JP7054556B2 - 神経変性疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents
神経変性疾患の予防又は治療用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7054556B2 JP7054556B2 JP2020525838A JP2020525838A JP7054556B2 JP 7054556 B2 JP7054556 B2 JP 7054556B2 JP 2020525838 A JP2020525838 A JP 2020525838A JP 2020525838 A JP2020525838 A JP 2020525838A JP 7054556 B2 JP7054556 B2 JP 7054556B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mir
- spg4
- spast
- gene
- function
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 17
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title description 27
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title description 27
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 6
- 108091049902 miR-33a stem-loop Proteins 0.000 claims description 126
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 33
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 claims description 2
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000664527 Homo sapiens Spastin Proteins 0.000 description 87
- 102100038829 Spastin Human genes 0.000 description 86
- 108091081013 MiR-33 Proteins 0.000 description 60
- 208000031629 Autosomal dominant spastic paraplegia type 4 Diseases 0.000 description 59
- 201000007473 hereditary spastic paraplegia 4 Diseases 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 230000006870 function Effects 0.000 description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 34
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 32
- 102000004880 Spastin Human genes 0.000 description 30
- 108090001068 Spastin Proteins 0.000 description 30
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 22
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 21
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 20
- 108091037290 miR-33b stem-loop Proteins 0.000 description 19
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 19
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 101150078320 SPAST gene Proteins 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 208000008675 hereditary spastic paraplegia Diseases 0.000 description 10
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 10
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 9
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 101000629597 Homo sapiens Sterol regulatory element-binding protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000629605 Homo sapiens Sterol regulatory element-binding protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 206010041415 Spastic paralysis Diseases 0.000 description 6
- 102100026839 Sterol regulatory element-binding protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100026841 Sterol regulatory element-binding protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 101150092476 ABCA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108700005241 ATP Binding Cassette Transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100033616 Phospholipid-transporting ATPase ABCA1 Human genes 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 102100027766 Atlastin-1 Human genes 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101100149977 Homo sapiens SPAST gene Proteins 0.000 description 2
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 2
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 2
- -1 L-Myc Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010074436 Sterol Regulatory Element Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010074438 Sterol Regulatory Element Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 2
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 2
- 101710202239 Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101710192130 Atlastin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101100424903 Homo sapiens GTF2B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000870426 Homo sapiens Phospholipase DDHD1 Proteins 0.000 description 1
- 101000870428 Homo sapiens Phospholipase DDHD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000665838 Homo sapiens Receptor expression-enhancing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005736 Nervous System Malformations Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100034178 Phospholipase DDHD1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034179 Phospholipase DDHD2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100038271 Receptor expression-enhancing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 101150044214 Srebf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008078 Sterol Regulatory Element Binding Protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008079 Sterol Regulatory Element Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- KMJPKUVSXFVQGZ-UHFFFAOYSA-N TF2B Natural products OC1CC2=C(O)C=C(O)C=C2OC1C(C1=C2)=CC(O)=C(O)C1=C(O)C(=O)C=C2C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2CC1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 KMJPKUVSXFVQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033662 Transcription initiation factor IIB Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002594 corticospinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000056978 human SPAST Human genes 0.000 description 1
- 102000049234 human SREBF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000049151 human SREBF2 Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004322 lipid homeostasis Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008035 nerve activity Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009038 pharmacological inhibition Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000037436 splice-site mutation Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、例えば遺伝性痙性対麻痺（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｓｐａｓｔｉｃ Ｐａｒａｐｌｅｇｉａ；ＨＳＰ）ＳＰＧ４（以下、「ＨＳＰ－ＳＰＧ４」と称する場合がある）等の神経変性疾患の予防又は治療用組成物に関する。
遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）は、皮質脊髄運動路における神経突起の変性に起因する下肢の進行性の痙性麻痺を特徴とする神経変性疾患であり、ＨＳＰの多くは、ＳＰＡＳＴ遺伝子に変異を有するＨＳＰ－ＳＰＧ４である（非特許文献１）。ＳＰＡＳＴ遺伝子は、ＳＰＡＳＴＩＮと呼ばれる微小管切断タンパク質をコードする。
従来において、ＨＳＰ－ＳＰＧ４に対する治療法としては、小胞体ストレスを軽減させて細胞死を抑制するような治療法しかなく、直接的な治療法がない。
従来において、ＨＳＰ－ＳＰＧ４に対する治療法としては、小胞体ストレスを軽減させて細胞死を抑制するような治療法しかなく、直接的な治療法がない。
Ｈｅｎｓｏｎ Ｂ．Ｊ．ら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１２年，Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ５，ｅ３６５０５
本発明は、上述の実情に鑑み、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ；ｍｉＲ）－３３をノックアウトしたヒトｉＰＳ細胞を用いて、発現量が増加する遺伝子をデータベースにて探索した結果、ＳＰＡＳＴ遺伝子を抽出した。上述のように、ＳＰＡＳＴ遺伝子は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の原因遺伝子であることが既に知られていた。
一方、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞を用いてｉＰＳ細胞を樹立し、神経細胞へと分化誘導した。ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞において、ＳＰＡＳＴ遺伝子にコードされるタンパク質（ＳＰＡＳＴＩＮ）に変異（エキソン９）があるという既知の事象を確認した。また、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞を神経細胞に分化誘導させたところ、神経突起が短く、枝分かれが少ないことが分かった。さらに、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞から分化誘導させた神経細胞において、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドでｍｉＲ－３３ａを抑制したところ、ＳＰＡＳＴＩＮが増加し、ＨＳＰ－ＳＰＧ４による神経細胞軸索の短縮が改善し、このようにｍｉＲ－３３ａを抑制することで、ＨＳＰ－ＳＰＧ４を直接的に治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、ｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤。
（２）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、神経変性疾患の予防又は治療用組成物。
（３）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（２）記載の予防又は治療用組成物。
（４）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（１）～（３）のいずれか１記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（５）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（４）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（６）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（５）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（７）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（６）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（８）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を対象に投与することを含む、神経変性疾患の予防又は治療方法。
