JP5860038B2 - 抗メタボリックシンドローム効果を持つ核酸 - Google Patents
抗メタボリックシンドローム効果を持つ核酸 Download PDFInfo
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Description
(項目1)SMS2の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物。
(項目2)前記核酸がsiRNAである、項目1に記載の医薬組成物。
(項目3)前記siRNAが下記の(a)〜(o)に記載のsiRNAからなる群より選択されるいずれか1つ以上からなる項目2記載の医薬組成物。
(a) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号1で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号2で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i6>;
(b) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号3で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号4で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i7>;
(c) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号5で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号6で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i8>;
(d) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号7で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号8で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i104>;
(e) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号9で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号10で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i105>;
(f) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号11で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号12で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i106>;
(g) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号13で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号14で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i107>;
(h) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号15で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号16で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i108>;
(i) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号17で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号18で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i10
9>;
(j) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号21で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号22で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i3>;
(k) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号23で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号24で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i11>;
(l) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号39で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号40で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i1>;
(m) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号41で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号42で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i2>;
(n) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号45で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号46で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i5>;ならびに
(o)一方または両方の塩基配列において1〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、 欠失または置換され、SMS2の発現を抑制する活性を有する、(a)〜(n)のいずれかに記載のsiRNA。
(項目4)前記核酸がアンチセンス核酸である、項目1に記載の医薬組成物。
(項目5)前記核酸がロックド核酸(LNA)を含むアンチセンス核酸である、項目1または4に記載の医薬組成物。
(項目5A)前記核酸が5’末端にロックド核酸(LNA)を、3’末端にLNAを含むアンチセンス核酸である、請求項1、4または5に記載の医薬組成物。
(項目6)前記アンチセンス核酸が、配列番号81〜92のいずれか1つ以上からなる請求項4、5または5A記載の医薬組成物。
(項目7)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目1〜5、5Aまたは6いずれか記載の医薬組成物。
(項目7A)前記核酸はSMS2の発現を抑制するのに有効な量で含まれる、項目1〜5、5A、6または7いずれか記載の医薬組成物。
(項目7B)薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目1〜5、5A、6、7または7Aのいずれか記載の医薬組成物。
(項目8)下記の(a)〜(o)からなる群より選択されるいずれかのsiRNA
(a) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号1で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号2で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i6>;
(b) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号3で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号4で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i7>;
