CN111184735A - 一种促进肌肉增长的组合物及其用途 - Google Patents

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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Abstract

本公开涉及一种促进肌肉增长的组合物及其用途。具体来说，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含微小RNA拮抗剂，其中所述微小RNA拮抗剂包含一种或多种微小RNA‑7拮抗剂。进一步的，本公开提供了一种新的可以用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长的活性成分，并且提供的用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长的组合物，具有良好的治疗效果。

Description

一种促进肌肉增长的组合物及其用途
技术领域
本申请的方面涉及生物化学和医学领域。更具体地，本文公开了新颖的微小RNA(microRNA)拮抗剂、包含一种或更多种这样的微小RNA拮抗剂的治疗性组合物，以及用这样的微小RNA拮抗剂促进肌肉生长的方法。
背景技术
MicroRNA(微小RNA)是一类21-23nt的非编码RNA，其前体约为70-100nt，形成标准的stem结构，加工后成为21-23nt的单链RNA。MicroRNA普遍存在于动植物中，高度保守，在机体的生长、发育、疾病发生和发展中起到了基因调控作用。MicroRNA的作用机制是与RNA互补，让RNA沉默或降解，从而参与基因的表达调控，其中最重要的是位于5’端第2-8位的序列，被称为“seed”序列，对于microRNA-mRNA识别至关重要。
MicroRNA-7(微小RNA-7)是一种高度保守的非编码RNA，其表达在时间和空间上都受到了严格的控制，不仅在机体的发育和成熟过程中十分重要，在包括癌症、帕金森综合症、糖尿病、心脏疾病等多种疾病中也扮演重要角色。在人中，微小RNA-7的表达来源于三个基因位点，HNRNPK、第15号染色体的基因间隔区，和PGSF1a。虽然每一个微小RNA-7基因都会转录出一条不同的微小RNA-7前体，但是最终都形成相同的成熟微小RNA-7。在小鼠中，有两种成熟的微小RNA-7表达，微小RNA-7a和微小RNA-7b,其中微小RNA-7a与人微小RNA-7的序列相同，而微小RNA-7a与微小RNA-7b虽相差一个核苷酸，但seed序列相同，识别序列也相同。
肌肉作为人体的最大器官，在运动、代谢和免疫调控中发挥重要作用。由衰老引起的肌肉减少、创伤引起的肌肉缺失和疾病引起的肌肉病变，导致患者失能，威胁患者生命，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。肌肉的增加不仅能够帮助健康人群塑造健康优美的体魄，提高运动成绩和劳动效率，更能帮助患者治疗由衰老、创伤和疾病等各种原因引起的机体功能(不仅有运动功能，还有免疫、代谢等重要功能)的减退。目前还没有以肌肉减少/缺失为适应症的药物，临床上治疗其他疾病的部分药物可能使肌肉获益，进而扩展用于缓解肌肉异常。包括同化激素、活性维生素D、β肾上腺能受体兴奋剂、血管紧张素转换酶抑制剂、生长激素等。此外运动疗法(例如有氧运动和抗阻训练)和物理因子治疗(例如水疗和功能性电刺激)也被应用于部分缓解肌肉异常。上述各种疗法均存在疗效有限，副作用大等问题。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术中存在的缺陷，在本公开的一种实施方式中，提供一种组合物，所述组合物可以作为药物，用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长，所述组合物中含有。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种表达盒(expression cassette)，所述表达盒包含编码一种或更多种微小RNA-7拮抗剂的核苷酸序列。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种表达载体，所述克隆或表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码一种或更多种微小RNA-7拮抗剂的核苷酸序列。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种治疗性组合物，所述治疗性组合物包含有效量所述组合物、所述表达盒或所述表达载体。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种调节肌细胞增殖的方法，所述方法包括施用有效量所述组合物、所述表达盒或所述表达载体。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量所述组合物、所述表达盒或所述表达载体。
在本公开的另一种实施方式中，其提供一种用于抑制或减少靶微小RNA的表达的方法，所述方法包括将治疗性组合物与肌细胞接触或提供给肌细胞。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
(1)一种组合物，所述组合物包含微小RNA拮抗剂，其中所述微小RNA拮抗剂包含一种或多种微小RNA-7拮抗剂。
(2)根据(1)所述的组合物，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有至少90％、95％、96％、97、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；可选的，所述反义微小RNA-7在非常高严格条件下与(i)或(ii)所示的多核苷酸杂交：
