KR20200011817A - 혈액 응고인자 ⅷ의 교정용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

혈액 응고인자 ⅷ의 교정용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

일 양상에 따른 혈액 응고 인자 Ⅷ(FⅧ)의 교정용 조성물, 이를 이용한 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법, 이에 의해 제조된 유도만능 줄기세포 및 내피 세포, 이들을 포함한 A형 혈우병 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 이들을 이용한 방법을 제공한다. 이에 따르면, 세포 또는 개체의 유전체에서 FⅧ 유전자를 녹-인(knock-in)시킬 수 있다. 특히 맞춤의료 또는 정밀의료로서, A형 혈우병을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

혈액 응고인자 Ⅷ의 교정용 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for correcting blood coagulation factor Ⅷ and method using the same}
혈액 응고인자 Ⅷ를 표적으로 하는 가이드 RNA, 이를 포함한 벡터, 이를 포함한 유전체 교정용 조성물, 이를 포함한 혈우병 예방 또는 치료용 조성물, 및 이들을 이용한 방법에 관한 것이다.
A형 혈우병(Hemophilia A: HA)는, 유병률이 전 세계적으로 남성에서 5,000 명 당 1 명 정도인, 가장 흔한 유전성 출혈 질환 중 하나이다. HA는 X-연관 응고 인자 Ⅷ(FⅧ) 유전자 내에서 대규모 결실, 삽입, 역위, 및 점 돌연변이를 포함한 다양한 유전자 돌연변이에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 현재, 임상에서 적용되는 HA 치료법은 재조합 FⅧ 단백질을 정맥 내 주입하는 것이다. 그러나, 이러한 치료법은 근본적인 치료법이 아닐 뿐만 아니라, 치료 비용이 높고 평생 치료해야 하고, FⅧ 단백질 비활성화 항체가 형성되는 문제가 있다.
유전자 가위는 유전자에 결합하여 특정 DNA 부위를 절단하여 사용하는 효소 또는 이를 이용한 유전체 편집(genome editing) 기법을 말한다. 유전자 가위를 이용하여 줄기세포 또는 체세포에서 유전병의 원인이 되는 돌연변이 교정, 항암 세포 치료제와 같이 다양한 분야에서 활용할 수 있다. 유전자 가위 중 하나인 CRISPR/ Cas 9 시스템은 Cas9 뉴클레아제와 적절한 가이드 RNA를 세포 내로 전달함으로써, 유전체에서 특정 유전자를 절단 및 삽입하는 기법이다. 최근, HA 환자의 유도만능줄기세포(iPSC)에서 역위가 발생한 내인성(endogenous) FⅧ 좌위(locus)를 역위시켜 정상 유전자 방향으로 교정하거나(KR 10-2016-0084958(2016.07.15)), FⅧ 유전자 엑손을 위치-특이적 돌연변이로 삽입하는 방법이 보고된 바 있다(Yong Wu et al., Scientific Reports, vol.6, Article No. 18865, 2016.01.08). 그러나, 이러한 방법은 HA에서 나타난 모든 유형의 유전적 변이에 적용되기 어렵고, iPSC를 FⅧ 단백질의 주요 생산 세포인 간 동모양혈관 세포(liver sinusoidal endothelial cell: LSEC)로 분화를 유도하는 방법이 아직 개발되지 않은 점에서 문제가 있다.
따라서, FⅧ 유전자를 유전적 변이 및 세포 유형에 관계없이 보편적으로 교정하고 HA를 근본적으로 치료할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.
혈액 응고 인자 Ⅷ의 교정용 조성물을 제공한다.
FⅧ 유전자가 교정된 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 의하여 제조된 유도만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 내피 세포를 제공한다.
A형 혈우병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
A형 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 인간 H11 유전자 좌위(locus)의 뉴클레오티드 서열과 동일 또는 상보적인 2개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드(guide) RNA 또는 이를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
혈액 응고 인자 Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ; FⅧ 또는 F8) 유전자의 1번째 엑손(exon) 내지 26번째 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑손을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 혈액 응고 인자 Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ; FⅧ 또는 F8)의 교정용 조성물을 제공한다.
용어 "좌위(locus)"는 염색체 상의 특정 위치를 말한다. 상기 좌위는 유전자 또는 유전자간 서열(intergenic sequence)이 차지하는 위치일 수 있다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 상기 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "상보적인(complementary)"은 혼성화 조건하에서 폴리뉴클레오티드가 표적 서열에 특이적으로 염기쌍을 이루어 이중가닥 구조를 형성할 수 있는 것을 말하고, 완전히 상보적인 경우뿐만 아니라 실질적으로 상보적인 경우도 포괄한다.
상기 H11 유전자 좌위는 인간 염색체 22에 존재하는 유전자간 서열일 수 있다. 상기 H11 유전자 좌위는 염색체 22q12.2에 위치할 수 있다. 상기 H11 유전자 좌위는는 DRG1 유전자와 EIF4ENIF1 유전자 사이에 위치할 수 있다. 상기 H11 유전자 좌위는 소위 "세이프 하버(sage harbor)"로 기능할 수 있다. 상기 세이프 하버는 유전체 중 세이프 하버 내에 삽입된 유전자가 안정적으로 발현될 수 있는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)를 포함할 수 있다. 상기 PAM은 5'-TGG-3', 5'-TAG-3', 5'-AGG-3', 및 5'-CTG-3'으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 10 뉴클레오티드(nucleotide: nt) 내지 약 100 nt, 약 10 nt 내지 약 90 nt, 약 10 nt 내지 약 80 nt, 약 10 nt 내지 약 70 nt, 약 10 nt 내지 약 60 nt, 약 10 nt 내지 약 50 nt, 약 10 nt 내지 약 40 nt, 약 10 nt 내지 약 30 nt, 약 15 nt 내지 약 30 nt, 또는 약 20 nt 내지 약 30 nt일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 nt일 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%,약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, PNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 특이적인 RNA로서, RNA 가이드 뉴클레아제와 결합하여 상기 뉴클레아제를 표적 핵산 서열로 인도할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-사슬 가이드 RNA(single-chain guide RNA: sgRNA)일 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 유전자 가위(programmable nuclease)의 구성요소일 수 있다. 유전자 가위는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제를 말한다. 상기 유전자 가위는 예를 들어, TALEN(transcription activator-like effector nuclease), 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease), 메가뉴클레아제(meganuclease), RGEN(RNA-guided engineered nuclease), 및 아고 상동체(Ago homolog, DNA-guided endonuclease)이다. 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 RGEN의 구성요소이다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드는 세포의 유전체에서 비상동성 말단-접합(non-homologous end-joining: NHEJ)를 야기할 수 있다. 상기 비상동성 말단-접합에 의해, 제2 폴리뉴클레오티드가 유전체 중 인간 H11 유전자 좌위에 삽입될 수 있다.
