ES2568702B1

ES2568702B1 - Método para el diagnóstico de artrosis

Info

Publication number: ES2568702B1
Application number: ES201431445A
Authority: ES
Inventors: Francisco J. BLANCO GARCÍA; Cristina Ruiz Romero; Carolina FERNÁNDEZ COSTA; José Luis CAPELO MARTÍNEZ; Florentino FERNÁNDEZ RIVEROLA; Miguel REBOIRO JATO
Original assignee: FUNDACION PROFESOR NOVOA SANTOS; Fund Profesor Novoa Santos; Servizo Galego de Saude SERGAS; Universidade de Vigo
Current assignee: FUNDACION PROFESOR NOVOA SANTOS; Fund Profesor Novoa Santos; Servizo Galego de Saude SERGAS; Universidade de Vigo
Priority date: 2014-10-01
Filing date: 2014-10-01
Publication date: 2017-02-13
Anticipated expiration: 2034-10-01
Also published as: CA2978169A1; US20180017555A1; WO2016051006A1; ES2781195T3; EP3236263A4; EP3236263B1; ES2568702A1; EP3236263A1

Abstract

Método para el diagnóstico de artrosis.#La presente invención se relaciona con un patrón peptídico característico de sujetos que padecen artrosis y el uso de dicho patrón peptídico en el diagnóstico de dicha enfermedad. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un método in vitro de diagnóstico y un kit para la puesta en práctica de dicho método.

Description

5

10

15

20

25

30

35

Metodo para el diagnostico de Artrosis DESCRIPCION

La presente invention se relaciona con un patron de peptidos caracteristico de sujetos que padecen artrosis y el uso de dicho patron en el diagnostico de dicha enfermedad. Por lo tanto, la presente invencion tambien se relaciona con un metodo in vitro de diagnostico y un kit para la puesta en practica de dicho metodo de diagnostico. Por tanto, la invencion pertenece al campo tecnico del diagnostico de enfermedades, en particular, el diagnostico de enfermedades reumaticas.

ESTADO DE LA TECNICA

La artrosis es una patologia reumatica que lesiona el cartflago articular. Las articulaciones son los componentes del esqueleto que nos permiten el movimiento y, por tanto, nuestra autonomia funcional, y estan formadas por la union de dos huesos a traves de la capsula articular. En el interior de las mismas existe, generalmente, un fluido llamado flquido sinovial que es producido por la membrana sinovial. Los extremos oseos que se unen para formar la articulation estan recubiertos por el cartflago articular.

Cuando este cartflago articular se lesiona, se produce dolor, rigidez e incapacidad funcional. Normalmente la artrosis se localiza en la columna cervical y lumbar, y en algunas articulaciones del hombro y de los dedos de las manos, la cadera, la rodilla y la articulacion del comienzo del dedo gordo del pie.

Esta enfermedad reumatica no es hereditaria en el sentido de que no hay un patron de herencia fijo como puede ser el caso de la hemofilia, pero si tiene un componente de riesgo genetico que, junto con otros factores, puede hacer que aparezca con mas facilidad en los sujetos que tienen una historia familiar. En Espana, la artrosis afecta al 10% de la poblacion general, representando casi la cuarta parte del total de pacientes atendidos en las consultas de los reumatologos.

Actualmente, el diagnostico de la artrosis se basa en la evaluation de los smtomas y en la exploration fisica que realiza el medico al paciente. El medico valora que smtomas tiene el enfermo, donde se localizan, como es el dolor, en que circunstancias mejora (con el reposo) o empeora (al subir o bajar escaleras, al abrir o cerrar grifos...). Tambien

5

10

15

20

25

30

35

interroga sobre que otras enfermedades padece el enfermo, que tratamientos esta recibiendo, y si el o algun familiar padecen o han padecido algun tipo de enfermedad reumatica, traumatismo o lesion articular previos.

Las radiografias permiten confirmar el diagnostico de artrosis, al poderse constatar en las articulaciones los cambios radiologicos tipicos de los procesos artrosicos. Mediante los estudios radiologicos se puede determinar de una forma mucho mas precisa la severidad de la artrosis.

Los analisis de sangre no tienen ninguna utilidad para diagnosticar la artrosis. Todos los resultados que se determinan son siempre normales, incluyendo las denominadas "pruebas reumaticas”, es decir, no llevan a pensar que dichos sujetos padecen la enfermedad. La unica indication para realizarlos es para confirmar con su normalidad el diagnostico de artrosis, descartando otras enfermedades reumaticas que si producen algunas alteraciones en los analisis de laboratorio. Por ejemplo, en las artritis estan alteradas la velocidad de sedimentation de la sangre, el factor reumatoide y otras pruebas reumaticas; en la gota, el acido urico esta alto, etc. Hasta la actualidad, no se ha identificado ningun marcador diagnostico en el suero o en el flquido sinovial de los pacientes que permita hacer un diagnostico o un seguimiento de la enfermedad.

No obstante, se estan realizando importante avances en el estudio de los denominados marcadores biologicos de la artrosis. Son productos que se liberan desde el cartflago articular al flquido sinovial, orina o sangre durante la smtesis y destruction del cartflago. Algunos de ellos son productos del queratan-sulfato, del condroitm sulfato, del acido hialuronico o la protema oligomerica de la matriz cartilaginosa (COMP). El aumento de los conocimientos sobre los marcadores bioquimicos de la artrosis permitiria un mejor diagnostico y una intervention mas temprana en el tratamiento de la enfermedad, ademas de facilitar el desarrollo de farmacos, iniciar las terapias mejoradas, permitir mejores opciones de medicamentos, ofrecer opciones de dosificacion seguras y finalmente disminuir los costos de atencion de salud. Por lo tanto, existe en el estado de la tecnica la necesidad de identificar marcadores de artrosis que permitan un diagnostico temprano de la enfermedad de una forma mas sencilla, fiable y segura.

5

10

15

20

25

30

35

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los autores de la presente invention han descubierto que los sujetos que padecen artrosis presentan un patron peptidico no presente en sujetos sanos, ni en sujetos que padecen otro tipo de enfermedades reumaticas, como la artritis psoriasica (APS) y la artritis reumatoide (AR), lo que convierte a dicho patron peptidico en una herramienta util para el diagnostico espetifico de la artrosis. Para obtener el mencionado patron, los autores partieron de muestras de suero procedentes de pacientes diagnosticados con artrosis y sobre el mismo llevaron a cabo una depletion quimica con ditiotrietol (DTT) y acetonitrilo (ACN), para despues digerir las protemas con tripsina acelerada con ultrasonidos. A continuation, los peptidos resultantes fueron retenidos en una punta comercial C18 y eluidos con diferentes cantidades de ACN. Finalmente, cada fraction de elucion se analizo por quintuplicado mediante espectrometria de masas MALDI- TOF/TOF (Ejemplo 1), obteniendo las masas de los peptidos caracteristicos del patron peptidico presentes en sujetos que padecen artrosis. La posterior validation del patron peptidico obtenido (Ejemplo 2), confirmo la utilidad de este patron en el diagnostico de la artrosis.

A continuacion, se describen los diferentes aspectos inventivos desarrollados por los inventores.

Patron peptidico de la invencion y sus usos

Los autores de la presente invencion han descubierto que pacientes con artrosis presentan un patron peptidico caracteristico el cual no esta presente ni en sujetos con enfermedades reumatoides distintas de la artrosis (como artritis psoriasica o artritis reumatoide) ni en sujetos sanos.

Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se relaciona con un patron peptidico, de aqu en adelante, patron peptidico de la invencion, que comprende los siguientes peptidos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.

En la presente invencion se entiende por "patron peptidico”, al conjunto o grupo de peptidos que estan presentes en una muestra biologica de un sujeto y que es

caracteristico de su estado fisiologico. En el contexto de la presente invencion, el patron peptidico aqu descrito es caracteristico de sujetos que padecen artrosis.

En la presente invencion se entiende por “peptido” a la molecula formada por la union 5 de varios aminoacidos mediante enlaces peptidicos y que presentan, aproximadamente, entre 2 y 100 aminoacidos. Orientativamente, si el peptido comprende entre aproximadamente 2 y 15 aminoacidos se denomina oligopeptido, y si comprende entre aproximadamente 16 y 100 aminoacidos se denomina polipeptido.

