KR20200021449A

KR20200021449A - sRAGE를 분비하는 줄기세포를 포함하는 신경질환 또는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20200021449A
Application number: KR1020197032547A
Authority: KR
Inventors: 이봉희; 바이예르사이칸대기; 이재석; 셰에드가샘호세이니살카데
Original assignee: 주식회사 툴젠; 주식회사 엔세이지
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2020-02-28
Also published as: WO2018203664A8; JP2020518618A; WO2018203664A3; US20200289575A1; WO2018203664A9; JP7084418B2; WO2018203664A2

Abstract

sRAGE-분비 줄기세포 (sRAGE-secreting stem cell) 및 이의 파킨슨병 등의 퇴행성 신경질환 및/또는 심혈관질환의 예방 및/또는 치료를 위한 용도가 제공된다.

Description

sRAGE를 분비하는 줄기세포를 포함하는 신경질환 또는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

sRAGE-분비 줄기세포 (sRAGE-secreting stem cell) 및 이의 신경질환 및/또는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 용도가 제공된다.

파킨슨병 (Parkinson's disease; PD)은 독성 약물에서 유발되는 산발적 요인 또는 유전적 요인과 같은 다양한 인자에 의하여 유발되는 대표적인 신경 퇴행성 질환 중 하나이다. PD 환자는 만성적인 진행성 신경계 파괴로 인한 운동 장애를 갖는다. 이러한 운동 장애는 경직, 운동지연 (bradykinesia), 떨림 (tremor), 및 자세 불안정 등의 특징을 가지며, 삶의 질을 낮추는 요인이 되므로, PD의 효과적인 치료는 PD 환자들에게 보다 나은 삶의 질을 제공한다는 측면에서 매우 중요하다.

PD의 원인을 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되었다. 예를 들어, 유전적 연구에 따르면, PD 환자에게서 SNCA, PARK2, LRRK2, PINK1 등과 같은 특정 유전자에 돌연변이가 일어나는 것으로 확인되었다. 이들 유전자는 대부분 루이체 (Lewy bodies)의 주요 성분인 알파-시누클레인(alpha-synuclein)과 관련있다. 루이체가 흑색질 (substantia nigra, SN)에서 형성되면 도파민신경세포 (dopaminergic neuron, DA)가 자멸사 하게 된다. 또한, 흑질질 부위의 DA가 만성적 인 영향으로 손상을 입고, 활성화된 미세아교세포가 신경세포 사멸에 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었다. 만성 PD 조건이 뇌, 특히, 흑색질에서 유발될 때, 도파민신경세포는 사이토카인을 신호 분자로 분비한다.

흑색질과 선조체 (corpus striatum, CS)가 함께 연결되어 있기 때문에, SN 내의 DA 세포는 도파민을 생성하여 CS에 신호를 보낸다. 따라서, SN 영역 주변의 DA 세포에서 세포 자멸사가 발생하면, SN으로부터 도파민이 생성되지 않고 CS는 더 이상 운동에 반응하는 신호를 갖지 않게 되고, 이러한 문제가 계속되면 불사용 위축(disuse atrophy)에 의한 손상을 갖게 된다.

많은 연구에서 PD의 다양한 원인들이 보고되어 있지만, PD에서 CS 영역이 손상되는 이유를 보여주는 확실한 증거를 제시하지 못하고 있다. PD의 원인을 이해하기 위해 SN의 신경 퇴화가 집중적으로 연구되었지만 CS에서의 신경 세포 사멸의 메커니즘은 여전히 명확하게 확인되지 않고 있다.

이와 같이, 현재까지 밝혀진 PD의 원인에 대한 연구 결과가 제한적이기 때문에, PD 치료에 한계가 있다.

한편, 알부민은 다기능 특성을 갖는 가장 풍부한 혈장 단백질로, 간세포에서 주로 합성되며, 간질액(interstitial fluid), 림프액 및 뇌척수액을 포함하는 대부분의 세포외액의 주요한 성분이다. 생체내에서 알부민이 감소되면 간기능 저하 및 영양상태가 불량하게 되므로, 임상학적으로 알부민은 중환자 및 간경변 환자의 혈관허탈(vascular collapse)을 포함하는 위독한 상태에서 광범위하게 사용되고 있다.

또한, 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)은 인체 내에서 끊임없이 발생하는 복합물질로 주로 탄수화물과 유리 아미노산의 반응에 의해 발생하며, 화학적으로 매우 불안정하고 반응성이 강한 물질이기 때문에 신경세포의 사멸을 촉진시키는 분자로 알려져 있다. 또한, 최종당화산물은 노인이나 노화된 동물의 뇌에서 증가되는 것으로 보고되어 있으며, 모든 세포와 생체 분자에 영향을 미쳐 노화 및 노화 관련 만성 질환의 원인이 된다. 즉, 최종당화산물은 혈관 투과성 증가, 산화 질소 방해에 의한 혈관 확장 억제, LDL 산화, 대식세포 또는 내피세포 등에서 여러 종류의 사이토카인 분비, 및 산화 스트레스를 증가시킴으로써, 노화, 알츠하이머병, 신장질환, 당뇨병, 당뇨병성 혈관 합병증, 당뇨병성 망막 이상 및 당뇨병성 신경 이상 등과 같은 성인병들과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

상기한 바와 같이, AGE는 노인이나 노화된 동물의 조직에서 증가된다고 알려져 있고, 대부분의 세포에 영향을 미쳐 노화 및 노화관련 만성질환의 원인이 된다고 알려져 있으므로, 세포의 사멸을 촉진하여 퇴행성 질환 또는 허혈성 질환 등에 영향을 미칠 수 있을 것이라고 많은 연구자들에 의해 제안되어 왔다. 최근, 여러 질환에서 AGE-albumin이 AGE 중 대부분을 차지하고 직접적으로 질환을 일으키는 원인으로 알려져 이를 저해하는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.

일 예는 sRAGE(soluble Receptor for Advanced Glycation End-products)를 분비하는 줄기세포 (sRAGE-secreting stem cell)를 제공한다. 일 예에서 상기 sRAGE를 분비하는 줄기세포는 sRAGE를 분비하는 인간 줄기세포일 수 있다. 다른 예는 sRAGE 암호화 유전자가 줄기세포의 유전체 내에 삽입된, 예컨대, 줄기세포의 유전체 중의 AAVS1 등과 같은 세이프 하버(safe harbor) 부위에 삽입된 sRAGE를 분비하는 줄기세포를 제공한다. 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있고, 예컨대, 재대혈 등에서 유래하는 중간엽줄기세포일 수 있다.

다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물을 포함하는, AGE(advanced glycation end-product; 최종당화산물)-알부민의 분비 억제용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물을 AGE-알부민의 분비 억제를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, AGE-알부민의 분비 억제 방법을 제공한다. 상기 AGE-알부민의 분비 억제는 단핵식세포계 세포(mononuclear phagocytes) 내에서의 AGE-알부민의 분비 억제일 수 있다.

다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물을 포함하는, AGE-알부민에 의한 세포사(apaotosis)의 억제용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물을 AGE-알부민에 의한 세포사의 억제를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, AGE-알부민에 의한 세포사의 억제 방법을 제공한다. 상기 AGE-알부민에 의한 세포사의 억제는 단핵식세포계 세포 내에서의 AGE-알부민에 의한 세포사의 억제일 수 있다.

다른 예는 유효성분으로 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물를 포함하는, 신경질환 환자, 예컨대 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD) 등과 같은 퇴행성 신경질환 환자에서의 세포사멸 (apaotosis) 저해용 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 단핵식세포 (mononuclear phagocytes)의 말초 세포(peripheral cells)의 세포 사멸을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단핵식세포의 말초세포는 신경세포 (neural cell)일 수 있으며, 상기 신경 세포는 성상세포 (astrocyte), 뉴런, 도파민 신경세포(dopaminergic neuron), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 유효성분으로 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물를 포함하는, 신경질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 AGE(Advanced Glycation End-product)-알부민 및/또는 RAGE(Receptor for Advanced Glycation End-products)의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 (apaotosis) 억제, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물를 AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 억제, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 억제, 및/또는 퇴행성 신경질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물의 (1) AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 저해, 신경질환 환자에서의 세포사멸 저해, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료, 또는 (2) AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 저해, 신경질환 환자에서의 세포사멸 저해, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

상기 신경 질환(Neurologic Disorders/Neurologic Diseases)은 신경계, 즉 뇌, 척수, 및/또는 신경에 구조적 및/또는 기능적 손상 (장애), 퇴행, 및/또는 정지가 생긴 모든 질환을 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD), 근위축측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS, 루게릭병), 전두측두치매 (frontotemporal dementia; FTD), 루이치매 (dementia with Lewy bodies; DLB), 피질기저퇴행증 (corticobasal degeneration), 다계통위축병 (multiple system atrophy; MSA), 진행성핵상마비 (progressive supranuclear palsy; PSP), 헌팅톤병 (Huntington's disease; HD) 등의 퇴행성 신경질환; 척수 손상 (spinal cord injury); 알코올 중독 (예컨대, 알코올성 소뇌변성증, 알코올성 말추신경병증 등); 뇌졸중 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물의 약학적 유효량을 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 sRAGE 분비 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물의 심혈관 질환의 예방 또는 치료, 또는 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

상기 심혈관질환은 심혈관 이상으로 생기는 병으로, 모든 허혈성 심혈관 질환 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 고혈압, 부정맥 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 줄기세포의 게놈에 sRAGE 유전자를 도입시키는 단계를 포함하는, sRAGE 분비 줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 줄기세포의 게놈에 sRAGE 유전자를 도입시키는 단계는 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)의 복합체에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA의 복합체는 CRISPR/Cas9 RNP (Ribonucleoprotein; RNA Guided Endonuclease; RGEN)일 수 있다.

다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 sRAGE 분비 줄기세포를 제공한다.

다른 예는 상기 sRAGE 분비 줄기세포 제작에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 (또는 이를 암호화하는 핵산분자)와 가이드 RNA (또는 이를 암호화하는 핵산 분자)의 복합체, 예컨대, CRISPR/Cas9 RNP를 제공한다.

다른 예는 유효성분으로 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물를 포함하는, 신경질환 환자에서의 세포사멸 (apaotosis) 저해용 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 단핵식세포 (mononuclear phagocytes)의 말초 세포(peripheral cells)의 세포 사멸을 저해하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단핵식세포의 말초세포는 신경세포 (neural cell)일 수 있으며, 상기 신경질환 환자는 파킨슨병 환자일 수 있고, 상기 신경 세포는 성상세포 (astrocyte), 뉴런, 도파민 신경세포(dopaminergic neuron), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 AGE(Advanced Glycation End-product)-알부민 및/또는 RAGE(Receptor for Advanced Glycation End-products)의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 (apaotosis) 억제, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 sRAGE 분비 줄기세포 배양물를 AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 억제, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, AGE-알부민 및/또는 RAGE의 합성 및/또는 분비의 억제, 신경질환 환자에서의 세포사멸 억제, 및/또는 신경질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 신경 질환 (Neurologic Disorders/Neurologic Diseases)은 신경계, 즉 뇌, 척수, 및/또는 신경에 구조적 및/또는 기능적 손상 (장애), 퇴행, 및/또는 정지가 생긴 모든 질환을 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD), 근위 축측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS, 루게릭병), 전두측두치매 (frontotemporal dementia; FTD), 루이치매 (dementia with Lewy bodies; DLB), 피질기저퇴행증 (corticobasal degeneration), 다계통위축병 (multiple system atrophy; MSA), 진행성핵상마비 (progressive supranuclear palsy; PSP), 헌팅톤병 (Huntington's disease; HD) 등의 퇴행성 신경질환; 척수 손상 (spinal cord injury); 알코올 중독 (예컨대, 알코올성 소뇌변성증, 알코올성 말추신경병증 등); 뇌졸중 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 sRAGE 분비 iPSC의 동시 투여되는 줄기세포 보호 용도를 제공한다 (실시예 14 및 도 21a 및 21b 참조). 상기 줄기세포는 sRAGE 분비 iPSC와 함께 투여되는, 생체로부터 분리된 다른 줄기세포일 수 있다. 보다 구체적으로, sRAGE 분비 iPSC를 포함하는 줄기세포 보호용 조성물을 제공한다. 다른 예는 분리된 sRAGE 분비 iPSC를 분리된 줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 보호 방법을 제공한다. 상기 공동배양은 in vitro로 수행되는 것일 수 있다. 다른 예는 통상의 줄기세포 치료제 및 sRAGE 분비 iPSC를 포함하는 병용 투여용 조성물을 제공한다. 다른 예는 줄기세포 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 줄기세포 치료제와 sRAGE 분비 iPSC를 함께 투여하는 단계를 포함하는, 줄기세포 치료 방법을 제공한다. 상기 줄기세포 치료제와 sRAGE 분비 iPSC는 동시에 또는 순서와 무관하게 순차적으로 투여될 수 있다. 상기 줄기세포 보호 효과는 AGE-알부민 축적에 의한 손상으로부터 줄기세포를 보호하는 효과일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:

상기 환자는 퇴행성 신경질환 및/또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유동물 또는 상기 포유동물로부터 분리된 세포 (뇌세포 또는, 심근 또는 심혈관 세포) 또는 조직 (뇌조직 또는 심장조직) 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 퇴행성 신경질환 및/또는 심혈관 질환을 앓고 있는 인간 또는 이로부터 분리된 뇌세포, 뇌조직, 심근 또는 심혈관 세포, 심장 조직, 또는 이들의 배양물 중에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 유효성분인 sRAGE를 분비하는 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 다양한 투여 경로로 투여 대상에게 투여될 수 있으며, 예컨대, 퇴행성 신경질환 환자의 병변 부위(예컨대, 뇌, 심장 (심근, 심혈관 등) 등)에 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 투여되거나, 혈관투여 (정맥투여 또는 동맥투여), 등의 투여 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 사용량은 치료 대상의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 암의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성, 및 상기 특정한 치료제에 대한 감수성에 의존적일 수 이 있으며, 이를 고려하여 적절히 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 줄기세포는 퇴행성 신경질환 환자의 체중 1 kg당 1x10³ ~ 1x10⁹개, 예컨대, 1x10⁴ ~ 1x10⁹개, 1x10⁴ ~ 1x10⁸개, 1x10⁵ ~ 1x10⁷개 또는 1x10⁵ ~ 1x10⁶개의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 sRAGE는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물 유래의 sRAGE일 수 있으며, 일 예에서, 인간 sRAGE 단백질 (GenBank Accession Nos. NP_001127.1 (유전자: NM_001136.4) [Q15109-1], NP_001193858.1 (유전자: NM_001206929.1) [Q15109-6], NP_001193861.1 (유전자: NM_001206932.1) [Q15109-7], NP_001193863.1 (유전자: NM_001206934.1) [Q15109-4], NP_001193865.1 (유전자: NM_001206936.1) [Q15109-9], NP_001193869.1 (유전자: NM_001206940.1) [Q15109-3], NP_001193883.1 (유전자: NM_001206954.1) [Q15109-8], NP_001193895.1 (유전자: NM_001206966.1) [Q15109-3], NP_751947.1 (유전자: NM_172197.2) [Q15109-2] 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

배아줄기세포 (embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.

유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다.

전발생세포 (progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.

성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대 (탯줄), 제대혈(탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경 등에서 추출한 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell), 신경줄기세포 (neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.

일 예에서, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)일 수 있다. 중간엽줄기세포는 중간엽기질세포 (mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포 (osteoblasts), 연골모세포 (chondrocytes), 근육세포 (myocytes), 지방세포 (adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 태반 (placenta), 재대(umbilical cord), 제대혈 (umbilical cord blood), 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육 (adult muscle), 각막 기질 (corneal stroma), 젖니의 치아 속질 (dental pulp) 등과 같은 비골수 조직 (non-marrow tissues) 등으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다.

상기 sRAGE를 분비하는 줄기세포 (이하, sRAGE-분비 줄기세포)는 인간 유래의 sRAGE-분비 중간엽 줄기세포 (이하, 인간 sRAGE-분비 중간엽 줄기세포(MSC)), 인간 유래의 sRAGE-분비 유도만능 줄기세포 (이하, 인간 sRAGE-분비 유도만능줄기세포(iPSC)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 중간엽줄기세포는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 제대 중간엽줄기세포 또는 제대혈 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 sRAGE-분비 줄기세포는 sRAGE 암호화 유전자가 줄기세포의 유전체에 삽입된 줄기 세포, 예컨대 중간엽 줄기세포 또는 유도만능 줄기세포일 수 있다.

일 예에서, 상기 sRAGE 암호화 유전자는 상기 줄기세포의 유전체 중의 세이프 하버 (safe harbor) 유전자 부위에 삽입된 것일 수 있다. 세이프 하버 유전자는 이 부분의 DNA가 손상 (절단, 및/또는 뉴클레오타이드의 결실, 치환, 또는 삽입 등)되어도 세포 손상을 유발하지 않는 안전한 유전자 부위를 의미하는 것으로, 예컨대, AAVS1 (Adeno-associated virus integration site; 예컨대 인간 염색체 19(19q13)에 위치하는 AAVS1 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 sRAGE 암호화 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입 (도입)은 동물 세포의 유전체 내로의 유전자 도입에 통상적으로 사용되는 모든 유전자 조작 기술을 통하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 유전자 조작 기술은 표적 특이적 뉴클레아제를 사용하는 것일 수 있다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 앞서 설명한 바와 같은 safe harbor 유전자 부위를 표적으로 하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 표적 특이적 뉴클레아제는, 유전자 가위 (programmable nuclease)라고도 불리며, 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단 (단일가닥 절단 또는 이중가닥 절단)할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제)를 통칭한다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.

예컨대, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는

유전체 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease);

징크-핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease);

메가뉴클레아제 (meganuclease);

미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대, Cas 단백질 (예컨대, Cas9 등), Cpf1, 등);

아고 호몰로그 (Ago homolog, DNA-guided endonuclease)

등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 표적 특이적 뉴클레아제는 원핵 세포, 및/또는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포 (예컨대, 진핵 세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라, 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데, 이 과정에 소망하는 변이를 표적 위치에 도입할 수 있다.

상기 메가뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 자연-발생 메가뉴클레아제일 수 있고 이들은 15 - 40 개 염기쌍 절단 부위를 인식하는데, 이는 통상 4 개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리, 및 HNH 패밀리. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-SceI, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-Ppol, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다.

자연-발생 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터 유래하는 DNA 결합 도메인을 이용하여 식물, 효모, 초파리 (Drosophila), 포유동물 세포 및 마우스에서 위치-특이적 게놈 변형이 촉진되었으나, 이런 접근법은 메가뉴클레아제 표적 서열이 보존된 상동성 유전자의 변형 (Monet et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88-93)으로, 표적 서열이 도입되는 사전-조작된 게놈의 변형에는 한계가 있었다. 따라서, 의학적으로나 생명공학적으로 관련된 부위에서 신규한 결합 특이성을 나타내도록 메가뉴클레아제를 조작하려는 시도가 있었다. 또한, 메가뉴클레아제로부터 유래하는 자연-발생된 또는 조작된 DNA 결합 도메인이 이종성 뉴클레아제 (예, FokI)로부터 유래하는 절단 도메인에 작동 가능하게 연결되었다.

상기 ZFN은 선택된 유전자, 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 상기 ZFN은 징크-핑거 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 인공적인 제한효소일 수 있다. 여기서, 징크-핑거 DNA 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작된 것일 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416이 본 명세서 참고자료로서 포함될 수 있다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.

표적 서열의 선택, 융합 단백질 (및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성은 당업자에 공지되어 있으며, 참고자료로 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987의 전문에 상세하게 설명되며, 상기 공개특허의 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다. 또한, 이러한 참고문헌 및 당업계의 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5 개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 6 개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국등록특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

또한, ZFN과 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 부분 (절단 도메인, 절단 하프-도메인)을 포함한다. 주지된 대로, 예를 들면 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인과 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제나 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

유사하게, 절단 하프-도메인은, 상기 제시된 바와 같이, 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우, 일반적으로 2 개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안으로, 2 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수도 있다. 2 개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한, 2 개의 융합 단백질의 표적 부위는, 2 개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단-하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써, 절단 하프-도메인이, 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 일 구현예에서, 3 - 8 개 뉴클레오티드 또는 14 - 18 개 뉴클레오티드에 의해 표적 부위의 이웃 가장자리가 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2 개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예, 2 내지 50 개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며, DNA에 서열-특이적으로 결합하여(표적 부위에서), 바로 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소 (예, Type IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리 가능한 결합과 절단 가능한 도메인을 가진다. 예를 들면, Type IIS 효소 FokI은 한 가닥 상의 인식 부위로부터 9 개 뉴클레오티드에서 그리고 나머지 한 가닥 상의 인식 부위로부터 13 개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 따라서, 한 구현예에서, 융합 단백질은 최소 1 개의 Type IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)과 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인 (조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는)을 포함한다.

"TALEN"은 DNA의 타켓 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 가리킨다. TALEN은 TALE 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 가리킨다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 뉴클레아제" 및 "TALEN"이라는 용어는 호환이 가능하다. TAL 이펙터는 크산토모나스 (Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 Ⅲ 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다. 따라서, TALE은 게놈 엔지니어링의 도구를 위한 신규 플랫폼이 될 수 있을 것으로 여겨진다. 다만 게놈-교정 활성을 갖는 기능 TALEN을 제작하기 위해서 다음과 같이 현재까지 알려지지 않았던 소수의 주요 매개변수가 정의되어야 한다. i) TALE의 최소 DNA-결합 도메인, ii) 하나의 타켓 영역을 구성하는 2 개의 절반-자리 사이의 스페이서의 길이, 및 iii) FokI 뉴클레아제 도메인을 dTALE에 연결하는 링커 또는 융합 접합 (fusion junction).

본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 보다 구체적으로는 1 내지 30 개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 도메인" 및 "TALE 도메인"이라는 용어는 호환가능하다. 상기 TALE 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALEN과 관련하여 국제공개특허 WO/2012/093833호 또는 미국공개특허 2013-0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.

일 예에서, 상기 sRAGE 암호화 유전자의 줄기세포 유전체 내로의 삽입 (도입)은 표적 특이적 뉴클레아제(CRISPR에서 유래한 RGEN)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는,

(1) RNA-가이드 뉴클레아제 (또는 이의 코딩 DNA, 또는 상기 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및

(2) 표적 유전자 (예컨대, AAVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor) 위치)의 표적 부위 (예컨대, AAVS1과 같은 세이프 하버 (safe harbor) 유전자 내의 연속하는 15 내지 30, 17 내지 23, 또는 18 내지 22 개의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 부위)와 혼성화 가능한 (또는 상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA (또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터)

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 표적 특이적 뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델 (insertion and/or deletion, Indel)을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질(CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) associated protein 9)), Cpf1 단백질 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 등과 같은 타입 Ⅱ 및/또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro)에서 전사된(transcribed) 것일 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는, 생체(세포) 외에서 또는 생체(세포) 내 전달 후, 가이드 RNA에 결합된 리보핵산-단백질 복합체를 형성(RNA-Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 작용할 수 있다.

Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있는 단백질이다.

Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas 단백질은,

스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질 (예컨대, SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1));

캄필로박터 속, 예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

스트렙토코커스 속, 예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;

파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 예컨대, 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질;

프란시셀라 (Francisella) 속, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질

등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 20bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C 또는 T임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNRYAC-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNAGAAW-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNNNGATT-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-NNGRR(T)-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

Cpf1 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracrRNA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한, 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.

예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Paceibacter, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .

엔도뉴클레아제로 Cpf1 단백질이 사용되는 경우, 상기 PAM 서열은 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임)이고, 상기 절단되는 염기서열 부위(타겟 부위)는 타겟 유전자 내의 5'-TTN-3' 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 23bp, 예컨대, 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위일 수 있다.

상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 in vitro에서 미리 전사된 mRNA 또는 미리 생산된 단백질 형태, 또는 표적 세포 또는 생체 내에서 발현하기 위하여 재조합 벡터에 포함된 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)는 재조합 DNA(Recombinant DNA; rDNA)에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 표적 특이적 뉴클레아제를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 코딩 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 상기 표적특이적 뉴클레아제는 변이된 형태의 변이 표적특이적 뉴클레아제일 수 있다. 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같은 표적특이적 뉴클레아제의 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 적어도 뉴클레아제의 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적특이적 뉴클레아제가 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질 (SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1); 서열번호 4)인 경우, 상기 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 예컨대, 서열번호 4의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 서열번호 4의 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

다른 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질과 상이한 PAM 서열을 인식하도록 변이된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 4) 중,

(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;

(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는

(3) (1)과 (2) 잔기 모두

에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자 내의 표적 부위 내의 특이적인 염기 서열 (표적서열)에 혼성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며, 생체 외 (in vitro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 결합하여 이를 표적 유전자 (또는 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다.

상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 뉴클레아제의 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.

