し、赤色は心筋細胞を示す。前記図２０ａの結果をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量してＬＶ断面積での線維化領域およびｉｎｆａｒｃｔｅｄ壁厚さの百分率を計算して、図２０ｂに示した。ｉＰＳＣ、ＶＥＧＦ−ｉＰＳＣまたはＡＮＧ１−ｉＰＳＣ投与群と比較して、ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ投与群で線維化部位が有意に減少した。また、図２０ｃに示されているように、組織ＲＡＧＥはまたＶＥＧＦまたはＡＮＧ１処理群と比較してｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ処理群で有意に減少した。

実施例１４．ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣの幹細胞保護効果
免疫組織化学試験によってＡＧＥ−ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＡ）処理ｉＰＳＣでＴＵＮＥＬが増加するが、ｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣ（ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ）と共に培養した後には強度が減少するのを確認した（図２１ａ参照）。また、ＰＢＳ、ＡＡまたはｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣでＲＡＧＥのウェスタンブロッティング結果を図２１ｂに示し、ＡＡ処理後のｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣ同時培養がｉＰＳＣｓでのＲＡＧＥ発現を減少させる結果を確認することができる。このような結果はｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣが他のｉＰＳＣを含む幹細胞を保護する効果を有し（特に、ＡＧＥ−ａｌｂｕｍｉｎが蓄積される心筋梗塞のような環境で幹細胞保護効果を有する）、これを通じて幹細胞治療剤と共に併用されることによって前記幹細胞治療剤の効果を増進させることができるのとｓＲＡＧＥ分泌ｉＰＳＣの他の幹細胞治療剤との併用用途を提案する。

Claims (9)

1. 可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を含むＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ；最終糖化産物）−アルブミンの分泌抑制またはＡＧＥ−アルブミンによる細胞死（アポトーシス）抑制用薬学組成物。
2. 可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物。
3. 可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を含む心血管疾患の予防または治療用薬学組成物。
4. 前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の薬学組成物。
5. 前記幹細胞は、人工多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項４に記載の薬学組成物。
6. 前記神経疾患は、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ＦＴＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ；ＤＬＢ）、皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＤ）、または脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）である、請求項２に記載の薬学組成物。
7. 前記心血管疾患は、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、または不整脈である、請求項３に記載の薬学組成物。
8. 可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を含む、幹細胞保護用組成物。
9. 分離された可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞と分離された幹細胞を共培養する工程を含む、幹細胞保護方法。