10 Tal como se muestra en los ejemplos incluidos en la presente description, el patron peptidico de la invencion ha sido obtenido mediante espectrometria de masas MALDI- TOF/TOF, por lo que los peptidos de la invencion, ademas de estar caracterizados por su secuencia espedfica de aminoacidos, tambien estan caracterizados por su valor masa/carga y su peso molecular [ver Tabla 1], los cuales son parametros estandar de 15 este tipo de tecnica.

Tabla 1. Valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometria de masas para cada peptido comprendido dentro del patron peptidico de la invencion. En la Tabla 1 se muestra tambien la secuencia peptidica de los peptidos que comprenden el patron 20 de la invencion.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 01: 1392,7526 1391,7526 1 QLTPYAQRMER

Peptido 02: 1532,8060 1531,806 2 QKWEAEPVYVQR

Peptido 03: 1758,9790 1757,979 3 ELQQRLEPYADQLR

Peptido 04: 1910,0176 1909,0176 4 LHELQEKLSPLGEEMR

Peptido 05: 2165,1272 2164,1272 5 QKLHELQEKLSPLGEEMR

Peptido 06: 2180,1445 2179,1445 6 LHELQEKLSPLGEEMRDR

Peptido 07: 2280,1501 2279,1501 7 DSFHLDEQFTVPVEMMQAR

Peptido 08: 2291,2260 2290,226 8 ARAHVDALRTHLAPYSDELR

Peptido 09: 2407,2880 2406,288 9 LHELQEKLSPLGEEMRDRAR

Peptido 10: 2436,2922 2435,2922 10 QKLHELQEKLSPLGEEMRDR

Peptido 11: 2663,4314 2662,4314 11 QKLHELQEKLSPLGEEMRDRAR

En una realization particular, el patron peptidico de la invention comprende, ademas, al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos que se muestran en la Tabla 2, que estan caracterizados tanto por su secuencia espedfica de aminoacidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular.

5

Tabla 2. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometria de masas para cada peptido adicional que puede usarse en

combination con el patron peptidico de la invencion.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 12: 871,502 870,502 12 VLNQELR

Peptido 13: 896,490 895,490 13 YLTWASR

Peptido 14: 961,627 960,627 14 GVTFLLRR

Peptido 15: 980,529 979,529 15 VGYVSGWGR

Peptido 16: 1019,604 1018,604 16 AFKAWAVAR

Peptido 17: 1108,588 1107,588 17 LQTDLSEFR

Peptido 18: 1117,669 1116,669 18 GFSPKDVLVR

Peptido 19: 1148,634 1147,634 19 DAVSAAFKGLK

Peptido 20: 1213,667 1212,667 20 WLQGSQELPR

Peptido 21: 1237,674 1236,674 21 LETPDFQLFK

Peptido 22: 1247,652 1246,652 22 LGMFNIQHCK

Peptido 23: 1249,655 1248,655 23 LICQATGFSPR

Peptido 24: 1255,716 1254,716 24 LRCLAPLEGAR

Peptido 25: 1263,683 1262,683 25 LGMFNIQHCK

Peptido 26: 1299,609 1298,609 26 WQEEMELYR

Peptido 27: 1380,780 1379,780 27 VQPYLDDFQKK

Peptido 28: 1403,749 1402,749 28 RLGMFNIQHCK

Peptido 29: 1449,800 1448,800 29 VVAGVANALAHKYH

Peptido 30: 1465,689 1464,689 30 DSGEGDFLAEGGGVR

Peptido 31: 1467,852 1466,852 31 VEPLRAELQEGAR

Peptido 32: 1470,813 1469,813 32 WLQGSQELPREK

Peptido 33: 1502,810 1501,810 33 VCPFAGILENGAVR

Peptido 34: 1518,710 1517,710 34 ADSGEGDFLAEGGGVR

Peptido 35: 1519,750 1518,750 35 ALYLQYTDETFR

Peptido 36: 1568,914 1567,914 36 LAARLEALKENGGAR

Peptido 37: 1569,907 1568,907 37 LAARLEALKENGGAR

Peptido 38: 1585,846 1584,846 38 THLAPYSDELRQR

Peptido 39: 1612,849 1611,849 39 LLDNWDSVTSTFSK

Peptido 40: 1641,892 1640,892 40 ITPNLAEFAFSLYR

Peptido 41: 1641,892 1640,892 41 AGDFLEANYMNLQR

Peptido 42: 1669,862 1668,862 42 VLGAFSDGLAHLDNLK

Peptido 43: 1706,931 1705,931 43 QKVEPLRAELQEGAR

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptldica

Peptido 44: 1707,875 1706,875 44 YVMLPVADQDQCIR

Peptido 45: 1736,970 1735,970 45 LSQRFPKAEFAEVSK

Peptido 46: 1743,882 1742,882 46 YAASSYLSLTPEQWK

Peptido 47: 1745,901 1744,901 47 YVGGQEHFAHLLILR

Peptido 48: 1771,885 1770,885 48 SLAELGGHLDQQVEEF

Peptido 49: 1786,909 1785,909 49 GLPGPPDVPDHAAYHPF

Peptido 50: 1810,992 1809,992 50 SYFEKSKEQLTPLIK

Peptido 51: 1815,922 1814,922 51 DSGRDYVSQFEGSALGK

Peptido 52: 1825,005 1824,005 52 ILGGHLDAKGSFPWQAK

Peptido 53: 1834,946 1833,946 53 VMPICLPSKDYAEVGR

Peptido 54: 1864,027 1863,027 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLR

Peptido 55: 1875,997 1874,997 55 VYACEVTHQGLSSPVTK

Peptido 56: 1876,017 1875,017 56 VTLTCVAPLSGVDFQLR

Peptido 57: 1884,000 1883,000 57 EIVLTQSPGTLSLSPGER

Peptido 58: 1899,060 1898,060 58 FNKPFVFLMIEQNTK

Peptido 59: 1906,873 1905,873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK

Peptido 60: 1922,877 1921,877 60 SEAEDASLLSFMQGYMK

Peptido 61: 1932,038 1931,038 61 SLHTLFGDKLCTVATLR

Peptido 62: 2012,011 2011,011 62 TFGSGEADCGLRPLFEKK

Peptido 63: 2020,138 2019,138 63 VLDAVRGSPAINVAVHVFR

Peptido 64: 2153,112 2152,112 64 SLEDKTERELLESYIDGR

Peptido 65: 2186,092 2185,092 65 LYHSEAFTVNFGDTEEAKK

Peptido 66: 2190,132 2189,132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK

Peptido 67: 2296,219 2295,219 67 TPGAAANLELIFVGPQHAGNYR

Peptido 68: 2315,195 2314,195 68 QSNNKYAASSYLSLTPEQWK

Peptido 69: 2344,169 2343,169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK

Peptido 70: 2348,245 2347,245 70 AHVDALRTHLAPYSDELRQR

Peptido 71: 2394,298 2393,298 71 LTPYADEFKVKIDQTVEELR

Peptido 72: 2409,281 2408,281 72 GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPGPI R

Peptido 73: 2565,322 2564,322 73 GPPGLPGLKGDPGVPGLPGAKGE VGADGV

Peptido 74: 2602,358 2601,358 74 AVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVV PR

Peptido 75: 2652,448 2651,448 75 TVRTPGAAANLELIFVGPQHAGNY R

Peptido 76: 2670,387 2669,387 76 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLK

Peptido 77: 2695,362 2694,362 77 QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR

Peptido 78: 2790,425 2789,425 78 YRSWVPHTFESELSDPVELLVAES

Peptido 79: 2940,755 2939,755 79 SASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLG ITK

En otra realization mas particular, el patron peptidico de la invention comprende, ademas, al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos que se muestran en la Tabla 3, que estan caracterizados tanto por su secuencia espedfica de aminoacidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los peptidos 5 mostrados en la Tabla 3 pueden usarse en combination con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos y sujetos normales. En otra realizacion mas preferida, los sujetos artrosicos muestran una presencia incrementada de los peptidos mostrados en la Tabla 3 respecto a los sujetos control sanos.