상기 혈액 응고 인자 Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ; FⅧ 또는 F8)는 혈액응고 단백질의 구성요소 중 하나이다. 상기 FⅧ를 암호화하는 유전자는 인간에서 X 염색체 상에 위치한다. 상기 FⅧ은 F8 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 상기 FⅧ은 인간에서 Uniprot No. P00451의 아미노산 서열 또는 마우스에서 Uniprot No. Q06194의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 제2 폴리뉴클레오티드는 F8 유전자의 1번째 엑손(exon) 내지 26번째 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑손을 암호화한다. 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 F8 유전자의 열린 해독틀(open reading frame: ORF)을 암호화할 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합은 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 에피좀성(episomal) 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 발현용 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 발현 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 프로모터, 항생제 저항성 유전자, 5'-상동성 암(Left arm: LA), 3'-상동성 암(Right arm: RA), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 신장 인자 1α(elongation factor 1 alpha: EF1α) 프로모터, U6 폴리머라제 III 프로모터, H1 프로모터, 사이토메갈로바이로스의 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "교정(correction)"은 유전체(genome)에서 특정한 유전자의 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하여 절단, 결실, 치환, 역위 (또는 역위의 재역위), 또는 삽입을 유도하여 표적 유전자를 정상 유전자로 유도하는 것을 말한다. 상기 교정은 유전체 편집(genome editing)으로도 불릴 수 있다.
상기 조성물은 FⅧ 유전자의 녹-인(knock-in)을 위한 조성물일 수 있다. 녹-인은 유전체에 특정 유전자를 표적으로 하여 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 말한다.
상기 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo) 투여용일 수 있다.
상기 조성물은 RNA 가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease: RGN) 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 RNA 가이드 뉴클레아제는 Cas 폴리펩티드일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 CRISPR/Cas 시스템의 단백질 구성 요소 중 하나로서, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 닉(nick) 형성 효소일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 그의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 예를 들어 스트렙토코커스 속(예, Streptococcus pyogens), 네이세리아 속(예, Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 속(예, Pasteurella multocida), 프란시셀라 속(예, Francisella novicida), 또는 캄필로박터 속(예, Campylobacter jejuni)의 세균으로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 Cas 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드일 수 있다.
상기 조성물은 단일 조성물 또는 별개의 조성물일 수 있다.
다른 양상은 A형 혈우병(Hemophilia A: HA) 환자의 체세포로부터 역분화된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 수득하는 단계;
상기 유도만능 줄기세포와 일 양상에 따른 FⅧ의 교정용 조성물을 접촉시켜 유도만능 줄기세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, FⅧ 유전자가 교정된 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 A형 혈우병은 FⅧ의 발현 수준 또는 활성이 정상에 비해 감소되거나, 거의 없는 유전적 질환을 말한다. 상기 A형 혈우병은 중증 A형 혈우병일 수 있다. 중증 A형 혈우병은 FⅧ의 활성이 정상인의 1% 미만일 수 있다.
상기 체세포는 근육세포, 신경세포, 상피세포, 혈액 세포, 비만 세포, 골 세포, 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 말한다. 상기 체세포는 예를 들어, 지방 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 혈액 세포, 또는 조혈모줄기세포일 수 있다. 상기 섬유아세포는 피부 유래 섬유아세포일 수 있다. 상기 상피 세포는 뇨관 유래 뇨(uninary) 상피 세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)일 수 있다.
용어 "역분화"는 존재하는 분화 세포들을 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 말한다. 상기 "역분화"는 0% 이상 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함된다. 예를 들어 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화시키는 과정도 이에 포함될 수 있다.
용어 "유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 전분화능(pluripotency)을 가지도록 유도된 세포를 말한다. 상기 유도만능 줄기세포는 배아줄기세포와 세포 외형, 유전자, 또는 단백질 발현 패턴이 유사하고, 시험관 내 및 생체 내에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 상기 유도만능 줄기세포는 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이 등의 모든 포유류 유래의 역분화 유도만능 줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 유도만능 줄기세포는 인간 유래의 유도만능 줄기세포일 수 있다. 상기 유도만능 줄기세포는 A형 혈우병 환자로부터 유래한 유도만능 줄기세포일 수 있다.
상기 형질전환은 동물 형질전환에 이용되는 알려진 모든 유전자 전달 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 형질전환은 예를 들어 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
상기 FⅧ 유전자가 교정된 유도만능 줄기세포는 그의 유전체 중 H11 유전자 좌위에 FⅧ 유전자의 1번째 엑손 내지 26번째 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑손이 삽입된 것일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따라 제조된 유도만능 줄기세포를 제공한다.
다른 양상은 일 양상에 따라 제조된 유도만능 줄기세포로부터 분화된 내피 세포를 제공한다.
상기 유도만능 줄기세포 또는 내피세포는 A형 혈우병에 대한 세포치료용 조성물에 포함될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 조성물, 유도만능 줄기세포, 또는 내피 세포를 포함하는 A형 혈우병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 A형 혈우병의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 A형 혈우병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
상기 약학적 조성물은 단일 조성물 또는 별개의 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal), 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 이들의 조합을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 2 g, 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 g, 약 1 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 100 ㎍ 내지 약 50 mg일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
다른 양상은 개체에 일 양상에 따른 조성물, 유도만능 줄기세포, 또는 내피 세포를 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 상기 세포와 RNA 가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease: RGN) 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드와 인큐베이션하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계는 상기 개체에 개체에 일 양상에 따른 조성물, 유도만능 줄기세포, 또는 내피 세포를 투여하는 단계와 동시 또는 순차로 수행될 수 있다.
상기 개체는 Ⅷ 유전자에 돌연변이가 있는 유전체를 갖는 개체일 수 있다. 상기 개체는 A형 혈우병에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 개체일 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다.
상기 조성물, 유도만능 줄기세포, 또는 내피 세포는 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내 또는 피하 투여될 수 있다. 상기 조성물, 유도만능 줄기세포, 또는 내피 세포의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
일 양상에 따른 혈액 응고 인자 Ⅷ(FⅧ)의 교정용 조성물, 이를 이용한 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법, 이에 의해 제조된 유도만능 줄기세포 및 내피 세포, 이들을 포함한 A형 혈우병 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 이들을 이용한 방법에 따르면, 유전체 편집 기법을 이용하여, 세포 또는 개체의 인간 H11 좌위에 FⅧ 유전자를 녹-인(knock-in)시킴으로써 FⅧ 유전자의 돌연변이 유형에 관계없이 A형 혈우병을 보편적으로 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.
