MX2011004852A - Uso de inhibidores de la actividad del plac8 para la modulacion de la adipogenesis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a Plac8, un nuevo objetivo implicado en la modulación de la adipogénesis. Usando una propuesta de siRNA, los autores demostraron que la disminución de la actividad de Plac8 en preadipocitos y tejido adiposo induce una disminución de la adipogénesis. Así, la presente invención se refiere a moduladores de la actividad de Plac8 así como a ensayos de detección sistemática para la identificación de moduladores de la actividad de este objetivo y su uso, especialmente en composición farmacéutica, para modular la adipogénesis y tratar así la obesidad y trastornos relacionados.

Description

USO DE I NH IBIDORES DE LA ACTIVIDAD DEL PLAC8 PARA LA MODU LACIÓN DE LA ADI POGÉN ESIS La presente invención se refiere a Plac8, un nuevo objetivo implicado en la mod ulación de la adipogénesis así como al ensayo de detección sistemática para la identificación de modu ladores de la actividad de este objetivo. Además, la presente invención se refiere a moduladores de la actividad del Plac8 y a su uso, especialmente en composición farmacéutica, para modula r la ad ipogénesis y tratar así la una serie de trastornos, incluyendo la hipertensión arterial, arteriopatía coronaria, dislipidemia , resistencia a la insu lina y diabetes de tipo 2. Debido a la importancia de la obesidad epidémica, gran parte de la i nvestigación se ha centrado en la biología del adipocito , incluyendo la vía de desarrollo por la que se crean nuevos adipocitos . La adipogénesis es el proceso por el que las cél ulas precursoras mesenquimatosas, no diferenciadas, llegan a ser adipocitos maduros. A lo largo de la última década , se ha realizado un considerable progreso en la dil ucidación de los mecanismos moleculares de la diferenciación de los adipocitos, que implica la activación secuencial de factores de transcripción de varias familias tales como CCAAT/proteínas potenciadoras de unión (C/???a, a y ? ) y el receptor de hormonas nucleares receptor y activado por proliferador de peroxisoma (PPARy) (Rosen , E . D. et al. , 2.002) . PPARy se describe como un "regulador maestro" de la adipogénesis puesto que se ha demostrado que es tanto suficiente como necesario para la adipogénesis tanto in vitro como in vivo. Recientemente, se ha descrito que participan en la adipogénesis nuevos factores de transcripción , tales como la familia KLF (KLF2 , 5 y KLF1 5) (Banerjee, S . S . et al. , 2.003; Gray, S . M . et al. , 2.002) , la familia Ebf (Jiménez, M. A. et al. , 2.007) y Krox 20 (Chen , Z. et al. , 2.005) , que sugieren que la cascada transcripcional que tiene lugar durante la adi pogénesis es mucho más compleja de lo que se pensaba previamente. Además, también se ha descrito que las moléculas de señalización y/o los receptores tales como la familia Wnt de proteínas seg regadas (Kang S . et al. , 2.007) , la proteína sonic hedgehog, el receptor notch , están impl icados en procesos moleculares que conducen a la formación de adipocitos. Es interesante observar que los procesos extracel ulares e intracelulares se acoplan de algún modo para regular la adipogénesis. Todas estas vías de señalización convergen en u na cascada transcri pcional estrecha mente regulada que requiere ser entendida más completamente para controlar potencialmente el desarrollo de los adipocitos y prevenir la obesidad.

El almacenamiento de la grasa en tej ido adiposo está limitado y exceder de esta capacidad conduce a la acumulación de lípidos en otros tejidos, en particular, en músculo , h ígado y el páncreas endocrino y a la segregación por los adi pocitos de diversas adipocinas. El tejido adiposo consiste en diversos depósitos situados en d iferentes sitios anatómicos que pueden originarse a partir de distintos precu rsores y que presentan diferentes funciones fisiológ icas y papeles patofisiológicos. Los viscerales, a diferencia de los depósitos ad iposos su bcutáneos, pueden contribuir más a los defectos asociados al síndrome metabólico.

Se han identificado receptores Canabinoides 1 en todos los órganos que desempeñan un papel clave en el metabolismo de la glucosa y la diabetes de tipo 2, es decir, tejido adiposo, el tracto gastrointestinal, el hígado, el músculo esquelético y el páncreas. Rimonabant, el primer antagonista del receptor canabinoide 1 selectivo (CB1R) en uso clínico, ha demostrado que reduce la absorción de alimento y el peso corporal, mejorando así la regulación del metabolismo de la glucosa.

Sin embargo, aún existe la necesidad de nuevos objetivos terapéuticos para el tratamiento de la obesidad.

Se conoce la proteína Placental 8 (Plac8) como una molécula de señalización citoplasmática, aunque se ha referido que tiene un péptido de señal putativa (Rogulski, K. et al., 2.005). Recientemente, se generaron ratones knockout Plac8 y presentaron una respuesta inmune deteriorada a la infección bacteriana (Ledford, J. G. et al., 2.007). Aún se desconoce el papel y la función de Plac8 en células inmunes, así como en otros tipos de células.

Los inventores han encontrado ahora que Plac8 desempeña un papel crítico en la diferenciación de los adipocitos. Se considera así Plac8 como un nuevo objetivo relevante para la modulación de la adipogénesis y para el tratamiento de la obesidad y los trastornos relacionados. También se puede usar la inhibición de Plac8 para disminuir la adipogénesis para la reducción de la acumulación de grasa subcutánea y visceral.

Descri pción detallada de la invención La presente invención se refiere a métodos para regular la adipogénesis y la función metabólica en los adipocitos.

La presente invención consiste en el uso de i nhi bidores de la actividad de Plac8 para la modu lación de la adipogénesis, en particular para el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene tales mod uladores de la adi pogénesis y los trastornos relacionados y a ensayos de detección sistemática para tales moduladores.