（９）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（８）記載の方法。
（１０）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（８）または（９）記載の方法。
（１１）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１０）記載の方法。
（１２）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（１１）記載の方法。
（１３）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（１２）記載の方法。
（１４）神経変性疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質の使用。
（１５）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（１４）記載の使用。
（１６）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（１４）または（１５）記載の使用。
（１７）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１６）記載の使用。
（１８）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（１７）記載の使用。
（１９）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（１８）記載の使用。
（２０）神経変性疾患の予防又は治療における使用のための、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質。
（２１）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（２０）記載の物質。
（２２）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（２０）または（２１）記載の物質。
（２３）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（２２）記載の物質。
（２４）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（２３）記載の物質。
（２５）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（２４）記載の物質。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１１９２５１号の開示内容を包含する。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ；ｍｉＲ）－３３をノックアウトしたヒトｉＰＳ細胞を用いて、発現量が増加する遺伝子をデータベースにて探索した結果、ＳＰＡＳＴ遺伝子を抽出した。上述のように、ＳＰＡＳＴ遺伝子は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の原因遺伝子であることが既に知られていた。
一方、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞を用いてｉＰＳ細胞を樹立し、神経細胞へと分化誘導した。ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞において、ＳＰＡＳＴ遺伝子にコードされるタンパク質（ＳＰＡＳＴＩＮ）に変異（エキソン９）があるという既知の事象を確認した。また、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞を神経細胞に分化誘導させたところ、神経突起が短く、枝分かれが少ないことが分かった。さらに、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者由来細胞から分化誘導させた神経細胞において、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドでｍｉＲ－３３ａを抑制したところ、ＳＰＡＳＴＩＮが増加し、ＨＳＰ－ＳＰＧ４による神経細胞軸索の短縮が改善し、このようにｍｉＲ－３３ａを抑制することで、ＨＳＰ－ＳＰＧ４を直接的に治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、ｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤。
（２）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有する、神経変性疾患の予防又は治療用組成物。
（３）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（２）記載の予防又は治療用組成物。
（４）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（１）～（３）のいずれか１記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（５）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（４）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（６）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（５）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（７）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（６）記載のｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤又は神経変性疾患の予防若しくは治療用組成物。
（８）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を対象に投与することを含む、神経変性疾患の予防又は治療方法。
（９）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（８）記載の方法。
（１０）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（８）または（９）記載の方法。
（１１）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１０）記載の方法。
（１２）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（１１）記載の方法。
（１３）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（１２）記載の方法。
（１４）神経変性疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質の使用。
（１５）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（１４）記載の使用。
（１６）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（１４）または（１５）記載の使用。
（１７）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１６）記載の使用。
（１８）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（１７）記載の使用。
（１９）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（１８）記載の使用。
（２０）神経変性疾患の予防又は治療における使用のための、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質。
（２１）神経変性疾患がＨＳＰ－ＳＰＧ４である、（２０）記載の物質。
（２２）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質が、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸である、（２０）または（２１）記載の物質。
（２３）ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸が、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（２２）記載の物質。
（２４）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその１２塩基以上の連続した塩基配列から成る、（２３）記載の物質。
（２５）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、（２４）記載の物質。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１１９２５１号の開示内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤は、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有するものである。本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤によれば、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の原因遺伝子であるＳＰＡＳＴ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに存在するｍｉＲ－３３の結合部位へのｍｉＲ－３３ａの結合を抑制することで、ＳＰＡＳＴ遺伝子によりコードされるＳＰＡＳＴＩＮタンパク質の発現を増加させ、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の症状（例えば、神経細胞軸索の短縮）を改善することができる。換言すれば、本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療用組成物ということができる。以下では、本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤及び神経変性疾患の予防又は治療用組成物を併せて「本発明に係る薬剤」という場合がある。
ここで、ｍｉＲ－３３ａの機能とは、ＳＰＡＳＴ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに存在するｍｉＲ－３３の結合部位に結合し、当該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するか、又は当該ｍＲＮＡの分解を誘導することによって、ＳＰＡＳＴ遺伝子の発現を抑制することを意味する。
また、本発明に係る薬剤により予防又は治療することができる神経変性疾患は、ｍｉＲ－３３ａを原因とする神経変性疾患であれば特に限定されないが、ＨＳＰ－ＳＰＧ４であることが好ましい。
本発明に係る薬剤の有効成分であるｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質は、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害することが可能であればどのような物質であっても、特に限定されないが、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であることが好ましい。
また、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸は、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であれば特に限定されないが、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－３３ａと当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが有するｍｉＲ－３３ａの少なくとも部分配列に相補的な鎖とがハイブリダイズすることによって、ｍｉＲ－３３ａのレベルを抑制するか又はｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）は、２０～２５塩基長の一本鎖のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写される。次いで、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡとなる。
ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列（配列番号１）に基づいて公知の手法により化学的に合成することができる。ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖若しくはその部分配列（例えば、シード配列を含む１２～２０塩基等の１２塩基以上の連続した塩基配列）を含むか又は当該相補鎖若しくはその部分配列から成ることが好ましい。
また、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の１～２１番目、好ましくは２～１３番目の塩基配列にハイブリダイズすることができる塩基配列を含み得る。
さらに、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の少なくとも一部と完全に相補的な塩基配列を含むことは必ずしも必要ではなく、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％相補的な塩基配列を含んでいればよい。
ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－３３ａにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ及び５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件（例えば、４５℃又は６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃又は６５℃以上の温度条件で洗浄すること等）も含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。当該ヌクレオチド分子は、安定性（化学的安定性及び／又は酵素に対する安定性）又は比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート及びホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、－ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’－Ｏ－Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよい。当該化学修飾としては、例えばピリミジン塩基の５位へのメチル基若しくはカチオン性官能基の導入、又は、２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。
ＲＮＡの糖部のコンフォーメーションは、Ｃ２’－ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’－ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。従って、ｍｉＲ－３３ａに対して強い結合能を付与するために、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が好ましく使用される。ＢＮＡは、２’酸素と４’炭素とを架橋することによって、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体である。ＢＮＡとしては、例えば２’酸素と４’炭素がメチレンによって架橋された２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）とも称される）、及び２’酸素と４’炭素がエチレンにより架橋されたＥＮＡが挙げられる。
