JP2010011843A - 化学物質が有する発生毒性の予測方法 - Google Patents

化学物質が有する発生毒性の予測方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2010011843A
JP2010011843A JP2009125077A JP2009125077A JP2010011843A JP 2010011843 A JP2010011843 A JP 2010011843A JP 2009125077 A JP2009125077 A JP 2009125077A JP 2009125077 A JP2009125077 A JP 2009125077A JP 2010011843 A JP2010011843 A JP 2010011843A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
base sequence
sequence shown
represented
sequence represented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2009125077A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5428527B2 (ja
Inventor
Noriyuki Suzuki
紀之 鈴木
Koichi Saito
幸一 斉藤
Manabu Ando
覚 安藤
Nobuyuki Horie
宣行 堀江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to JP2009125077A priority Critical patent/JP5428527B2/ja
Publication of JP2010011843A publication Critical patent/JP2010011843A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5428527B2 publication Critical patent/JP5428527B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0603Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00Animals characterised by species
    • A01K2227/10Mammal
    • A01K2227/105Murine
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供する。
【解決手段】化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における特定の塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
【選択図】図1

Description

本発明は、化学物質が有する発生毒性の予測方法等に関する。
医薬、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、非ヒト動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、生殖性や胎児・新生児の発生等に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、医薬、農薬及び他の化学物質においては、その製造・販売に際し、これらの生殖毒性や発生毒性に関する試験を実施することが求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を非ヒト哺乳動物の妊娠期に投与し、該哺乳動物の胎児に及ぼす形態的な変化の有無及びその程度等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、化学物質をラット、マウス、ウサギ、サル等の非ヒト動物個体の妊娠雌動物に一定期間投与し、該動物個体の胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、該化学物質が有する発生毒性評価が行われている。
しかしながら、非ヒト動物個体を使用した発生毒性試験は、動物個体を飼育する等の多大な時間と経費を要する。そこで、より簡便な発生毒性試験法として様々な手法(哺乳動物の細胞や組織等を用いた試験系としては、マウス胚性幹細胞(以下、ES細胞と記すこともある。)を用いた試験法(EST : Embryonic Stem cell Test)(H. Spielmann, I. Pohl, B. Doring, M. Liebsch, F. Moldenhauer, In vitro toxicology, 10(1), p119-127, 1997、E. Genschow, H. Spielmann, G. Scholz, I. Pohl, A. Seiler, N. Clemann, S. Bremer, K. Becker, ATLA 32, p209-244, 2004)、ラット胎児の肢芽を用いる小塊培養法(Micro mass culture)及びラットの初期胚を用いた全胚培養法(Whole embryo culture)(E. Genschow, H. Spielmann, G. Scholz, A. Seiler, N. Brown, A. Piersma, M. Brady, N. Clemann, H. Huuskonen, F. Paillard, S. Bremer, K. Becker, ATLA 30, p151-176, 2002)等が試みられているが、いずれの方法も精度上の信頼性が確立されていない。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供することを目的とする。
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明1]
化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明2]
検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である発明1に記載の方法。
[発明3]
遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる発明1又は2に記載の方法。
[発明4]
遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である発明1〜3のいずれか一項に記載の方法。
[発明5]
発明1〜4のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
[発明6]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
(2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、
(3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明7]
化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
(2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
(3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、
を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明8]
発明1に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
[発明9]
遺伝子がHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子である発明1〜8のいずれか一項に記載の方法。
[発明10]
発明1〜5に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
[発明11]
発明9に記載の遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物。
[発明12]
発明11に記載の核酸構築物を含むベクター。
[発明13]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
[発明14]
宿主細胞が動物細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明15]
宿主細胞が幹細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明16]
宿主細胞が胚性幹細胞である発明13に記載の形質転換体。
[発明17]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
[発明18]
発明13〜16に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
[発明19]
発明11に記載の核酸構築物又は発明12に記載のベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
[発明20]
発明19に記載の遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
本発明により、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供することができる。
溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-Fluorouracil、hydroxyurea、6- aminonicotinamide)、発生毒性陰性化合物処理群(saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である(実施例3)。 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-Fluorouracil、hydroxyurea、6- aminonicotinamide)、発生毒性陰性化合物処理群(saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である(実施例3)。 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-bromo-2'-deoxyuridine、 methotrexate、all-trans -retinoic acid)、発生毒性陰性化合物処理群(penicillin G、 sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である(実施例4)。 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-bromo-2'-deoxyuridine、 methotrexate、all-trans -retinoic acid)、発生毒性陰性化合物処理群(penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量定量し、相対発現量を示した図である(実施例4)。 a)リアルタイムPCRを用いた分化誘導後の内在性Hand1遺伝子の経時的な発現変動、およびb)Hand1-ES細胞の分化誘導後の経時的なルシフェラーゼ活性の変動を示した図である。c)リアルタイムPCRを用いた分化誘導後の内在性Smyd1遺伝子の経時的な発現変動、およびd)Smyd1-ES細胞の分化誘導後の経時的なルシフェラーゼ活性の変動を示した図である。(実施例5) 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate)、発生毒性陰性化合物処理群(Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である(実施例11)。 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate)、発生毒性陰性化合物処理群(Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である(実施例11)。 溶媒対照群、発生毒性陽性化合物処理群(5-Fluorouracil、hydroxyurea、methotrexate)、発生毒性陰性化合物処理群(Saccharin sodium hydrate、ascorbic acid、isoniazid、penicillin G sodium salt、acrylamide、D-(+)-camphor)について、リアルタイムPCR法を用いて発生毒性予測用のマーカー遺伝子の発現量を定量し、相対発現量を示した図である(実施例11)。 発生毒性陽性の4化合物(5-fluorouracil、hydroxyurea、dexamethasone、5-bromo-2'-deoxyuridine)について、Hand1-ES細胞および3T3細胞による試験結果を溶媒対照に対する相対値として示した図である(実施例12) 発生毒性陽性の2化合物(ascorbic acid、acrylamide)について、Hand1-ES細胞および3T3細胞による試験結果を溶媒対照に対する相対値として示した図である(実施例12)
以下、本発明を説明する。本発明の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本発明において使用される用語は、特に言及しない限り、該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
本発明の化学物質が有する発生毒性の予測方法は、
(1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
(2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、を有する。
(1) 配列番号1で示される塩基配列
(2) 配列番号2で示される塩基配列
(3) 配列番号3で示される塩基配列
(4) 配列番号4で示される塩基配列
(5) 配列番号5で示される塩基配列
(6) 配列番号6で示される塩基配列
(7) 配列番号7で示される塩基配列
(8) 配列番号8で示される塩基配列
(9) 配列番号9で示される塩基配列
(10)配列番号10で示される塩基配列
(11)配列番号11で示される塩基配列
(12)配列番号12で示される塩基配列
(13)配列番号13で示される塩基配列
(14)配列番号14で示される塩基配列
(15)配列番号15で示される塩基配列
(16)配列番号16で示される塩基配列
(17)配列番号17で示される塩基配列
(18)配列番号18で示される塩基配列
(19)配列番号19で示される塩基配列
(20)配列番号20で示される塩基配列
(21)配列番号21で示される塩基配列
(22)配列番号22で示される塩基配列
(23)配列番号23で示される塩基配列
(24)配列番号24で示される塩基配列
(25)配列番号25で示される塩基配列
(26)配列番号26で示される塩基配列
(27)配列番号27で示される塩基配列
(28)配列番号28で示される塩基配列
(29)配列番号29で示される塩基配列
(30)配列番号30で示される塩基配列
(31)配列番号31で示される塩基配列
(32)配列番号32で示される塩基配列
(33)配列番号33で示される塩基配列
(34)配列番号34で示される塩基配列
(35)配列番号35で示される塩基配列
(36)配列番号36で示される塩基配列
(37)配列番号37で示される塩基配列
(38)配列番号38で示される塩基配列
(39)配列番号39で示される塩基配列
(40)配列番号40で示される塩基配列
(41)配列番号41で示される塩基配列
(42)配列番号42で示される塩基配列
(43)配列番号43で示される塩基配列
(44)配列番号44で示される塩基配列
(45)配列番号45で示される塩基配列
(46)配列番号46で示される塩基配列
(47)配列番号47で示される塩基配列
(48)配列番号48で示される塩基配列
(49)配列番号49で示される塩基配列
(50)配列番号50で示される塩基配列
(51)配列番号51で示される塩基配列
(52)配列番号52で示される塩基配列
(53)配列番号53で示される塩基配列
(54)配列番号54で示される塩基配列
(55)配列番号55で示される塩基配列
(56)配列番号56で示される塩基配列
(57)配列番号57で示される塩基配列
(58)配列番号58で示される塩基配列
(59)配列番号59で示される塩基配列
(60)配列番号60で示される塩基配列
(61)配列番号61で示される塩基配列
(62)配列番号62で示される塩基配列
(63)配列番号63で示される塩基配列
(64)配列番号64で示される塩基配列
(65)配列番号65で示される塩基配列
(66)配列番号66で示される塩基配列
(67)配列番号67で示される塩基配列
(68)配列番号68で示される塩基配列
(69)配列番号69で示される塩基配列
(70)配列番号70で示される塩基配列
(71)配列番号71で示される塩基配列
(72)配列番号72で示される塩基配列
(73)配列番号73で示される塩基配列
(74)配列番号74で示される塩基配列
(75)配列番号75で示される塩基配列
(76)配列番号76で示される塩基配列
(77)配列番号77で示される塩基配列
(78)配列番号78で示される塩基配列
(101)配列番号101で示される塩基配列
(102)配列番号102で示される塩基配列
(103)配列番号103で示される塩基配列
(104)配列番号104で示される塩基配列
(105)配列番号105で示される塩基配列
(106)配列番号106で示される塩基配列
(107)配列番号107で示される塩基配列
(108)配列番号108で示される塩基配列
(109)配列番号109で示される塩基配列
(110)配列番号110で示される塩基配列
(111)配列番号111で示される塩基配列
(112)配列番号112で示される塩基配列
(113)配列番号113で示される塩基配列
(114)配列番号114で示される塩基配列
(115)配列番号115で示される塩基配列
(116)配列番号116で示される塩基配列
(117)配列番号117で示される塩基配列
(118)配列番号118で示される塩基配列
(119)配列番号119で示される塩基配列
(120)配列番号120で示される塩基配列
(121)配列番号121で示される塩基配列
(122)配列番号122で示される塩基配列
(123)配列番号123で示される塩基配列
(124)配列番号124で示される塩基配列
(125)配列番号125で示される塩基配列
(126)配列番号126で示される塩基配列
(127)配列番号127で示される塩基配列
(128)配列番号128で示される塩基配列
(129)配列番号129で示される塩基配列
(130)配列番号130で示される塩基配列
(131)配列番号131で示される塩基配列
(132)配列番号132で示される塩基配列
(133)配列番号133で示される塩基配列
(134)配列番号134で示される塩基配列
(135)配列番号135で示される塩基配列
(136)配列番号136で示される塩基配列
(137)配列番号137で示される塩基配列
(138)配列番号138で示される塩基配列
(139)配列番号139で示される塩基配列
(140)配列番号140で示される塩基配列
(141)配列番号141で示される塩基配列
(142)配列番号142で示される塩基配列
(143)配列番号143で示される塩基配列
(144)配列番号144で示される塩基配列
(145)配列番号145で示される塩基配列
(146)配列番号146で示される塩基配列
(147)配列番号147で示される塩基配列
(148)配列番号148で示される塩基配列
(149)配列番号149で示される塩基配列
(150)配列番号150で示される塩基配列
(151)配列番号151で示される塩基配列
(152)配列番号152で示される塩基配列
(153)配列番号153で示される塩基配列
(154)配列番号154で示される塩基配列
(155)配列番号155で示される塩基配列
(156)配列番号156で示される塩基配列
(157)配列番号157で示される塩基配列
(158)配列番号158で示される塩基配列
(159)配列番号159で示される塩基配列
(160)配列番号160で示される塩基配列
(161)配列番号161で示される塩基配列
(162)配列番号162で示される塩基配列
(163)配列番号163で示される塩基配列
(164)配列番号164で示される塩基配列
(165)配列番号165で示される塩基配列
(166)配列番号166で示される塩基配列
(167)配列番号167で示される塩基配列
(168)配列番号168で示される塩基配列
(169)配列番号169で示される塩基配列
(170)配列番号170で示される塩基配列
(171)配列番号171で示される塩基配列
(172)配列番号172で示される塩基配列
(173)配列番号173で示される塩基配列
(174)配列番号174で示される塩基配列
(175)配列番号175で示される塩基配列
(176)配列番号176で示される塩基配列
(177)配列番号177で示される塩基配列
(178)配列番号178で示される塩基配列
(179)配列番号179で示される塩基配列
(180)配列番号180で示される塩基配列
(181)配列番号181で示される塩基配列
(182)配列番号182で示される塩基配列
(183)配列番号183で示される塩基配列
(184)配列番号184で示される塩基配列
(185)配列番号185で示される塩基配列
(186)配列番号186で示される塩基配列
(187)配列番号187で示される塩基配列
(188)配列番号188で示される塩基配列
(189)配列番号189で示される塩基配列
(190)配列番号190で示される塩基配列
(191)配列番号191で示される塩基配列
(192)配列番号192で示される塩基配列
(193)配列番号193で示される塩基配列
(194)配列番号194で示される塩基配列
(195)配列番号195で示される塩基配列
(196)配列番号196で示される塩基配列
(197)配列番号197で示される塩基配列
(198)配列番号198で示される塩基配列
(199)配列番号199で示される塩基配列
(200)配列番号200で示される塩基配列
(201)配列番号201で示される塩基配列
(202)配列番号202で示される塩基配列
(203)配列番号203で示される塩基配列
(204)配列番号204で示される塩基配列
(205)配列番号205で示される塩基配列
(206)配列番号206で示される塩基配列
(207)配列番号207で示される塩基配列
(208)配列番号208で示される塩基配列
(209)配列番号209で示される塩基配列
(210)配列番号210で示される塩基配列
(211)配列番号211で示される塩基配列
(212)配列番号212で示される塩基配列
(213)配列番号213で示される塩基配列
(214)配列番号214で示される塩基配列
(215)配列番号215で示される塩基配列
(216)配列番号216で示される塩基配列
(217)配列番号217で示される塩基配列
(218)配列番号218で示される塩基配列
(219)配列番号219で示される塩基配列
(220)配列番号220で示される塩基配列
(221)配列番号221で示される塩基配列
(222)配列番号222で示される塩基配列
(223)配列番号223で示される塩基配列
(224)配列番号224で示される塩基配列
(225)配列番号225で示される塩基配列
(226)配列番号226で示される塩基配列
(227)配列番号227で示される塩基配列
(228)配列番号228で示される塩基配列
(229)配列番号229で示される塩基配列
(230)配列番号230で示される塩基配列
本発明において「化学物質」とは、動物試験データ及びヒトでの疫学的データにより、発生毒性の有無が報告された化学物質や発生毒性が未知の化学物質を指す。発生毒性が知られている化学物質としては具体的に、5-Fluorouracil、hydroxyurea、6-aminonicotinamide、5-bromo-2'-deoxyuridine、methotrexate、all-trans -retinoic acid、phenytonin、varpoic acid、phenobarbital Na、thalidomide、ribavirin、cyclophosphamide、leflunomide、warfarin、sulfadimetcin、6-mercaptopurine、aspirin、acetazolamide、cyclizine HCl、estrogene、testosterone、lead acetate、arsenic、retinol、toluene、aminopterine、azathiopurine、captafol、methadone、acutane等が知られており、米国NTP(National Toxicology Program)の公表するNTP abstractに記載されている。本発明においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本発明において「発生毒性」とは、受精、受胎に係る胎児の発達(発生)に対する悪影響及び異常を引き起こす有害作用の総称であり、胎児に奇形を引き起こす催奇形性又は催奇性も含む。発生毒性により引き起こされる悪影響や異常として具体的には、発育遅滞や機能・知能の障害等の肉眼形態的又は機能的な異常を示す先天異常、胎生期の胎児の死亡が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において「非ヒト哺乳動物」としては、毒性試験、薬理試験等に使用される哺乳動物種が挙げられる。例えば、ラット、マウス、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット等の哺乳類が知られているがそれらに限定されない。
本発明において「哺乳動物細胞」としては、例えば、ヒト、ラット、マウス、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット等の哺乳類動物の細胞が挙げられる。
本発明において「検体」としては、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体等が挙げられる。
本発明において「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞又は組織幹細胞(組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう)、又は人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell細胞)であり得るがそれらに限定されない。
本発明において「胚性幹細胞(ES細胞)」とは、自己複製能を有し、多分化能(すなわち多能性「pluripotency」)を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核/細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。人工多能性幹細胞は繊維芽細胞等分化した細胞をOct3/4、sox2、klf4、myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された(Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676)。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、 Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318 (5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106)。本発明において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞又は人工多能性幹細胞も使用され得る。
本発明において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子(例えば、「プロモーター」)という。本発明では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」を指すことがある。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。
本発明において「遺伝子の発現」は、遺伝子に応じて発現されたポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び核酸ならびに/又はタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドの発現を包含する。本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。
本発明において「遺伝子の発現レベルを測定」する方法としては、目的の細胞等において例えば、遺伝子の転写産物量や翻訳産物量を測定する方法等が挙げられる。遺伝子の転写産物量を測定する方法としては、例えばmRNAの発現量を測定する方法をあげることができ、具体的にはノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法、リアルタイムPCR法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法が挙げられる。遺伝子の翻訳産物量を測定する方法としては該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現量を測定する方法をあげることができ、具体的にはELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法が挙げられる。また、遺伝子の発現変動とは、通常の分子生物学的測定方法又は免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるmRNAレベル又はポリペプチドレベルでの発現量が増加或いは減少することを意味する。
遺伝子の発現レベルは、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定することもできる。
分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法又はPCR法等が例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、ELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等が例示される。またさらに免疫染色の検出法として文献(A. Seiler, A. Visan, R. Buesen, E. Genschow, H. Spielmann, Reproductive Toxicology 18, p231-240 (2004)) に例示されるフトーサイトメトリーまたはFACS(fluorescence activated cell sorting)を用いた解析方法によっても行われ得る。また、アレイ(例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ)を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、(秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」)に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet. 2002 Dec;32 Suppl:526−32に詳述されている。上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two-hybridシステム、インビトロ翻訳等が挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 ・ 中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社(2002)等に記載されており、本発明においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本発明の予測方法の第一工程において、前記化学物質に接触した前記非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子(以下、一括して本遺伝子ということがある。)から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを前記の手法により測定する。
配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列は、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子の塩基配列であり、マウス、ヒト、サル、ラット、イヌ等の様々な動物種の該遺伝子の配列である。配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列はNCBI(National Center for Biotechnology Information)に登録されている塩基配列であり、これらは、NCBIのWEBペ−ジ(URL;http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から、遺伝子名や部分配列をもとにデータベースを検索することによって入手することができる。
配列番号1〜5に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのhand1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号6〜14に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトのアイソフォーム1およびアイソフォーム2、チンパンジーの4種、イヌ、及びラットのADAM19遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号15〜18に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌ、及びラットのCmya1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号19〜35に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームc、a、b、ヒトのアイソフォームc、b、及びa、チンパンジーの6種、イヌの3種、並びにラットのアイソフォーム1および2のPitx2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号36〜40に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、イヌの2種、及びラットのSmyd1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号41〜44に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びイヌのPim2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号45〜50に示される塩基配列は、それぞれマウスのアイソフォームb及びa、チンパンジー、イヌの3種のTbx20遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号51〜56に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒトの2種、チンパンジー、イヌの2種のMyl4遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号57〜60に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、及びラットのMyl7遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号61〜65に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのHbb-bh1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号66〜70に示される塩基配列は後述するHba-a1遺伝子をコードするものであり、マウス、ヒトのアイソフォームα2及びα1、並びにラットのアイソフォームα1及びα2のHba-a1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号71〜75に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのCol1a2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号76〜78に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、及びチンパンジーのHba-x遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号101〜106に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのbasp1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号107〜110に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ及びマウスのCpe遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号111〜119に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームb、アイソフォームa、及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウスのアイソフォーム1及びアイソフォーム2、並びにラットのDdr1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号120〜125に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのMarcks遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号126〜131に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのNdn遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号132〜139に示される塩基配列は、ヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームa及びアイソフォームb、並びにラットのアイソフォームa及びアイソフォームbのNnat遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号140〜145に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのPtbp2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号146〜151に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのSfrp2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号152〜155に示される塩基配列は、それぞれヒト、ウシ、マウス、及びラットのSox11遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号156〜162に示される塩基配列は、それぞれヒトの2種、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのTtc3遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号163〜167に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、及びラットのTubb2b遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号168〜173に示される塩基配列は、それぞれマウス、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、及びラットのUbqln2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号174〜179に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのVim遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号180〜184に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、ウシ、マウス、及びラットのSix3遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号185〜188に示される塩基配列は、それぞれヒト、イヌ、マウス、及びラットのArx遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号189〜199に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa、アイソフォームc、アイソフォームb及びアイソフォームc、チンパンジー、イヌ、マウスのアイソフォームaの2種、アイソフォームb及びアイソフォームc、並びにラットのDcx遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号200〜206に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォーム1及びアイソフォーム2、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのL1cam遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号207〜212に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットEmx2遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号213〜218に示される塩基配列は、それぞれヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、及びラットのWnt1遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号219〜225に示される塩基配列は、それぞれヒトのアイソフォームa及びアイソフォームb、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、並びにラットのReln遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号226〜230に示される塩基配列は、マウス、ヒトのアイソフォームaの2種及びアイソフォームb、並びにラットのPax6遺伝子の完全長mRNAをコードする塩基配列である。
配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子のオーソログな遺伝子としては、該塩基配列に生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
本発明の予測方法の第二工程において、第一工程で得られた検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を本遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する。
「遺伝子の発現レベルの対照値」としては、例えば被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を挙げることができる。かかる対照値は、被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、本遺伝子の発現レベルの測定値が対照値と有意に異なれば、該化学物質は発生毒性を有すると評価することができる。
具体的に例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、被験化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触したES細胞および接触していないES細胞の心筋分化過程における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。
また例えば、被験化学物質が発生毒性を有する場合、該化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該化学物質に発生毒性があると評価することができる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。
本発明の方法により評価された前記化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜することが可能となり、換言すると発生毒性を有する化学物質を探索することが可能となる。具体的に例えば、特定の化学物質に接触していないES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該特定の化学物質に接触したES細胞由来の心筋分化細胞における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該特定の化学物質が発生毒性を有する化学物質であることが分かる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の心筋分化過程における配列番号1〜78に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有する化学物質であることが分かる。
また例えば、特定の化学物質に接触していないES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値を対照値として、細胞増殖への阻害を示さない濃度以下において、該特定の化学物質に接触したES細胞由来の神経分化細胞における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又オ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、該特定の化学物質が発生毒性を有する化学物質であることが分かる。また、化学物質が母動物に与える影響の指標として例えばbalb/c 3T3のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響の指標として該化学物質に接触および接触していないES細胞の神経分化過程における配列番号101〜230に示される塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有する化学物質であることが分かる。
また、前記配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として使用することが可能である。
本発明において「心臓組織細胞」とは心臓を形成する組織細胞を指し、心筋細胞、弁、血管、心室及び心房を含む組織又は細胞である。機能的に、律動的な収縮によって血液の循環を行うポンプの役目を担う組織細胞を指す。心臓の構造は、収縮することで心臓外に血液を拍出する心室、心室の上流にあって心室に入る前の血液を貯留し心室へ血液を送り込む心房、血管及び血液の逆流を防ぐ弁から構成される。心筋は、不随意に律動的な収縮を行う心筋細胞から構成され、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化心筋を特定する方法としては、心筋ミオシン軽鎖Myh6遺伝子、心房性ナトリウム利尿ペプチドANP遺伝子等の発現で確認できるが、それらに限定されない。