Los inventores han identificado el papel de Plac8 en la modulación de la adipogénesis. Mediante un enfoque transcriptómico, identificaron genes cuya expresión está en correlación con la gana ncia de peso corporal en grupos de ratones C57BI/6 alimentados con una dieta rica en grasa. Después, lleva a cabo un seg undo análisis para evaluar los cambios en la expresión de los genes, inducidos por el tratamiento con rimonabant, de los ratones al imentados con u na dieta rica en grasa . Se conservaron genes que no se han descrito nunca a ntes en la biolog ía de los adipocitos, pero q ue pod ían estar im plicados en importantes procesos biológicos tales como la señalización , modificación de proteínas de matriz extracel ulares y la transcripción de los genes. Estos genes pod ían ser importantes para la adipogénesis especialmente puesto que pod ían estar impl icados en el mecanismo por el que el rimonabant reduce la masa de grasa en los ratones. En este contexto, se identificó Plac8 como im plicado en el metabol ismo de los adipocitos, especialmente en n ueva vía de señalización . De manera más general , parece que este gene desempeña un papel en la adipogénesis y en el control del desarrollo del tej ido ad i poso en la obesidad .

La presente invención consiste en la identificación de moduladores de la actividad de Plac8. Tales mod uladores pueden ser cualquier com puesto o molécula capaz de modular la actividad de Plac8 en particular moléculas peq ueñas, lípidos y si RNA.

Se pueden identificar mod uladores de la actividad de Plac8 por detección de la capacidad de un agente para mod ular la actividad de Plac8. Los inhibidores de Plac8 son cualqu ier compuesto capaz de reducir o in hi bir, totalmente o parcialmente, la actividad de Plac8. Los inhibidores de Plac8 incluyen , pero no se limitan a, agentes que interfieren con la interacción de Plac8 con su ligando natural en el compartimento intracel ular, agentes que reducen la expresión de Plac8, tanto a niveles de transcripción y trad ucción , así como agentes que inhiben las señales intracelulares en las que está impl icado Plac8.

En una modalidad , se puede reducir la actividad de Plac8 usando moléculas peq ueñas que inhiban , totalmente o parcialmente, la transcri pción de Plac8. Tales moduladores se pueden identificar usando métodos conocidos por el experto en la materia , como un sistema reportador q ue consiste en el activador de Plac8 unido en una estructura a un gene reportador y expresado en una l ínea cel ular adecuada ; se puede medir cuantitativamente la actividad del producto del gene reportador. Así, se puede considerar como u n potencial candidato un compuesto que inhiba la expresión del gene reportador, por ejemplo por inhibición de un factor activador de la transcripción.

Son numerosos los genes reportadores que se pueden usar en tales sistemas informadores y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales genes informadores pueden ser genes que permitan la expresión de la Proteína Verde Fluorescente (GFP), luciferasa, ß-galactosidasa...

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método para la clasificación de inhibidores de la actividad de Plac8, que comprende las etapas de: a) transfectar una línea celular con una construcción reportadora que comprenda un promotor de Plac8 unido a un gene reportador b) cultivar dicha línea celular en las condiciones que permitan la expresión del gene reportador c) añadir compuestos candidatos al cultivo celular e d) identificar los compuestos inhibidores como los compuestos que presentan la capacidad de reducir o inhibir la expresión del gene reportador El promotor de Plac8 pronosticado que se tiene que usar en el ensayo de clasificación descrito anteriormente para moduladores de la transcripción de Plac8 corresponde a la SEC ID N° 23.

En otra modalidad, la expresión de Plac8 se modula por interferencia de RNA, usando los pequeños RNA de interferencia (siRNA) o los pequeños RNA en forma de horquilla (los shRNA). Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos de doble filamento, incluyendo pequeñas moléculas de ácidos nucleicos, tales como pequeñas moléculas de ácidos nucleicos de interferencia (si NA) , de pequeño RNA de interferencia (si RNA) , de RNA de doble cadena (dcRNA), de micro-RNA (mi RNA) y de pequeño RNA en forma de horquilla (shRNA) , capaces de actuar como mediadoras de la interferencia de RNA (RNAi) contra la expresión del gene Plac8, incluyendo cócteles de dichas pequeñas moléculas de ácidos nucleicos y formulaciones adecuadas de tales pequeñas moléculas de ácidos nucleicos.

E l fenómeno del silenciamiento de los genes mediado por RNAi se ha descrito pri mero en el sistema del Caenorhabditis elegans, en que se refirió la microinyección de molécu las de RNA de doble filamento, largas. El mecanismo de la inactivación de los genes mediada por RNA parece ser ligeramente diferente en los diversos organismos que se han estudiado hasta ahora. Sin embargo, en todos los sistemas, el silenciamiento de los genes mediado por RNA está basado en la degradación postranscripcional del mRNA objetivo, inducido por la endonucleasa Argonaute2 q ue es parte del complejo denominado RISC . La especificidad de la secuencia de la degradación se determina por la secuencia de n ucleótidos de la filamento de RNA antisentido, específica, cargada en el complejo RISC.

La introducción en células de un compuesto de si RNA da como resultado células con un nivel reducido del m RNA objetivo y, por lo tanto, del polipéptido correspondiente y al mismo tiempo, de la actividad enzimática correspondiente.

Se pueden usar si RNA específicos para Plac8, como se describe en la presente memoria , como moduladores de la actividad de Plac8, para reducir la traducción de mRNA de Plac8. Más en particular, se puede usar si RNA específico para Plac8 , para reducir la adipogénesis y tratar así la obesidad y las enfermedades relacionadas.

