JP5428527B2 - 化学物質が有する発生毒性の予測方法 - Google Patents
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Description
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供することを目的とする。
[発明1]
化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
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(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
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(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
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(180)配列番号180で示される塩基配列
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(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
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(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
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(197)配列番号197で示される塩基配列
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(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
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(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明2]
検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である発明1に記載の方法。
[発明3]
遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる発明1又は2に記載の方法。
[発明4]
遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である発明1〜3のいずれか一項に記載の方法。
[発明5]
発明1〜4のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
[発明6]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
(2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、
(3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
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(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
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(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
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(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
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(66)配列番号66で示される塩基配列
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(69)配列番号69で示される塩基配列
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(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
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(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
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(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
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(113)配列番号113で示される塩基配列
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(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
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(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
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(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
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(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
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(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明7]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
(2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
(3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
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(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
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(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
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(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
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(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
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(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
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(164)配列番号164で示される塩基配列
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(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
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(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
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(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明8]
発明1に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明9]
遺伝子がHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子である発明1〜8のいずれか一項に記載の方法。
[発明10]
発明1〜5に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
[発明11]
発明9に記載の遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物。
[発明12]
発明11に記載の核酸構築物を含むベクター。
[発明13]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
[発明14]
宿主細胞が動物細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明15]
宿主細胞が幹細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明16]
宿主細胞が胚性幹細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明17]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
[発明18]
発明13〜16に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
[発明19]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
[発明20]
発明19に記載の遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、を有する。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
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本発明において「哺乳動物細胞」としては、例えば、ヒト、ラット、マウス、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット等の哺乳類動物の細胞が挙げられる。
遺伝子の発現レベルは、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定することもできる。