도 1a는 디자인된 sgRNA의 뉴클레아제 활성을 확인하기 위해 T7 엔도뉴클레아제 I(T7E1) 분석법을 수행하여 얻은 이미지이고, 도 1b는 sgRNA4의 indel 효율을 T7E1 분석법으로 검증한 이미지이고, 도 1c 및 도 1d는 sgRNA4의 indel 빈도 및 indel 부위의 염기서열을 나타낸다.
도 2는 일 양상에 따라 제작된 공여자 플라스미드의 모식도이다.
도 3a는 염색체 22에서 녹-인 대립 형질의 모식도 및 공여자 DNA의 표적화된 녹-인을 확인하기 위한 PCR 결과를 나타내고, 도 3b는 PCR-기반 유전자형분석을 통해 퓨로마이신 선별 카세트가 절제(excision)된 것을 확인한 결과를 나타내고, 도 3c는 생거 서열분석법으로 두 loxP 부위 간의 재조합을 검증한 결과를 나타낸다.
도 4a는 선별된 iPSC 클론에서 OCT4, SOX2, 및 LIN28의 발현 양상을 나타낸 그래프이고, 도 4b는 OCT4 및 NANOG의 면역염색 이미지이고, 도 4c는 교정된 클론의 NESTIN, α-SMA, 및 HNF-3β 면역염색 이미지이고, 도 4d는 교정된 클론의 핵형 분석 이미지이고, 도 4e는 오프-타겟 부위를 표적 심층 서열분석법으로 확인한 그래프이다.
도 5a는 시험관 내에서 교정된 iPSC의 유전체 중 H11 유전자 좌위의 FⅧ를 PCR로 증폭한 결과이고, 도 5b는 절제후(post-excision) 클론(inv-K1e1 내지 inv-K1e3, 또는 del-K1e1 및 del-K1e2) 사이에 FⅧ 유전자의 발현의 qPCR 분석 결과이고, 도 5c는 시험관 내에서 교정된 iPSC에서 측정된 FⅧ 활성(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 내피세포로 분화된 iPSC에서 CD31 및 폰 빌레브란트 인자의 면역염색 이미지이고, 도 6b는 내피세포로 분화된 iPSC에서vWF, CD31, 및 FⅧ의 mRNA의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 6c는 내피세포로 분화된 iPSC의 FⅧ 활성 수준(%)을 나타낸 그래프이고, 도 6d는 내피세포가 이식된 HA 마우스에서 수득된 혈장 시료의 FⅧ 활성(%)을 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 가이드 RNA의 스크리닝 및 확인
1. FⅧ 결실된 환자 유래 유도만능줄기세포의 제조
A형 혈우병(HA) 환자의 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)의 제조 및 분석은 연세대 학교 기관 심사위원회(IRB # 4-2012-0028)의 승인을 받았다. 이 연구에 참여한 모든 지원자는 iPSC 생성을 위해 세포를 기증하기 전에 서면동의서 양식에 서명하였다.
우선, 한국 혈우병 재단 병원에서 임상적으로 중증 HA로 진단받고 FⅧ 결실(엑손(exon) 8 내지 22의 결실)을 갖는 것으로 확인된 환자로부터 수득한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)를 준비하였다. 준비된 MSC를 10%(v/v) FBS, 0.0145g/L 아스코르브산 및 I 형 콜라겐-코팅 플레이트에서 1%(w/v) 항생제가 보충된 DMEM(저농도 글루코스)에서 배양하였다. 인간 야생형 iPSC(WT-iPSC), FⅧ-역위 환자 유래 iPSC(인트론 22 역위된 iPSC), FⅧ-결실 환자 유래 iPSC을 iPSC 배양 배지(4 ng/mL 염기성 섬유 아세포 성장 인자(bFGF; PeproTech), 20% 녹아웃 혈청 대체물(Invitrogen), 1%(w/v) 비필수 아미노산(Invitrogen), 및 0.1 mM 2-머캅토 에탄올(Sigma)을 함유하는 DMEM/F12 배지)에서 유지하였다.
에피좀 리프로그래밍(Episomal reprograming) 벡터인 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(addgene, no. 27077), pCXLE-hSK(addgene, no. 27078), 및 pCXLE-hUL(addgene, no. 27080)을 사용하여, 준비된 MSC로부터 FⅧ 결실된 환자 유래-iPSC를 생성하였다. 간략하게, 증식된 MSC는 Neon Transfection System(Life Technologies)을 사용하여 리프로그래밍 벡터(각 1 ㎍, 총 3 ㎍)로 전기천공시켰다. 10 ms 동안 1,650 V에서 3 회 펄스시킨 후, 세포를 I형 콜라겐이 코팅된 플레이트 상에 10%(v/v) FBS가 보충된 저농도 글루코스 DMEM에서 더 배양하였다. 전기천공 후 일주일째에, 세포를 피더(feeder) 층으로서 마우스 SIM 티오구아닌 /오우바인(Thioguanine/Ouabain)-내성 마우스 섬유아세포 세포주(SIM Thioguanine/Ouabain: STO) 섬유아세포(ATCC)으로 옮겼다. 인간 ESC-유사 iPSC 콜로니를 기계적으로 골라내고, 특성분석을 위해 더 배양하였다. 그 후, iPSC를 FⅧ 녹-인 실험에 이용하기 위해 StemMACSTM iPS-Brew XF 배지(Miltenyi Biotec)에서 배양하여 피더가 없는(feeder free) 배양 조건에서 적응시켰다.
총 9개의 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC)-유사 클론을 선별하였다. 7번의 계대배양 후에, 1개를 제외한 나머지 클론에서 에피좀 벡터가 없어진 것을 PCR로 확인하였다. 또한, 선별된 클론이 벡터에서 코딩되는 EBNA-1 서열을 함유하지 않는다는 것을 PCR로 확인하였고, 면역염색 및 RRT-PCR 방법을 이용하여 전분화능(pluripotency) 마커인 SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, 및 Lin28을 발현하는 1개의 클론을 선별하였다. 선별된 클론이 시험관 내에서의 분화능을 갖고 정상 핵형을 갖는다는 것을 확인하였다. 최종 선별된 FⅧ 역위된-iPSC(inv-Pa) 세포 또는 FⅧ 결실된-iPSC(del-Pa) 세포로부터 유래된 FⅧ 녹-인 클론을 iPSC 배양 배지에서 유지하였다.