(c) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号5で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号6で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i8>;
(d) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号7で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号8で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i104>;
(e) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号9で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号10で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i105>;
(f) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号11で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号12で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i106>;
(g) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号13で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号14で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i107>;
(h) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号15で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号16で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i108>;
(i) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号17で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号18で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i109>;
(j) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号21で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号22で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i3>;
(k) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号23で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号24で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i11>;
(l) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号39で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号40で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i1>;
(m) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号41で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号42で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i2>;
(n) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号45で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号46で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i5>;ならびに
(o)一方または両方の塩基配列において1〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、 欠失または置換され、SMS2の発現を抑制する活性を有する、(a)〜(n)のいずれかに記載のsiRNA。
(項目9)メタボリックシンドロームの処置または予防のための項目8に記載のsiRNA。
(項目10)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目9記載のsiRNA。
(項目10A)メタボリックシンドロームの処置または予防のための医薬を製造するための、項目8〜10いずれかに記載のsiRNAの使用。
(項目10B)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である請求項10A記載の使用。
(項目11)配列番号81〜92のいずれか1つ以上からなるロックド核酸(LNA)含有核酸。
(項目12)メタボリックシンドロームの処置または予防のための項目11に記載のロックド核酸(LNA)含有核酸。
(項目13)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目12記載のロックド核酸(LNA)含有核酸。
(項目14)メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目1〜5、5A、6、7、7Aまたは7Bいずれかに記載の医薬組成物を該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
(項目15)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目14記載の方法。
(項目16)メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目8〜10、10Aまたは10Bいずれかに記載のsiRNAを該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
(項目17)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目16記載の方法。
(項目18)メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目11〜13いずれかに記載のLNA含有核酸を該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
(項目19)前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である項目18記載の方法。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
69.2(ヒト)、NM_028943(マウス)である。
の増加を防止する薬剤をいう。内臓脂肪は、当該分野において通常使用される意味で用いられ、体脂肪のうち、内臓の周囲に付いた脂肪をいう。内臓脂肪の減少は、白色脂肪細胞重量を測定すること、腹部CT画像により測定すること、などで判定することができる。内臓脂肪減少の対象としては、内臓脂肪過多、あるいは脂質異常症などの疾患または症状を挙げることができる。「脂質異常症」は、血液中に含まれる脂質が過剰、もしくは不足している状態を指し、以前は、高脂血症とも呼ばれていた。脂質異常症は、メタボリックシンドロームの1つであり、疾患の一つとして捉えることができる。
、(秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」)に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet.2002 Dec;32 Suppl:526−32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社(2002)などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