예컨대, 상기 가이드 RNA는,

표적 서열과 혼성화 가능한 부위 (표적화 서열)을 포함하는 CRISPR RNA (crRNA);

Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 상호작용하는 부위를 포함하는 trans-activating crRNA (tracrRNA); 및

상기 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위 (예컨대, 표적화 서열을 포함하는 crRNA 부위 및 뉴클레아제와 상호작용하는 tracrRNA의 부위)가 융합된 형태의 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며,

구체적으로 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA (dual RNA), 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위를 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.

상기 sgRNA는 표적 유전자 (표적 부위) 내의 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 내의 표적서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조, 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5'에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분 및 표적 DNA의 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.

예컨대, Cas9 단백질은 표적 유전자 교정을 위하여 두 개의 가이드 RNA, 즉, 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 Cas9 단백질와 상호작용하는 trans-activating crRNA (tracrRNA; Cas9 단백질과 상호작용함)를 필요로 하며, 이들 crRNA와 tracrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA) 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, sgRNA는 적어도 상기 crRNA의 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA 일부 또는 전부와 상기 Cas9의 tracrRNA의 Cas9 단백질와 상호작용하는 부위를 적어도 포함하는 tracrRNA 일부 또는 전부가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때 뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당할 수 있음).

상기 가이드 RNA, 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA는 표적 유전자 내 표적 서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하며, crRNA 또는 sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5' 말단에 하나 이상, 예컨대, 1-10개, 1-5개, 또는 1-3개의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 상기 뉴클레아제가 Cpf1인 경우, 상기 가이드 RNA는 crRNA을 포함하는 것일 수 있으며, 복합체를 형성할 Cpf1 단백질 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.

상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 뉴클레아제 (Cas9 또는 Cpf1)의 종류 (즉, 유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.

일 예에서, 표적특이적 뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:

상기 일반식 1에서,

N_cas9는 표적화 서열, 즉 표적 유전자(target gene)의 표적 부위(target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (표적 부위의 표적 서열과 혼성화 가능)이며, l은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 15 내지 30, 17 내지 23, 또는 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고,

상기 표적화 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA) (서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,

X_cas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 예에서, 상기 X_cas9는 UGCUGUUUUG (서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:

상기 일반식 2에서,

60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC) (서열번호 3)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,

Y_cas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

또한, sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서, crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.

일 예에서, sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:

상기 일반식 3에서, (N_cas9)_l는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.

상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif 서열(S. pyogenes Cas9의 경우, 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17개 내지 약 23개 또는 약 18개 내지 약22개, 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.

상기 가이드 RNA의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열(5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥) 또는 이의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.

다른 예에서, 표적 특이적 뉴클레아제가 Cpf1 시스템인 경우, 가이드 RNA (crRNA)는 다음의 일반식 4로 표현될 수 있다:

상기 일반식 4에서,

n1은 존재하지 않거나, U, A, 또는 G이고, n2는 A 또는 G이고, n3은 U, A, 또는 C이고, n4는 존재하지 않거나 G, C, 또는 A이고, n5는 A, U, C, G, 또는 존재하지 않고, n6은 U, G 또는 C이고, n7은 U 또는 G이며,

Ncpf1는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열로서 표적 유전자의 표적 서열에 따라서 결정되며, q는 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로, 15 내지 30의 정수일 수 있다. 상기 표적 유전자의 표적 서열 (crRNA와 혼성화 하는 서열)은 PAM 서열 (5'-TTN-3' 또는 5'-TTTN-3'; N은 임의의 뉴클레오타이드로서, A, T, G, 또는 C의 염기를 갖는 뉴클레오타이드임)의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 (예컨대, 연속하는) 15 내지 30개의 표적 유전자의 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.

상기 일반식 4에서 5' 말단에서 카운팅하여 6번째부터 10번째까지의 5개의 뉴클레오타이드 (5' 말단 스템 부위)와 15번째 (n4가 존재하는 경우 16번째)부터 19번째 (n4가 존재하는 경우 20번째)까지의 5개 뉴클레오타이드(3' 말단 스템 부위)은 서로 역평행 (antiparallel)하게 상보적 뉴클레오타이드로 이루어져 이중 가닥 구조 (스템 구조)를 형성하고, 상기 5' 말단 스템 부위와 3' 말단 스템 부위 사이의 3 내지 5개 뉴클레오타이드가 루프 구조를 형성할 수 있다.

상기 Cpf1 단백질의 crRNA (예컨대, 일반식 4로 표현됨)는 5' 말단에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

Cpf1 유래 미생물에 따라 사용 가능한 Cpf1 단백질의 crRNA 서열의 5' 말단 부위 서열 (타겟팅 서열 부위 제외한 부분)을 표 1에 예시적으로 기재하였다:

(-: 뉴클레오타이드가 존재하지 않음을 의미)

본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열 (표적 서열)과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용되며, 상기 서열 상동성은 통상적인 서열 비교 수단 (예컨대 BLAST)를 사용하여 확인될 수 있다).

상기 방법에서, 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9 단백질)의 세포 내로의 형질도입은 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 통상적인 방법 (예컨대, 전기천공 등)으로 직접 세포에 도입하거나, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자(또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 염기서열 상동성을 갖는 유전자)를 하나의 벡터 또는 각각 별개의 벡터 (예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 등)에 포함된 상태로 세포에 도입하거나, mRNA delivery를 통하여 수행할 수 있다.

일 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련(adenoassociated) 바이러스 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이(Sendai), 알파바이러스(alphavirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 Cas9 단백질 암호화 핵산 분자, 가이드 RNA 암호화 핵산 분자, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 바이러스벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들을 사용하여 세포 내로 전달될 수 있으며, 세포의 핵내 전달을 위하여, 상기 Cas9 단백질 및/또는 가이드 RNA는 적절한 핵 위치호 신호 (nuclear localization signal)를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 타겟 부위의 "절단(cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 covalent backbone의 파손(breakage)을 의미한다. 절단은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이외의 다양한 여러 가지 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 단일-가닥의 절단 및 이중-가닥의 절단 모두 가능하며, 이중-가닥의 절단은 두 개의 구별되는(distinct) 단일-가닥의 절단의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 절단은 blunt ends 또는 staggered end를 생성할 수 있다.

파킨슨병 (Parkinson's disease, PD)은 신경계의 진행성 퇴행성 질환이며 신경세포 사멸에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 본 명세서에서는 PD에서의 신경세포 사멸의 메커니즘을 밝히고, PD 동물 모델에서 sRAGE를 분비하는 줄기세포 (예컨대, 인간 제대혈 유래 줄기세포 (human Umbilical Cord Blood derived Mesenchymal Stem cells; hUCB-MSCs))가 신경세포 사멸 및 행동 장애 회복에 대하여 효과를 가짐을 확인하였다. 본 명세서에서 제공되는 일 실시예에서, sRAGE를 분비하는 hUCB-MSCs를 로테논 (rotenone)에 의하여 유도된 PD 동물 모델의 선조체(Corpus Striatum)에 이식한 후, 행동 검사, 형태학적 분석, 및 면역조직화학적 실험을 통하여 신경세포 사멸 감소 및 운동 회복 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이러한 결과는 sRAGE를 분비하는 줄기세포의 PD를 포함하는 신경퇴행성 질환에 대한 증상 완화(개선), 진행 억제, 및/또는 치료 효과를 제안하는 것이다. sRAGE를 분비하는 줄기세포는 sRAGE의 지속적인 분비에 따른 효과와, 이에 더하여 줄기세포 (예컨대, UCB-MSC) 자체의 뇌 영역 (예컨대, 선조체 영역)에서의 신경세포 사멸 억제 (신경 세포 보호) 효과가 서로 상승 작용을 나타내어, 보다 우수한 신경 퇴행성 질환 치료 효과를 얻을 수 있다.

sRAGE는 막통과 도메인(transmembrane domain)을 제외하고 RAGE과 동일한 단백질의 가용성 형태이다. sRAGE의 활성 부위는 RAGE와 동일하기 때문에, sRAGE는 AGE 또는 S100 등과 같은 특정 리간드에 결합할 수 있고, 표적 세포에서의 리간드와의 결합에 있어서 RAGE와 경쟁할 수 있다.

AGE-RAGE 관련성

많은 문헌에서 RAGE의 리간드가 표적 세포의 RAGE에 결합하면 apoptosis 상태가 되어 세포 사멸이 진행된다는 보고가 있다. AGE-알부민이 RAGE와 결합하면 RAGE가 활성화되고 세포 사멸과 관련된 유전자 발현이 증가한다. 이것은 뇌뿐만 아니라 다른 장기에서도 일어난다. AGE-RAGE 결합은 다양한 세포 유형에서 세포 사멸에 결정적 원인이 된다. 따라서 AGE-RAGE 결합을 방지하여 세포를 세포 사멸로부터 보호할 수 있다.

sRAGE 분비 UCB-MSC의 제작

sRAGE를 분비하는 줄기세포 (예컨대, UCB-MSC, iPSC 등)는 많은 장점을 갖는다. sRAGE 단백질이 세포에서 분비되는 경우, 그 분비 수준이 지속적으로 유지되고, 주입 부위의 정상 재조합 단백질과 비교하여 지속 기간이 길어진다. 또한, 이와 같이 sRAGE 단백질을 분비하는 세포로서 줄기세포를 채용하는 경우, 분비된 sRAGE는 주입부의 주변 부위에서 줄기세포와 함께 상승 효과를 발휘하여 보다 많은 이점을 나타낼 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 sRAGE 분비 세포에 적용하기에 가장 적합한 후보 세포 중 하나이다.

일 구체예에서, PD 치료를 위하여, sRAGE 분비하는 줄기세포는 sRAGE 분비 UCB-MSC 또는 iPSC 등 일 수 있으며, 이 경우, sRAGE 분비 수준이 가장 높은, sRAGE 암호화 유전자로 형질감염 후 첫 번째 계대(passage)의 UCB-MSC 또는 iPSC 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

The AGE-RAGE 관련성; 알츠하이머병(AD), 알코올 중독, 및 PD

PD 동물 모델은 CS 영역에서 높은 AGE 형성 수준을 보이며, 이와 같은 높은 AGE 형성은 AGE-RAGE 결합에 의한 세포 사멸을 유발할 수 있다. 본 명세서에서는, sRAGE 또는 sRAGE 분비 UCB-MSC (또는 sRAGE 분비 iPSC)를 처리한 동물 모델의 행동 시험(rotarod 및 the pole tests)에서 회복 결과를 확인하였다. 특히, sRAGE 또는 sRAGE 분비 UCB-MSC 투여군에서 AGE-RAGE 결합 차단 효과가 우수하였으며, 이에 의하여 sRAGE 또는 sRAGE 분비 UCB-MSC는 세포 자멸사로부터 신경세포를 보호하는 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 특히 sRAGE 또는 sRAGE 분비 UCB-MSC를 투여한 PD 동물모델의 CS 및 SN 영역에서의 신경 세포의 수가 대조군 PD 동물모델 (sRAGE 또는 sRAGE 분비 UCB-MSC 비투여군)보다 많음을 확인하여, 신경세포 자멸사에 대한 보호 효과를 확인하였다.

신경세포 사멸에 대한 보호효과의 기초가 되는 메커니즘

미토겐-활성화 단백질 키나아제 (Mitogen-Activated Protein Kinase)

미토겐-활성 단백질 키나아제 (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)는 진핵 생물에서만 발견되는 단백질 키나아제로, 기본 상태인 비활성 상태로 유지되다가, 활성화될 필요가 있을 때, 활성화 루프에서 인산화된다. PD 배후의 주요 신호 경로를 확인하기 위하여 다음과 같은 전형적인 MAPK들을 관찰하였다: ERK1/2, JNK, p38 및 이들의 인산화된 형태. 관찰 결과, p38, Erk1/2 및 JNK 단백질은 세포 사멸 메커니즘에 기여하는 것으로 확인되었고, 따라서, 이들 단백질은 PD 진행 경로에 관여하는 것으로 추정할 수 있다.

Bax

AGE-RAGE 의존 경로에 대한 sRAGE의 효과를 시험하기 위하여, Bax를 관찰하였다. 세포에 AGE-알부민을 처리시, Bax의 발현이 증가되었다. 그러나, sRAGE가 AGE-알부민과 함께 처리된 경우, Bax의 발현 수준은 약간 감소하였으며, 이는 sRAGE가 AGE-RAGE 결합을 차단함으로써 세포를 세포사멸(apoptosis)로부터 보호함을 의미한다.

한편, sRAGE 단백질은 체내 반감기가 있기 때문에 파킨슨병을 치료에 한계를 갖는다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 본 발명에서는 sRAGE를 분비하는 줄기세포 (예컨대, UCB-MSC 또는 iPSC 등)을 사용하여 지속적인 분비가 가능하도록 한다.