En una modalidad, la invención caracteriza una molécula de ácido nucleico de doble filamento, tal como una molécula de siRNA, donde una de las filamentos comprende una secuencia de nucleótidos con complementariedad para una secuencia de nucleótidos de Plac8 predeterminada, en una molécula objetivo de ácido nucleico de Plac8, o una porción de la misma .

Se puede usar la molécula de RNA mod ificada o no modificada. Un ejemplo de modificación es la incorporación de tricilo-DNA para permitir la estabilidad mejorada del suero del oligon ucleótido .

En una modalidad , la secuencia de nucleótidos de Plac8 determi nada, es u na secuencia objetivo de nucleótidos de Plac8, descrita en la presente (SEC I D N° 1 y S EC I D N° 3) .

Debido a la potencial variabilidad de las secuencias del genoma a través de diferentes organismos o diferentes individuos, la selección de las moléculas de siRNA para extensas aplicaciones terapéuticas, implica probablemente las regiones conservadas del gene. Así en una modal idad , la presente invención se refiere a moléculas de si RNA que fijan como regiones conservadas objetivo del genoma o regiones que se conservan a través de diferentes objetivos. Las moléculas de siRNA diseñadas para fijar como regiones conservadas objetivo de diversas objetivos, permiten la inh ibición eficaz de la expresión del gene Plac8 en diversas poblaciones de pacientes.

En una modalidad, la invención caracteriza una pequeña molécula de ácido nucleico de interferencia , de doble filamento, que reduce la regulación de la expresión de un gene Plac8 objetivo o que se dirige a la escisión de un RNA objetivo, en la que dicha molécula de siRNA comprende aproximadamente 1 5 a aproximadamente 28 pares de bases, preferiblemente aproximadamente 1 9 pares de bases. Se puede sintetizar químicamente u n inhibidor de si RNA o RNAi de la presente invención , expresado a partir de un vector o se puede sintetizar enzimáticamente.

En una modal idad particular, el siRNA específico para Plac8 es shRNA con las secuencias SEC I D N° 5 o SEC I D N° 6 o SEC I D N° 7. En una modalidad preferida , el si RNA específico para Plac8 es shRNA con la secuencia SEC I D N° 6 o SEC I D N° 7 y en una modalidad más preferida , el siRNA específico para Plac8 es sh RNA con la secuencia SEC I D N° 6.

El uso de u n si RNA según la presente i nvención conduce a la reducción del nivel de mRNA desde 5% a 20% , preferiblemente desde 5% a 15% , más preferiblemente desde 5% a 1 0% del nivel de mRNA de la correspondiente célula de cepa natu ral. La célula de cepa natural es la cél ula previa a la introducción del ácido nucleico que codifica el compuesto de siRNA, en que el m RNA objetivo no es deg radado por un compuesto de siRNA.

Los in hi bidores de la actividad de Plac8 se pueden administrar por cualquier vía adecuada, tanto local mente como sistémicamente, dependiendo de la natu raleza de la molécula y el efecto esperado. Se puede administrar localmente siRNA en el caso de molécula de doble filamento, directamente en el tejido objetivo o admi nistrarse por un vector en el caso de shRNA, seg ún los protocolos usados en la técnica.

En una modalidad , se obtiene RNAi usando moléculas de shRNA. Las construcciones de shRNA codifican un RNA de tal lo-bucle. Después de la introducción en las células, se transforma este RNA tallo-bucle en un com puesto de RNA de doble filamento, cuya secuencia corresponde a la raíz de la molécula de RNA original . Tal RNA de doble filamento se puede preparar según cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos i n vitro e in vivo, como se describe en , pero no se limita a , Sahber et al ( 1 .987) , Bhattacharyya et al, ( 1 .990) o la patente estadounidense 5 , 795,71 5.

Para administración in vivo, se puede i ntroducir shRNA en un plásmido. Los sh RNA procedentes de plásmido presentan la ventaja de proporcionar la opción de la combinación con genes reportadores o marcadores de selección y distribuirse mediante vectores virales o no virales. La introducción de sh RNA en un vector y después en células asegura que el shRNA se exprese de manera continua. Se hace pasar el vector normalmente a células hermanas, permitiendo que se herede el silenciamiento del gene.

La presente invención también proporciona vectores que comprenden los polinucleótidos para la expresión de la expresión de shRNA de la invención . Estos vectores son , por ejemplo, el vector AAV, el vector retroviral en particular el vector lentiviral, el vector adenoviral que se puede administrar por diferentes vías adecuadas incluyendo vía intravenosa , vía intram uscular, inyección di recta en tejido subcutáneo u otro tejido, fijado como objetivo, elegido según la práctica normal.

La vía de administración de si RNA varía desde distribución directa , local , a administración intravenosa sistémica. La ventaja de la distribución local es que las dosis de siRNA requeridas para ser eficaces son sustancialmente bajas puesto que las moléculas se inyectan en o cerca del tejido fijado como objetivo. La ad ministración local permite también la distribución centrada en si RNA. Para tal distri bución directa, se puede usar si RNA simple. "si RNA simple" se refiere a la distribución de si RNA (no modificado o modificado) en disolución salina u otros excipientes sim ples tales como dextrosa al 5% . La facilidad de formulación y administración de tales molécul as hace esto una propuesta terapéutica atractiva . También se puede formular DNA simple en l ípidos, especialmente liposomas.

