ES2703999T3

ES2703999T3 - Predicción diagnóstica de artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico

Info

Publication number: ES2703999T3
Application number: ES09796375T
Authority: ES
Inventors: Zoltán Konthur; Hans Lehrach; Karl Skriner
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2019-03-13
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CA2748157A1; US20110311999A1; CA2748157C; EP2380027B1; EP2380027A1; EP2204655A1; WO2010072673A1; US9335329B2

Abstract

Procedimiento de determinación en una muestra de un sujeto de la presencia de dos o más anticuerpos que comprende: - poner en contacto dicha muestra con: i. un polipéptido similar a hnRNP-D (hnRNP-DL) citrulinado que comprende la secuencia de SEC ID nº: y ii. por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNPDL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, y - determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL citrulinado y determinar además si por lo menos un anticuerpo adicional está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, y/o dicho CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Predicción diagnóstica de artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de ensayos y procedimientos de diagnóstico in vitro. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos y ensayos para el diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, en particular artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

Antecedentes

La artritis reumatoide (RA) y el lupus eritematoso sistémico (SLE) son ambas enfermedades crónicas autoinmunitarias.

La RA se caracteriza por inflamación en múltiples articulaciones provocada por una reacción autoinmunitaria. Esta reacción autoinmunitaria provoca dolor en las articulaciones y la erosión y la destrucción de la superficie de la articulación, lo que afecta a la amplitud de su movimiento y desemboca en deformidad y pérdida de función. Las articulaciones pequeñas de las manos, los pies y la columna cervical son las más afectadas, pero también pueden verse afectadas articulaciones más grandes, tales como los hombros y las rodillas. Además, la RA está asociada en muchos casos también con la formación de nódulos reumatoides en la piel, vasculitis, fibrosis de los pulmones y/o amiloidosis renal, entre otros. La RA se puede diagnosticar, por ejemplo, utilizando imágenes de rayos X y mediante la determinación de la presencia de determinados autoanticuerpos en muestras de sangre de pacientes. En particular, la presencia de factor reumatoide (RF, un autoanticuerpo dirigido a la región Fc de la IgG humana) y anticuerpos anti-proteínas citrulinadas (ACPA), por ejemplo, anti-péptido citrulinado cíclico (anti-CCP), es indicativa de RA. Otros marcadores y ensayos de diagnóstico se utilizan para el diagnóstico diferencial, incluyendo dichos marcadores y ensayos, por ejemplo, la determinación de la tasa de sedimentación eritrocítica (ESR), proteína C reactiva, un hemograma completo, la función renal, enzimas hepáticas y otros ensayos inmunológicas (por ejemplo anticuerpo antinuclear/ANA).

En el SLE, el sistema inmunitario ataca las células y tejidos del cuerpo, lo que tiene como consecuencia inflamación y daño tisular. El SLE puede afectar cualquier parte del cuerpo, pero con mayor frecuencia daña el corazón, las articulaciones, la piel, los pulmones, los vasos sanguíneos, el hígado, los riñones y el sistema nervioso. Los ensayos de diagnóstico indicativos de SLE incluyen ensayos de anticuerpos antinucleares (ANA), ensayos de anticuerpos anti-fosfolípidos y ensayos anti-antígenos nucleares extraíbles (anti-ENA). Ensayos más específicos son los anticuerpos anti-Smith y anti-ADNbc. Otros ensayos que se realizan de forma rutinaria si se sospecha que hay presencia de SLE son los niveles del sistema del complemento (los niveles bajos sugieren un consumo por parte del sistema inmunitario), electrolitos y función renal, enzimas hepáticas y un hemograma completo.

La presencia de autoanticuerpos contra antígenos intracelulares tales como los componentes de estructuras de ribonucleoproteína (RNP) grandes (por ejemplo, ribosoma o espliceosoma) es característica de enfermedades autoinmunitarias reumáticas tales como la RA y el SLE.

Los complejos de ribonucleoproteínas heterogéneos están presentes en el núcleo celular durante la transcripción génica y la subsiguiente modificación post-transcripcional del ARN recién sintetizado (pre-ARNm). El complejo hnRNP está formado por pre-ARNm y ~30 proteínas, entre las mismas las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas hnRNP-A2 y -B1 como proteínas del núcleo. La hnRNP-A2 (también conocida como RA33) y la hnRNP-B1 son el resultado de dos variantes de corte y empalme diferentes del gen HNRNPA2B1. Los anticuerpos contra hnRNP-A2 o -B1 (es decir, los denominados autoanticuerpos anti-A2/-B1/-RA33), han demostrado ser más específicos para RA que otros marcadores, tales como RF. Esto mismo tiene validez para la hnRNP-A1 estrechamente relacionada. También se han encontrado autoanticuerpos anti-A2/-B1/-RA33 en muestras de una fracción significativa de pacientes con SLE.

Las proteínas hnRNP se han clasificado mediante análisis de homología de secuencia en dos subgrupos, el subgrupo A y el subgrupo D. El subgrupo A comprende hnRNP-A0, hnRNP-A1, hnRNP-A2, hnRNP-B1 y hnRNP-A3, mientras que el subgrupo D comprende hnRNP-A/B, hnRNP-D y hnRNP-DL (hnRNP-D).

Las proteínas hnRNP y los fragmentos peptídicos de las mismas son un estimulador importante de la autoinmunidad en ratas con artritis inducida por pristano y anticuerpos contra proteínas hnRNP y fragmentos peptídicos de las mismas son marcadores en ratones SKG que tienen una enfermedad de tipo Ra y ratones MRLpr y NZW que tienen una enfermedad de tipo SLE (Hoffmann et al., J. Immunol., 2007, 179: 7568-7576).

El sistema más utilizado para clasificar la RA es el de los criterios revisados del Colegio Estadounidense de Reumatología (American College of Rheumatology) de 1987 para la clasificación de RA. (Arnett, F.C., et al., Arthritis Rheum. 31 (1988) 315-324). Según estos criterios (conocidos como criterios ARA), se dice que un paciente tiene RA si satisface por lo menos cuatro de los siete criterios siguientes, en los que los criterios 1-4 deben estar presentes durante por lo menos seis semanas: 1) rigidez matutina durante por lo menos una hora, 2) artritis de tres o más zonas articulares, 3) artritis de las articulaciones de la mano, 4) artritis simétrica, 5) nódulos reumatoides, 6) factor reumatoide ("RF") en suero y 7) cambios radiográficos. Estos criterios tienen una sensibilidad y especificidad de aproximadamente el 90%.

El marcador bioquímico más importante generalmente aceptado (véanse los criterios ARA anteriores) y que ayuda en el diagnóstico de RA es el factor reumatoide (FR) detectado en suero.

La detección de anticuerpos anti-CCP (péptido citrulinado cíclico) e interleucina 6 para diagnosticar la RA se ha descrito en el documento EP 1700129 B1.