10 Tabla 3. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometria de masas para cada peptido adicional que puede usarse en combinacion con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos y sujetos normales.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 13: 896,490 895,490 13 YLTWASR

Peptido 14: 961,627 960,627 14 GVTFLLRR

Peptido 15: 980,529 979,529 15 VGYVSGWGR

Peptido 16: 1019,604 1018,604 16 AFKAWAVAR

Peptido 17: 1108,588 1107,588 17 LQTDLSEFR

Peptido 18: 1117,669 1116,669 18 GFSPKDVLVR

Peptido 19: 1148,634 1147,634 19 DAVSAAFKGLK

Peptido 20: 1213,667 1212,667 20 WLQGSQELPR

Peptido 21: 1237,674 1236,674 21 LETPDFQLFK

Peptido 24: 1255,716 1254,716 24 LRCLAPLEGAR

Peptido 28: 1403,749 1402,749 28 RLGMFNIQHCK

Peptido 32: 1470,813 1469,813 32 WLQGSQELPREK

Peptido 33: 1502,810 1501,810 33 VCPFAGILENGAVR

Peptido 36: 1568,914 1567,914 36 LAARLEALKENGGAR

Peptido 38: 1585,846 1584,846 38 THLAPYSDELRQR

Peptido 40: 1641,892 1640,892 40 ITPNLAEFAFSLYR

Peptido 41: 1641,892 1640,892 41 AGDFLEANYMNLQR

Peptido 42: 1669,862 1668,862 42 VLGAFSDGLAHLDNLK

Peptido 43: 1706,931 1705,931 43 QKVEPLRAELQEGAR

Peptido 51: 1815,922 1814,922 51 DSGRDYVSQFEGSALGK

Peptido 52: 1825,005 1824,005 52 ILGGHLDAKGSFPWQAK

Peptido 53: 1834,946 1833,946 53 VMPICLPSKDYAEVGR

Peptido 54: 1864,027 1863,027 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLR

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 55: 1875,997 1874,997 55 VYACEVTHQGLSSPVTK

Peptido 56: 1876,017 1875,017 56 VTLTCVAPLSGVDFQLR

Peptido 57: 1884,000 1883,000 57 EIVLTQSPGTLSLSPGER

Peptido 65: 2186,092 2185,092 65 LYHSEAFTVNFGDTEEAKK

Peptido 67: 2296,219 2295,219 67 TPGAAANLELIFVGPQHAGNYR

Peptido 68: 2315,195 2314,195 68 QSNNKYAASSYLSLTPEQWK

Peptido 70: 2348,245 2347,245 70 AHVDALRTHLAPYSDELRQR

Peptido 75: 2652,448 2651,448 75 TVRTPGAAANLELIFVGPQHAGNY R

Peptido 76: 2670,387 2669,387 76 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLK

Peptido 77: 2695,362 2694,362 77 QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR

Peptido 78: 2790,425 2789,425 78 YRSWVPHTFESELSDPVELLVAES

En otra realization mas preferida, el patron peptidico de la invention comprende, ademas, al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos que 5 se muestran en la Tabla 4, que estan caracterizados tanto por su secuencia espedfica de aminoacidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los peptidos mostrados en la Tabla 4 pueden usarse en combination con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos y sujetos normales. En otra realizacion preferida, los sujetos artrosicos muestran una presencia disminuida de los 10 peptidos mostrados en la Tabla 4 respecto a los sujetos control sanos.

Tabla 4. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometria de masas para cada peptido adicional que puede usarse en combinacion con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos 15 artrosicos y sujetos normales.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 12: 871,502 870,502 12 VLNQELR

Peptido 34: 1518,71 1517,71 34 ADSGEGDFLAEGGGVR

Peptido 50: 1810,992 1809,992 50 SYFEKSKEQLTPLIK

Peptido 60: 1922,877 1921,877 60 SEAEDASLLSFMQGYMK

Peptido 62: 2012,011 2011,011 62 TFGSGEADCGLRPLFEKK

Peptido 64: 2153,112 2152,112 64 SLEDKTERELLESYIDGR

Peptido 74: 2602,358 2601,358 74 AVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVVPR

En otra realization particular, el patron peptidico de la invention comprende, ademas, al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos que se muestran en la Tabla 5, que estan caracterizados tanto por su secuencia espedfica de aminoacidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los peptidos 5 mostrados en la Tabla 5 pueden usarse en combination con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.

Tabla 5. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por 10 espectrometria de masas para cada peptido adicional que puede usarse en

combinacion con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 22: 1247,652 1246,652 22 LGMFNIQHCK

Peptido 23: 1249,655 1248,655 23 LICQATGFSPR

Peptido 26: 1299,609 1298,609 26 WQEEMELYR

Peptido 30: 1465,689 1464,689 30 DSGEGDFLAEGGGVR

Peptido 31: 1467,852 1466,852 31 VEPLRAELQEGAR

Peptido 35: 1519,75 1518,75 35 ALYLQYTDETFR

Peptido 39: 1612,849 1611,849 39 LLDNWDSVTSTFSK

Peptido 45: 1736,97 1735,97 45 LSQRFPKAEFAEVSK

Peptido 46: 1743,882 1742,882 46 YAASSYLSLTPEQWK

Peptido 47: 1745,901 1744,901 47 YVGGQEHFAHLLILR

Peptido 48: 1771,885 1770,885 48 SLAELGGHLDQQVEEF

Peptido 58: 1899,060 1898,060 58 FNKPFVFLMIEQNTK

Peptido 59: 1906,873 1905,873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK

Peptido 61: 1932,038 1931,038 61 SLHTLFGDKLCTVATLR

Peptido 63: 2020,138 2019,138 63 VLDAVRGSPAINVAVHVFR

Peptido 66: 2190,132 2189,132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK

Peptido 69: 2344,169 2343,169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK

Peptido 71: 2394,298 2393,298 71 LTPYADEFKVKIDQTVEELR

Peptido 72: 2409,281 2408,281 72 GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPG PIR

Peptido 73: 2565,322 2564,322 73 GPPGLPGLKGDPGVPGLPGAKG EVGADGV

En otra realization particular, el patron peptidico de la invention comprende, ademas, al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en los peptidos que se muestran en la Tabla 6, que estan caracterizados tanto por su secuencia espedfica de aminoacidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los peptidos 5 mostrados en la Tabla 6 pueden usarse en combination con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis psoriasica.

Tabla 6. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por 10 espectrometria de masas para cada peptido adicional que puede usarse en

combinacion con el patron peptidico de la invencion para diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis psoriasica.

: Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO: Secuencia peptidica

Peptido 22: 1247,652 1246,652 22 LGMFNIQHCK

Peptido 25: 1263,683 1262,683 25 LGMFNIQHCK

Peptido 26: 1299,609 1298,609 26 WQEEMELYR

Peptido 27: 1380,78 1379,78 27 VQPYLDDFQKK

Peptido 29: 1449,8 1448,8 29 VVAGVANALAHKYH

Peptido 30: 1465,689 1464,689 30 DSGEGDFLAEGGGVR

Peptido 31: 1467,852 1466,852 31 VEPLRAELQEGAR

Peptido 37: 1569,907 1568,907 37 LAARLEALKENGGAR

Peptido 39: 1612,849 1611,849 39 LLDNWDSVTSTFSK

Peptido 46: 1743,882 1742,882 46 YAASSYLSLTPEQWK

Peptido 47: 1745,901 1744,901 47 YVGGQEHFAHLLILR

Peptido 48: 1771,885 1770,885 48 SLAELGGHLDQQVEEF

Peptido 49: 1786,909 1785,909 49 GLPGPPDVPDHAAYHPF

Peptido 58: 1899,060 1898,060 58 FNKPFVFLMIEQNTK

Peptido 59: 1906,873 1905,873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK

Peptido 66: 2190,132 2189,132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK

Peptido 69: 2344,169 2343,169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK

Peptido 79: 2940,755 2939,755 79 SASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQ LGITK

15 Los metodos y tecnicas para obtener patrones peptidicos a partir de una muestra son ampliamente conocidos en el estado de la tecnica, y seran explicados en detalle en la description del metodo de diagnostico de la invencion.

5

10

15

20

25

30

35

En otro aspecto, la invention tambien se relaciona con el uso del patron peptidico de la invention como marcador de diagnostico de artrosis en un sujeto.