La aplicación sistémica de siRNA es con frecuencia menos invasiva y, en mayor medida, no está limitada a tejidos que sea n suficientemente accesibles desde el exterior. Para distribución sistémica, se puede form ular si RNA con conjugado de colesterol , liposomas o nanopartículas a base de polímeros. Los liposomas se usan tradicionalmente para proporcionar propiedades farmacoci néticas mejoradas y/o perfiles de toxicidad reducida. Permiten una distribución in vivo exitosa , sig n ificativa y repetitiva. En la actualidad , el uso de formulaciones a base de l ípidos, de distribución sistémica de siRNA, especialmente para hepatocitos, parece representar una de las oportunidades más prometedoras, a corto plazo, para el desarrollo de tratamientos de RNAi . La formulación con pol ímeros tales como policonjugados dinámicos - por ejemplo, acoplados con N-acetilglucosami na para enfoque de hepatocitos - y nanopartículas a base de ciclodextrina, perm ite tanto la distribución dirigida como los mecanismos de escape endosómicos. Otros pol ímeros tales como atelocolágeno y quitosá n permiten efectos terapéuticos sobre xenoinjertos de tumores subcutáneos así como en metástasis ósea .

También se puede conjugar directamente siRNA con una entidad molecular diseñada para ayudar a la distribución dirigida . Dada la naturaleza del dúplex de siRNA, la presencia de la hebra inactiva o transcrita conlleva un sitio ideal para la conjugación. Ejemplos de conjugados son conj ugados li pófilos, tales como colesterol o conj ugados a base de aptámero .

También se usan proteínas y péptidos catiónicos para formar complejos con la cadena principal de fosfato cargada de manera negativa, del dúplex de siRNA.

Se pueden usar estas diferentes propuestas de distribución para dirigir el siRNA de Plac8 hacia el tejido relevante, especial mente tejido adiposo. Para tal enfoq ue, se puede conjugar siRNA con diferentes moléculas que interactúen con preadipocitos y adipocitos, como por ejemplo ligandos q ue i nteractúan con transportadores de lípidos, receptores, receptor de insulina o cua lquier molécula conocida en la técnica.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, un modulador de Plac8 de acuerdo con la presente invención . Estas composiciones farmacéuticas comprenden una dosis eficaz de al menos un mod ulador de acuerdo con la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes se eligen según la forma farmacéutica y la vía de administración deseada , entre los excipientes habituales conocidos por un experto en la materia .

La invención tam bién consiste en un método para la modulación de la adipogénesis. Se puede usar dicho método para tratar la obesidad o las enfermedades relacionadas. También se puede usar dicho método para reduci r la acumulación de g rasa con una finalidad cosmética.

Los moduladores de la actividad de Plac8 son úti les en terapéutica para modular la adipogénesis, en particular en el tratamiento y la prevención de trastornos relacionados con la obesidad, en particular diabetes de ti po 2, d isl ipidemia , presión arterial elevada, resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares y de manera más general síndromes metabólicos.

La presente invención , según otro de sus aspectos, se refiere a un método para el tratamiento de las patolog ías anteriores, que comprende la administración ¡n vivo a un paciente de u na dosis eficaz de u n modulador de Plac8 según la invención .

Las formas farmacéuticas unitarias apropiadas comprenden las formas orales, tales como tabletas, cápsulas de gelati na duras o blandas, polvos, gránulos y soluciones o suspensiones orales, las formas sublingual , bucal , intratraqueal, intraocular, intranasal, por inhalación, las formas tópica , transdérm ica , su bcutánea , i ntramuscular o intravenosa , las formas rectales y los implantes. Para la aplicación tópica , pueden util iza rse los compuestos de la invención como cremas, geles, pomadas o lociones.

Según la práctica habitual , la dosificación adecuada para cada paciente es determinada por el médico de acuerdo con la vía de administración , el peso y la respuesta del paciente.

También son útiles los inhibidores de Plac8 para aplicaciones cosméticas para reducir la acumulación de grasa deplorable. Para aplicaciones cosméticas, se pueden incorporar in hi bidores de Plac8 en una formu lación adecuada para uso tópico. Los i n hibidores de Plac8 pueden ser tanto moléculas pequeñas como si RNA, como se describió previamente.

Se descri be ahora la invención por referencia a los siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos y que no pretenden limitar la presente invención .

Ejemplos Breve descri pción de las fig uras Figura 1 : Selección de genes reguladores de tejido adiposo, críticos. Los diagramas de Ven n il ustran la selección de genes basada en los siguientes criterios: A) Regulación similar por ali mentación rica en grasa en subcutáneo (SCAT o Sq) y visceral (VAT) . Se seleccionaron 151 genes (48 por SCAT y 88 por VAT) . B) Entre esos 1 51 genes, selección de genes reg ulada por tratamiento con rimonabant ( 14 por SCAT y 54 por VAT) . Esto conduce a la selección de 34 genes reg ulados en ambos tejidos por alimentación rica en grasa y rimonabant. Entre esos genes, 16 presentan un nivel de expresión correlacionado con el peso corporal de los grupos L, M y H (ligado a la obesidad) y 1 8 están regulados por DRG al m ismo nivel en cada subgrupo (no ligado a la obesidad) .

Figura 2 : Expresión de Plac8 en diversos tipos de tej idos y cél ulas: A) Transferencia de northern para Plac8 q ue demuestra expresión de, mRNA en diversos tejidos de ratón : bazo , músculo (gastrocenemio) , corazón , pulmón , riñon, hígado, tejido adiposo marrón (BAT, por sus siglas en inglés) , tejidos adiposos subcutáneo (SCAT) y visceral (VAT). Como control se colorea la membrana con azul de metileno. El tamaño del mRNA de Plac8 se muestra a la derecha. B a E : niveles de mRNA de Plac8 medidos por RT-PCR B) en SCAT y VAT de ratones de cepa natural y Ob/Ob (n=5) * p<0, 05, los datos se presentan como media ± sd y se expresan como veces de aumento en relación con el SCAT de control fijado en 1 . C) en fracción estromal vascular (SVF) y adipocitos aislados de ratones (n=5 ratones reunidos para cada extracción, el experimento se repitió 3 veces, se muestra un experimento representativo) . Los datos se expresan como veces de aumento con respecto a la expresión de SCAT SVF. D) en SCAT y VAT de tejido completo humano , adipocitos aislados , preadipocitos aislados y adipocitos diferenciados in vitro. Los datos se expresan como niveles relativos a expresión de SCAT de tejido completo, fijado en 1 . E) en cél ulas 3T3-L 1 previamente a tratamiento de DM I el d ía 2 y después del tratamiento de DMI hasta el d ía 7. N=2-3 series de células. Los datos se representan como niveles relativos a la expresión el día 0.