(i)如SEQ ID NO：2所示的序列；
(ii)(i)的全长互补多核苷酸。
(3)根据(1)所述的组合物，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有一个或更多个取代的核碱基的核苷酸序列。
(4)根据(2)-(3)中任一项所述的组合物，其中反义微小RNA中的至少一种包含选自由以下组成的组的一种或更多种化学修饰：修饰的核苷间连接、修饰的核苷酸和修饰的糖部分及其组合；可选的，所述组合物为药物制剂。
(5)一种表达盒，所述表达盒包含编码一种或更多种微小RNA-7拮抗剂的核苷酸序列。
(6)根据(5)所述的表达盒，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有至少90％、95％、96％、97、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；可选的，所述反义微小RNA-7在非常高严格条件下与(i)或(ii)所示的多核苷酸杂交：
(i)如SEQ ID NO：2所示的序列；
(ii)(i)的全长互补多核苷酸。
(7)根据(5)所述的表达盒，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有一个或更多个取代的核碱基的核苷酸序列。
(8)根据(6)-(7)中任一项所述的表达盒，其中反义微小RNA中的至少一种包含选自由以下组成的组的一种或更多种化学修饰：修饰的核苷间连接、修饰的核苷酸和修饰的糖部分及其组合。
(9)一种表达载体，所述表达载体包含根据(5)-(8)中任一项所述的表达盒。
(10)根据(9)所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体；优选的，所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
(11)一种药物组合物，所述治疗性组合物包含有效量的以下的一种或更多种：a)包含一种或多种微小RNA拮抗剂的根据(1)-(4)中任一项所述的组合物；b)根据(5)-(8)中任一项所述的表达盒；和c)根据(9)-(10)中任一项所述的表达载体。
(12)一种调节肌细胞增殖的方法，所述方法包括1)将治疗性组合物引入肌细胞中，其中(a)所述治疗性组合物是根据(1)-(4)中任一项所述的组合物；(b)所述治疗性组合物包含根据(5)-(8)中任一项所述的表达盒；和/或(c)所述治疗性组合物包含根据(9)-(10)中任一项所述的表达载体；和2)允许从步骤(1)获得的所述肌细胞分裂，从而调节所述肌细胞的增殖。
(13)根据(12)所述的方法，其中所述引入包括用至少一种表达盒或至少一种病毒载体转染所述肌细胞，所述至少一种表达盒或至少一种病毒载体包含编码所述多种微小RNA拮抗剂的核酸序列。
(14)根据(12)-(13)中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述肌细胞的增殖。
(15)根据(12)-(14)中任一项所述的方法，其中与缺少编码所述多种微小RNA拮抗剂的核酸序列的对照肌细胞相比，所述肌细胞的增殖被增加。
(16)根据(12)-(15)中任一项所述的方法，其中所述肌细胞是体内的或离体的；可选的，所述肌细胞在人类受试者中。
(17)根据(12)-(16)中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体；优选的，所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
(18)一种用于治疗肌营养不良或促进肌肉生长的方法，所述方法包括向受试者施用或提供治疗性组合物，其中：
(a)所述治疗性组合物是根据(1)-(4)中任一项所述的组合物；
(b)所述治疗性组合物包含根据(5)-(8)中任一项所述的表达盒；和/或
(c)所述治疗性组合物包含根据(9)-(10)中任一项所述的表达载体；
可选的，其中所述治疗性组合物的施用与有效量的至少一种另外的治疗剂或至少一种另外的疗法组合进行，以提供组合疗法。
(19)一种用于抑制或减少靶微小RNA的表达的方法，所述方法包括将治疗性组合物与肌细胞接触或提供给肌细胞，其中：
(a)所述治疗性组合物是根据(1)-(4)中任一项所述的组合物；
(b)所述治疗性组合物包含根据(5)-(8)中任一项所述的表达盒；和/或
(c)所述治疗性组合物包含根据(9)-(10)中任一项所述的表达载体；
可选的，所述治疗性组合物和至少一种另外的治疗剂或疗法的组合，与所述肌细胞接触或提供给所述肌细胞。
发明的效果
在本公开的一种实施方式中，其提供了一种新的可以用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长的活性成分。
在本公开的一种实施方式中，其通过实验证明，本公开提供的用于治疗肌营养不良(MD)或促进肌肉生长的组合物，具有良好的治疗效果。
附图说明
图1为过表达微小RNA-7抑制肌肉干细胞分化的实验结果图。
图2为抑制微小RNA-7促进肌肉干细胞分化的实验结果图。
图3为过表达微小RNA-7抑制肌肉再生的实验结果图。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，除非上下文中另有说明，否则例如“一个/种(a,an)”、“所述(said)”或“所述(the)”等指示对象旨在支持单数和/或复数情况二者。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