Metodo de diagnostico de la invencion

En un aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar artrosis en un sujeto, o para monitorizar la eficacia de la terapia administrada a un sujeto que padece artrosis, de aqu en adelante "metodo de la invencion”, que comprende:

a) aislar la fraction proteica de una muestra biologica procedente del sujeto,

b) digerir la fraccion proteica obtenida en la etapa a) con tripsina, y

c) detectar la presencia o ausencia del patron peptidico de la invencion,

en donde si dicho patron peptidico es detectado, entonces el sujeto padece artrosis o la terapia administrada al sujeto no esta siendo eficaz.

En la presente invencion se entiende por "diagnostico” al procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosologica, smdrome, o cualquier condition de salud-enfermedad, mediante el analisis de una serie de parametros clmicos o smtomas caracteristicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clmicos semejantes. En la presente invencion la enfermedad, entidad nosologica o smdrome a detectar es la artrosis, y los parametros clmicos es el patron peptidico de la invencion.

En la presente invencion, se entiende por "artrosis” o "osteoartritis” a la enfermedad articular cronica ocasionada por el deterioro del cartflago hialino e hiperreactividad osteoblastica del hueso subcondral. En la presente invencion los terminos "artrosis” y "osteoartritis” son equivalentes y pueden emplearse indistintamente a lo largo de la misma. Como sabe el experto en la materia, la artrosis puede clasificarse en artrosis idiopatica y en artrosis secundaria (Modificada de Altman RC, Semin Arthritis Rheum 1991; 20:40-47).

La artrosis idiopatica (se desconoce el origen de la enfermedad) puede ser, localizada, por ejemplo, en manos, pies, caderas, columna, etc., o generalizada, en la que estan afectadas tres o mas areas articulares, tales como las articulaciones pequenas y la columna, las articulaciones grandes y columna, o mixta, que es una combination de las anteriores.

5

10

15

20

25

30

35

La artrosis secundaria se clasifica en enfermedades congenitas o del desarrollo (entre las que se incluyen, sin limitar a, la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de legg- calve, displasias oseas, etc.), enfermedades por deposito de calcio (entre las que se incluyen sin limitar artropatia por hidroxiapatita, artropatia destructiva y deposito de pirofosfato calcico), en enfermedades postraumaticas, en enfermedades del hueso y articulares (entre las que se incluyen, sin limitar a necrosis avascular, artritis reumatoide, artritis gotosa, artritis septica, enfermedad de Paget, osteopetrosis, osteocondritis), y enfermedades varias que tienen su origen en la artritis (entre las que se incluyen, sin limitar a, articulacion de Charcot, diabetes mellitus, acromegalia, hipotiroidismo, hiperparatiroidismo, enfermedad de Kashin-Beck, enfermedad de Caisson, etc.).

Por otro lado, la artrosis tambien puede clasificarse utilizando la escala KELLGREN Y LAWRENCE (K/L) radiologica, que clasifica a la artrosis en 5 grados radiologicos: Grado 0, I, II, III, y IV.

Cualquiera de las enfermedades incluidas dentro de la clasificacion de artrosis puede ser diagnosticada mediante el empleo del patron peptidico de la invention.

En la presente invencion se entiende por “sujeto” o “individuo” a cualquier animal, preferiblemente un mamifero, mas preferiblemente un primate, en particular, un ser humano, de cualquier raza, sexo o edad. No obstante, en una realization particular, el sujeto es una mujer, mas en particular, es una mujer con una edad superior a 50 anos.

La puesta en practica de la invencion comprende determinar la presencia o ausencia de los peptidos que comprenden el patron peptidico de la invencion en una muestra biologica procedente de dicho sujeto. En la presente invencion se entiende por “muestra biologica” a cualquier material de origen animal, en particular, humano, que incluye excretas (heces y orina), secreciones (genitales, respiratorias,...), sangre o sus componentes, tejidos y fluidos organicos (biopsias, liquidos: cefalorraqtideo, sinovial, articular, asdtico,...), etc. En una realizacion particular, la muestra procedente del sujeto es un fluido biologico que, en otra realizacion todavia mas particular, se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, liquido sinovial y orina.

Una vez que se ha obtenido la muestra biologica del sujeto, esta debe ser procesada para obtener los peptidos objeto del analisis. Para ello, primero se lleva a cabo el

5

10

15

20

25

30

35

aislamiento de la fraccion proteica de la muestra biologica [etapa a) del metodo de la invention].

As^ la muestra biologica se puede tratar para disgregar de forma fisica o mecanica la estructura del tejido o la celula, liberando los componentes intracelulares en una solution acuosa u organica. Una vez hecho esto, las protemas son aisladas de la muestra. Cualquiera de las tecnicas que existen en el estado de la tecnica para aislar protemas puede ser empleada en la presente invencion como por ejemplo, centrifugation, depletion, etc. Una vez aisladas las protemas, se procede a la digestion de las mismas para obtener el perfil peptido de la invencion.

Asi, en una segunda etapa [etapa b) del metodo de la invencion], este comprende digerir la fraccion proteica obtenida en la etapa a) con tripsina, llevando a cabo la digestion enzimatica de las protemas y obteniendo peptidos. La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptidicos de las protemas mediante hidrolisis para formar peptidos de menor tamano y aminoacidos. La tripsina es producida en el pancreas y secretada en el duodeno (parte del intestino), donde es esencial para la digestion. El pH optimo es 8 y la temperatura optima es 37 °C.

Una vez obtenidos los peptidos, estos pueden ser detectados mediante tecnicas ampliamente conocidas en el estado de tecnica. Ejemplos de dichas tecnicas incluyen, sin limitar a, espectrometria de masas, citometria de flujo, Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimatico competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo) y tecnicas inmunocitoquimicas e inmunohistoquimicas. En una realization particular, la obtencion del patron pepridico de la invencion se lleva a cabo mediante espectrometria de masas, ELISA o citometria de flujo.

La espectrometria de masas es una tecnica analrtica que permite elucidar estructuras quimicas, basada en la medicion de la relation masa/carga de especies moleculares. Las determinaciones requieren de la generation de especies cargadas electricamente, lo cual se logra por diferentes metodologias como pueden ser el impacto electronico, el bombardeo de atomos rapidos (FAB), y la generacion de iones enlazados. La medicion de la relacion masa/carga permite conocer el peso molecular exacto de la molecula. Tecnicas derivadas de la espectrometria de masas que tambien pueden emplearse en el contexto de la presente invencion incluyen, sin limitarse a, la cromatografia de gases-

5

10

15

20

25

30

35

espectrometria de masas (GC-MS) y cromatografia Kquida-espectrometria de masas (LC-MS).

La tecnica ELISA (acronimo del ingles Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas) es una tecnica de inmunoensayo en la cual un antigeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algun otro tipo.

En la presente invencion, el termino “anticuerpo” es interpretado de forma amplia e incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespedficos y fragmentos de los mismos [F(ab')2, Fab, scFv, etc.], siempre que sean capaces de reconocer al antigeno de interes, es decir, que sean capaces de unirse a los peptidos comprendidos dentro del patron peptidico de la invencion. Ejemplos de anticuerpos que pueden emplearse en el contexto de la presente invencion incluyen, sin limitarse a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, etc. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimaticos o cofactores, inhibidores enzimaticos, partmulas, colorantes, etc.

La citometria de flujo es una tecnologia biofisica basada en la utilizacion de luz laser, en la que las protemas unidas a un anticuerpo marcado y suspendidas en un fluido, atraviesan un fidsimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz laser, la luz transmitida y dispersada por el paso de las protemas a traves del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de deteccion, permitiendo detectar y separar las protemas unidas a los anticuerpos marcados.

Una vez obtenido el patron peptidico del sujeto de estudio, si dicho patron peptidico comprende los peptidos que aparecen en el patron peptidico de la invencion, entonces se puede concluir que el sujeto padece artrosis.

Kit y array de la invencion y sus usos

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un kit, de aqu en adelante “kit de la invencion”, que comprende anticuerpos espedficos contra los peptidos que comprenden

5

10

15

20

25

30

35

el patron peptidico de la invencion. Los terminos “patron peptidico”, “peptidos” y “anticuerpo” ya han sido descritos y explicados en la seccion anterior y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Por “kit” se entiende, en el contexto de la presente invencion, un producto que contiene los diferentes reactivos para poner en practica el metodo de la invencion, empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetamiento de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, cristal, plastico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares.