Figura 3: Eliminación de la expresión de Plac8 y la actividad por shRNA: A) Transfección de shRNA en células 293T. Se transfectaron de manera conjunta plásmidos retrovirales pSIREN con secuencias de shRNA frente a Plac8, con plásmido que expresa pCMVSPORT. Como control para la construcción de shRNA, usamos un shRNA frente a la proteína luciferasa de luciérnaga (shRNA luciferasa). Se ensayaron 3 shRNA para Plac8. B) Se transdujeron células 3T3-L1 con retrovirus que contenían shRNA dirigido contra luciferasa (shLuc) o Plac8 (shPlac8). Se midieron los niveles de mRNA por RT-PCR previamente a la diferenciación. C) Dibujos de oil-red-0 de 3T3-L1 diferenciadas el día 9. D) Expresión de mRNA de aP2 (marcador de diferenciación) medida por RT-PCR en las mismas células que en C) el día 9. Los resultados se expresan como media ± sd *P<0,05, **, P<0,01; ***, P<0,005. n=3.

Figura 4: Sobreexpresión de cDNA de Plac8 en la línea celular 3T3-L1: A) 3T3-L1 transducida con retrovirus que expresan el cDNA de murino para Plac8 o los retrovirus vacíos como control. Expresión de mRNA de Plac8 medida por RT-PCR el día 0. B) Dibujos de oil-red-0 de las placas de 3T3-L1 diferenciadas el día 4 y 9, transducidas bien con construcción que contiene cDNA para Plac8 o bien con retrovirus de construcción vacía (control). C) Expresión de mRNA de PPARgamma2 (marcador de diferenciación) medida por RT-PCR en las mismas células, el día 9. Los resultados se expresan como media ± sd * P<0,05, **, P<0,01. n=3.

Material y Métodos Tratamiento de los Animales Se alimentaron ratones C57BL/6J, que eran propensos a la obesidad (Collins et al., 2.004), durante 6 meses, con una dieta rica en grasa (HFD). Después de 6 meses de HFD, los ratones presentaron una dispersión de pesos corporales, con diversos grados de intolerancia a la glucosa (medida por un ensayo de tolerancia a la glucosa. Se separaron los ratones de la HFD en 3 grupos, indicando el mismo nivel de intolerancia a la glucosa pero con pesos corporales bajo (B), medio (M) o alto (A) y se trataron, así como a ratones alimentados con comida Normal (NC), durante un mes con vehículo o rimonabant (10 mg. kg*1. día"1), para normalizar su peso corporal.

Preparación de RNA, marcado e hibridación en micromatrices de cDNA.

Se extrajo RNA de 5 ratones diferentes por grupo, de tejidos adiposos viscerales y subcutáneos, usando peqGOLD Trifast™ (peqlab) y extracción con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se precipitó RNA con isopropanol y se purificó por pase por columnas RNeasy (Qiagen). Se comprobó la calidad del RNA antes y después de multiplicación con un Bioanalyzer 2100 (Agilent). Se transcribió invertido el RNA y se multiplicó el RNA con un estuche MessageAmp™ (Ambion). Se multiplicó de manera similar una Referencia Universal de Ratón (Clontech) y se marcó tanto el tejido adiposo como los RNA de referencia por una técnica indirecta con Cy5 y Cy3 según protocolos publicados (De Fourmestraux et al., 2.004). Se hibridaron los RNAs marcados con micromatrices que contenían 17,664 cDNA preparados en el DNA Array Facility de la Universidad de Lausanne. Se realizaron barridos, formación de imágenes y análisis de control de calidad, como se publicó previamente (de Fourmestraux et al., J. Biol. Chem. 2.004, 279:50.743-53). Los datos se expresaron como log2 de relaciones de intensidad (Cy5/Cy3), Normalizados con un método de regresión lineal, localmente ponderada, de punta impresa (Lowess) y se filtraron basándose en la calidad de la mancha y anotación incompleta. Todos los análisis se realizaron con el programa informático R para cálculo estadístico disponible en the Comprehensive R Archive Network (cran.us.r-project.org/).

Cultivo celular Se cultivaron células 3T3-L1 en DMEM (Gibco) con FBS al 10% (Gibco) a 5% de C02. Después de infección retroviral (véase a continuación), se permitió que las células crecieran para confluencia en placas de 100 mm o de 60 mm en DMEM con FBS al 10%. Una vez alcanzada la confluencia, se expusieron las células a medio de diferenciación con dexametasona (1 µ?), insulina (5 µg/ml) e isobutilmetilxantina (05 µ?) (DMI). Después de 2 días, se mantuvieron las células en medio que contenía insulina (5 µg/ml) hasta que estuvieron listas para la recogida a los 7 días.

Coloración con oil-red-0 Después de 7 a 10 días de diferenciación, se lavaron las células una vez con PBS y se fijaron con formaldehído (Formadle-fresh; Fisher), durante 15 minutos. Se preparó la disolución de coloración por disolución de 0.5 g de oil-red-0 en 100 mi de isopropanol; se mezclaron 60 mi de esta disolución con 40 mi de agua destilada. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se filtró la disolución de coloración y se añadió a las placas durante 4 horas. Después se retiró la disolución de coloración y se lavaron las células dos veces con agua destilada.