配列番号6〜14に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトのアイソフォーム1およびアイソフォーム2、チンパンジーの4種、イヌ、及びラットのADAM19遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号15〜18に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌ、及びラットのCmya1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号19〜35に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームc、a、b、ヒトのアイソフォームc、b、及びa、チンパンジーの6種、イヌの3種、並びにラットのアイソフォーム1および2のPitx2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号36〜40に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌの2種、及びラットのSmyd1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号41〜44に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びイヌのPim2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号45〜50に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームb及びa、チンパンジー、イヌの3種のTbx20遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号51〜56に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトの2種、チンパンジー、イヌの2種のMyl4遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号57〜60に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びラットのMyl7遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号61〜65に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのHbb-bh1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号66〜70に示される塩基配列は後述するHba-a1遺伝子をコードするものであり、マウス、ヒトのアイソフォームα2及びα1、並びにラットのアイソフォームα1及びα2のHba-a1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号71〜75に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのCol1a2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号76〜78に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、及びチンパンジーのHba-x遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号101〜106に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのbasp1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号107〜110に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ及びマウスのCpe遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号111〜119に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームb、アイソフォームa、及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウスのアイソフォーム1及びアイソフォーム2、並びにラットのDdr1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号120〜125に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのMarcks遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号126〜131に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのNdn遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号132〜139に示される塩基配列は、ヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームa及びアイソフォームb、並びにラットのアイソフォームa及びアイソフォームbのNnat遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号140〜145に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのPtbp2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号146〜151に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのSfrp2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号152〜155に示される塩基配列は、それぞれヒト、ウシ、マウス、及びラットのSox11遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号156〜162に示される塩基配列は、それぞれヒトの2種、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのTtc3遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号163〜167に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのTubb2b遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号168〜173に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、及びラットのUbqln2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号174〜179に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのVim遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号180〜184に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、ウシ、マウス、及びラットのSix3遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号185〜188に示される塩基配列は、それぞれヒト、イヌ、マウス、及びラットのArx遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号189〜199に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa、アイソフォームc、アイソフォームb及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームaの2種、アイソフォームb及びアイソフォームc、並びにラットのDcx遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号200〜206に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォーム1及びアイソフォーム2、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのL1cam遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号207〜212に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットEmx2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号213〜218に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのWnt1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号219〜225に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのReln遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号226〜230に示される塩基配列は、マウス、ヒトのアイソフォームaの2種及びアイソフォームb、並びにラットのPax6遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子のオーソログな遺伝子としては、該塩基配列に生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
具体的に例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、被験化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触したES細胞および接触していないES細胞の心筋分化過程における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。
また例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。
また例えば、特定の化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該特定の化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又オ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該特定の化学物質が発生毒性を有する化学物質であることが分かる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有する化学物質であることが分かる。
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
(2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、(3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、を有する。
第A工程では、具体的には例えば、発生毒性を示す化学物質又は発生毒性を示さない複数の化学物質に接触した該組織分化過程における細胞を継時的に取得して、前記配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する。
第B工程では、化学物質に接触しない該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子の発現量を測定して対照値とし、第A工程の遺伝子発現レベルと各時点で比較して該遺伝子の各化学物質に対する発現変動の差異のパターンを明らかにする。そして、複数の化学物質に対する特徴的な遺伝子発現変動のパターンが該遺伝子の発現変動パターンと同様のパターンを示す別の遺伝子を発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として特定する。第C工程では、第B工程で特定した遺伝子をPCR法などにより取得する。
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
(2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
(3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、を有する。
(ES細胞の心筋への分化誘導)
ATCC(American Type Culture Collection)よりマウスES細胞(ES-D3株)を入手した。ES-D3株は、マウスLIF(白血病阻害因子:leukemia inhibitory factor)を添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地において、未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた。LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、1滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmディッシュに懸滴培養(本培養方法をハンギングドロップ培養又はハンギングドロップ法とも呼ぶ)により37℃、5%CO2インキュベーター内で3日間培養を行い、胚様体(embryoid body)を形成させた。この胚様体を更に2日間、非接着系のシャーレの中で浮遊培養した後、胚様体を接着系のシャーレに移行した。ハンギングドロップ開始から10日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。ES細胞から心筋への分化過程で発現変動する遺伝子を経時的、網羅的把握するため、12000滴以上の懸滴培養を開始し、先述の分化誘導過程において0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。本操作を10日目まで実施した。
(心筋分化過程の網羅的発現変動解析)
分化誘導後0日、2日、4日、6日、8日、10日目、計6時点の保存サンプル合計24サンプル(1日あたり4群)より、RNeasy RNA抽出キット(キアゲン社)を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array(アフィメトリクス社)を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。0日に対して各日(2日、4日、6日、8日、10日)において発現変化を示したHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子又は、Hba-x遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