트랜스펙션된 UCB-MSC로부터의 sRAGE 분비 수준은 첫 번째 계대에서 가장 높게 나타났으며, 그 이후 계대에서 다소 감소하는 경향을 나타내었다. PD 동물 모델에서의 세포 이식은 정위 수술 (stereotaxic surgery)에 의해 수행되었다. PD 동물 모델의 행동 능력은 로타로드(rotarod) 및 폴 테스트(pole test)로 시험하였다. 이러한 행동 능력시험 결과, sRAGE 분비 줄기세포 투여군에서 미투여 PD군과 비교하여 운동 능력이 유의하게 개선되었음을 확인하였다. 또한 조직학적 분석 결과, sRAGE 분비 줄기세포가 선조체의 선조세포의 세포사에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다.

이러한 보호 활성과 관련된 메커니즘을 확인하기 위하여, PD의 주요 신호 전달 경로에서 단백질 발현 수준을 관찰하였다. 특히, MAPK 단백질과 그 인산화 된 형태의 발현 수준을 관찰하였다. 그 결과, 신경 세포 사멸의 주요 경로가 MAPK 경로 중의 p38, Erk1/2, 및 JNK와 관련있는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에 따른 심근 또는 근육세포사 유도 저해는 단핵식세포계 세포 내에시 AGE-알부민의 합성 또는 분비를 저해하여 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포의 세포사 (cell death) 유도를 저해하는 것을 특징으로 한다.

상기 세포사는 크게 괴사(necrosis)와 아폽토시스(apoptosis)로 나뉜다. 괴사는 화상, 타박, 독극물 등의 자극에 의해 일어나는 세포의 죽음으로, 일명 세포의 사고사라고 할 수 있다. 괴사의 경우에는 세포 밖에서 수분이 유입됨으로써 세포가 팽창하여 파괴된다. 종래에는, 세포의 죽음을 모두 괴사라고 생각하였다. 그러나, 최근 30여년 사이에 세포에는 자발적인 죽음을 일으키는 유발인자가 있다는 사실이 알려졌다. 유전자에 제어되는 이와 같은 능동적인 세포의 죽음이 아폽토시스이다. 괴사가 오랜 시간에 걸쳐 무질서하게 일어나는데 반해, 아폽토시스는 단시간에 질서있게 일어난다. 아폽토시스는 세포가 축소되면서 시작된다. 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는 DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화된다. 마지막에 세포 전체도 단편화되어 아롭토시스 소체로 된 후 가까이에 있는 세포에게 먹힘으로써 죽음에 이르게 된다. 아폽토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다. 동물의 몸 안에서 일어나는 발생, 분화의 과정에서 유전적인 프로그램에 의해 일어나는 세포사를 예정된 세포사(PCD; programed cell death)라고 한다. 예정된 세포사는 발생의 어느 단계에서 치사 유전자가 움직이기 시작하여 그 세포가 죽은 경우 등이다. 사람의 경우에는 태아의 초기에 손이나 발은 주걱 모양을 하고 있어 발가락이나 손가락 사이가 벌어지지 않고 있다가 후기에 그 사이에 해당하는 부분에 있던 세포가 예정된 세포사 단계를 거침으로써 손가락이나 발가락의 형태가 생긴다. 퇴행성 질환은 상기 두 가지 형태의 세포를 동반한다고 알려져 있다.

상기 세포사는 세포는 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포가 바람직하며, 상기 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포는 심근세포등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 AGE-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해는 알부민 siRNA, 알부민 항체, AGE 항체, AGE-알부민 항체 및 AGE-알부민 합성 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 이용하여 저해될 수 있다.

본 발명은 항체의 한 종류인 sRAGE(soluble Receptor for AGE)가 지속적으로 분비되어, AGE-알부민의 독성 기능을 저해시킬 수 있는 sRAGE 분비 줄기세포를 제작하고, 이를 이용하여 심근 또는 근육세포의 사멸을 예방하고 심근경색 등의 심혈관 질환을 치료하는 것을 특징으로 한다.

만성 상태가 지속될 때, CS에서의 AGE-RAGE 의존적 세포 사멸이 PD의 신경 퇴화에 기여한다. sRAGE는 AGE-RAGE 결합을 방지하여 신경 세포의 세포 사멸을 방지한다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 sRAGE를 분비하는 줄기세포는 PD 등의 퇴행성 신경질환에 대한 매우 유효한 치료 방법 중 하나일 수 있다.

또한, AGE-알부민은 심근경색 또는 하지허혈 모델의 대식세포에서 합성 및 분비되며, AGE-알부민의 합성 및 분비가 산화적 스트레스에 의한 것이고, 세포사를 유도한다. 따라서, 본 발명의 sRAGE 분비 줄기세포는, 심근경색, 하지허혈 등의 심혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 pZDonor-AAVS1 퓨로마이신 벡터의 개열지도 (A) 및 sRAGE 코딩 서열의 삽입 상태를 예시적으로 보여주는 모식도(B)이다.
도 2는 표적 유전자 transfection과 CRISPR/Cas9 RNP를 이용한 유전자 삽입 메커니즘을 보여주는 모식도이다.
도 3은 UCB-MSC로부터의 sRAGE 단백질 분비를 확인한 웨스턴블라팅 분석 결과로서, A는 sRAGE (Flag로 표지됨)로 트랜스펙션된 UCB-MSC 세포주의 조건화 배지 (Conditioned media)를 수거하여 Flag 항체로 확인한 결과이고, B는 A 에서 측정된 강도를 Image J software로 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 대조군 (정상 미처리군), PD군 (미처리 PD 동물모델), sRAGE 처리군 (sRAGE 처리된 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC 처리군 (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)에 대하여, 동물 행동을 시험하기 위한 Rotarod 테스트에서 측정한 유지시간(maintaining time, 단위: 초) 결과를 보여준다 (student T-test (p<0.05)).
도 5는 대조군 (정상 미처리군), PD (미처리 PD 동물모델), sRAGE 처리군 (sRAGE 처리된 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC 처리군 (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)에 대하여, 동물 행동을 시험하기 위한 pole test에서 측정한 유지시간(maintaining time, 단위: 초) 결과를 보여준다 (student T-test (p<0.05)).
도 6은 Cresyl violet 염색에 의하여 대조군 (정상 미처리군), PD군 (미처리 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC 처리군 (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)의 SN 영역에서의 신경 세포(neuronal cell)의 population 변화를 보여주는 것으로, A는 Cresyl violet 염색 결과를 보여주는 이미지이고 (Bar= 100 um), B는 image J software에서 계수된 신경 세포의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Cresyl violet 염색에 의하여 대조군 (정상 미처리군), PD군 (미처리 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC 처리군 (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)의 CS 영역에서의 신경 세포(neuronal cell)의 population 변화를 보여주는 것으로, A는 Cresyl violet 염색 결과를 보여주는 이미지이고 (Bar= 100 um), B는 image J software에서 계수된 신경 세포의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 대조군 (정상 미처리군), PD (미처리 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)의 Striatum에서의 AGE (green) 및 Iba-1 (red, activated microglial cell marker)의 이중 면역염색에 의하여 AGE 및 활성화된 미세아교 세포의 분포를 보여주는 형광이미지로서, AGE 및 활성화된 미세아교 세포의 공동위치화 (co-localization)를 보여주며, 병합된 이미지는 AGE 및 Iba1이 주로 PD (rotenone treated mouse brain)의 striatum 영역에 위치함을 보여준다 (Scale bar: White = 50 um, Yellow = 20 um).
도 9는 HT22 세포 (neural cell lines)에 AGE-알부민 처리군 (AA), AGE-알부민/sRAGE 동시 처리군 (AA-sRAGE), 및 미처리군 (대조군)의 세포 생존률을 MTT 분석으로 측정한 결과를 보여주는 결과로서, sRAGE 처리에 의하여 AGE-알부민 결합이 저해됨을 보여준다 (세포의 생존율은 대조군의 결과를 100%으로 한 상대값으로 나타냄; MTT 분석은 570 nm 파장에서 수행됨).
도 10은 대조군 (정상 미처리군), PD군 (미처리 PD 동물모델), sRAGE 처리군 (sRAGE 처리된 PD 동물모델), 및 sRAGE UCB-MSC 처리군 (sRAGE 분비 UCB-MSC 처리된 PD 동물모델)의 CS 영역으로부터 수집된 MAPK 단백질의 수준을 웨스턴블라팅으로 분석한 결과를 보여준다 (standard protein: 베타-엑틴).
도 11a 및 11b는 심근경색 동물 렛트 모델에서 대식세포의 증가와 심근세포의 사멸이 동시에 증가함을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 11a는 대식세포 증가를 보여주는 사진 (위)과 이를 정량화한 그래프 (아래)이고, 11b는 심근세포의 사멸 정도를 보여주는 사진 (위)과 이를 정량화한 그래프 (아래)이다.
도 12은 심근경색 동물 렛드 모델의 심장조직에서 대식세포의 주변에서 AGE-알부민의 합성 및 분비량의 변화를 항체를 이용하여 면역조직화학염색를 시행한 후 확인한 결과이다.
도 13은 인간 대식세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 저산소환경의 자극을 받아 증가됨을 ELISA를 통해 확인한 도이다.
도 14a는 일차 인간 심근세포에서 AGE-알부민을 투여한 후 그 수용체인 RAGE의 증가를 확인하고 여기에 sRAGE를 동시에 투여 하였을 때 RAGE가 감소함을 보여주는 형광 이미지이고, 14b는 면역블라팅 결과이며, 14b는 이때 MAPK 신호 전달계중 pSAPK/JNK와 p38의 반응이 관여함을 보여주는 그래프이다.
도 15a는 sRAGE 분비 중간엽줄기세포를 만들기 위한 벡터 구성도이고, 15b는 sRAGE 분비 중간엽줄기세포의 sRAGE의 분비를 western blotting 및 ELISA로 확인한 결과이고, 15c는 형광 염색 결과를 보여주는 형광 이미지이다.
도 16은 sRAGE 분비세포 제작용 벡터를 전달하기 위한 CRISPR/Cas9 RNP를 제작하여 Jurkat 세포에서 이입율의 증가를 확인한 결과를 보여준다.
도 17은 심근경색모델과 심근경색모델에 sRAGE-MSC를 함께 처리한 랫트의 심장조직에서 섬유화 정도를 확인하는 염색을 시행한 후 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 18a 및 18b는 하지허혈 모델에서 근육세포에서 RAGE가 증가되어 세포사가 증가됨을 확인하고 sRAGE를 투여 후 회복을 확인한 결과를 보여준다.
도 19a 내지 19c는 sRAGE를 분비하는 iPSC의 특성을 보여주는 것으로,
도 19a는 sRAGE를 분비하는 iPSC의 제작에 사용된 발현벡터의를 모식적으로 나타내고,
도 19b는 sRAGE 암호화 유전자 삽입된 pZDonor-AAVS1 벡터로 형질감염된 iPSC의 PCR 결과를 보여주는 전기영동 이미지이고,
도 19c는 sRAGE의 발현 및 분비 수준을 웨스턴블랏 및 ELISA로 확인한 결과이다.
도 20a 내지 20c는 sRAGE 분비 iPSC (sRAGE-iPSC)의 급성 심근경색에 대한 보호 효과를 보여주는 것으로, 20a는 Masson' trichrome 염색 결과를 가시화한 결과이고, 20b는 LV 단면적에서의 섬유화 영역 및 infarcted 벽 두께의 백분율을 계산한 결과를 보여주며(*,p<0.05, **,p<0.01, ***,p<0.001), 20c는 GFP, VEGF, ANG1 또는 sRAGE-iPSC 처리된 심장 조직에서의 RAGE 발현을 면역조직화학적 방법으로 측정한 결과를 보여주는 형광이미지이다.
도 21a 및 21b는 sRAGE 분비 iPSC의 줄기세포 보호 효과를 보여주는 것으로, 21a는 AGE-albumin (AA) 및 sRAGE-iPSC의 공배양 후의 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 변화를 보여주는 결과이고, 21b는 PBS 처리, AA 처리, 및 AGE-albumin 처리 후 sRAGE 분비 iPSC의 줄기세포와 공배양된 iPSCs에서의 RAGE 발현 수준을 웨스턴블라팅으로 확인한 결과이다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.