Construcciones de shRNA Se construyeron los shRNA usando el RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (Clontech). Se diseñaron secuencias objetivo para Plac8 consultando el algoritmo de siRNA de Whitehead (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) así como el programa informático de diseño de siRNA de Clontech (http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/); se subclonaron al menos dos secuencias representadas por ambos algoritmos en los vectores pSIREN (Clontech) usando los sitios de restricción EcoRI y BamH1. Se eligieron las siguientes tres secuencias objetivo para Plac8: SEC. ID. N° 5 (shPlac8-1), SEC ID N° 6 (shPlac8-2) y SEC ID N° 7 (shPlac8-3); Como un control negativo, se usó una secuencia de siRNA contra luciferasa con la secuencia SEC ID N° 8 (shLuc).

Transfección de construcciones de shRNA Se ensayó la especificidad de los shRNA en células 293T HEK transfectadas conjuntamente usando métodos de calcio-fosfato descritos en Jordán, M., et al., (2004) con vectores de expresión que contenían cDNA de Plac8 (SEC ID N° 21) y el vector RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen que expresa ya sea el sh RNA contra l uciferasa (control shLUC) o Plac8 (shPlac8) . Se real izó el análisis RT-PCR en RNA de células -extracción 24 h después de la transfección .

Generación de construcciones retrovirales e infecciones retrovirales Se construyeron retrovirus en el RNAi-Ready pS I REN-RetroQ ZsGreen (pS I REN Clontech) o plásmido de puromicina de pMSCV (pMSCV, Clontech). Se transfectaron construcciones virales usando el método de calcio-fosfato descrito en Jordán , M . , et al. (2004) en células de envasado 293 HEK junto con construcciones q ue codificaban gag-pol y la proteína VSV-G . Se recogieron los sobrenadantes después de 48 h en presencia de 3 µ?t? de Trichostatina A (Sigma) y se usaron o inmediatamente o se congelaron instantá neamente y se al macenaron a -80°C para uso posterior. Se añadieron sobrenadantes virales a las cél ulas durante 6 horas, en presencia de polibreno (4 µg ml) y se diluyó dos veces con medio fresco durante las 1 5 horas siguientes.

Construcciones de sobreexpresión Se usó un plásmido retrovi ral de puromicina pMSCV modificado (de Clontech) que expresaba un marcador de G FP, para sobreexpresar el cDNA de Plac8 en cél ulas. Se insertó el cDNA (S EC I D N° 21 ) despu ntado en el sitio de restricción hpa l a parti r del sitio de multiclonación de pMSCV. Se ensayó en las colonias resultantes la orientación correcta y se seleccionaron por digestión de enzimas. Se seleccionó el clon correcto y se am plificó y se usó para la infección retroviral de células 3T3-L1.

Aislamiento de adipocitos y fracción estromal vascular (SVF) de tejido adiposo Se practicó la eutanasia a ratones C57BL/6J, macho, de ocho semanas, (n=6-8) por inhalación de C02 y se recogió tejido adiposo epididimal (visceral) y subcutáneo y se pusieron en medio DMEM que contenía 10 mg/ml de BSA deficiente en ácidos grasos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI). Se trituró el tejido en trozos pequeños y después se digirió en 0.12 unidades/ml de colagenasa de tipo I (Sigma), a 37°C, en un baño de agua de agitación (80 Hz), durante 1 hora. Después se filtraron las muestras por una malla de nylon de 250 µ??, estéril, (Scrynel NY250HC, Milian) para retirar los fragmentos no digeridos. Se centrifugó la suspensión resultante a 1100 RPM, durante 10 min, para separar SVF de los adipocitos. Se retiraron los adipocitos y se lavaron con amortiguador DMEM. Después se suspendieron en reactivo peqGOLD TriFast (Axonlab) y se aisló RNA según las instrucciones del fabricante. Se incubó la fracción SVF en amortiguador de lisis de eritrocitos (NH4CI 0.154 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0.1 mM), durante 2 min. Después se centrifugaron las células a 1100 RPM, durante 10 min y se resuspendieron en 500 µ? de reactivo peqGOLD TriFast (Axonlab) para aislamiento de RNA.

Extracción de RNA y PCR a Tiempo real Se aisló el RNA total de las células cultivadas usando reactivo peqGOLD TriFast según las instrucciones del fabricante (Axonlab). Se sintetizó cDNA de primera hebra a partir de 0.5 µg de RNA total usando iniciadores aleatorios y Superscript II (Invitrogen). Se realizó PCR en tiempo real usando Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem). Se usaron los siguientes iniciadores para genes de ratón: SEC ID N° 9 (Plac8-Sentido directo), SEC ID N° 10 (Plac8-lnvertido), SEC ID N° 11 (PPARgamma2-F), SEC ID N° 12 (PPPARgamma2-R), SEC ID N° 13 (Ap2-F), SEC ID N° 14 (Ap2-R), SEC ID N° 15 (Ciclofilina A-F), SEC ID N° 16 (Ciclofilina A-R). Se usaron los siguientes iniciadores para genes humanos: SEC ID N° 17 (hPlac8-F), SEC ID N° 18 (hPlac8-R), SEC ID N° 19 (hCiclofilina A-F) y SEC ID N° 20 (hCiclofilina A-R).