本発明において「脳・神経組織」とは情報の統合のため体正中部に集合して存在する中枢神経系と、中枢外に存在し、個別に線維として認識される末梢神経系を含む神経系組織細胞を指す。神経系組織細胞は神経細胞 (別名:ニューロン)、神経膠細胞(別名:グリア細胞)から構成される。神経細胞の基本的な機能は、神経細胞へ入力刺激が入ってきた場合に、活動電位を発生させ、他の細胞に情報を伝達することである。一つの神経細胞に複数の細胞から入力したり、活動電位がおきる閾値を変化させることにより、情報の修飾が行われる。また、神経膠細胞(アストロサイト及びオリゴデンドロサイト)は、神経系の維持に関与する細胞群である。神経細胞、グリア細胞は、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化神経を特定する方法としては、MAP2遺伝子、GFAP遺伝子等の神経系細胞特異的に発現する遺伝子の発現で確認できるが、それらに限定されない。
本発明において「筋・骨格組織」とは、横紋筋、平滑筋、腱等の骨格を構成/形成する筋と、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞等の骨を構成/形成する細胞を含む。筋・骨格組織は、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化した筋・骨格組織の細胞を特定する方法としては、骨芽細胞ではRunx2遺伝子やosteoproteogerin遺伝子、筋肉ではMyoD遺伝子等の遺伝子発現で確認できるが、それらに限定されない。
本発明において、「分化」とは、1個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的及び/又は機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団(細胞系譜)が、特定のタンパク質の産生等はっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を、ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内或いは細胞外の因子又は条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では,別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
本発明において「特定の組織細胞」とは、機能及び形態が特殊化した細胞をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、又はほとんどない。特定の組織細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。
「Hand1」遺伝子とは「heart and neural crest derivatives expressed transcript 1」遺伝子であり、Hand1以外にもHxt、Th1、eHAND、Ehand1、Thing1として記載される場合もある。National center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースにおいて、例えばマウスHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008213.2として、また該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_032239.1として掲載されている。ヒトHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_004821.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_004812.1として掲載されている。チンパンジーHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_518050.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_518050.2として掲載されている。イヌHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_546282.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_546282.2として掲載されている。ラットHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号 NM_021592.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_067603.1として掲載されている。上記Hand1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号1〜5に示されている。
「ADAM19」遺伝子とは、「a disintegrin and metallopeptidase domain 19」遺伝子又は「meltrin beta」遺伝子であり、M[b]、Mltnb、AL024287として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009616.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033746.1として掲載されている。ヒトADAM19遺伝子のアイソフォーム1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_023038.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_075525.2として掲載されており、アイソフォーム2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_033274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_150377.1として掲載されている。チンパンジーADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001137770.1、XM_001137856.1、XM_001137686.1、及びXM_001137600.1として、前記塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_001137770.1、XP_001137856.1、XP_001137686.1、及びXP_001137600.1として掲載されている。イヌADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_546274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_546274.2として掲載されている。ラットADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001069002.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001069002.1として掲載されている。上記ADAM19遺伝子の塩基配列は本願の配列番号6〜14に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_414565.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号XP_414565.2として掲載されている。ゼブラフィシュADAM19遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_688620.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_693712.2として掲載されている。
「Cmya1」遺伝子とは、「xin actin-binding repeat containing 1」遺伝子であり、Xirp1、Xin、mXin、AI415219、MGC144145、MGC144146として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001081339.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001074808.1として掲載されている。ヒトcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_194293.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_919269.2として掲載されている。イヌcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_846492.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_851585.1として掲載されている。ラットcmya1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_236702.4又はXM_001077697.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_236702.4又はXP_001077697.1として掲載されている。上記cmya1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号15〜18に示されている。
「Pitx2」遺伝子とは、「paired-like homeodomain transcription factor 2」遺伝子であり、Brx1、Ptx2、Rieg、Brx1a、Brx1b、Otlx2、Munc30、Pitx2a、Pitx2b、Pitx2c、solurshin、9430085M16Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスpitx2遺伝子のアイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001042502.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001035967.1として記載されており、アイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001042504.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001035969.1として記載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_011098.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_035228.2として記載されている。ヒトpitx2遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_153427.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_700476.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_153426.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_700475.1として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000325.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000316.2として掲載されている。チンパンジーpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001141151.1、XM_517398.2、XM_001141078.1、XM_001141403.1、XM_001141320.1、及びXM_001141234.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_001141151.1、XP_517398.2、XP_001141078.1、XP_001141403.1、XP_001141320.1、及びXP_001141234.1として掲載されている。イヌpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_858568.1、XM_545025.2、及びXM_846277.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_863661.1、XP_545025.2、及びXP_851370.1として掲載されている。ラットpitx2遺伝子のアイソフォーム1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001042505.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番NP_001035970.1として掲載されており、アイソフォーム2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_019334.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_062207.1として掲載されている。上記pitx2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号19〜35に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_205010.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_990341.1として掲載されている。ゼブラフィッシュpitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_130975.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571050.1として掲載されている。ショウジョウバエpitx2遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_170531.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_733410.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_176593.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_788770.1として掲載されおり、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_206591.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_996314.1として掲載されている。線虫pitx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001042502.1又はNM_001026106.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001021276.1又はNP_001021277.1として掲載されている。
「Smyd1」遺伝子とは、正式名称は「SET and MYND domain containing 1」遺伝子であり、Bop、C78565、Zmynd18、4632404M21Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_009762.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_033892.1として掲載されている。ヒトsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_198274.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_938015.1として掲載されている。イヌsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532967.2及びXM_847011.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_532967.1及びXP_852104.1として掲載されている。ラットsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001106595.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001100065.1として掲載されている。上記smyd1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号36〜40に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ラットsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_216172.4及びXM_001062526.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号XP_216172.4及びXP_001062526.1として掲載されている。ニワトリsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_204155.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_989486.1として掲載されている。ゼブラフィッシュsmyd1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001039636.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001034725.1として掲載されている。
「Pim2」遺伝子とは「proviral integration site 2」遺伝子であり、Pim-2、DXCch3として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_138606.2として掲載されており、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_613072.1として掲載されている。ヒトpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_006875.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_006866.2として掲載されている。チンパンジーpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_528972.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_528972.2として掲載されている。イヌpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_548990.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_548990.2として掲載されている。上記pim2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号41〜44に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ゼブラフィッシュpim2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号 NM_131539.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_571614.1として掲載されている。
「Tbx20」遺伝子とは、「T-box 20」遺伝子であり、Tbx12、AL022859、9430010M06Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスtbx20遺伝子アイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_194263.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_919239.1として掲載されており、マウスのtbx20遺伝子アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_020496.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_065242.1として掲載されている。チンパンジーtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_522453.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_522453.2として掲載されている。イヌtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_539513.2、XM_860427.1及びXM_860408.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_539513.2、XP_865520.1及びXP_865501.1として掲載されている。上記tbx20遺伝子の塩基配列は本願の配列番号45〜50に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_204144.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_989475.1として掲載されている。ゼブラフィッシュtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_131506.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571581.1として掲載されている。また、ショウジョウバエtbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_135083.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_608927.2として掲載されている。線虫tbx20遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_061349.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_493750.1として掲載されている。
「Myl4」遺伝子とは「myosin, light polypeptide 4」遺伝子であり、ELC、GT1、ALC1、AMLC、Myla、ELC1a、MLC1aとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスMyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_010858.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_034988.2として掲載されている。ヒトmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001002841.1及びNM_002476.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001002841.1及びNP_002467.1として掲載されている。チンパンジーmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_511623.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_511623.1として掲載されている。イヌmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_537609.2及びXM_854741.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号XP_537609.1及びXP_859834.1として掲載されている。上記my14遺伝子の塩基配列は本願の配列番号51〜56に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_205479.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_990810.1として掲載されている。ゼブラフィッシュmyl4遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_131692.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571767.1として掲載されている。
「Myl7」遺伝子とは「myosin, light polypeptide 7, regulatory」遺伝子であり、MLC2a、MYL2A、RLC-A、Mylc2a、MLC-2alpha として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_022879.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_075017.2として掲載されている。ヒトmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_021223.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_067046.1として掲載されている。チンパンジーmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519549.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_519549.2として掲載されている。ラットmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001106017.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001099487.1として掲載されている。上記my17遺伝子の塩基配列は本願の配列番号57〜60に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ラットmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_214074.4及びXM_001069249.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号XP_214074.4及びXP_001069249.1として掲載されている。ゼブラフィッシュmyl7遺伝子のmRNAをコードする塩基配列番号NM_131329.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_571404.1として掲載されている。
「Hbb-bh1」遺伝子とは、「hemoglobin Z, beta-like embryonic chain」遺伝子であり、betaH1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008219.3として、アミノ酸配列番号NP_032245.1として掲載されている。ヒトHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000559.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000550.2として掲載されている。チンパンジーHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001161821.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001161821.1として掲載されている。イヌHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_542373.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_542373.2として掲載されている。ラットHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_172093.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_742090.1として掲載されている。上記Hbb-bh1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号61〜65に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、チンパンジーHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録NM_001071779.1、XM_001161863.1、XM_001161978.1、XM_001161706.1、XM_001162021.1、XM_001161903.1、XM_001161943.1、XM_001161662.1、XM_001162055.1、XM_508243.2、及びXM_001161615.1として掲載されており、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001065247.1、XP_001161863.1、XP_001161978.1、XP_001161706.1、XP_001162021.1、XP_001161903.1、XP_001161943.1、XP_001161662.1、XP_001162055.1、XP_508243.1、及びXP_001161615.1として掲載されている。ニワトリHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001031489.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001026660.1として掲載されている。ゼブラフィッシュHbb-bh1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001015058.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001015058.1として掲載されている。
「Hba-a1」遺伝子とは「hemoglobin alpha, adult chain 1」遺伝子であり、Hba1 として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHba-a1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008218.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_032244.2として掲載されている。ヒトHba-a1遺伝子のアイソフォームα1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000558.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000549.1として掲載されており、アイソフォームα2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000517.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000508.1として掲載されている。ラットHba-a1遺伝子のアイソフォームα1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013096.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_037228.1として掲載されており、アイソフォームα2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001007722.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001007723.1として掲載されている。上記Hba-a1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号66〜70に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリHba-a1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001004376.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001004376.1として掲載されている。
「Col1a2」遺伝子とは「procollagen, type I, alpha 2」遺伝子であり、oim、Cola2、Cola-2、Col1a-2、AA960264、AI325291 として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_007743.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_031769.2として掲載されている。ヒトCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000089.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_000080.2として掲載されている。チンパンジーCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519207.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001168704.1として掲載されている。イヌCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001003187.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001003187.1として掲載されている。ラットCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053356.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号 NP_445808.1として掲載されている。上記Colla2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号71〜75に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号XM_001234350.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号XP_001234351.1として掲載されている。ゼブラフィッシュCol1a2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_182968.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_892013.2として掲載されている。
「Hba-x」遺伝子とは、「hemoglobin X, alpha-like embryonic chain in Hba complex」遺伝子であり、AI450015として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_010405.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_034535.1として掲載されている。ヒトHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_005332.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_005323.1として掲載されている。チンパンジーHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001151282.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録XP_001151282.1として掲載されている。上記Hba-x遺伝子の塩基配列は本願の配列番号76〜78に示されている。また、これら遺伝子のオーソログな遺伝子もNCBIのデータベース上に掲載されており、例えば、ニワトリHba-x遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001004374.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録NP_001004374.1として掲載されている。
「basp1」遺伝子とは「brain abundant, membrane attached signal」遺伝子であり、2610024P12Rik、CAP-23、CAP23、Ckap3、NAP-22、NAP22として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_006317.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_006308.3として掲載されている。チンパンジーbasp1遺伝子のmRNAは登録配列番号XM_001175409.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001175409.1として掲載されている。イヌbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_863690.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_868783.1として掲載されている。ウシbasp1遺伝子のmRNAは登録配列番号NM_174780.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_777205.1として掲載されている。マウスbasp1遺伝子のmRNA配列は登録番号NM_027395.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_081671.1として掲載されている。ラットbasp1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_022300.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_071636.1として掲載されている。上記basp1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号101〜106に示されている。
「cpe」遺伝子とは「carboxypeptidase E」遺伝子であり、CPH、Cph-1、Cph1、MGC7101、R74677、Fatとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001873.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001864.1として掲載されている。チンパンジーcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001098559.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001092029.1として掲載されている。イヌcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532715.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_532715.2として掲載されている。マウスcpe遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013494.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_038522.2として掲載されている。上記cpe遺伝子の塩基配列は本願の配列番号107〜110に示されている。
「ddr1」遺伝子とは「discoidin domain receptor family, member 1」遺伝子であり、6030432F18、AI323681、CD167a、Cak、Nep、PTK3Aとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトddr1遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013993.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_054699.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001954.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_001945.3として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013994.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_054700.2として掲載されている。チンパンジーddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001045502.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001038967.1として掲載されている。イヌddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_532062.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_532062.2として掲載されている。ウシddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001076012.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069480.2として掲載されている。マウスddr1遺伝子のアイソフォーム1のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_007584.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_031610.1として掲載されており、アイソフォーム2のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_172962.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_766550.1として掲載されている。ラットddr1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013137.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_037269.1として掲載されている。上記ddr1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号111〜119に示されている。
「marcks」遺伝子とは「myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate」遺伝子であり、Macs、PKCSLとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_002356.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_002347.5として掲載されている。チンパンジーmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001159872.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001159872.1として掲載されている。イヌmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_850164.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_855257.1として掲載されている。ウシmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001076276.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069744.1として掲載されている。マウスmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_008538.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_032564.1として掲載されている。ラットmarcks遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001060954.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001060954.1として掲載されている。上記marcks遺伝子の塩基配列は本願の配列番号120〜125に示されている。