Adicionalmente, los kits pueden contener instrucciones para el empleo de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electronico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leidas por un sujeto, tales como medios de almacenamientos electronicos (discos magneticos, cintas y similares), medios opticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionen dichas instrucciones.

Como entiende el experto en la materia, la puesta en practica del metodo de la invencion puede hacerse mediante el empleo de un array que comprenda los anticuerpos que reconocen espedficamente los peptidos comprendidos en el patron peptidico de la invencion. Por lo tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con un array que comprende un conjunto de anticuerpos, en donde dicho conjunto de anticuerpos comprende anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse espedficamente con los peptidos comprendidos en patron peptidico de la invencion.

Alternativamente, la puesta en practica del metodo de la invencion tambien puede hacerse mediante el empleo de un array que comprenda los peptidos de la invencion. Por lo tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con un array que comprende los peptidos comprendidos en el patron peptidico de la invencion.

En la presente invencion se entiende por “array’ o “matriz” a la disposicion ordenada (en un soporte generalmente en filas y columnas) de (i) los anticuerpos que reconocen de forma espedfica los peptidos comprendidos en el patron peptidico de la invencion (array

5

10

15

20

25

30

35

de anticuerpos), o de (ii) los peptidos que comprenden el patron peptidico de la invention (array de peptidos).

En el caso del array de anticuerpos, una vez que las protemas han sido aisladas de la muestra biologica y digeridas tal como se ha descrito anteriormente en el metodo de la invencion, la disolucion resultante se anade al array y se incuba la mezcla. Si los peptidos del patron peptidico de la invencion estan presentes en la muestra, estos quedaran unidos al array, siendo posible su detection. Cualquier metodo de detection de los habitualmente empleados en arrays puede ser empleado en la puesta en practica de la presente invencion.

Por otro lado, como entiende el experto en la materia, dentro de la invencion tambien estan contemplados el uso del kit o el array de la invencion en el diagnostico in vitro de artrosis.

Asi, en otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del kit o del array de la invencion para el diagnostico in vitro de artrosis. Alternativamente, el kit de la invencion, tambien puede usarse para diferenciar entre pacientes que padecen artrosis de aquellos que padecen otras patologias reumaticas diferentes a la artrosis, como por ejemplo, artritis o artritis psoriasica.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Diagramas de los analisis de componentes principales (PCA) realizados con los peptidos de la invencion obtenidos mediante la tecnica de MALDI-TOF, para el grupo de pacientes artrosicos (gris) y para el grupo de pacientes control (negro), en cada porcentaje de elucion. Los PCAs muestran que en todas las condiciones de extraction la clasificacion de las muestras se consigue en al menos dos planos.

5

10

15

20

25

30

35

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

Ejemplo 1. MATERIAL Y METODOS

1.1 Reactivos

DL-ditiotreitol (DTT >99%) lodoacetamida (IAA >99%)

Acido trifluoroacetico (TFA >99%, para LC-MS)

Acetonitrilo (ACN, LC-MS CHROMASOLV)

Agua (LC-MS CHROMASOLV)

Bicarbonato amonico (>99 %)

Tripsina (grado de secuenciacion, Roche)

NuTips large 10-200 ^l, C-18 (Glygen, Columbia, EE.UU.) a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid puriss., para MALDI-MS (Fluka, Alemania)

Mezcla de calibration 1, 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.)

1.2. Muestras de suero

Las muestras de suero humano se obtuvieron de donantes anonimos en el Complejo Hospitalario Universitario de A Coruna, Espana. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el comite de etica local en Galicia (Espana). Se escogieron 40 muestras de suero de donantes artrosicos (OA), 40 muestras de suero de donantes diagnosticados con artritis reumatoide (AR), 40 muestras de donantes diagnosticados con artritis psoriasica (APS) y 40 muestras de suero de donantes sin ninguna de las anteriores patologias, es decir, son sujetos que no presentan ningun tipo de patologia reumatica. Este ultimo grupo es el grupo control (N). Se emplearon 20 sueros de cada grupo de pacientes para la busqueda del patron peptidico caracteristico de cada patologia. Posteriormente, se emplean los otros 20 sueros restantes de cada grupo de pacientes como muestras ciegas para comprobar la validez del patron peptidico de la invencion. Las muestras de suero se almacenaron a - 80 °C hasta su procesamiento.

5

10

15

20

25

30

35

1.3. Deplecion secuencial de protelnas en suero

La deplecion de protemas se realizo de acuerdo con el protocolo desarrollado previamente en nuestro laboratorio (Fernandez-Costa et al., Proteome Sci 2012; 55). Cada uno de los sueros fueron sometidos a un protocolo de deplecion secuencial que implica dos etapas de precipitacion: primero con DTT y a continuacion con ACN, de acuerdo con el protocolo descrito por Kay et al. (Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22: 3255-60), con pequenas modificaciones. Brevemente, 2,2 ^.l de DTT 500 mM se anadieron a 20 ^.l de suero y se agitaron en vortex. A continuacion, la muestra se incubo

1 hora hasta la formacion de un precipitado blanco viscoso persistente, que se sedimento por centrifugacion a 14,000 xg durante 2 x 20 minutos. El sobrenadante se transfirio a un tubo limpio (LoBind, Eppendorf) y se depleciono de nuevo mediante la adicion de 57 % (v/v) acetonitrilo, seguido de dos ciclos de vortex breve y 10 minutos de ultrasonidos en un bano de ultrasonidos (SONOREX, Bandelin). El precipitado de protema formado se sedimento por centrifugacion a 14,000 xg durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfirio a un tubo limpio LoBind y se evaporo a sequedad empleando una centrifuga de vado.

1.4. Digestion en solucion

La digestion ultrasonica en solucion se realizo de acuerdo con el protocolo de digestion proteolrtica ultrarrapida desarrollado previamente (HM Santos et al. J Proteome Res 2007,6:3393-9). La muestra evaporada se resuspendio en 20 ^.l de bicarbonato amonico 25mM (AmBi), se anadieron 10 ^.l de acetonitrilo y se mezclo mediante vortex y sonicacion durante 1 minuto (50% de amplitud) en bano de ultrasonidos (SONOPULS HD 2200 con accesorio BB6, Bandelin). Los residuos de cistema de las protemas se redujeron con 2 ^.l de DTT 110 mM seguido de vortex y 1 minuto de sonicacion, y a continuacion se bloqueo con 2 ^.l de IAA 600 mM, vortex y 1 minuto sonicacion. Para inactivar la IAA se anadieron a la muestra 10 ^.l de DTT 110 mM. Despues, la muestra se diluyo hasta un volumen final de 200 ^.l con AmBi 12,5 mM, y se anadio tripsina de acuerdo con un ratio 1:20 (p/p) de tripsina:protema. La digestion se llevo a cabo en el aparato de ultrasonidos durante 5 minutos a un 50% amplitud. Finalmente, se anadieron

2 ^.l de acido formico al 50% (v/v) para parar la reaccion enzimatica. El suero digerido se evaporo a sequedad en una centrifuga de vado.

5

10

15

20

25

30

35

1.5. Elucion secuencial mediante NuTips (separacion de peptidos)

Las muestras digeridas se reconstituyeron en 30 ^.l de TFA al 0,1 % (v/v), y 20 ^.g de digerido se cargaron en una punta de tipo NuTip C18 (large). La separacion de los peptidos se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo:

Acondicionado: se aspiro y expulso 5 veces 30 ^.l de una solucion de ACN al 60-80% (v/v) y TFA al 0,1% (v/v), y se lavo 3 veces con TFA al 0,1%.

Union: se aspiro y expulso la muestra 50 veces, para permitir que los peptidos se adsorbieran al material de fase reversa empaquetado en la punta.

Elucion secuencial: se aspiro y expulso (20 veces cada uno) 30 ^.l de diferentes porcentajes de ACN, de baja a alta concentration de ACN. La elucion secuencial se realizo con 4, 7, 10 y 14% (v/v) de ACN. Los eluidos se evaporaron a sequedad.