例えば、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ）が配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖の５’側から３’側方向に９、１１、１３、１５、１７及び／又は１９番目の位置に配置される。
具体的なｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施例で使用された「ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３」（配列番号２４）である。当該ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３は、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列における２～１３番目の塩基配列の相補鎖に相当する核酸であって、ＬＮＡが配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖の５’側から３’側方向に９、１１、１３、１５、１７及び１９番目の位置に配置され、且つ各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、核酸である。
本発明に係る薬剤は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、皮下若しくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、脊髄内的又は経鼻的）に投与することができる。経口投与のための剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射用水性剤、注射用油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、製薬上許容される担体又は添加剤を含有することができる。
本発明に係る薬剤を投与する対象としては、例えばヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ等の哺乳動物が挙げられる。本発明に係る薬剤は、ヒトに対して好適に用いられる。
本発明に係る薬剤は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば有効成分がｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、且つヒトに対して投与される場合、１日当たり１２０～２４０μｇ／ｋｇ体重のｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与されるように用いられる。
また、本発明は、上述の本発明に係る薬剤に準じて、
ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を対象に投与することを含む、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療方法；
ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質の使用；
ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療における使用のための、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質；
に関する。
本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤は、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を有効成分として含有するものである。本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤によれば、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の原因遺伝子であるＳＰＡＳＴ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに存在するｍｉＲ－３３の結合部位へのｍｉＲ－３３ａの結合を抑制することで、ＳＰＡＳＴ遺伝子によりコードされるＳＰＡＳＴＩＮタンパク質の発現を増加させ、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の症状（例えば、神経細胞軸索の短縮）を改善することができる。換言すれば、本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療用組成物ということができる。以下では、本発明に係るｍｉＲ－３３ａ機能阻害剤及び神経変性疾患の予防又は治療用組成物を併せて「本発明に係る薬剤」という場合がある。
ここで、ｍｉＲ－３３ａの機能とは、ＳＰＡＳＴ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに存在するｍｉＲ－３３の結合部位に結合し、当該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するか、又は当該ｍＲＮＡの分解を誘導することによって、ＳＰＡＳＴ遺伝子の発現を抑制することを意味する。
また、本発明に係る薬剤により予防又は治療することができる神経変性疾患は、ｍｉＲ－３３ａを原因とする神経変性疾患であれば特に限定されないが、ＨＳＰ－ＳＰＧ４であることが好ましい。
本発明に係る薬剤の有効成分であるｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質は、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害することが可能であればどのような物質であっても、特に限定されないが、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であることが好ましい。
また、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸は、ｍｉＲ－３３ａにハイブリダイズし、且つ該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であれば特に限定されないが、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－３３ａと当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが有するｍｉＲ－３３ａの少なくとも部分配列に相補的な鎖とがハイブリダイズすることによって、ｍｉＲ－３３ａのレベルを抑制するか又はｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）は、２０～２５塩基長の一本鎖のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写される。次いで、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡとなる。
ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列（配列番号１）に基づいて公知の手法により化学的に合成することができる。ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖若しくはその部分配列（例えば、シード配列を含む１２～２０塩基等の１２塩基以上の連続した塩基配列）を含むか又は当該相補鎖若しくはその部分配列から成ることが好ましい。
また、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の１～２１番目、好ましくは２～１３番目の塩基配列にハイブリダイズすることができる塩基配列を含み得る。
さらに、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の少なくとも一部と完全に相補的な塩基配列を含むことは必ずしも必要ではなく、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％相補的な塩基配列を含んでいればよい。
ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－３３ａにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、該ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する核酸であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ及び５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件（例えば、４５℃又は６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃又は６５℃以上の温度条件で洗浄すること等）も含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。当該ヌクレオチド分子は、安定性（化学的安定性及び／又は酵素に対する安定性）又は比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート及びホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、－ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’－Ｏ－Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよい。当該化学修飾としては、例えばピリミジン塩基の５位へのメチル基若しくはカチオン性官能基の導入、又は、２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。
ＲＮＡの糖部のコンフォーメーションは、Ｃ２’－ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’－ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。従って、ｍｉＲ－３３ａに対して強い結合能を付与するために、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が好ましく使用される。ＢＮＡは、２’酸素と４’炭素とを架橋することによって、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体である。ＢＮＡとしては、例えば２’酸素と４’炭素がメチレンによって架橋された２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）とも称される）、及び２’酸素と４’炭素がエチレンにより架橋されたＥＮＡが挙げられる。
例えば、ｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ）が配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖の５’側から３’側方向に９、１１、１３、１５、１７及び／又は１９番目の位置に配置される。
具体的なｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施例で使用された「ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３」（配列番号２４）である。当該ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３は、配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列における２～１３番目の塩基配列の相補鎖に相当する核酸であって、ＬＮＡが配列番号１記載のヒト成熟ｍｉＲ－３３ａの塩基配列の相補鎖の５’側から３’側方向に９、１１、１３、１５、１７及び１９番目の位置に配置され、且つ各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、核酸である。
本発明に係る薬剤は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、皮下若しくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、脊髄内的又は経鼻的）に投与することができる。経口投与のための剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射用水性剤、注射用油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、製薬上許容される担体又は添加剤を含有することができる。
本発明に係る薬剤を投与する対象としては、例えばヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ等の哺乳動物が挙げられる。本発明に係る薬剤は、ヒトに対して好適に用いられる。
本発明に係る薬剤は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば有効成分がｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、且つヒトに対して投与される場合、１日当たり１２０～２４０μｇ／ｋｇ体重のｍｉＲ－３３ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与されるように用いられる。
また、本発明は、上述の本発明に係る薬剤に準じて、
ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質を対象に投与することを含む、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療方法；
ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質の使用；
ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患の予防又は治療における使用のための、ｍｉＲ－３３ａの機能を阻害する物質；
に関する。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いたＳＰＧ４遺伝性痙性対麻痺の治療標的としてのｍｉＲ－３３ａの同定〕
１．序論
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するか、又はｍＲＮＡ分解を促進する小さな非タンパク質コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、様々な細胞の状況において、細胞型、組織及び種特異的な標的制御を示す。従って、適切な細胞型、組織及び種においてｍｉＲＮＡ機能を研究することが重要である。以前に、本発明者等は、ｍｉＲ－３３がｍｉＲ－３３欠損マウスの使用によって脂質恒常性を制御することを示した。しかしながら、ヒトにおけるｍｉＲ－３３の生理学的機能は、適切なモデルの欠如のために依然として未知であった。
ｍｉＲ－３３は、ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂの２つのアイソフォームを有する。ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂは、成熟形態においてわずか２ヌクレオチドだけ異なるが、それらのシード配列においては同一である。ｍｉＲ－３３ａは進化を通じて高度に保存されているが、ｍｉＲ－３３ｂは大型哺乳動物のＳＲＥＢＦ１遺伝子にのみ存在し、齧歯類はｍｉＲ－３３ｂを欠いている。
ヒトにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂの新規標的遺伝子を調査するために、本発明者等は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術により、ｍｉＲ－３３単一（ｍｉＲ－３３ａ又はｍｉＲ－３３ｂ）及び二重（ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂ）ノックアウトヒトｉＰＳＣを作製し、それらのトランスクリプトームを分析した。