[퇴행성 신경질환(파킨슨병)에 대한 효과]

참고예

1. PD 마우스 모델의 제작

동물실험은 C57BL/6N 마우스 (20-22 gm)를 사용하여 수행하였다. 8 주령의 수컷 마우스를 무작위로 나누어 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하여 12 시간의 명주기/암주기의 온도-조절 환경 하에서 각 케이지 당 5 마리씩 사육하였다. 본 명세서에서 수행된 모든 동물실험은 CACU 동물 센터 윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다. 적합한 PD 모델을 확립하기 위해, 2개월 동안 0.5%(w/v) CMC (carboxymethyl cellulose)에 현탁시킨 rotenone (Sigma-Aldrich)을 30 mg/kg의 양으로 1일 1회 경구투여하였다. 마우스의 체중은 매주 모니터링 하였다.

2. 줄기세포 배양

PD 동물 모델에 처리될 줄기세포로서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 (UCB-MSC, Medi-post)를 선택하였다. UCB-MSC을 10%(w/v) 우태아혈청 (FBS, Gibco® Life Technologies Corp.) 및 1%(w/v) 페니실린 및 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich)이 보충된 알파-MEM 배지 (DMEM, Gibco® Life Technologies Corp.)에서 키웠다. 이 세포들을 5% CO₂, 및 가습 대기 조건 하의 37℃에 유지시켰다. UCB-MSC 배양을 위하여 100 mm² 디쉬를 사용하고, 세포를 80%의 confluence에서 옮겼다. 세포를 Trypsin ETDA (Typsin ETDA, Gibco® Life Technologies Corp)와 함께 37℃에서 5분간 배양하여 분리(detachment)하였다.

3. 가용성 RAGE (sRAGE) 분비 UCB-MSC의 제작

sRAGE를 분비하는 UCB-MSC를 제작하기 위하여, AAVS1의 safe harbor 부위를 표적으로 하도록 설계된 mRNA Zinc Finger Nuclease (Sigma-Aldrich)를 사용하여 UCB-MSC의 형질감염을 수행하였다. UCB-MSC의 형질감염은 다음 조건으로 nucleofection을 사용하여 수행하였다: two consecutive shock of 1000V, 30ms pulse width. 세포를 6 개의 웰플레이트에 각 플레이트 당 8x10⁵개씩 포함하도록 시딩하였다. 형질감염된 세포를 37℃에서 7일간 배양하여 이들 세포를 안정화시켰다. 배지는 7일간 매일 교체해주었다.

4. 정위 수술 (Stereotaxic surgery) 및 조직 준비

Rotenone의 경구 투여 후 30 일째에, 동물을 무작위로 5개 군으로 나누었다: 대조군(정상 마우스 미투여군), PD 마우스 알파-MEM 투여군, PD 마우스 sRAGE 투여군, PD 마우스 UCB-MSC 투여군, 및 PD 마우스 sRAGE 분비 UCB-MSC 투여군. 동물의 수술 전에 Zoletil 50 (Virbac)과 Rompun (Bayer Korea)이 3:1 비율로 혼합된 혼합물을 1ml/kg 양으로 복강내 투여하여 마취시켰다. 마우스를 정위 장치 (stereotaxic apparatus; Stoelting Co)에 올려 놓았다. 약물을 atlas of Paxinos and Watson (Atlas)에 따라, 우측 CS (anterior and posterior 0.4, medial and lateral 1.8, dorsal and ventral from Bregma 3.5 mm) 내로 일방 주입하였다. 약물 주입은 자동화 microinjector (kd Scientic)에 부착된 26 게이지 Hamilton 주사기를 사용하여 수행하였다. 10uM(마이크로 몰) sRAGE 3㎕를 자동화 microinjector를 사용하여 분당 1uL의 속도로 서서히 주입하였다. 그런 다음, 주사기를 서서히 제거하고 수술 상처를 봉합한 다음 항생제를 국소적으로 처리하였다. FBS 및 항생제를 포함하지 않는 alpha-MEM 배지 3㎕에서 1x10⁶ 세포를 제작하였다. 신경 세포에 대한 약물 투여 효과를 확인하기 위하여, 50ml 1xPBS로 심장을 통해 마취한 후, 4%(w/v) 파라포름알데하이드 (PFA)를 포함하는 냉각 고정액 50ml으로 관류하였다. 관류 후, 뇌를 제거하고, 4% PFA에서 5시간 동안 고정시킨 후, 20%(w/v) 수크로스 용액에서 밤새 저장하였다. 동해방지된(Cryoprotected) 뇌 블록을 저온유지장치(cryostat)에서 10㎛ 슬라이스로 절단하였다.

5. 면역 염색 (Immunostaining)

마우스 뇌의 냉동 절편을 1xPBS로 5회 세척하고, 단백질 특이적 항체와 함께 배양하였다. 정상 염소, 토끼 또는 말 혈청 (Vector laboratories)를 사용하여 항체의 비특이적 결합을 차단하였다. 4℃에서 일차항체와 하룻밤 배양 후, 시료를 1xPBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 이차항체 배양을 수행하였다. 핵의 대조염색을 위하여, 시료를 DAPI (4'6-diamino-2-phenilindole, 1㎍/ml, Sigma-Aldrich)와 함께 20초 동안 배양하였다. 1xPBS로 세척한 후, Vectashield mounting media (Vector laboratories)를 사용하여 coverslips를 글라스 슬라이드 위에 마운팅하고, LSM 710 공촛점 현미경(Carl Zeiss)으로 분석하였다.

면역 염색에 사용된 일차항체를 하기의 표 2에 열거하였다:

면역 염색에 사용된 이차항체를 하기의 표 3에 열거하였다:

6. 크레실 바이올렛 염색 (Cresyl violet staining)

마우스 뇌의 냉동 절편을 실온에서 5 분간 건조시키고, 1xPBS로 10분간 5회 세척한 다음, 다단계 에탄올에서 배양하였다 (95% 에탄올 15분, 70% 에탄올 1분, 및 50% 에탄올 1분). 증류수로 세척한 후, 뇌 조직을 0.5% cresyl violet acetate (Sigma-Aldrich) 용액에서 12분 동안 염색하고, 증류수 (1분), 50% 에탄올 (1분), 70% 에탄올 (2분), 95% 에탄올 (2회 2분), 100% 에탄올 (1분) 및 마지막으로 xylene (5분)로 세척하였다. 염색된 슬라이드를 조직학적 분서을 위한 DPX mounting medium (Sigma-Aldrich)로 마운팅하였다.

7. 웨스턴 블라팅 (Western blotting)

뇌 조직을 RIPA 용해 완충액 (AMRESCO)으로 준비하고, 1x protease inhibitor (ROCHE)를 첨가한 후, 초음파 처리하였다. 이렇게 준비된 조직을 4℃에서 20분 동안 14,000 x g로 원심분리하였다. 총 단백질 농도는 BCA (Life technologies)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다. 10%(w/v) 폴리아크릴아마이드 젤 (Life technologies)에서 동량(20㎍)의 단백질을 분리하고 PVDF 멤브레인 (Miliipore Corp.)으로 옮겼다. 단백질 특이적 항체로 단백질을 검출하였다. ECL (Animal Genetics Corp.) 검출 시약을 사용하여 멤브레인 상의 면역반응성 단백질을 가시화시켰다.

웨스턴블라팅에 사용된 일차항체를 표 4에 열거하였다:

웨스턴블라팅에 사용된 이차항체를 표 5에 열거하였다:

8. MTT 분석

HT22 세포(ATCC)를 2x10³개의 양으로 각 96 웰플레이트에 시딩하였다. 시딩 후, 세포를 AGE-알부민 (Sigma-Aldrich) (50nM)으로 12시간 동안 처리하였다. 상기 세포를 AGE-알부민 처리 전에 1시간 sRAGE (cat. RD172116100, Biovendor; 서열번호 6)(50nM)와 함께 배양한 후 12시간 배양하였다. MTT 분석(3-2,5- dipheniltetrazolium, Sigma-Aldrich)에 의하여 세포 사멸을 평가하였다. 황색 MTT 화합물은 살아있는 세포에 의해 디메틸술폭사이드 (Me₂SO)에 용해되는 청색 formazen으로 변환된다. 0.5 mg/ml MTT를 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양하고 DMSO (Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 배양 배지에서의 청색 염색 강도는 분광 광도계로 540 및 570nm에서 측정하였고, 생존 세포의 비례량(proportional amount)으로 나타냈다.

9. 행동 시험 (Behavior test)

9.1. 로타로드 시험 (Rotarod test)

가속화 로타로드 (UGO Basile Accelerating Rotarod)를 사용하는 로타로드 테스트는 마우스를 회전 드럼 (직경 3cm)에 놓고 각 동물이 로드 상에서 균형을 유지할 수 있는 지속시간을 측정하여 수행하였다. 로타로드의 속도는 15-16 rpm로 하였다.

9.2. 폴 테스트 (Pole test)

폴 테스트는 Fleming et al (Neuroscience. 2006 November 3; 142(4): 1245-1253)를 참조하여 수행하였다. 스틱을 지면에 수직으로 부착하였다 (직경 1cm, 높이 35cm). 마우스를 바닥에 면한 스틱 상단에 놓고 바닥에 도달했을 때 시간을 측정하였다. 시간 측정 전에 두 번의 training trial 시행 후 3번째 trial시의 시간을 측정하였다.

통계 분석

모든 실험 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 평가하였으며 P≤0.05를 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1: sRAGE 분비UCB-MSCs의 특성 분석

1-1. donor sRAGE vector의 구축

sRAGE (cat. RD172116100, Biovendor; 서열번호 6) 코딩 서열(GenBank Accession No. NM_001206940.1)을 준비하고, AAVS1 pZDonor 벡터 (Sigma Aldrich; 도 1의 A) 내에 통합시켰다. 상기 벡터의 길이는 5637bp이며, HA-L 및 HA-R은 상동재조합을 위해 준비되었다. 이들은 AAVS1 부위와 정확히 동일한 서열이므로, 이중가닥절단 발생 후 자연복구시스템(상동 재조합)을 촉진한다. Homologous sequence insert는 특정 유전자 서열(sRAGE 코딩 서열)을 knocking in 하기 위해 UCB-MSC의 염색체에 통합될 수 있다. Multiple Cloning Sites (MCS)는 sRAGE 코딩 서열을 AAVS1-pZDonor 벡터에 삽입하기 위한 다양한 제한 효소 부위를 갖는다.

1-2. sRAGE 분비 UCB-MSCs의 제작을 위한 플라스미드 준비

sRAGE를 분비하는 UCB-MSC (sRAGE 분비 UCB-MSCs)를 제작하기 위한 insert는 인간 EF1-alpha 프로모터, sRAGE (서열번호 6; sRAGE의 분석을 용이하게 하기 위하여 Flag 표지된 형태로 사용됨) 코딩 서열, 및 polyA 신호로 구성하였다 (도 1의 B 및 도 15a 참조). 인간 EF1-alpha 프로모터와 polyA 신호는 각각 EF1-alpha-AcGFP-C1 (Clontech) 및 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)로부터 증폭시켰다. 상기 insert는 제한효소 (EcoRI 및 NotI)를 사용하여 의해 AAVS1-pZDonor 플라스미드 내의 EcoRI 및 NotI 제한부위에 삽입하였다.

도 1은 pZDonor-AAVS1 puromycin 및 sRAGE 코딩 서열의 삽입 정보를 나타낸다.

1-3. CRISPR/Cas9 RNP를 이용한 sRAGE 코딩 유전자의 UCB-MSCs의 표적 유전자 내 도입

AAS1 유전자를 표적으로 하는 mRNA CRISPR/Cas9 RNP (ToolGen, Inc; Cas9: Streptococcus pyogenes 유래 (서열번호 4), 및 sgRNA의 AAVS1 표적 부위: 5'-gtcaccaatcctgtccctag-3' (서열번호 7))를 electroporator를 사용하여 인간 UCB-MSCs 세포 (CEFObio, Seoul, Korea) 내로 도입하였다. 세포 내로 도입된 mRNA CRISPR/Cas9 RNP는 CRISPR/Cas9 RNP 단백질이 된다. CRISPR/Cas9 RNP에 의한 유전자 편집 기술을 도 2에 모식적으로 나타내었다. 상기 sgRNA는 다음의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:

5'-(표적 서열)-(GUUUUAGAGCUA; 서열번호 1)-(뉴클레오타이드 링커)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC; 서열번호 3)-3'

(상기 표적 서열은 서열번호 7의 AAVS1 표적 부위 서열에서 "T"를 "U"로 변환한 서열이고, 상기 뉴클레오타이드 링커는 GAAA의 뉴클레오타이드 서열을 가짐).