如本公开所使用的，术语“约”表示：一个数值包括测定该数值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。示例性的，前述标准偏差一般为原始数值相差5％的范围之内。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，在两种核酸比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸序列按照一致的核苷酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数，在比对部分的全部核苷酸数中的比例。
如本公开所使用的，两个或更多个多核苷酸之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸的核苷酸序列对准且对经对准的多核苷酸中含有相同核苷酸的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸中含有不同核苷酸的位置数目进行比较。多核苷酸可，例如通过含有不同核苷酸或缺失核苷酸而在一个位置处不同。多序列同一性可通过用含有相同核苷酸的位置数目除以多核苷酸的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸的位置数目除以多核苷酸中核苷酸的总数且乘以100来计算同一性百分比。
如本公开所使用的，术语“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
如本公开所使用的，术语“表达载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。
如本公开所使用的，术语“重组表达载体”指多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“慢病毒载体(Lentiviral vector)”有广阔的宿主范围，能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
如本公开所使用的，术语“逆转录病毒载体”为具有如下功能的载体：其缺失了逆转录病毒结构基因gag、env和pol，但是前述基因的缺失不影响病毒载体其它部分的活性；与此同时，“逆转录病毒载体”可以保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。
如本公开所使用的，术语“腺病毒载体”中的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。
如本公开所使用的，术语“腺相关病毒(AAV)”，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其能感染多种细胞。“腺相关病毒载体”源于非致病的野生型腺相关病毒，具有其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点。
如本公开所使用的，“miR拮抗剂”指被设计为干扰或抑制miRNA活性的剂。在某些实施方案中，miR拮抗剂包含靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中，miR拮抗剂包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在其他实施方案中，miR拮抗剂包含干扰或抑制miRNA活性的小分子或类似物。
在本公开公开的组合物的各种实施方案中，所述“化学修饰”包括选自由以下组成的组的一种或更多种化学修饰：修饰的核苷间连接、修饰的核苷酸和修饰的糖部分及其组合。在一些实施方案中，一种或更多种化学修饰包括修饰的核苷间连接。在一些实施方案中，修饰的核苷间连接选自由以下组成的组：硫代磷酸酯、2’-O甲氧基乙基(MOE)、2’-氟代、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酸酯(acetamidate)、羧甲基酯及其组合。在一些实施方案中，修饰的核苷间连接包括硫代磷酸酯核苷间连接。
在一些实施方案中，一种或更多种化学修饰中的至少一种包括修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述针对核苷酸的修饰包括：甲基化修饰、硫代修饰、胆固醇修饰。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括锁核酸(LNA)化学修饰、肽核酸(PNA)、阿拉伯糖核酸(arabino-nucleic acid；FANA)、其类似物、衍生物或组合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括锁核酸(LNA)。在一些实施方案中，锁核酸(LNA)被掺入到修饰的反义微小RNA的一端或两端。
在一些实施方案中，一种或更多种化学修饰中的至少一种包括修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分或其组合。在一些实施方案中，修饰的糖部分包含2’-O-甲基糖部分。在本公开公开的组合物的一些实施方案中，组合物还被配制成药物制剂。
虽然本公开中的组合物可以作为原料施用，但是考虑到它们的效力，优选将其作为药物制剂呈现。因此，在本公开公开的组合物的一些实施方案中，组合物还被配制成药物制剂。如本公开使用的术语“药物制剂”指适于施用至个体的包括药剂的组合物。例如，根据本公开内容的一些方面和实施方案的药物制剂可以包含本公开公开的反义微小RNA拮抗剂和无菌水溶液。例如，用于人类使用的本公开内容的药物制剂包含该剂以及一种或更多种可接受的载体和任选的其他治疗性成分。载体必须在与制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”，并且对其受体无害或对活性剂的抑制功能无害。理想的是，药物制剂不应包括氧化剂和已知与剂不相容的其他物质。