El lupus eritematoso sistémico (SLE) y la artritis reumatoide son enfermedades inflamatorias crónicas de etiología multifactorial, caracterizadas por la inflamación y el daño en diversos tejidos y órganos. Los tratamientos actuales de la enfermedad se basan principalmente en fármacos inmunosupresores. Aunque estos tratamientos han reducido la morbimortalidad, causan una supresión inmunitaria no específica. Para evitar estos efectos secundarios, se han sugerido estrategias terapéuticas alternativas, que consisten, por ejemplo, en dirigirse a células T específicas utilizando péptidos derivados de autoantígenos identificados como secuencias que abarcan los epítopes principales (Monneaux y Muller (2007), Adv. Exp. Medicina. Biol. 601: 105-12; Monneaux y Muller (2004), Autoimmun. Rev. 3 (1): 16-24).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un ensayo de diagnóstico mejorado para el diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, en particular artritis reumatoide (RA) y lupus eritematoso sistémico (SLE). En particular, la invención se basa en la detección de autoanticuerpos contra hnRNP y otros autoantígenos en muestras biológicas. La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente por los inventores de que la nueva proteína de tipo hnRNP-D en combinación con otros marcadores tiene poder de diagnóstico y de pronóstico con respecto a enfermedades autoinmunitarias, en particular con respecto a artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

La presente invención se refiere a las formas de realización tal como se caracterizan en las reivindicaciones. Por lo tanto, se refiere a los puntos siguientes.

1. Un procedimiento para determinar en una muestra de un sujeto la presencia de dos o más anticuerpos que comprende:

- poner en contacto dicha muestra con:

i. un polipéptido similar a hnRNP-D (hnRNP-DL) citrulinado que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5, y

ii. por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, y

- determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL citrulinado y determinar adicionalmente si por lo menos otro anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con respecto a dicho polipéptido hnRNP-DL, y/o dicho CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente.

2. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende:

- determinar en una muestra de dicho sujeto la presencia de:

i. un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP-DL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5, y

ii. por lo menos otro anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG,

en el que la presencia de un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL y por lo menos un anticuerpo adicional que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, o dicho péptido CCP, o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente, es indicativa de la presencia de la enfermedad autoinmunitaria en dicho sujeto.

3. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria según el punto 2 caracterizado por que la muestra la proporciona un sujeto sospechoso de tener una enfermedad inmunitaria en etapa temprana; en el que el sujeto no ha mostrado ningún síntoma durante más de 3 meses o la enfermedad autoinmunitaria no se ha diagnosticado durante más de 3 meses en dicho sujeto.

4. Un procedimiento según el punto 3, caracterizado por que la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad reumática mediada inmunológicamente, preferentemente Ra temprana, y/o la muestra la proporciona un sujeto sospechoso de tener una enfermedad reumática mediada inmunológicamente, preferentemente RA temprana.

5. Un procedimiento según el punto 3, caracterizado por que la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad autoinmunitaria sistémica, preferentemente lupus eritematoso sistémico, y/o la muestra la proporciona un sujeto sospechoso de tener una enfermedad autoinmunitaria sistémica, preferentemente lupus eritematoso sistémico.

6. Un conjunto de proteínas que comprende:

i. un polipéptido hnRNP-DL citrulinado, en el que dicho polipéptido hnRNP-DL comprende por lo menos la secuencia de la SEC ID NO: 5; y

ii. por lo menos otro péptido seleccionado del grupo que comprende un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, seleccionándose dicho hnRNP del grupo que consiste en las SEC ID NO: 6 a 17, opcionalmente citrulinado, respectivamente, un péptido cíclico citrulinado (CCP), un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, MCV (vimentina citrulinada mutada), filagrina citrulinada, alfa-enolasa citrulinada y fibrinógeno citrulinado.

7. Un kit de diagnóstico que comprende un conjunto de proteínas según la reivindicación 6.

8. Un polipéptido hnRNP-DL citrulinado o una composición que comprende el polipéptido hnRNP-DL citrulinado, en la que el hnRNP-DL citrulinado comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5.

9. Utilización de un conjunto de proteínas según el punto 6, o un kit de diagnóstico según el punto 7, o un polipéptido hnRNP-DL, o una composición que comprende el polipéptido hnRNP-DL citrulinado según el punto 8 para predecir el desarrollo de RA en pacientes con artritis temprana, en la que el polipéptido hnRNP-DL comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5.

10. Un procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de

- determinar en una muestra de dicho sujeto el nivel de por lo menos

i. un anticuerpo contra un polipéptido hnRNP-DL citrulinado, comprendiendo el polipéptido hnRNP-DL la secuencia de la SEC ID NO: 5;

- comparar el nivel determinado de dicho anticuerpo con el nivel respectivo en una muestra de un paciente que se sabe que padece la enfermedad autoinmunitaria o comparar el nivel con el nivel respectivo en una muestra de un paciente que se sabe que no padece la enfermedad autoinmunitaria; y

- correlacionar los niveles determinados con la ausencia o la presencia de la enfermedad autoinmunitaria.

11. Procedimiento para el diagnóstico diferencial de artritis reumatoide y una enfermedad autoinmunitaria sistémica que comprende las etapas de

- poner en contacto una muestra de un sujeto con:

i. un primer polipéptido hnRNP que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5, y

ii. un segundo polipéptido hnRNP que es el mismo que el primero, pero que está citrulinado (cit-hnRNP) - determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dichos primer y segundo polipéptido hnRNP y determinar adicionalmente si la cantidad de anticuerpo unido a dicho primer polipéptido hnRNP es aproximadamente igual o inferior que la cantidad de anticuerpo unido a dicho segundo polipéptido hnRNP, en el que si la relación entre el anticuerpo unido a cit-hnRNP y el anticuerpo unido a hnRNP es 1.2 o superior, se puede diagnosticar artritis reumatoide.

También se divulga un procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende:

- proporcionar una muestra de dicho sujeto,

- determinar la presencia de:

(i) un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo, y

(ii) por lo menos otro anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL o fragmentos del mismo o variantes de corte y empalme del mismo, respectivamente, o un péptido CCP o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG,

en el que la presencia de un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo y por lo menos un anticuerpo adicional que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho péptido hnRNP-DL o fragmentos del mismo o variantes de corte y empalme del mismo, o dicho péptido CCP o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente, es indicativa de la presencia de la enfermedad autoinmunitaria en dicho sujeto.

Particularmente, también se divulga un procedimiento para determinar en una muestra de un sujeto la presencia de dos o más anticuerpos que comprende:

- proporcionar una muestra de dicho sujeto,

- poner en contacto dicha muestra con:

(i) un polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o variante de corte y empalme, y

(ii) por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL o fragmentos del mismo o variantes de corte y empalme del mismo, respectivamente, y/o un péptido CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG y

- determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo y además determinar si por lo menos otro anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL o fragmentos del mismo o variantes de corte y empalme del mismo, y/o dicho péptido CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente.

También se divulga un procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de

a. proporcionar una muestra de dicho paciente,

b. determinar en dicha muestra el nivel de por lo menos

- un anticuerpo contra un polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o variante de corte y empalme y

- por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que comprende RF, anti-CCP y un anticuerpo contra un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL o contra fragmentos del mismo o variantes de empalme del mismo,

c. correlacionar los niveles determinados con la ausencia o la presencia de la enfermedad autoinmunitaria. La invención también se refiere a polipéptidos, conjuntos de proteínas y anticuerpos que pueden utilizarse en estos procedimientos.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar en una muestra de un sujeto la presencia de dos o más anticuerpos que comprende:

- poner en contacto dicha muestra con:

i. un polipéptido de tipo hnRNP-D (hnRNP-DL) citrulinado que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5, y

- determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL citrulinado y además determinar si por lo menos un anticuerpo adicional está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, y/o dicho CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente.