여기에, 10㎕의 sRAGE 서열 (실시예 1-2에서 준비된 벡터 형태로 사용됨) 및 형질감염 기질 (transfect substrates)을 사용하여 다음의 조건 하에서 Nucleofection을 수행하였다; 1050 volts, pulse width 30, pulse number 2, NEON Microporator (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 사용. 10⁶ 세포를 60mm 배양 접시 (BD Biosciences, San Jose, CA)에 접종한 다음, 주사 전 7일 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 안정화시켰다. 배지는 매일 교체해주었다.

상기와 같이 준비된 AAS1 유전자 내에 sRAGE 코딩 유전자가 도입된 UCB-MSCs를 계대배양하여 1-4세대 세포 (T1, T2, T3 및 T4)를 준비하였다: Passage 1 after Transfection (T1), Passage 2 after Transfection (T2), Passage 3 after Transfection (T3), 및 Passage 4 after Transfection (T4).

1-4. sRAGE 분비 인간 UCB-MSC의 특성 분석

sRAGE 단백질이 sRAGE 분비 UCB-MSC 외로 분비되기 때문에, sRAGE 분비 수준을 세포를 배양한 conditioned medium에 대하여 웨스턴블라팅(참고예 7)을 수행하여 측정하였다. 상기 세포로부터 분비된 sRAGE 단백질은 Flag 항체를 사용하여 측정하였다.

대조군 (sRAGE 코딩 유전자가 미도입 UCB-MSC), T1, T2, T3, 및 T4에 대한 웨스턴블라팅 결과 및 밴드 강도를 Image J software로 정량화한 결과를 도 3에 나타내었다. 각 밴드의 강도는 Control, T1, T2, T3 및 T4에서 각각 0, 30174.41, 1061.7, 0 및 0으로 측정되었다. T1 강도는 T2 밴드 강도보다 28.4 배 더 높았다.

실시예 2. sRAGE 분비 UCB-MSC의 신경세포 보호 효과 및 운동 개선 효과

2-1. 로타로드 테스트 (Rotarod test)

PD 마우스의 운동 능력의 변화를 조사하기 위하여 로타로드 테스트를 수행하였다 (참고예 9.1). 그 결과를 도 4에 나타내었다. 대조군(정상 마우스), PD 마우스(미처리군), sRAGE 처리 PD 마우스, 및 sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스에서의 평균 유지시간은 각각 65.54±10.73, 29.30±13.48, 47.65±17.68 및 58.19±18.70 초였다. 도 4에서 확인되는 바와 같이. 운동 능력은 sRAGE 분비 UCB-MSC 및 sRAGE 처리 마우스에서 현저하게 증가하였으며, 특히 sRAGE 분비 UCB-MSC를 처리한 경우 정상 마우스와 유사한 정도까지의 운동 능력 회복을 보였다.

2-2. 폴 테스트 (Pole test)

동물 행동 회복을 폴 테스트로 검사하여 (참고예 9.2), 그 결과를 도 5에 나타내었다. 대조군(정상 마우스), PD 마우스(미처리군), sRAGE 처리 PD 마우스, 및 sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스 (각 그룹당 10 마리)에서의 평군 유지시간은 각각 5.00±1.20, 6.06±1.40, 4.52±1.79 및 3.56±0.44로 나타났다. 도 5에서 확인되는 바와 같이. 행동 능력 회복은 sRAGE 분비 UCB-MSC 및 sRAGE 처리 마우스에서 현저하게 증가하였으며, 특히 이들 그룹은 대조군보다 상승된 행동 능력을 나타내었다.

2-3. 마우스 뇌의 조직학적 분석

뇌의 다양한 영역에서의 세포 사멸을 조사하기 위하여, 다음의 3개 그룹의 마우스의 SN 영역 및 CS 영역에 대하여 Cresyl violet staining(참고예 6)을 수행하여 얻어진 염색 이미지 및 신경세포를 Image J software 로 계수한 결과를 도 6 (SN 영역) 및 도 7(CS 영역)에 나타내었다: 대조군 (정상 마우스), PD 마우스(미처리군), 및 sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스.

도 6(SN 영역 결과)의 A에서 신경 세포는 보라색으로 염색되었고, 각 단일점은 단일 신경 세포를 나타낸다. 도파민성 뉴런은 대부분 SN 영역에 존재하였으며, 대조군의 세포 수는 453개인 반면 PD 마우스에서는 세포 수가 127개로 감소하였고, sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스에서는 489개로 극적으로 증가하였다. 이러한 결과는 sRAGE 분비 UCB-MSC가 SN 영역에서 현저한 신경세포 보호 효과를 가짐을 나타낸다.

도 7(CS 영역 결과)의 A에서 신경 세포는 보라색으로 염색되었고, 각 단일점은 단일 신경 세포를 나타낸다. 대조군의 세포 수는 3949개인 반면 PD 마우스에서는 세포 수가 3329개로 감소하였고, sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스에서는 3822개로 극적으로 증가하였다. 이러한 결과는 sRAGE 분비 UCB-MSC가 CS 영역에서 현저한 신경세포 보호 효과를 가짐을 나타낸다.

2-4. PD 마우스 뇌의 CS에서의 미세아교세포 활성화 시험

AGE 형성과 미세아교세포(microglial cells) 활성화를 확인하기 위하여 다음의 3개 그룹의 마우스 뇌의 CS (Corpus Striatum) 영역에 면역조직화학 염색을 수행하였다 (참고예 5): 대조군 (정상 마우스), PD 마우스(미처리군), 및 sRAGE 분비 UCB-MSC 처리 PD 마우스. 상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군의 마우스 뇌에서는 AGE(녹색)가 거의 발견되지 않았지만, PD 뇌에서는 AGE 신호가 주로 CS 영역 (선조체 영역)에서 관찰되고, Iba1 (적색, 활성화된 미세아교세포 마커)도 PD 마우스의 뇌에서 주로 관찰되었으며, PD 마우스의 뇌는 striatum의 전체 영역에서 대조군 마우스의 뇌보다 높은 신호를 보였다. 이러한 결과는 PD 조건에서 더 많은 AGE가 형성되고 많은 미세아교세포가 활성화되어 있음을 보이는 것이라 할 수 있다. 도 8의 병합된 이미지는 Iba1이 PD 마우스 뇌의 striatum 영역에서 AGE와 함께 공동 위치화함을 보여준다.

2-5. sRAGE 및 sRAGE 분비 UCB-MSC의 AGE-알부민에 의한 신경세포 사멸에 대한 보호 효과 시험

신경 세포 사멸에 대한 sRAGE 및 sRAGE 분비 UCB-MSC의 보호 효과를 보이기 위하여 MTT 분석을 수행하였다 (참고예 8). CS 영역은 주로 신경 세포로 구성 되기 때문에 해마의 신경 세포 (HT22)을 다음의 3개의 군으로 준비하여 신경 세포 보호 효과를 시험하였다: 대조군 (미처리군), AGE-알부민 (50nM) 처리군 (AA), 및 AGE-알부민 (50nM) + sRAGE (50nM) 처리군 (AA+sRAGE). 상기 얻어진 MTT 분석 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, AGE-알부민이 처리된 HT22 세포(AA)에서는 세포 사멸이 유발되었고 세포의 생존률이 현저하게 감소한 반면, AGE-알부민을 sRAGE와 함께 처리한 경우 (AA+sRAGE), 세포 생존를(100.96%)이 대조군(100%)과 동등 이상인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 sRAGE 단백질이 AGE-알부민에 의한 손상으로부터 신경 세포를 보호함을 보여준다.

실시예 3: 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과의 기작 확인

3-1. MAPK pathway 시험 - p38, Erk1/2 및 JNK 단백질이 MAPK pathway에서 세포 사멸에 기여하는 주요 단백질임

PD 동물 모델에서 일어난 전반적인 기전을 단백질 발현 수준의 변화에 의해 조사하였다. PD 마우스의 CS 영역으로부터 뇌조직을 분리하고 AGE-알부민 (50nM) (AA) 또는 AGE-알부민 (50nM) + sRAGE (50nM)를 처리한 후, 웨스턴 블라팅으로 MAPK pathway 관여 단백질 발현을 시험하였다 (참고예 7). 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, JNK, p38, ERK1/2 및 이들의 인산화 형태가 검출되었으며, p38, Erk 및 JNK의 발현 수준에서 변화를 확인하였다. 이러한 결과는, PD 마우스에서의 이들 3 가지 단백질(p38, Erk 및 JNK)이 신경 세포 사멸에 기여하여 신경퇴행을 유도함을 보여준다.

3-2. Bax 시험

AGE-RAGE 의존 경로에 대한 sRAGE의 효과를 시험하기 위해, 웨스턴 블라팅을 수행하여 (참고예 7), 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 확인되는 바와 같이, Bax (apoptotic cell marker protein)가 관찰되었으며, AGE-알부민이 처리된 세포에서 Bax의 발현이 증가하였다. 그러나 sRAGE를 함께 처리한 경우, Bax의 발현 수준이 감소하였다.

[심혈관 질환에 대한 효과]

실시예 4: 심장질환 환자의 대식세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비

심근경색 또는 하지허혈모델의 대식세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비량을 확인하기 위하여 ELISA를 이용하여 AGE-알부민의 발현 양을 측정하였다.

4-1. 세포배양

in vitro 연구를 위해, 불멸화 인간 macrophage cell (RAW264.7, Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 대식 세포를 10% 열-불활성화된 FBS (fetal bovine serum, Gibco) 및 20mg/㎖의 겐타마이신(Sigma-Aldrich)이 첨가된 고농도의 글루코오스를 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)에서 성장시키고, 대식 세포를 5% CO₂, 37℃로 유지시켰다. 그 다음 대식 세포를 hypoxia 상태로 배양하였다.

4-2. 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양 측정(ELISA)

이미 합성된 알부민을 알부민 항체로 제거한 후, 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 구체적으로는, 인간 대식세포에 hypoxia 처리한 후, 세포 용해물(0.5㎍ 단백질) 및 배양 배지(0.1mg 단백질)를 이용하여 측정하였다. AGE-알부민의 양은 토끼 항-AGE 항체 (1:1000, Abcam) 및 마우스 항-인간 알부민 항체(1:800, Abcam)로 측정하였다, HRP 결합된 항-마우스 이차 항체(1:1000, Vector Laboratories)를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 가하여 발색시키고, 같은 부피의 2M H₂SO₄로 정지시켰다. 그 다음 ELISA 플레이트 리더(VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 인간 대식세포에서 심근경색 시 AGE-알부민의 합성과 분비 증가

심근경색은 오랜 기간 동안 산화적 스트레스에 의해 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서는 인간 대식세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지 확인하기 위하여, 인간 대식세포에 산화적 스트레스 유도물질인 0~1000μM의 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 후 세포 용해물을 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 또한, 인간 대식세포에 항산화제를 처리하여 AGE-알부민의 발현양이 감소하는지를 ELISA 분석을 통해 확인하였다.

결과는 도 13 에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 상기 결과에 의해, 인간 대식세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 증가 되는 것임을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 랫트의 심근경색 또는 하지허혈 모델에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치

6-1. 동물모델

무게가 250-300 g의 흰쥐(Sprague Dawley)를 준비하여 Ketamine (50 mg/kg), xylazine (4 mg/kg)의 혼합하여 마취하였다. 실험동물의 기관에 16 gauge의 catheter를 삽입하고 인공호흡기와 연결하고, 평평한 판에 눕혀서 테이프로 팔다리와 꼬리를 고정한 후에 복장뼈의 왼쪽에서 1~1.5 cm정도 피부를 세로로 절개하고 큰가슴근육(pectoralis major muscle)과 작은가슴근육 사이를 벌려 다섯 번째 갈비사이공간을 확인하고 조심스럽게 갈비사이근육을 가로로 1cm 정도 절개하였다. 다섯 번째, 여섯 번째 갈비뼈 사이에 retractor를 넣고 위아래로 벌린 후, 보통 흰쥐에서 가슴샘(thymus)가 심장 윗부분을 덮어 시야를 가리므로 angle hook 등을 이용해서 머리 쪽으로 가슴샘을 당겼다. 왼심장동맥(left coronary artery)의 형태를 관찰하여 어느 범위의 혈관가지를 묶을지 결정한 후에 폐동맥원뿔(pulmonary conus)과 왼심방귀(left atrial appendage)의 뾰족한 부분이 교차하는 선의 2~3 mm 아래에 위치하는 LAD(Left Anterior Descending artery)를 6-0 silk로 묶었다. 벌려진 다섯 번째, 여섯 번째 갈비뼈를 다시 모으고 절개했던 갈비사이근육을 MAXON 4-0 filament로 묶어준 다음 흉강에 남아있는 공기를 23 Gauge needle 주사기로 빼주어 폐가 완전히 펴질 수 있도록 하였다. 피부를 MAXON 4-0 filament를 이용하여 봉합하고, 기관삽관 하였던 튜브를 빼내고 인두에 묻어있는 점액들을 제거하였다. 수술 투에 진통제((Buprenorphine 0.025 mg/kg)를 12시간마다 피부 주사 하였다.