Northern blot Se aisló el RNA total de diversos tejidos de ratón usando el reactivo peqGOLD TriFast según las instrucciones del fabricante (Axonlab). Se separó RNA total (8 µg) en un gel al 1.2% de agarosa/formaldehído y se transfectó durante la noche a una membrana de nylon. Para controlar la carga de la cantidad de RNA, se coloreó la membrana con azul de metileno previamente a las hibridaciones posteriores. Para la detección de señales de Plac8, se usaron sondas de plásmido de ratón de cDNA de tamaño natural (Open Biosystem). Se marcaron las sondas por iniciación aleatoria con [ot-32P]dCTP (Amersham). Se llevó a cabo hibridación y lavado usando el método Quickhib, según las instrucciones del fabricante (Stratagene). Se expusieron las manchas a Hyperfilm ECL (Amersham), a -80°C, durante 1 día o varios días dependiendo de la intensidad de la señal.

Resultados Ejemplo 1 : Resultados de micromatrices Se realizó un análisis bioinformático de los datos de micromatrices para identificar genes que satisfacieran los tres criterios siguientes: (i) regulado por alimentación rica en grasa, (ii) expresión regulada similar por alimentación rica en grasa tanto en grasa visceral como subcutánea y (iii) normalización similar de su expresión por tratamiento con Rimonabant (Figura 1 ). Fuera de los -17000 genes objetivo, presentes en la micromatriz de cDNA usada, 34 genes satisfacían estos criterios, que se enumeran en la Tabla 1 . Sorprendentemente, se sabía previamente que 1 0 de estos genes - Caví , Fgf1 , Fndc3b, Kif5b, Mest, Npr3, Pik3ca, Sparc, Vldlr y Wwtrl - eran reguladores importantes del desarrollo y función del tejido adiposo. Algunos de estos genes presentaron niveles de expresión correlacionados con la ganancia de peso corporal (mostrado en gris en la Tabla 1 ) , sugiriendo un papel potencial en la hiperplasia y/o hipertrofia de tejidos adiposos durante la obesidad. Estos resultados validan la propuesta usada para identificar posibles nuevos objetivos para el tratamiento terapéutico de la obesidad.

Principalmente, no se han estudiado nunca muchos de los genes citados en la tabla 1 , en el contexto de, en desarrollo o biología del tejido adiposo. Estos genes pertenecen a las siguientes clases de función: interacción celular/matriz extracelular, citoesqueleto, señalización intracelular, enzimas y factores/co-factores de transcripción. Es probable que estén implicados en reestructuración de tejidos y en particular en el desarrol lo de adipocitos. Uno de estos genes, el gene Plac8 y su papel en la biología de los adipocitos, se presenta aquí y constituye u n aspecto de la presente invención.

Las secuencias de ratón y de ser humano de Plac8, como se usan en la presente invención , corresponden a la SEC I D N° 1 y la SEC I D N° 3, respectivamente.

Tabla 1 : Lista de 34 genes candidatos regulados por H FD y rimonabant en SCAT y VAT. El nombre completo y el símbolo del gene se muestran en la primera columna . El papel biológico para genes conocidos y las referencias se indican en la seg u nda columna . Todos estos genes fueron regulados de manera mejorada por H FD y normalizados por tratamiento con rimonabant, excepto para Plac8 y Rp9h , que estaban su b-regulados por H FD. Los genes relacionados con el aumento del peso corporal se muestran en g ris.

RI.KEN (tipo .gjc_osiJtrans_ferasa): Ejemplo 2: Tejido y expresión celular de los genes seleccionados Para entender mejor el papel de Plac8 en el desarrollo de los adipocitos, se caracterizó primero su patrón de expresión. Se midieron niveles de mRNA mediante northern blot y RT-PCR en diversos tejidos de ratón, en preadipocitos y adipocitos aislados, en tejido adiposo visceral (VAT) y tejido adiposo subcutáneo (SCAT) del modelo de obesidad de ratón (ratones Ob/Ob) y en tejidos adiposos humanos.

Por northern blot, se demostró que Plac8 (señal de 1 kb indicada por una flecha en la figura 2A) se expresa en el mismo nivel alto en SCAT y bazo de ratones C57BL/6J de dieta de comida y a un nivel más bajo en VAT, SCAT, músculo, corazón, pulmón y músculo (Figura 2A). Después se observaron los patrones de expresión de Plac8 por estudios de micromatriz. En tejidos adiposos blancos de ratones Ob/Ob, el nivel de Plac8 disminuye en comparación con el nivel en ratones de cepa natural (Figura 2B). Los valores se expresan como veces de aumento relativo a los valores de control en SCAT, ajustado arbitrariamente a 1.

El tejido adiposo es un tejido complejo que incluye no sólo adipocitos maduros sino también células precursoras tales como preadipocitos así como vasos sanguíneos, macrófagos y células fibroblásticas. Basado en una técnica de digestión de colagenasa I, se separó fracción estromal vascular (SVF) (incluyendo preadipocito, células endoteliales y macrófagos) de la fracción de adipocitos aislados. Se encontró que el Plac8, se expresa fundamentalmente en la fracción estromal vascular, que contiene preadipocitos (Figura 2C) . Estos resultados indican que el Plac8, se expresa más en preadi pocitos y parece así que está implicado en procesos de diferenciación o proliferación .

La siguiente etapa fue determinar si el gene de Plac8 se conserva entre muestras. Para responder a esta pregunta , se realiza un RT-PCR en muestras de tej ido adiposo humano. Se aislaron preadipocitos y adipocitos de SCAT o VAT. Se indujeron preadi pocitos aislados para diferenciar in vitro hasta el día 7. Los resultados demostraron que el Plac8 se expresa por supuesto en grasa hu mana (Figu ra 2D) . I ndican que estos genes están presentes en tejidos adiposos h umanos. Aunque estos resultados sugieren que Plac8 es un gene cand idato importante para el desarrollo de los adipocitos, es posiblemente requerido para la adipogénesis o agrandamiento de tej ido graso en la obesidad .