オキシTを2bp)等を挙げることができる。例えば、好ましいsiRNAとしては、全てのsiRNAのセンス・アンチセンス鎖の、3’末端にdTdT(デオキシTを2bp)をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基(abasic)ヌクレオシド;アラビノヌクレオシド、2’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−L−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド;ペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基が結合したペプチド核酸(PHONA)、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、2’−O−メチルリボース、2’−デオキシ−2’−フルオロリボース、3’−O−メチルリボース等の置換五炭糖;1’,2’−デオキシリボース;アラビノース;置換アラビノース等;六炭糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、5−ヒドロキシシトシン、5−フルオロウラシル、4−チオウラシル等のピリミジン;6−メチルアデニン、6−チオグアノシン等のプリン;および他の複素環塩基等が挙げられる。
限定する相同組換による導入のいずれも含むものである。遺伝子導入の手法としては、たとえば、レトロウイルス、プラスミド、ベクター等を用いた手法、あるいは、エレクトロポレーション法、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法、リン酸カルシウム法が挙げられるがそれに限定されない。遺伝子導入に使用される細胞は、どのような細胞でもよいが、未分化細胞(たとえば、線維芽細胞など)を利用することが好ましい。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
本発明は、SMS2の発現を抑制する核酸を提供する。本発明の核酸は、核酸の翻訳または転写等を抑制する働きを有する。そのような核酸としては、アンチセンス核酸、RNAi作用を有する核酸(例えば、siRNA)、リボザイム活性を有する核酸等を挙げることができる。本発明のSMS2の発現を抑制する核酸は、修飾された核酸を含みうる。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873−7)に
よって決定することができる。あるいは、本発明の標的となる配列は、上記ヌクレオチド配列に関連するAccession番号に記載のDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば、「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
長さに限定されず、例えば、11塩基以下、100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、DNAのみから構成されていてもよいが、DNA以外の核酸、例えば、ロックド核酸(LNA)を含んでいてもよい。1つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、5’末端にLNA、3’末端にLNAを含むLNA含有アンチセンス核酸であってもよい。このようなLNA含有アンチセンス核酸としては、配列番号81〜92などを挙げることができるがそれに限定されない。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上,新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現,日本生化学会編,東京化学同人,1993,319−347.に記載される方法を用いて、配列番号79または80に記載されるSMS2の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。参考となる配列としては、配列番号1〜18、21〜24、39〜42、45、46などを用いることができるがこれらに限定されない。例えば、実施例10に記載される配列番号81〜92のようなものが好ましく使用されるがこれに限定されない。これらのアンチセンス核酸を、実施例7および8に例示されるマウスおよびHepG2細胞を用いた手法で本発明のアンチセンスの効果を確認することができる。
RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,タンパク質核酸酵素,1990,35,2191.)。
いては、短鎖dsRNA(siRNA)を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。siRNAについては、本明細書において他の箇所においても詳述されている。
(a) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号1で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号2で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i6>;
(b) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号3で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号4で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i7>;
(c) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号5で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号6で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i8>;
(d) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号7で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号8で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i104>;
(e) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号9で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号10で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i105>;
(f) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号11で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号12で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i106>;
(g) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号13で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号14で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i107>;
(h) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号15で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号16で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i108>;
(i) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号17で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号18で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i109>;