1.6. Analisis mediante espectrometria de masas

Las muestras evaporadas se resuspendieron en 6 ^.l de TFA al 0,1 % (v/v), y 1 ^.l de cada muestra se deposito por quintuplicado en una placa para MALDI (placa de 384 puntos recubierta de Teflon®), y se dejo secar al aire a temperatura ambiente, Posteriormente, se anadieron a las muestras secas de peptidos 1 ^.l de una solucion de 3 mg/ml de acido a-ciano-4-hidroxicinamico en TFA al 0,1% (v/v) y 50% (v/v) ACN, y se dejo secar de nuevo.

Las muestras se analizaron en modo de ion positivo usando un espectrometro de masas MALDI-TOF/TOF 4800 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.), equipado con un laser Nd:YAG (A,=355 nm) y el programa 4000 Series Explorer™ (ABSciex). La calibration interna, adquisicion de datos, procesamiento e interpretation se llevaron a cabo segun lo recomendado por el fabricante. Todos los espectros de masas deben ser calibrados externamente empleando una mezcla de peptidos estandar (ABSciex). Los datos de masas se exportaron de acuerdo con las siguientes caracteristicas: a) rango de masas: 500 - 4000 (Da); b) densidad de picos: maximo 50 picos por 200 Da; c) relation senal/ruido: mmimo 20; d) area minima: 100; e) picos maximos/spot: 500.

5

10

15

20

25

30

35

El analisis del espectro de masas para cada muestra corresponde a un promedio de 1.500 disparos de laser. Los espectros de fragmentation se adquieren mediante la selection de los precursores de interes en cada mapa de masas MALDI-TOF, con un promedio de 2.000 disparos de laser por espectro. Para la fragmentacion (MS/MS), todos los picos con un ratio senal/ruido (S/N)>10 se incluyeron en la busqueda en bases de datos.

La secuenciacion de peptidos se realizo mediante el software ProteinPilot™ (ABSciex), con los siguientes parametros: (i) Version UniProt: 2013_09, que contiene 540,958 entradas de secuencia, (ii) Taxonomia: Homo sapiens, (iii) Enzima: tripsina o sin enzima; (v) Modificaciones fijas: iodoacetamida. Solo se informo de los peptidos identificados con al menos un 70 % de confianza.

1.7. Analisis bioinformatico

Cada espectro se pre-proceso empleando los siguientes parametros: rango de masas de 500 a 4000 Da, densidad de picos maxima: 10 picos por 200 Da, relation senal/ruido mmimo (S/N) de 10, area minima de 100, numero maximo de picos por espectro: 120. Los picos se alinearon con una tolerancia de la masa del peptido de 150 ppm y, finalmente, se creo un espectro representativo para cada muestra con aquellos picos presentes en al menos 4 de las 5 replicas espectrales de la muestra. De cada pico solo se tuvo en cuenta su presencia o ausencia en cada espectro, descartandose el uso de su intensidad mas alla del pre-procesamiento.

Con el objetivo de identificar picos diferencialmente expresados en los distintos grupos se aplico el test de independencia de Fisher para comparaciones entre dos grupos y el test de independencia X2 para comparaciones entre los cuatro grupos analizados. Dado que estos tests se realizaron sobre todos los picos detectados, se aplico posteriormente la correction False Discovery Rate (FDR) de Benjamini-Hochberg con el fin de reducir el numero de falsos positivos.

Mediante el uso de Analisis de Componentes Principales (Principal Component Analysis, PCA) se analizo graficamente la separation entre las muestras de distintas condiciones.

5

10

15

20

25

30

35

Por ultimo, con el objetivo de comprobar la utilidad de los peptidos que comprenden el patron peptidico descrito en la presente invention para el diagnostico de artritis, se evaluo el rendimiento de clasificadores automaticos entrenados unicamente con la information de estos peptidos sobre un conjunto de muestras ciegas.

Ejemplo 2. RESULTADOS

2.1. Obtencion del patron peptldico caracterlstico de la artrosis

Para la obtencion del patron peptidico descrito en la presente invencion se utilizaron 20 muestras de suero de cada uno de los grupos de pacientes incluidos en el presente estudio (OA: artrosis, AR: artritis reumatoide, APS: artritis psoriasica y N; control) y mediante las tecnicas descritas en el Ejemplo 1 se detectaron los peptidos caracteristicos de cada uno de los grupos de estudio analizados. Brevemente, primero se seleccionaron los peptidos que se detectan de forma significativa en una patologia con respecto a las otras en base al valor q < 0,05 del test de Fisher corregido aplicado por parejas. Y despues se seleccionaron los peptidos que se detectan de forma significativa en dos o mas condiciones de acuerdo con un valor q < 0,05 del test de independencia X2 corregido, como se ha indicado anteriormente.

Mediante dicha metodologia se identificaron un total de 11 peptidos que se expresaban de forma significativa en el grupo de pacientes artrosicos respecto al resto de grupos incluidos en el estudio. Este patron peptidico espedfico permite distinguir las muestras de los sujetos con artrosis (OA) de las muestras de sujetos control (N), e incluso de las muestras de los sujetos que padecen otras enfermedades reumaticas, como la artritis psoriasica (APS) y la artritis reumatoide (AR).

Dicho conjunto de 11 peptidos que forman el patron pepridico de la invencion, se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Masas de los peptidos caracteristicos que comprenden el patron pepridico para el diagnostico de pacientes que padecen artrosis (OA). Los porcentajes indican la presencia de cada peptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes, APS: grupo de pacientes que padecen artritis psoriasica; AR: grupo de pacientes que padecen artritis reumatoide; N: grupo de sujetos control.

m/z: SEQ ID No. APS (n=20) AR (n= 20) OA (n=20) N (n=20)

1392,7517: 1 0% 5% 50% 10%

1532,796: 2 5% 15% 40% 0%

1758,979: 3 5% 5% 40% 0%

1909,9498: 4 0% 5% 40% 0%

2165,146: 5 10% 5% 45% 0%

2180,1414: 6 15% 10% 70% 20%

2280,1501: 7 5% 5% 40% 5%

2291,227: 8 5% 10% 60% 20%

2407,3042: 9 5% 0% 45% 0%

2436,3015: 10 35% 25% 90% 40%

2663,4382: 11 5% 5% 60% 15%

Los peptidos escogidos como caracteristicos de artrosis aparecen significativamente mas en los sueros de donantes artrosicos que en los sueros de los pacientes control o de los pacientes que padecen APS o AR.

5

2.2. Peptidos adicionales especlficos para el diagnostico de otras patologlas como AR y APS

Ademas de la detection del patron peptidico descrito en la invention, mediante los 10 metodos descritos previamente se seleccionaron un conjunto de peptidos adicionales a los 11 peptidos que comprenden el patron peptidico de la invencion para el diagnostico de la artrosis, para mejorar la clasificacion de las muestras, preferentemente muestras de suero, de donantes artrosicos. Dichos peptidos adicionales se seleccionaron de los datos procedentes del analisis de las 80 muestras de suero analizadas. En este caso, al 15 tratarse de comparaciones entre parejas de condiciones, los peptidos seleccionados fueron aquellos para los que se obtuvo un valor q < 0,05 para el test de Fisher corregido.

En la Tabla 8 se muestran los peptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el 20 patron peptidico de la invencion y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrosicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patologia artrosica.

Tabla 8. Masas de los peptidos adicionales al patron peptidico de la invencion, utiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que no padecen ninguna patologia artrosica. Los porcentajes indican la presencia de cada peptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.

5

m/z: SEQ ID No. OA (n=20) N (n=20)

896,490: 13 65% 5%

961,627: 14 70% 15%

980,529: 15 70% 20%

1019,604: 16 65% 10%

1108,588: 17 50% 0%

1117,669: 18 55% 5%

1148,634: 19 75% 15%

1213,667: 20 60% 5%

1237,674: 21 50% 0%

1255,716: 24 50% 0%

1403,749: 28 45% 0%

1470,813: 32 70% 5%

1502,810: 33 65% 5%

1568,914: 36 75% 20%

1585,846: 38 50% 10%

1641,892: 40 85% 35%

1641,892: 41 85% 35%

1669,862: 42 80% 45%

1706,931: 43 70% 5%

1815,922: 51 60% 10%

1825,005: 52 80% 30%

1834,946: 53 45% 5%

1864,027: 54 75% 25%

1875,997: 55 75% 20%

1876,017: 56 75% 20%

1884,000: 57 65% 20%

2186,092: 65 60% 10%

2296,219: 67 80% 20%

2315,195: 68 75% 30%

2348,245: 70 95% 30%

2652,448: 75 70% 5%

2670,387: 76 50% 15%

2695,362: 77 95% 40%

2790,425: 78 55% 15%

5

10

15

20

25

Alternativamente, en la Tabla 9 se muestran los peptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patron peptidico de la invention y que tambien, son capaces de diferenciar entre sujetos artrosicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patolog^a artrosica. La diferencia entre los datos mostrados en la Tabla 8 y la Tabla 9 radica en que en la Tabla 8 los sujetos artrosicos muestran una mayor presencia de dichos peptidos, mientras que los datos mostrados en la Tabla 9 ponen de manifiesto que los sujetos artrosicos muestran una menor presencia de dichos peptidos respecto a los sujetos control, sanos.