2. 단일-사슬 가이드 RNA의 제작 및 뉴클레아제 활성의 검증
(1) sgRNA 의 제작 및 선별
FⅧ 유전자를 22번 염색체의 H11 좌위에 녹-인하기 위해, 웹-기반 인 실리코(in silico) 도구(crispr.mit.edu)를 이용하여 표적 부위를 인식하는 단일-사슬 가이드 RNA(single-chain guide RNA: sgRNA)를 디자인하였다. 디자인된 sgRNA의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
이름 sgRNA 서열/PAM 서열
sgRNA-1 5'-CAGTATAAACTGACCTGTTG GGG -3' (서열번호 1)
sgRNA-2 5'-CACAAGGCTATGCTATCTAT AGG -3' (서열번호 2)
sgRNA-3 5'-CCCAACAGGTCAGTTTATAC TGG -3' (서열번호 3)
sgRNA-4 5'-ATAGCCTTGTGGCTAATACC AGG -3' (서열번호 4)
sgRNA-5 5'-CTATAGATAGCATAGCCTTG TGG -3' (서열번호 5)
sgRNA-6 5'-ACAAGGCTATGCTATCTATA GGG -3' (서열번호 6)
sgRNA-7 5'-TGAGCTTTAAAGACCCCAAC AGG -3' (서열번호 7)
sgRNA-8 5'-CCAGTATAAACTGACCTGTT GGG -3' (서열번호 8)
sgRNA-9 5'-CAGTATAAACTGACCTGTTG GGG -3' (서열번호 9)
표 1에서, 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM) 서열은 굵은 글씨 및 밑줄로 표시하였다.
디자인된 sgRNA 중 sgRNA-1 내지 sgRNA-4의 서열에 대해 뉴클레아제 활성을 확인하였다.
HEK-293T(ATCC) 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)과 1%(w/v) 항생제가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 배양하였다. HEK-293T 세포(ATCC)를 Cas9 및 sgRNA 벡터와 함께 형질감염시켰다. 뉴클레아제 활성을 확인하기 위해, T7 엔도뉴클레아제 I(T7E1) 분석법을 하였다.
구체적으로, 표적 부위를 위해 고안된 CRISPR/Cas9의 활성을 확인하기 위해 T7E1 분석을 앞서 기술 한 바와 같이 수행하였다. 간략히, HEK-293T 세포에 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 1 ㎍ SpCas9 플라스미드((주)툴젠) 및 2 ㎍ sgRNA 플라스미드((주)툴젠)로 공-형질감염시켰다. 공-형질감염 후 4일째, 고 정확도(fidelity) PrimeSTAR®Max DNA 중합효소(Takara Bio) 및 하기 프라이머쌍을 사용하여 뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 유전체 DNA 절편을 증폭시켰다.
T7E1 정방향 프라이머: 5'-GTGAGCTAAGGAATGTGATACAG-3' (서열번호 10)
T7E1 역방향 프라이머: 5'-ACCCATGGAAATTGGGCACTG-3' (서열번호 11)
PCR 앰플리콘을 T7E1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치 DNA를 절단하였다. 핵산 증폭 시료를 전기영동하고, 수득된 이미지를 도 1a에 나타내었다(←: 비특이적 절단에 의한 밴드, *: 특이적 절단에 의한 밴드). 절단되지 않거나 절단된 단편의 밴드 강도를 측정하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, sgRNA1 및 sgRNA3은 뉴클레아제 활성이 없는 것으로 보이고, sgRNA2는 sgRNA4에 비해 뉴클레아제 활성이 낮은 것으로 확인되었다. 따라서, 추후 실험에서는 sgRNA4를 가이드 RNA로 사용하였다.
(2) 선별된 sgRNA 의 indel 빈도
sgRNA4의 삽입 및 삭제(insertions and deletion: indel) 효율을 T7E1 분석법으로 검증하였고, T7E1 분석법에 서열번호 10의 T7E1 정방향 프라이머와 하기 뉴클레오티드 서열의 역방향 프라이머를 사용하였다.
T7E1 역방향 프라이머 2: 5'-AGGCTGAGACAGAAGAATCGCCT-3' (서열번호 12)
indel 효율 분석 결과를 도 1b에 나타내었다(*: 특이적 절단에 의한 밴드). 도 1b의 이미지를 분석하여, sgRNA4의 indel 빈도를 산출하였다. 산출된 indel 빈도는 약 15%로서, sgRNA4의 뉴클레아제 활성이 상당히 높음을 확인하였다.
(3) 선별된 sgRNA 의 검증
웹-기반 인 실리코(in silico) 도구(crispr.mit.edu)를 이용하여 표적 부위에서 4nt 범위 내에서 잠재적인 오프-타겟 위치 10 개를 검색하였다. 심층 시퀀싱(deep sequencing) 분석을 위해, 각각의 오프 표적 부위 및 표적 부위에 대한 PCR 앰플리콘을 고 정확도의 PrimeSTAR®Max DNA 중합효소(Takara Bio) 및 하기 표 2의 프라이머쌍을 사용하여 유전체 DNA로부터 제조하였다.
표적 부위 표적 서열(5'-> 3') 정방향 프라이머(5'->3') 역방향 프라이머(5'->3')
온-타겟
(On, Chr. 22)		 ATAGCCTTGTGGCTAATACC (서열번호 13) GATTTGTTTGAGAGAAACTACC (서열번호 14) CCTTGAGCTTTAAAGACCCC (서열번호 15)
오프-타겟 1
(OT1, Chr. 17)		 ACAGCCCTGTGGCTAACACT (서열번호 16) ATGGTTAGCAGTCAACCGTG (서열번호 17) CCACAAACAAGAGGTCATCC (서열번호 18)
오프-타겟 2
(OT2, Chr. 9)		 AAAGCCTGGTGGCTGATAAC (서열번호 19) CTTCACTACCATCCCCCACT (서열번호 20) ACTTTTGACATCCATCGCCG (서열번호 21)
오프-타겟 3
(OT3, Chr. 6)		 TTAGCCTAGTGGTTAATCCC (서열번호 22) TTAGCACTAAGATGGACCAC (서열번호 23) TACCTGCTTGGCACCATGTC (서열번호 24)
오프-타겟 4
(OT4, Chr. 20)		 CCAACCTAGTGGCTAATACC (서열번호 25) GTAGTTTTAAAATAGGAGTCAGGG (서열번호 26) GGTTCAATAACCATTGTTCCC (서열번호 27)
오프-타겟 5(OT5, Chr. 5) ACACCCTTGTGGCTAAAACC (서열번호 28) AGTGGACAGAATTCCCTCTG (서열번호 29) TACACTAGGGGTCATTGAGC (서열번호 30)
오프-타겟 6
(OT6, Chr. 14)		 AGAGCCTTGTGACTAATACT (서열번호 31) AGGAAAGCGTCTACTGTTAG (서열번호 32) GTGTTAAATCTAGTGTGTTGC (서열번호 33)
오프-타겟 7
(OT7, Chr. X)		 TTAGTCTGGTGGCTAATACA (서열번호 34) CCTTCAGAGTGGAATGCTAT (서열번호 35) ATTAGAAGCGTCCTGGTAGG (서열번호 36)
오프-타겟 8
(OT8, Chr. 4)		 ATATCCATGTGGCTAATAGC (서열번호 37) CAGGCCAGACTATAGAAGTT (서열번호 38) AAGTTCAAATGCCCAATGGG (서열번호 39)
오프-타겟 9
(OT9, Chr. 7)		 ATGTCCTTGTGGCTAATCCC (서열번호 40) TCTCTGGGGCTGAAACCCAA (서열번호 41) GGAGGTCTTTGTGTCTTAGC (서열번호 42)
오프-타겟 10
(OT10, Chr. X)		 GGGGCCTTGTGGCTAACACC (서열번호 43) AGACCTATCAGAGAGCCTAG (서열번호 44) TAAGTTCCCCACAGCATCTC (서열번호 45)
AccuPrep®PCR 정제 키트((주)바이오니아)를 사용하여 얻어진 PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 앰플리콘을 MiSeq 시스템(Illumina)을 사용하여 페어-엔드(paired-end) 시퀀싱을 수행하였다. 뉴클레아제 절단 부위 주변에 위치한 Indel은 Cas9에 의한 돌연변이로 돌연변이로 간주되었다.