(j) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号21で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号22で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i3>;
(k) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号23で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号24で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i11>;
(l) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号39で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号40で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i1>;
(m) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号41で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号42で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i2>;
(n) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号45で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号46で表される塩基配列であるsiRNA;<SMS2−i5>;ならびに
(o)一方または両方の塩基配列において1〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、SMS2の発現を抑制する活性を有する、(a)〜(n)のいずれかに記載のsiRNA。
別の局面において、本発明は、SMS2の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物を提供する。ここで使用されるSMS2の発現を抑制する核酸としては、本明細書において(SMS2の発現を抑制する核酸)に記載される任意の核酸を用いることができることが理解される。
性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
:31−52,2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありsiRNAのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸または医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Takeshita
F. PNAS.(2003) 102(34) 12177−82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、siRNAのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
ができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に1回(例えば、1週間に1回〜1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1日〜1ヶ月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本明細書において用いられる医療器具製造技術、製剤技術、微細加工、分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Maniatis,T.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold
Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel,F.M.,et al.eds,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons Inc.,NY,10158(2000);Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols
for Functional Genomics,Academic Press;Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approac,IRL Press;Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman & Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G
.T.(1996).Bioconjugate Techniques,Academic Press;Method in Enzymology 230、242、247、Academic Press、1994;別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
SMS:スフィンゴミエリン合成酵素
SMS1、SMS2:遺伝子名
KO:ノックアウト
wKO:ダブルノックアウト
MEF:マウス胚性線維芽細胞
FBS:ウシ胎仔血清
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
TG:トリグリセリド
SM:スフィンゴミエリン
MeβCD:メチルβシクロデキストリン
HFD:高脂肪食
ND:通常食
WAT:白色脂肪細胞量
WT:野生型
1)SMSsノックアウトマウスの作製
マウスのSMSはこれまでに、発現クローニング法によって単離されたSMS1と、そのホモログとして同定されたSMS2、SMSrの3つのアイソフォームが見つかっている。SMS1ノックアウト(SMS1−KO)マウス、SMS2ノックアウト(SMS2−KO)マウスはともに、図1に示すターゲティングベクターを用いて、一般的なノックアウトマウス作製方法に則してエキソン1を欠損させて、作製した。
4週齢の雄の野生型マウス(WT;C57BL6)とSMS2−KOマウスにそれぞれ高脂肪食(HFD;58Y1,testDiet社)と対照通常食(ND;AIN76A,testDiet社)を投与し、その後の体重変動を9週に渡って計測した。その結果、図2に示すように、SMS2 KOマウスにHFDを負荷した場合、WTに同様のHFDを投与した場合と比較して、体重増加が有意に抑えられた。
2)と同様にHFDを投与したWTとSMS2 KOマウス(12週後)を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しその重量を計測した。その結果、図3に示すように、SMS2 KO/HFDでは、白色脂肪細胞量(WAT)に減少傾向は見られるものの有意な差ではなかった。図には示さないが、対照通常食(ND)を並行して与えた同様の実験も行っており、WT/HFD群に比べてSMS2 KO/HFD群では白色脂肪細胞量(WAT)が減少していた。一方、SMS2 KO/HFD群とSMS2 KO/ND群との間には有意差は見られなかったことがわかっている。
2)と同様にHFDを投与したWTとSMS2 KOマウス(12週後)を開腹し、肝臓を採取した。肝ホモジネート中のトリグリセリドをTriglyceride Quatification Kit(Biovision社)にて定量した。方法はキットの説明書に従った。ホモジネート中のタンパク質量をBCA protein assay(Pierce社)を用いて定量し、トリグリセリド量の補正に用いた。その結果、図4に示すように、WT/HFD群に比べてSMS2 KO/HFD群では有意にトリグリセリド量が減少していた。
2)と同様にHFDを投与したWTとSMS2 KOマウス(12週後)を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しmRNAを抽出し、QPCR(Thermal Cycler Dice TP800,タカラバイオ社)によってアディポネクチンのmRNA発現量を計測した。その際に同サンプル中のGAPDHのmRNA発現量で補正を行った。試薬は、第1鎖cDNA合成には、PrimeScript RT−reagent Kit(タカラバイオ社)を、QPCRには、SYBR premix EX Taq II(タカラバイオ社)を用いた。PCRプライマーは、