6-2. 면역조직화학 검사(immunohistochemistry, IHC)

정상(normal) 또는 심근경색(Acute Myocardial Infarction; AMI) 랫트의 심장조직에서 면역 조직화학을 수행하였다[S. M. Ahn et al., PLoS ONE 3, e2829 (2008)]. 정상 또는 심근경색 랫트의 심장조직을 0.1M 중성 인산염완충용액 내 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 30% 수크로오스 용액에서 밤새도록 냉동보관한 다음, 저온유지장치(cryostat, Leica CM 1900)로 10㎛ 절편을 준비하였다. 파라핀-포매 조직을 10 ㎛ 두께의 절편으로 절단하고, 자일텐에서 탈파라핀시킨 후, 일련의 등급 에탄올로 재수화하였다. 정상 염소 혈청(10%)을 사용하여 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 조직 절편을 하기 항체들 중 하나와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다: 토끼 항-AGE 항체(Abcam), 마우스 항-인간 알부민 항체(1:200, R&D System), 염소 항-Iba1 항체(1:500, Abcam). 상기 배양된 조직 절편을 PBS로 3번 세척하고, Alexa flour 633 anti-mouse IgG(l:500, Invitrogen), Alexa flour 488 anti-rabbit IgG(1:500, Invitrogen), 또는 Alexa flour 555 anti-goat IgG (1:500, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이차 항체를 PBS로 3번 세척한 후, 커버슬립을 Vectashield mounting medium(Vector Laboratories)를 사용하여 글라스 슬라이드 위에 설치하고, 레이저 공초점 형광현미경(LSM-710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.

결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 심근경색 전 또는 후의 랫트의 심장세포에서 알부민(녹색)과 AGE(적색)가 같은 위치에서 염색됨을 확인하였다. 또한, 심근경색랫트의 혈액단핵세포에서 알부민과 AGE가 넓게 분포되어 있으며, AGE-알부민의 발현양이 정상랫트보다 증가하는 것을 관찰하였다.

실시예 7: 심근경색모델에서의 수용성 RAGE(sRAGE)의 AGE-알부민 합성 억제 효과 ( in vivo )

심근경색 세포 모델에서 RAGE의 증가와 sRAGE에 의한 RAGE 감소효과를 확인하기 위하여, RAGE(적색) 및 DAPI(푸른색) 염색하여 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 심근경색 모델에서 sRAGE 단백질을 투여하기 전 또는 후세포에시 RAGE 가 증가 또는 감소함을 보여 주었다. 또한 이는 MAPK 신호 전달계의 pSAPK/JNK 및 pp38 의 영향이 가장 큰 것으로 확인 되었다.

실시예 8: 심근세포에서 AGE-알부민에 의한 세포사 유도

스트레스에 의해 활성화된 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)가 신경세포사를 유도한다고 보고되어 있다. 따라서, 본 실험에서는 일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민이 직접적으로 세포사를 유도하는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

8.1. 인간 심근세포 배양

심근 세포를 5% FBS, 5% HS (horse serum), 20㎍/㎖의 겐타마이신 및 2.5㎍/㎖의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM (배양배지)에 현탁시키고, 10cm 배양접시에 1x10⁶ cells/㎖ (10㎖)로 플레이트한 다음, 5% CO₂/95% 대기 하의 배양기에서 37℃로 유지하였다. in vitro 배양 2~3주 후, AGE-알부민으로 처리한 후 아폽토시스-관련 특성을 위해 사용하였다.

8.2. 세포생존율(MTT assay) 측정

인간 심근세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2x10³ 세포로 접종하였다. 80% 융합(confluence)에 도달한 후, 일차 인간 신경세포를 여러 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10, 20㎍/㎖)의 AGE-알부민 또는 여러 농도(0, 0.5, 1, 5, 10mg/㎖)의 알부민으로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포생존율을 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. 각 웰의 흡광도는 96-웰 플레이트 리더(VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 540nm에서 측정하였다.

결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 인간 심근세포에 AGE-알부민을 처리한 경우 AGE-알부민의 농도가 증가할수록 세포생존율이 감소하여 세포사가 유도됨을 확인하였다. 반년, 일차 인간 심장세포에 알부민을 처리한 경우 알부민의 농도에 상관없이 세포생존율이 거의 변화가 없어 세포사가 유도되지 않음을 확인하였다.

또한, 심장세포사에 대한 수용성 sRAGE의 보호 효과를 확인하기 위하여, 인간 심근세포에 sRAGE 단독, AGE-알부민 단독, 또는 sRAGE/AGE-알부민을 함께 처리한 후 측정하였다.

결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 인간 심근세포에 sRAGE와 AGE-알부민을 동시에 처리한 경우 세포생존율이 증가하여 세포사가 감소됨을 확인하였다. 따라서, sRAGE가 심근세포사에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.

실시예 9: 사람에게 적용 가능한 성장인자 분비 줄기세포 제작기술 확립

CRISPR/Cas9 RNP 을 이용한 sRAGE 분비세포 제작 기술 확립

- sRAGE 분비세포제작

우선, pZDonor vector(Sigma aldrich)에 sRAGE의 유전자 (GenBank Accession No. NM_001206940.1)이 삽입된 sRAGE 유전자를 포함하는 pZDonor 벡터를 제작하였다 (도 15a 참조). 또한, AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP ((주)툴젠)을 준비하였다 (Cas9: Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질; AAVS1 타겟으로 하는 sgRNA의 타겟팅 서열: gucaccaauccugucccuag; 전체 서열은 앞서 기재된 일반식 3 참조).

상기 준비된 AAVS1을 타겟으로하는 CRISPR/Cas9 RNP를 포함하는 벡터와 sRAGE의 유전자를 포함하는 pZDonor 벡터를 사람의 제대 중간엽줄기세포 (메디포스트)에 함께 transfection 하였다.

CRISPR/Cas9 RNP는 세포 게놈 유전자중에서 AAVS site를 절단함으로써 원하는 유전자 (즉 sRAGE 유전자)를 상기 절단 부위 사이에 삽입하게 되고, 이로써 sRAGE를 분비하는 세포가 만들어지게 된다. 상기 제작된 세포의 sRAGE 분비 여부를 웨스턴블라팅, ELISA, 및 형광면역염색(Flag)으로 시험하였으며, 그 결과를 각각 도 5b 및 도 5c에 나타내었다.

또한, 상기 준비된 CRISPR/Cas9 RNP의 유전자 교정 (Indel: 삽입 및/또는 결실) 효율을 Jurkat 세포에서 시험하여 그 결과를 도 6에 나타내었다 (none: 아무것도 없이 transfection진행; sgRNA#1: 1번 서열 target하는 guide RNA만 넣고 진행; sgRNA#2: 2번 서열 target하는 guide RNA만 넣고 진행; Sp.cas9 only: cas9 protein만 넣고 진행; aRGEN1: 1번 target하는 gRNA와 cas9단백질을 넣고 진행; aRGEN2: 2번 target하는 gRNA와 cas9 단백질을 넣고 진행; dRGEN1: 1번 target하는 gRNA와 cas9을 coding하는 plasmid를 사용하여 진행; dRGEN2: 2번서열을 target하는 gRNA와 cas9을 coding하는 plasmid를 사용하여 진행)

상기 도 15 및 16에 나타난 결과는 아래의 방법으로 얻었다:

줄기세포 및 특정물질 분비세포의 표준화 분석

- RT-PCR 분석

Trizol 용액을 이용하여 RNA를 추출한 후 olig-dT primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 42℃에서 1시간 동안 진행하고, 95℃에서 10분간 반응하여 효소활성을 정지시켰다. 확인하고자 하는 유전자의 primer를 제작한 후 PCR을 수행하였다 (프라이머: Fwd: 5'-cggaactctgccctctaacg-3'; Rev: 5'-tgaggaagagttcttgcagct-3').

- Western blot

분리된 단백질 용액의 단백질 농도를 BCA법으로 확인한 후 일정량의 단백질용액을 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동한 후 PVDF membrane으로 transfer하였다. 1차 항체 (Sigma aldrich)와 함께 4℃에서 12시간 반응시키고 반응이 끝나면 1차 항체를 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체(vector laboratories)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 ECL(Amersham)로 단백질 발현 여부를 분석하였다.

- 면역세포화학-형광염색

고정된 세포를 4℃에서 12시간동안 1차 항체와 반응시킨 후 세척하고 상온에서 1시간동안 fluorescein-conjugated goat anti-rabbit IgG와 반응시켰다. 이렇게 염색된 세포는 glass slide에 올려놓은 후 Zeiss confocal microscope로 관찰하였다.

제작된 인간 제대 유래 성장인자 분비 줄기세포의 특성 분석

- 제작된 혈관 성장인자 분비 기능성줄기세포를 배양한 후 줄기세포 특성 분석법으로 증식능과 세포표지마커(면역표현형) 및 다분화 능력 그리고 이동능 및 분비능 등에 대한 검증을 거친 후, 소정의 기준에 따라 우수한 고효능 sRAGE 분비 줄기세포를 선정하였다. 상기 선정된 sRAGE 분비 줄기세포를 sRAGE-UC-MSC로 칭하였다.

실시예 10: 심근경색모델 심근세포사에 대한 sRAGE-UC-MSC 의 보호 효과:

in vivo 실험

심근경색모델에서 심근세포사에 대한 sRAGE 의 보호 효과를 확인하기 위하여, 랫트의 심근경색모델을 제작하고 조직에 상기 실시예 6에서 선정된 sRAGE-UC-MSC를 주입한 후 (주입량: 10ul * 3번 총 30ul, 30ul 내의 총 세포 수는 1x10⁶개임), 심근세포의 수를 크레실 바이올렛 (cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타난 바와 같이, 랫트의 심장조직에 sRAGE-UC-MSC를 처리한 경우 심근경색 영역이 작아지고 섬유화 범위가 줄어들었다.

실시예 11: 하지허혈모델 근육세포사에 대한 sRAGE-UC-MSC 의 보호 효과

in vivo 실험: 동물모델 제작(Rat lower limb ischemia model)

동물은 male Balb/c-nu 마우스를 사용하였다. 동물모델 제작시 모든 환경은 깨끗하고 멸균된 장소에서 시행하였으며, N₂O:O₂=1:1 (v:v), 포란 마취제 흡입에 의하여 마취시켜 진행하였다.

마취 후, 약 2 cm가량 피부를 절개 후 3-0 surgical silk로 정확한 부위에 결찰 (iliac arteries 혹은 superficial femoral arteries와 inguinal ligament에서 5 - 6 mm 아래)한 후, Skin clip을 이용 피부를 닫아주었다.

하지허혈모델에서 하지근육세포사에 대한 sRAGE 의 보호 효과를 확인하기 위하여, 랫트의 하지허혈모델을 제작하고 조직에 sRAGE (단백질)을 주입한 후(주입량: 0.8ug의 sRAGE protein이 포함된 총 8ul 주입), 근육세포를 RAGE, TUNEL 및 a-actinin으로 염색한 후 공초점현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 18a 및 18b에 나타내었다. 도 8a (A, C: in vitro; B, D: in vivo) 및 18b에서, AA는 Age-알부민 투여군, IR은 허혈-재관류(Ischemia reperfusion) 모델군, sRAGE는 sRAGE (단백질) 투여군을 각각 의미한다.

도 18a 및 18b에 나타난 바와 같이, 마우스의 하지 조직에 sRAGE-UC-MSC를 처리한 경우 RAGE 와 TUNEL의 발현이 줄어들었다. 또 이는 pp38이 관여 함을 확인하였다.

실시예 12. sRAGE-iPSC의 제조 및 특성 시험

sRAGE를 분비하는 iPSC를 생성하기 위해, pZDonor 벡터(Sigma-Aldrich)에 인간 EF1-α 프로모터, sRAGE 코딩 서열, 및 poly A tail을 클로닝 방법으로 삽입하여 제작한 sRAGE 도너 벡터(도 1의 A 및 19a참조) 및 CRISPR/CAS9 RNP 시스템을 사용하여 iPSC의 형질감염(Transfection)을 수행하였다. 가이드 RNA는 19 번 염색체에서 AAVS1으로 알려진 safe harbor site을 표적으로 하도록 설계하였다 (Cas9: Streptococcus pyogenes 유래 (서열번호 4), sgRNA의 표적 부위: gtcaccaatcctgtccctag (서열번호 7)). 형질감염은 4D nucleofector system((Lonza)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 조건은 웹 사이트 상의 Lonza 프로토콜(cell type 'hES/H9')에 제공되어 있는 조건에 따랐다. P3 primary cell 4D nucleofector X kit L (Lonza, V4XP-3024)을 사용하여 electroporation을 수행하였다. 2x10^5개의 인간 iPSC (Korean National Stem Cell Bank)을 cas9 단백질 15ug, gRNA 20ug 및 sRAGE 도너 벡터 1ug 로 형질감염시켜서, sRAGE를 분비하는 iPSC를 제조하였다.