또한, 심층 염기서열 분석을 수행하고, 산출된 sgRNA4의 indel 빈도 및 indel 부위의 염기서열을 도 1c 및 도 1d에 나타내었다. 도 1c에 나타난 바와 같이, sgRNA4의 indel 빈도는 약 25.8%였고, 오프-타겟(off-target) 돌연변이는 8개의 상동성 부위에서 확인되지 않았다. 도 1d에 나타난 바와 같이, 다양한 indel이 표적 위치에서 확인되었다.
3. 인간 H11 좌위로 FⅧ 유전자의 녹-인(knock-in)에 의한 유전자 교정
(1) 녹-인 공여자(donor) 벡터의 준비
녹-인 공여자 플라스미드를 제작하기 위해, pCDNA4/BDD-FⅧ 플라스미드(addgene, no. 41035)을 백본으로 사용하였다. 백본의 MfeI 및 MauBI 제한효소 부위를 이용하여 In-Fusion 클로닝으로 각각 5'-상동성 암(Left arm: LA) 및 3'-상동성 암(Right arm: RA)을 삽입하였다. 다음으로, 인간 신장인자 1 알파(elongation factor 1 alpha: EF1α) 프로모터 서열을 LA와 FⅧ 열린 해독틀(open reading frame: ORF) 사이에 클로닝하였다. 그 후, loxP 부위들이 양 옆에 위치한 퓨로마이신 발현 카세트를 In-Fusion 클로닝으로 FⅧ 유전자 카세트와 RA 사이에 삽입하였다.
공여자 플라스미드를 제작한 후, Solgent, Inc.(한국)에서 생거 시퀀싱으로 클로닝된 DNA의 서열을 확인하였다. 제작된 공여자 플라스미드의 모식도를 도 2에 나타내었다.
(2) iPSC에의 형질감염, 선별, 및 성공적으로 편집된 세포의 수득
스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 재조합 Cas9 단백질(SpCas9)을 툴젠(ToolGen, Inc.)에서 구입하였다. SpCas9에 대한 5'-GGX20 sgRNA (5'-ATAGCCTTGTGGCTAATACC-3': 서열번호 14)를 MEGAshortscriptTM 키트 (Ambion)를 사용하여 T7 프로모터의 조절 하에서 시험관 내(in vitro) 전사하였다. Kim, S. et al., Genome Res., vol.24, p.1012-1019 (2014)에 기재된 바와 같이 정제하여 sgRNA를 얻었다.
15 ㎍의 SpCas9 단백질을 20 ㎍의 시험관 내 전사된 sgRNA와 혼합하고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 Cas9 리보핵산단백질(RNP)을 준비하였다.
실시예 1.1에 기재된 바와 같이 준비된 iPSC는 전기천공(electroporation) 전 적어도 2 시간 동안 10 μM ROCK 억제제(Y-27632, Sigma)로 전처리하였다. PBS로 세척 한 후, 세포를 1X Versene 용액(Life Technologies)으로 3 분 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 긁어서 거의 단일 세포로 떼어냈다.
원심분리 후, 5×105 세포를 Neon Transfection System(Life Technologies)을 사용하여 Cas9 RNP 및 3 ㎍의 공여자 DNA로 전기천공시켰다. 850의 전압에서 10 ms 동안 한 번 펄스한 후, 세포를 1일 동안 10 μM Y-27632를 갖는 StemMACS ™iPS-Brew XF 배지(Miltenyi Biotec)에서 배양하였다. 형질감염 4일 후, 0.5 ㎍/mL 퓨로마이신을 사용하여 세포를 선별하였다. 표적화된 세포의 클론 집단을 분리하기 위해 3 회 계대배양하였다.
표적 부위로 녹-인된 유전자를 함유한 콜로니를 확인하기 위해 PCR-기반 유전자형분석(genotyping)을 수행하였다.
DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen)를 사용하여 세포로부터 유전체 DNA를 분리하였다. H11 좌위에서 공여자 DNA의 표적화된 녹-인을 확인하기 위해, 각 녹-인 접합부를 포함한 DNA 단편을 EmeraldAmp®GT PCR Master Mix (Takara Bio)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 정제 후, 각 DNA 앰플리콘의 서열을 Solgent, Inc.(한국)에서 생거 시퀀싱으로 확인하였다.
14 개의 콜로니 중 9 개(Inv-Pa의 경우, 64.3%), 27 개의 콜로니 중 18 개 (66.7%)는 아가로스 겔 상에서 inv-Pa와 del-Pa 녹-인 접합부에 대한 양성 PCR 밴드를 보였다.
3 계대배양 후, inv-Pa iPSC로부터 2개의 클론(inv-K1 및 inv-K2) 및del-Pa iPSC로부터 3개의 클론(del-K1 내지 del-K3)을 수득하고, 모든 클론이 단일의 대립형질(allele) 녹-인 클론인 것을 확인하였다(도 3a, 파랑색 및 밑줄: sgRNA 표적 부위, 빨강색: PAM 서열, 화살표: 유전자형 분석에 이용된 프라이머 위치). 추가적으로, PCR 앰플리콘의 생거(Sanger) 서열분석법으로 분석하여, 모든 클론이 표적 부위에 녹-인된 것을 검증하였다.