「ndn」遺伝子とは「necdin」遺伝子であり、AI528698、Peg6として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばヒトndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_002487.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_002478.1として掲載されている。チンパンジーndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_510257.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_510257.2として掲載されている。イヌndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_545810.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_545810.1として掲載されている。ウシndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001014982.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001014982.1として掲載されている。マウスndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010882.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035012.2として掲載されている。ラットndn遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001008558.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001008558.1として掲載されている。上記ndn遺伝子の塩基配列は本願の配列番号126〜131に示されている。
「nnat」遺伝子とは「neuronatin」遺伝子であり、5730414I02Rik、AW107673、Peg5、RP23-169M4.6として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005386.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005377.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_181689.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_859017.1として掲載されている。チンパンジーnnat遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001141473.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001141473.1として掲載されている。イヌnnat遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_847444.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_852537.1として掲載されている。マウスnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010923.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035053.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_180960.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_851291.1として掲載されている。ラットnnat遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053601.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_446053.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_181687.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_859015.1として掲載されている。上記nnat遺伝子の塩基配列は本願の配列番号132〜139に示されている。
「ptbp2」遺伝子とは「polypyrimidine tract binding protein 2」遺伝子であり、Ptb2、brPTB、nPTBとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_021190.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_067013.1として掲載されている。チンパンジーptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001157727.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001157727.1として掲載されている。イヌptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_861727.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_866820.1として掲載されている。ウシptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110081.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103551.1として掲載されている。マウスptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_019550.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_062423.1として掲載されている。ラットptbp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001005555.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001005555.1として掲載されている。上記ptbp2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号140〜145に示されている。
「sfrp2」遺伝子とは「secreted frizzled-related protein 2」遺伝子であり、AI851596、Sdf5として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003013.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003004.1として掲載されている。チンパンジーsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001155803.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸は登録配列番号XP_001155803.1として掲載されている。イヌsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001002987.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001002987.1として掲載されている。ウシsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001034393.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001029565.1として掲載されている。マウスsfrp遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009144.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033170.1として掲載されている。ラットsfrp2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001100700.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001094170.1として掲載されている。上記sfrp2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号146〜151に示されている。
「sox11」遺伝子とは「SRY-box 11」遺伝子であり、1110038H03Rik、6230403H02Rik、AI836553、end1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003108.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003099.1として掲載されている。ウシsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001250191.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号XP_001250192.1として掲載されている。マウスsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009234.5として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_033260.4として掲載されている。ラットsox11遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053349.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_445801.1として掲載されている。上記sox11遺伝子の塩基配列は本願の配列番号152〜155に示されている。
「ttc3」遺伝子とは「tetratricopeptide repeat domain 3」遺伝子であり、2610202A04Rik、AA409221、D16Ium21、D16Ium21e、KIAA4119、TPRD、mKIAA4119として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_001001894.1及びNM_003316.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列がそれぞれ登録番号NP_001001894.1及びNP_003307.3として掲載されている。チンパンジーttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001169886.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001169886.1として掲載されている。イヌttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_844474.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_849567.1として掲載されている。ウシttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001109767.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103237.1として掲載されている。マウスttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_009441.2、アミノ酸配列番号NP_033467.2として掲載されている。ラットttc3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001108315.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001101785.1として掲載されている。上記ttc3遺伝子の塩基配列は本願の配列番号156〜162に示されている。
「tubb2b」遺伝子とは「tubulin, beta 2b」遺伝子であり、2410129E14Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、マウスtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_023716.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_076205.1として掲載されている。ヒトtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178012.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_821080.1として掲載されている。チンパンジーtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001162039.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001162039.1として掲載されている。イヌtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_851105.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_856198.1として掲載されている。ラットtubb2b遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001013886.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001013908.2として掲載されている。上記tubb2b遺伝子の塩基配列は本願の配列番号163〜167に示されている。
「ubqln2」遺伝子とは「ubiquilin 2」遺伝子であり、Chap1、Dsk2、HRIHFB2157、Plic-2、Plic2、RP23-240F13.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えばマウスubqln2遺伝子はmRNA配列番号NM_018798.2、アミノ酸配列番号NP_061268.2として掲載されている。ヒトubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013444.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_038472.2として掲載されている。チンパンジーubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001148609.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001148609.1として掲載されている。イヌubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_549029.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_549029.2として掲載されている。ウシubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_587928.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_587928.3として掲載されている。ラットubqln2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001061090.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001061090.1として掲載されている。上記ubqln2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号164〜173に示されている。
「vim」遺伝子とは「vimentin」遺伝子であり、MGC102095、RP23-185P20.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_003380.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_003371.2として掲載されている。チンパンジーvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001009148.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001009148.1として掲載されている。イヌvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_851385.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_856478.1として掲載されている。ウシvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_173969.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_776394.2として掲載されている。マウスvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011701.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035831.2として掲載されている。ラットvim遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_031140.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_112402.1として掲載されている。上記vim遺伝子の塩基配列は本願の配列番号174〜179に示されている。
「six3」遺伝子とは「sine oculis homeobox homolog 3」遺伝子であり、Six3a、Six3alpha、Six3b、Six3betaとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005413.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005404.1として掲載されている。チンパンジーsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_525749.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_525749.2として掲載されている。ウシsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_868863.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_873956.2として掲載されている。マウスsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011381.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035511.2として掲載されている。ラットsix3遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_023990.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_076480.1として掲載されている。上記six3遺伝子の塩基配列は本願の配列番号180〜184に示されている。
「arx」遺伝子とは「aristaless related homeobox」遺伝子であり、RP23-53K18.1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_139058.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_620689.1として掲載されている。イヌarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001114666.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001108138.1として掲載されている。マウスarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_007492.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_031518.2として掲載されている。ラットarx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001100174.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001093644.1として掲載されている。上記arx遺伝子の塩基配列は本願の配列番号185〜188に示されている。
「dcx」遺伝子とは「doublecortin」遺伝子であり、DBCN、DC、LISX、RP5-914P14.1、SCLH、XLISとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトdcx遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_000555.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_000546.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178152.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_835365.1として、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_178151.1及びNM_178153.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_835364.1及びNP_835366.1として掲載されている。チンパンジーdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_529107.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_529107.2として掲載されている。イヌdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_848089.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_853182.1として掲載されており、ラットdcx遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_053379.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列番号NP_445831.2として掲載されている。マウスdcx遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110222.1及びNM_001110223.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_001103692.1及びNP_001103693.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001110224.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001103694.1として掲載されており、アイソフォームcのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010025.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_034155.2として掲載されている。上記dcx遺伝子の塩基配列は本願の配列番号189〜199に示されている。
「L1cam」遺伝子とは「L1 cell adhesion molecule」遺伝子であり、CAML1、CD171、HSAS、HSAS1、MASA、MIC5、N-CAML1、S10、SPG1として記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトL1cam遺伝子のアイソフォーム1のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_000425.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_000416.1として掲載されており、アイソフォーム2のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_024003.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_076493.1として掲載されている。チンパンジーL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001139376.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001139376.1として掲載されている。イヌL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_549364.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_549364.2として掲載されている。ウシL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001250423.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001250424.1として掲載されている。マウスL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_008478.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_032504.3として掲載されている。ラットL1cam遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_017345.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_059041.1として掲載されている。上記L1cam遺伝子の塩基配列は本願の配列番号200〜206に示されている。
「emx2」遺伝子とは「empty spiracles homeobox 2」遺伝子であり、Pdoとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_004098.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_004089.1として掲載されている。チンパンジーemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001152098.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001152098.1として掲載されている。イヌemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_848240.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_853333.1として掲載されている。ウシemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001075845.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001069313.1として掲載されている。マウスemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_010132.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_034262.2として掲載されている。ラットemx2遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001109169.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001102639.1として掲載されている。上記emx2遺伝子の塩基配列は本願の配列番号207〜212に示されている。
「wnt1」遺伝子とは「wingless-type MMTV integration site family, member 1」遺伝子であり、Int-1、Wnt-1、sw、swayingとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005430.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005421.1として掲載されている。チンパンジーwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_001159566.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_001159566.1として掲載されている。イヌwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_543686.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_543686.2として掲載されている。ウシwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001114191.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001107663.1として掲載されている。マウスwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_021279.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_067254.1として掲載されている。ラットwnt1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001105714.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001099184.1として掲載されている。上記wnt1遺伝子の塩基配列は本願の配列番号213〜218に示されている。
「reln遺伝子」とは「reelin」遺伝子であり、reeler、rlとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、ヒトreln遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_005045.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_005036.2として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_173054.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_774959.1として掲載されている。チンパンジーreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_519291.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_519291.2として掲載されている。イヌreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_844371.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_849464.1として掲載されている。ウシreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001105321.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001098791.1として掲載されている。マウスreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_011261.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_035391.2として掲載されている。ラットreln遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_080394.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_536319.2として掲載されている。上記reln遺伝子の塩基配列は本願の配列番号219〜225に示されている。
「pax6」遺伝子とは「paired box 6」遺伝子であり、AN、AN2、MGDA、WAGR、D11S812E、MGC17209、Dey、Sey、AEY11、Gsfaey11、1500038E17Rikとして記載される場合もある。NCBIのデータベース上に、例えば、マウスpax6遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_013627.4として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_038655.1として掲載されている。ヒトpax6遺伝子のアイソフォームaのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_000280.3及びNM_001127612.1として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列はそれぞれ登録番号NP_000271.1及びNP_001121084.1として掲載されており、アイソフォームbのmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_001604.3として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_001595.2として掲載されている。ラットpax6遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_013001.2として、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_037133.1として掲載されている。上記pax6遺伝子の塩基配列は本願の配列番号226〜230に示されている。
また、本発明は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
(2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、(3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、を有する。
第A工程では、具体的には例えば、発生毒性を示す化学物質又は発生毒性を示さない複数の化学物質に接触した該組織分化過程における細胞を継時的に取得して、前記配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する。
第B工程では、化学物質に接触しない該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子の発現量を測定して対照値とし、第A工程の遺伝子発現レベルと各時点で比較して該遺伝子の各化学物質に対する発現変動の差異のパターンを明らかにする。そして、複数の化学物質に対する特徴的な遺伝子発現変動のパターンが該遺伝子の発現変動パターンと同様のパターンを示す別の遺伝子を発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として特定する。第C工程では、第B工程で特定した遺伝子をPCR法などにより取得する。
また、本発明は、化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
(1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
(2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
(3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、を有する。
第A工程では、幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において経時的に取得した該組織細胞における配列番号1〜78および101〜230に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する。具体的に例えば、該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子発現を測定し、0日の発現量と比較して優位に発現変動する遺伝子を特定する。第B工程では、第A工程で特定した遺伝子について、動物において発生毒性を示す化学物質又は発生毒性を示さない複数の化学物質を接触した該組織細胞の発現量を測定する。そして、第C工程では、化学物質に接触しない該組織分化過程における細胞を継時的に取得して該遺伝子の発現量を測定して対照値とし、第B工程の遺伝子発現レベルと各時点で比較して該遺伝子の各化学物質に対する発現変動の差異のパターンを明らかにする。そして、複数の化学物質に対する特徴的な遺伝子発現変動のパターンが特定した遺伝子の発現変動パターンと同様のパターンを示す別の遺伝子を発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子として特定する。
本発明の「レポーター遺伝子」は、本遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含む。レポータータンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ(firefly luc)、ウミシイタケルシフェラーゼ(renilla luc)、β-ガラクトシダーゼ、もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素、又は核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にする選択マーカータンパク質等が挙げられる。そのような選択マーカータンパク質としては、例えば、緑色蛍光プロテイン(GFP)、青色蛍光プロテイン(CFP)、黄色蛍光プロテイン(YFP)及び赤色蛍光プロテイン(dsRed)等の生細胞での観察が可能な蛍光色素マーカー又は色素マーカーが挙げられる。上記レポータータンパク質は、本発明の核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さないことが好ましい。また、レポーター遺伝子発現の検出は、レポータータンパク質が酵素である場合も蛍光プロテインである場合も、それ自体が既知の検出方法により行うことができる。
本発明において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、通常RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本発明においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター配列」という。プロモーターの配列は、通常、推定タンパク質コード領域の第1エキソンの上流約5kbp以内の領域であることが多いので、DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター配列を推定することはできる。DNA解析用ソフトウェアは例えばDNASISソフトウェア(日立ソフトウェア)、GENETYX(株式会社ゼネティックス)等が使用できる。推定プロモーター配列は、構造遺伝子ごとに異なり、通常構造遺伝子の上流にあるが、構造遺伝子の下流にもあり得る。
本発明において、プロモーター配列と予測されるDNA配列をNCBIデータベースより入手する方法について、マウスHand1遺伝子を例にして具体的に記載する。マウスHand1遺伝子のmRNA配列としては、インターネット上のNCBIホームページで「hand1」をキーワードとして検索することにより、登録番号NM_008213.2で登録された塩基配列を入手することができる。次に、マウス総ゲノム配列を対象としたblast検索法により、NM_008213.2にて登録された配列のうち、転写開始点周辺配列と相同な配列を含むゲノム配列を検索する。その結果、登録番号ref|NT_096135.5|Mm11_95772_37のマウス11番染色体全体配列の中から、Hand1遺伝子周辺1Mbpのゲノム情報を知ることができる。表示される範囲を10kbp程度まで絞込んだのち、ダウンロードを指示することにより、Hand1遺伝子周辺10kbp程度のゲノム配列を入手することができる。得られたゲノム配列とmRNA配列とをDNA解析用ソフトウェアを用いて分析することにより、転写開始点より上流の約5kbpのDNA配列を入手することができる。DNA解析用ソフトウェアは例えばDNASISソフトウェア(日立ソフトウェア)、GENETYX(株式会社ゼネティックス)等が使用できる。
本発明において「プロモーター配列に作動可能に連結される」とは、所望の遺伝子の発現(作動)があるプロモーター配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが構造遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その構造遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。本遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子において、そのようなプロモーター配列は、配列の転写開始点から上流5kbpの間の領域であり得る。この領域には、Sp1及びAP-2等の既知転写調節因子の結合可能配列が存在し、この領域が発現制御に重要な働きをすることが予想されるからである。このことから少なくともこれらの領域に転写を誘導するために必要十分な塩基配列(プロモーター配列)を含むと推測される。プロモーター配列は、レポータータンパク質コード配列と作動可能に連結して機能すればよく、長さに限定されない。
本発明において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、該分野において多数存在し、販売元により、その構造上の違い(例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列)から名前を変えて販売されている。例えば、 ‘Molecular Cloning(3rd edition)’ by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)) に代表的なものが記載(発売元も記載)されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
本発明において「ベクター」は「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含有し、「発現ベクター」においては、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されていてもよい。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー及び、エンハンサーを含み得る。生物(例えば、動物)の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明において使用される「組換えベクター」としては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダFIXベクター(ファージベクター)を、cDNAのスクリーニングではラムダZAPベクター(ファージベクター)を利用することができる。ゲノムDNAのクローニングにはpBluescript II SK+/−, pGEM,pCR2.1ベクター(プラスミドベクター)等を使用することができる。発現ベクターとしてpSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、pMEI-5/neoベクター等(プラスミドベクター)を利用することができる。レポーターベクターとしてpGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を利用することができる。このようなベクターは、前出のMolecular Cloning誌を参考にして適宜使用することができる。
本発明において、核酸分子を細胞に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等が挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F. A.ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら(1987)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.及びその第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997等に記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本発明に記載される方法又は他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にDNAを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換等(例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法等)が挙げられる。
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞等の生命体の全部又は一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主等ともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作等において原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Eschericia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する原核生物細胞、例えば、Eschericia XL1-Blue、Eschericia XL2-Blue、Eschericia DH1が例示され、そのような細胞は、‘Molecular Cloning(3rd edition)’ by Sambrook,J and Russell, D.W., Appendix 3(Volume3),Vectors and Bacterial strains. A3.2(Cold Spring Harbor USA 2001) に記載されている。
本発明において「遺伝子改変非ヒト動物」とは、遺伝子操作により外部から特定の遺伝子(DNA)を導入し作出させたトランスジェニック非ヒト動物(マウス、ラット)や特定の遺伝子を破壊して欠失させたノックアウトマウス、逆に特定の遺伝子に付加置換したノックインマウス等の総称である。

