Fwプライマー:GTCAGTGGATCTGACGACACCAA(配列番号25);Rvプライマー:ATGCCTGCCATCCAACCTG(配列番号26)
を用いた。
6−1)インスリン受容体の発現分析
次にWTおよびSMS2−KOマウスでの脂肪組織におけるインスリン受容体のmRNAの発現量を定量的PCRにて分析した。高脂肪食(HFD;60%脂肪食)または対照通常食(ND)を野生型(WT)およびSMS2−KOマウスに投与した際のインスリン受容体の相対的な発現量を調べた。使用したプライマー配列と対照プライマー配列を示す。定量的PCRは、5)に記載のものと同様の手法で行った。
フォワード(Fw):CAGCTCGAAACTGCATGGTTG(配列番号27)
リバース(Rv):GGTGACATCCACCTCACAGGAA(配列番号28)
次に、脂肪組織におけるGlut4に対する60%脂肪食投与の影響を検討し、高脂肪食(HFD;60%脂肪食)または対照通常食(ND)を野生型(WT)およびSMS2−KOマウスに投与した際のGlut4の相対的な発現量を比較した。使用したプライマー配列と対照プライマー配列を示す。
フォワード(Fw):CTGTAACTTCATTGTCGGCATGG(配列番号29)
リバース(Rv):AGGCAGCTGAGATCTGGTCAAAC(配列番号30)
内在性対照遺伝子であるヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT):
フォワード(Fw):TTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTA(配列番号7)
リバース(Rv):AGGCAGATGGCCACAGGACTA(配列番号8)。
上記「2)体重に対する60%脂肪食投与の影響の検討」において記載される対照通常食(ND)または高脂肪食(HFD;60%脂肪食)を野生型(WT)またはSMS2−KOマウスに投与し、さらに9週間成育させたマウスを用いて耐糖能試験を行った。24時間絶食させた当該マウスの腹腔内に2g/kgでグルコースを投与し、投与直前、15分後、30分後、60分後、120分後に血糖値を尾静脈からの採血により測定した。測定にはグルコメーターを使用した。その結果、高脂肪食を投与した野生型およびSMS2―KOマウス間において120分の時点で、SMS2―KOマウスで有意に血糖値が低下することが判明した(P<0.05;図5C)。この耐糖能試験のグラフのグラフ下の面積を比較したところ(GTT AUC;図5D)、高脂肪食を投与した野生型およびSMS2―KOマウス間において、SMS2―KOマウスで有意に面積が低下していた(P<0.05)。
のマウスと比較して、有意に血中グルコース濃度が低下していたので、SMS2−KOマウスはインスリンに対して感受性であることが明らかとなった。
1)不死化MEF細胞の作製
新培養細胞実験法(羊土社)第4章 初代培養 線維芽細胞 p.66−70に記載されるようにして、実施例1において作製したSMS1−KOマウスとSMS2−KOマウスとを交配させて得た、SMS1、SMS2を共に欠損したダブルノックアウト(SMS1,2−wKO)の胎児からMEF(マウス胚性線維芽細胞)を単離した。pMFG−SV40Tstを安定的に保持した293T細胞の培養上清に放出されたレトロウイルスをこのMEFに感染させて、MEFを不死化した。
ウイルス産生細胞としてNIH3T3エコトロピック・プロデューサー細胞 ΨCRE−MFGtsT(RCB1119;SV40 T抗原発現ウイルス産生細胞;http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB1119&type=1を参照のこと)を使用した。ΨCRE−MFGtsT細胞は、SV40tsTを発現するレトロウイルスを培地中に放出し、マウス宿主細胞に感染する。サブコンフルエントのΨCRE−MFGtsT細胞を10% FBSを含むDMEM中、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、上清をウイルス液として回収し、0.20mmシリンジフィルター(CORNINGから入手可能)で濾過した。
MEFの培養物において、10% FBS、ウイルス原液1mLを含むDMEM 5mLで培地を置換し、34℃、5% CO2の条件下で24時間培養してウイルスに感染させた後、10% FBSを含むDMEM 5mLを加えてさらに一晩培養した。翌日、10% FBSを含むDMEM 10mLに培地交換した。2〜3日ごとに培地を交換し、MEFの不死化細胞株を樹立し、さらに不死化したMEFからいくつかの細胞株をクローニングし、その一つをZS2と命名した。
pQCXIP(クロンテック社)に、C末端にV5タグを付加したSMS1およびSMS2を組み込み、レトロウイルスベクターを作製した。このプラスミドとGP2−293細胞(クロンテック社)を用いて、SMS1、SMS2をそれぞれ発現するレトロウイルスを作製し、クロンテック社の説明書に従って、1)でクローニングした細胞株の一つZS2細胞に感染させた。4μg/mlのピューロマイシンで非感染細胞を除き、SMS1を過剰発現した細胞ZS2/SMS1、およびSMS2を過剰発現した細胞株ZS2/S
MS2を得た。これら3つの細胞株について、抗V5 mab(invitrogen)抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。SMS1を発現させた細胞およびSMS2を発現させた細胞では、図6に示すように、抗V5 mabで検出されるSMS1、SMS2のバンドがそれぞれ確認された。
実施例2で作製したZS2、ZS2/SMS1およびZS2/SMS2細胞の機能、特に、SMS活性およびTG合成について検討した。
実施例2で作製した細胞(2×105細胞/ウェル)を各々6ウェルプレートに播き、10% FBSを含むDMEM中で一晩培養した後、血清を含まないDMEMに培地を交換し、最終濃度が1μMとなるように調整したBODIPY−C5−セラミド(molecular probe社)を加えて、37℃で30分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、100μlの溶解バッファー(20mM Tris−HCl、pH7.5、0.2%TritonX−100、1×complete(Roche社)、1mM PMSF)で溶解させ、タンパク量をBCA protein asay(Pierce社)で測定した。溶解液からBligh&Dyer法で脂質を抽出し、HPTLC(Merck社)を用いて、BODIPY−セラミドと生成したBODIPY−C5−スフィンゴミエリンを、Fla7000(Fuji film)で定量し、SMS活性を算出した。SMS活性はタンパク質量で補正した。図7に示すように、ZS2/SMS1細胞およびZS2/SMS2細胞がSMS活性を有していたのに対し、ZS2細胞はSMS活性がなかった。
実施例2で作製した細胞(2×105細胞/プレート)を6ウェルプレートに播き、DMEM、10% FBS中で一晩培養後、血清を含まないDMEMに培地を交換し、最終濃度が1μCiの[14C]オレイン酸(American Radiolabeled
Chemicals社)を加えて、37℃で30分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、100μlの溶解バッファー(20mM TrisHCl、pH7.5、0.2%TritonX−100、1×complete(Roche社)、1mM PMSF)で溶解させ、蛋白量をBCA protein asay(Pierce社)で測定した。溶解液からBligh&Dyer法で脂質を抽出し、HPTLC(Merck社)を用いて[14C]オレイン酸と、生成した[14C]オレイン酸−トリグリセリドを、Fla7000(Fuji film)で定量し、TG量を算出した。図8に示すように、ZS2/SMS1細胞およびZS2/SMS2細胞におけるTG量と、ZS2細胞におけるTG量との間には有意差があった(各々、p<0.005およびp<0.02)。
本実施例では、SMS2に対するsiRNAのスクリーニングを行った。具体的手順は以下のとおりである。