Los polipéptidos están citrulinados. La citrulinación o desiminación es el término utilizado para la modificación postraduccional del aminoácido arginina en una proteína para dar el aminoácido citrulina. Esta reacción se realiza mediante enzimas denominadas peptidilarginina desiminasas (PAD). en la presente memoria, la totalidad o fracciones de las argininas presentes en el polipéptido pueden ser citrulina.

La invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende:

- determinar en una muestra de dicho sujeto la presencia de:

ii. por lo menos otro anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, en el que la presencia de un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL y por lo menos un anticuerpo adicional que reconoce específicamente dicho, por lo menos otro, polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, o dicho péptido CCP, o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente, es indicativa de la presencia de la enfermedad autoinmunitaria en dicho sujeto.

Tal como se divulga en la presente memoria, las proteínas, polipéptidos, péptidos, fragmentos y variantes de corte y empalme tienen preferentemente por lo menos 12 aminoácidos de longitud. Un polipéptido en la presente memoria es un péptido que tiene una longitud de por lo menos 12 aminoácidos, particularmente una proteína. En una forma de realización preferida, el polipéptido hnRNP-DL comprende por lo menos la secuencia que abarca los residuos de aminoácidos 81-420 de la SEC ID NO: 1. Los residuos de aminoácidos 81-420 de la SEC ID NO: 1 corresponden a la SEC ID NO: 5.

Preferentemente en la presente memoria, el polipéptido hnRNP-DL se refiere a las isoformas 1 a 4 de hnRNP-DL tal como se representan en las SEC ID NO: 1 a 4 (figura 1 a figura 4) o fragmentos de las mismas.

Se prefiere que los anticuerpos distintos que reconocen específicamente un determinado polipéptido hnRNP no muestren reactividad cruzada hacia otros tipos de polipéptidos hnRNP. Preferentemente, dichos anticuerpos son inmunoglobulinas IgG.

El sujeto, en el contexto de la presente invención, puede ser un ser humano u otro animal, preferentemente un mamífero. Se prefiere que el sujeto sea un ser humano. Por lo tanto, la presente invención se puede utilizar en un contexto médico y en un contexto veterinario.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende las etapas de los procedimientos descritos anteriormente, siendo la presencia de dichos dos o más anticuerpos indicativa del riesgo de desarrollar dicha enfermedad autoinmunitaria y/o de la presencia de dicha enfermedad autoinmunitaria y/o la diferenciación entre formas de enfermedad específicas de la enfermedad autoinmunitaria.

En una forma de realización preferida, el procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria se caracteriza por que se diagnostica una enfermedad autoinmunitaria en una etapa temprana y/o la muestra la proporciona un sujeto que es sospechoso de padecer una enfermedad inmunitaria en una etapa temprana. Una enfermedad autoinmunitaria en una etapa temprana se relaciona, a este respecto, con una enfermedad autoinmunitaria que no ha presentado ningún síntoma durante más de 3 meses o que no se ha diagnosticado durante más de 3 meses.

En el contexto de la presente invención, la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad reumática mediada inmunológicamente y/o la muestra la proporciona un sujeto que es sospechoso de padecer una enfermedad reumática mediada inmunológicamente.

En una forma de realización preferida de la invención, la enfermedad es RA, preferentemente RA temprana. En una forma de realización preferida, el procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria se caracteriza por que la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad autoinmunitaria sistémica y/o la muestra la proporciona un sujeto que es sospechoso de padecer una enfermedad autoinmunitaria sistémica. Preferentemente la enfermedad autoinmunitaria sistémica es SLE.

En una forma de realización particular del procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria, el procedimiento proporciona una sensibilidad de diagnóstico de por lo menos el 80%, preferentemente del 85%, preferentemente del 90%, preferentemente de por lo menos el 94%; preferentemente superior al 94%.

En el contexto de la presente divulgación, los polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos están preferentemente no relacionados con el factor reumatoide y el CCP. También se prefiere que los polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se reconozcan principalmente por la IgG.

No relacionado con el factor reumatoide y el CCP en la presente memoria significa que no existe una reactividad cruzada inmunológica basada en una secuencia primaria específica o relacionada estructuralmente entre dichos polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos y el factor reumatoide y la CCP.

Tal como se divulga en la presente memoria, los polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se seleccionan de un grupo que comprende hnRNP-D, -A1, -A2, -B1, -A/B y -A3. De forma incluso más preferida, dichos polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se seleccionan del grupo que comprende polipéptidos de las SEC ID NO: 6 a 17.

Un procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de

a. proporcionar una muestra de dicho paciente,

b. determinar en dicha muestra el nivel de por lo menos

- un anticuerpo contra un polipéptido hnRNP-DL o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme o una forma citrulinada del mismo y,

c. correlacionar los niveles determinados con la ausencia o la presencia de la enfermedad autoinmunitaria. Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de

- determinar en una muestra de dicho sujeto el nivel de por lo menos

- correlacionar los niveles determinados con la ausencia o la presencia de la enfermedad autoinmunitaria. Dicho polipéptido hnRNP-DL comprende preferentemente la secuencia que abarca los residuos de aminoácidos 81-420 de la SEC ID NO: 1, es decir, la SEC ID NO: 5. Preferentemente en el contexto del procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico.

Preferentemente, en el contexto de la presente invención, la muestra se selecciona de un grupo que comprende sangre, suero, saliva, lágrimas, líquido sinovial y cefalorraquídeo, plasma, orina y heces.

Los autoanticuerpos de la presente invención se detectan preferentemente en un ensayo, preferentemente un ensayo inmunológico, por ejemplo, un ensayo serológico. Los autoanticuerpos presentes en las muestras pueden detectarse, por ejemplo, inmovilizando los autoantígenos respectivos y detectando la unión de los anticuerpos después de poner en contacto los antígenos inmovilizados con la muestra.

Tal como se menciona en la presente memoria, un "ensayo" puede ser de cualquier tipo aplicado en el campo de los diagnósticos. Dicho ensayo puede basarse en la unión de un analito que se desea detectar a una o más sondas de captura con una determinada afinidad. Con respecto a la interacción entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés, la constante de afinidad es, en una forma de realización muy particular, preferentemente superior a 108 M-1.

En el contexto de la presente invención, las "moléculas de captura" son moléculas que pueden utilizarse para que se unan a moléculas diana o moléculas de interés, es decir, analitos, de una muestra. Por lo tanto, las moléculas de captura deben tener una forma adecuada, tanto espacial como en términos de características de superficie, tales como carga superficial, hidrofobicidad, hidrofilicidad, la presencia o la ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para unirse específicamente a las moléculas diana o moléculas de interés. De esta forma, la unión puede estar mediada, por ejemplo, por interacciones iónicas, de van-der-Waals, pi-pi, sigma-pi, hidrofóbicas o de enlaces de hidrógeno o una combinación de dos o más de las interacciones mencionadas anteriormente entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés.

Los procedimientos de detección preferidos comprenden inmunoensayos en diversos formatos, tales como, por ejemplo, inmunotransferencia, inmunoensayos de línea, inmunotransferencia inmuno-dot-blot, ensayos de inmunotransferencia dot-blot rápidos, radioinmunoensayos, quimioluminiscencia e inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos ligados a enzima (ELISA), matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatrices de proteínas y formatos de ensayo rápidos tales como, por ejemplo, ensayos de tira inmunocromatográfica.

Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos, ensayos de tipo sándwich competitivos y no competitivos. La composición general y los procedimientos relacionados con los "ensayos de tipo sándwich" están bien establecidos y son conocidos por los expertos. (The Immunoassay Handbook, ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3a ed. (mayo de 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol., febrero de 2006; 10 (1): 4-l0. PMID: 16376134), incorporados al presente documento por referencia.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un conjunto de proteínas que comprende:

i. un polipéptido hnRNP-DL citrulinado, en el que dicho polipéptido hnRNP-DL comprende por lo menos la secuencia de la SEC ID NO: 5 y

ii. por lo menos otro péptido seleccionado del grupo que comprende un polipéptido hnRNP que no tiene homología de secuencia con dicho polipéptido hnRNP-DL, seleccionándose dicho hnRNP del grupo que consiste en las SEC ID NO: 6 a 17, opcionalmente citrulinado, respectivamente, un péptido cíclico citrulinado (CCP), un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, MCV (vimentina citrulinada mutada), filagrina citrulinada, alfa-enolasa citrulinada y fibrinógeno citrulinado.

En el conjunto de proteínas tal como se describe en la presente memoria, dicho polipéptido hnRNP, o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo, no está relacionado con el factor reumatoide ni con el CCP. También se prefiere que dichos polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se reconozcan principalmente por la IgG. En una forma de realización particular, dichos polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se seleccionan del grupo que comprende hnRNP-D, -A1, -A2, -B1, -A/B y A3. Además, se prefiere que dichos polipéptidos hnRNP o fragmentos de los mismos o variantes de corte y empalme de los mismos se seleccionen del grupo que comprende polipéptidos de las SEC ID NO: 6 a 17. Determinados CCP se describen en el documento WO 98/22503. El documento WO 98/22503 muestra que la ciclación de los CCP conduce a una reactividad mejorada de los péptidos respectivos. En un ejemplo específico se muestra que si un péptido de fórmula general HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS, en la que X representa citrulina, se cicla por medio de un enlace disulfuro entre los dos residuos de cisteína, la sensibilidad aumenta al 63% en comparación con el 36% respecto al péptido lineal correspondiente. Como los autoanticuerpos presentes en los sueros de pacientes tienen una reactividad ligeramente diferente con respecto a diferentes péptidos cíclicos, se sugirió una combinación de péptidos en el documento WO 98/22503 para mejorar adicionalmente el ensayo. Los niveles de autoanticuerpos anti-CCP se pueden medir tal como se describe en el documento WO 03/050542. En resumen, se utiliza una combinación de péptidos que contienen sitios de epítopes con la fórmula general XG y X-noG en las que X representa citrulina, G representa glicina y noG representa cualquiera de los aminoácidos H, I, W, S, R, K, Y, M, F, V, P, Cit o un análogo de los mismos para evaluar el nivel de anticuerpos anti-CCP (anti-CCP) en una muestra. En el documento WO 03/050542 se divulgan péptidos específicos útiles en dicha evaluación. Como apreciarán fácilmente los expertos en la materia, son posibles mejoras y refinamientos adicionales con respecto al antígeno peptídico citrulinado cíclico utilizado en un ensayo para medir anti-CCP que, por ejemplo, darán como resultado una secuencia alterada de la secuencia del péptido citrulinado cíclico. Sin embargo, dichas modificaciones no se apartarán del ámbito de la presente invención.

También se divulga un ensayo de diagnóstico que comprende un conjunto de proteínas tal como se ha descrito anteriormente.

Dicho ensayo de diagnóstico proporciona preferentemente una sensibilidad de diagnóstico de por lo menos el 80%, de forma más preferida del 85%, de forma incluso más preferida del 90%, de la forma más preferida de por lo menos el 94% cuando se utiliza en el contexto de los procedimientos de la presente invención.

También se divulga un polipéptido hnRNP-DL que comprende la secuencia que abarca los residuos de aminoácidos 81 a 420 de la SEC ID NO: 1 (es decir, la SEC ID NO: 5) o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo o un polipéptido que presenta por lo menos el 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 5 o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo caracterizado porque este polipéptido hnRNP-DL se reconoce específicamente por un anticuerpo presente en una muestra de un sujeto que padece una enfermedad autoinmunitaria.

También se divulga un polipéptido hnRNP-DL o una composición que comprende el polipéptido hnRNP-DL con la secuencia de la SEC ID NO: 5 o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo o un polipéptido que muestra por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 5 o un fragmento del mismo o una variante de corte y empalme del mismo caracterizado porque este polipéptido hnRNP-DL se reconoce específicamente por un anticuerpo presente en una muestra de un sujeto que padece una enfermedad autoinmunitaria.

El polipéptido hnRNP-DL está citrulinado. La composición puede comprender adicionalmente un polipéptido hnRNP adicional, que puede estar opcionalmente citrulinado, seleccionado del grupo de hnRNP-B1, hnRNP-D, hnRNP-A1, hnRNP-A2, hnRNP-B1, hnRNP-A/B y hnRNP-A3, preferentemente hnRNP-B1 y hnRNP-D.

El polipéptido de la invención se modifica preferentemente de forma que el polipéptido no sea un activador inmunitario.

También se divulga una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención o fragmentos del mismo. Dicha composición farmacéutica puede comprender disolventes, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales que son conocidos por los expertos. La composición farmacéutica se puede utilizar en el tratamiento de enfermedades reumatoides, particularmente para el tratamiento de RA y SLE. También se divulga un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido tal como se ha descrito anteriormente, es decir, hnRNP-DL. En una forma de realización, este no muestra reactividad cruzada hacia otros tipos de polipéptidos hnRNP.

Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo neutralizante. En una forma de realización, un "anticuerpo neutralizante" se refiere a cualquier anticuerpo que es capaz de unirse a su antígeno específico in vivo pero que no es capaz de activar el sistema inmunitario. Esto se puede lograr, por ejemplo, aislando anticuerpos contra el antígeno de interés a partir de una muestra de un sujeto, la subsiguiente desglicosilación de los anticuerpos aislados ex vivo y reinsertando los anticuerpos desglicosilados en el sujeto.

El anticuerpo puede modificarse in vitro (por ejemplo, desglicosilarse, por ejemplo, mediante endoglicosidasa S (EndoS de Streptococcus pyogenes, y/o carboxilarse y/o transglutaminarse) y después devolverse al paciente para bloquear la activación inmunitaria. La eliminación del dominio de azúcar conduce a la pérdida de actividad proinflamatoria, es decir, la modulación in vivo de la glicosilación de anticuerpos es una estrategia para interferir con procesos autoinmunitarios.

Además, los anticuerpos se pueden modificar (por ejemplo, carboxilar) y después del aislamiento y la modificación se pueden devolver al paciente para inhibir la activación inmunitaria.

En el presente documento se describe también la utilización del conjunto de proteínas o el polipéptido, el polipéptido modificado o el anticuerpo tal como se describen en la presente memoria como inmunomoduladores para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad reumática mediada inmunológicamente. De forma incluso más preferida, la enfermedad es RA. La enfermedad autoinmunitaria puede ser una enfermedad autoinmunitaria sistémica. Preferentemente la enfermedad autoinmunitaria sistémica es SLE.