本発明を以下の実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例1
(ES細胞の心筋への分化誘導)
ATCC(American Type Culture Collection)よりマウスES細胞(ES-D3株)を入手した。ES-D3株は、マウスLIF(白血病阻害因子:leukemia inhibitory factor)を添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地において、未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた。LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、1滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmディッシュに懸滴培養(本培養方法をハンギングドロップ培養又はハンギングドロップ法とも呼ぶ)により37℃、5%CO2インキュベーター内で3日間培養を行い、胚様体(embryoid body)を形成させた。この胚様体を更に2日間、非接着系のシャーレの中で浮遊培養した後、胚様体を接着系のシャーレに移行した。ハンギングドロップ開始から10日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。ES細胞から心筋への分化過程で発現変動する遺伝子を経時的、網羅的把握するため、12000滴以上の懸滴培養を開始し、先述の分化誘導過程において0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。本操作を10日目まで実施した。
実施例2
(心筋分化過程の網羅的発現変動解析)
分化誘導後0日、2日、4日、6日、8日、10日目、計6時点の保存サンプル合計24サンプル(1日あたり4群)より、RNeasy RNA抽出キット(キアゲン社)を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array(アフィメトリクス社)を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。0日に対して各日(2日、4日、6日、8日、10日)において発現変化を示したHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子又は、Hba-x遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
実施例3
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
(心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により37℃、5%CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmシャーレに懸滴培養により3日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性6cmシャーレ(グライナー社)の中で浮遊培養した後、胚様体を24ウェルプレート(BDファルコン社)に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(0.05μg/mL 5-Fluorouracil、4.0μg/mL hydroxyurea、1.0μg/mL 6- aminonicotinamide)、および発生毒性陰性化合物処理群(1000μg/mL saccharin sodium hydrate、7.5μg/mL ascorbic acid、125μg/mL isoniazide)を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。
(候補遺伝子の定量的PCRによる発現解析)
RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日の候補遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各候補遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図1および2に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
実施例4
実施例3において特定したマーカー遺伝子について、発生毒性の予測性を実施例3で用いた以外の発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて検証する工程を記載する。
(心筋分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞株を、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により37℃、5%CO2インキュベーター内で未分化維持培養を行った。分化誘導方法においては、まず0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、一滴あたり約750個の細胞を含むように、直径10cmシャーレに懸滴培養により3日間培養を行った。形成した胚様体を更に2日間、非接着性6cmシャーレ(グライナー社)の中で浮遊培養した後、胚様体を24ウェルプレート(BDファルコン社)に播種した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(1.5μg/mL 5-bromo-2'-deoxyuridine、 0.6μg/mL methotrexate、0.001μg/mL all-trans -retinoic acid)、および発生毒性陰性化合物処理群(1500μg/mL penicillin G sodium salt、25μg/mL acrylamide、100μg/mL D-(+)-camphor)を添加した培地で行った。ハンギングドロップ開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。ハンギングドロップ開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。
(マーカー遺伝子の定量的PCRによる発現解析)
RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1、ADAM19遺伝子はMm00477337_m1、Pitx2遺伝子はMm00440826_m1、Cmya1遺伝子はMm00495998_m1、Smyd1遺伝子はMm00477663_m1、Pim2遺伝子はMm00454579_m1、Tbx20遺伝子はMm00451515_m1、Myl4遺伝子はMm00440378_m1、Myl7遺伝子はMm00491655_m1、Hbb-bh1遺伝子はMm00433932_g1、Hba-a1遺伝子はMm00845395_s1、Col1a2遺伝子はMm00483888_m1、Hba-x遺伝子はMm00439255_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。
また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図3および4に示すように、Hand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子およびHba-x遺伝子は発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制される傾向が認められ、マーカー遺伝子として検証された。
実施例5
以下に、マーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
(マーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製)
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングした。
Hand1遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号79記載のプライマーと配列番号82記載のプライマー、プロモーター領域2kbを増幅する場合には配列番号80記載のプライマーと配列番号82記載のプライマー、プロモーター領域1kbを増幅する場合には配列番号81記載のプライマーと配列番号82記載のプライマーを用いた。ES-D3細胞より抽出したゲノムDNA20ngと10μMに調製した上記の各プライマーとをPlatinum Taq polymerase(インビトロジェン社)を用いてPCR法にて増幅した。PCR反応はGeneAmp PCR System9700(アプライドバイオシステム社)にて、95℃5分間反応させた後、95℃30秒間、55℃30秒間、72℃1分間を30サイクル行い、72℃7分間の反応条件で実施した。
Smyd1遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号83記載のプライマーと配列番号86記載のプライマー、プロモーター領域2kbを増幅する場合には配列番号84記載のプライマーと配列番号86記載のプライマー、プロモーター領域1kbを増幅する場合には配列番号85記載のプライマーと配列番号86記載のプライマーを用いた。
Pitx2遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号87記載のプライマーと配列番号90記載のプライマー、プロモーター領域2kbを増幅する場合には配列番号88記載のプライマーと配列番号90記載のプライマー、プロモーター領域1kbを増幅する場合には配列番号89記載のプライマーと配列番号90記載のプライマーを用いた。
Cmya1遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号91記載のプライマーと配列番号94記載のプライマー、プロモーター領域2kbを増幅する場合には配列番号92記載のプライマーと配列番号94記載のプライマー、プロモーター領域1kbを増幅する場合には配列番号93記載のプライマーと配列番号94記載のプライマーを用いた。
Pim2遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号95記載のプライマーと配列番号98記載のプライマー、プロモーター領域2kbを増幅する場合には配列番号96記載のプライマーと配列番号98記載のプライマー、プロモーター領域1kbを増幅する場合には配列番号97記載のプライマーと配列番号98記載のプライマーを用いた。
ADAM19遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号99記載のプライマーと配列番号100記載のプライマーを用いた。
Cmya1遺伝子の各PCR産物はHind III(タカラバイオ社)、Hand1、ADAM19、Smyd1、Pitx2及びPim2遺伝子の各PCR産物はKpn I(タカラバイオ社)にて消化した後、電気泳動を行い、ゲル中より精製した。精製したDNA断片はそれぞれ、Hind III又はKpn Iにて消化し、Alkaline phosphatase(タカラバイオ社)にて脱リン酸化処理を行ったpGL4.17[Luc2/Neo]vector(プロメガ社)とLigation kit(タカラバイオ社)を用いて連結し、DH5αコンピテンセル(タカラバイオ社)に形質転換して、37℃でLB/アンピシリン培地にて一晩培養した。出現したコロニーはLB/アンピシリン液体培地にて培養し、増殖した大腸菌よりプラスミドDNAを抽出した。取得したプラスミドDNAは挿入断片のシークエンスを決定し、変異等の有無を確認した。
ES細胞へトランスフェクションに用いるため、各プラスミドはQiafilterプラスミド抽出キット(キアゲン社)にて再度抽出した。得られたプラスミドDNA20μgをCmya1、Hand1、Pim2、ADAM19、Pitx2プロモーターに関してはSal Iにて、Smyd1についてはNot Iにて制限酵素処理を行った後、精製を行い、線状化DNAを取得した。
(組換えES細胞の作製方法)
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1%ゼラチンコートした35mmシャーレ中に0.3X10個の細胞を播種し、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養した。その後、Opti-MEM培地と4μgの線状化DNA、12μLのリポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)とを混合し、30分間室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加した。
37℃にて5%COインキュベーターで1時間培養したのち、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換した。12時間後、各細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1%ゼラチンコートした10cmシャーレに100μg/mLのG418(インビトロジェン社)を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始した。7日〜10日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、96ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続した。3日毎に培地交換を行い、7〜10日後に増殖した細胞を継代培養して48ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得した。
(細胞株の選別法)
取得した細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量で3日間のハンギング培養を実施し、2日間の浮遊培養、5日間の接着培養を経て心筋へ分化誘導を行った。各細胞株について、2日毎に10日間、50以上の胚葉体を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。RiboGreenキット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定後、1μg相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させcDNAを合成した。各細胞株のそれぞれ0日、2日、4日、6日、8日10日のサンプルについて、Luc2遺伝子を増幅可能なプライマー対(5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3')及びExTaq polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行った。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc2遺伝子が発現誘導される細胞株を選択した。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施した。まず、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた。LIF未添加の15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に培地交換を行ったのち、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法により心筋分化誘導を開始し、3日間浮遊培養を行った。3日後に100μLのLIF未添加、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を追加して2日間浮遊培養を継続した後、5日目に、形成した胚葉体を接着培養用96ウエルプレート(コーニング社)に移し、接着培養を開始した。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した4枚の96ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加した。10分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定した。例えば、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞(以下、Hand1-ES細胞と記す)およびsmyd1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞(以下、smyd1-ES細胞と記す)について、内在性のhand1またはsmyd1遺伝子、およびルシフェラーゼ活性の経時的な測定結果を図5に示す。Hand1-ES細胞およびsmyd1-ES細胞は内在性の遺伝子発現とルシフェラーゼ活性誘導のパターンが一致することが明らかとなった。
実施例6
以下に、選定した組換えES細胞を利用した心筋分化過程での発生毒性評価法を記載する。
取得した組換えES細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行う。未分化なコロニーは、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去し、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントする。溶媒対象群としてPBS(-)のみを添加した分化培地、陽性対象(心筋への分化が阻害される陽性化合物及び濃度)群として最終濃度4.0μg/mLになるようにhydroxyurea溶液(PBS(-)に溶解)を添加した分化培地、及び被験物質を公比10にて5段階に希釈して調製した分化培地を作製した後、各分化培地に1mL当たり3.75X104個の細胞数になるように細胞懸濁液を調製し、750cell/20μLの容量でハンギングドロップ法による心筋分化誘導を開始し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地100μLを追加して2日間浮遊培養を継続する。5日目に、形成した胚葉体を、再度調製した分化培地及び該被験物質を添加した分化培地を予め分注した接着培養系96ウエルプレート(コーニング社)に移し、接着培養を開始する。分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、培養液を吸引除去した4枚の96ウエルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加する。10分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、陽性対照群及び該被験物質の濃度毎に集計する。これらの方法を用いて、溶媒対照群、陽性対照群、該被験物質のルシフェラーゼ活性の変化量を比較し、該被験物質の心筋分化を阻害する濃度を決定することができる。
実施例7
(ES細胞の神経への分化誘導)
実施例1〜5に記載した工程により、心臓組織に対する発生毒性を予測するマーカーを特定すること、及びマーカー遺伝子の核酸構築物及び形質転換された細胞を用いることにより被験物質の心臓組織に対する発生毒性を評価することが可能となった。以下に示す、ES細胞から脳・神経への分化誘導方法を応用すれば、脳・神経に対する発生毒性評価方法も心臓組織と同様に実施可能である。以下にES細胞の神経細胞への分化誘導方法を示した。
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の10cmシャーレ中に5X105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から3日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から5日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で10分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して6cmシャーレに移行した。前記6cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート24ウェルプレートの各ウェルに10〜20個の胚様体になるように播種し、更に5日間、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で培養を継続した。分化開始より10日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を観察、更に神経分化の代表マーカー遺伝子MAP2に対する抗体を用いて免疫染色を実施し、MAP2陽性細胞の有無を確認した。
実施例8
(ES細胞の骨芽細胞への分化誘導)
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁し、遠心操作および上清の吸引操作により、残余トリプシンおよび血清を除去した。その後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に再度懸濁し、少量の細胞溶液を用いて細胞数を計測した。計測後、0.1%ゼラチンコートを施した35mm dishに、1.0x104cells/mlの濃度となるように調製した細胞懸濁液を2ml加え、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養を開始した。培養開始より4日後にPBSによりディッシュを洗浄し、アスコルビン酸を50μg/ml、ベータグリセロリン酸を10mMの濃度で添加した15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地へと培地交換を行った。その後、2乃至3日毎に同様の組成の培地へと培地交換を行った。培養開始より4、10、15、20日目にサンプルを回収し、一部はアリザリン染色によりカルシウムの沈着を検出した。一方でTotal RNAを抽出した後に骨芽細胞系に特異的な遺伝子(Runx2、Osteoprotegerin、Osteopontin、Collagen1a1)について、内部標準にACTBを用いて相対的な発現量を比較し、その結果特異的遺伝子の発現が確認できた。
実施例9
(神経分化過程の網羅的発現変動解析)
実施例7の方法により分化誘導後0日、2日、4日、6日、8日、10日目、計6時点の保存サンプル合計24サンプル(1日あたり4群)より、RNeasy RNA抽出キット(キアゲン社)を用いてRNAを抽出した。抽出したすべてのRNAはRiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)による濃度測定、及び電気泳動によるRNA分解の品質確認を行った。濃度測定の結果に基づき4μgに調製したRNAを用いて、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array(アフィメトリクス社)を利用して網羅的に遺伝子発現変動プロファイルデータを収集、解析した。具体的な解析法は、まずバイオインフォマティクス解析ソフトを利用して各時点で全ての群に共通に発現変動する遺伝子を抽出した。次いで経時的に発現パターン分類を行い、抽出遺伝子をグループ化した。0日に対して各日(2日、4日、6日、8日、10日)において発現変化を示したBasp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子を候補遺伝子として抽出した。
実施例10
発生毒性陽性および陰性の化学物質を用いて、候補遺伝子の発現量の変動を定量的PCRにより解析することによりマーカー遺伝子を特定する方法について説明する。
(神経分化誘導時の被験物質接触サンプルの回収)
ES-D3細胞は、37℃、5%CO2インキュベーター内で、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、LIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁した。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、非接着系の10cmシャーレ中に5×105/mL個の細胞密度にて10mLの細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5%O2インキュベーター内で培養した。分化開始から3日に10mLの神経分化培地を追加して2日間の浮遊培養を継続した。分化開始から5日目にすべての細胞及び培養液を遠心管に移し、室温で10分間静置して、胚様体を沈降させた。静かに上清を除いたのち、神経分化培地にて胚様体を懸濁して6cmシャーレに移行した。前記6cmシャーレ中の胚様体を実体顕微鏡を用いて、5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート24ウェルプレートの各ウェルに10〜20個の胚様体になるように播種し、更に5日間、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で培養を継続した。これら一連の分化誘導は溶媒対照群と発生毒性陽性化合物処理群(0.03μg/mL 5-Fluorouracil、4.0μg/mL hydroxyurea、0.2μg/mL methotrexate)、および発生毒性陰性化合物処理群(4,000μg/mL saccharin sodium hydrate、20μg/mL ascorbic acid、150μg/mL isoniazide、600μg/mL penicillin G sodium salt、50μg/mL acrylamide、100μg/mL D-(+)-camphor)を添加した培地で行った。分化誘導開始から3日目及び5日目に再度調製した化合物を添加した培地に交換して10日間の培養を行った。分化誘導開始から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日の各日当たり50個以上の細胞を混合して1群とし、4群以上の細胞を回収した。回収した細胞はTrisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製した。分化開始より10日目に、一部のウェルについて位相差顕微鏡下で神経突起を確認した。
実施例11
(候補遺伝子の定量的PCRによる発現解析)
実施例10で抽出したRNAは、RiboGreen RNA定量キット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定し、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製した。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施した。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Basp1遺伝子はMm02344032_s1、Cpe遺伝子はMm00516341_m1、DDR1遺伝子はMm01273494_g1、Marcks遺伝子はMm02524303_s1、NDN遺伝子はMm02524479_s1、Nnat遺伝子はMm00731416_s1、Ptbp2遺伝子はMm00497922_m1、Sfrp2遺伝子はMm01213947_m1、Sox11遺伝子はMm01281943_s1、Ttc3遺伝子はMm00493917_m1、Tubb2b遺伝子はMm00849948_g1、Ubqln2遺伝子はMm00834570_s1、Vim遺伝子はMm00449201_m1、Six3遺伝子はMm01237639_m1、Arx遺伝子はMm00545903_m1、Dcx遺伝子はMm00438401_m1、L1cam遺伝子はMm00493049_m1、Emx2遺伝子はMm00550241_m1、Wnt1遺伝はMm00810320_s1、Reln遺伝子はMm00465200_m1、Pax6遺伝子はMm00443081_m1(すべてアプライドバイオシステム社製)を使用した。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得した。解析により得られたデータは、分化誘導各日のマーカー遺伝子発現量を、同日のマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各マーカー遺伝子発現量を評価した。測定日に関しては各マーカー遺伝子の最も発現上昇する日数とした。その結果、図6、図7および8に示すように、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子およびPax6遺伝子は、発生毒性陰性化合物処理群に比べ発生毒性陽性化合物処理群で強く抑制され、マーカー遺伝子として特定された。