asy Mini Kit(QIAGEN)を用いて添付マニュアルに従いDNase I処理した後、全RNAを回収し、SuperScriptIII First Strand Synthesis System(インビトロゲン)を用いて添付マニュアルに従いcDNA合成を行った。合成したcDNAを鋳型としてリアルタイム定量PCRを行ない、SMS2のmRNA量を定量した。リアルタイム定量PCRは反応試薬としてSYBR
Green PCR Master Mix (ABI)を用い、Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム(ABI)を用いて測定を実施した。G3PDHの発現量でサンプル間のcDNAの均一化をおこなった。
Fwプライマー:TCAATGGAGACTCTCAGGC(配列番号33);
Rvプライマー:CCGCTGAAGAGGAAGTCTC(配列番号34)
を用い、
ヒトG3PDHの発現量を測定するために使用したリアルタイム定量PCRプライマー配列は、
Fwプライマー:CCTTCCGTGTCCCCACTG(配列番号35);
Rvプライマー:ACCCTGTTGCTGTAGCCAA(配列番号36)
を用い、
マウスG3PDHの発現量を測定するために使用したリアルタイム定量PCRプライマー配列は、
Fwプライマー:CAACTCCCACTCTTCCACCTTC(配列番号37);
Rvプライマー:CTTACTCCTTGGAGGCCATGTAG(配列番号38)
を用いた。
SMS2-i1 5’-ggucacuuggaaagucaaa-3’ (センス鎖)(配列番号39)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号40)
SMS2-i2 5’-ccggacuacauccagauuu-3’ (センス鎖)(配列番号41)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号42)
SMS2-i3 5’-ggaugguauugguuggguu-3’ (センス鎖)(配列番号21)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号22)
SMS2-i4 5’-gcagauuguuguugaucau-3’ (センス鎖)(配列番号43)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号44)
SMS2-i5 5’-cauagagacagcaaaacuu-3’ (センス鎖)(配列番号45)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号46)。
SMS2-i6 5’-gcauuuucuguaucagaaa-3’ (センス鎖)(配列番号1)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号2)
SMS2-i7 5’-gucacuucuggugguauca-3’ (センス鎖)(配列番号3)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号4)
SMS2-i8 5’-cuguuuuggugguaccauu-3’ (センス鎖)(配列番号5)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号6)
用いたヒト特異的siRNAの配列を示す。
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号8)
SMS2-i105 5'-ggcuguuucugagauacaa-3' (センス鎖)(配列番号9)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号10)
SMS2-i106 5'-ggugguggauuguccauaa-3'(センス鎖)(配列番号11)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号12)
SMS2-i107 5'-ggauuguccauaacuggau-3' (センス鎖)(配列番号13)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号14)
SMS2-i108 5'-ccauaacuggaucacauau-3' (センス鎖)(配列番号15)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号16)
SMS2-i109 5'-gcacacgaacacuacacua-3' (センス鎖)(配列番号17)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号18)
図11に示すように、マウスZS2/SMS2細胞でSMS2−i8を用いて実施例4と同じ実験を行った。siRNAの最終濃度は100nMであり、形質転換後48時間に定量的PCRを行った。その結果80%程度のSMS2の遺伝子発現抑制が確認できた。内在性対照としてG3PDHを使用した。
CTR−i 5’−uucuccgaacgugucacgu−3’(センス鎖)配列番号19)
同アンチセンス鎖(配列番号20)
本実施例では、マウスSMS2に対する2種類のsiRNA(SMS2−i3、i11)を用いてマウス肝実質細胞株であるHepa1c1c7細胞(ATCC)でSMS2をノックダウンし、その効果を確認した。
SMS2−i3 5’−ggaugguauugguuggguu−3’(センス鎖)(配列番号21)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号22)
SMS2−i11 5’−ggcucuuucugcguuacaa−3’(センス鎖)(配列番号23)
その相補配列である同アンチセンス鎖(配列番号24)
7週齢のob/obマウス(♂)へsiRNA搭載リポソームをsiRNA量にして1.25mg/kgでマウス尾静脈内注射して投与した(n=3)。投与後10日間、体重と摂餌量の測定を行った。投与から10日後、4時間絶食させたob/obマウスの肝臓組織を回収した。投与後10日経過後の体重の変化と10日間の平均摂餌量を測定した結果を図16および図17に示す。対照群と比較して体重増加および平均摂餌量に有意差はなかった。
ヒト肝実質細胞株であるHepG2細胞に対照のsiRNA配列であるCTR−i、SMS2−i104またはSMS2−i109を形質転換した。48時間後のSMS2のノックダウン率を図9と同じ方法で測定した。その結果いずれのsiRNA配列を用いた場合にも60%程度のノックダウンが確認できた(図19)。
を形質転換した場合と比較して、SMS2−i104またはSMS2−i109を形質転換した場合には、蛍光量が有意に低下しており、ヒト肝実質細胞でオレイン酸の取り込みかそのTGへの変換あるいはその両方が阻害されていることが判明した。このようにTG蓄積の抑制効果は前述のカベオリン阻害などでも同様の効果があり、また一般的にいって細胞内へのTG蓄積を抑制するような作用は抗肥満効果を惹起することが知られている。したがってSMS2阻害によりヒトsiRNAを用いた細胞レベルの解析においても、マウス肝臓でのノックダウンにより肝TG蓄積抑制作用と同じように、内臓脂肪蓄積抑制、脂肪肝抑制を示唆する効果が確認できた。
次に、例えばKikuchi,Y.& Sasaki,N.,Nucl Acids Res,1991,19,6751.、菊池洋,化学と生物,1992,30,112.に記載される方法を用いて、配列番号79または80に記載されるSMS2の核酸配列に基づき、リボザイム配列を設計する。
本実施例では、ヒトおよびマウスのSMS2の塩基配列での相同性領域(13マー以上の連続相同性領域)をもとに設計したアンチセンス核酸の有効性を実証した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、製造し、ヒトHEK293細胞でノックダウン実験を行った。配列の構造の設計はNucleic Acid Research 2010, Vol38, No.1
のEfficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense ligonucleotides, unassisted by transfection reagents.を参考にした。
acid)であり、小文字はDNAである。LNAはBNA(Bridged Nucleic Acid)の一種で、BNAは10種類以上が知られており、このうちLNAは、糖の2’位と4’位とを−O−CH2−で架橋しコンフォメーションをN型に固定した人工核酸であり、Funakoshi等から入手可能である。これらのオリゴヌクレオチドにおいて、すべての核酸は、ホスホロチオエート修飾のバックボーンでつながっている。LNA部分のCはすべてメチルシトシンである。以下の例では、5’末端にロックド核酸(LNA)が3つ、3’末端にLNAが2つ含まれる。