다음으로, FⅧ 녹-인 클론에서 퓨로마이신 발현 카세트를 제거하기 위해, 표적 부위와 이의 대립유전자 모두에 indel을 갖지 않는 inv-K1과 del-K1 클론을 선택했다. 2x105 녹-인 iPSC에 1 ㎍의 Cre 발현 플라스미드(pCAG-Cre:GFP, addgene)를 전기천공하여, Cre 재조합효소(recombinase)를 일시적(transient)으로 발현시켰다. 단일 세포 계대 배양을 수행하여 클론을 분리하였다. F3 및 R2 프라이머쌍을 사용하여 PCR-기반 유전자형분석을 통해 7개의 콜로니를 스크리닝했다.
또한, 특정 프라이머쌍을 이용한 PCR-기반 유전자형분석을 통해 퓨로마이신 선별 카세트가 절제(excision)된 것을 확인하였다(도 3b, 검정색 화살표: inv-K1 및 del-K1 클론에서 퓨로마이신 카세트를 포함한 DNA 밴드).
F1 프라이머: 5'-CAACCCAGTCCTCCTTACCTTGC-3' (서열번호 46)
F2 프라이머: 5'-GCCTGAGGGGATCAATTCTCTAG-3' (서열번호 47)
F3 프라이머: 5'-GGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCCG-3' (서열번호 48)
R1 프라이머: 5'-CCGTTGCGAAAAAGAACGTTCAC-3' (서열번호 49)
R2 프라이머: 5'-GTTAGGCCTGTGTCAACAGTTTGG-3' (서열번호 50)
생거 서열분석법으로 두 loxP 부위 간의 재조합을 검증하였다(도 3c). inv-K1 클론으로부터 3개의 퓨로마이신-절제 클론(inv-K1e1 내지 inv-K1e3)을 수득하고, del-K1 클론으로부터 2개의 클론(del-K1e1 및 del-K1e2)를 수득하였다. 이러한 결과는 표적화된 녹-인 방법은 H11 좌위에서 FⅧ 유전자를 유전적으로 교정했다는 것을 나타낸다.
4. 교정된 클론에서 전분화성 확인 및 오프타겟의 분석
(1) 전분화능 유전자의 발현 확인
실시예 1.3에 기재된 바와 같이 수득된 클론이 모(parent) 클론에 비해 전분화능 특징을 유지하는지 여부를 조사하였다.
Easy-SpinTM Total RNA 추출 키트 (iNtRON Biotech)를 사용하여 세포에서 총 RNA를 정제하였다. PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara Bio)를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. mRNA 수준의 정량화를 위해 SYBR Premix Ex-Taq(Takara Bio) 및 CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)을 사용하여 qPCR을 수행하였다. 각 유전자에 대한 Ct 값은 GAPDH에 대한 Ct 값으로 표준화하였다. 반정량적(semiquantitative) RT-PCR은 EmeraldAmp®GT PCR Master Mix(Takara Bio)를 사용하여 수행하였다. 녹-인 클론에서 FⅧ mRNA를 증폭하기 위해 하기의 프라이머쌍을 사용하였다.
엑손 21의 염기서열에 상보적인 정방향 프라이머:
5'-CCGGATCAATCAATGCCTGGAG-3' (서열번호 51)
엑손 23의 염기서열에 상보적인 역방향 프라이머:
5'-ATGAGTTGGGTGCAAACGGATG-3' (서열번호 52)
모든 교정된 클론은 OCT4, SOX2, 및 LIN28를 포함한 전분화능 유전자를 활발하게 전사하였고(도 4a), 모 iPSC 클론과 비교하여 SSEA4, TRA-1-60, OCT4 및 NANOG 같은 전분화성 마커 단백질과 유사한 수준을 유지하였다(도 4b).
(2) 3배엽 분화의 확인
iPSC는 콜라게나제 제IV형(Invitrogen)을 사용하여 부분적으로 덩어리로 떼어냈다. 덩어리를 저-접착 조직 플레이트에 옮겨 배아체(embryonic body: EB)를 형성시키고 bFGF가 없고 5%(v/v) FBS를 함유한 iPSC 배양 배지 일주일 동안 배양했다. 다음으로, EB를 마트리겔-코팅된 커버슬립에 부착시키고, 10일 동안 추가로 배양하여 EB의 3 배엽의 층을 나타내는 세포로 자발적 분화를 유도하였다.
세포를 실온에서 0.2%(v/v) Triton X-100을 함유하는 4%(v/v) 파라포름알데히드 용액에서 10 분 동안 고정하고, PBS로 3 회 세척하였다. 세척된 세포에 정상 염소 혈청 5%(v/v) 및 소 혈청 알부민 2%(v/v)를 함유하는 블로킹 용액을 가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
세포에 항-NEXTIN 항체(Millipore), α-평활근 액틴(smooth muscle actin: SMA) 항체(Sigma), 및 간세포 핵 인자(hepatocyte nuclear factor: HNF)-3β 항체(Santa Cruz)를 가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 형광-결합된 2 차 항체(Alexa Fluor®488 또는 594; Invitrogen)로 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 0.1%(v/v) Tween 20을 함유하는 PBS로 다시 세척하고 마운팅(mounting) 용액을 사용하여 커버슬립 상에 마운팅하였다. 핵의 시각화를 위해, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Vector Laboratories)을 사용하였다. 이미지를 캡처하고 Olympus IX71 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 캡쳐한 이미지를 도 4c에 나타내었다(막대 눈금: 100 ㎛).
도 4c에 나타난 바와 같이, 교정된 클론은 NESTIN(외배엽), α-SMA(중배엽), 및 HNF-3β(내배엽)에 대해 면역염색 결과가 양성으로 나타났다. 따라서, 교정된 클론은 3개의 배엽층으로 성공적으로 분화되었다.
(3) 핵형 분석
교정된 클론의 핵형 분석을 위해, 각 iPSC 클론으로부터 분리된 염색체를 G-밴드 분석을 위해 Giemsa로 염색하고 GenDix Inc.(한국)의 Chromosome Image Processing System을 사용하여 분석하였다.
핵형 분석 결과를 도 4d에 나타내었다. 도 4d에 나타난 바와 같이, 교정된 클론은 정상 46, XY 핵형을 보였다.
(4) 오프 - 타겟 돌연변이의 분석
오프-타겟(off-target) 돌연변이가 교정된 클론에서 뉴클레아제에 의해 유도되었는지 여부를 조사하였다. 10 개의 잠재적인 오프-타겟 부위를 4 개의 교정된 클론 및 2 개의 모 클론에서 표적 심층 서열분석법으로 검사하였고, 그 결과를 도 4e에 나타내었다(OT: off target, 파랑색: 미스매치 뉴클레오티드, 빨강색: PAM 서열(5'-NRG-3', R = A 또는 G)).