実施例12
以下に、hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたHand1-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。
Hand1-ES細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。未分化なHand1-ES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続した。6日目に各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo(プロメガ社)を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31(以下3T3細胞とする)を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価した。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行った。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続した。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット(プロメガ社)中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定した。被験物質はin vivoでの発生毒性が陽性の4化合物(5-fluorouracil、hydroxyurea、dexamethasone、5-bromo-2'-deoxyuridine)、および陰性の2化合物(ascorbic acid、acrylamide)について実施した。Hand1-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出した。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1-ES細胞のルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。今回評価した発生毒性が陽性の4化合物については、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれ、5-fluorouracil(Hand1-ES ID50 : 0.02μg/mL / 3T3 IC50 : 0.16 μg/mL)、hydroxyurea(Hand1-ES ID50 : 2.5μg/mL / 3T3 IC50 : 4.7 μg/mL)、dexamethasone(Hand1-ES ID50 : 15.6 μg/mL / 3T3 IC50 : 36.7 μg/mL )、5-bromo-2'-deoxyuridine(Hand1-ES ID50 : 0.12μg/mL /3T3 IC50 : 0.80μg/mL )となり、ID50 <IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価することができる。また、発生毒性が陰性のascorbic acidおよびacrylamideについては、Hand1-ES ID50濃度と3T3 IC50濃度はそれぞれascorbic acid(Hand1-ES ID50 : 28.3μg/mL /3T3 IC50 : 2.0μg/mL )、acrylamide(Hand1-ES ID50 : 85.3μg/mL /3T3 IC50 : 54.0μg/mL )となり、Hand1-ES ID50 >3T3 IC50の関係が認められ、母動物に比べ胎児への影響が弱いと考えられ発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により従来のEST法よりも短期間にまた簡便に被験物質の発生毒性を予測することが可能となった。
実施例13
Hand1の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存した。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、Hand1遺伝子評価用のTaqManプローブ(Mm00433931_m1)1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施した。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブとして、Hand1遺伝子はMm00433931_m1を使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのhand1遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのhand1遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたHand1遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1の発現量が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
実施例14
マーカー遺伝子Hand1の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。-未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地(以下、心筋分化培地)に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、15,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液(心筋分化培地)を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した心筋分化培地50μLを追加して3日間浮遊培養を継続する。6日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。Hand1遺伝子産物(タンパク質)を認識する抗hand1抗体(abcam社)や抗eHAND (H-100)抗体(Santa cruz社)を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra(Beckman Coulter)等のフローサイトメトリーによりhand1遺伝子産物を発現する陽性細胞(以下、hand1陽性細胞)を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたHand1陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をhand1陽性細胞数が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。
実施例15
以下に、神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞の作製法を記載する。
(神経分化過程におけるマーカー遺伝子のプロモーターのクローニングとレポータープラスミドの作製)
本発明の各マーカー遺伝子のプロモーター領域は以下に示すプライマーを用いてPCRによりクローニングする。
Ndn遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号231記載のプライマーと配列番号232記載のプライマーを用いる。ES-D3細胞より抽出したゲノムDNA20ngと10μMに調製した上記の各プライマーとをPlatinum Taq polymerase(インビトロジェン社)を用いてPCR法にて増幅する。PCR反応はGeneAmp PCR System9700(アプライドバイオシステム社)にて、95℃5分間反応させた後、95℃30秒間、55℃30秒間、72℃1分間を30サイクル行い、72℃7分間の反応条件で実施する。
Cpe遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号233記載のプライマーと配列番号234記載のプライマーを用いる。
L1cam遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号235記載のプライマーと配列番号236記載のプライマーを用いる。
L1cam遺伝子のプロモーター領域5kbを増幅する場合には配列番号237記載のプライマーと配列番号238記載のプライマーを用いる。
各PCR産物は電気泳動を行った後、ゲル中より精製し、精製したDNA断片はそれぞれ末端リン酸化反応を行う。各断片は、EcoR Vを用いて消化した後にAlkaline phosphatase(タカラバイオ社)にて脱リン酸化処理を行ったpGL4.17[Luc2/Neo]vector(プロメガ社)とLigation kit(タカラバイオ社)を用いて連結し、DH5αコンピテンセル(タカラバイオ社)に形質転換して、37℃でLB/アンピシリン培地にて一晩培養する。出現したコロニーはLB/アンピシリン液体培地にて培養し、増殖した大腸菌よりプラスミドDNAを抽出する。取得したプラスミドDNAは挿入断片のシークエンスを決定し、変異等の有無を確認する。ES細胞へのトランスフェクションに用いるため、各プラスミドはQiafilterプラスミド抽出キット(キアゲン社)にて再度抽出する。得られたプラスミドDNA20μgは適した制限酵素により消化した後、精製を行い、線状化DNAを取得する。
(神経分化過程におけるマーカー遺伝子の組換えES細胞の作製方法)
未分化維持培養を行ったES-D3細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、0.1%ゼラチンコートした35mmシャーレ中に0.3×10個の細胞を播種し、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地により培養する。その後、Opti-MEM培地と4μgの線状化DNA、12μLのリポフェクトアミン2000(インビトロジェン社)とを混合し、30分室温にて反応させた後、全量を細胞培養液中に添加する。
37℃にて5%COインキュベーターで1時間培養したのち、LIFを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地に交換する。12時間後、各細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、0.1%ゼラチンコートした10cmシャーレに100μg/mLのG418(インビトロジェン社)を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて播種し、薬剤選択培養を開始する。7〜10日後、実体顕微鏡下でシャーレ中に形成したES細胞コロニーを単離し、96ウェルプレートに播種し、薬剤選択培養を継続する。3日毎に培地交換を行い、7〜10日後に増殖した細胞を継代培養して48ウェルプレートに播種して薬剤選択培養を継続し、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得する。
(細胞株の選別法)
取得した細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行い、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製した後、50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。各細胞株について、2日毎に10日間、24ウェル分以上の細胞を回収して1サンプルとし、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RiboGreenキット(インビトロジェン社)を用いてRNA濃度を測定後、1μg相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させcDNAを合成する。各細胞株のそれぞれ0日、2日、4日、6日、8日および10日のサンプルについて、Luc2遺伝子を増幅可能なプライマー対(5'-agtagtggcagtaccggat -3'及び5'-ctcgtgcaagttgcttagg -3')及びExTaq polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行い、その後PCR産物のゲル電気泳動を行う。また、各マーカー遺伝子、及びβアクチン遺伝子についても発現量を比較し、分化誘導に伴ってLuc2遺伝子が発現誘導される細胞株を選択する。更に、選択した細胞株の分化誘導後のルシフェラーゼ活性測定は以下の通り実施する。まず先述の神経分化誘導法に従って培養した後、分化誘導開始6日目から10日目の各日毎に、96ウェルプレートの各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Gloを50μL添加する。30分間振とうした後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたES細胞のルシフェラーゼ活性と内在性のマーカー遺伝子の発現パターンが一致するES細胞を選択し、それぞれの細胞株をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞と命名する。
実施例16
以下に、神経分化過程でのマーカー遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞、Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ES細胞を利用した被験物質の発生毒性予測法を記載する。それぞれの細胞株は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導開始から8〜10日後、各ウェルにルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo(プロメガ社)を100μL添加し30分間振盪した後、全量を96ウェル白色プレートに移し替えTopCount NXTルミネッセンス検出カウンター(パッカードジャパン社)にてルシフェラーゼ活性を測定する。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計する。
またATCCより入手したbalb/c 3T3細胞cloneA31(以下3T3細胞とする)を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行なう。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。分化誘導開始8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット(プロメガ社)中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。Ndn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞、Pax6-ES細胞および3T3細胞の各試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をNdn-ES細胞、Cpe-ES細胞、L1cam-ES細胞およびPax6-ESのルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求める。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
実施例17
神経分化過程でのマーカー遺伝子の発現量測定による被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、Trisol液(インビトロジェン社)100μlに溶解して-80℃にて保存する。回収したサンプルは、定法に従ってRNA抽出を行った後、RNaeasy mini kit(キアゲン社)により精製する。RNAの濃度を決定した後、300ng相当のRNAをoligo dTプライマー及びSuperscript III RT(インビトロジェン社)の逆転写酵素を用いて、42℃、1時間反応させ、各日のcDNAを作製する。得られたcDNA1μL、TaqManプローブ1μL、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 8 μL(アプライドバイオシステムズ)を解析用試験管中で混合し、95℃10分間の保温後、95℃10秒間と60℃20秒間の反応を40サイクル繰り返す反応条件にて、7900HT Real-time PCR systemを用いて実施する。各サンプルについては3反復にて実施する。解析に用いた各遺伝子のTaqManプローブは実施例11記載のプローブを使用する。また、マウスβアクチン遺伝子を解析可能なPre-developed TaqMan Assay Reagents 1 μLとcDNA1 μL用いて、7900HT Real-time PCR systemを用いて同様に実施し、内在性コントロールのデータを取得する。解析により得られたデータは、各サンプルのマーカー遺伝子発現量を、同一サンプルのマウスβアクチン遺伝子発現量で割ることにより、各サンプルのマーカー遺伝子の発現量変化を評価する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。リアルタイムPCRを用いたマーカー遺伝子の相対発現量、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子の発現量が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
実施例18
神経分化過程におけるマーカー遺伝子の発現量をフローサイトメトリーまたはFACSにより測定する方法により被験物質の発生毒性判定法を記載する。まず被験物質接触サンプルを以下の方法で回収する。未分化維持培養を行ったES細胞は、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させる。15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した後、遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシン及び血清を除去して、5%KSR(インビトロジェン社)、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM 2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸溶液を添加したDMEM培地からなる神経分化培地に懸濁する。少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントした後、5×105/mL個の細胞密度に調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で非接着性U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内、又は37℃、5%CO2及び5%O2インキュベーター内で3日間培養を行う。分化開始から3日目に50μLの神経分化培地を追加して浮遊培養を継続する。非接着性U底の96ウェルプレート内で形成した胚葉体は5μg/mLに調製したフィブロネクチン/PBS(-)溶液によりコート処理を施したPoly-D-Lysine/Laminineコート96ウェルプレートの各ウェルに播種し、更に5日間、37℃、5% CO2インキュベーター内、又は37℃、5% CO2及び5% O2インキュベーター内で神経分化誘導を継続する。分化誘導から8〜10日目に各ウェルの細胞を回収し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を分散した後、パラホルムアルデヒド溶液で細胞固定する。Saponin溶液等で細胞透過処理後、normal goat serumでブロッキングを行う。各マーカー遺伝子の遺伝子産物(タンパク質)を認識する抗体を添加して数時間反応した後、3回程度洗浄する。抗体としては例えば、抗necdin抗体(abcam社)、抗Cpe抗体(Santa cruz社)、抗L1CAM抗体(abcam社)、抗Pax6抗体(abcam社)等を1次抗体として使用する。またさらに1次抗体を認識する蛍光物質等の標識化2次抗体を反応した後、3回程度洗浄する。先述工程により得られたサンプルをそれぞれEpics Altra(Beckman Coulter)等のフローサイトメトリーにより各マーカー遺伝子産物を発現する陽性細胞(以下、マーカー遺伝子産物陽性細胞)を算定する。
またATCCより入手した3T3細胞を用いて以下の方法により各被験物質の細胞増殖に対する影響を評価する。10%非働化処理済み牛胎児血清、2mMグルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM培地(3T3用培地)で37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した3T3細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて分散させた後、3T3用培地にて細胞を懸濁する。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、3T3用培地に細胞を懸濁する。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、10,000/mLの細胞数になるように細胞懸濁液を調製する。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等を添加、または溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を50μLの容量で細胞培養用白色96ウェルプレートに播種し、3日間培養を行う。3日目に、再度調製した該被験物質を添加した3T3用培地50μLを追加して3日間培養を継続する。8〜10日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキット中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにて活性を測定する。フローサイトメトリーを用いたマーカー遺伝子産物陽性細胞数、および3T3細胞を用いた試験より得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、該被験物質の濃度毎に集計した後、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出する。
化学物質が母動物に与える影響は例えば3T3細胞のような分化した細胞を用いて50%細胞増殖抑制濃度(IC50)を測定し、該化学物質が胎児に与える影響をマーカー遺伝子産物陽性細胞数が50%阻害される濃度として50%分化抑制濃度(ID50)を求めることができる。もしその化学物質がID50<IC50であれば当該化学物質は母動物に比べ胎児への影響が強いと考えられ発生毒性を有すると評価できる。また、ID50>IC50であれば発生毒性を示さないと評価することができる。以上の工程により被験物質の神経分化過程での発生毒性を予測することが可能となる。
本発明により、簡便で汎用性の高い化学物質が有する発生毒性の予測方法を提供するこ
とができる。
配列番号79
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号80
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号81
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号82
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号83
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号84
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号85
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号86
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号87
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号88
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号89
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号90
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号91
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号92
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号93
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号94
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号95
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号96
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号97
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号98
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号99
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号100
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号231
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号232
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号233
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号234
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号235
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号236
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号237
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号238
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー

Claims (20)

  1. 化学物質が有する発生毒性の予測方法であって、
    (1)被験化学物質に接触した非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における、以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程と、
    (2)第一工程で得られた検体における前記遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該検体における該被験化学物質が有する発生毒性のレベルを評価する第二工程と、
    を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性の予測方法。
    (1) 配列番号1で示される塩基配列
    (2) 配列番号2で示される塩基配列
    (3) 配列番号3で示される塩基配列
    (4) 配列番号4で示される塩基配列
    (5) 配列番号5で示される塩基配列
    (6) 配列番号6で示される塩基配列
    (7) 配列番号7で示される塩基配列
    (8) 配列番号8で示される塩基配列
    (9) 配列番号9で示される塩基配列
    (10)配列番号10で示される塩基配列
    (11)配列番号11で示される塩基配列
    (12)配列番号12で示される塩基配列
    (13)配列番号13で示される塩基配列
    (14)配列番号14で示される塩基配列
    (15)配列番号15で示される塩基配列
    (16)配列番号16で示される塩基配列
    (17)配列番号17で示される塩基配列
    (18)配列番号18で示される塩基配列
    (19)配列番号19で示される塩基配列
    (20)配列番号20で示される塩基配列
    (21)配列番号21で示される塩基配列
    (22)配列番号22で示される塩基配列
    (23)配列番号23で示される塩基配列
    (24)配列番号24で示される塩基配列
    (25)配列番号25で示される塩基配列
    (26)配列番号26で示される塩基配列
    (27)配列番号27で示される塩基配列
    (28)配列番号28で示される塩基配列
    (29)配列番号29で示される塩基配列
    (30)配列番号30で示される塩基配列
    (31)配列番号31で示される塩基配列
    (32)配列番号32で示される塩基配列
    (33)配列番号33で示される塩基配列
    (34)配列番号34で示される塩基配列
    (35)配列番号35で示される塩基配列
    (36)配列番号36で示される塩基配列
    (37)配列番号37で示される塩基配列
    (38)配列番号38で示される塩基配列
    (39)配列番号39で示される塩基配列
    (40)配列番号40で示される塩基配列
    (41)配列番号41で示される塩基配列
    (42)配列番号42で示される塩基配列
    (43)配列番号43で示される塩基配列
    (44)配列番号44で示される塩基配列
    (45)配列番号45で示される塩基配列
    (46)配列番号46で示される塩基配列
    (47)配列番号47で示される塩基配列
    (48)配列番号48で示される塩基配列
    (49)配列番号49で示される塩基配列
    (50)配列番号50で示される塩基配列
    (51)配列番号51で示される塩基配列
    (52)配列番号52で示される塩基配列
    (53)配列番号53で示される塩基配列
    (54)配列番号54で示される塩基配列
    (55)配列番号55で示される塩基配列
    (56)配列番号56で示される塩基配列
    (57)配列番号57で示される塩基配列
    (58)配列番号58で示される塩基配列
    (59)配列番号59で示される塩基配列
    (60)配列番号60で示される塩基配列
    (61)配列番号61で示される塩基配列
    (62)配列番号62で示される塩基配列
    (63)配列番号63で示される塩基配列
    (64)配列番号64で示される塩基配列
    (65)配列番号65で示される塩基配列
    (66)配列番号66で示される塩基配列
    (67)配列番号67で示される塩基配列
    (68)配列番号68で示される塩基配列
    (69)配列番号69で示される塩基配列
    (70)配列番号70で示される塩基配列
    (71)配列番号71で示される塩基配列
    (72)配列番号72で示される塩基配列
    (73)配列番号73で示される塩基配列
    (74)配列番号74で示される塩基配列
    (75)配列番号75で示される塩基配列
    (76)配列番号76で示される塩基配列
    (77)配列番号77で示される塩基配列
    (78)配列番号78で示される塩基配列
    (101)配列番号101で示される塩基配列
    (102)配列番号102で示される塩基配列
    (103)配列番号103で示される塩基配列
    (104)配列番号104で示される塩基配列
    (105)配列番号105で示される塩基配列
    (106)配列番号106で示される塩基配列
    (107)配列番号107で示される塩基配列
    (108)配列番号108で示される塩基配列
    (109)配列番号109で示される塩基配列
    (110)配列番号110で示される塩基配列
    (111)配列番号111で示される塩基配列
    (112)配列番号112で示される塩基配列
    (113)配列番号113で示される塩基配列
    (114)配列番号114で示される塩基配列
    (115)配列番号115で示される塩基配列
    (116)配列番号116で示される塩基配列
    (117)配列番号117で示される塩基配列
    (118)配列番号118で示される塩基配列
    (119)配列番号119で示される塩基配列
    (120)配列番号120で示される塩基配列
    (121)配列番号121で示される塩基配列
    (122)配列番号122で示される塩基配列
    (123)配列番号123で示される塩基配列
    (124)配列番号124で示される塩基配列
    (125)配列番号125で示される塩基配列
    (126)配列番号126で示される塩基配列
    (127)配列番号127で示される塩基配列
    (128)配列番号128で示される塩基配列
    (129)配列番号129で示される塩基配列
    (130)配列番号130で示される塩基配列
    (131)配列番号131で示される塩基配列
    (132)配列番号132で示される塩基配列
    (133)配列番号133で示される塩基配列
    (134)配列番号134で示される塩基配列
    (135)配列番号135で示される塩基配列
    (136)配列番号136で示される塩基配列
    (137)配列番号137で示される塩基配列
    (138)配列番号138で示される塩基配列
    (139)配列番号139で示される塩基配列
    (140)配列番号140で示される塩基配列
    (141)配列番号141で示される塩基配列
    (142)配列番号142で示される塩基配列
    (143)配列番号143で示される塩基配列
    (144)配列番号144で示される塩基配列
    (145)配列番号145で示される塩基配列
    (146)配列番号146で示される塩基配列
    (147)配列番号147で示される塩基配列
    (148)配列番号148で示される塩基配列
    (149)配列番号149で示される塩基配列
    (150)配列番号150で示される塩基配列
    (151)配列番号151で示される塩基配列
    (152)配列番号152で示される塩基配列
    (153)配列番号153で示される塩基配列
    (154)配列番号154で示される塩基配列
    (155)配列番号155で示される塩基配列
    (156)配列番号156で示される塩基配列
    (157)配列番号157で示される塩基配列
    (158)配列番号158で示される塩基配列
    (159)配列番号159で示される塩基配列
    (160)配列番号160で示される塩基配列
    (161)配列番号161で示される塩基配列
    (162)配列番号162で示される塩基配列
    (163)配列番号163で示される塩基配列
    (164)配列番号164で示される塩基配列
    (165)配列番号165で示される塩基配列
    (166)配列番号166で示される塩基配列
    (167)配列番号167で示される塩基配列
    (168)配列番号168で示される塩基配列
    (169)配列番号169で示される塩基配列
    (170)配列番号170で示される塩基配列
    (171)配列番号171で示される塩基配列
    (172)配列番号172で示される塩基配列
    (173)配列番号173で示される塩基配列
    (174)配列番号174で示される塩基配列
    (175)配列番号175で示される塩基配列
    (176)配列番号176で示される塩基配列
    (177)配列番号177で示される塩基配列
    (178)配列番号178で示される塩基配列
    (179)配列番号179で示される塩基配列
    (180)配列番号180で示される塩基配列
    (181)配列番号181で示される塩基配列
    (182)配列番号182で示される塩基配列
    (183)配列番号183で示される塩基配列
    (184)配列番号184で示される塩基配列
    (185)配列番号185で示される塩基配列
    (186)配列番号186で示される塩基配列
    (187)配列番号187で示される塩基配列
    (188)配列番号188で示される塩基配列
    (189)配列番号189で示される塩基配列
    (190)配列番号190で示される塩基配列
    (191)配列番号191で示される塩基配列
    (192)配列番号192で示される塩基配列
    (193)配列番号193で示される塩基配列
    (194)配列番号194で示される塩基配列
    (195)配列番号195で示される塩基配列
    (196)配列番号196で示される塩基配列
    (197)配列番号197で示される塩基配列
    (198)配列番号198で示される塩基配列
    (199)配列番号199で示される塩基配列
    (200)配列番号200で示される塩基配列
    (201)配列番号201で示される塩基配列
    (202)配列番号202で示される塩基配列
    (203)配列番号203で示される塩基配列
    (204)配列番号204で示される塩基配列
    (205)配列番号205で示される塩基配列
    (206)配列番号206で示される塩基配列
    (207)配列番号207で示される塩基配列
    (208)配列番号208で示される塩基配列
    (209)配列番号209で示される塩基配列
    (210)配列番号210で示される塩基配列
    (211)配列番号211で示される塩基配列
    (212)配列番号212で示される塩基配列
    (213)配列番号213で示される塩基配列
    (214)配列番号214で示される塩基配列
    (215)配列番号215で示される塩基配列
    (216)配列番号216で示される塩基配列
    (217)配列番号217で示される塩基配列
    (218)配列番号218で示される塩基配列
    (219)配列番号219で示される塩基配列
    (220)配列番号220で示される塩基配列
    (221)配列番号221で示される塩基配列
    (222)配列番号222で示される塩基配列
    (223)配列番号223で示される塩基配列
    (224)配列番号224で示される塩基配列
    (225)配列番号225で示される塩基配列
    (226)配列番号226で示される塩基配列
    (227)配列番号227で示される塩基配列
    (228)配列番号228で示される塩基配列
    (229)配列番号229で示される塩基配列
    (230)配列番号230で示される塩基配列
  2. 検体が、幹細胞、胚性幹細胞、心臓組織細胞、脳組織細胞、神経組織細胞、筋組織細胞、骨格組織細胞、妊娠非ヒト動物個体又は非ヒト胎児動物個体である請求項1に記載の方法。
  3. 遺伝子の発現レベルの測定が、転写産物量又は翻訳産物量の測定によりなされる請求項1又は2に記載の方法。
  4. 遺伝子の発現レベルの対照値が、該被験化学物質に接触していない非ヒト哺乳動物個体又は哺乳動物細胞由来の検体における該遺伝子の発現レベルの測定値である請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法により評価された化学物質が有する発生毒性のレベルに基づいて、発生毒性を有する化学物質を選抜する工程を更に有する発生毒性を有する化学物質の探索方法。
  6. 化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
    (1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において被験化学物質に接触した該組織細胞における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現レベルを測定する第A工程と、
    (2)第A工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定する第B工程と、
    (3)第B工程で特定された遺伝子を取得する第C工程と、
    を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
    (1) 配列番号1で示される塩基配列
    (2) 配列番号2で示される塩基配列
    (3) 配列番号3で示される塩基配列
    (4) 配列番号4で示される塩基配列
    (5) 配列番号5で示される塩基配列
    (6) 配列番号6で示される塩基配列
    (7) 配列番号7で示される塩基配列
    (8) 配列番号8で示される塩基配列
    (9) 配列番号9で示される塩基配列
    (10)配列番号10で示される塩基配列
    (11)配列番号11で示される塩基配列
    (12)配列番号12で示される塩基配列
    (13)配列番号13で示される塩基配列
    (14)配列番号14で示される塩基配列
    (15)配列番号15で示される塩基配列
    (16)配列番号16で示される塩基配列
    (17)配列番号17で示される塩基配列
    (18)配列番号18で示される塩基配列
    (19)配列番号19で示される塩基配列
    (20)配列番号20で示される塩基配列
    (21)配列番号21で示される塩基配列
    (22)配列番号22で示される塩基配列
    (23)配列番号23で示される塩基配列
    (24)配列番号24で示される塩基配列
    (25)配列番号25で示される塩基配列
    (26)配列番号26で示される塩基配列
    (27)配列番号27で示される塩基配列
    (28)配列番号28で示される塩基配列
    (29)配列番号29で示される塩基配列
    (30)配列番号30で示される塩基配列
    (31)配列番号31で示される塩基配列
    (32)配列番号32で示される塩基配列
    (33)配列番号33で示される塩基配列
    (34)配列番号34で示される塩基配列
    (35)配列番号35で示される塩基配列
    (36)配列番号36で示される塩基配列
    (37)配列番号37で示される塩基配列
    (38)配列番号38で示される塩基配列
    (39)配列番号39で示される塩基配列
    (40)配列番号40で示される塩基配列
    (41)配列番号41で示される塩基配列
    (42)配列番号42で示される塩基配列
    (43)配列番号43で示される塩基配列
    (44)配列番号44で示される塩基配列
    (45)配列番号45で示される塩基配列
    (46)配列番号46で示される塩基配列
    (47)配列番号47で示される塩基配列
    (48)配列番号48で示される塩基配列
    (49)配列番号49で示される塩基配列
    (50)配列番号50で示される塩基配列
    (51)配列番号51で示される塩基配列
    (52)配列番号52で示される塩基配列
    (53)配列番号53で示される塩基配列
    (54)配列番号54で示される塩基配列
    (55)配列番号55で示される塩基配列
    (56)配列番号56で示される塩基配列
    (57)配列番号57で示される塩基配列
    (58)配列番号58で示される塩基配列
    (59)配列番号59で示される塩基配列
    (60)配列番号60で示される塩基配列
    (61)配列番号61で示される塩基配列
    (62)配列番号62で示される塩基配列
    (63)配列番号63で示される塩基配列
    (64)配列番号64で示される塩基配列
    (65)配列番号65で示される塩基配列
    (66)配列番号66で示される塩基配列
    (67)配列番号67で示される塩基配列
    (68)配列番号68で示される塩基配列
    (69)配列番号69で示される塩基配列
    (70)配列番号70で示される塩基配列
    (71)配列番号71で示される塩基配列
    (72)配列番号72で示される塩基配列
    (73)配列番号73で示される塩基配列
    (74)配列番号74で示される塩基配列
    (75)配列番号75で示される塩基配列
    (76)配列番号76で示される塩基配列
    (77)配列番号77で示される塩基配列
    (78)配列番号78で示される塩基配列
    (101)配列番号101で示される塩基配列
    (102)配列番号102で示される塩基配列
    (103)配列番号103で示される塩基配列
    (104)配列番号104で示される塩基配列
    (105)配列番号105で示される塩基配列
    (106)配列番号106で示される塩基配列
    (107)配列番号107で示される塩基配列
    (108)配列番号108で示される塩基配列
    (109)配列番号109で示される塩基配列
    (110)配列番号110で示される塩基配列
    (111)配列番号111で示される塩基配列
    (112)配列番号112で示される塩基配列
    (113)配列番号113で示される塩基配列
    (114)配列番号114で示される塩基配列
    (115)配列番号115で示される塩基配列
    (116)配列番号116で示される塩基配列
    (117)配列番号117で示される塩基配列
    (118)配列番号118で示される塩基配列
    (119)配列番号119で示される塩基配列
    (120)配列番号120で示される塩基配列
    (121)配列番号121で示される塩基配列
    (122)配列番号122で示される塩基配列
    (123)配列番号123で示される塩基配列
    (124)配列番号124で示される塩基配列
    (125)配列番号125で示される塩基配列
    (126)配列番号126で示される塩基配列
    (127)配列番号127で示される塩基配列
    (128)配列番号128で示される塩基配列
    (129)配列番号129で示される塩基配列
    (130)配列番号130で示される塩基配列
    (131)配列番号131で示される塩基配列
    (132)配列番号132で示される塩基配列
    (133)配列番号133で示される塩基配列
    (134)配列番号134で示される塩基配列
    (135)配列番号135で示される塩基配列
    (136)配列番号136で示される塩基配列
    (137)配列番号137で示される塩基配列
    (138)配列番号138で示される塩基配列
    (139)配列番号139で示される塩基配列
    (140)配列番号140で示される塩基配列
    (141)配列番号141で示される塩基配列
    (142)配列番号142で示される塩基配列
    (143)配列番号143で示される塩基配列
    (144)配列番号144で示される塩基配列
    (145)配列番号145で示される塩基配列
    (146)配列番号146で示される塩基配列
    (147)配列番号147で示される塩基配列
    (148)配列番号148で示される塩基配列
    (149)配列番号149で示される塩基配列
    (150)配列番号150で示される塩基配列
    (151)配列番号151で示される塩基配列
    (152)配列番号152で示される塩基配列
    (153)配列番号153で示される塩基配列
    (154)配列番号154で示される塩基配列
    (155)配列番号155で示される塩基配列
    (156)配列番号156で示される塩基配列
    (157)配列番号157で示される塩基配列
    (158)配列番号158で示される塩基配列
    (159)配列番号159で示される塩基配列
    (160)配列番号160で示される塩基配列
    (161)配列番号161で示される塩基配列
    (162)配列番号162で示される塩基配列
    (163)配列番号163で示される塩基配列
    (164)配列番号164で示される塩基配列
    (165)配列番号165で示される塩基配列
    (166)配列番号166で示される塩基配列
    (167)配列番号167で示される塩基配列
    (168)配列番号168で示される塩基配列
    (169)配列番号169で示される塩基配列
    (170)配列番号170で示される塩基配列
    (171)配列番号171で示される塩基配列
    (172)配列番号172で示される塩基配列
    (173)配列番号173で示される塩基配列
    (174)配列番号174で示される塩基配列
    (175)配列番号175で示される塩基配列
    (176)配列番号176で示される塩基配列
    (177)配列番号177で示される塩基配列
    (178)配列番号178で示される塩基配列
    (179)配列番号179で示される塩基配列
    (180)配列番号180で示される塩基配列
    (181)配列番号181で示される塩基配列
    (182)配列番号182で示される塩基配列
    (183)配列番号183で示される塩基配列
    (184)配列番号184で示される塩基配列
    (185)配列番号185で示される塩基配列
    (186)配列番号186で示される塩基配列
    (187)配列番号187で示される塩基配列
    (188)配列番号188で示される塩基配列
    (189)配列番号189で示される塩基配列
    (190)配列番号190で示される塩基配列
    (191)配列番号191で示される塩基配列
    (192)配列番号192で示される塩基配列
    (193)配列番号193で示される塩基配列
    (194)配列番号194で示される塩基配列
    (195)配列番号195で示される塩基配列
    (196)配列番号196で示される塩基配列
    (197)配列番号197で示される塩基配列
    (198)配列番号198で示される塩基配列
    (199)配列番号199で示される塩基配列
    (200)配列番号200で示される塩基配列
    (201)配列番号201で示される塩基配列
    (202)配列番号202で示される塩基配列
    (203)配列番号203で示される塩基配列
    (204)配列番号204で示される塩基配列
    (205)配列番号205で示される塩基配列
    (206)配列番号206で示される塩基配列
    (207)配列番号207で示される塩基配列
    (208)配列番号208で示される塩基配列
    (209)配列番号209で示される塩基配列
    (210)配列番号210で示される塩基配列
    (211)配列番号211で示される塩基配列
    (212)配列番号212で示される塩基配列
    (213)配列番号213で示される塩基配列
    (214)配列番号214で示される塩基配列
    (215)配列番号215で示される塩基配列
    (216)配列番号216で示される塩基配列
    (217)配列番号217で示される塩基配列
    (218)配列番号218で示される塩基配列
    (219)配列番号219で示される塩基配列
    (220)配列番号220で示される塩基配列
    (221)配列番号221で示される塩基配列
    (222)配列番号222で示される塩基配列
    (223)配列番号223で示される塩基配列
    (224)配列番号224で示される塩基配列
    (225)配列番号225で示される塩基配列
    (226)配列番号226で示される塩基配列
    (227)配列番号227で示される塩基配列
    (228)配列番号228で示される塩基配列
    (229)配列番号229で示される塩基配列
    (230)配列番号230で示される塩基配列
  7. 化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法であって、
    (1)幹細胞を特定の組織細胞に分化させる過程において、該分化過程における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子の発現変動を測定し、変動する遺伝子を特定するA工程と、
    (2)第A工程で特定した遺伝子について、被験化学物質に接触した該組織細胞における遺伝子の発現レベルを測定する第B工程と、
    (3)第B工程における遺伝子の発現レベルの測定値を該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて該被験化学物質に特徴的な変動を示す別の遺伝子を特定し取得する第C工程と、
    を有することを特徴とする化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子の取得方法。
    (1) 配列番号1で示される塩基配列
    (2) 配列番号2で示される塩基配列
    (3) 配列番号3で示される塩基配列