Tabla 9. Masas de los peptidos adicionales al patron peptidico de la invencion, utiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que no padecen ninguna patologia artrosica. Los porcentajes indican la presencia de cada peptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes,

m/z: SEQ ID No. OA (n=20) N (n=20)

871,502: 12 0% 30%

1518,710: 34 15% 55%

1810,992: 50 5% 40%

1922,877: 60 5% 50%

2012,011: 62 40% 80%

2153,112: 64 30% 90%

2602,358: 74 35% 65%

En la Tabla 10 se muestran los peptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patron peptidico de la invencion y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis reumatoide. Es interesante destacar que, como se puede apreciar en dicha Tabla 10, los sujetos que padecen OA presentan una mayor presencia de los peptidos SEQ ID NO: 30, 59 y 69, respecto a los pacientes que padecen AR. En cambio, los sujetos artrosicos presentan una menor presencia de los peptidos SEQ ID NO: 22, 23, 26, 31, 35, 39, 45, 46, 47, 48, 58, 61, 63, 66, 71, 72 y 73, respecto a los sujetos que padecen AR.

Tabla 10. Masas de los peptidos adicionales al patron peptidico de la invencion, utiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que padecen artritis reumatoide (AR). Los porcentajes indican la presencia de cada peptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.

m/z: SEQ ID No. AR (n=20) OA (n=20)

1247,652: 22 50% 25%

1249,655: 23 30% 0%

1299,609: 26 90% 20%

1465,689: 30 30% 80%

1467,852: 31 90% 45%

1519,750: 35 30% 0%

1612,849: 39 55% 20%

1736,970: 45 35% 0%

1743,882: 46 45% 10%

1745,901: 47 45% 5%

1771,885: 48 90% 25%

1899,060: 58 55% 15%

1906,873: 59 5% 80%

1932,038: 61 45% 0%

2020,138: 63 60% 15%

2190,112: 66 85% 20%

2344,169: 69 5% 80%

2394,298: 71 60% 10%

2409,281: 72 50% 0%

2565,322: 73 70% 20%

En la Tabla 11 se muestran los peptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patron peptidico de la invencion y que son capaces de diferenciar entre sujetos 5 artrosicos de sujetos que padecen artritis psoriasica. Es interesante destacar que, como se puede apreciar en dicha Tabla 11, los sujetos que padecen OA presentan una mayor presencia de los peptidos SEQ ID NO: 25, 29, 30, 59 y 69, respecto a los pacientes que padecen APS. En cambio, los sujetos artrosicos presentan una menor presencia de los peptidos SEQ ID NO: 22, 26, 27, 31, 37, 39, 46, 47, 48, 49, 58, 66 y 79 respecto a los 10 sujetos que padecen APS.

Tabla 11. Masas de los peptidos adicionales al patron peptidico de la invencion utiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que padecen artritis psoriasica (APS). Los porcentajes indican la presencia de cada peptido 15 en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.

m/z: SEQ ID No. APS (n=20) OA (n=20)

1247,652: 22 55% 25%

1263,683: 25 10% 60%

1299,609: 26 90% 20%

1380,780: 27 30% 0%

1449,800: 29 25% 75%

1465,689: 30 5% 80%

1467,852: 31 95% 45%

1569,907: 37 50% 0%

1612,849: 39 75% 20%

1743,882: 46 55% 10%

1745,901: 47 25% 5%

1771,885: 48 95% 25%

1786,909: 49 65% 20%

1899,060: 58 50% 15%

1906,873: 59 0% 80%

2190,132: 66 70% 20%

2344,169: 69 0% 80%

2940,755: 79 60% 20%

2.3. Analisis de componentes principales (PCA).

5 Con los peptidos seleccionados en el perfil peptidico descrito en la invencion obtenidos de las muestras de sueros del grupo de pacientes artrosicos y de las muestras del grupo control se realizo un analisis de componentes principales (PCA), comprobando que las muestras se separan en al menos dos planos para todas las condiciones de elucion, con lo que los peptidos son capaces de diferenciar entre muestras de donantes artrosicos y 10 sujetos control.

Antes de realizar el PCA, se creo un grupo de datos unico para cada porcentaje de elucion (4%, 7%, 10% y 14%), con el espectro representativo de cada muestra. Los espectros de cada grupo de datos se convirtieron en vectores 1s y 0s, donde 1 significa 15 presencia de pico y 0 significa ausencia de pico.

El analisis PCA y su visualization se realizaron usando el programa RapidMiner v5,3 (
http://rapid-i,com/content/view/181/190/), que configura el algoritmo PCA para reducir la dimensionalidad de los grupos de datos hasta 3 componentes principales.

5

10

15

20

25

30

35

Estos resultados se muestran en la Figura 1.

2.4. Comprobacion del clasificador con muestras ciegas

Se comprobo la utilidad de los peptidos que comprenden el patron peptidico descrito en la presente invencion para el diagnostico de artrosis en un grupo de pacientes del que no se conoda la patologia que padedan (muestras ciegas). Las muestras de dichos pacientes (n=79) se procesaron de la misma manera que se ha descrito anteriormente en materiales y metodos.

Utilizando el conjunto de datos descrito en la seccion 2.1 se evaluaron una serie de clasificadores automaticos mediante la herramienta de aprendizaje automatico Weka 3.7 (
http://www.cs.waikato.ac.nz/ml/weka/). Estos clasificadores fueron entrenados con las distintas combinaciones posibles de los datos de cada elucion. Esta evaluacion se hizo utilizando el esquema de validation cruzada conocido como Leave-One-Out sobre dos problemas distintos: i) clasificacion de muestras de todas las condiciones y ii) clasificacion de las muestras que presentan una condition relacionada con una patologica (grupos AR, APS y OA). Como resultado de esta evaluation se selecciono como mejor clasificador para el problema de clasificar todas las condiciones a la implementation LibSVM del algoritmo Support Vector Machine (SVM) con kernel Radial Basis Function (RBF) entrenado con los datos de los porcentajes de elucion 7% y 10% y combinado con un optimizador de parametros basado en una busqueda en rejilla (algoritmo GridSearch) configurado para buscar el valor optimo del parametro "cost” entre los valores 2-5, 2-3, 2-1, 21, 23, 25, 27, 29, 211, 213 y 215, y del parametro "gamma” entre los valores 2-15, 2-13, 2-11, 2-9, 2-7, 2-5, 2-3, 2-1, 21 y 23. Por otro lado, se selecciono como mejor clasificador para el problema de clasificar las condiciones patologicas al clasificador Artificial Neural Network (ANN) entrenado con los datos del porcentaje 10%.

Con estos clasificadores entrenados con el conjunto de datos descrito en la seccion 2.1 se realizo la clasificacion del conjunto de datos de muestras ciegas. En el caso del clasificador SVM-RBF para el problema de todas las condiciones, el poder de clasificacion fue moderado, al presentar un porcentaje de aciertos ligeramente superior al 60% y un valor del estadistico Kappa de Cohen (kappa) aproximado de 0,48. Por otro lado, el clasificador ANN para el problema de las condiciones patologicas mostro unos resultados superiores, con un porcentaje de aciertos proximo al 75% y un valor de kappa de 0,619. Los resultados de la clasificacion se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12: Clasificadores automaticos creados mediante el uso del patron peptidico descrito en la presente invencion obtenido a partir de muestras de suero analizadas de cada grupo de pacientes (n= 20 para cada grupo de pacientes). Conds.: condiciones, 5 Clas.: clasificador, Elu.: porcentajes de elucion, %Ac.: porcentaje de aciertos, K: kappa global, Cond.: condicion, Sen.: sensibilidad por condicion, Esp.: especificidad por condicion, n: muestras por condicion, N: total de muestras, DC: diagnostico correcto, DCP: diagnostico correcto por patologia.