도 4e에 나타난 바와 같이, 교정된 클론에서 유의한 오프-타겟 돌연변이가 유도되지 않았다는 것을 확인하였다.
5. 시험관 내에서 FⅧ 결핍의 표현형 교정
유전자 좌위에 FⅧ 유전자를 성공적으로 표적화한 후, 시험관 내 배양 시스템을 사용하여 교정된 클론의 표현형을 확인하였다. 반-정량적 RT-PCR을 사용하여, H11 유전자 좌위의 FⅧ mRNA 발현 수준을 미분화 단계에서 측정하였다.
예상대로, FⅧ 엑손 21 및 23에 해당하는 PCR 밴드는 잘못된 스플라이싱 (inv-Pa) 또는 해당 부위(del-Pa)의 결실로 인하여 두 유형의 환자 iPSC에서 증폭되지 않았다(도 5a). 대조적으로, 엑손 21 및 23에 상응하는 PCR 밴드는 교정된 iPSC에서 증폭되었고, 선별 카세트의 유무에 관계없이 검출되었다(도 5a).
또한, qPCR 분석에서 절제후(post-excision) 클론(inv-K1e1 내지 inv-K1e3, 또는 del-K1e1 및 del-K1e2) 사이에 FⅧ 유전자의 발현에 차이가 없음을 증명했다 (도 5b).
FⅧ 발현의 유도가 교정된 클론에서 증가된 FⅧ 활성에 상응하는지 여부를 조사 하였다. FⅧ 활성을 측정하기 위해, Amicon®Ultra-4 원심분리 필터 (Millipore)를 사용하여 배양 상층액을 20 배 농축시켰다. 농축된 배양 상층액에 대해 Coamatic® Factor Ⅷ 발색 분석 키트(Instrumentation Laboratory)를 사용하여 FⅧ 활성을 측정하였다. FⅧ 활성 측정을 96-웰 마이크로 플레이트에서 수행하고 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용하여 종점(endpoint) 판독값으로 결정하였다. 인간 칼리브레이션 혈장 (Instrumentation Laboratory)을 희석하여 표준 곡선을 만들었다. 측정된 FⅧ 활성(%)은 도 5c에 나타내었다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 교정된 클론 모두가 선별 카세트를 가졌는지 여부에 관계없이, 모 환자-iPSC의 수준과 비교하여 매우 높은 FⅧ 활성 수준을 나타냈다. 이러한 결과는 환자 iPSC의 표현형이 H11 유전자 좌위에서 표적화된 녹-인을 통한 FⅧ 유전자의 발현에 의해 시험관 내에서 교정될 수 있음을 나타냈다.
6. 혈우병 마우스에서 FⅧ 결핍의 기능적 치유
(1) 내피세포로의 분화
내피 세포 (endothelial cell: EC)로 iPSC의 분화를 유도하기 위해, iPSC를 계대배양 하기 전 적어도 2시간 동안 10 μM ROCK 억제제 (Y-27632, Sigma)로 전처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 1X Versene 용액(Life Technologies)으로 3 분 동안 처리하였다. 세포를 긁어내고 작은 덩어리로 떼어냈다. 원심분리 후, 덩어리를 마트리겔-코팅 배양 접시에 접종하고 10 μM Y-27632를 함유한 StemMACS™ iPS-Brew XF 배지(Miltenyi Biotec)에서 1일 동안 배양하였다. 2일 후 배양 배지를 6 μM CHIR99012(Tocris Bioscience)가 함유된 STEMdiff™ APEL™ 배지(STEMCELL Technologies)로 교체하여 중배엽을 유도하였다. 그 후 세포를 25 ng/mL 골 형성 단백질 4(bone morphogenetic protein4: BMP4, R&D Systems), 10 ng/mL bFGF(PeproTech), 및 50 ng/mL 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF, R & D Systems)를 갖는 STEMdiff™ APEL™ 배지에서 2일 동안 배양하여 혈관 전구 세포를 유도하였다. 마지막으로, 상기 세포를 50 ng/mL VEGF를 갖는 EC 성장 배지 MV2(ECGM-MV2, PromoCell)에서 배양하여 내피 전구 세포를 생성시킨 다음, 매 2일 마다 배지를 교환하였다.
분화를 유도한 세포를 내피세포 마커인 CD31 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWF)에 대해 면역염색을 수행하고, 그 결과를 도 6a에 나타내었다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 모든 클론에서 분화과정인 제4일에 자갈(cobblestone)-유사 형태를 나타내고, 분화 마지막에 CD31 및 vWF의 염색이 양성이었다. 따라서, 클론의 내피 세포로의 분화에 어떤 문제도 발견되지 않았다.
qPCR 분석에 의해 vWF, CD31, 및 FⅧ의 mRNA의 수준을 더 평가했다. vWF 및 CD31의 검출을 위해 하기 프라이머쌍을 사용하였고, FⅧ의 검출을 위해 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍을 사용하였다.
vWF 정방향 프라이머: 5'-TCGGGCTTCACTTACGTTCT-3' (서열번호 53)
vWF 역방향 프라이머: 5'-CCTTCACTCGGACACACTCA-3' (서열번호 54)
CD31 정방향 프라이머: 5'-GGTCAGCAGCATCGTGGTCAACATAAC-3' (서열번호 55)
CD31 역방향 프라이머: 5'-TGGAGCAGGACAGGTTCAGTCTTTCA-3' (서열번호 56)
vWF, CD31, 및 FⅧ의 mRNA의 수준을 도 6b에 나타내었다(ND: 검출되지 않음). 도 6b에 나타난 바와 같이, 내피세포의 마커인 CD31 및 vWF는 모든 내피세포에서 증폭되었다. inv-Pa 및 del-Pa 클론으로부터 분화된 내피세포에서는 FⅧ 엑손 21 및 23에 해당하는 PCR 밴드는 검출되지 않은 반면에, 교정된 iPSC 클론으로부터 분화된 내피세포에서 FⅧ mRNA가 증폭되었다.
FⅧ 활성을 측정하고, 그 결과를 도 6c에 나타내었다(*: 모세포와 비교하여 p <0.001). 도 6c에 나타난 바와 같이, 교정된 iPSC 클론으로부터 분화된 내피세포는 모 환자 iPSC 클론으로부터 분화된 내피세포과 비교하여 FⅧ 활성 수준(%)이 유의하게 상승하였다.
(2) 내피세포의 생체 내 이식
기능적 회복 수준을 조사하기 위해, 모 환자 iPSC(inv-Pa와 del-Pa) 및 교정된 iPSC(inv-K1e1와 del-K1e1)로부터 유도된 내피 세포를 FⅧ 결핍 HA 마우스에 정맥 내 이식하였다.