    (4) 配列番号4で示される塩基配列
    (5) 配列番号5で示される塩基配列
    (6) 配列番号6で示される塩基配列
    (7) 配列番号7で示される塩基配列
    (8) 配列番号8で示される塩基配列
    (9) 配列番号9で示される塩基配列
    (10)配列番号10で示される塩基配列
    (11)配列番号11で示される塩基配列
    (12)配列番号12で示される塩基配列
    (13)配列番号13で示される塩基配列
    (14)配列番号14で示される塩基配列
    (15)配列番号15で示される塩基配列
    (16)配列番号16で示される塩基配列
    (17)配列番号17で示される塩基配列
    (18)配列番号18で示される塩基配列
    (19)配列番号19で示される塩基配列
    (20)配列番号20で示される塩基配列
    (21)配列番号21で示される塩基配列
    (22)配列番号22で示される塩基配列
    (23)配列番号23で示される塩基配列
    (24)配列番号24で示される塩基配列
    (25)配列番号25で示される塩基配列
    (26)配列番号26で示される塩基配列
    (27)配列番号27で示される塩基配列
    (28)配列番号28で示される塩基配列
    (29)配列番号29で示される塩基配列
    (30)配列番号30で示される塩基配列
    (31)配列番号31で示される塩基配列
    (32)配列番号32で示される塩基配列
    (33)配列番号33で示される塩基配列
    (34)配列番号34で示される塩基配列
    (35)配列番号35で示される塩基配列
    (36)配列番号36で示される塩基配列
    (37)配列番号37で示される塩基配列
    (38)配列番号38で示される塩基配列
    (39)配列番号39で示される塩基配列
    (40)配列番号40で示される塩基配列
    (41)配列番号41で示される塩基配列
    (42)配列番号42で示される塩基配列
    (43)配列番号43で示される塩基配列
    (44)配列番号44で示される塩基配列
    (45)配列番号45で示される塩基配列
    (46)配列番号46で示される塩基配列
    (47)配列番号47で示される塩基配列
    (48)配列番号48で示される塩基配列
    (49)配列番号49で示される塩基配列
    (50)配列番号50で示される塩基配列
    (51)配列番号51で示される塩基配列
    (52)配列番号52で示される塩基配列
    (53)配列番号53で示される塩基配列
    (54)配列番号54で示される塩基配列
    (55)配列番号55で示される塩基配列
    (56)配列番号56で示される塩基配列
    (57)配列番号57で示される塩基配列
    (58)配列番号58で示される塩基配列
    (59)配列番号59で示される塩基配列
    (60)配列番号60で示される塩基配列
    (61)配列番号61で示される塩基配列
    (62)配列番号62で示される塩基配列
    (63)配列番号63で示される塩基配列
    (64)配列番号64で示される塩基配列
    (65)配列番号65で示される塩基配列
    (66)配列番号66で示される塩基配列
    (67)配列番号67で示される塩基配列
    (68)配列番号68で示される塩基配列
    (69)配列番号69で示される塩基配列
    (70)配列番号70で示される塩基配列
    (71)配列番号71で示される塩基配列
    (72)配列番号72で示される塩基配列
    (73)配列番号73で示される塩基配列
    (74)配列番号74で示される塩基配列
    (75)配列番号75で示される塩基配列
    (76)配列番号76で示される塩基配列
    (77)配列番号77で示される塩基配列
    (78)配列番号78で示される塩基配列
    (101)配列番号101で示される塩基配列
    (102)配列番号102で示される塩基配列
    (103)配列番号103で示される塩基配列
    (104)配列番号104で示される塩基配列
    (105)配列番号105で示される塩基配列
    (106)配列番号106で示される塩基配列
    (107)配列番号107で示される塩基配列
    (108)配列番号108で示される塩基配列
    (109)配列番号109で示される塩基配列
    (110)配列番号110で示される塩基配列
    (111)配列番号111で示される塩基配列
    (112)配列番号112で示される塩基配列
    (113)配列番号113で示される塩基配列
    (114)配列番号114で示される塩基配列
    (115)配列番号115で示される塩基配列
    (116)配列番号116で示される塩基配列
    (117)配列番号117で示される塩基配列
    (118)配列番号118で示される塩基配列
    (119)配列番号119で示される塩基配列
    (120)配列番号120で示される塩基配列
    (121)配列番号121で示される塩基配列
    (122)配列番号122で示される塩基配列
    (123)配列番号123で示される塩基配列
    (124)配列番号124で示される塩基配列
    (125)配列番号125で示される塩基配列
    (126)配列番号126で示される塩基配列
    (127)配列番号127で示される塩基配列
    (128)配列番号128で示される塩基配列
    (129)配列番号129で示される塩基配列
    (130)配列番号130で示される塩基配列
    (131)配列番号131で示される塩基配列
    (132)配列番号132で示される塩基配列
    (133)配列番号133で示される塩基配列
    (134)配列番号134で示される塩基配列
    (135)配列番号135で示される塩基配列
    (136)配列番号136で示される塩基配列
    (137)配列番号137で示される塩基配列
    (138)配列番号138で示される塩基配列
    (139)配列番号139で示される塩基配列
    (140)配列番号140で示される塩基配列
    (141)配列番号141で示される塩基配列
    (142)配列番号142で示される塩基配列
    (143)配列番号143で示される塩基配列
    (144)配列番号144で示される塩基配列
    (145)配列番号145で示される塩基配列
    (146)配列番号146で示される塩基配列
    (147)配列番号147で示される塩基配列
    (148)配列番号148で示される塩基配列
    (149)配列番号149で示される塩基配列
    (150)配列番号150で示される塩基配列
    (151)配列番号151で示される塩基配列
    (152)配列番号152で示される塩基配列
    (153)配列番号153で示される塩基配列
    (154)配列番号154で示される塩基配列
    (155)配列番号155で示される塩基配列
    (156)配列番号156で示される塩基配列
    (157)配列番号157で示される塩基配列
    (158)配列番号158で示される塩基配列
    (159)配列番号159で示される塩基配列
    (160)配列番号160で示される塩基配列
    (161)配列番号161で示される塩基配列
    (162)配列番号162で示される塩基配列
    (163)配列番号163で示される塩基配列
    (164)配列番号164で示される塩基配列
    (165)配列番号165で示される塩基配列
    (166)配列番号166で示される塩基配列
    (167)配列番号167で示される塩基配列
    (168)配列番号168で示される塩基配列
    (169)配列番号169で示される塩基配列
    (170)配列番号170で示される塩基配列
    (171)配列番号171で示される塩基配列
    (172)配列番号172で示される塩基配列
    (173)配列番号173で示される塩基配列
    (174)配列番号174で示される塩基配列
    (175)配列番号175で示される塩基配列
    (176)配列番号176で示される塩基配列
    (177)配列番号177で示される塩基配列
    (178)配列番号178で示される塩基配列
    (179)配列番号179で示される塩基配列
    (180)配列番号180で示される塩基配列
    (181)配列番号181で示される塩基配列
    (182)配列番号182で示される塩基配列
    (183)配列番号183で示される塩基配列
    (184)配列番号184で示される塩基配列
    (185)配列番号185で示される塩基配列
    (186)配列番号186で示される塩基配列
    (187)配列番号187で示される塩基配列
    (188)配列番号188で示される塩基配列
    (189)配列番号189で示される塩基配列
    (190)配列番号190で示される塩基配列
    (191)配列番号191で示される塩基配列
    (192)配列番号192で示される塩基配列
    (193)配列番号193で示される塩基配列
    (194)配列番号194で示される塩基配列
    (195)配列番号195で示される塩基配列
    (196)配列番号196で示される塩基配列
    (197)配列番号197で示される塩基配列
    (198)配列番号198で示される塩基配列
    (199)配列番号199で示される塩基配列
    (200)配列番号200で示される塩基配列
    (201)配列番号201で示される塩基配列
    (202)配列番号202で示される塩基配列
    (203)配列番号203で示される塩基配列
    (204)配列番号204で示される塩基配列
    (205)配列番号205で示される塩基配列
    (206)配列番号206で示される塩基配列
    (207)配列番号207で示される塩基配列
    (208)配列番号208で示される塩基配列
    (209)配列番号209で示される塩基配列
    (210)配列番号210で示される塩基配列
    (211)配列番号211で示される塩基配列
    (212)配列番号212で示される塩基配列
    (213)配列番号213で示される塩基配列
    (214)配列番号214で示される塩基配列
    (215)配列番号215で示される塩基配列
    (216)配列番号216で示される塩基配列
    (217)配列番号217で示される塩基配列
    (218)配列番号218で示される塩基配列
    (219)配列番号219で示される塩基配列
    (220)配列番号220で示される塩基配列
    (221)配列番号221で示される塩基配列
    (222)配列番号222で示される塩基配列
    (223)配列番号223で示される塩基配列
    (224)配列番号224で示される塩基配列
    (225)配列番号225で示される塩基配列
    (226)配列番号226で示される塩基配列
    (227)配列番号227で示される塩基配列
    (228)配列番号228で示される塩基配列
    (229)配列番号229で示される塩基配列
    (230)配列番号230で示される塩基配列
  8. 請求項1に記載の方法における以下に示される塩基配列のいずれかを有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子の化学物質が有する発生毒性を予測するためのマーカー遺伝子としての使用方法。
    (1) 配列番号1で示される塩基配列
    (2) 配列番号2で示される塩基配列
    (3) 配列番号3で示される塩基配列
    (4) 配列番号4で示される塩基配列
    (5) 配列番号5で示される塩基配列
    (6) 配列番号6で示される塩基配列
    (7) 配列番号7で示される塩基配列
    (8) 配列番号8で示される塩基配列
    (9) 配列番号9で示される塩基配列
    (10)配列番号10で示される塩基配列
    (11)配列番号11で示される塩基配列
    (12)配列番号12で示される塩基配列
    (13)配列番号13で示される塩基配列
    (14)配列番号14で示される塩基配列
    (15)配列番号15で示される塩基配列
    (16)配列番号16で示される塩基配列
    (17)配列番号17で示される塩基配列
    (18)配列番号18で示される塩基配列
    (19)配列番号19で示される塩基配列
    (20)配列番号20で示される塩基配列
    (21)配列番号21で示される塩基配列
    (22)配列番号22で示される塩基配列
    (23)配列番号23で示される塩基配列
    (24)配列番号24で示される塩基配列
    (25)配列番号25で示される塩基配列
    (26)配列番号26で示される塩基配列
    (27)配列番号27で示される塩基配列
    (28)配列番号28で示される塩基配列
    (29)配列番号29で示される塩基配列
    (30)配列番号30で示される塩基配列
    (31)配列番号31で示される塩基配列
    (32)配列番号32で示される塩基配列
    (33)配列番号33で示される塩基配列
    (34)配列番号34で示される塩基配列
    (35)配列番号35で示される塩基配列
    (36)配列番号36で示される塩基配列
    (37)配列番号37で示される塩基配列
    (38)配列番号38で示される塩基配列
    (39)配列番号39で示される塩基配列
    (40)配列番号40で示される塩基配列
    (41)配列番号41で示される塩基配列
    (42)配列番号42で示される塩基配列
    (43)配列番号43で示される塩基配列
    (44)配列番号44で示される塩基配列
    (45)配列番号45で示される塩基配列
    (46)配列番号46で示される塩基配列
    (47)配列番号47で示される塩基配列
    (48)配列番号48で示される塩基配列
    (49)配列番号49で示される塩基配列
    (50)配列番号50で示される塩基配列
    (51)配列番号51で示される塩基配列
    (52)配列番号52で示される塩基配列
    (53)配列番号53で示される塩基配列
    (54)配列番号54で示される塩基配列
    (55)配列番号55で示される塩基配列
    (56)配列番号56で示される塩基配列
    (57)配列番号57で示される塩基配列
    (58)配列番号58で示される塩基配列
    (59)配列番号59で示される塩基配列
    (60)配列番号60で示される塩基配列
    (61)配列番号61で示される塩基配列
    (62)配列番号62で示される塩基配列
    (63)配列番号63で示される塩基配列
    (64)配列番号64で示される塩基配列
    (65)配列番号65で示される塩基配列
    (66)配列番号66で示される塩基配列
    (67)配列番号67で示される塩基配列
    (68)配列番号68で示される塩基配列
    (69)配列番号69で示される塩基配列
    (70)配列番号70で示される塩基配列
    (71)配列番号71で示される塩基配列
    (72)配列番号72で示される塩基配列
    (73)配列番号73で示される塩基配列
    (74)配列番号74で示される塩基配列
    (75)配列番号75で示される塩基配列
    (76)配列番号76で示される塩基配列
    (77)配列番号77で示される塩基配列
    (78)配列番号78で示される塩基配列
    (101)配列番号101で示される塩基配列
    (102)配列番号102で示される塩基配列
    (103)配列番号103で示される塩基配列
    (104)配列番号104で示される塩基配列
    (105)配列番号105で示される塩基配列
    (106)配列番号106で示される塩基配列
    (107)配列番号107で示される塩基配列
    (108)配列番号108で示される塩基配列
    (109)配列番号109で示される塩基配列
    (110)配列番号110で示される塩基配列
    (111)配列番号111で示される塩基配列
    (112)配列番号112で示される塩基配列
    (113)配列番号113で示される塩基配列
    (114)配列番号114で示される塩基配列
    (115)配列番号115で示される塩基配列
    (116)配列番号116で示される塩基配列
    (117)配列番号117で示される塩基配列
    (118)配列番号118で示される塩基配列
    (119)配列番号119で示される塩基配列
    (120)配列番号120で示される塩基配列
    (121)配列番号121で示される塩基配列
    (122)配列番号122で示される塩基配列
    (123)配列番号123で示される塩基配列
    (124)配列番号124で示される塩基配列
    (125)配列番号125で示される塩基配列
    (126)配列番号126で示される塩基配列
    (127)配列番号127で示される塩基配列
    (128)配列番号128で示される塩基配列
    (129)配列番号129で示される塩基配列
    (130)配列番号130で示される塩基配列
    (131)配列番号131で示される塩基配列
    (132)配列番号132で示される塩基配列
    (133)配列番号133で示される塩基配列
    (134)配列番号134で示される塩基配列
    (135)配列番号135で示される塩基配列
    (136)配列番号136で示される塩基配列
    (137)配列番号137で示される塩基配列
    (138)配列番号138で示される塩基配列
    (139)配列番号139で示される塩基配列
    (140)配列番号140で示される塩基配列
    (141)配列番号141で示される塩基配列
    (142)配列番号142で示される塩基配列
    (143)配列番号143で示される塩基配列
    (144)配列番号144で示される塩基配列
    (145)配列番号145で示される塩基配列
    (146)配列番号146で示される塩基配列
    (147)配列番号147で示される塩基配列
    (148)配列番号148で示される塩基配列
    (149)配列番号149で示される塩基配列
    (150)配列番号150で示される塩基配列
    (151)配列番号151で示される塩基配列
    (152)配列番号152で示される塩基配列
    (153)配列番号153で示される塩基配列
    (154)配列番号154で示される塩基配列
    (155)配列番号155で示される塩基配列
    (156)配列番号156で示される塩基配列
    (157)配列番号157で示される塩基配列
    (158)配列番号158で示される塩基配列
    (159)配列番号159で示される塩基配列
    (160)配列番号160で示される塩基配列
    (161)配列番号161で示される塩基配列
    (162)配列番号162で示される塩基配列
    (163)配列番号163で示される塩基配列
    (164)配列番号164で示される塩基配列
    (165)配列番号165で示される塩基配列
    (166)配列番号166で示される塩基配列
    (167)配列番号167で示される塩基配列
    (168)配列番号168で示される塩基配列
    (169)配列番号169で示される塩基配列
    (170)配列番号170で示される塩基配列
    (171)配列番号171で示される塩基配列
    (172)配列番号172で示される塩基配列
    (173)配列番号173で示される塩基配列
    (174)配列番号174で示される塩基配列
    (175)配列番号175で示される塩基配列
    (176)配列番号176で示される塩基配列
    (177)配列番号177で示される塩基配列
    (178)配列番号178で示される塩基配列
    (179)配列番号179で示される塩基配列
    (180)配列番号180で示される塩基配列
    (181)配列番号181で示される塩基配列
    (182)配列番号182で示される塩基配列
    (183)配列番号183で示される塩基配列
    (184)配列番号184で示される塩基配列
    (185)配列番号185で示される塩基配列
    (186)配列番号186で示される塩基配列
    (187)配列番号187で示される塩基配列
    (188)配列番号188で示される塩基配列
    (189)配列番号189で示される塩基配列
    (190)配列番号190で示される塩基配列
    (191)配列番号191で示される塩基配列
    (192)配列番号192で示される塩基配列
    (193)配列番号193で示される塩基配列
    (194)配列番号194で示される塩基配列
    (195)配列番号195で示される塩基配列
    (196)配列番号196で示される塩基配列
    (197)配列番号197で示される塩基配列
    (198)配列番号198で示される塩基配列
    (199)配列番号199で示される塩基配列
    (200)配列番号200で示される塩基配列
    (201)配列番号201で示される塩基配列
    (202)配列番号202で示される塩基配列
    (203)配列番号203で示される塩基配列
    (204)配列番号204で示される塩基配列
    (205)配列番号205で示される塩基配列
    (206)配列番号206で示される塩基配列
    (207)配列番号207で示される塩基配列
    (208)配列番号208で示される塩基配列
    (209)配列番号209で示される塩基配列
    (210)配列番号210で示される塩基配列
    (211)配列番号211で示される塩基配列
    (212)配列番号212で示される塩基配列
    (213)配列番号213で示される塩基配列
    (214)配列番号214で示される塩基配列
    (215)配列番号215で示される塩基配列
    (216)配列番号216で示される塩基配列
    (217)配列番号217で示される塩基配列
    (218)配列番号218で示される塩基配列
    (219)配列番号219で示される塩基配列
    (220)配列番号220で示される塩基配列
    (221)配列番号221で示される塩基配列
    (222)配列番号222で示される塩基配列
    (223)配列番号223で示される塩基配列
    (224)配列番号224で示される塩基配列
    (225)配列番号225で示される塩基配列
    (226)配列番号226で示される塩基配列
    (227)配列番号227で示される塩基配列
    (228)配列番号228で示される塩基配列
    (229)配列番号229で示される塩基配列
    (230)配列番号230で示される塩基配列
  9. 遺伝子がHand1遺伝子、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp2遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子またはPax6遺伝子である請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 請求項1〜5に記載の方法であって、遺伝子の発現レベルを、該遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを指標として測定する方法。
  11. 請求項9に記載の遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子を含む核酸構築物。
  12. 請求項11に記載の核酸構築物を含むベクター。
  13. 請求項11に記載の核酸構築物又は請求項12に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
  14. 宿主細胞が動物細胞である請求項13に記載の形質転換体。
  15. 宿主細胞が幹細胞である請求項13に記載の形質転換体。
  16. 宿主細胞が胚性幹細胞である請求項13に記載の形質転換体。
  17. 請求項11に記載の核酸構築物又は請求項12に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
  18. 請求項13〜16に記載の形質転換体の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
  19. 請求項11に記載の核酸構築物又は請求項12に記載のベクターが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
  20. 請求項19に記載の遺伝子改変非ヒト動物の、化学物質の発生毒性予測法への使用。
JP2009125077A 2008-06-03 2009-05-25 化学物質が有する発生毒性の予測方法 Active JP5428527B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009125077A JP5428527B2 (ja) 2008-06-03 2009-05-25 化学物質が有する発生毒性の予測方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008145433 2008-06-03
JP2008145433 2008-06-03
JP2009125077A JP5428527B2 (ja) 2008-06-03 2009-05-25 化学物質が有する発生毒性の予測方法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013250834A Division JP5910618B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法
JP2013250835A Division JP5910619B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2010011843A true JP2010011843A (ja) 2010-01-21
JP5428527B2 JP5428527B2 (ja) 2014-02-26