(心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により37℃、5%CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmシャーレに懸滴培養により3日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性6cmシャーレ(グライナー社)の中で浮遊培養した後、胚様体を24ウェルプレート(BDファルコン社)に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(0.05μg/mL 5-Fluorouracil、4.0μg/mL hydroxyurea、1.0μg/mL 6- aminonicotinamide)、および発生毒性陰性化合物処理群(1000μg/mL saccharin sodium hydrate、7.5μg/mL ascorbic acid、125μg/mL isoniazide)を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。
RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日の候補遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各候補遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図1および2に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
実施例3において特定したマーカー遺伝子について、発生毒性の予測性を実施例3で用いた以外の発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて検証する工程を記載する。
(心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により37℃、5%CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmシャーレに懸滴培養により3日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性6cmシャーレ(グライナー社)の中で浮遊培養した後、胚様体を24ウェルプレート(BDファルコン社)に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(1.5μg/mL 5-bromo-2'-deoxyuridine、 0.6μg/mL methotrexate、0.001μg/mL all-trans -retinoic acid)、および発生毒性陰性化合物処理群(1500μg/mL penicillin G sodium salt、25μg/mL acrylamide、100μg/mL D-(+)-camphor)を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。
RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。
また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図3および4に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制される傾向が認められ、マーカー遺伝子として検証された。
以下に、マーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
(マーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製)
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングした。
ES細胞へトランスフェクションに用いるため、各プラスミドはQiafilterプラスミド抽出キット(キアゲン社)にて再度抽出した。得られたプラスミドDNA20μgをCmya1、Hand1、Pim2、ADAM19、Pitx2プロモーターに関してはSal Iにて、Smyd1についてはNot Iにて制限酵素処理を行った後、精製を行い、線状化DNAを取得した。
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1%ゼラチンコートした35mmシャーレ中に0.3X105個の細胞を播種し、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養した。その後、Opti-MEM培地と4μgの線状化DNA、12μLのリポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)とを混合し、30分間室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加した。
37℃にて5%CO2インキュベーターで1時間培養したのち、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換した。12時間後、各細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1%ゼラチンコートした10cmシャーレに100μg/mLのG418(インビトロジェン社)を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始した。7日〜10日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、96ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続した。3日毎に培地交換を行い、7〜10日後に増殖した細胞を継代培養して48ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得した。
取得した細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量で3日間のハンギング培養を実施し、2日間の浮遊培養、5日間の接着培養を経て心筋へ分化誘導を行った。各細胞株について、2日毎に10日間、50以上の胚葉体を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。RiboGreenキット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定後、1μg相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させcDNAを合成した。各細胞株のそれぞれ0日、2日、4日、6日、8日10日のサンプルについて、Luc2遺伝子を増幅可能なプライマー対(5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3')及びExTaq polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行った。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc2遺伝子が発現誘導される細胞株を選択した。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施した。まず、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法により心筋分化誘導を開始し、3日間浮遊培養を行った。3日後に100μLのLIF未添加、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を追加して2日間浮遊培養を継続した後、5日目に、形成した胚葉体を接着培養用96ウエルプレート(コーニング社)に移し、接着培養を開始した。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した4枚の96ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加した。10分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定した。例えば、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞(以下、Hand1-ES細胞と記す)およびsmyd1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞(以下、smyd1-ES細胞と記す)について、内在性のhand1またはsmyd1遺伝子、およびルシフェラーゼ活性の経時的な測定結果を図5に示す。Hand1-ES細胞およびsmyd1-ES細胞は内在性の遺伝子発現とルシフェラーゼ活性誘導のパターンが一致することが明らかとなった。
以下に、選定した組換えES細胞を利用した心筋分化過程での発生毒性評価法を記載する。
取得した組換えES細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行う。未分化なコロニーは、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去し、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントする。溶媒対象群としてPBS(-)のみを添加した分化培地、陽性対象(心筋への分化が阻害される陽性化合物及び濃度)群として最終濃度4.0μg/mLになるようにhydroxyurea溶液(PBS(-)に溶解)を添加した分化培地、及び被験物質を公比10にて5段階に希釈して調製した分化培地を作製した後、各分化培地に1mL当たり3.75X104個の細胞数になるように細胞懸濁液を調製し、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法による心筋分化誘導を開始し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地100μLを追加して2日間浮遊培養を継続する。5日目に、形成した胚葉体を、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地を予め分注した接着培養系96ウエルプレート(コーニング社)に移し、接着培養を開始する。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した4枚の96ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加する。10分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。これらの方法を用いて、溶媒対照群、陽性対照群、該被験物質のルシフェラーゼ活性の変化量を比較し、該被験物質の心筋分化を阻害する濃度を決定することができる。
(ES細胞の神経への分化誘導)
実施例1〜5に記載した工程により、心臓組織に対する発生毒性を予測するマーカーを特定すること、及びマーカー遺伝子の核酸構築物及び形質転換された細胞を用いることにより被験物質の心臓組織に対する発生毒性を評価することが可能となった。以下に示す、ES細胞から脳・神経への分化誘導方法を応用すれば、脳・神経に対する発生毒性評価方法も心臓組織と同様に実施可能である。以下にES細胞の神経細胞への分化誘導方法を示した。
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の10cmシャーレ中に5X105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から3日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から5日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で10分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して6cmシャーレに移行した。前記6cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート24ウェルプレートの各ウェルに10〜20個の胚様体になるように播種し、更に5日間、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で培養を継続した。分化開始より10日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を観察、更に神経分化の代表マーカー遺伝子MAP2に対する抗体を用いて免疫染色を実施し、MAP2陽性細胞の有無を確認した。
(ES細胞の骨芽細胞への分化誘導)