Los procedimientos, los ensayos, los polipéptidos, el conjunto de proteínas y el anticuerpo de la presente invención también se pueden utilizar para realizar un seguimiento del tratamiento en pacientes con RA o SLE. En dicha forma de realización, la presencia o la ausencia o el nivel de uno o más de los autoanticuerpos según la presente invención en una muestra de un paciente que padece RA o SLE son indicativos del éxito de un tratamiento contra SLE o RA en comparación con los valores correspondientes en muestras de referencia o muestras anteriores.

El conjunto de proteínas según el ensayo de diagnóstico o el polipéptido tal como se describe en la presente memoria también se pueden utilizar para predecir el desarrollo de RA en pacientes con artritis temprana.

Los polipéptidos hnRNP pueden ser también, particularmente en este contexto, derivados modificados sintéticamente o versiones modificadas postraduccionalmente de polipéptidos hnRNP, por ejemplo, polipéptidos hnRNP citrulinados y/o N,N-dimetilados. En particular, los polipéptidos del grupo que comprende polipéptidos de las SEC ID NO: 1 a 17 pueden modificarse sintéticamente o modificarse postraduccionalmente, por ejemplo citrulinarse o N,N-dimetilarse. Además, los hnRNP DL, D, A2, B1, A3, A1 o AB pueden modificarse sintéticamente o modificarse postraduccionalmente, por ejemplo citrulinarse o N,N-dimetilarse. Se prefiere una versión modificada in vitro de hnRNP (particularmente modificada mediante peptidilarginina desiminasa (PAD) de conejo o PAD humana (particularmente de tipo II o IV)) y tiene una sensibilidad de entre el 60% y el 70%. En particular, los péptidos lineales modificados fuera de la región M9 de los hnRNP pueden utilizarse para la detección específica de sueros de pacientes con RA.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos hnRNP según la presente invención se proporcionan en las SEC ID NO: 1 a 17 (Fig. 1 a 17). en la presente memoria también se describen proteínas o péptidos que tienen por lo menos el 70%, preferentemente por lo menos el 80%, de forma más preferida el 90%, de la forma más preferida el 95% de homología de secuencia o identidad de secuencia con las proteínas o péptidos respectivos según las SEC ID NO: 1 a 17. En particular, las secuencias homólogas respectivas de otros animales, preferentemente mamíferos, también se encuentran dentro del ámbito de la presente invención cuando el sujeto es un animal no humano.

Tal como se usa en la presente memoria, el grado de "homología" e "identidad" de secuencia se puede determinar utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la homología se puede determinar utilizando el programa de algoritmos de homología en línea "BLAST", disponible públicamente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

Los procedimientos, los ensayos, los anticuerpos y los conjuntos de proteínas de la presente invención también pueden utilizarse para el diagnóstico diferencial de RA y SLE. Por ejemplo, cuando se detectan anticuerpos contra hnRNP citrulinados o fragmentos citrulinados de hnRNP o contra ^cC^py los niveles de anticuerpos de RF son superiores a 50 [unidades] en la muestra, el paciente probablemente padece RA y no SLE. En caso de que no se detecten anticuerpos anti-CCP y se detecten anti-DNA o histona, Sm o CRP en una muestra de suero de un paciente, es probable que el paciente padezca SLE y no RA.

Los niveles de los marcadores obtenidos mediante los procedimientos o el uso de los procedimientos según la presente invención pueden analizarse de una serie de maneras bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, cada resultado de ensayo obtenido puede compararse con un valor "normal", o un valor que indica una enfermedad o un resultado particular. Un diagnóstico/pronóstico particular puede depender de la comparación de cada resultado del ensayo con dicho valor, que puede denominarse "umbral" de diagnóstico o pronóstico. En determinadas formas de realización, los ensayos para determinar uno o más indicadores de diagnóstico o pronóstico se correlacionan con una afección o enfermedad simplemente por la presencia o la ausencia del indicador o los indicadores en el ensayo. Por ejemplo, un ensayo puede diseñarse de forma que solo se produzca una señal positiva por encima de una concentración umbral de interés particular, y que por debajo de dicha concentración el ensayo no proporcione ninguna señal superior al fondo.

La sensibilidad y la especificidad de un ensayo de diagnóstico y/o pronóstico dependen de algo más que solamente la "calidad" analítica del ensayo, también dependen de la definición de qué constituye un resultado anormal. En la práctica, las curvas de características operativas del receptor (curvas ROC), se calculan normalmente mediante la representación del valor de una variable en función de su frecuencia relativa en poblaciones "normales" (es decir, aparentemente sanas) y en "enfermas". Para cualquier marcador particular, una distribución de niveles de marcador para sujetos con y sin una enfermedad probablemente se superpondrá. En dichas condiciones, un ensayo no distingue en absoluto lo normal de la enfermedad con una precisión del 100%, y el área de superposición indica dónde el ensayo no puede distinguir lo normal de la enfermedad. Se selecciona un umbral por encima del cual (o por debajo del cual, en función de cómo cambie un marcador con la enfermedad), el ensayo se considera que es anormal y por debajo del cual el ensayo se considera normal. El área bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que la medición percibida permita la identificación correcta de una afección. Las curvas ROC se pueden utilizar incluso cuando los resultados de los ensayo no proporcionan necesariamente un número exacto. Siempre que se puedan clasificar los resultados, se puede crear una curva ROC. Por ejemplo, los resultados de un ensayo en muestras de "enfermedad" podrían clasificarse según el grado (por ejemplo, 1 = bajo, 2 = normal y 3 = alto). Esta clasificación puede correlacionarse con los resultados en la población "normal", y crear así una curva ROC. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36. Preferentemente, se selecciona un umbral para proporcionar un área de curva ROC superior a aproximadamente 0,5, de forma más preferida superior a aproximadamente 0,7, de forma aún más preferida superior a aproximadamente 0,8, de forma incluso más preferida superior a aproximadamente 0,85, y de la forma más preferida superior a aproximadamente 0,9. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- 5% de una medición dada.

El eje horizontal de la curva ROC representa (especificidad 1), que aumenta con la tasa de falsos positivos. El eje vertical de la curva representa la sensibilidad, que aumenta con la tasa de verdaderos positivos. Por lo tanto, para un corte particular seleccionado, se puede determinar el valor de (especificidad 1), y se puede obtener una sensibilidad correspondiente. El área bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que el nivel del marcador medido permitirá la identificación correcta de una enfermedad o afección. Por lo tanto, el área bajo la curva ROC se puede utilizar para determinar la eficacia del ensayo.

También se divulga que no se confía en umbrales particulares para uno o más marcadores en un panel para determinar si un perfil de niveles de marcadores obtenidos de un sujeto es indicativo de un diagnóstico/pronóstico particular. Más bien, la presente invención puede utilizar una evaluación de un "perfil" de panel de marcadores como un todo unitario. Un patrón particular de "huella dactilar" de cambios en dicho panel de marcadores puede, en efecto, actuar como un indicador de diagnóstico o de pronóstico específico. Como se analiza en la presente memoria, ese patrón de cambios se puede obtener a partir de una única muestra o de cambios temporales en uno o más miembros del panel (o un valor de respuesta del panel). Un panel en la presente memoria se refiere a un conjunto de marcadores.