Conds.: Clas. Elu. %Ac. K Cond. Sen. Esp. n N DC DCP

: SVM- APS 0,80 0,93 20 16

Todas: 7% 60,76 0,477 AR 1,00 0,92 19 79 48 19

RBF-

10%: OA 0,45 0,75 20 9

: OPT




: N 0,20 0,88 20 4





: APS 0,55 0,90 20 11

Patologlas: ANN 10% 74,58 0,619 AR 0,89 0,38 19 59 44 17





: OA 0,80 0,23 20 16

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso in vitro de un patron peptldico que comprende los siguientes peptidos:

Masa/carga(m/z) Peso molecular(Da) SEQ ID NO

Peptido 01

1392,7526 1391,7526 1

Peptido 02

1532,8060 1531,806 2

Peptido 03

1758,9790 1757,979 3

Peptido 04

1910,0176 1909,0176 4

Peptido 05

2165,1272 2164,1272 5

Peptido 06

2180,1445 2179,1445 6

Peptido 07

2280,1501 2279,1501 7

Peptido 08

2291,2260 2290,226 8

Peptido 09

2407,2880 2406,288 9

Peptido 10

2436,2922 2435,2922 10 y el

Peptido 11

2663,4314 2662,4314 11,

5 como marcador en el diagnostico de artrosis en un sujeto.
2. Uso segun la reivindicacion 1 caracterizado por que el patron peptldico comprende ademas al menos uno de los peptidos:

Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID

Peptido 12

871,502 870,502 12

Peptido 13

896,490 895,490 13

Peptido 14

961,627 960,627 14

Peptido 15

980,529 979,529 15

Peptido 16

1019,604 1018,604 16

Peptido 17

1108,588 1107,588 17

Peptido 18

1117,669 1116,669 18

Peptido 19

1148,634 1147,634 19

Peptido 20

1213,667 1212,667 20

Peptido 21

1237,674 1236,674 21

Peptido 24

1255,716 1254,716 24

Peptido 28

1403,749 1402,749 28

Peptido 32

1470,813 1469,813 32

Peptido 33

1502,810 1501,810 33

Peptido 34

1518,710 1517,71 34

Peptido 36

1568,914 1567,914 36

Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO:

Peptido 38

1585,846 1584,846 38

Peptido 40

1641,892 1640,892 40

Peptido 41

1641,892 1640,892 41

Peptido 42

1669,862 1668,862 42

Peptido 43

1706,931 1705,931 43

Peptido 50

1810,992 1809,992 50

Peptido 51

1815,922 1814,922 51

Peptido 52

1825,005 1824,005 52

Peptido 53

1834,946 1833,946 53

Peptido 54

1864,027 1863,027 54

Peptido 55

1875,997 1874,997 55

Peptido 56

1876,017 1875,017 56

Peptido 57

1884,000 1883,000 57

Peptido 60

1922,877 1921,877 60

Peptido 62

2012,011 2011,011 62

Peptido 64

2153,112 2152,112 64

Peptido 65

2186,092 2185,092 65

Peptido 67

2296,219 2295,219 67

Peptido 68

2315,195 2314,195 68

Peptido 70

2348,245 2347,245 70

Peptido 74

2602,358 2601,358 74

Peptido 75

2652,448 2651,448 75

Peptido 76

2670,387 2669,387 76

Peptido 77

2695,362 2694,362 77

Peptido 78

2790,425 2789,425 78
3. Uso segun la reivindicacion 1 caracterizado por que el patron peptldico comprende ademas al menos uno de los peptidos:

Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO:

Peptido 22

1247,652 1246,652 22

Peptido 23

1249,655 1248,655 23

Peptido 26

1299,609 1298,609 26

Peptido 30

1465,689 1464,689 30

Peptido 31

1467,852 1466,852 31

Peptido 35

1519,750 1518,750 35

Peptido 39

1612,849 1611,849 39

Peptido 45

1736,970 1735,970 45

Peptido 46

1743,885 1742,882 46

Peptido 47

1745,901 1744,901 47

Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO:

Peptido 48

1771,885 1770,885 48

Peptido 58

1899,060 1898,060 58

Peptido 59

1906,873 1905,873 59

Peptido 61

1932,038 1931,038 61

Peptido 63

2020,138 2019,138 63

Peptido 66

2190,132 2189,132 66

Peptido 69

2344,169 2343,169 69

Peptido 71

2394,298 2393,298 71

Peptido 72

2409,281 2408,281 72

Peptido 73

2565,322 2564,322 73
4. Uso segun la reivindicacion 1 caracterizado por que el patron peptldico comprende ademas al menos uno de los peptidos:

Masa/carga (m/z) Peso molecular (Da) SEQ ID NO:

Peptido 22

1247,652 1246,652 22

Peptido 25

1263,683 1262,683 25

Peptido 26

1299,609 1298,609 26

Peptido 27

1380,780 1379,780 27

Peptido 29

1449,800 1448,800 29

Peptido 30

1465,689 1464,689 30

Peptido 31

1467,852 1466,852 31

Peptido 37

1569,907 1568,907 37

Peptido 39

1612,849 1611,849 39

Peptido 46

1743,882 1742,882 46

Peptido 47

1745,901 1744,901 47

Peptido 48

1771,885 1770,885 48

Peptido 49

1786,909 1785,909 49

Peptido 58

1899,060 1898,060 58

Peptido 59

1906,873 1905,873 59

Peptido 66

2190,132 2189,132 66

Peptido 69

2344,169 2343,169 69

Peptido 79

2940,755 2939,755 79

5
5. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por que el patron peptldico es caracterlstico de sujetos que presentan artrosis frente a sujetos control sanos o frente sujetos que padecen otra patologla artrosica diferente a la artrosis.

10 6. Uso segun la reivindicacion 5 caracterizado por que las patologlas artrosicas

diferentes a la artrosis se seleccionan entre: artritis reumatoide o artritis psoriasica.

5

10

15

20

25

30

35
7. Uso segun la reivindicacion 3 caracterizado por que selecciona entre sujetos que padecen artrosis de sujetos que padecen artritis reumatoide.
8. Uso segun la reivindicacion 4 caracterizado por que selecciona entre sujetos que padecen artrosis de sujetos que padecen artritis psoriasica.
9. Metodo in vitro para diagnosticar artrosis en un sujeto, o para monitorizar la eficacia de la terapia administrada a un sujeto que padece artrosis, que comprende:

a) aislar la fraccion proteica de una muestra biologica procedente del sujeto,

b) digerir la fraccion proteica obtenida en la etapa a) con tripsina, y

c) detectar la presencia o ausencia de un patron peptldico segun se describe en la reivindicacion 1,

en donde si dicho patron peptldico es detectado, entonces el sujeto padece artrosis o la terapia administrada al sujeto no esta siendo eficaz.
10. Metodo segun la reivindicacion 9, caracterizado por que en la etapa c) adicionalmente se puede detectar la presencia o ausencia de los patrones peptldicos segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en que la muestra es un fluido biologico.
12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que el fluido biologico se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, llquido sinovial y orina.
13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la obtencion del patron peptldico se lleva a cabo mediante espectrometrla de masas, ELISA o citometrla de flujo.
14. Un Kit para llevar a cabo los usos segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y/o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende anticuerpos especlficos contra los peptidos comprendidos en el patron peptldico segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
15. Un array para llevar a cabo los usos segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y/o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende un

conjunto de anticuerpos, en donde dicho conjunto de anticuerpos comprende anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse especlficamente con los peptidos comprendidos en patron peptldico segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

5
16. Un array para llevar a cabo los usos segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y/o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende los peptidos que comprenden el patron peptldico segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10
17. Uso de un kit segun la reivindicacion 14 o un array segun la reivindicacion 15 o 16 para el diagnostico in vitro de artrosis, o para monitorizar la eficacia de la terapia administrada a un sujeto que padece artrosis.