ヒトSMS2の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:TCAATGGAGACTCTCAGGC(配列番号33);
Rvプライマー:CCGCTGAAGAGGAAGTCTC(配列番号34)
を用い、
ヒトG3PDHの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:CCTTCCGTGTCCCCACTG(配列番号35);
Rvプライマー:ACCCTGTTGCTGTAGCCAA(配列番号36)
を用いた。
とが理解される。
配列番号2:SMS2-i6の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号3:SMS2-i7の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号4:SMS2-i7の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号5:SMS2-i8の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号6:SMS2-i8の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号7:SMS2-i104の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号8:SMS2-i104の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号9:SMS2-i105の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号10:SMS2-i105の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号11:SMS2-i106の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号12:SMS2-i106の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号13:SMS2-i107の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号14:SMS2-i107の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号15:SMS2-i108の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号16:SMS2-i108の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号17:SMS2-i109の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号18:SMS2-i109の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号19:CTR−iの二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号20:CTR−iの二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号21:SMS2-i3の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号22:SMS2-i3の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号23:SMS2-i11の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号24:SMS2-i11の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号25:実施例1で用いたアディポネクチンFwプライマー
配列番号26:実施例1で用いたアディポネクチンRvプライマー
配列番号27:インスリン受容体(IR)のFwプライマー
配列番号28:インスリン受容体(IR)のRvプライマー
配列番号29:GLUT4のFwプライマー
配列番号30:GLUT4のRvプライマー
配列番号31:ヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)のFwプライマー
配列番号32:ヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)のRvプライマー
配列番号33:ヒトおよびマウスSMS2の発現量を測定するために使用したリアルタイム定量PCRのFwプライマー
配列番号34:ヒトおよびマウスSMS2の発現量を測定するために使用したリアルタイム定量PCRのRvプライマー
配列番号35:ヒトG3PDHのFwプライマー
配列番号36:ヒトG3PDHのRvプライマー
配列番号37:マウスG3PDHのFwプライマー
配列番号38:マウスG3PDHのRvプライマー
配列番号39:SMS2-i1の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号40:SMS2-i1の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号41:SMS2-i2の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号42:SMS2-i2の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号43:SMS2-i4の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号44:SMS2-i4の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号45:SMS2-i5の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号46:SMS2-i5の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号47:SMS2-i6のセンス鎖部分の配列
配列番号48:SMS2-i6のアンチセンス鎖の配列
配列番号49:SMS2-i7のセンス鎖部分の配列
配列番号50:SMS2-i7のアンチセンス鎖の配列
配列番号51:SMS2-i8のセンス鎖部分の配列
配列番号52:SMS2-i8のアンチセンス鎖の配列
配列番号53:SMS2-i104のセンス鎖部分の配列
配列番号54:SMS2-i104のアンチセンス鎖の配列
配列番号55:SMS2-i105のセンス鎖の配列
配列番号56:SMS2-i105のアンチセンス鎖の配列
配列番号57:SMS2-i106のセンス鎖の配列
配列番号58:SMS2-i106のアンチセンス鎖の配列
配列番号59:SMS2-i107のセンス鎖の配列
配列番号60:SMS2-i107のアンチセンス鎖の配列
配列番号61:SMS2-i108のセンス鎖の配列
配列番号62:SMS2-i108のアンチセンス鎖の配列
配列番号63:SMS2-i109のセンス鎖の配列
配列番号64:SMS2-i109のアンチセンス鎖の配列
配列番号65:CTR−iのセンス鎖の配列
配列番号66:CTR−iのアンチセンス鎖の配列
配列番号67:SMS2-i3のセンス鎖の配列
配列番号68:SMS2-i3のアンチセンス鎖の配列
配列番号69:SMS2-i11のセンス鎖の配列
配列番号70:SMS2-i11のアンチセンス鎖の配列
配列番号71:SMS2-i1のセンス鎖部分の配列
配列番号72:SMS2-i1のアンチセンス鎖の配列
配列番号73:SMS2-i2のセンス鎖部分の配列
配列番号74:SMS2-i2のアンチセンス鎖の配列
配列番号75:SMS2-i4のセンス鎖の配列
配列番号76:SMS2-i4のアンチセンス鎖の配列
配列番号77:SMS2-i5のセンス鎖の配列
配列番号78:SMS2-i5のアンチセンス鎖の配列
配列番号79:ヒトSMS2の核酸配列
配列番号80:マウスSMS2の核酸配列