因此，本公开中的一些实施方案涉及包括本公开描述的治疗性组合物和药学上可接受的载体的药物制剂。制剂还可以包含另外的成分，诸如稀释剂、稳定剂、赋形剂和佐剂。如本公开使用的，“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂、佐剂或稳定剂是以所用剂量和浓度对暴露于其的细胞或受试者无毒的那些，或者具有由熟练的专业人员确定的可接受的毒性水平的那些。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1：在肌肉干细胞中导入微小RNA-7后，肌管细胞分化受到抑制
我们在小鼠的肌肉干细胞中过表达微小RNA-7，然后诱导肌肉干细胞分化，并且检测MyHC、Myogenin、MCK在细胞中的表达情况。
实验步骤：
1-3个月C57/B6野生型小鼠用于肌肉干细胞的分离。小鼠处死后,取四肢肌肉。Collagenase D(BD)和Dispase II(Roche)于37℃消化1.5小时。肌肉组织充分消化后使用带血清的培养基(F10+20％FBS，Gibco)终止消化。70μm滤网(BD)过滤未消化的组织块和其他杂质。1500rpm离心后使用PBS重悬，反复2次。随后使用荧光标记的抗体anti-CD45-PerCP-cy5.5(BD),anti-CD11-PerCP-cy5.5(BD),anti-CD31-PerCP-cy5.5(BD),anti-Sca1-AF700(eBioscience)，和biotinylated anti-VCAM antibodies(BioLegend)，冰上孵育40分钟，随后用streptavidin-PE-Cy7(BioLegend)继续冰上孵育40分钟。
CD45-/CD11-/CD31-/Sca1-/VCAM+的肌肉干细胞通过FACS分选获得。肌肉干细胞培养在Collagen I包被的F10培养基中(F10培养基含有20％FBS和2.5ng/ml FGF)，使用Lipofectmine 2000(Life Technologies)，按照说明书的内容，转染微小RNA-7(50nM)。其中，微小RNA-7的序列为：UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU(SEQ ID NO：1)
转染两天后使用分化培养基F10和2％马血清诱导肌肉干细胞的分化。分化完成后，分别收集细胞进行MyHC染色、Western blot、和RT-qPCR实验。
MyHC染色的步骤如下：分化的肌管细胞用PBS洗3次，用4％甲醛室温固定15分钟。用PBS洗3次，加入0.1％Triton，室温10分钟。用PBS洗3次，加入在含有1％BSA的PBS中稀释500倍的MyHC抗体(Upstate,05-716)，4℃孵育过夜。用PBS洗三次，每次5分钟。加入在含1％BSA PBS溶液中1：1000稀释的荧光标记的驴抗兔二抗(Thermo Scientific)，室温孵育1小时。用PBS洗一次，加入含有20μM DAPI的PBS,室温5分钟，用PBS洗三次，每次5分钟。加入抗猝灭剂后封片。在Zeiss激光共聚焦显微镜下观察拍照。
Western blot的步骤如下：肌管细胞使用细胞裂解液(50mM Tris-HCl pH 7.4,100mM NaCl,0.5％Tween-20,0.5％NP-40,5mM PMSF and 1mM DTT)重悬，冰上孵育30分钟。13,200rpm/min 4℃离心30分钟，上清转入另一干净EP管中。加入SDS上样缓冲液后进行SDS-PAGE电泳后，转膜至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜首先通过5％脱脂牛奶室温封闭1小时，再进行MyHC抗体(Upstate)和GAPDH抗体(Protein Tech)4℃孵育过夜。硝酸纤维素膜使用TBST洗三次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1小时，TBST洗三次。最后使用化学发光检测仪器(Thermo Scientific)进行显色。
RT-qPCR实验的步骤如下：收集对照组肌管细胞和转染微小RNA-7的肌管细胞，置于1.5ml EP管中，加入1mlTrizol，充分吹吸破碎细胞。13,200rpm/min 4℃离心10分钟，上清转入另一干净EP管中。加入200μl苯酚：氯仿(24：1)，涡旋震荡充分混匀，13，200rpm/min4℃离心15分钟。上清转入一干净EP管中，加入500μl异丙醇，充分混匀，13,200rpm/min 4℃离心15分钟。弃上清，用75％乙醇洗两次，每次13,200rpm/min 4℃离心5分钟。弃上清，室温放置5-10分钟晾干，加入30-50μl DEPC水溶解，此即为总RNA。然后将总RNA反转录为cDNA。取RNA1μg，加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mM dNTP混合物，4μM Oligo dT,1μl RNase inhibitor 42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在90℃灭活10分钟，作为PCR模板。使用上面列出的正向和反向引物，进行实时荧光定量PCR检测目的基因的表达量。PCR条件为95℃ 10分钟，95℃ 30秒，60℃ 60秒，第二和第三步反复循环40次。采用GAPDH作为内参，所用引物序列为