本実施例では、ＳＰＡＳＴがヒトにおけるｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを明らかにした。実際には、ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲのｍｉＲ－３３結合部位は、マウスではなく中～大型哺乳動物で保存されており、マウスのＳＰＡＳＴに対するｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂの役割を明らかにすることは不可能である。ＳＰＡＳＴは、ＳＰＡＳＴＩＮと呼ばれる微小管切断タンパク質をコードし、ＳＰＡＳＴ（以前は「ＳＰＧ４」として知られていた）遺伝子の変異は、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の最も一般的な原因である。本発明者等は、ｍｉＲ－３３ａが、ＳＰＧ４患者のｉＰＳＣ由来皮質ニューロンにおいてＳＰＡＳＴ発現を調節し、病理学的表現型に影響を与えることを示した。さらに、ロックド核酸－アンチ－ｍｉＲ（ＬＮＡ）を介した、ヒトニューロンにおけるｍｉＲ－３３の主要な形態であるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者ニューロンにおいて病理学的表現型を改善した。このように、ｍｉＲ－３３ａは、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の治療のための治療標的であり得る。
２．結果
２－１．ｍｉＲ－３３ノックアウトヒトｉＰＳＣの作製
ヒト細胞におけるｍｉＲ－３３の役割を調べるために、本発明者等はヒトｉＰＳＣからｍｉＲ－３３単一ノックアウト（ＫＯ）及びｍｉＲ－３３二重ＫＯ細胞を作製した。
一対のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現ベクターを構築し（表１）、それらを、二本鎖切断を導入するためにＤ１０Ａ Ｃａｓ９ ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）と共にコントロールｉＰＳＣ（「２０１Ｂ７」と命名）に共エレクトロポレーションした。
オフターゲット突然変異誘発を最小限に抑えるためにダブルニッキングアプローチを選択した。以前の研究では、ｍｉＲＮＡシード領域が、高効率で且つ特異的にｍｉＲＮＡ遺伝子をノックアウトするための最も好ましい切断部位であることが示されており、本発明者等は、各シード領域内／その隣接のＰＡＭ（ＮＧＧ）をトリガーとした。二重対立遺伝子欠失のスクリーニングを容易にするために、上記の手順を相同組換えドナーベクターと組み合わせ、ネオマイシン及び／又はピューロマイシン耐性選択を可能にした（図１ａ）。
成熟ｍｉＲ－３３配列欠失及びｌｏｘＰ配列挿入等のｉｎｄｅｌｓの予測されたサイズは、ＤＮＡ配列決定によって同定された（図１ｂ、図２ａ）。ＫＯ ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂ発現の完全な消失は、ＲＴ－ＰＣＲ分析（図２ｂ）によって確認されたが、ＰＣＲベースのｍｉＲＮＡ測定のためにわずかなシグナルが残っていた。ＳＲＥＢＦ２及びＳＲＥＢＦ１のイントロンによってコードされるｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの欠失は、それらの宿主遺伝子のタンパク質レベル及びスプライシングに影響しなかった（図２ｃ及びｄ）。
さらに、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の欠失がそれらの宿主遺伝子の活性化を干渉することなく確立されたかどうかを確認しようと試みた。ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害剤であるＮＫ１０４は、ＳＲＥＢＦ２の転写を活性化し、また、ＬＸＲアゴニストであるＴ０９０１３７は、ＳＲＥＢＦ１発現を増強する。これらの薬理学的刺激により、コントロール及びＫＯ ｉＰＳＣにおけるＳＲＥＢＦ２及びＳＲＥＢＦ１ ｍＲＮＡは有意に増加し、コントロールｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂの発現レベルは並行して増加した。各ＫＯ ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの発現レベルは、それらの宿主遺伝子の刺激によっても検出されなかったので、ｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの完全な喪失は、ｍｉＲ－３３単一及び二重ＫＯ ｉＰＳＣにおいて達成された（図１ｃ及びｄ）。
染色体Ｑバンド分析は、確立されたｉＰＳ系統が正常な核型を有することを示した（図１ｅ）。
２－２．ｍｉＲ－３３はヒトにおいてＳＰＡＳＴ発現を調節する
ｍｉＲ－３３のヒト細胞への効果を分析するために、ｍｉＲ－３３単一、二重ＫＯ及びコントロールｉＰＳＣ（２０１Ｂ７）を用いてマイクロアレイ分析を行った。マイクロアレイデータは、コントロールに対して、ｍｉＲ－３３ａ ＫＯにおいて９３個のアップレギュレート遺伝子及び１９１個のダウンレギュレート遺伝子、ｍｉＲ－３３ｂ ＫＯにおいて９９個のアップレギュレート遺伝子及び１１０個のダウンレギュレート遺伝子、ｍｉＲ－３３二重ＫＯ ｉＰＳＣにおいて４９個のアップレギュレート遺伝子及び１２７個のダウンレギュレート遺伝子を検出した（倍数変化＞２）（図３ａ）。
公的データベースＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）を使用して、ｍｉＲ－３３単一、二重ＫＯ ｉＰＳＣの全てにおいてアップレギュレートされた遺伝子の中でｍｉＲ－３３標的遺伝子について検索した。図３ｂに示すように、ＳＰＡＳＴがこの方法によって同定されたただ１つの遺伝子であった。
次に、ＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロッティング分析によってＳＰＡＳＴ及びＳＰＡＳＴＩＮ発現レベルを検証した（図３ｃ及びｄ）。ＳＰＡＳＴにおける２つの翻訳開始コドンの存在により、２つのＳＰＡＳＴＩＮアイソフォーム（「Ｍ１」と呼ばれる完全長アイソフォーム、及び「Ｍ８７」と呼ばれるわずかに短いアイソフォーム）が合成される。Ｍ８７は、ニューロン及び非ニューロン組織の両方においてより豊富である。
ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲは、中～大型哺乳動物においてｍｉＲ－３３の潜在的結合部位を有する。しかしながら、マウスには標的部位が存在しない（図３ｅ）。ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲの推定ｍｉＲ－３３標的配列が翻訳抑制を媒介できるかどうかを試験するために、ＳＰＡＳＴ転写物の３’－ＵＴＲをルシフェラーゼ発現プラスミドに挿入し（ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２－ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂによれば、コントロールベクター（ｍｉＲ－コントロール）と比較してルシフェラーゼ活性が低下した（図３ｆ）。３’－ＵＴＲの潜在的結合部位における突然変異は、ｍｉＲ－３３の効果を無効にした（図３ｇ）。
２－３．ＳＰＡＳＴＩＮ活性の消失は、遺伝性痙性対麻痺ＳＰＧ４（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の特徴的な表現型である
ＳＰＡＳＴ遺伝子の突然変異（２ｐ２２．３に位置する）は、ＨＳＰの最も一般的な原因である。ほとんどの場合、常染色体優性のＨＳＰ－ＳＰＧ４は、下肢の痙攣及び衰弱に起因する歩行障害を伴うプロトタイプのＨＳＰであると考えられている。
ヒトのＳＰＡＳＴ遺伝子の調節におけるｍｉＲ－３３の効果を考慮して、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の阻害が１つの正常なＳＰＡＳＴ対立遺伝子の活性化を促進し、続いて病理学的表現型を減少させると仮説を立てた。この仮説に取り組むために、ＳＰＧ４患者１人と健常対照者からｉＰＳＣ（「ｈｃ１－Ａ」及び「ｈｃ３－Ａ」と称する）を作製した。当該患者は、スプライス部位を変化させるＳＰＡＳＴ遺伝子のイントロン９に位置するヘテロ接合Ｇ＞Ａ置換を有し（ＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ）、エキソン９のスキッピングを引き起こす。エキソン９は、当該遺伝子のＡＡＡカセットコード領域内にある（図４ａの系統）。ＨＳＰ患者のこのＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ変異は、以前に記載されていた。この領域を配列決定して、ＳＰＧ４由来ｉＰＳＣがＳＰＡＳＴ遺伝子の当該変異を維持していることを確認した（図４ｂ、図５ａ－ｂ）。染色体Ｑバンド分析は、ＳＰＧ４由来のこのｉＰＳＣが正常な核型を有することを示した（図５ｃ）。
細胞表現型を調べるために、本発明者等は、以前に記載された無血清凝集浮遊培養（ＳＦＥＢｑ）法によってＳＰＧ４及びコントロールｉＰＳＣを皮質ニューロンに分化させた。ＳＰＧ４は常染色体優性突然変異によって引き起こされるので、ＳＰＧ４患者は、１つの対立遺伝子が機能しない場合、ＳＰＡＳＴＩＮ活性の約５０％を有する可能性が高い。以前の研究では、スプライス部位変異を有するＳＰＧ４患者由来のニューロンは、コントロールと比較して約５０％のＳＰＡＳＴＩＮタンパク質レベルの減少を示すことが明らかにされている。これと一致して、コントロールと比較してＳＰＡＳＴ ｍＲＮＡ及びＳＰＡＳＴＩＮタンパク質レベルの両方が有意に低下した（図４ｃ及びｄ）。
最後に、ＳＰＧ４由来の神経突起の形態を調べた。免疫蛍光染色により、ＳＰＧ４由来の皮質ニューロンにおいて全神経突起の長さ及び分岐点の数が減少することが明らかとなった（図４ｅ）。
２－４．ｍｉＲ－３３は、ＳＰＡＳＴ ３’ＵＴＲ調節を介してｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンの神経突起の長さを減少させる
以前の研究は、ＳＰＡＳＴＩＮレベルの低下が観察された疾患の表現型と直接関連していることを示し、ＳＰＡＳＴＩＮを過剰発現するＳＰＧ４由来のニューロンが神経突起伸長欠損を救済できることが示されている。ｍｉＲ－３３がＳＰＡＳＴ発現を直接調節し、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経表現型に影響するかどうかを調べるために、本発明者等は、レンチウイルス構築物をＳＰＧ４由来ニューロンに同時トランスフェクトした。
シナプシンＩニューロンドライバーの存在下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－潜在的結合部位を含む３’－ＵＴＲを伴う／伴わないＳＰＡＳＴ（ベクター１及びベクター２）を過剰発現させた。コントロールとしてＧＦＰ過剰発現ＳＰＧ４ニューロンを用いた（図６ａ）。
以前の報告と一致して、ＳＰＡＳＴＩＮを過剰発現するＳＰＧ４由来のニューロンは、ＧＦＰコントロールと比較して神経突起の長さを回復させた。ベクター１又はベクター２のいずれかの過剰発現による同時トランスフェクトＣＭＶ駆動ｍｉＲコントロールは、ＳＰＧ４由来ニューロンにおける神経突起の長さの回復をもたらした。しかしながら、ＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａのベクター２との同時トランスフェクションは、ベクター１で観察されなかった神経突起の長さを減少させた（図６ｂ、図７ａ－ｂ）。
２－５．ロックド核酸－アンチ－ｍｉＲを介したｍｉＲ－３３ａの阻害は神経突起の長さを改善する
本発明者等は、ｍｉＲ－３３が、ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲを標的とすることによって、ＳＰＧ４由来ニューロンにおいて神経表現型を調節することを示した。ｍｉＲ－３３の阻害がＳＰＧ４の潜在的治療標的であるかどうかを調べるために、ＳＰＧ４－ｉＰＳＣをＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３ａ（ＬＮＡ－ｍｉＲ－３３ａ）又はコントロール（ＬＮＡ－コントロール）でトランスフェクトした。ｍｉＲ－３３ａを選択した理由としては、ｍｉＲ－３３ａの絶対的レベルが、未分化状態及び神経分化の両方においてｍｉＲ－３３ｂよりも豊富であったためである（図８ａ）。
ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３ａのノックダウン効率を確認するために、ｍｉＲ－３３ａの発現レベルを、トランスフェクションの４８時間後にＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて、ｍｉＲ－３３ａのノックダウンが約４０％であった（図８ｂ）。
ｍｉＲ－３３ａのダウンレギュレーションは、ｍｉＲ－３３ａの直接下流標的として知られているＡＢＣＡ１のアップレギュレーションと関連していた（図８ｃ）。
本発明者等は、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経突起の長さがＬＮＡ－ｍｉＲ－３３ａのトランスフェクションの４８時間後に有意に回復したことを観察し、このことはＳＰＧ４の治療のためのｍｉＲ－３３ａ阻害の治療可能性を示唆するものである（図９ａ及びｂ）。
さらに、宿主遺伝子のｍＲＮＡ発現及びタンパク質レベルと並行して、コントロールと比較して、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおいて、ｍｉＲ－３３ａの発現の増強が観察された（図１０ａ－ｃ）。ｍｉＲ－３３ａ上昇の原因を同定するために、ｓｈＲＮＡ構築物のレンチウイルス感染を用いてＳｐａｓｔ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｎｅｕｒｏ ２ａ系統を樹立した。それぞれＳｐａｓｔ ＲＮＡｉ系統１及び２におけるＳｐａｓｔ ｍＲＮＡ発現の約５０％がノックダウンした（図１０ｄ）。ＲＴ－ＰＣＲの結果によれば、コントロールと比較してｓｐａｓｔｉｎが減少したニューロン細胞が、宿主遺伝子Ｓｒｅｂｆ２と並行してｍｉＲ－３３ａの発現レベルを増加させる傾向があることが明らかになった（図１０ｅ）。このように、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおけるｍｉＲ－３３ａの発現の増強は、ＳＰＡＳＴＩＮ減少の直接的な効果であり得る。
３．考察
以前の報告では、マウスにおけるｍｉＲ－３３の役割が、脂質代謝の調節因子としての証拠と共に探求されてきた。しかしながら、ヒトにおいては、適切なモデルを欠いていたため、依然として不明確であった。
本実施例において、本発明者等は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってｍｉＲ－３３単一（ｍｉＲ－３３ａ又はｍｉＲ－３３ｂ）及び二重（ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂ）ノックアウトｉＰＳＣを作製し、これらのＫＯ ｉＰＳＣにおける成熟ｍｉＲ－３３生合成の完全な欠失を示した。さらに、ＳＰＡＳＴがヒトにおけるｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを同定した。遺伝性痙性対麻痺の原因遺伝子の１つであるＳＰＡＳＴは、ｍｉＲ－３３によって直接的に調節された。ＬＮＡによるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンの病理学的表現型を部分的に減少させた。合成ＲＮＡオリゴによるｍｉＲ－３３ａの阻害が１つの正常なＳＰＡＳＴ対立遺伝子の活性化を促進し、続いて病理学的表現型を減少させることが推測される。
ｍｉＲＮＡの特異的で安定したノックアウトは、ｍｉＲＮＡの機能を研究する上で不可欠である。ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックアウトは、ｍｉＲＮＡの機能喪失の研究に関する最も信頼できる技術である。近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術が多様なモデルの機能遺伝子の研究に応用されている。さらに、幾つかの刊行物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術がｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの末端ループ又は５’領域を標的とすることによってｍｉＲＮＡ発現を抑制し得ることを報告した。本実施例では、宿主遺伝子の発現に影響を与えずに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってｍｉＲ－３３単一及び二重ノックアウトｉＰＳＣを作製した。