Tal como se describe en la presente memoria más adelante, un valor de respuesta del panel se determina preferentemente representando curvas ROC para la sensibilidad (es decir, verdaderos positivos) de un panel particular de marcadores frente a 1-(especificidad) (es decir, falsos positivos) para el panel en diversos puntos de corte. En estos procedimientos, un perfil de mediciones de marcadores de un sujeto se considera en conjunto para proporcionar una probabilidad general (expresada como una puntación numérica o como un porcentaje de riesgo) de un diagnóstico o pronóstico. En dichas formas de realización, un aumento en un determinado subconjunto de marcadores puede ser suficiente para indicar un diagnóstico/pronóstico particular en un paciente, mientras que un aumento en un subconjunto diferente de marcadores puede ser suficiente para indicar el mismo o diferente diagnóstico/pronóstico en otro paciente. También se pueden aplicar factores de ponderación a uno o más marcadores de un panel, por ejemplo, cuando un marcador es de una utilidad particularmente alta en la identificación de un diagnóstico/pronóstico particular, puede ponderarse de forma que a un nivel dado él solo sea suficiente para señalar un resultado positivo. Del mismo modo, un factor de ponderación puede proporcionar que ningún nivel dado de un marcador particular sea suficiente para indicar un resultado positivo, sino que solo indique un resultado cuando otro marcador también contribuye al análisis.

Los marcadores y/o paneles de marcadores pueden seleccionarse de forma que muestren por lo menos aproximadamente el 70% de sensibilidad, de forma más preferida por lo menos aproximadamente el 80% de sensibilidad, de forma incluso más preferida por lo menos aproximadamente el 85% de sensibilidad, de forma aún más preferida por lo menos aproximadamente el 90% de sensibilidad y de la forma más preferida por lo menos aproximadamente el 95% de sensibilidad, combinada con por lo menos aproximadamente el 70% de especificidad, de forma más preferida por lo menos aproximadamente el 80% de especificidad, de forma incluso más preferida por lo menos aproximadamente el 85% de especificidad, de forma aún más preferida por lo menos aproximadamente el 90% de especificidad y de la forma más preferida por lo menos aproximadamente el 95% de especificidad. En formas de realización particularmente preferidas, tanto la sensibilidad como la especificidad son por lo menos de aproximadamente el 75%, de forma más preferida de por lo menos aproximadamente el 80%, de forma incluso más preferida de por lo menos aproximadamente el 85%, de forma aún más preferida de por lo menos aproximadamente el 90% y de la forma más preferida de por lo menos aproximadamente el 95% %. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- 5% de una medición dada.

Se puede utilizar una relación de probabilidad positiva, una relación de probabilidad negativa, una razón de momios o una relación de riesgo como medida de la capacidad de un ensayo para predecir el riesgo o diagnosticar una enfermedad. En el caso de una relación de probabilidad positiva, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre sujetos tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "control"; un valor superior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo enfermo y un valor inferior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de control. En el caso de una relación de probabilidad negativa, un valor de 1 indica que un resultado negativo es igualmente probable entre sujetos tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "control"; un valor superior a 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo de ensayo y un valor inferior a 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo de control. Los marcadores y/o paneles de marcadores pueden seleccionarse preferentemente de forma que muestren una relación de probabilidad positiva o negativa de por lo menos aproximadamente 1.5 o más o aproximadamente 0.67 o menos, de forma más preferida de por lo menos aproximadamente 2 o más o aproximadamente 0.5 o menos, de forma aún más preferida de por lo menos aproximadamente 5 o más o aproximadamente 0.2 o menos, de forma incluso más preferida de por lo menos aproximadamente 10 o más o de aproximadamente 0,1 o menos, y de la forma más preferida de por lo menos aproximadamente 20 o más o aproximadamente 0.05 o menos. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- 5% de una medición dada.

En el caso de una razón de momios, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre los sujetos de los grupos "enfermo" y "control"; un valor superior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo enfermo y un valor inferior a 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de control. Los marcadores y/o paneles de marcadores pueden seleccionarse preferentemente de forma que muestren una razón de momios de por lo menos aproximadamente 2 o más o aproximadamente 0.5 o menos, de forma más preferida de por lo menos aproximadamente 3 o más o aproximadamente 0.33 o menos, de forma aún más preferida de por lo menos aproximadamente 4 o más o aproximadamente 0.25 o menos, de forma incluso más preferida de por lo menos aproximadamente 5 o más o aproximadamente 0.2 o menos y de la forma más preferida de por lo menos aproximadamente 10 o más o aproximadamente 0.1 o menos. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- 5% de una medición dada.

En el caso de una relación de riesgo, un valor de 1 indica que el riesgo relativo de un punto final (por ejemplo, la muerte) es igual en los grupos "enfermo" y "control"; un valor superior a 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo enfermo y un valor inferior a 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo de control. Los marcadores y/o paneles de marcadores pueden seleccionarse preferentemente de forma que muestren una relación de riesgo de por lo menos aproximadamente 1.1 o más o aproximadamente 0.91 o menos, de forma más preferida de por lo menos aproximadamente 1.25 o más o aproximadamente 0.8 o menos, de forma aún más preferida de por lo menos aproximadamente 1.5 o más o aproximadamente 0.67 o menos, de forma incluso más preferida de por lo menos aproximadamente 2 o más o aproximadamente 0.5 o menos y de la forma más preferida de por lo menos aproximadamente 2.5 o más o aproximadamente 0.4 o menos. El término "aproximadamente" en este contexto se refiere a /- 5% de una medición dada.

El experto entenderá que la asociación de un indicador de diagnóstico o de pronóstico con un diagnóstico o con un riesgo de pronóstico de un resultado clínico futuro es un análisis estadístico. Por ejemplo, un nivel de marcador superior a X puede indicar que un paciente tiene más probabilidades de sufrir un resultado adverso que los pacientes con un nivel inferior o igual a X, determinado mediante un nivel de significancia estadística. Además, un cambio en la concentración del marcador con respecto a los niveles de referencia puede reflejar el pronóstico del paciente, y el grado de cambio en el nivel del marcador puede relacionarse con la gravedad de los eventos adversos. La significancia estadística a menudo se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor de p. Véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza preferidos de la invención son 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% y 99.99%, mientras que los valores de p preferidos son 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, y 0.0001.

Se pueden realizar múltiples determinaciones de marcadores de diagnóstico o de pronóstico, y se puede utilizar un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, la concentración de un marcador en una muestra de sujeto puede determinarse en un momento inicial, y de nuevo en un segundo momento a partir de una segunda muestra del sujeto. Un aumento en el marcador desde el momento inicial hasta el segundo momento puede ser indicativo de un diagnóstico particular, o un pronóstico particular. Del mismo modo, una disminución en el marcador desde el momento inicial hasta el segundo momento puede ser indicativo de un diagnóstico particular, o un pronóstico particular.

El término "muestra", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una muestra de fluido corporal obtenida con un propósito de diagnóstico, pronóstico o evaluación de un sujeto de interés, tal como un paciente. Las muestras de ensayo preferidas incluyen sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, esputo y derrames pleurales. Además, un experto se dará cuenta de que algunas muestras de ensayo se analizarán más fácilmente después de un procedimiento de fraccionamiento o purificación, por ejemplo, la separación de sangre completa en componentes de suero o plasma.