형질감염 3일 후에, 형질감염된 iPSC로부터 게놈 DNA를 분리하여, iPSC의 게놈 DNA에서 sRAGE의 KI(knock-in) 여부를 결정하였다. PCR 프라이머는 AAVS1 Fwd (iPSC 자체 서열) 및 Puro rev (삽입 서열) (AAVS1 FWD primer: CGG AAC TCT GCC CTC TAA CG; Puro Rev primer: TGA GGA AGA GTT CTT GCA GCT)로 준비하였다.

PCR은 56℃ 및 30cycles 조건으로 수행하고, 전기영동 후, UV광 하에서 밴드를 관찰하였다. 상기 얻어진 결과를 도 19b에 나타내었다. 도 9b는 sRAGE의 유전자가 성공적으로 AAVS1 사이트에 통합되었음을 보여준다.

sRAGE의 발현 및 분비 수준을 면역블라팅 및 ELISA로 확인하였다.

우선, 면역블라팅은 다음과 같이 수행하였다: 전체 세포 용해물을 RIPA(radio immunoprecipitation assay) lysis buffer (ATTA, WSE7420) 및 protease inhibitor cocktail (ATTA, WSE7420)에서 준비한 후 초음파 처리하였다. 상기 준비된 세포 용해물을 4℃에서 20분 동안 17,000 x g로 원심분리하고, 상등액을 수집하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동량(30㎍)의 단백질을 분리하고 200 mA에서 2시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인(Millipore)으로 옮겼다. 5% non-fat skim milk를 사용하여 실온에서 1시간 동안 비특이적 항체 결합을 차단하였다. 상기 준비된 멤브레인을 1차 단백질 특이적 항체 (Sigma, F-7425) 및 b-액틴 (Abcam, ab8227)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이팅하고, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 수 차례 세척 후, enhanced chemiluminescence (ECL)를 사용하여 단백질을 검출하였다.

ELISA는 다음과 같이 수행하였다: human sRAGE(soluble receptor advanced glycation end products) ELISA kit (Aviscera Bioscience, SK00112-02)를 사용하여 전체 분비된 용해성 RAGE를 정량하였다. 인간 sRAGE 항체가 미리 코팅되어 있고 희석 완충액 100㎕가 포함된 96-웰 마이크로 플레이트에 시료와 표준 용액 100㎕ (serial dilution의 역순으로)를 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 밀봉제(seal)로 덮고 실온에서 마이크로 플레이트 쉐이커 상에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 용액을 모두 흡인하고 세척액으로 4회 세척하였다. working solution에 희석된 검출 항체 100㎕를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 밀봉제로 덮고 실온에서 마이크로 플레이트 쉐이커 상에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후, 흡인 및 세척 단계를 반복 수행하였다. HRP(Horse Radish Peroxidase)-접합된 2차 항체 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 빛이 차단된 실온 조건에서 마이크로 플레이트 쉐이커 상에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 흡인 및 세척 단계를 반복 수행하였다. 마지막으로, 기질 용액 100㎕을 각 웰에 첨가하고 5-8 분 동안 반응시킨 후 정지 용액 100㎕을 가하여 반응을 종료시켰다. 450 nm로 설정된 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다.

상기 면역블라팅(western blot) 및 ELISA를 수행하여 얻어진 결과를 도19c에 나타내었다. 도 19c의 웨스턴블랏 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, pzDonor 벡터가 형질감염된 sRAGE-iPSC에서 Flag의 발현이 관찰되었다. 도 19c의 배지에서 전체 sRAGE의 분비 수준을 보여주는 ELISA 결과에서 나타난 바와 같이, sRAGE-iPSC의 배양 배지에서 15.6ng/ml의 sRAGE가 검출되었으며, 이는 mock-iPSC의 배지에서 0.8ng/ml의 sRAGE가 검출된 것과 비교하여, 현저하게 높은 수준이다.

실시예 13. 심근경색 (MYOCARDIAL INFARCTION; MI) 모델링 및 sRAGE-iPSC 이식

체중 290-330g(8-9 주령)의 Sprague-Dawley 수컷 래트에 대하여 MI 및 재관류 과정을 수행하여 심근경색을 유도하였다. 간단히 설명하면, 래트에 삽관(intubated) 및 volume-cycled small-animal ventilator를 사용하여 환기(ventilated)를 수행하였다. 수술 동안 5% isoflurane으로 마취를 유지시켰다. left anterior descending coronary artery (LAD)을 확인한 후, 40분 동안 6-0 폴리프로필렌으로 혈관을 연결시켰다. 재관류 후, 해밀턴 주사기를 사용하여 PBS 10ul(microliter)을 GFP-iPSC 또는 sRAGE-iPSC 세포 (1x10⁶)와 함께 또는 단독으로 경색 주위 및 경색 영역에 주입하였다. 근육증과 피부를 봉한 후 회복하도록 두었다. 허위수술군(sham-operated group)은 상기와 동일한 실험 절차를 거쳤지만 ligation 및 세포 이식은 수행하지 않았다. 이식 거부 반응을 예방하기 위해 세포 이식받은 래트에게 cyclosporine A (10 mg/kg/day)를 투여 하였다. 모든 동물 실험은 Gachon University의 Lee Gil Ya Cancer and Diabetes Institute의 Institute Animal Care and Use Committee에서 승인받아 진행하였다 (#LCDI-2014-0020).

세포 이식 4 주 후에 동물을 희생시켰다. 심장을 절제하고, PBS와 얼음-냉각된 4% 파라포름알데히드로 오른쪽 경동맥을 통해 관류시켰다. 조직을 4% 파라포름알데히드 (PFA, Sigma-Aldrich, 158127)에 4℃에서 밤새 고정한 후 탈수 과정으로 옮겼다. 탈수 후, 조직을 xylene으로 2회 각각 1.5시간 동안 클리어하고, 60℃에서 파라핀에 함침시켰다. 파라핀 함침된 (Paraffin-embedded) 심장 조직을 7 μm 두께로 절단하였다.

H&E와 Masson trichrome 염색을 시행하여 경색 크기, 전벽(anterior wall) 두께 및 섬유화의 비율을 측정하였다. H&E 및 Masson' trichrome-stained 절편을 광학현미경으로 관찰하고, collagen-delegated 경색 비율을 blinded investigator에 의하여 계산 및 분석하였다. 경색 부위의 크기와 다른 매개 변수는 ligation 지점과 심장의 정점 사이의 중간 수평 단면에서 측정하였다. 경색 크기는 다음의 식으로 계산하였다:

% infarct size= (infarct areas/total left ventricle (LV area)) X 100

% infarct thickness: (anterior wall (infarct wall thickness)/septal wall thickness) X100

Viable LV area= total LV myocardial area- infarct myocardial area

상기 얻어진 결과를 도 20a 내지 20c에 나타내었으며, 이들 결과는 sRAGE 분비 iPSC 처리에 의하여 래트의 허혈성 재관류 손상된 심장(ischemic reperfusion injured heart)의 심근세포(cardiomyocyte) 사멸이 억제됨을 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 20a는 심근 경색 부위의 크기를 평가하기 위하여, 수술 및 GFP-iPSC 또는 sRAGE-iPSC 이식 후 28일째에 Masson' trichrome 염색한 결과를 보여준다. 도 20a에서 파란색은 infarction damage에 의한 섬유화 부위을 나타내고 붉은색은 심근 세포를 나타낸다. 상기 도 20a의 결과를 Image J software를 사용하여 정량하여 LV 단면적에서의 섬유화 영역 및 infarcted 벽 두께의 백분율을 계산하여, 도 20b에 나타내었다. iPSC, VEGF-iPSC 또는 ANG1-iPSC 투여군과 비교하여, sRAGE-iPSC 투여군에서 섬유화 부위가 유의하게 감소하였다. 또한 도 20c에 나타난 바와 같이, 조직 RAGE는 또한 VEGF 또는 ANG1 처리군과 비교하여 sRAGE-iPSC 처리군에서 유의하게 감소하였다.

실시예 14. sRAGE 분비 iPSC의 줄기세포 보호 효과

면역조직화학 시험에 의하여 AGE-albumin (AA) 처리 iPSC에서 TUNEL이 증가하지만, sRAGE 분비 iPSC (sRAGE-iPSC)와 함께 배양한 후에는 강도가 감소함을 확인하였다 (도 21a 참조). 또한, PBS, AA 또는 sRAGE-iPSC에서 RAGE의 웨스턴블라팅 결과를 도 21b에 나타내었으며, AA 처리 후의 sRAGE-iPSC 동시 배양이 iPSCs에서의 RAGE 발현을 감소시키는 결과를 확인할 수 있다. 이러한 결과는 sRAGE 분비 iPSC이 다른 iPSC를 포함한 줄기세포를 보호하는 효과를 가지며 (특히, AGE-albumin이 축적되는 심근경색과 같은 환경에서 줄기세포 보호효과를 가짐), 이를 통하여 줄기세포 치료제와 함께 병용됨으로써 상기 줄기세포 치료제의 효과를 증진시킬 수 있음과 sRAGE 분비 iPSC의 다른 줄기세포 치료제와의 병용 용도를 제안한다.

<110> TOOLGEN INCORPORATED nSAGE corp. <120> Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Neurologic Disease or Cardiovascular Disease Comprising sRAGE-secreting stem cell <130> OPP20180958KR <150> KR 10-2017-0056433 <151> 2017-05-02 <150> KR 10-2017-0078196 <151> 2017-06-20 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of crRNA <400> 1 guuuuagagc ua 12 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-terminal part of crRNA <400> 2 ugcuguuuug 10 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of tracrRNA <400> 3 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 60 <210> 4 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 from Streptococcus pyogenes <400> 4 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 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Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly 20 25 30 Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly 35 40 45 Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp 50 55 60 Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala 65 70 75 80 Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile 100 105 110 Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly 115 120 125 Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala 130 135 140 Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu 145 150 155 160 Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly 165 170 175 Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly 180 185 190 Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg 195 200 205 His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro 210 215 220 Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala 225 230 235 240 Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln 245 250 255 Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu 260 265 270 Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln 275 280 285 Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu 290 295 300 Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro 305 310 315 320 Thr Ala Gly Glu Gly Phe Asp Lys Val Arg Glu Ala Glu Asp Ser Pro 325 330 335 Gln His Met <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of human AAVS1 <400> 7 gtcaccaatc ctgtccctag 20

Claims

가용성(soluble)의 최종당화산물 수용체 (Receptor for Advanced Glycation End products; RAGE) (sRAGE)를 분비하는 줄기세포를 포함하는 AGE (advanced glycation end-product; 최종당화산물)-알부민의 분비 억제 또는 AGE-알부민에 의한 세포사(apaotosis)의 억제용 약학 조성물.
가용성(soluble)의 최종당화산물 수용체 (Receptor for Advanced Glycation End products; RAGE) (sRAGE)를 분비하는 줄기세포를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
가용성(soluble)의 최종당화산물 수용체 (Receptor for Advanced Glycation End products; RAGE) (sRAGE)를 분비하는 줄기세포를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 중간엽줄기세포인, 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 신경질환은 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD), 근위축측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS, 루게릭병), 전두측두치매 (frontotemporal dementia; FTD), 루이치매 (dementia with Lewy bodies; DLB), 피질기저퇴행증 (corticobasal degeneration), 다계통위축병 (multiple system atrophy; MSA), 진행성핵상마비 (progressive supranuclear palsy; PSP), 헌팅톤병 (Huntington's disease; HD), 또는 척수 손상 (spinal cord injury), 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 하지허혈, 고혈압, 또는 부정맥인, 약학 조성물.
가용성(soluble)의 최종당화산물 수용체 (Receptor for Advanced Glycation End products; RAGE) (sRAGE)를 분비하는 줄기세포를 포함하는, 줄기세포 보호용 조성물.
분리된 가용성(soluble)의 최종당화산물 수용체 (Receptor for Advanced Glycation End products; RAGE) (sRAGE)를 분비하는 줄기세포와 분리된 줄기세포를 공동배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 보호 방법.