Ejemplo 3: Expresión de genes seleccionados du rante diferenciación 3T3-L1 A continuación, se evaluó la expresión del gene Plac8 durante la adipogénesis. Para tal fin , se mid ieron los niveles de mRNA mediante RT-PCR durante el transcurso de tiempo de la diferenciación detallada de 3T3-L1 (una l ínea celular adi pogénica) (Figu ra 2E) . El experimento demostró que el Plac8 aumentaba notablemente en una etapa temprana (1 a 3 horas después del trata miento de DM I ) . Este patrón es interesante puesto q ue factores de transcripción adipogénicos conocidos tales como ????ß y ? (Rosen E. D. et al, 202) , Krox20 (Chen , Z. et al. , 2.005) y Ebf (Jiminez, M. A. er a/. , 2.007) mostraron una expresión similar, sugiriendo la implicación de este gene en las etapas tempranas de la adipogénesis.

Ejem plo 4: La eliminación de shRNA de Plac8 en células 3T3-L1 reduce la adipogénesis Para los estudios de pérdida de función se usó shRNA específico para Plac8 subclonado en un vector retroviral de Clontech (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen o pSIREN). Este plásmido contiene un marcador GFP, que permite controlar la eficacia de la infección en células 3T3-L1 . Se clonaron tres diferentes shRNA para Plac8, en el plásmido pSIREN y se ensayaron primero en células 293T HEK. Este experimento demostró la capacidad del shRNA específico para Plac8 para inhibir la expresión de Plac8. De modo interesante, se obtuvieron 75% y 40% de eliminación con shPlac8-2 y shPlac8-3, respectivamente (Figura 3A), usándose ambos así para transducción en células 3T3-L1 .

Después se infectaron células 3T3-L1 durante 6 horas con vectores retrovirales que expresan shRNA dirigidos hacia o Plac8 (shPlac8) o luciferasa (shLuc). Usando el marcador GFP, observamos una infección del 90% en las células 3T3-L1 . El día 0, se obtuvo un 50% de eliminación para Plac8 en células infectadas tanto con shPlac8-2 como con shPlac8-3 (Figura 3B) , mientras no se obtuvo inhibición con control de shLuc. Después, se permitió que las células alcanzaran la confluencia y después de una semana se diferenciaron con DMI . Después de 7 a 1 0 días de la diferenciación , se colorearon las células para determinar la cantidad de contenido en lípidos con coloración oil-red-O. La eliminación de Plac8 reduce la adipogénesis como se demuestra por la disminución de la coloración de lípidos y el marcador de la adipogénesis en células transfectadas con shPlac8, comparado con células de control transfectadas con shLuc (Figuras 3C y 3D).

Ejemplo 5: La sobreexpresión de Plac8 en la línea celular 3T3-L1 incrementa la adipogénesis.

Para el estudio de ganancia de función, se subclonó el cDNA de la secuencia de murino de Plac8, en el plásmido retroviral pMSCV de Clontech. Después de la infección de las células 3T3-I1, se midieron los niveles de RNA de Plac8 por RT-PCR. El día 0, previamente a la diferenciación, se obtuvo una inducción de 3,5 veces de Plac8 en células 3T3-I1 que sobreexpresaban Plac8 (L1 Plac8), comparado con las células de control infectadas con el plásmido vacío (control L1) (Figura 4A). Se permitió que las células alcanzaran confluencia y se diferenciaron con DMI. El día 4 y el día 9, se colorearon las células para el contenido en lípidos con oil-red-O. Como se muestra en la Figura 4B, la sobreexpresión de Plac8 aumenta el potencial adipogénico de 3T3-L1. También se midió un marcador de diferenciación (PPARg2) por RT-PCR y el resultado demostró que este marcador aumentó en un 54% en 3T3-L1 que sobreexpresaba Plac8, comparado con células de control el día 9 (Figura 4C).

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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. I. Inhibidor de la actividad de Plac8 para la modulación de la adipogénesis.
2. 2. Inhibidor según la reivindicación 1, que reduce la adipogénesis.
3. 3. Inhibidor según la reivindicación 1 o 2, para el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados.
4. 4. Inhibidor según la reivindicación 1 o 2, para la reducción de la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.
5. 5. Inhibidor según cualquier reivindicación previa, en donde dicho inhibidor es una molécula pequeña.
6. 6. Inhibidor según cualquier reivindicación previa, en donde dicho inhibidor es pequeño RNA de interferencia.
7. 7. Inhibidor según la reivindicación 7, en donde el siRNA es un shRNA con una secuencia que corresponde a la SEC ID N° 5 o la SEC ID N° 6 o la SEC ID N° 7.
8. 8. Uso de un inhibidor de la actividad de Plac8 para la fabricación de un medicamento para la modulación de la adipogénesis.
9. 9. Ácido nucleico con la secuencia SEC ID N° 6 o SEC ID N° 7.
10. 10. Ácido nucleico que es un siRNA específico para inhibición transcripcional de Plac8.
11. II. Método para la clasificación de inhibidores de la actividad de Plac8, que comprende: a) transfectar una línea celular con una construcción reportadora que comprende un promotor de Plac8 unido a un gene reportador b) cultivar dicha línea celular en condiciones que permitan la expresión del gene reportador c) añadir compuesto candidato al cultivo celular e d) identificar compuestos inhibidores como los compuestos que presentan la capacidad de reducir o inhibir la expresión del gene reportador
12. 12. Composición que comprende un inhibidor de la actividad de Plac8 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. 13. Composición según la reivindicación 12, para tratar la obesidad y enfermedades relacionadas.
14. 14. Composición según la reivindicación 12, para la reducción de la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.
15. 15. Método de modulación de la adipogénesis que consiste en la administración a un paciente con necesidad del mismo, de un inhibidor de Plac8 para modular la adipogénesis.