El término "sujeto", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un organismo vivo humano o no humano que recibe atención médica o que debería recibir atención médica debido a una enfermedad. Esto incluye a personas sin enfermedad definida que están siendo investigadas para determinar signos de patología. Por lo tanto, los procedimientos y ensayos descritos en la presente memoria son aplicables tanto a enfermedades humanas como veterinarias.

Los resultados de los procedimientos y ensayos de la presente invención, es decir, la presencia o la ausencia de los autoanticuerpos contra los péptidos marcadores de la invención o el nivel de los autoanticuerpos pueden correlacionarse con un pronóstico o diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, particularmente RA o S, tal como se ha descrito anteriormente.

Las expresiones "correlacionado" o "correlacionarse", tal como se utilizan en la presente memoria con referencia al uso de marcadores de diagnóstico y de pronóstico, se refieren a la comparación de la presencia o la cantidad del marcador o los marcadores en un paciente con su presencia o su cantidad en personas que se sabe que padecen, o se sabe que están en riesgo de padecer, una afección dada; o en personas que se sabe que no padecen una afección dada. Tal como se ha discutido anteriormente, un nivel de un marcador en una muestra de un paciente puede compararse con un nivel conocido asociado con un diagnóstico específico. Se dice que el nivel de un marcador en la muestra se ha correlacionado con un diagnóstico; es decir, el experto puede utilizar el nivel de marcador para determinar si el paciente padece un tipo específico de diagnóstico y responder en consecuencia. Alternativamente, el nivel de un marcador en la muestra se puede comparar con un nivel del marcador que se sabe que está asociado con un buen resultado (por ejemplo, la ausencia de enfermedad, etc.). En formas de realización preferidas, un panel de niveles de marcadores se correlaciona con una probabilidad global o un resultado particular.

En una forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico diferencial de artritis reumatoide y una enfermedad autoinmunitaria sistémica que comprende las etapas de

- poner en contacto una muestra de un sujeto con:

i. un primer polipéptido hnRNP que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5 y

ii. un segundo polipéptido hnRNP que es el mismo que el primero, pero que está citrulinado (cit-hnRNP) - determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho primer y segundo polipéptido hnRNP y además determinar si la cantidad de anticuerpo unido a dicho primer polipéptido hnRNP es aproximadamente igual o inferior a la cantidad de anticuerpo unido a dicho segundo polipéptido hnRNP, pudiendo diagnosticarse artritis reumatoide si la relación entre el anticuerpo unido a cit-hnRNP y el anticuerpo unido a hnRNP es 1.2 o superior.

La enfermedad autoinmunitaria sistémica se puede seleccionar del grupo de lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, artritis psoriásica, espondiloartropatías, artritis reactiva u osteoartritis, una enfermedad de las articulaciones principalmente degenerativa.

Preferentemente, la relación es de 1.5, 1.8, 2, 2.5, 3, 3.5 o superior.

Preferentemente, el primer y el segundo hnRNP se seleccionan del grupo de hnRNP-D, -A1, -A2, -B1, -A/B y hnRNP-DL. Más preferentemente se analizan otros hnRNP, uno de los cuales es hnRNP-DL.

Es importante tener en cuenta que los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden no estar presentes simplemente como una composición, en la que, por ejemplo, están presentes dos o más hnRNP, pero también pueden estar presentes como moléculas quiméricas en las que, por ejemplo, un primer y un segundo hnRNP se fusionan conjuntamente en una forma de cabeza a cola, o de cabeza a cabeza, o de cola a cola. Se fusionarían preferentemente solo la región inmunodominante, es decir, los dominios de unión a ARN. También pueden fusionarse polipéptidos de longitud completa.

Descripción de los dibujos

Las secuencias de aminoácidos de determinados hnRNP y sus variantes de corte y empalme (isoformas) se proporcionan en las figuras 1 a 17.

Figura 1: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de hnRNP-DL humano (SEC ID NO. 1)

Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de hnRNP-DL humano (SEC ID NO: 2)

Figura 3: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 3 de hnRNP-DL humano (SEC ID NO: 3)

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 4 de hnRNP-DL humano (SEC ID NO: 4)

Figura 5: Secuencia de los residuos de aminoácidos 81-420 de la isoforma 1 de hnRNP-DL humano (SEC ID NO: 5, es decir, residuos de aminoácidos 81-420 de la SEC ID NO: 1)

Figura 6: Secuencia de aminoácidos de hnRNP-A2 humano (SEC ID NO: 6)

Figura 7: Secuencia de aminoácidos de hnRNP-B1 humano (SEC ID NO: 7)

Figura 8: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de hnRNP-D humano (SEC ID NO: 8)

Figura 9: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de hnRNP-D humano (SEC ID NO: 9)

Figura 10: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 3 de hnRNP-D humano (SEC ID NO: 10)

Figura 11: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 4 de hnRNP-D humano (SEC ID NO: 11)

Figura 12: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de hnRNP-A3 humano (SEC ID NO: 12)

Figura 13: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de hnRNP-A3 humano (SEC ID NO: 13)

Figura 14: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de hnRNP-A1 humano (SEC ID NO: 14)

Figura 15: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de hnRNP-A1 humano (SEC ID NO: 15)

Figura 16: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 1 de hnRNP-A/B humano (SEC ID NO: 16)

Figura 17: Secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 de hnRNP-A/B humano (SEC ID NO: 17)

Figura 18: Inmunotransferencia con hnRNP citrulinados. El hnRNP citrulinado (cit-hnRNP) se puede utilizar en un inmunoensayo de línea (LIA) e inmunotransferencia para detectar sueros con RA. Reconocimiento adicional de sueros pero sin pérdida de reactividad de hnRNP nativos. Se analizaron 24 sueros mediante inmunotransferencia. El hnRNP citrulinado y el hnRNP sin modificar se transfirieron y se analizaron mediante inmunotransferencia con 24 sueros de RA e IgG antihumana conjugada con AP. La reactividad se incrementa en los 6 (6 de 24; 25%) sueros de pacientes positivos a hnRNP con cit-hnRNP y 5 sueros dan positivo adicionalmente por medio de sueros de RA cuando se citrulinan y se analizan mediante inmunotransferencia, siendo ahora en total 11 (11 de 24; 46%) positivos. Conclusión: utilizando cit-hnRNP en un inmunoensayo, la sensibilidad general del ensayo aumenta en un 21% y la intensidad de la señal positiva aumenta en el 100% de los sueros de pacientes analizados.

Figura 19: los inmunoensayos basados en hnRNP citrulinados o sin modificar pueden distinguir entre artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios sistémicos que pueden mostrar una manifestación reumática. Solo RA proporcionará señales positivas adicionales e intensidades de señal mejoradas (> factor 1.2) en hnRNP citrulinados.

Ejemplos

Ejemplo 1: Determinación del nivel de anticuerpos anti-hnRNP en muestras de pacientes que padecen RA oSLE

256 muestras de pacientes que padecen RA (n = 169), SLE (n = 63) y un grupo de control (n = 24). Las muestras de suero se derivan de pacientes bien caracterizados clínicamente y serológicamente de un estudio clínico del departamento de pacientes ambulatorios de la Charité Universitatsmedizin, Berlín, Alemania.