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁し、遠心操作および上清の吸引操作により、残余トリプシンおよび血清を除去した。その後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に再度懸濁し、少量の細胞溶液を用いて細胞数を計測した。計測後、0.1%ゼラチンコートを施した35mm dishに、1.0x104cells/mlの濃度となるように調製した細胞懸濁液を2ml加え、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養を開始した。培養開始より4日後にPBSによりディッシュを洗浄し、アスコルビン酸を50μg/ml、ベータグリセロリン酸を10mMの濃度で添加した15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地へと培地交換を行った。その後、2乃至3日毎に同様の組成の培地へと培地交換を行った。培養開始より4、10、15、20日目にサンプルを回収し、一部はアリザリン染色によりカルシウムの沈着を検出した。一方でTotal RNAを抽出した後に骨芽細胞系に特異的な遺伝子(Runx2、Osteoprotegerin、Osteopontin、Collagen1a1)について、内部標準にACTBを用いて相対的な発現量を比較し、その結果特異的遺伝子の発現が確認できた。
(神経分化過程の網羅的発現変動解析)
実施例7の方法により分化誘導後0日、2日、4日、6日、8日、10日目、計6時点の保存サンプル合計24サンプル(1日あたり4群)より、RNeasy RNA抽出キット(キアゲン社)を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array(アフィメトリクス社)を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。0日に対して各日(2日、4日、6日、8日、10日)において発現変化を示したBasp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
(神経分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の10cmシャーレ中に5×105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から3日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から5日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で10分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して6cmシャーレに移行した。前記6cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート24ウェルプレートの各ウェルに10〜20個の胚様体になるように播種し、更に5日間、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で培養を継続した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(0.03μg/mL 5-Fluorouracil、4.0μg/mL hydroxyurea、0.2μg/mL methotrexate)、および発生毒性陰性化合物処理群(4,000μg/mL saccharin sodium hydrate、20μg/mL ascorbic acid、150μg/mL isoniazide、600μg/mL penicillin G sodium salt、50μg/mL acrylamide、100μg/mL D-(+)-camphor)を添加した培地で行った。分化誘導開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。分化誘導開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。分化開始より10日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を確認した。
(候補遺伝子の定量的PCRによる発現解析)
実施例10で抽出したRNAは、RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Basp1遺伝子はMm02344032_s1、Cpe遺伝子はMm00516341_m1、DDR1遺伝子はMm01273494_g1、Marcks遺伝子はMm02524303_s1、NDN遺伝子はMm02524479_s1、Nnat遺伝子はMm00731416_s1、Ptbp2遺伝子はMm00497922_m1、Sfrp2遺伝子はMm01213947_m1、Sox11遺伝子はMm01281943_s1、Ttc3遺伝子はMm00493917_m1、Tubb2b遺伝子はMm00849948_g1、Ubqln2遺伝子はMm00834570_s1、Vim遺伝子はMm00449201_m1、Six3遺伝子はMm01237639_m1、Arx遺伝子はMm00545903_m1、Dcx遺伝子はMm00438401_m1、L1cam遺伝子はMm00493049_m1、Emx2遺伝子はMm00550241_m1、Wnt1遺伝はMm00810320_s1、Reln遺伝子はMm00465200_m1、Pax6遺伝子はMm00443081_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図6、図7および8に示すように、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子は、発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
以下に、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたHand1-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。
Hand1-ES細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。未分化なHand1-ES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続した。6日目に各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo(プロメガ社)を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31(以下3T3細胞とする)を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価した。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続した。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット(プロメガ社)中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定した。被験物質はin vivoでの発生毒性が陽性の4化合物(5-fluorouracil、hydroxyurea、dexamethasone、5-bromo-2'-deoxyuridine)、および陰性の2化合物(ascorbic acid、acrylamide)について実施した。Hand1-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出した。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1-ES細胞のルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。今回評価した発生毒性が陽性の4化合物については、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれ、5-fluorouracil(Hand1-ES ID50 : 0.02μg/mL / 3T3 IC50 : 0.16 μg/mL)、hydroxyurea(Hand1-ES ID50 : 2.5μg/mL / 3T3 IC50 : 4.7 μg/mL)、dexamethasone(Hand1-ES ID50 : 15.6 μg/mL / 3T3 IC50 : 36.7 μg/mL )、5-bromo-2'-deoxyuridine(Hand1-ES ID50 : 0.12μg/mL /3T3 IC50 : 0.80μg/mL )となり、ID50 <IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。また、発生毒性が陰性のascorbic acidおよびacrylamideについては、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれascorbic acid(Hand1-ES ID50 : 28.3μg/mL /3T3 IC50 : 2.0μg/mL )、acrylamide(Hand1-ES ID50 : 85.3μg/mL /3T3 IC50 : 54.0μg/mL )となり、Hand1-ES ID50 >3T3 IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が弱いと考えられ発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により従来のEST法よりも短期間にまた簡便に被験物質の発生毒性を予測することが可能となった。
Hand1の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、Hand1遺伝子評価用のTaqManプローブ(Mm00433931_m1)1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1を使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのhand1遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのhand1遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたHand1遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1の発現量が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
マーカー遺伝子Hand1の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。-未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。Hand1遺伝子産物(タンパク質)を認識する抗hand1抗体(abcam社)や抗eHAND (H-100)抗体(Santa cruz社)を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra(Beckman Coulter)等のフローサイトメトリーによりhand1遺伝子産物を発現する陽性細胞(以下、hand1陽性細胞)を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたHand1陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1陽性細胞数が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
以下に、神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
(神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製)
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングする。
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1%ゼラチンコートした35mmシャーレ中に0.3×105個の細胞を播種し、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養する。その後、Opti-MEM培地と4μgの線状化DNA、12μLのリポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)とを混合し、30分室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加する。
37℃にて5%CO2インキュベーターで1時間培養したのち、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換する。12時間後、各細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1%ゼラチンコートした10cmシャーレに100μg/mLのG418(インビトロジェン社)を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始する。7〜10日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、96ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続する。3日毎に培地交換を行い、7〜10日後に増殖した細胞を継代培養して48ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得する。