GAPDH F:ACCCAGAAGACTGTGGATGG(SEQ ID NO：3)
GAPDH R:ACACATTGGGGGTAGGAACA(SEQ ID NO：4)
同时检测肌肉中肌肉分化特异性基因MyHC、Myogenin、MCK的表达作为肌肉分化的标记。所用引物为：
MyHC F:TCGATGACCTCGCTAGTAACA(SEQ ID NO：5)
MyHC R:TTTCGTCTAGCTGGCGTGAG(SEQ ID NO：6)
Myogenin F:ACTCCCTTACGTCCATCGTG(SEQ ID NO：7)
Myogenin R:CAGGACAGCCCCACTTAAAA(SEQ ID NO：8)
MCK F:CATGGAGAAGGGAGGCAATA(SEQ ID NO：9)
MCK R:GACGAAGGCGAGTGAGAATC(SEQ ID NO：10)
实验结果：如说明书附图1所示，我们发现肌管细胞的形成受到明显抑制(图1)。体现在肌管细胞的数量明显变少，细小且短。
具体来说，如图1中的A部分所示，在肌肉干细胞中过表达微小RNA-7后诱导肌肉干细胞分化，肌管细胞的免疫荧光染色结果。其中，红色代表的是MyHC染色；蓝色代表的是DAPI染色；Merge代表的是不同染色(MyHC和DAPI)的叠加的结果。相比较于对照组，转染微小RNA-7的肌管细胞明显更小。
与此同时，图1中的B部分示出了，在肌肉干细胞中过表达微小RNA-7后诱导肌肉干细胞分化，收集未分化和分化后的细胞，进行Western blot蛋白印记实验的结果。
进一步的，图1中的C部分示出了，在肌肉干细胞中过表达微小RNA-7后诱导肌肉干细胞分化，收集分化后的细胞，进行RT-qPCR实验，检测Myogenin、MCK、MyHC的表达量。其中，星号代表P值小于0.05的显著差异。
实施例2：在肌肉干细胞中导入微小RNA-7的反义核苷酸，肌管细胞分化得到增强
我们在小鼠的肌肉干细胞中导入微小RNA-7的反义核苷酸，抑制微小RNA-7的表达，然后诱导肌肉干细胞分化，并且检测MyHC、Myogenin、MCK在细胞中的表达情况。
实验步骤：
除了使用Lipofectmine 2000(Life Technologies)按照说明书的内容，转染微小RNA-7的反义核苷酸(50nM)外，其它步骤和实施例1相同。
其中，反义微小RNA-7的序列为：ACAACAAAATCACTAGTCTTCCA(SEQ ID NO：2)。其中，前述全序列均进行甲基化修饰，在5’端和3’端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3’端连接有高亲和性胆固醇修饰。
实验结果：如说明书附图2所示，我们发现肌管细胞的分化得到增强。
具体来说，如2中的A部分所示，在肌肉干细胞中导入微小RNA-7的反义核苷酸后，诱导肌肉干细胞分化，肌管细胞的免疫荧光染色。其中，红色代表的是MyHC染色；蓝色代表的是DAPI染色；Merge代表的是不同染色(MyHC和DAPI)的叠加的结果。
与此同时，图2中的B部分示出了，在肌肉干细胞中导入微小RNA-7的反义核苷酸后，诱导肌肉干细胞分化，收集未分化和分化后的细胞，进行Western blot蛋白印记实验的结果。
进一步的，图2中的C部分示出了，在肌肉干细胞中导入微小RNA-7的反义核苷酸后，诱导肌肉干细胞分化，收集分化后的细胞，进行RT-qPCR实验，检测Myogenin、MCK、MyHC的表达量。其中，星号代表P值小于0.05的显著差异。
实施例3：在小鼠肌肉中过表达微小RNA-7，肌肉再生受到抑制
我们在诱导小鼠肌肉损伤的同时，通过腺病毒在肌肉中导入微小RNA-7，观察肌肉再生所受到的影响。
实验步骤：
采用三个月龄C57BL/6小鼠，于胫骨前肌注射表达微小RNA-7的腺病毒，注射体积为50μl，浓度为1.0x107 unit/μl，连续注射7天。7天后，15μlCTX(10μM，Sigma)用于胫骨前肌注射诱导肌肉损伤，分上、中、下三个注射位点，每个位点5μl。7天后，收集肌肉样品用于一下分析。
将小于100mg的老年或成年肌肉包埋于OCT中，置于液氮中冷冻30秒制成冰冻样品，用于制作冷冻切片，厚度8μm。切片用于苏木精－伊红(HE)染色，确定肌纤维轮廓，统计肌纤维大小。
HE染色方法如下：染色方法如下：冰冻切片用PBS洗3次。切片入苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1-3min。将切片固定：依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
随机选取不同的视野，统计至少1500个肌纤维，通过ImageJ软件计算计算肌纤维的面积。
实验结果：如说明书附图3所示，我们通过HE染色，发现肌肉再生受到严重抑制。
具体来说，如图3中A部分和B部分所示，CTX诱导肌肉损伤的同时，在小鼠TA中注射可表达微小RNA-7的腺病毒，5天后收集肌肉，OCT包埋做冰冻切片后，进行苏木精－伊红(HE)染色的结果。其中，红色代表肌肉细胞；蓝色代表细胞核。从图3中A部分和B部分可以发现，注射可表达微小RNA-7的腺病毒后，肌肉细胞的数量明显减少。
进一步的，如图3中C部分所示，每个视野中再生肌肉细胞的数量统计。星号代表P值小于0.05的显著差异。其同样证明了，注射可表达微小RNA-7的腺病毒后，肌肉细胞的数量明显减少。
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 苏州神肌赢生物医药科技有限公司