神経変性疾患は、主に遺伝子の発現レベルの変化を伴うタンパク質症と考えられている。以前の研究では、ＳＰＧ４由来ニューロンは、ヒトＥＣＳ由来ニューロンをｓｉＲＮＡによってＳＰＡＳＴＩＮを枯渇させた場合に観察された表現型に類似する、より短く、且つより分岐の少ない一次神経突起の数がより少ないことが示された。さらに、ＳＰＧ４由来ニューロンにおけるＳＰＡＳＴＩＮの過剰発現は、それらの病理学的表現型を回復させ、このことは、ＳＰＧ４表現型がＳＰＡＳＴＩＮ投与量に依存することを示唆している。ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者に見られる突然変異の圧倒的大部分は、突然変異ＳＰＡＳＴ対立遺伝子から生成されたＳＰＡＳＴＩＮの微小管作用活性を無効にし、理論的には数が少ないがより安定した微小管の蓄積が生じ２６、発生において神経系異常を引き起こすことである。
本実施例では、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の阻害が１つの正常な対立遺伝子の転写の促進を介してＳＰＡＳＴＩＮレベルを増加させることができ、続いて病理学的表現型を減少させると仮説を立てた。この仮説に対処するために、１人のＳＰＧ４患者と対照者からｉＰＳＣを生成した。以前の研究と一致して、本発明者等のＳＰＡＳＴ ＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ変異を有するＳＰＧ４由来ニューロンが神経突起の長さ及び分枝の障害を示すことが観察された。さらに、結合部位を含む３’ＵＴＲを有するか又は有しないＳＰＡＳＴのいずれかの過剰発現を伴う同時トランスフェクトされたＣＭＶ駆動ｍｉＲコントロールが、ＳＰＧ４由来ニューロンにおける神経突起の長さ及び正常分枝を回復させるのに十分であることを観察した。一方、３’ＵＴＲを有するＳＰＡＳＴを伴う同時トランスフェクトされたＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａは、３’ＵＴＲを有しないＳＰＡＳＴの場合には観察されなかった神経突起表現型の回復を損なった。本発明者等のデータは、ｍｉＲ－３３ａがＳＰＡＳＴ発現を直接調節し、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経表現型に影響を及ぼすことを示した。
幾つかのｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びＬＮＡは、現在、様々な疾患の臨床試験において研究中である。本実施例では、ｍｉＲ－３３ａのＬＮＡに基づく薬理学的阻害が、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンにおいて神経突起の長さを回復させることが示された。ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング研究は、当初癌分野で行われ、特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３３を含む）が、腫瘍抑制機能又は腫瘍形成能を有するとして同定されている。最近、ｍｉＲＮＡプロファイル研究により、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）等の神経変性疾患において示差的に発現されるｍｉＲＮＡが同定された。本発明者等は、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおけるｍｉＲ－３３ａの発現の増強を観察し、これはｍｉＲ－３３ａのＬＮＡに基づく阻害の実質的効果を説明し得る。ＨＳＰは、ＳＰＡＳＴＩＮ（ＳＰＧ４）、ＡＴＬＡＳＴＩＮ－１（ＳＰＧ３）及びＲＥＥＰ１（ＳＰＧ３１）タンパク質をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる。これまでの報告では、これらのタンパク質が互いに結合して、細胞全体に管状小胞体ネットワークを形成し、脂質液滴の形成及び拡大にも関与していることが示された。さらに、ＨＳＰ遺伝子の劣性形態は、ＤＤＨＤ１及びＤＤＨＤ２等の脂肪酸代謝に関与する遺伝子発現の変化に関連付けられている。これらのデータ及びＳｐａｓｔ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｎｅｕｒｏ ２ａ系統を用いた本発明者等の実験は、ＨＳＰの脂質代謝の変化が、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおいてｍｉＲ－３３ａを上昇させる可能性があることを示唆した。
まとめると、本発明者等は、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の原因遺伝子の１つであるＳＰＡＳＴが、ヒトにおいてｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを同定した。ＬＮＡによるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンの神経突起長の減少等の病理学的表現型を正常化した。本発明者等のデータは、ｍｉＲ－３３ａがＳＰＧ４の治療のための潜在的な治療法であり得ることを示した。
４．方法
４－１．ｉＰＳＣの生成と細胞培養
以前に報告されているように（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．３１，４５８－４６６（２０１３））、ＯＣＴ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びドミナントネガティブｐ５３、又はＯＣＴ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びｐ５３－ｓｈＲＮＡのためのエピソームベクターを用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＴリンパ球からＳＰＧ４患者のｉＰＳＣを作製し、４ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したヒトｉＰＳＣ培地（霊長類胚性幹細胞培地；ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＳＮＬフィーダー層上で培養した。
４－２．遺伝子ターゲティングのためのプラスミドの構築
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎプラスミドについては、ガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を用いて設計した。ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（表１）を、ｐＨＬ－Ｈａ－ｃｃｄＢプラスミドに挿入した。供与体プラスミドを構築するために、選択カセット及びＰＣＲによって増幅されたゲノム配列５’及び３’の断片を挿入することによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を改変した。各相同アームを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて５’及び３’相同性アームとして結合させた。
４－３．遺伝子ターゲティングによるｉＰＳＣのゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎのトランスフェクションについては、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、それぞれ３μｇの２つのｇＲＮＡプラスミド、５μｇのＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９）プラスミド及び１０μｇのドナープラスミドで、１×１０６個のｉＰＳＣをエレクトロポレーションした。トランスフェクションした細胞を、フィーダー細胞上にプレーティングし、１０μＭのＹ－２７６３２を補充したヒトＥＳ培地で１日間培養した。トランスフェクションの３日後、ネオマイシン及び／又はピューロマイシン選択を適用し、１０日間続けた。耐性コロニーを取り出し、ゲノムＤＮＡ抽出及びＰＣＲスクリーニングのために拡大した。選択カセットを除去するために、エレクトロポレーションによりＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミド（ｐＣＸＷ－Ｃｒｅ－Ｐｕｒｏ）で細胞を一過的にトランスフェクションし、ピューロマイシン耐性コロニーを選択した。選択カセット切除並びにｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの二重対立遺伝子欠失は、ゲノムＰＣＲスクリーニング及びサンガー配列決定分析によって確認した。
４－４．皮質ニューロン分化の誘導
ヒトｉＰＳＣを単一細胞に解離させ、１００％エタノール中の２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で予めコーティングした浮遊培養用のＵ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋ－ｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において迅速に再凝集させた。胚様体（ＥＢ）の凝集体を、神経誘導段階（０～８日目）において５％ＤＦＫ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１Ｍ ２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；２μＭ ドルソモルフィン及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む又は有さない）中で培養した。誘導後、ＥＢをマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）コーティング６ウェル培養プレート上に移し、１×Ｎ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＭ ドルソモルフィン及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２を補充して、パターニング段階（８～２４日目）において培養した。パターニング段階後、遊走した神経前駆細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてプレート底から分離して、ビタミンＡを含まない１ｘＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ－３を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ＦＵＬＬ，Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）中、マトリゲルでコーティングした１２ウェル若しくは２４ウェル培養プレート又はカバースリップ上で、神経成熟段階において培養し、次いで、実験まで培養した。
４－５．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、既述の標準的な方法を用いて行った４０。サンプルを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）から成る溶解バッファーで溶解した。溶解バッファーに、使用直前に完全ミニプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＬＬＮ（２５μｇ ｍｌ－１）、０．５ｍＭ ＮａＦ及び１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を補充した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて測定した。全てのサンプル（タンパク質１０μｇ）を溶解バッファーに懸濁し、ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲルを用いて分画し、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルローストランスファーメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ）に転写した。メンブレンを、５％脱脂乳を含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて１時間ブロッキングし、ＳＰＡＳＴＩＮに対する一次抗体（Ｓ７０７４，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＢＣＡ１に対する一次抗体（ＮＢ４００－１０５，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＳＲＥＢＰ－１に対する一次抗体（２Ａ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＲＥＢＰ－２に対する一次抗体（Ｃａｙｍａｎ）、ＴＦ２Ｂに対する一次抗体（ＥＰ４５８８，Ａｂｃａｍ）、βアクチンに対する一次抗体（Ｃ４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％Ｔ－ＰＢＳ）中での洗浄ステップの後、メンブレンを二次抗体（抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合；１：２，０００）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンを０．０５％Ｔ－ＰＢＳで洗浄し、ＬＡＳ－４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＥＣＬウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
４－６．ＲＮＡ抽出及びｑＰＴ－ＰＣＲ
ＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて全ＲＮＡを単離精製し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造業者の説明書に従って、１００ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ－ＰＣＲのために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、特定の遺伝子を４０サイクルで増幅した。発現は、ハウスキーピング遺伝子である１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化した。遺伝子特異的プライマーを表２に示す。
４－７．ｍｉＲＮＡの定量ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて単離した。ｍｉＲ－３３を、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プロトコルに従って測定し、生成物をサーマルサイクラー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴ配列検出システム）を用いて分析した。サンプルを、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ発現によって標準化した。また、ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂのオリゴヌクレオチド１６ｐＭ、４ｐＭ、１ｐＭ、２５０ｆＭ、６２．５ｆＭ及び１５．６２５ｆＭを測定し、検量線を作成した。サンプルの吸光度値を計算して濃度を算出した。
４－８．デュアルルシフェラーゼアッセイ
ＳＰＡＳＴの３’－ＵＴＲの完全長ＰＣＲ断片をヒトｉＰＳＣ ｃＤＮＡから増幅し、ｐｓｉ－ＣＨＥＣＫ２－ｌｅｔ－７ ８Ｘベクター（ａｄｄｇｅｎｅ）にサブクローニングした。ＷＴ又は変異体３’－ＵＴＲルシフェラーゼレポーター遺伝子を作製するために、以下のＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲの断片をｐｓｉ－ＣＨＥＣＫ２－ｌｅｔ－７ ８Ｘベクターに挿入した：
ルシフェラーゼ活性は、以前に記載のように測定した４１。
４－９．ＳＰＡＳＴＩＮ及びＧＦＰの過剰発現
ＳＰＡＳＴの全長３’－ＵＴＲを有するか又は有しないヒトＳＰＡＳＴをヒトｉＰＳＣからクローニングし、ｐＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターに挿入し、次いでＣＭＶプロモーターを、比較的ニューロン特異的なシナプシンＩプロモーターと置換した。製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、２９３ＦＴ細胞中にレンチウイルスストックを産生した。要するに、トランスフェクションの４８時間後にウイルス含有培地を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。細胞に、ＳＰＡＳＴ、３’－ＵＴＲを有するＳＰＡＳＴ又は空のＧＦＰコントロールレンチウイルスを感染させた。神経細胞培養物をＤＮＡ形質導入後１０日間分化させた。感染細胞はＧＦＰで強調された。