取得した細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製した後、50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。各細胞株について、2日毎に10日間、24ウェル分以上の細胞を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RiboGreenキット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定後、1μg相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させcDNAを合成する。各細胞株のそれぞれ0日、2日、4日、6日、8日および10日のサンプルについて、Luc2遺伝子を増幅可能なプライマー対(5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3')及びExTaq polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行う。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc2遺伝子が発現誘導される細胞株を選択する。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施する。まず先述の神経分化誘導法に従って培養した後、分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、96ウェルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加する。30分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞のルシフェラーゼ活性と内在性のマーカー遺伝子の発現パターンが一致するES細胞を選択し、それぞれの細胞株をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞と命名する。
以下に、神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞、Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。それぞれの細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導開始から8〜10日後、各ウェルにルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo(プロメガ社)を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計する。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31(以下3T3細胞とする)を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行なう。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。分化誘導開始8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット(プロメガ社)中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞、Pax6-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ESのルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
神経分化過程でのマーカー遺伝子の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存する。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施する。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブは実施例11記載のプローブを使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのマーカー遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのマーカー遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたマーカー遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子の発現量が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
神経分化過程におけるマーカー遺伝子の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法により被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導から8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。各マーカー遺伝子の遺伝子産物(タンパク質)を認識する抗体を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。抗体としては例えば、抗necdin抗体(abcam社)、抗Cpe抗体(Santa cruz社)、抗L1CAM抗体(abcam社)、抗Pax6抗体(abcam社)等を1次抗体として使用する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra(Beckman Coulter)等のフローサイトメトリーにより各マーカー遺伝子産物を発現する陽性細胞(以下、マーカー遺伝子産物陽性細胞)を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたマーカー遺伝子産物陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子産物陽性細胞数が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
とができる。
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号80
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号81
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号82
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号83
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号84
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号85
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号86
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号87
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号88
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号89
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号90
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号91
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号92
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号93
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号94
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号95
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号96
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号97
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号98
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号99
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号100
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号231
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号232
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号233
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号234
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号235
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号236
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号237
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号238
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Claims (14)
- 化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列 - 検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である請求項1に記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる請求項
1又は2に記載の方法。 - 遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
- 化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
(2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、
(3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列 - 化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
(2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
(3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列 - 請求項1に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列 - 遺伝子がHand1遺伝子である請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
- Hand1遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物、又は前記核酸構築物を含むベクターが胚性幹細胞に導入されてなる形質転換体。
- Hand1遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物又は前記核酸構築物を含むベクターを胚性幹細胞に導入することを特徴とする化学物質の発生毒性予測法用形質転換体の製造方法。
- 請求項11に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
- Hand1遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物、又は前記核酸構築物を含むベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
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