<120> 一种促进肌肉增长的组合物及其用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Homo sapiens/Mus musculus
<400> 1
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaacaaaat cactagtctt cca 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccagaaga ctgtggatgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acacattggg ggtaggaaca 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgatgacct cgctagtaac a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttcgtctag ctggcgtgag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actcccttac gtccatcgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggacagcc ccacttaaaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catggagaag ggaggcaata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacgaaggcg agtgagaatc 20

Claims (11)

1.一种组合物，所述组合物包含微小RNA拮抗剂，其中所述微小RNA拮抗剂包含一种或多种微小RNA-7拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有至少90％、95％、96％、97、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；可选的，所述反义微小RNA-7在非常高严格条件下与(i)或(ii)所示的多核苷酸杂交：
(i)如SEQ ID NO：2所示的序列；
(ii)(i)的全长互补多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有一个或更多个取代的核碱基的核苷酸序列。
4.根据权利要求2至3中任一项所述的组合物，其中反义微小RNA中的至少一种包含选自由以下组成的组的一种或更多种化学修饰：修饰的核苷间连接、修饰的核苷酸和修饰的糖部分及其组合；可选的，所述组合物为药物制剂。
5.一种表达盒，所述表达盒包含编码一种或更多种微小RNA-7拮抗剂的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其中，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有至少90％、95％、96％、97、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；可选的，所述反义微小RNA-7在非常高严格条件下与(i)或(ii)所示的多核苷酸杂交：
(i)如SEQ ID NO：2所示的序列；
(ii)(i)的全长互补多核苷酸。
7.根据权利要求5所述的表达盒，所述一种或更多种微小RNA-7拮抗剂中的至少一种包含反义微小RNA-7，所述反义微小RNA-7包含与选自如SEQ ID NO：2所示的序列具有一个或更多个取代的核碱基的核苷酸序列。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的表达盒，其中反义微小RNA中的至少一种包含选自由以下组成的组的一种或更多种化学修饰：修饰的核苷间连接、修饰的核苷酸和修饰的糖部分及其组合。
9.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求5至8中任一项所述的表达盒。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体；优选的，所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
11.一种药物组合物，所述治疗性组合物包含有效量的以下的一种或更多种：a)包含一种或多种微小RNA拮抗剂的根据权利要求1至4中任一项所述的组合物；b)根据权利要求5至8中任一项所述的表达盒；和c)根据权利要求9至10中任一项所述的表达载体。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI LI等: "MyoD-induced circular RNA CDR1as promotes myogenic differentiation of skeletal muscle satellite cells", 《BBA-GENE REGULATORY MECHANISMS》, vol. 1862, 16 July 2019 (2019-07-16), pages 807 - 821 *
SHAWNA DOWNING等: "MicroRNA-7 directly targets Reg1 in pancreatic cells", 《AM J PHYSIOL CELL PHYSIOL》, vol. 317, 5 June 2019 (2019-06-05), pages 366 *

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