４－１０．ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３による細胞トランスフェクション
製造者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１０ｎＭ ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３又はＬＮＡ－コントロールで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を分析に使用した。
ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３は、以下の配列を有する核酸である：
また、ＬＮＡ－コントロールは、以下の配列を有する核酸である：
（表記規則）Ｎ（Ｌ）＝ＬＮＡ，５（Ｌ）＝ＬＮＡ＿ｍＣ（５－メチルシトシン），＾＝ホスホロチオエート結合。
４－１１．免疫細胞化学
細胞を、室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）において固定し、ＰＢＳでリンスした。細胞を、室温で１０分間、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含有するＰＢＳ中で透過処理し、続いてＰＢＳでリンスした。非特異的結合を、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳ ｐｈａｒｍａｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で室温で６０分間ブロックした。細胞を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いで適切な蛍光標識二次抗体で標識した。核を標識するためにＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）を使用した。以下の一次抗体を免疫細胞化学で使用した：
βＩＩＩチューブリン（１：１０００，ＣＳＴ，５５６８Ｓ）。免疫細胞化学の陽性カウント率を評価するために、ＡｒｒａｙＳｃａｎによる自動顕微鏡検査を用いて細胞を画像化し、ＨＣＳＳｔｕｄｉｏ ２．０細胞分析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、免疫染色構造を計数した。
４－１２．統計分析
データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。統計的比較は、図の凡例に示すように、独立ｔ検定又はＳｉｄａｋ事後検定（３つ以上の群）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。＜０．０５のｐ値を統計学的に有意とみなし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて統計分析を行った。
〔ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いたＳＰＧ４遺伝性痙性対麻痺の治療標的としてのｍｉＲ－３３ａの同定〕
１．序論
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するか、又はｍＲＮＡ分解を促進する小さな非タンパク質コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、様々な細胞の状況において、細胞型、組織及び種特異的な標的制御を示す。従って、適切な細胞型、組織及び種においてｍｉＲＮＡ機能を研究することが重要である。以前に、本発明者等は、ｍｉＲ－３３がｍｉＲ－３３欠損マウスの使用によって脂質恒常性を制御することを示した。しかしながら、ヒトにおけるｍｉＲ－３３の生理学的機能は、適切なモデルの欠如のために依然として未知であった。
ｍｉＲ－３３は、ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂの２つのアイソフォームを有する。ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂは、成熟形態においてわずか２ヌクレオチドだけ異なるが、それらのシード配列においては同一である。ｍｉＲ－３３ａは進化を通じて高度に保存されているが、ｍｉＲ－３３ｂは大型哺乳動物のＳＲＥＢＦ１遺伝子にのみ存在し、齧歯類はｍｉＲ－３３ｂを欠いている。
ヒトにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂの新規標的遺伝子を調査するために、本発明者等は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術により、ｍｉＲ－３３単一（ｍｉＲ－３３ａ又はｍｉＲ－３３ｂ）及び二重（ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂ）ノックアウトヒトｉＰＳＣを作製し、それらのトランスクリプトームを分析した。
本実施例では、ＳＰＡＳＴがヒトにおけるｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを明らかにした。実際には、ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲのｍｉＲ－３３結合部位は、マウスではなく中～大型哺乳動物で保存されており、マウスのＳＰＡＳＴに対するｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂの役割を明らかにすることは不可能である。ＳＰＡＳＴは、ＳＰＡＳＴＩＮと呼ばれる微小管切断タンパク質をコードし、ＳＰＡＳＴ（以前は「ＳＰＧ４」として知られていた）遺伝子の変異は、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の最も一般的な原因である。本発明者等は、ｍｉＲ－３３ａが、ＳＰＧ４患者のｉＰＳＣ由来皮質ニューロンにおいてＳＰＡＳＴ発現を調節し、病理学的表現型に影響を与えることを示した。さらに、ロックド核酸－アンチ－ｍｉＲ（ＬＮＡ）を介した、ヒトニューロンにおけるｍｉＲ－３３の主要な形態であるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者ニューロンにおいて病理学的表現型を改善した。このように、ｍｉＲ－３３ａは、ＨＳＰ－ＳＰＧ４の治療のための治療標的であり得る。
２．結果
２－１．ｍｉＲ－３３ノックアウトヒトｉＰＳＣの作製
ヒト細胞におけるｍｉＲ－３３の役割を調べるために、本発明者等はヒトｉＰＳＣからｍｉＲ－３３単一ノックアウト（ＫＯ）及びｍｉＲ－３３二重ＫＯ細胞を作製した。
一対のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現ベクターを構築し（表１）、それらを、二本鎖切断を導入するためにＤ１０Ａ Ｃａｓ９ ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）と共にコントロールｉＰＳＣ（「２０１Ｂ７」と命名）に共エレクトロポレーションした。
成熟ｍｉＲ－３３配列欠失及びｌｏｘＰ配列挿入等のｉｎｄｅｌｓの予測されたサイズは、ＤＮＡ配列決定によって同定された（図１ｂ、図２ａ）。ＫＯ ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂ発現の完全な消失は、ＲＴ－ＰＣＲ分析（図２ｂ）によって確認されたが、ＰＣＲベースのｍｉＲＮＡ測定のためにわずかなシグナルが残っていた。ＳＲＥＢＦ２及びＳＲＥＢＦ１のイントロンによってコードされるｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの欠失は、それらの宿主遺伝子のタンパク質レベル及びスプライシングに影響しなかった（図２ｃ及びｄ）。
さらに、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の欠失がそれらの宿主遺伝子の活性化を干渉することなく確立されたかどうかを確認しようと試みた。ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害剤であるＮＫ１０４は、ＳＲＥＢＦ２の転写を活性化し、また、ＬＸＲアゴニストであるＴ０９０１３７は、ＳＲＥＢＦ１発現を増強する。これらの薬理学的刺激により、コントロール及びＫＯ ｉＰＳＣにおけるＳＲＥＢＦ２及びＳＲＥＢＦ１ ｍＲＮＡは有意に増加し、コントロールｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ／ｂの発現レベルは並行して増加した。各ＫＯ ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの発現レベルは、それらの宿主遺伝子の刺激によっても検出されなかったので、ｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの完全な喪失は、ｍｉＲ－３３単一及び二重ＫＯ ｉＰＳＣにおいて達成された（図１ｃ及びｄ）。
染色体Ｑバンド分析は、確立されたｉＰＳ系統が正常な核型を有することを示した（図１ｅ）。
２－２．ｍｉＲ－３３はヒトにおいてＳＰＡＳＴ発現を調節する
ｍｉＲ－３３のヒト細胞への効果を分析するために、ｍｉＲ－３３単一、二重ＫＯ及びコントロールｉＰＳＣ（２０１Ｂ７）を用いてマイクロアレイ分析を行った。マイクロアレイデータは、コントロールに対して、ｍｉＲ－３３ａ ＫＯにおいて９３個のアップレギュレート遺伝子及び１９１個のダウンレギュレート遺伝子、ｍｉＲ－３３ｂ ＫＯにおいて９９個のアップレギュレート遺伝子及び１１０個のダウンレギュレート遺伝子、ｍｉＲ－３３二重ＫＯ ｉＰＳＣにおいて４９個のアップレギュレート遺伝子及び１２７個のダウンレギュレート遺伝子を検出した（倍数変化＞２）（図３ａ）。
公的データベースＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）を使用して、ｍｉＲ－３３単一、二重ＫＯ ｉＰＳＣの全てにおいてアップレギュレートされた遺伝子の中でｍｉＲ－３３標的遺伝子について検索した。図３ｂに示すように、ＳＰＡＳＴがこの方法によって同定されたただ１つの遺伝子であった。
次に、ＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロッティング分析によってＳＰＡＳＴ及びＳＰＡＳＴＩＮ発現レベルを検証した（図３ｃ及びｄ）。ＳＰＡＳＴにおける２つの翻訳開始コドンの存在により、２つのＳＰＡＳＴＩＮアイソフォーム（「Ｍ１」と呼ばれる完全長アイソフォーム、及び「Ｍ８７」と呼ばれるわずかに短いアイソフォーム）が合成される。Ｍ８７は、ニューロン及び非ニューロン組織の両方においてより豊富である。
ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲは、中～大型哺乳動物においてｍｉＲ－３３の潜在的結合部位を有する。しかしながら、マウスには標的部位が存在しない（図３ｅ）。ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲの推定ｍｉＲ－３３標的配列が翻訳抑制を媒介できるかどうかを試験するために、ＳＰＡＳＴ転写物の３’－ＵＴＲをルシフェラーゼ発現プラスミドに挿入し（ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２－ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂによれば、コントロールベクター（ｍｉＲ－コントロール）と比較してルシフェラーゼ活性が低下した（図３ｆ）。３’－ＵＴＲの潜在的結合部位における突然変異は、ｍｉＲ－３３の効果を無効にした（図３ｇ）。
２－３．ＳＰＡＳＴＩＮ活性の消失は、遺伝性痙性対麻痺ＳＰＧ４（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の特徴的な表現型である
ＳＰＡＳＴ遺伝子の突然変異（２ｐ２２．３に位置する）は、ＨＳＰの最も一般的な原因である。ほとんどの場合、常染色体優性のＨＳＰ－ＳＰＧ４は、下肢の痙攣及び衰弱に起因する歩行障害を伴うプロトタイプのＨＳＰであると考えられている。
ヒトのＳＰＡＳＴ遺伝子の調節におけるｍｉＲ－３３の効果を考慮して、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の阻害が１つの正常なＳＰＡＳＴ対立遺伝子の活性化を促進し、続いて病理学的表現型を減少させると仮説を立てた。この仮説に取り組むために、ＳＰＧ４患者１人と健常対照者からｉＰＳＣ（「ｈｃ１－Ａ」及び「ｈｃ３－Ａ」と称する）を作製した。当該患者は、スプライス部位を変化させるＳＰＡＳＴ遺伝子のイントロン９に位置するヘテロ接合Ｇ＞Ａ置換を有し（ＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ）、エキソン９のスキッピングを引き起こす。エキソン９は、当該遺伝子のＡＡＡカセットコード領域内にある（図４ａの系統）。ＨＳＰ患者のこのＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ変異は、以前に記載されていた。この領域を配列決定して、ＳＰＧ４由来ｉＰＳＣがＳＰＡＳＴ遺伝子の当該変異を維持していることを確認した（図４ｂ、図５ａ－ｂ）。染色体Ｑバンド分析は、ＳＰＧ４由来のこのｉＰＳＣが正常な核型を有することを示した（図５ｃ）。
細胞表現型を調べるために、本発明者等は、以前に記載された無血清凝集浮遊培養（ＳＦＥＢｑ）法によってＳＰＧ４及びコントロールｉＰＳＣを皮質ニューロンに分化させた。ＳＰＧ４は常染色体優性突然変異によって引き起こされるので、ＳＰＧ４患者は、１つの対立遺伝子が機能しない場合、ＳＰＡＳＴＩＮ活性の約５０％を有する可能性が高い。以前の研究では、スプライス部位変異を有するＳＰＧ４患者由来のニューロンは、コントロールと比較して約５０％のＳＰＡＳＴＩＮタンパク質レベルの減少を示すことが明らかにされている。これと一致して、コントロールと比較してＳＰＡＳＴ ｍＲＮＡ及びＳＰＡＳＴＩＮタンパク質レベルの両方が有意に低下した（図４ｃ及びｄ）。
最後に、ＳＰＧ４由来の神経突起の形態を調べた。免疫蛍光染色により、ＳＰＧ４由来の皮質ニューロンにおいて全神経突起の長さ及び分岐点の数が減少することが明らかとなった（図４ｅ）。
２－４．ｍｉＲ－３３は、ＳＰＡＳＴ ３’ＵＴＲ調節を介してｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンの神経突起の長さを減少させる
以前の研究は、ＳＰＡＳＴＩＮレベルの低下が観察された疾患の表現型と直接関連していることを示し、ＳＰＡＳＴＩＮを過剰発現するＳＰＧ４由来のニューロンが神経突起伸長欠損を救済できることが示されている。ｍｉＲ－３３がＳＰＡＳＴ発現を直接調節し、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経表現型に影響するかどうかを調べるために、本発明者等は、レンチウイルス構築物をＳＰＧ４由来ニューロンに同時トランスフェクトした。
シナプシンＩニューロンドライバーの存在下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－潜在的結合部位を含む３’－ＵＴＲを伴う／伴わないＳＰＡＳＴ（ベクター１及びベクター２）を過剰発現させた。コントロールとしてＧＦＰ過剰発現ＳＰＧ４ニューロンを用いた（図６ａ）。
以前の報告と一致して、ＳＰＡＳＴＩＮを過剰発現するＳＰＧ４由来のニューロンは、ＧＦＰコントロールと比較して神経突起の長さを回復させた。ベクター１又はベクター２のいずれかの過剰発現による同時トランスフェクトＣＭＶ駆動ｍｉＲコントロールは、ＳＰＧ４由来ニューロンにおける神経突起の長さの回復をもたらした。しかしながら、ＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａのベクター２との同時トランスフェクションは、ベクター１で観察されなかった神経突起の長さを減少させた（図６ｂ、図７ａ－ｂ）。
２－５．ロックド核酸－アンチ－ｍｉＲを介したｍｉＲ－３３ａの阻害は神経突起の長さを改善する
本発明者等は、ｍｉＲ－３３が、ＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲを標的とすることによって、ＳＰＧ４由来ニューロンにおいて神経表現型を調節することを示した。ｍｉＲ－３３の阻害がＳＰＧ４の潜在的治療標的であるかどうかを調べるために、ＳＰＧ４－ｉＰＳＣをＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３ａ（ＬＮＡ－ｍｉＲ－３３ａ）又はコントロール（ＬＮＡ－コントロール）でトランスフェクトした。ｍｉＲ－３３ａを選択した理由としては、ｍｉＲ－３３ａの絶対的レベルが、未分化状態及び神経分化の両方においてｍｉＲ－３３ｂよりも豊富であったためである（図８ａ）。
ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３ａのノックダウン効率を確認するために、ｍｉＲ－３３ａの発現レベルを、トランスフェクションの４８時間後にＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて、ｍｉＲ－３３ａのノックダウンが約４０％であった（図８ｂ）。
ｍｉＲ－３３ａのダウンレギュレーションは、ｍｉＲ－３３ａの直接下流標的として知られているＡＢＣＡ１のアップレギュレーションと関連していた（図８ｃ）。
本発明者等は、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経突起の長さがＬＮＡ－ｍｉＲ－３３ａのトランスフェクションの４８時間後に有意に回復したことを観察し、このことはＳＰＧ４の治療のためのｍｉＲ－３３ａ阻害の治療可能性を示唆するものである（図９ａ及びｂ）。
さらに、宿主遺伝子のｍＲＮＡ発現及びタンパク質レベルと並行して、コントロールと比較して、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおいて、ｍｉＲ－３３ａの発現の増強が観察された（図１０ａ－ｃ）。ｍｉＲ－３３ａ上昇の原因を同定するために、ｓｈＲＮＡ構築物のレンチウイルス感染を用いてＳｐａｓｔ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｎｅｕｒｏ ２ａ系統を樹立した。それぞれＳｐａｓｔ ＲＮＡｉ系統１及び２におけるＳｐａｓｔ ｍＲＮＡ発現の約５０％がノックダウンした（図１０ｄ）。ＲＴ－ＰＣＲの結果によれば、コントロールと比較してｓｐａｓｔｉｎが減少したニューロン細胞が、宿主遺伝子Ｓｒｅｂｆ２と並行してｍｉＲ－３３ａの発現レベルを増加させる傾向があることが明らかになった（図１０ｅ）。このように、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおけるｍｉＲ－３３ａの発現の増強は、ＳＰＡＳＴＩＮ減少の直接的な効果であり得る。
３．考察
以前の報告では、マウスにおけるｍｉＲ－３３の役割が、脂質代謝の調節因子としての証拠と共に探求されてきた。しかしながら、ヒトにおいては、適切なモデルを欠いていたため、依然として不明確であった。
本実施例において、本発明者等は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってｍｉＲ－３３単一（ｍｉＲ－３３ａ又はｍｉＲ－３３ｂ）及び二重（ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂ）ノックアウトｉＰＳＣを作製し、これらのＫＯ ｉＰＳＣにおける成熟ｍｉＲ－３３生合成の完全な欠失を示した。さらに、ＳＰＡＳＴがヒトにおけるｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを同定した。遺伝性痙性対麻痺の原因遺伝子の１つであるＳＰＡＳＴは、ｍｉＲ－３３によって直接的に調節された。ＬＮＡによるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンの病理学的表現型を部分的に減少させた。合成ＲＮＡオリゴによるｍｉＲ－３３ａの阻害が１つの正常なＳＰＡＳＴ対立遺伝子の活性化を促進し、続いて病理学的表現型を減少させることが推測される。
ｍｉＲＮＡの特異的で安定したノックアウトは、ｍｉＲＮＡの機能を研究する上で不可欠である。ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックアウトは、ｍｉＲＮＡの機能喪失の研究に関する最も信頼できる技術である。近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術が多様なモデルの機能遺伝子の研究に応用されている。さらに、幾つかの刊行物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術がｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの末端ループ又は５’領域を標的とすることによってｍｉＲＮＡ発現を抑制し得ることを報告した。本実施例では、宿主遺伝子の発現に影響を与えずに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってｍｉＲ－３３単一及び二重ノックアウトｉＰＳＣを作製した。
神経変性疾患は、主に遺伝子の発現レベルの変化を伴うタンパク質症と考えられている。以前の研究では、ＳＰＧ４由来ニューロンは、ヒトＥＣＳ由来ニューロンをｓｉＲＮＡによってＳＰＡＳＴＩＮを枯渇させた場合に観察された表現型に類似する、より短く、且つより分岐の少ない一次神経突起の数がより少ないことが示された。さらに、ＳＰＧ４由来ニューロンにおけるＳＰＡＳＴＩＮの過剰発現は、それらの病理学的表現型を回復させ、このことは、ＳＰＧ４表現型がＳＰＡＳＴＩＮ投与量に依存することを示唆している。ＨＳＰ－ＳＰＧ４患者に見られる突然変異の圧倒的大部分は、突然変異ＳＰＡＳＴ対立遺伝子から生成されたＳＰＡＳＴＩＮの微小管作用活性を無効にし、理論的には数が少ないがより安定した微小管の蓄積が生じ２６、発生において神経系異常を引き起こすことである。
本実施例では、本発明者等は、ｍｉＲ－３３の阻害が１つの正常な対立遺伝子の転写の促進を介してＳＰＡＳＴＩＮレベルを増加させることができ、続いて病理学的表現型を減少させると仮説を立てた。この仮説に対処するために、１人のＳＰＧ４患者と対照者からｉＰＳＣを生成した。以前の研究と一致して、本発明者等のＳＰＡＳＴ ＩＶＳ９＋１ Ｇ→Ａ変異を有するＳＰＧ４由来ニューロンが神経突起の長さ及び分枝の障害を示すことが観察された。さらに、結合部位を含む３’ＵＴＲを有するか又は有しないＳＰＡＳＴのいずれかの過剰発現を伴う同時トランスフェクトされたＣＭＶ駆動ｍｉＲコントロールが、ＳＰＧ４由来ニューロンにおける神経突起の長さ及び正常分枝を回復させるのに十分であることを観察した。一方、３’ＵＴＲを有するＳＰＡＳＴを伴う同時トランスフェクトされたＣＭＶ駆動ｍｉＲ－３３ａは、３’ＵＴＲを有しないＳＰＡＳＴの場合には観察されなかった神経突起表現型の回復を損なった。本発明者等のデータは、ｍｉＲ－３３ａがＳＰＡＳＴ発現を直接調節し、ＳＰＧ４由来ニューロンの神経表現型に影響を及ぼすことを示した。
幾つかのｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びＬＮＡは、現在、様々な疾患の臨床試験において研究中である。本実施例では、ｍｉＲ－３３ａのＬＮＡに基づく薬理学的阻害が、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンにおいて神経突起の長さを回復させることが示された。ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング研究は、当初癌分野で行われ、特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３３を含む）が、腫瘍抑制機能又は腫瘍形成能を有するとして同定されている。最近、ｍｉＲＮＡプロファイル研究により、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）等の神経変性疾患において示差的に発現されるｍｉＲＮＡが同定された。本発明者等は、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおけるｍｉＲ－３３ａの発現の増強を観察し、これはｍｉＲ－３３ａのＬＮＡに基づく阻害の実質的効果を説明し得る。ＨＳＰは、ＳＰＡＳＴＩＮ（ＳＰＧ４）、ＡＴＬＡＳＴＩＮ－１（ＳＰＧ３）及びＲＥＥＰ１（ＳＰＧ３１）タンパク質をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる。これまでの報告では、これらのタンパク質が互いに結合して、細胞全体に管状小胞体ネットワークを形成し、脂質液滴の形成及び拡大にも関与していることが示された。さらに、ＨＳＰ遺伝子の劣性形態は、ＤＤＨＤ１及びＤＤＨＤ２等の脂肪酸代謝に関与する遺伝子発現の変化に関連付けられている。これらのデータ及びＳｐａｓｔ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｎｅｕｒｏ ２ａ系統を用いた本発明者等の実験は、ＨＳＰの脂質代謝の変化が、本発明者等のＳＰＧ４由来ニューロンにおいてｍｉＲ－３３ａを上昇させる可能性があることを示唆した。
まとめると、本発明者等は、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ－ＳＰＧ４）の原因遺伝子の１つであるＳＰＡＳＴが、ヒトにおいてｍｉＲ－３３の新規標的遺伝子であることを同定した。ＬＮＡによるｍｉＲ－３３ａの阻害は、ＳＰＧ４由来皮質ニューロンの神経突起長の減少等の病理学的表現型を正常化した。本発明者等のデータは、ｍｉＲ－３３ａがＳＰＧ４の治療のための潜在的な治療法であり得ることを示した。
４．方法
４－１．ｉＰＳＣの生成と細胞培養
以前に報告されているように（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．３１，４５８－４６６（２０１３））、ＯＣＴ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びドミナントネガティブｐ５３、又はＯＣＴ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びｐ５３－ｓｈＲＮＡのためのエピソームベクターを用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＴリンパ球からＳＰＧ４患者のｉＰＳＣを作製し、４ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したヒトｉＰＳＣ培地（霊長類胚性幹細胞培地；ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＳＮＬフィーダー層上で培養した。
４－２．遺伝子ターゲティングのためのプラスミドの構築
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎプラスミドについては、ガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を用いて設計した。ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（表１）を、ｐＨＬ－Ｈａ－ｃｃｄＢプラスミドに挿入した。供与体プラスミドを構築するために、選択カセット及びＰＣＲによって増幅されたゲノム配列５’及び３’の断片を挿入することによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を改変した。各相同アームを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて５’及び３’相同性アームとして結合させた。
４－３．遺伝子ターゲティングによるｉＰＳＣのゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎのトランスフェクションについては、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、それぞれ３μｇの２つのｇＲＮＡプラスミド、５μｇのＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９）プラスミド及び１０μｇのドナープラスミドで、１×１０６個のｉＰＳＣをエレクトロポレーションした。トランスフェクションした細胞を、フィーダー細胞上にプレーティングし、１０μＭのＹ－２７６３２を補充したヒトＥＳ培地で１日間培養した。トランスフェクションの３日後、ネオマイシン及び／又はピューロマイシン選択を適用し、１０日間続けた。耐性コロニーを取り出し、ゲノムＤＮＡ抽出及びＰＣＲスクリーニングのために拡大した。選択カセットを除去するために、エレクトロポレーションによりＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミド（ｐＣＸＷ－Ｃｒｅ－Ｐｕｒｏ）で細胞を一過的にトランスフェクションし、ピューロマイシン耐性コロニーを選択した。選択カセット切除並びにｍｉＲ－３３ａ及び／又はｍｉＲ－３３ｂの二重対立遺伝子欠失は、ゲノムＰＣＲスクリーニング及びサンガー配列決定分析によって確認した。
４－４．皮質ニューロン分化の誘導
ヒトｉＰＳＣを単一細胞に解離させ、１００％エタノール中の２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で予めコーティングした浮遊培養用のＵ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋ－ｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において迅速に再凝集させた。胚様体（ＥＢ）の凝集体を、神経誘導段階（０～８日目）において５％ＤＦＫ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１Ｍ ２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；２μＭ ドルソモルフィン及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む又は有さない）中で培養した。誘導後、ＥＢをマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）コーティング６ウェル培養プレート上に移し、１×Ｎ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＭ ドルソモルフィン及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２を補充して、パターニング段階（８～２４日目）において培養した。パターニング段階後、遊走した神経前駆細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてプレート底から分離して、ビタミンＡを含まない１ｘＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ－３を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ＦＵＬＬ，Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）中、マトリゲルでコーティングした１２ウェル若しくは２４ウェル培養プレート又はカバースリップ上で、神経成熟段階において培養し、次いで、実験まで培養した。
４－５．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、既述の標準的な方法を用いて行った４０。サンプルを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）から成る溶解バッファーで溶解した。溶解バッファーに、使用直前に完全ミニプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＬＬＮ（２５μｇ ｍｌ－１）、０．５ｍＭ ＮａＦ及び１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を補充した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて測定した。全てのサンプル（タンパク質１０μｇ）を溶解バッファーに懸濁し、ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲルを用いて分画し、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルローストランスファーメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ）に転写した。メンブレンを、５％脱脂乳を含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて１時間ブロッキングし、ＳＰＡＳＴＩＮに対する一次抗体（Ｓ７０７４，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＢＣＡ１に対する一次抗体（ＮＢ４００－１０５，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＳＲＥＢＰ－１に対する一次抗体（２Ａ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＲＥＢＰ－２に対する一次抗体（Ｃａｙｍａｎ）、ＴＦ２Ｂに対する一次抗体（ＥＰ４５８８，Ａｂｃａｍ）、βアクチンに対する一次抗体（Ｃ４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％Ｔ－ＰＢＳ）中での洗浄ステップの後、メンブレンを二次抗体（抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合；１：２，０００）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンを０．０５％Ｔ－ＰＢＳで洗浄し、ＬＡＳ－４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＥＣＬウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