Para la detección de anticuerpos específicos para las diversas proteínas hnRNP, se realizaron inmunoensayos ELISA de sitio único no competitivos, en los que las placas de microvaloración se recubrieron con el antígeno hnRNP distinto respectivo. Los valores de corte (= valor medio 2 * desviación estándar) se determinaron para los niveles de anticuerpos con respecto a los niveles en el grupo de control. Los valores de corte para hnRNP-D y hnRNP-DL se determinaron como 0.09 y 0.1 OD, respectivamente. Estos valores de corte se utilizaron para determinar la presencia o la ausencia de la enfermedad en el paciente (positivo/negativo).

Las tablas 1 y 2 resumen los resultados de la determinación de la presencia de anticuerpos contra hnRNP-D y hnRNP-DL en muestras de suero de los pacientes del estudio. La tabla 3 resume los resultados de una combinación de ambos ensayos.

Tabla 1: Aparición y distribución relativa de la presencia de anticuerpos contra hnRNP-D en muestras de suero de pacientes

La especificidad de RA o SLE frente al control fue del 96%, la especificidad de RA frente a SLE fue del 70%. Tabla 2: Aparición y distribución relativa de la presencia de anticuerpos contra hnRNP-DL en muestras de suero de pacientes

La especificidad de RA o SLE frente al control fue del 96%, la especificidad de RA frente a SLE fue del 54%. Tabla 3: Aparición y distribución relativa de la presencia de anticuerpos contra hnRNP-D y hnRNP-DL en muestras de suero de pacientes

La especificidad de RA o SLE frente al control fue del 92%, la especificidad de RA frente a SLE fue del 52%. No se observó reactividad cruzada de los anticuerpos para hnRNP-D y hnRNP-DL.

La tabla 4 resume los resultados para un análisis ROC de los datos. Las tablas 5 y 6 indican la exactitud de los ensayos.

Tabla 4: Área bajo la curva (AUC) más errores estándar (e.e.) para el diagnóstico de RA y SLE mediante la determinación de anticuerpos contra hnRNP-D y hnRNP-DL ya sea individualmente o en combinación en muestras de suero de pacientes

Tabla 5: Precisión, especificidad y sensibilidad para los ensayos de detección con respecto a la RA.

Tabla 6: Precisión, especificidad y sensibilidad para los ensayos de detección con respecto al SLE.

Ejemplo 2: Relevancia de hnRNP-DL en el diagnóstico temprano

Un diagnóstico temprano de la artritis reumatoide (RA) puede evitar la pérdida del movimiento y el daño a las articulaciones. El diagnóstico común en suero de la RA (factores reumatoides y PCR) no es suficiente por sí solo porque los factores reumáticos son demasiado inespecíficos (también se pueden encontrar pruebas de otras enfermedades e infecciones autoinmunitarias). A su vez, los anticuerpos contra los péptidos citrulinados cíclicos (CCP) aparecen casi exclusivamente en pacientes con artritis reumática (especificidad de hasta el 98%). Sin embargo, hasta el 30% de los pacientes con RA temprana presentan sueros negativos a RF y/o CCP. La

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de determinación en una muestra de un sujeto de la presencia de dos o más anticuerpos que comprende:

- poner en contacto dicha muestra con:

i. un polipéptido similar a hnRNP-D (hnRNP-DL) citrulinado que comprende la secuencia de SEC ID n°: 5, y

ii. por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, y

- determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL citrulinado y determinar además si por lo menos un anticuerpo adicional está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dicho por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, y/o dicho CCP y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente.

2. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende:

- determinar en una muestra de dicho sujeto la presencia de:

i. un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP-DL que comprende la secuencia de SEC ID n°: 5, y

ii. por lo menos otro anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, en el que dicho otro polipéptido hnRNP comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 6 a 17, y/o un péptido citrulinado cíclico (CCP) y/o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG,

en el que la presencia de un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido hnRNP-DL y por lo menos un anticuerpo adicional que reconoce específicamente dicho por lo menos otro polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, o dicho péptido CCP, o un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, respectivamente es indicativa de la presencia de la enfermedad autoinmunitaria en dicho sujeto.

3. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria según la reivindicación 2 caracterizado por que la muestra es proporcionada por un sujeto que se sospecha que presenta una enfermedad inmunitaria de fase temprana; en el que el sujeto no ha mostrado ningún síntoma durante más de 3 meses o la enfermedad autoinmunitaria no se ha diagnosticado durante más de 3 meses en dicho sujeto.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad reumática mediada inmunológicamente, preferentemente RA temprana, y/o la muestra es proporcionada por un sujeto que se sospecha que presenta una enfermedad reumática mediada inmunológicamente, preferentemente RA temprana.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad autoinmunitaria sistémica, preferentemente el lupus eritematoso sistémico, y/o la muestra es proporcionada por un sujeto que se sospecha que presenta una enfermedad autoinmunitaria sistémica, preferentemente el lupus eritematoso sistémico.

6. Conjunto de proteínas que comprende:

i. un polipéptido hnRNP-DL citrulinado, en el que dicho polipéptido hnRNP-DL comprende por lo menos la secuencia de SEC ID n°: 5; y

ii. por lo menos otro péptido seleccionado de entre el grupo que comprende un polipéptido hnRNP que no es homólogo de secuencia a dicho polipéptido hnRNP-DL, siendo seleccionado dicho hnRNP de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 6 a 17, opcionalmente citrulinado, respectivamente, un péptido cíclico citrulinado (CCP), un polipéptido que comprende por lo menos la parte Fc de IgG, MCV (vimentina citrulinada mutada), filagrina citrulinada, alfa-enolasa citrulinada y fibrinógeno citrulinado.

7. Kit de diagnóstico que comprende un conjunto de proteínas según la reivindicación 6.

8. Polipéptido hnRNP-DL citrulinado o composición que comprende el polipéptido hnRNP-DL citrulinado, en el que el hnRNP-DL citrulinado comprende la secuencia de SEC ID n°: 5.

9. Utilización de un conjunto de proteínas según la reivindicación 6, o un kit de diagnóstico según la reivindicación 7, o un polipéptido hnRNP-DL, o una composición que comprende el polipéptido hnRNP-DL citrulinado según la reivindicación 8 para predecir el desarrollo de RA en pacientes con artritis temprana, en la que el polipéptido hnRNP-DL comprende la secuencia de SEC ID n°: 5.

10. Procedimiento para evaluar la ausencia o la presencia de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de

- determinar en una muestra de dicho sujeto el nivel de por lo menos

i. un anticuerpo contra un polipéptido hnRNP-DL citrulinado, comprendiendo el polipéptido hnRNP-DL la secuencia de SEC ID n°: 5;

- poner en contacto una muestra de un sujeto con:

i. un primer polipéptido hnRNP que comprende la secuencia de SEC ID n°: 5, y

ii. un segundo polipéptido hnRNP que es el mismo que el primero pero que está citrulinado (cit-hnRNP) - determinar si un anticuerpo está presente en dicha muestra que reconoce específicamente dichos primer y segundo polipéptidos hnRNP y determinar además si la cantidad de anticuerpo unido a dicho primer polipéptido hnRNP es aproximadamente la misma que o inferior a la cantidad de anticuerpo unido a dicho segundo polipéptido hnRNP, en el que puede diagnosticarse artritis reumatoide si la relación entre el anticuerpo unido a cit-hnRNP y el anticuerpo unido a hnRNP es 1.2 o superior.