配列番号81:実施例10で使用されたSMS2-13-003のアンチセンス核酸の配列
配列番号82:実施例10で使用されたSMS2-13-006のアンチセンス核酸の配列
配列番号83:実施例10で使用されたSMS2-13-007のアンチセンス核酸の配列
配列番号84:実施例10で使用されたSMS2-13-008のアンチセンス核酸の配列
配列番号85:実施例10で使用されたSMS2-13-009のアンチセンス核酸の配列
配列番号86:実施例10で使用されたSMS2-13-010のアンチセンス核酸の配列
配列番号87:実施例10で使用されたSMS2-13-011のアンチセンス核酸の配列
配列番号88:実施例10で使用されたSMS2-13-012のアンチセンス核酸の配列
配列番号89:実施例10で使用されたSMS2-13-014のアンチセンス核酸の配列
配列番号90:実施例10で使用されたSMS2-13-017のアンチセンス核酸の配列
配列番号91:実施例10で使用されたSMS2-13-019のアンチセンス核酸の配列
配列番号92:実施例10で使用されたSMS2-13-020のアンチセンス核酸の配列
Claims (5)
- SMS2の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物であって、
該核酸が、
下記の(a)〜(o):
(a) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号1で表される塩基配列であり、他方が配列番号2で表される塩基配列であるsiRNA;
(b) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号3で表される塩基配列であり、他方が配列番号4で表される塩基配列であるsiRNA;
(c) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号5で表される塩基配列であり、他方が配列番号6で表される塩基配列であるsiRNA;
(d) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号7で表される塩基配列であり、他方が配列番号8で表される塩基配列であるsiRNA;
(e) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号9で表される塩基配列であり、他方が配列番号10で表される塩基配列であるsiRNA;
(f) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号11で表される塩基配列であり、他方が配列番号12で表される塩基配列であるsiRNA;
(g) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号13で表される塩基配列であり、他方が配列番号14で表される塩基配列であるsiRNA;
(h) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号15で表される塩基配列であり、他方が配列番号16で表される塩基配列であるsiRNA;
(i) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号17で表される塩基配列であり、他方が配列番号18で表される塩基配列であるsiRNA;
(j) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号21で表される塩基配列であり、他方が配列番号22で表される塩基配列であるsiRNA;
(k) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号23で表される塩基配列であり、他方が配列番号24で表される塩基配列であるsiRNA;
(l) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号39で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号40で表される塩基配列であるsiRNA;
(m) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号41で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号42で表される塩基配列であるsiRNA;
(n) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号45で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号46で表される塩基配列であるsiRNA;および
(o)一方または両方の塩基配列において1〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、SMS2の発現を抑制する活性を有する、(a)〜(n)のいずれかに記載のsiRNA
からなる群より選択されるいずれか1つ以上からなる
医薬組成物。 - SMS2の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物であって、該核酸が配列番号81〜92のいずれか1つ以上からなる、医薬組成物。
- 前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される1または2以上である請求項1または2記載の医薬組成物。
- 下記の(a)〜(l)からなる群より選択されるいずれかのsiRNA:
(a) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号1で表される塩基配列であり、他方が配列番
号2で表される塩基配列であるsiRNA;
(b) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号3で表される塩基配列であり、他方が配列番
号4で表される塩基配列であるsiRNA;
(c) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号7で表される塩基配列であり、他方が配列番
号8で表される塩基配列であるsiRNA;
(d) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号9で表される塩基配列であり、他方が配列番
号10で表される塩基配列であるsiRNA;
(e) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号11で表される塩基配列であり、他方が配列
番号12で表される塩基配列であるsiRNA;
(f) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号13で表される塩基配列であり、他方が配列
番号14で表される塩基配列であるsiRNA;
(g) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号15で表される塩基配列であり、他方が配列
番号16で表される塩基配列であるsiRNA;
(h) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号21で表される塩基配列であり、他方が配列
番号22で表される塩基配列であるsiRNA;
(i) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号23で表される塩基配列であり、他方が配列
番号24で表される塩基配列であるsiRNA;
(j) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号39で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号40で表される塩基配列であるsiRNA;
(k) 二重鎖RNA部分の一方が配列番号45で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号46で表される塩基配列であるsiRNA;ならびに
(l)一方または両方の塩基配列において1〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、SMS2の発現を抑制する活性を有する、(a)〜(k)のいずれかに記載のsiRNA。 - 配列番号81〜92のいずれか1つ以上からなるロックド核酸(LNA)含有核酸。
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