Family

ID=41398248

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009125077A Active JP5428527B2 (ja) 2008-06-03 2009-05-25 化学物質が有する発生毒性の予測方法
JP2013250834A Expired - Fee Related JP5910618B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法
JP2013250835A Active JP5910619B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013250834A Expired - Fee Related JP5910618B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法
JP2013250835A Active JP5910619B2 (ja) 2008-06-03 2013-12-04 化学物質が有する発生毒性の予測方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9783852B2 (ja)
EP (2) EP2302050B1 (ja)
JP (3) JP5428527B2 (ja)
AU (3) AU2009255027B2 (ja)
CA (1) CA2728556C (ja)
WO (1) WO2009148177A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012214603A (ja) * 2011-03-31 2012-11-08 Dainippon Toryo Co Ltd 活性エネルギー線硬化型インクジェットインク組成物
JP2013527751A (ja) * 2010-03-15 2013-07-04 ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティー 物質の非毒性を決定する方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110208516B (zh) * 2019-06-03 2021-07-30 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种化学品发育毒性检测方法
WO2021015611A1 (en) * 2019-07-19 2021-01-28 Toxys B.V. Methods to determine the effect of an agent on mammalian embryonic development.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531852A (ja) * 1998-12-09 2002-09-24 ビスタジェン インコーポレイテッド 胚様体を用いる毒性の分類

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1603701A (en) 1999-11-19 2001-05-30 Cold Spring Harbor Laboratory Transgenic mice expressing fluorescent protein under the control of the nestin promoter
US6780595B2 (en) * 2002-02-26 2004-08-24 Origene Technologies, Inc. Human Tbx20 gene and uses
AU2003217966A1 (en) 2002-03-07 2003-10-08 Licentia, Ltd. Lymphatic and blood endothelial cell genes
US20090328243A1 (en) 2003-07-08 2009-12-31 Andreas Ehlich Secreted proteins as markers for cell differentiation
DE102004037860A1 (de) 2004-08-04 2006-03-16 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Turmormarker zur Diagnose von Karzinomen und/oder davon abstammender Metastasen
WO2006116622A2 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 Emiliem Novel methods and devices for evaluating poisons
US20060292695A1 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Roslin Institute Methods and kits for drug screening and toxicity testing using promoter-reporter cells derived from embryonic stem cells
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
WO2008021288A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Johns Hopkins University Consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers
US20100248229A1 (en) * 2007-04-20 2010-09-30 Stempeutics Research Private Limited Invitro human embryonic model and a method thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531852A (ja) * 1998-12-09 2002-09-24 ビスタジェン インコーポレイテッド 胚様体を用いる毒性の分類

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6009032300; ADLER S., et al.: 'First steps in establishing a developmental toxicity test method based on human embryonic stem cells' Toxicol. In Vitro 22, 200802, pp.200-211 *
JPN6009032302; NEMETH K.A., et al.: 'Searching for biomarkers of developmental toxicity with microarrays: normal eye morphogenesis in rod' Toxicol. Appl. Pharmacol. 206, 2005, pp.219-228 *
JPN6009042714; VASICEK R., et al.: 'Expression of the human Hand1 gene in trophoblastic cells is transcriptionally regulated by activati' Gene 302, 2003, pp.115-127 *
JPN6013034305; SEILER, A., et al.: 'Improvement of an in vitro stem cell assay for development toxicity: the use of molecular endpoints' Reproductive Toxicology 18, 2004, pp.231-240 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013527751A (ja) * 2010-03-15 2013-07-04 ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティー 物質の非毒性を決定する方法
JP2012214603A (ja) * 2011-03-31 2012-11-08 Dainippon Toryo Co Ltd 活性エネルギー線硬化型インクジェットインク組成物

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009255027B2 (en) 2016-01-28
JP5428527B2 (ja) 2014-02-26
JP5910618B2 (ja) 2016-04-27
AU2016202635A1 (en) 2016-05-19
CA2728556C (en) 2020-04-14
AU2016202634A1 (en) 2016-05-19
CA2728556A1 (en) 2009-12-10
US20110167506A1 (en) 2011-07-07
EP3296396A1 (en) 2018-03-21
AU2016202635B2 (en) 2018-10-25
EP2302050B1 (en) 2018-04-18
AU2009255027A1 (en) 2009-12-10
EP2302050A1 (en) 2011-03-30
JP2014073131A (ja) 2014-04-24
JP2014073132A (ja) 2014-04-24
WO2009148177A1 (ja) 2009-12-10
US9783852B2 (en) 2017-10-10
EP2302050A4 (en) 2012-01-25
JP5910619B2 (ja) 2016-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Holm et al. Loss-and gain-of-function analyses reveal targets of Pax6 in the developing mouse telencephalon
Poon et al. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons
JP4814875B2 (ja) invitro分化細胞に基づく薬物発見のための検定
JP4862146B2 (ja) 細胞アレイとその使用
US20030224411A1 (en) Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
Neidhardt et al. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos
JP5002105B2 (ja) 内因性のmRNAタンパク質(mRNP)複合体の単離および特徴付けの方法
US20180251843A1 (en) Diagnostic transcriptomic biomarkers in inflammatory cardiomyopathies
JP2007532103A (ja) 非侵襲性生体外機能組織検定システム
JP5910618B2 (ja) 化学物質が有する発生毒性の予測方法
Takeuchi et al. Gene expression profiling of granule cells and Purkinje cells in the zebrafish cerebellum
Sørhus et al. Developmental transcriptomics in Atlantic haddock: Illuminating pattern formation and organogenesis in non-model vertebrates
Jung et al. Single-cell RNA sequencing revealed the heterogeneity of gonadal primordial germ cells in zebra finch (Taeniopygia guttata)
US6509153B1 (en) Genetic markers of toxicity preparation and uses
NL2019390B1 (en) Screening Method
Glassmann et al. Basic molecular fingerprinting of immature cerebellar cortical inhibitory interneurons and their precursors
US20050123966A1 (en) Diagnostic and prognostic methods and compositions for seizure- and plasticity-related disorders
KR102083408B1 (ko) 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법
KR101945433B1 (ko) 해수 산성화에 대응하는 말레이해파리 유전자 및 이를 이용한 말레이해파리의 생리 또는 대사 변화 예측방법
KR20180133180A (ko) 성숙 췌장 베타 세포 바이오마커 및 이를 사용하는 방법
Augustin et al. Pantr2, a trans-acting lncRNA, modulates the differentiation potential of neural progenitors in vivo
GB2434867A (en) Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
KR20180088602A (ko) 암에 공통적으로 관련되는 fbp 유전자를 포함하는 바이오마커 및 이의 용도
Goetz The identification of effectors of retinal cell fate determination through single cell transcriptomics
Jiang Transcriptional regulation of axonal pathfinding: Foxb1 and the mammillothalamic tract

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110912

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130716

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130913

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20131105

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20131118

R151 Written notification of patent or utility model registration

Ref document number: 5428527

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350