구체적으로, HA 마우스(Jackson Laboratory, B6; 129S4-F8tm1Kaz/J)를 사용하였다. 8주령의 마우스에 꼬리 정맥을 통해 환자 iPSC 또는 FⅧ 녹-인 iPSC 유래 1×106 내피세포(100 ㎕의 PBS 중)를 주사하였다. 면역 억제를 위해, 내피세포의 이식 전에 항-LFA-1 및 CTLA4-Ig(BioXCell) 20 mg/kg을 복강 내 주사하였다. 이식 3일 후, 꼬리 절단(snip)을 통해 혈액 시료를 채취하였다. 혈액 시료와 3.8%(w/v) 소듐 시트레이트 용액(시트레이트 부피:혈액 부피=1:9)을 혼합한 후 20℃에서 1,500x g에서 10 분간 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 수득된 혈장 시료를 사용하여 FⅧ 활성을 산출하였다. 음성 대조군으로 이식하지 않은 HA 마우스를 이용하였다. 모든 동물 실험은 연세대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다(IACUC-2017-0138).
산출된 FⅧ 활성(%)을 도 6d에 나타내었다(HA: 이식되지 않은 마우스, n.s.: 유의하지 않음, *: inv-Pa과 비교하여 p <0.05, **: del-Pa과 비교하여 p <0.01). 도 6d에 나타난 바와 같이, 이식되지 않은 마우스(0.8%) 및 환자 iPSC-유래 세포(inv-Pa에서 1.1% 및 del-Pa에서 1.2%)에 비해 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 교정된 iPSC 유래 내피세포의 이식이 생체 내에서 FⅧ 결핍을 기능적으로 회복시켰다는 것을 나타낸다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for correcting blood coagulation factor VIII and method using the same <130> PN123130KR <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 1 <400> 1 cagtataaac tgacctgttg ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 2 <400> 2 cacaaggcta tgctatctat agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 3 <400> 3 cccaacaggt cagtttatac tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 4 <400> 4 atagccttgt ggctaatacc agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 5 <400> 5 ctatagatag catagccttg tgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 6 <400> 6 acaaggctat gctatctata ggg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 7 <400> 7 tgagctttaa agaccccaac agg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 8 <400> 8 ccagtataaa ctgacctgtt ggg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-chain guide RNA 9 <400> 9 cagtataaac tgacctgttg ggg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7E1 Forward primer <400> 10 gtgagctaag gaatgtgata cag 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7E1 Reverse primer <400> 11 acccatggaa attgggcact g 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7E1 Reverse primer 2 <400> 12 aggctgagac agaagaatcg cct 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of on-target <400> 13 atagccttgt ggctaatacc 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for on-target <400> 14 gatttgtttg agagaaacta cc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for on-target <400> 15 ccttgagctt taaagacccc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of off-target 1 <400> 16 acagccctgt ggctaacact 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for off-target 1 <400> 17 atggttagca gtcaaccgtg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 1 <400> 18 ccacaaacaa gaggtcatcc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequenc of off-target 2 <400> 19 aaagcctggt ggctgataac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for off-target 2 <400> 20 cttcactacc atcccccact 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 2 <400> 21 acttttgaca tccatcgccg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of off-target 3 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Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 5 <400> 30 tacactaggg gtcattgagc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of off-target 6 <400> 31 agagccttgt gactaatact 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for off-target 6 <400> 32 aggaaagcgt ctactgttag 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 6 <400> 33 gtgttaaatc tagtgtgttg c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of off-target 7 <400> 34 ttagtctggt ggctaataca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for off-target 7 <400> 35 ccttcagagt ggaatgctat 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 7 <400> 36 attagaagcg tcctggtagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of off-target 8 <400> 37 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Sequence <220> <223> Reverse primer for off-target 10 <400> 45 taagttcccc acagcatctc 20 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 46 caacccagtc ctccttacct tgc 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer <400> 47 gcctgagggg atcaattctc tag 23 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 48 ggccctttcg tcttcaagaa ttccg 25 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 49 ccgttgcgaa aaagaacgtt cac 23 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer <400> 50 gttaggcctg tgtcaacagt ttgg 24 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer complementary to nucleotide sequence of exon 21 <400> 51 ccggatcaat caatgcctgg ag 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer complementary to nucleotide sequence of exon 23 <400> 52 atgagttggg tgcaaacgga tg 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWF Forward primer <400> 53 tcgggcttca cttacgttct 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWF Reverse primer <400> 54 ccttcactcg gacacactca 20 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 Forward primer <400> 55 ggtcagcagc atcgtggtca acataac 27 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD31 Reverse primer <400> 56 tggagcagga caggttcagt ctttca 26

Claims (18)

  1. 인간 H11 유전자 좌위(locus)의 뉴클레오티드 서열과 동일 또는 상보적인 2개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 가이드(guide) RNA 또는 이를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
    혈액 응고 인자 Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ; FⅧ 또는 F8) 유전자의 1번째 엑손(exon) 내지 26번째 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑손을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
    혈액 응고 인자 Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ; FⅧ 또는 F8)의 교정용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)를 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 PAM은 5'-TGG-3', 5'-TAG-3', 5'-AGG-3', 및 5'-CTG-3'으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 뉴클레오티드 내지 100 뉴클레오티드인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합은 벡터에 포함된 것인 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 벡터는 에피좀성(episomal) 벡터인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, FⅧ 유전자의 녹-인(knock-in)을 위한 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo) 투여용인 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, RNA 가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease: RGN) 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 RNA 가이드 뉴클레아제는 Cas 폴리펩티드인 것인 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 Cas 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드인 것인 조성물.
  13. A형 혈우병(Hemophilia A: HA) 환자의 체세포로부터 역분화된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 수득하는 단계;
    상기 유도만능 줄기세포와 청구항 1의 조성물을 접촉시켜 상기 유도만능 줄기세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는,
    FⅧ 유전자가 교정된 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 FⅧ 유전자가 교정된 유도만능 줄기세포는 그의 유전체(genome) 중 H11 유전자 좌위에 FⅧ 유전자의 1번째 엑손 내지 26번째 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 엑손이 삽입된 것인 방법.
  15. 청구항 13의 방법에 의하여 제조된 유도만능 줄기세포.
  16. 청구항 15의 유도만능 줄기세포로부터 분화된 내피 세포.
  17. 청구항 1의 조성물, 청구항 15의 유도만능 줄기세포, 또는 청구항 16의 내피 세포를 포함하는 A형 혈우병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 개체에 청구항 1의 조성물, 청구항 15의 유도만능 줄기세포, 또는 청구항 16의 내피 세포를 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법.
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