４－６．ＲＮＡ抽出及びｑＰＴ－ＰＣＲ
ＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて全ＲＮＡを単離精製し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造業者の説明書に従って、１００ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ－ＰＣＲのために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、特定の遺伝子を４０サイクルで増幅した。発現は、ハウスキーピング遺伝子である１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化した。遺伝子特異的プライマーを表２に示す。
全ＲＮＡを、ＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて単離した。ｍｉＲ－３３を、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プロトコルに従って測定し、生成物をサーマルサイクラー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴ配列検出システム）を用いて分析した。サンプルを、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ発現によって標準化した。また、ｍｉＲ－３３ａ及びｍｉＲ－３３ｂのオリゴヌクレオチド１６ｐＭ、４ｐＭ、１ｐＭ、２５０ｆＭ、６２．５ｆＭ及び１５．６２５ｆＭを測定し、検量線を作成した。サンプルの吸光度値を計算して濃度を算出した。
４－８．デュアルルシフェラーゼアッセイ
ＳＰＡＳＴの３’－ＵＴＲの完全長ＰＣＲ断片をヒトｉＰＳＣ ｃＤＮＡから増幅し、ｐｓｉ－ＣＨＥＣＫ２－ｌｅｔ－７ ８Ｘベクター（ａｄｄｇｅｎｅ）にサブクローニングした。ＷＴ又は変異体３’－ＵＴＲルシフェラーゼレポーター遺伝子を作製するために、以下のＳＰＡＳＴ ３’－ＵＴＲの断片をｐｓｉ－ＣＨＥＣＫ２－ｌｅｔ－７ ８Ｘベクターに挿入した：
４－９．ＳＰＡＳＴＩＮ及びＧＦＰの過剰発現
ＳＰＡＳＴの全長３’－ＵＴＲを有するか又は有しないヒトＳＰＡＳＴをヒトｉＰＳＣからクローニングし、ｐＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターに挿入し、次いでＣＭＶプロモーターを、比較的ニューロン特異的なシナプシンＩプロモーターと置換した。製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、２９３ＦＴ細胞中にレンチウイルスストックを産生した。要するに、トランスフェクションの４８時間後にウイルス含有培地を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。細胞に、ＳＰＡＳＴ、３’－ＵＴＲを有するＳＰＡＳＴ又は空のＧＦＰコントロールレンチウイルスを感染させた。神経細胞培養物をＤＮＡ形質導入後１０日間分化させた。感染細胞はＧＦＰで強調された。
４－１０．ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３による細胞トランスフェクション
製造者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１０ｎＭ ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３又はＬＮＡ－コントロールで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を分析に使用した。
ＬＮＡ－アンチ－ｍｉＲ－３３は、以下の配列を有する核酸である：
４－１１．免疫細胞化学
細胞を、室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）において固定し、ＰＢＳでリンスした。細胞を、室温で１０分間、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含有するＰＢＳ中で透過処理し、続いてＰＢＳでリンスした。非特異的結合を、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳ ｐｈａｒｍａｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で室温で６０分間ブロックした。細胞を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いで適切な蛍光標識二次抗体で標識した。核を標識するためにＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）を使用した。以下の一次抗体を免疫細胞化学で使用した：
βＩＩＩチューブリン（１：１０００，ＣＳＴ，５５６８Ｓ）。免疫細胞化学の陽性カウント率を評価するために、ＡｒｒａｙＳｃａｎによる自動顕微鏡検査を用いて細胞を画像化し、ＨＣＳＳｔｕｄｉｏ ２．０細胞分析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、免疫染色構造を計数した。
４－１２．統計分析
データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。統計的比較は、図の凡例に示すように、独立ｔ検定又はＳｉｄａｋ事後検定（３つ以上の群）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。＜０．０５のｐ値を統計学的に有意とみなし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて統計分析を行った。
本発明によれば、ＨＳＰ－ＳＰＧ４等の神経変性疾患を直接的に治療することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
［配列表］
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
［配列表］
Claims (4)
- miR-33aにハイブリダイズし、且つ該miR-33aの機能を阻害する核酸を有効成分として含有する、遺伝性痙性対麻痺SPG4の予防又は治療用組成物。
- 前記核酸が、miR-33aにハイブリダイズし、且つ該miR-33aの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１記載の塩基配列の相補鎖又はその12塩基以上の連続した塩基配列から成る、請求項２記載の組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２４記載の塩基配列から成り、且つ該塩基配列における各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018119251 | 2018-06-22 | ||
| JP2018119251 | 2018-06-22 | ||
| PCT/JP2019/025759 WO2019245060A1 (ja) | 2018-06-22 | 2019-06-21 | 神経変性疾患の予防又は治療用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019245060A1 JPWO2019245060A1 (ja) | 2021-07-08 |
| JP7054556B2 true JP7054556B2 (ja) | 2022-04-14 |
Family
ID=68984102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020525838A Active JP7054556B2 (ja) | 2018-06-22 | 2019-06-21 | 神経変性疾患の予防又は治療用組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11685919B2 (ja) |
| EP (1) | EP3811973A4 (ja) |
| JP (1) | JP7054556B2 (ja) |
| WO (1) | WO2019245060A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022260162A1 (ja) * | 2021-06-11 | 2022-12-15 | 国立大学法人京都大学 | Ｎａｓｈの予防及び／又は治療剤 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012027704A1 (en) | 2010-08-27 | 2012-03-01 | New York University | Mir-33 inhibitors and uses thereof |
| WO2013111081A1 (en) | 2012-01-24 | 2013-08-01 | Bar-Ilan University | Treatment of disease by modulation of sirt6 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018119251A (ja) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | 正仁 櫨田 | Ｐｅｔボトルを再生したｐｅｔ樹脂繊維を水着やｙシャツに再利用する方法 |
-
2019
- 2019-06-21 JP JP2020525838A patent/JP7054556B2/ja active Active
- 2019-06-21 US US17/253,484 patent/US11685919B2/en active Active
- 2019-06-21 EP EP19823375.1A patent/EP3811973A4/en active Pending
- 2019-06-21 WO PCT/JP2019/025759 patent/WO2019245060A1/ja unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012027704A1 (en) | 2010-08-27 | 2012-03-01 | New York University | Mir-33 inhibitors and uses thereof |
| WO2013111081A1 (en) | 2012-01-24 | 2013-08-01 | Bar-Ilan University | Treatment of disease by modulation of sirt6 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210189395A1 (en) | 2021-06-24 |
| WO2019245060A1 (ja) | 2019-12-26 |
| JPWO2019245060A1 (ja) | 2021-07-08 |
| US11685919B2 (en) | 2023-06-27 |
| EP3811973A1 (en) | 2021-04-28 |
| EP3811973A4 (en) | 2022-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090082297A1 (en) | Compositions and Methods for Regulating Gene Expression | |
| JP2015518714A (ja) | 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法 | |
| US20220133774A1 (en) | Modulation of micrornas against myotonic dystrophy type 1 and antagonists of micrornas therefor | |
| HUE026280T2 (en) | Treatment of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) -related diseases by inhibition of natural antisense transcripts associated with BDNF \ t | |
| WO2018152523A1 (en) | Use of trinucleotide repeat rnas to treat cancer | |
| JP7054556B2 (ja) | 神経変性疾患の予防又は治療用組成物 | |
| US20230287427A1 (en) | Inhibition of lncExACT1 to Treat Heart Disease | |
| JP5850702B2 (ja) | 間葉系細胞の分化調節剤およびこれを用いた医薬、並びに間葉系細胞への分化調節作用を有する物質のスクリーニング方法 | |
| US9018188B2 (en) | MicroRNA inhibitors | |
| JP6194517B2 (ja) | 神経分化促進剤 | |
| JP2021534799A (ja) | 肥満細胞のアポトーシスを誘導するためにスプライススイッチングオリゴヌクレオチドを用いてＫｉｔを標的とする方法 | |
| US20190055553A1 (en) | Methods for identifying and targeting non-coding rna scaffolds | |
| EP4046631A1 (en) | Msi2 as a therapeutic target for the treatment of myotonic dystrophy | |
| EP4215614A1 (en) | Combination therapy for dystrophin-related diseases | |
| KR20170004821A (ko) | Dcun1d3의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 dcun1d3을 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포함하는 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도 | |
| Wang et al. | Research Article Exosomal CircHIPK3 Released from Hypoxia-Induced Cardiomyocytes Regulates Cardiac Angiogenesis after Myocardial Infarction | |
| KR101414383B1 (ko) | Ｄｌｋ-1 유전자 발현억제용 조성물 | |
| Pinnarò | Role of noncoding RNAs in muscle differentiation | |
| EP3820483A2 (en) | Compositions and methods for treating endometriosis | |
| O'Sullivan | Requirements for ARS2 in RNA processing and retina development | |
| FI20195871A1 (fi) | Synteettiset pienet rna:t | |
| Choy | The role of Npas4 in Neuroprotection and neurogenesis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220128 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220315 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220328 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7054556 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |