BR112012026219B1 - método para o diagnóstico de glaucoma, elementos carreadores de antígeno e kit - Google Patents

Abstract

método diagnósticos para glaucoma. a presente invenção refere-se a um primeiro método diagnóstico para glaucoma com base em uma análise da reatividade autoimune em fluidos corporais contra pelo menos uma amostra de antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados, em que a reatividade autoimune contra antígenos individuais é medida e transformada em um escore de glaucoma para determinar o resultado diagnóstico. outros aspectos da invenção incluem elementos portadores de antígeno que trazem pelo menos uma amostra dos antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados e kits para o diagnóstico de glaucoma. outros aspectos incluem métodos de coleta de um fluido corporal, tais como lágrimas, para a utilização no método diagnóstico para o glaucoma. ainda outros aspectos incluem antígenos oculares que servem como marcadores diagnósticos e/ ou para o preparo de composições farmacêuticas para o tratamento de glaucoma. a invenção diz ainda respeito a um segundo método diagnóstico para glaucoma compreendendo as etapas de: a) fornecimento de uma cultura de células in vitro, b) incubação de um fluido corporal de um indivíduo teste com a cultura de células in vitro ou componentes de incubação, os quais são francionados a partir do fluido corporal ou de uma amostra corporal do indivíduo de teste com a cultura de células in vitro, c) análise da expressão de protéina das células e/ ou análise da viabilidade das células após o tratamento de acordo com a etapa b) e d) comparação dos resultados da análise na etapa c) com os dados padrões para determinar um resultado diagnóstico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO DE GLAUCOMA, ELEMENTOS CARREADORES DE ANTÍGENO E KIT".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção repousa no campo de diagnóstico médico e refere-se, em particular, a métodos de diagnóstico de glaucoma baseados em análise de reatividade autoimune. A presente invenção compreende dois métodos diagnósticos para glaucoma. O primeiro e o segundo método diagnóstico contam com as reatividades autoimunes em fluidos corporais de pacientes com glaucoma. Um outro aspecto da invenção refere-se a métodos terapêuticos de modulação da reatividade autoimune de pacientes com glaucoma.

[0002] Um primeiro método diagnóstico para glaucoma é baseado em uma análise de reatividade autoimune de fluidos corporais contra antígenos oculares os quais são pelo menos parcialmente purificados. Um segundo método diagnóstico para glaucoma é baseado na análise do efeito de autoanticorpos em fluidos corporais, sobre a expressão de proteína de células ganglionares da retina (RGC) cultivadas in vitro. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Glaucoma é um grupo de distúrbios oculares caracterizado por perda progressiva de células ganglionares da retina e seus axônios e uma perda gradual de campo visual. Ele é uma das principais causas de cegueira no mundo todo. O glaucoma tem uma prevalência de cerca de 1-2% na população geral na Europa. Até 3-4% das pessoas com idade acima de 60 anos são afetadas pela doença. A forma mais comum de glaucoma é o glaucoma de ângulo aberto primário (Primary Open-Angle Glaucoma - POAG), com uma prevalência oscilando de 1,1% a 2%.

[0004] A patogênese de glaucoma é apenas parcialmente entendida e uma pressão intraocular elevada não é unicamente responsável pela doença. Uma pressão intraocular aumentada ainda é considerada como um principal fator de risco, mas outros fatores patogênicos, tais como processos apoptóticos, níveis elevados de óxido nítrico ou um envolvimento do sistema imune provavelmente são relevantes.

[0005] Além disso, uma pressão intraocular elevada é muito prevalente (10% da população na idade de 40 anos), contudo, apenas alguns desenvolvem glaucoma com os anos. Até o momento, não há testes diagnósticos padrões para identificar quais pessoas com uma pressão intraocular elevada desenvolvem glaucoma. Uma vez que um tratamento precoce de glaucoma é crucial para prevenir a perda de visão, há uma necessidade por ferramentas diagnósticas aprimoradas, as quais detectam glaucoma em um estágio precoce, independente de uma pressão intraocular elevada.

[0006] Uma pressão intraocular elevada é conhecida como uma principal causa de morte celular da retina e o desenvolvimento da doença glaucoma. Pressão elevada como uma causa para morte celular foi reproduzida in vitro. Agar et al. (Brain Res. 2006. 1086(1): página 191-200) expuseram culturas in vitro de linhagens de células ganglionares da retina à pressão hidrostática elevada e induziram à morte celular.

[0007] Contudo, sabe-se também que cerca de 30% dos casos de glaucoma não são acompanhados por uma pressão intraocular elevada. Pelo menos algumas formas da doença glaucoma se adaptam ao padrão de doenças neurodegenerativas com disfunção progressiva de aspectos do sistema nervoso junto com atrofia progressiva das estruturas afetadas do sistema nervoso central ou periférico. Portanto, são discutidos causas e mecanismos adicionais os quais, além de uma pressão intraocular elevada, levam à destruição das células ganglionares da retina tais como, por exemplo, um nível elevado de óxido nítrico ou um processo mediado por células T ou ataques autoimunes.

[0008] Métodos de detecção precoce de glaucoma são ainda limitados. Medição da pressão intraocular pode detectar alguns dos pacientes, mas níveis de pressão flutuantes também podem dar um resultado falso negativo. No momento quando os próprios pacientes reconhecem uma perda da função visual, um grande defeito irreversível de células ganglionares da retina já ocorreu na maioria dos casos.

[0009] Aproximadamente 30% dos casos de glaucoma, os quais não são acompanhados por uma pressão intraocular elevada, são denominados como glaucoma de tensão normal. O método de detecção tradicional que mede uma pressão intraocular elevada falha com esses pacientes. Considerando a falta de um método diagnóstico para o glaucoma de tensão normal, bem como a falta de um método de detecção para a fase inicial do glaucoma, é necessário desenvolver métodos para a detecção de glaucoma independente da pressão intraocular. Autoimunidade, como um fator importante em Glaucoma, foi demonstrada em vários estudos que mostram anticorpos séricos contra antígenos oculares. Por exemplo, proteínas de choque térmico HSP27, HSP60, α-B-cristalina, enolase-γ, α-fodrina, glutationa-S-transferase e glicosaminoglicanas, têm diferentes níveis de reatividades de ligação em pacientes com glaucoma comparado com indivíduos saudáveis (por exemplo, Joachim, Res S.C., et al., Curr Eye 2007, 32 (6): páginas 501-9). Curiosamente, não só reatividades elevadas de anticorpos, o que poderia ter um impacto autoagressivo mas, para certos antígenos, reatividades autoimunes diminuídas, são característicos em fluidos corporais de pacientes com glaucoma. Além disso, demonstrou-se que a aplicação direta de anticorpos anti-Hsp resulta em uma apoptose das células ganglionares da retina em uma abordagem de cultura de células (Tezel G., et al., Invest. Ophthalmol.

Vis. Sci. 1998; 39: 2277-2287).

[00010] Anteriormente, métodos diagnósticos com base no padrão de reatividade autoimune específico de pacientes com glaucoma foram divulgados. Por exemplo, o documento WO2004/036220 descreve métodos para o diagnóstico de glaucoma através da análise do repertório de autoanticorpos complexo nos fluidos corporais, tais como soro, lágrimas, saliva ou humor aquoso contra antígenos oculares. Como fonte de antígenos oculares, misturas brutas de antígenos da retina, antígenos do nervo óptico e outros têm sido utilizados e os padrões de reatividade autoimune complexos foram medidos. Uma variedade de técnicas imunológicas analíticas, incluindo ensaios Western blot, ensaio de quimioluminescência, ELISA, radioimunoensaios para a detecção e medição dos padrões de reatividade autoimune, bem como métodos para detecção, processamento e análise por imagem digital, foram utilizados para a geração e análise comparativa dos padrões de reatividade autoimune de indivíduos teste, indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma foram divulgados. O documento WO2004/036220 ensina métodos diagnósticos para o glaucoma contando com os padrões de reatividade autoimune contra antígenos oculares, os quais não são isolados a partir de misturas complexas de um grande número de antígenos oculares e a maioria dos quais ainda não foram identificados. A diferença dos padrões de reatividade autoimune em fluidos corporais de indivíduos teste, indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma, então, proporciona o resultado diagnóstico. No entanto, estudos na área de diagnóstico sobre outras doenças, tal como câncer, revelaram que diagnóstico baseado em reatividade autoimune contra biomarcadores de identidade desconhecida é muitas vezes não confiável. Assim, há uma necessidade por métodos confiáveis de diagnóstico de glaucoma, os quais são independentes de uma pressão intraocular elevada.

[00011] É um objetivo da presente invenção proporcionar métodos diagnósticos alternativos e aprimorados e confiáveis para detectar glaucoma independente de uma pressão intraocular aumentada por meio de análise de fluidos corporais. É um objetivo adicional da presente invenção proporcionar métodos diagnósticos para detectar glaucoma com graus selecionáveis de sensibilidade e especificidade usados tanto para testagem rápida quanto para testagem em laboratório profissional. Outros objetivos da presente invenção incluem o fornecimento de elementos portadores antígeno e kits para o diagnóstico de glaucoma, bem como antígenos oculares recentemente identificados que servem como biomarcadores para o diagnóstico de glaucoma e como agentes de bloqueio no tratamento terapêutico de glaucoma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00012] Um aspecto da presente invenção diz respeito a um primeiro método diagnóstico para glaucoma com base em uma análise da reatividade autoimune em um fluido corporal contra pelo menos uma amostra compreendendo pelo menos um antígeno ocular pelo menos parcialmente purificado, em que as reatividades autoimunes contra um ou mais antígenos oculares conhecidos são medidas e transformadas em um escore de glaucoma por sua contribuição ponderada preferível das reatividades autoimunes medidas para um resultado diagnóstico.

[00013] Outros aspectos da invenção incluem elementos portadores antígeno que trazem pelo menos um antígeno ocular parcialmente purificado e métodos de preparo desses elementos portadores antígeno e uso dos mesmos para diagnóstico de glaucoma. Outros aspectos incluem kits para diagnóstico de glaucoma que compreendem o elemento portador antígeno e, opcionalmente, materiais auxiliares. Outros aspectos incluem métodos de coleta de um fluido corporal, tal como lágrimas, para a utilização no método diagnóstico para o glaucoma. Ainda outros aspectos incluem antígenos oculares que servem como biomarcadores para o diagnóstico de glaucoma ou servem como agentes terapêuticos no tratamento terapêutico de glaucoma ou servem para o preparo de anticorpos específicos que se ligam a tal antígeno ocular, para utilização em um método ou composição diagnóstica ou terapêutica. [00014] O primeiro método diagnóstico de glaucoma compreende as etapas de (a) fornecimento de pelo menos uma amostra compreendendo pelo menos um antígeno ocular pelo menos parcialmente purificado, (b) reação de um fluido corporal com a pelo menos uma amostra de antígeno ocular, (c) detecção e / ou quantificação das reações entre autoanticorpos no fluido corporal e a pelo menos uma amostra de antígeno ocular da etapa b para determinar um valor de reatividade autoimune, d) comparação dos valores medidos com os dados padrões de reatividade autoimune obtidos a partir de pacientes com glaucoma e / ou de indivíduos saudáveis para determinar um escore de glaucoma para a amostra de pelo menos um antígeno e e) opcionalmente, determinação do resultado diagnóstico por meio de avaliação do pelo menos um escore de glaucoma.

[00015] O termo fluido corporal de indivíduos humanos ou animais, no contexto do presente pedido inclui, porém sem limitações, soro, lágrimas, saliva, urina, humor aquoso, humor vítreo do olho ou fluido cérebro-espinhal e suas frações ou um homogenato tecidual de espécimes de indivíduos humanos ou animais e frações dos mesmos. Em modalidades preferidas do método diagnóstico de glaucoma, soro sanguíneo ou lágrimas são usados.

[00016] Antígeno ocular refere-se a qualquer antígeno que ocorre também no olho e, obviamente, alguns destes antígenos oculares explicitamente mencionados abaixo são ubíquos. Antígenos oculares presentes no olho incluem, em particular, antígenos da retina, antígenos do nervo óptico, antígenos da cabeça do nervo óptico, antígenos da rede trabecular, antígenos uveais. Sabe-se que os antígenos relevantes para glaucoma não se restringem à proteínas presentes em células ganglionares da retina, mas incluem antígenos os quais são característicos de células vizinhas, tais como células da glia ou de componentes do citoesqueleto.

[00017] Além disso, para o presente pedido, o termo antígenos oculares - incluindo todos os antígenos oculares designados especificamente mencionados abaixo - aplica-se não apenas à formas fisiológicas, naturais das respectivas proteínas, mas também à formas pós-traducionalmente modificadas e quaisquer outros derivados artificiais ou naturais, tais como peptídeos, e formas as quais são marcadas, clivadas, modificadas quimicamente de outro modo, incluindo combinações das modificações mencionadas.

[00018] Antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados refere-se a antígenos oculares que são isolados a partir da mistura complexa de proteínas de seu meio ambiente fisiológico por meio de purificação, pelo menos parcial, da proteína por meio de técnicas padrões de purificação de proteínas. Antígenos oculares com pureza de grau comercial disponíveis também são considerados como antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados para utilização em um método diagnóstico de glaucoma, no contexto do presente documento. Tais purificação parcial proporciona pelo menos 70% de um ou mais antígenos oculares desejados, em peso de proteína total, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%.

[00019] O termo amostra de antígeno ocular refere-se a uma amostra que compreende um ou mais antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados. Em modalidades preferidas do método de acordo com a invenção, a amostra de antígeno ocular compreende apenas um antígeno ocular e escores de glaucoma são determinados individualmente para cada um dos antígenos oculares parcialmente purificados separadamente. Em outras modalidades preferidas, dois ou mais antígenos oculares parcialmente purificados são combinados em pelo menos uma das amostras de antígeno ocular. Para estas amostras de antígenos oculares, as reatividades autoimunes medidas correspondem à reação autoimune contra uma combinação de dois ou mais antígenos oculares a qual, então, leva a um escore de glaucoma. Em contraste com antígenos não isolados do seu ambiente fisiológico, tais como lisados de células oculares, as quantidades relativas dos componentes da combinação de antígeno são controladas. Tal combinação controlada de antígenos pode também levar a um coeficiente, isto é, o efeito de um fator de ponderação, o qual modula a contribuição da reatividade autoimune medida de determinados antígenos oculares para o resultado diagnóstico.

[00020] Além disso, no presente pedido os termos "antígenos oculares" ou "antígenos" são muitas vezes usados como sinônimos e, em vez das expressões longas "antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados" ou "amostras de antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados ".

[00021] Reatividade autoimune ou, como sinônimos, imunorreatividade e reatividade de autoanticorpo, no contexto do presente documento, referem-se à atividade de ligação de autoanticorpos presentes em um fluido corporal a um antígeno ocular pelo menos parcialmente purificado, o qual é incubado com o fluido corporal.

[00022] Métodos para detectar e medir a reatividade autoimune incluem técnicas analíticas imunológicas padrões, tais como ensaios Western Blot, teste de quimioluminescência, Elisa, radioimunoensaio, microarranjos e outros. Os antígenos são aplicados e fixados a um elemento portador antígeno e, então, incubadas com o fluido corporal contendo autoanticorpos a serem detectados. Subsequentemente, autoanticorpos ligados são identificados para determinar as reatividades autoimunes. Métodos de identificação incluem, por exemplo, pré-marcação da amostra a ser analisada, a adição de um anticorpo secundário o qual se liga aos autoanticorpos ligados a antígeno ou a um marcador indireto, por exemplo, anticorpos de cabra marcados anti-imunoglobulinas humanas, etc. Métodos incluem ainda análise de elementos endereçáveis, tais como esferas, nanopartículas, tags, etc. Métodos de detecção podem também incluir métodos os quais não requerem marcação, por exemplo, tipo SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization In Time Of Flight Mass Spectrometry), MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectroscopy) ou outras técnicas de chips de anticorpo.

[00023] O primeiro método para o diagnóstico de glaucoma de acordo com a invenção baseia-se na diferença da reatividade autoimune média em indivíduos saudáveis quando comparado com pacientes com glaucoma contra determinados antígenos oculares. Assim, certas titulações de autoanticorpos contra determinados antígenos oculares em um fluido corporal são utilizadas como uma evidência diagnóstica para a doença glaucoma.

[00024] Um aspecto da presente invenção diz respeito a antígenos oculares recentemente identificados, aos quais autoanticorpos se ligam diferencialmente em indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma e os quais são úteis como marcadores diagnósticos (ou biomarcadores) para a detecção e para o tratamento terapêutico da doença glaucoma.

[00025] A fim de extrair informação dos sinais medidos de reatividades autoimunes contra amostras de antígeno ocular, os sinais ou valores de reatividade autoimune medidos são comparados com os dados padrões, em modalidades preferidas a comparação da etapa d) é realizada para cada amostra de antígeno ocular, separadamente. Em modalidades preferidas, os dados padrões incluem os valores médios para a reatividade autoimune medida contra cada uma das amostras de antígeno ocular para os controles saudáveis e pacientes com glaucoma. Em outras modalidades preferidas, os dados padrões incluem valores médios para a reatividade autoimune contra cada amostra de antígeno ocular medida característica para certos estágios da doença. Assim, o diagnóstico de diferentes estágios da doença glaucoma e também o monitoramento da progressão da doença glaucoma estão dentro do espírito do método de acordo com a invenção. Em outras modalidades preferidas, os dados padrões de reatividade autoimune incluem reatividades autoimunes características de subtipos de formas específicas da doença glaucoma.

[00026] Tais dados padrão podem ser gerados por meio de reações de controle das etapas (a) - (c) do método para o diagnóstico de glaucoma em fluidos corporais de indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma, as quais são conduzidas em paralelo com as amostras de teste ou tais dados padrões podem derivar de dados armazenados a partir de reações de controle realizadas sob condições idênticas em um momento diferente.

[00027] Em formas modalidades preferidas, o escore de glaucoma é deduzido, para cada amostra de antígeno ocular, a partir do valor medido de reatividade autoimune, correlacionando o valor medido de um indivíduo teste com os dados padrões e transformando o valor medido da reatividade autoimune em um escore de glaucoma. Em um exemplo simplificado, de um escore de glaucoma é determinado a partir da reatividade autoimune medida para cada amostra individual de antígeno ocular em escala exemplificativa de diagnóstico de glaucoma de 0 a 100, em que 0 corresponde ao valor médio da reatividade autoimune medida contra um antígeno ocular específico em pessoas saudáveis e 100 corresponde ao valor médio da reatividade autoimune medida contra este antígeno em pacientes com glaucoma.

[00028] Em modalidades preferidas do método de acordo com a invenção, algoritmos que usam métodos convencionais de técnicas estatísticas multivariadas, algoritmos de árvore ou redes neurais artificiais são utilizados para calcular a transformação de um valor de reatividade autoimune medida para o escore de glaucoma correspondente de acordo com a etapa (d). Similarmente, na etapa (e), são utilizados algoritmos, em algumas modalidades preferidas, para a análise dos determinados escores de glaucoma para cada uma das amostras de antígenos oculares para determinar o resultado diagnóstico e, em outras modalidades preferidas, algoritmos são usados para ambas as etapas. Em ainda outras variantes, o pelo menos um escore de glaucoma da etapa d é a última etapa do primeiro método diagnóstico de glaucoma. De acordo com estas variantes, a etapa e não é compreendida pelo primeiro método diagnóstico para o glaucoma, mas é realizada por um profissional médico, que deduz um resultado diagnóstico a partir dos escores de glaucoma.

[00029] Uma grande vantagem do método diagnóstico para glaucoma de acordo com a invenção é que o resultado diagnóstico baseia-se na análise dos escores de glaucoma de antígenos parcialmente purificados de identidade conhecida.

[00030] Em modalidades preferidas, um fator de ponderação é atribuído a pelo menos uma das amostras de antígenos oculares. Tais fatores de ponderação modulam a contribuição da reatividade autoimune contra uma determinada amostra de antígeno ocular para o resultado diagnóstico. Em concretizações preferidas, o fator de ponderação é introduzido, de forma calculável, na etapa (c) ou (d) ou (e) do primeiro método diagnóstico, no entanto, em algumas modalidades preferidas, um fator de ponderação é introduzido nas etapas (a) ou (b) e, em ainda outras modalidades, fatores de ponderação são introduzidos em mais de uma das etapas (a) - (e). Fatores de ponderação têm o efeito de modular o resultado diagnóstico independentemente da etapa na qual eles são introduzidos. Um escore de glaucoma ponderado resulta de um fator de ponderação, o qual foi introduzido em qualquer uma ou mais de uma das etapas (a) - (e).

[00031] De acordo com modalidades preferidas nas quais o resultado diagnóstico é baseado em um escore ponderado de glaucoma, o fator de ponderação específico é introduzido em uma etapa computacional quando os sinais estimulados por autoanticorpos que se ligam a antígenos individuais são detectados e medidos em um instrumento de detecção de sinal, tal como um leitor óptico.

[00032] De acordo com outras modalidades preferidas, o fator de ponderação é introduzido ponderando diferencialmente a quantidade de antígenos individuais expostos à reação com anticorpos autoimunes e / ou ponderando uma ou mais das etapas de análise para a detecção e medição da reatividade autoimune aos antígenos individuais. Exemplos de tais modalidades incluem a detecção da reatividade autoimune com as esferas concebidas para serem específicas para diferentes antígenos e a ponderação pode ser realizada tanto pela intensidade diferencial de marcação de esferas específicas ao antígeno ou por uma sensibilidade diferencialmente graduada da ferramenta de detecção.

[00033] Os escores de glaucoma são, por exemplo, ponderados de modo que escores de glaucoma para amostras de antígeno ocular com uma alta relevância diagnostica estejam contribuindo mais para o resultado diagnóstico. Em um exemplo simplificado, uma amostra de antígeno ocular X, a qual provoca reatividades autoimunes, que difere por um grande valor significativo entre pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis, e com dados padrões de valores médios com baixos desvios padrões, é geralmente de maior relevância diagnóstica do que uma amostra de antígeno ocular Y a qual provoca reatividades autoimunes que diferem apenas ligeiramente entre pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis e têm valores médios normais com alto desvio padrão. Correspondente e particularmente, em um teste de glaucoma o qual é concebido para maximizar a especificidade, os escores de glaucoma para a amostra de antígeno X seria ponderada mais fortemente que escores de glaucoma para a amostra de antígeno Y para modular sua respectiva contribuição para o resultado diagnóstico.

[00034] É uma outra vantagem do primeiro método diagnóstico que os antígenos oculares parcialmente purificados conhecidos, os quais estão compreendidos nas amostras de antígenos oculares fornecidas na etapa a) e / ou qualquer fator de ponderação atribuído pode ser escolhido, é selecionado dependendo da finalidade de um teste de diagnóstico específico para o glaucoma. Por exemplo, em um teste de triagem concebido para o diagnóstico de glaucoma em um estágio inicial da doença, seria desejável maximizar a sensibilidade. Para tal aplicação de teste de diagnóstico, um certo número de falsos positivos é considerado aceitável, mas falsos negativos devem ser evitados.

[00035] Uma vantagem adicional de modalidades preferidas do primeiro método diagnóstico é que a partir do conhecimento sobre o papel fisiológico de antígenos os quais proporcionaram um alto escore de glaucoma em um paciente em particular, informação diagnóstica adicional pode ser extraída, enriquecendo assim o resultado diagnóstico.

[00036] À medida que mais e mais é conhecido sobre como a progressão da doença autoimune está correlacionada com a reatividade autoimune contra os antígenos oculares, tais antígenos característicos de um estágio específico, em particular uma fase inicial, podem ser utilizados como biomarcadores para o monitoramento da progressão da doença, incluindo monitoramento da eficácia de um tratamento médico em abrandar ou parar a progressão da doença. Clinicamente, é de grande importância identificar entre os indivíduos com uma pressão intraocular elevada daqueles que desenvolvem glaucoma, a fim de iniciar o tratamento antes da morte irreversível das células ganglionares da retina.

[00037] Em concretizações preferidas da etapa a) do método para o diagnóstico de glaucoma, pelo menos dois antígenos oculares parcialmente purificados ou pelo menos 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 antígenos ou, de preferência, pelo menos dois e menos do que 5 ou 10 antígenos do grupo 1, composto pelos seguintes 48 antígenos oculares estão compreendidos em uma ou mais amostras de antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados: actina, albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, receptor beta-2-adrenérgico cerebral, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (Glial Fibrillary Acidic Protein - GFAP), glutationa-S-transferase, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), HSP27, HSP60, insulina, HSP70, jo-1, lisozima, proteína de ligação à mielina (MBP), glicoproteína oligodendrócito de mielina ( MOG), mioglobina, enolase neuronal específica (NSE), neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutase de peróxido, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina.

[00038] O subgrupo a seguir dos antígenos acima referidos, denominado grupo 2, foi identificado como marcadores diagnósticos para o glaucoma pela primeira vez. Em outras modalidades preferidas da etapa a) do método para o diagnóstico de glaucoma, pelo menos um antígeno ocular parcialmente purificado ou pelo menos 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 antígenos ou, de preferência, pelo menos 2 e menos de a 5 ou 10 ou 20 antígenos do Grupo 2 a seguir que consiste em 36 antígenos oculares são compostos de uma ou mais amostras de antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados: albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, beta-2 -adrenérgico, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, topoisomerase de DNA 1, fibronectina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, glicoproteína oligodendrócito de mielina ( MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutase de peróxido, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF).

[00039] Para alguns dos antígenos no grupo 1 acima mencionado, se sabia previamente que as reatividades de autoanticorpo contra os mesmos são diferentes em pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis. Isto foi confirmado (ver exemplos e números) e sua reatividade de autoanticorpo tem relevância para o diagnóstico de glaucoma também. Estes antígenos oculares do grupo 3 são: actina, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (Glial Fibrillary Acidic Protein - GFAP), glutationa-S-transferase, HSP27, HSP60, HSP70, proteína de ligação à mielima (MBP), enolase neurônio específica (NSE), vimentina.

[00040] Os antígenos do grupo 1 foram classificadas em três subgrupos A, B e C. Pelos métodos descritos nos exemplos e figuras, nos quais as reatividades autoimunes contra diferentes antígenos oculares em indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma são medidas, a relevância diagnóstica ou os antígenos foram avaliados. Antígenos de grupo C ou, de preferência, os antígenos do grupo B ou, mais preferivelmente, os antígenos do grupo A estão compreendidos na pelo menos uma amostra de antígenos oculares utilizada para o primeiro método diagnóstico para o glaucoma.

[00041] O grupo a seguir de 24 antígenos oculares parcialmente purificados foi identificado como muito altamente relevantes marcadores diagnósticos muito altamente relevantes para o glaucoma e foi classificado como antígenos do grupo A: actina, alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (Glial Fibrillary Acidic Protein - GFAP), glutationa-S-transferase, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, proteína de ligação de mielina (MBP), enolase neuronal específica (NSE), inibidor da proteína quinase C, superóxido dismutase, transferrina, transtirretina, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina. Em modalidades preferidas, a pelo menos uma amostra de antígenos oculares fornecida na etapa a) compreende pelo menos dois antígenos selecionados de antígenos oculares do grupo A. [00042] O grupo a seguir de 9 antígenos oculares parcialmente purificados foi identificado como marcadores diagnósticos altamente relevantes para o glaucoma e foi classificado como antígenos do grupo B: anexina I-IV, beta-2-adrenérgico, calreticulina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, superóxido-peróxido, proteína quinase C, alfa-sinucleína, gama-sinucleína. Em outras modalidades preferidas, a pelo menos uma amostra de antígenos oculares fornecida na etapa a) compreende pelo menos dois antígenos selecionados de antígenos oculares do grupo A e / ou do grupo B. [00043] Além disso, o grupo C a seguir de 14 antígenos oculares parcialmente purificados foi identificado como marcadores diagnósticos relevantes para glaucoma: albumina, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), cardiolipina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, lisozima, glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, 3-fosfoserina, tireoglobulina, inibidor de topoisomerase.

[00044] Em outras modalidades preferidas, a pelo menos uma amostra de antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados compreende pelo menos um antígeno ou, de preferência, pelo menos 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 antígenos ou, de preferência, pelo menos 1 e menos do que 5 ou 10 antígenos ou, de preferência, pelo menos 2 e menos de 20 ou todos os antígenos os quais pertencem ao grupo 2 ou a ambos os Grupos 2 e Grupo A classificados como o grupo 2-A ou os quais pertencem ao grupo 2 e qualquer um do Grupo A ou Grupo B classificados como Grupo AB-2.

[00045] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um elemento portador de antígeno que traz pelo menos uma amostra compreendendo pelo menos um antígeno ocular pelo menos parcialmente purificado. Modalidades preferidas, o elemento portador de antígeno inclui chips de microarranjo, tiras de teste de fluxo lateral e chips microfluídicos. Em algumas modalidades preferidas, o elemento portador de antígeno compreende uma zona predeterminada do antígeno que é uma área de superfície sobre uma tira ou uma lâmina ou uma placa, etc. ou uma superfície predeterminada em um dispositivo sobre o qual as amostras de antígeno ocular são colocadas em micropontos. Em ainda outras modalidades preferidas, o elemento portador de antígeno compreende adicionalmente uma zona de recepção de fluidos corporais. Em outras modalidades preferidas, o elemento portador de antígeno compreende esferas ou outro substrato que é revestido com amostras de antígenos oculares. Em outras modalidades preferidas, o elemento portador de antígeno traz quantidades ponderadas de amostras de antígenos oculares e, em ainda outras modalidades, o elemento portador de antígeno compreende os antígenos oculares selecionados do grupo 1 ou Grupo 2 ou Grupo A ou Grupo A e Grupo B ou 2-A. Certamente, está dentro do espírito da invenção a utilização de combinações das características acima mencionadas para o elemento portador de antígeno de acordo com a invenção.

[00046] Em uma modalidade preferida do primeiro método diagnóstico para o glaucoma, o elemento portador da pelo menos uma amostra de amostras de antígenos oculares é um chip de microarranjo antigênico. A pelo menos uma amostra de antígenos oculares é colocada como um arranjo antigênico ou microarranjo antigênico em uma matriz bidimensional ou tridimensional de pontos sobre um elemento portador do antígeno a qual é, por exemplo, uma lâmina de vidro, uma placa ou um chip ou uma lâmina de nitrocelulose ou uma lâmina de hidrogel e similares. Os arranjos de proteína são preparados colocando-se pelo menos 2, de preferência, 3-5 ou 3-9 ou 3-12 amostras dos antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados, quando aplicável, de um grupo particular de antígenos descrito acima para o elemento portador, tal como sobre lâminas revestidas de nitrocelulose. Os arranjos são incubados com amostras diluídas de forma adequada de um fluido corporal tal como soro do sangue, lágrimas ou do humor aquoso. A reatividade autoimune, por exemplo, é detectada pela visualização de reações de autoanticorpo-antígeno sobre os arranjos de acordo com técnicas estabelecidas conhecidos no campo tais como, por exemplo, através de tratamento com um anticorpo anti-IgG marcado por fluorescência, seguido por varredura de fluorescência. Os sinais emitidos pelos anticorpos secundários são digitalizados; as intensidades locais medidas e, opcionalmente, comparadas com os resultados de fluidos corporais de indivíduos controle, utilizando técnicas estatísticas multivariadas. Alternativas para a detecção de reatividade de autoanticorpo incluem a visualização por anticorpos anti-IgG humana ligados a uma enzima que reage com um componente adicionado ou presente no elemento portador de antígeno, resultando no aparecimento de uma cor ou na mudança de cor. Tal mudança de cor, em algumas aplicações, pode ser visualizada diretamente ou através de uma ferramenta de detecção, tal como um leitor óptico. Em modalidades ainda mais preferidas, as reatividades autoimunes são medidas com um ensaio de competição, o qual é uma outra técnica de imunoensaio estabelecida. Por exemplo, anticorpos monoclonais fluorescentes comercialmente disponíveis específicos para determinados antígenos oculares estão competindo com autoanticorpos, os quais estão presentes no fluido corporal da etapa b) para reação com os antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados fornecidos na etapa a). Uma forte reatividade autoimune no fluido corporal contra um antígeno ocular em particular em tal ensaio resulta em um sinal fraco, porque ligação dos anticorpos comerciais fluorescentemente marcados ao antígeno é impedida por autoanticorpos não marcados no fluido corporal. Evidentemente, a invenção não está limitada a estes exemplos de ensaios imunológicos padrões conhecidos na técnica, os quais são aqui mencionados como meros exemplos, mas estende-se a qualquer ensaio imunológico padrão conhecido na técnica que é aplicável para determinar a reatividade autoimune em fluidos corporais contra antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados.

[00047] Em algumas aplicações preferidas, um fator de ponderação atribuído a antígenos individuais para modular a sua contribuição para o resultado diagnóstico é introduzido, por exemplo, colocando-se diferentes quantidades de antígeno no microarranjo ou por meio de ponderação diferencial dos sinais estimulados por anticorpos ligados a antígenos individuais. Em outras modalidades preferidas, as quantidades de antígeno colocado sobre o microarranjo são variadas a fim de modular a intensidade de sinal esperada da reatividade autoimune, de tal modo que ela se encontre dentro da faixa linear de detecção de sinal pela ferramenta de detecção.

[00048] Conforme ainda apresentado no exemplo 7, um teste para glaucoma com uma seleção com apenas 5 antígenos pelo menos parcialmente purificados resulta em uma diferenciação entre pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis com uma especificidade e uma sensibilidade de aprox. 90%. Assim, em outras modalidades preferidas, o número de amostras de antígenos oculares está limitado a um número pequeno, tal como 10 ou 8 ou 6 ou 5 ou menos do que 5, a fim de proporcionar um teste o qual é simples de analisar e o qual é produzível em um baixo custo, para triagem em massa de um elevado número de indivíduos.

[00049] Em uma outra modalidade preferida do primeiro método diagnóstico para o glaucoma, o elemento portador na pelo menos uma amostra de amostras de antígeno ocular é uma tira de teste de fluxo lateral. Em variantes preferidas destas modalidades, o elemento portador de antígeno compreende uma zona portadora de antígeno predeterminada e uma zona predeterminada para a recepção de um fluido corporal. Em outras variantes preferidas, a tira de fluxo lateral compreende, opcionalmente, várias zonas que compreendem subzonas. A seleção dos antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados é aplicada à zona de antígeno. Amostras individuais de antígenos oculares podem, de acordo com algumas variantes do método, ser aplicadas à diferentes subzonas ou misturadas em uma zona ou várias subzonas. Em uma etapa subsequente, uma amostra de fluido do corpo a qual é, opcionalmente, pré-tratada de forma adequada e / ou diluída, é aplicada à zona de recepção da tira de teste. Reagentes apropriados para a visualização de anticorpos os quais estão ligados aos antígenos podem ser incluídos na zona de antígenos ou a zona de recepção ou ambas. Alternativamente, a tira de teste com os autoanticorpos ligados pode, posteriormente à etapa de ligação, ser incubada com reagentes para visualização. As etapas de detecção, tal como visualização, são medidas com e sem ferramentas analíticas, tal como um leitor de imagem que fornece um resultado digitalizado. Em aplicações preferidas, um fator de ponderação atribuído ao antígeno individual quanto à sua contribuição para o resultado diagnóstico é introduzido, por exemplo, aplicando-se diferentes quantidades de antígeno às zonas de antígeno da tira de teste ou mediante a adição diferencial de reagentes químicos ou ponderação diferencial dos sinais estimulados a partir de anticorpos ligados a antígenos individuais. Obviamente, algumas das características e combinações de características as quais são descritas acima para as modalidades do método utilizando microarranjos também são igualmente aplicáveis à modalidades preferidas das tiras de teste de fluxo lateral.

[00050] Outras modalidades preferidas das tiras de teste de fluxo lateral são concebidas para contatar diretamente um paciente com a zona de recepção da tira de teste para coletar fluidos corporais, tais como lágrimas. Zonas de recepção similares para coleta de fluidos corporais são também parte de outras modalidades de elemento portador de antígeno, tais como chips microfluídicos ou colunas com esferas carreando antígeno que compreendem uma zona de recepção de material adsorvente.

[00051] É conhecido a partir do estado da arte, que a ausência de reatividade autoimune ou autoimune reatividade reduzida para certos antígenos é também indicativo de glaucoma. Assim, algumas modalidades preferidas são concebidas de tal modo que a ausência ou redução de ligação de anticorpos autoimunes a antígenos selecionados está a contribuir para o resultado diagnóstico ou é a base para o resultado diagnóstico. Por exemplo, em algumas modalidades das tiras de teste de fluxo lateral, uma ou mais subzonas de antígenos são pontuadas com antígenos para os quais nenhuma autoimunorreatividade é indicativa da doença, enquanto outras subzonas são pontuadas com antígenos que induzem uma baixa reatividade de autoanticorpo em pacientes com glaucoma do que em indivíduos saudáveis, e / ou com os antígenos que induzem uma maior reatividade de autoanticorpo em pacientes com glaucoma do que em indivíduos saudáveis e / ou com os antígenos para os quais nenhuma autoimunorreatividade é indicativo da ausência de glaucoma e variações favoráveis das combinações acima.

[00052] Em uma modalidade adicional preferida do primeiro método diagnóstico para o glaucoma do antígeno para a realização elemento na amostra de pelo menos um dos antígenos é um chip microfluídico ou dispositivo lab-on-a-chip, no qual os antígenos individuais são preferivelmente fornecidos em microcanais separados. O fluido corporal é carregado para o chip microfluídico ou é recebido em uma zona de recepção de fluido corporal do chip. Subsequentemente, o fluido corporal é movido para o sistema de microcanais do chip microfluídico por exemplo, por uma unidade de controle de pressão. Em modalidades preferidas reatividades autoimunes secundárias são detectadas com anticorpos marcados com fluorescência padrão e leitores ópticos normais ou computadores equipados com uma câmara e, posteriormente, quantificado e transformado em um escore de glaucoma, tal como descrito. Está, obviamente, dentro do espírito da invenção combinar características mencionadas de outros elementos que carreiam antígenos, tais como chips de microarranjo e tiras de teste de fluxo lateral com características de chips microfluídicos para outras modalidades de elementos carreadores de antígenos para realizar os métodos e dispositivos descritos neste pedido. Isso inclui chips microfluídicos com subzonas de antígenos com reatividade autoimune superiores e outras subzonas para antígenos com menor reatividade autoimune em pacientes com glaucoma contra indivíduos saudáveis.

[00053] Outros aspectos da invenção referem-se a testar a kits para o primeiro método para diagnóstico de glaucoma e de componentes de kits de teste que compreendem um elemento carreador de uma amostra, pelo menos uma das amostras de antígenos oculares e opcionalmente materiais auxiliares. Em algumas modalidades de acordo com este aspecto tal kit compreende um elementos carreadores de antígenos que transportam diferentes variações de um na amostra, pelo menos uma das amostras de antígenos oculares, dependendo do objetivo do ensaio de diagnóstico. Em algumas modalidades preferidas do kit de elemento carreadorde antígeno compreende antígenos oculares selecionadas do grupo 1 ou Grupo 2 ou Grupo A ou Grupo A e B ou o grupo 2-A, em que em algumas destas modalidades preferidas as quantidades de antígenos carregada no elemento carreador de antígeno é ponderada. Em algumas modalidades preferidas do kit do elemento carreador de antígeno é ou é parte de uma lâmina de microarranjo, uma tira de teste de fluxo lateral ou um chip microfluídico. Em outras modalidades de tais kits de teste de materiais auxiliares, tais como ferramentas analíticas e ou software está incluído para instrumentos analíticos, tais como um leitor de imagem ou software e por um leitor de imagem proporcionando uma saída digitalizada dos resultados dos ensaios do resultado do teste é incluído, no qual este software é utilizado para uma ou mais das etapas de quantificação da reatividade autoimune medida, calculando a pontuação glaucoma ou resultado diagnóstico. Em outras modalidades preferidas o material auxiliar para retirar uma amostra de fluido corporal está incluído. Material auxiliar tal é por exemplo, papel mata-borrão para receber lágrimas. Outras modalidades preferidas refere-se os reagentes e / ou os recipientes de reação para a detecção e medição da reatividade autoimune após a incubação com o elemento carreador de antígeno com um fluido corporal ou reagentes para o tratamento de uma amostra de fluido corporal, antes da incubação com o elemento carreador de antígeno ou para eluição do fluido corporal de um material adsorvente no qual foi coletado. Qualquer combinação das características acima descritas, no contexto dos métodos para o diagnóstico de glaucoma pode ser combinado para outras modalidades preferidas de kits para realizar o método para o diagnóstico de glaucoma.

[00054] Em outras modalidades preferidas do primeiro método diagnóstico para o glaucoma de uma amostra de fluido corporal é primeiramente seco e depois eluída ressolubilizada ou antes da reação com o pelo menos uma das amostras de antígenos oculares. A amostra de fluido corporal é coletada ou em um ambiente profissional ou um ambiente doméstico. Em algumas variantes que é coletado sobre um pedaço de material adsorvente tal como uma tira de papel ou diretamente na zona de recepção do elemento carreador de antígeno ou qualquer outro recipiente de recepção para o fluido corporal. A amostra de fluido corporal é permitida secar e ser armazenada, por exemplo, à temperatura ambiente. A experiência mostra que, depois de armazenagem durante até uma semana ou também mais particularmente a uma temperatura inferior ou se forem congelados, os autoanticorpos presentes na amostra de fluido corporal seco pode ser reconstituído e eluído a partir do material adsorvente, por exemplo, com um tampão ou solução salina fisiológica. Assim, é uma vantagem desta modalidade que amostra de fluido corporal pode ser recolhido por exemplo, pelo próprio paciente em casa e enviado por correio para o laboratório para análise. Em outras modalidades preferidas do primeiro método diagnóstico para o glaucoma do fluido corporal, a qual é seca e reconstituída antes da análise, é lágrimas ou soro do sangue.

[00055] Em modalidades preferidas do primeiro método diagnóstico para a medição da reatividade glaucoma autoimune em lágrimas, as lágrimas são recolhidas com qualquer método padrão, tal como por meio de pipetas ou por uma tira de papel de filtro, tais como uma tira de papel Schirmer ou outro material adequado adsorvente. Opcionalmente, as lágrimas são secas e armazenadas, por exemplo, à temperatura ambiente durante até uma semana ou mais, a 0-5°C ou mais, quando congelada. Subsequentemente, os autoanticorpos são eluídos a partir da tira de papel seca ou ainda molhado com, por exemplo, tampão salina tamponada com fosfato. Em outras modalidades preferidas, as lágrimas são diretamente recolhidas em uma tira de teste de fluxo lateral, por exemplo, expondo a zona de recepção da tira de teste de lágrimas no olho. Obviamente, uma das vantagens das modalidades utilizando o fluido lacrimal, em vez de, por exemplo, soro sanguíneo é que as amostras de lágrimas podem ser obtidas de forma não invasiva. Esta é uma vantagem particular para os locais onde profissionais médicos não treinados adequadamente estão disponíveis, tais como, em alguns escritórios e oftalmologista optometrista, bem como para o autoteste.

[00056] Um aspecto adicional do primeiro método para diagnóstico de glaucoma refere-se a sua utilização de um teste rápido para a detecção precoce de glaucoma antes da perda de visão nos exames de rotina. Modalidades preferidas são para testes exemplo de baixo custo de diagnóstico concebidos para ser muito sensível de modo que, em exames de rotina a probabilidade de resultados falso-negativos são minimizados. Assim, posterior acompanhamento, exames mais elaborados são, por exemplo, contando com um número maior de antígenos oculares e são concebidos para identificar falsos-positivos entre os indivíduos com um resultado positivo no teste rápido. Por exemplo, uma tira de teste de fluxo lateral, um chip microfluídico ou um chip de microarranjo simples, tal como descrito em várias modalidades acima podem ser utilizados para tais testes rápidos.

[00057] Um aspecto adicional da utilização do primeiro método para diagnóstico de glaucoma refere-se à sua aplicação para o monitoramento da progressão da doença e para monitorizar o efeito do tratamento médico. Em modalidades preferidas destes aspectos da seleção de antígenos e / ou o fator de ponderação que lhes é atribuído foi concebido para monitorizar a reatividade autoimune contra antígenos característicos de uma fase particular da doença de glaucoma.

[00058] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método de contato de um paciente com uma zona de recepção de um elemento carreador de antígeno para recolher um fluido corporal do paciente, por exemplo, lágrimas dos olhos do paciente. Em modalidades preferidas, o paciente é colocado em contato com uma zona de recepção de um elemento carreador de antígeno que compreende o material adsorvente, em que a zona de recepção em si é livre de antígeno, mas o fluido corporal flui para a zona carreadora de antígeno. Por exemplo, uma tira de teste com uma zona de recepção que compreende papel absorvente como uma tira de teste Schirmers 'é tocado com a zona de recepção para um olho humano para recolher lágrimas. Subsequentemente, o fluido lacrimal difunde para a zona antigênica e, assim, encaixa na etapa b do método para o diagnóstico de glaucoma.

[00059] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a qualquer um dos antígenos de oculares ou qualquer combinação de um ou mais do seguinte grupo de dois antígenos oculares para o uso em métodos de diagnóstico do glaucoma ou um elemento carreador de antígeno para o uso em métodos de diagnosticar glaucoma: albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, beta-2-adrenérgico, o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF).

[00060] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito qualquer um dos antígenos de oculares ou qualquer combinação de um ou mais do seguinte grupo de dois antígenos oculares ou derivados de antígenos oculares, tais como fragmentos ou antígenos modificados oculares ou ligantes, tais como anticorpos, que são específicos para o qualquer um dos antígenos oculares do grupo 2 para a utilização em métodos de tratamento terapêutico de glaucoma ou para o uso em uma composição para utilização em um tratamento médico e, especificamente para uso em uma composição para utilização no tratamento do glaucoma.

[00061] Em modalidades preferidas da utilização de antígenos oculares de uma composição farmacêutica para o tratamento de glaucoma, são utilizados como agentes de bloqueio de ligação a autoanticorpos presentes em níveis aumentados em um paciente com glaucoma. Em particular, verificou-se que muitas das reatividades elevadas autoimunes em pacientes com glaucoma são dirigidos contra as proteínas do citoesqueleto, por exemplo, actina e proteínas a ligação à actina, tais como a anexina V, fodrina alfa, a proteína de mielina de ligação, HSP 27. Sabe-se que os autoanticorpos contra estruturas do citoesqueleto, tais como a malha f-actina, quando absorvidos pelas células ganglionares da retina perturbar a malha de actina e induzir a apoptose celular. Assim, de acordo com este aspecto da invenção, uma composição farmacêutica que é fornecida, para impedir a morte das células ganglionares da retina. A composição compreende pelo menos um dos antígenos oculares do grupo 2 para a progressão da doença de glaucoma por antígenos oculares, que se ligam aos anticorpos e bloquear os seus efeitos destrutivos sobre as células ganglionares da retina em pacientes com glaucoma.

[00062] Enquanto o primeiro método diagnóstico para o glaucoma, que é independente de uma pressão intraocular elevada, depende de um perfil de biomarcadores de antígenos identificadas oculares, um tal método diagnóstico segundo a qual é independente de uma pressão intraocular elevada se baseia no efeito de fluidos corporais em uma cultura de célula em um ensaio in vitro.

[00063] O segundo método para o diagnóstico de glaucoma compreende as etapas de a) fornecimento de uma cultura de células in vitro, b) incubação de um fluido corporal de um indivíduo teste com a cultura de células in vitro, c) analisar a expressão de proteínas pela cultura de células in vitro e / ou analisar a viabilidade das células após o tratamento de acordo com a etapa (b), e d) comparação dos resultados da análise na etapa c) com os dados padrões para determinar um resultado diagnóstico.

[00064] Para a etapa a) uma cultura in vitro de preferência de células primárias ou imortalizadas de origem humana ou animal, mais preferencialmente células de mamífero são proporcionadas, tais como as células de uma linhagem celular imortalizada comercialmente disponível Preferivelmente, as células neuronais e células ganglionares da retina de preferência mais ou células precursoras de células ganglionares da retina são fornecidas. Padrões de expressão de proteínas, expressão de biomarcadores de proteínas específicas e da viabilidade das células ganglionares da retina expostas aos fluidos corporais de indivíduos saudáveis e pacientes com diferentes tipos de glaucoma ou hipertensão ocular podem ser diferenciadas. É, por conseguinte, uma vantagem particular da variável as modalidades preferidas do método para o diagnóstico de glaucoma que diferenciar entre pacientes com diferentes formas de glaucoma e, além disso, entre os pacientes com hipertensão ocular, aqueles que têm glaucoma ou que estão em risco elevado de desenvolver glaucoma. Assim, este método, que é independente de controle da hipertensão ocular, torna possível o diagnóstico precoce de glaucoma de pressão normal e, além disso, a diferenciação entre os indivíduos afetados pela hipertensão ocular, que estão a sofrer, e que não sofram de glaucoma. [00065] Em outras variantes preferidas, as amostras de fluidos corporais ou frações das mesmas, para o tratamento na etapa b) por exemplo, são conservadas por congelamento e / ou secagem ou por adição de um tal conservadora como conservadores encontrados em mais usados tubos de soro. Após armazenamento durante um período de tempo variável de uma amostra adequada reconstituída do fluido do corpo é utilizada para o tratamento na etapa b) do segundo método diagnóstico.

[00066] Em outras modalidades preferidas do segundo método diagnóstico, o fluido corporal é pré-tratado quimicamente ou fisicamente, a fim de estabilizar ou aumentar o seu efeito na etapa b), do teste de diagnóstico. Por exemplo, o fluido corporal pode ser parcialmente purificado para remover as substâncias a partir do fluido do corpo, o que pode, potencialmente, interferir com o crescimento celular e a expressão da proteína das células da cultura de células in vitro fornecida na etapa a) de um modo relacionado com glaucoma ou para mostrar as reações específicas das células fornecidas na etapa a) para subfrações do fluido corporal.

[00067] Em outras variantes preferidas de modalidades os rendimentos de pré-tratamento ou de fracionamento de uma fração do fluido corporal, que compreende ou é enriquecido com uma seleção predeterminada de anticorpos, tais como anticorpos ou autoanticorpos que se sabe serem específicos para antígenos associados com glaucoma ou um certo forma da doença do glaucoma. Em outras variantes preferidas, pelo menos um anticorpo é removido do fluido do corpo. Em algumas destas variantes, a remoção de uma seleção de anticorpos a partir do fluido do corpo antes da sua utilização na etapa b) , que serve para remover um ou mais anticorpos, que inibem o crescimento de células ou de influenciar a expressão da proteína das células de uma forma, a qual não está relacionada ao glaucoma e pode obscurecer o resultado diagnóstico. Em modalidades adicionais de remoção tal serve a eliminação de autoanticorpos que se sabe ser específico para determinadas formas de glaucoma. Em outras modalidades preferidas, as células são incubadas com os anticorpos removidas, a fim de produzir uma reação da célula típica para o tipo de soro usado.

[00068] A incubação da etapa b) é realizada de acordo com técnicas de incubação padrão conhecidos na arte. Em variantes diferentes de modalidades preferidas da etapa b) o tempo de incubação, a temperatura de incubação e o nível de pressão hidrostática aplicada são variados.

[00069] Na etapa c) o efeito do fluido corporal durante a incubação da etapa b) sobre as células proporcionado na etapa a) é analisada. Em um primeiro grupo de modalidades preferidas da etapa c) os padrões de expressão de proteína são submetidas à lise, em um segundo grupo de modalidades preferidas da etapa c) a expressão de proteínas específicas, tais como biomarcadores ou antígenos são submetidas à lise, em um terceiro grupo de modalidades preferidas, a viabilidade das células são submetidas à lise e em modalidades ainda mais preferida da etapa c) análise por mais de um dos métodos acima é executada. Em todas estas modalidades da etapa c) os resultados da análise são usados para a etapa d) para determinar um resultado diagnóstico.

[00070] Em modalidades preferidas do primeiro grupo de modalidades preferidas da etapa c), a análise de expressão de proteína é efetuada com as proteínas, tais como proteínas inteiras intactas bem como, por exemplo, com proteínas digeridas ou fracionados obtidos a partir da cultura celular in vitro. Por exemplo, o conjunto das proteínas e das células, bem como as proteínas extracelulares, em algumas variantes, incluindo as proteínas, que as células liberadas para o meio. Em modalidades preferidas da etapa c) as proteínas submetidas à análise de expressão de proteína são obtidas da cultura de células in vitro por lise das células e recuperou por exemplo, por precipitação, facultativamente pré-tratados, por exemplo, por digestão da proteína, o fracionamento de proteínas e / ou separação e / ou etapas de purificação e análise de proteínas por meio de técnicas padrão de análise conhecidos na arte. Exemplos de métodos aplicáveis como conhecidos na arte incluem e não se limitam a precipitação com acetona, a digestão com tripsina, gel de eletroforese, HPLC, etc.

[00071] Em outras modalidades preferidas do primeiro grupo de modalidades preferidas da etapa c) a análise da expressão de proteínas é realizada por análise de padrão de proteína, fingerprinting conhecidos na arte, tais como espectroscopia de massa, incluindo MS TOF MALDI-TOF (espectroscopia de massa de matriz assistida com laser de dessorção / ionização de tempo de voo), espectrometria de massa Orbitrap, LC-MS (espectrometria de massa de cromatografia líquida-), HPLC-MS (Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas) e de SELDI-TOF-MS (espectroscopia de massa de superfície melhorada de tempo de voo).

[00072] Em outras modalidades preferidas do primeiro grupo de modalidades preferidas da etapa c), a análise dos dados de expressão de proteína, tais como os padrões de expressão de proteína ou impressões digitais são processados por sistemas de análise de imagem digital ou qualquer outro dispositivo de digitalização tal como é conhecido na arte. Em modalidades preferidas dados digitalizados são subsequentemente processadas por técnicas estatísticas multivariadas, por exemplo, análise de discriminatória, classificação / regressão árvores e / ou redes neurais artificiais.

[00073] No segundo grupo de modalidades preferidas da etapa c) a expressão de proteínas específicas são submetidas à lise. Em variantes preferidas destas modalidades da análise da expressão de proteínas na etapa c) compreende um ensaio dirigido a pelo menos uma proteína específica ou biomarcador. Em variantes preferenciais de tais modalidades o biomarcador é uma proteína conhecida por estar associada com a doença de glaucoma ou de uma doença autoimune ou uma doença neurodegenerativa ou apoptose. Em modalidades preferidas, o ensaio para um biomarcador baseia-se em um ensaio imunológico, por exemplo, um imunoensaio com base em fluorescência ou quimioluminescência, bem como ELISA ou arranjos de proteína Elispot que utiliza pelo menos uma sonda de anticorpo, que é de preferência específico para tais biomarcadores conhecidos para ser associado com a doença de glaucoma ou de uma doença autoimune ou uma doença neurodegenerativa ou apoptose. Em variantes preferidas, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

[00074] Em modalidades preferidas da análise da expressão de proteínas, utilizando um imunoensaio na etapa c) do segundo método diagnóstico, os anticorpos que são utilizados são os anticorpos específicos contra um ou mais dos 48 antígenos dos grupos 1 revelados na primeira invenção do presente pedido. Por todos estes antígenos que se sabe que o seu nível de expressão é aumentada ou diminuída em pacientes com glaucoma, em comparação com indivíduos saudáveis: actina, albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, beta-2-adrenérgico, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase, 1, fibronectina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutationa-S-transferase, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), HSP27, HSP60, insulina, HSP70, jo-1, lisozima, proteínas de ligação a mielina (MBP), glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, enolase neuronal específica NSE, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama- sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina.

[00075] Em outras modalidades preferidas da análise da expressão de proteínas com os imunoensaios em fase c) do segundo método diagnóstico para o glaucoma, os anticorpos que são utilizados são os anticorpos específicos contra um ou mais dos 36 antígenos do Grupo 2 descritas na primeira invenção do presente pedido, que são os seguintes: albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, beta-2-adrenérgico, BDNF cérebro fator neurotrófico derivado, calreticulina, cardiolipina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, a glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF).

[00076] Em outras modalidades preferidas da análise da expressão de proteínas com os imunoensaios em fase c) do segundo método diagnóstico para o glaucoma, os anticorpos que são utilizados são os anticorpos específicos contra um ou mais dos 24 antígenos do grupo A divulgados na primeira invenção do presente pedido, que são: a actina, a alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutationa-S-transferase, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, a proteína de ligação de mielina (MBP), enolase neuronal específica (NSE), inibidor da proteína quinase C, superóxido dismutase, transferrina, transtirretina, ubiquitina, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), vimentina. [00077] Em outras modalidades preferidas da análise da expressão de proteínas com os imunoensaios na etapa C) do segundo método diagnóstico para o glaucoma, os anticorpos que são utilizados são os anticorpos específicos contra um ou mais dos 33 antígenos do grupo A ou B descritos na presente invenção, antes de esta aplicação, que são: a actina, a alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (Glial Fibrillary Acidic Protein - GFAP), glutationa-S-transferase, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, a proteína de ligação de mielina (MBP), enolase neuronal específica (NSE), inibidor da proteína quinase C, superóxido dismutase, transferrina, transtirretina, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina, anexina I-IV, beta-2-adrenérgico, calreticulina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, superóxido-peróxido, proteína quinase C, alfa-sinucleína, gama-sinucleína.

[00078] Em outras modalidades preferidas de análise de proteínas de expressão com os imunoensaios em fase c), as células são submetidas à lise, por exemplo, e o repertório completo de proteínas ou frações de proteínas específicas analisados por Western Blotting ou ELISA ou ELISPOT ou microarranjos.

[00079] Em variantes preferidas de modalidades que compreendem microarranjos, anticorpos, que podem ser anticorpos monoclonais ou agentes de captura para outros biomarcadores selecionados, são depositados sobre um elemento de transporte, tal como um chip de superfície, incluindo, mas não se limitam a uma lâmina de vidro ou uma superfície de silício ou de nitrocelulose e subsequentemente, o chip é incubado com lisados celulares ou preparações proteicas obtidas a partir de células após o tratamento de acordo com a etapa b). Em outras variantes preferidas, o elemento carreador dos agentes de captura é um chip microfluídico ou uma tira de teste.

[00080] Em outras modalidades preferidas, a análise de expressão de proteína da etapa c) é realizada in situ na cultura in vitro de células. A análise in situ de expressão de proteínas inclui, mas não está limitado a, métodos de marcação ou livres de marcação, bem como os métodos colorimétricos, tais como fluorescência ou quimioluminescência de marcação de proteínas intra ou extracelular, a aplicação do Elispot (Enzyme Linked Immuno spot), método de medição de mudanças na absorção por meio de marcação de proteína dentro ou sobre as células, bem como proteínas no meio, etc. Na análise in situ a expressão da proteína é de preferência realizada sobre as células da garrafa de cultura de células após a remoção do fluido do corpo para a etapa b).

[00081] No terceiro grupo de modalidades preferidas da etapa c) a viabilidade das células é analisada. Análise da viabilidade celular incluem, mas não se limitam a contagem de células, por exemplo, citometria de fluxo e / ou a análise de padrões de crescimento celular, e / ou monitoramento da viabilidade e / ou apoptose e / ou monitoramento de necrose. Métodos preferidos incluem, mas não estão limitados a marcação das células com anexina V e iodeto de propídio, a fim de detectar a necrose e apoptose, bem como um teste WST (tetrazólio solúveis em água) ou coloração com azul alamar, a fim de detectar a viabilidade das células. Em modalidades preferidas resultados de diferentes métodos de análise de viabilidade são comparados com os dados padrões e combinado para a determinação de um resultado diagnóstico de acordo com a etapa d). Em outras modalidades preferidas, também resulta do primeiro grupo e / ou a segunda modalidades preferidas da etapa c), que compreende a análise da expressão de proteínas são combinados com os resultados do terceiro grupo de modalidades da etapa c), que compreende a análise da viabilidade celular.

[00082] Na etapa d) os resultados da análise da expressão de proteínas de células e viabilidade celular ou da análise da etapa c) são comparados com os dados padrões para determinar um resultado diagnóstico. Em modalidades preferidas da etapa d) uma comparação calculadora da expressão de proteínas de células teste com dados padrões é executada com métodos computacionais conhecidos na arte.

[00083] Em algumas modalidades preferidas, os dados padrão utilizados na etapa d) parte de corridas controle das etapas (a) - (c) do método para o diagnóstico de glaucoma, que são conduzidos em paralelo. As corridas controle incluem uma ou mais mas não estão limitados aos seguintes exemplos: as células tratadas com um fluido corporal de pacientes com glaucoma, incluindo fluidos corporais de pacientes com glaucoma específicas conhecidas formas de glaucoma tais como NTG (glaucoma de tensão normal) ou POAG (glaucoma primário de ângulo aberto) ou de pacientes com glaucoma, em uma fase específica da doença, como por exemplo, em uma fase precoce da doença, e as células tratadas com um fluido corporal de pessoas saudáveis. Em outras realizações preferidas tais dados padrões pode decorrer de dados armazenados de controle executa realizadas em um horário diferente.

[00084] No primeiro grupo de modalidades preferidas da etapa c) o resultado diagnóstico determinado na etapa d) diferencia entre indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma por análise de expressão de proteínas considerando os perfis de proteínas complexas de proteínas expressas por células submetidas à lise de um indivíduo teste.

[00085] No segundo grupo de modalidades preferidas da etapa c), o resultado diagnóstico determinado na etapa d) diferencia entre indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma por análise de expressão de proteínas considerando biomarcadores selecionados entre as proteínas expressas pelas células após o tratamento com um fluido corporal de acordo com a etapa b).

[00086] No terceiro grupo de modalidades preferidas da etapa c), o resultado diagnóstico determinado na etapa d) diferencia entre indivíduos saudáveis e pacientes com glaucoma, considerando a viabilidade celular das células após o tratamento com um fluido corporal de acordo com a etapa b).

[00087] Em outras modalidades preferidas do método de acordo com a invenção uma etapa de processamento computacional combina tanto o processamento de dados a partir dos resultados da análise da expressão de proteínas e / ou da análise de viabilidade de células na etapa c), e a comparação dos resultados da expressão de proteínas análise com dados normalizados na etapa d).

[00088] Em algumas modalidades preferidas da etapa d), uma comparação calculadora dos resultados da análise da expressão de proteínas e / ou análise de viabilidade de células da etapa c) é realizado, o qual se baseia em métodos computacionais conhecidos na arte. Padrões de maior similaridade entre os resultados da etapa c) das células tratadas com um fluido corporal de um indivíduo de ensaio na fase b) e de dados padrões correspondente aos resultados da etapa c) das células tratadas na etapa b) com um fluido corporal de um grupo controle, como variáveis grupos clínicos de pacientes ou indivíduos saudáveis. Nas variantes preferenciais os dados padrões são obtidos de corridas controle realizadas em paralelo em outras variantes os dados padrões decorrem de corridas controle realizadas em um horário diferente.

[00089] Em variantes preferenciais da comparação calculadora na etapa d), redes neurais artificiais são usadas, que aprende a distinguir entre diferentes grupos clínicos com base na experiência, e não a partir de programação. Exemplos de técnicas de redes neuronais artificiais aplicáveis para a etapa d) incluir camadas múltiplas de alimentação para a frente da rede (MLFN), redes neuronais artificiais com autopropagação dos procedimentos, bem como outros tipos de algoritmos de formação, as técnicas de pruning e algoritmos genéticos. [00090] O método da presente invenção inclui não só as técnicas computacionais, como aqui demonstrado para a etapa d), mas também, por exemplo, tecnologias similares o uso de técnicas padrão de harmonização restantes, outras técnicas estatísticas de classificação ou outros métodos para comparar a expressão de proteínas com os resultados dados padrões - tanto para a comparação de perfis de expressão de proteínas complexas ou os perfis de fração de proteína, bem como para a comparação da expressão de um número limitado de biomarcadores ou antígenos ou a comparação da análise de viabilidade celular.

[00091] O resultado diagnóstico obtido pelo primeiro método e segundo para diagnóstico de glaucoma em algumas modalidades é resultado diagnóstico pronto para ser entendido por um paciente ou, em outras modalidades o resultado diagnóstico compreende um ou mais valores de diagnóstico para ser interpretada por um profissional médico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00092] Figura 1: Pontos de replica IgG / A / M anti-humana gerado pela impressão de contato (A) e a técnica de spotting com base em piezo (B).

[00093] Figura 2A: Coeficientes de variação (CV) discriminados para os antígenos oculares em estudo de microarranjos .

[00094] Figura 2B: Os desvios padrão (SD) discriminados para diferentes antígenos em estudo de microarranjos.

[00095] Figura 3: Comparação dos dados obtidos a partir de manipulações de dados diferentes para quatro diferentes antígenos. Listados são: dados brutos (A), dados de AUC (B) e dados de Z-escore (C).

[00096] Figura 4: Perfis das intensidades médias de antígenos para 20 antígenos incubadas com soro (A) e no humor aquoso (B) dos indivíduos controle (CTRL) e dos pacientes com glaucoma de ângulo aberto primário (POAG).

[00097] Figura 5: Box-Plot para IgG / A / M anti-humana para indivíduos saudáveis controle (CTRL) e pacientes com glaucoma (POAG).

[00098] Figura 6: Curva ROC (receiver operating characteristic) para detecção de glaucoma por reatividade de anticorpo para soro (6a) e humor aquoso (6B).

[00099] Figura 7: Comparação intraindividual de valores de imunorreatividade do soro e do humor aquoso para o grupo controle (7A) e amostras POAG (7B).

[000100] Figura 8: Análise das funções biológicas por anotações GO revelou vários termos super-representados através de cálculo do modelo hipergeométrico para antígenos oculares que apresentaram diferenças significativas entre os grupos de estudo em amostras de soro.

[000101] Figura 9: padrão típico de anticorpo de um paciente com glaucoma.

[000102] Figura 10: Reprodutibilidade semana a semana de dados de microarranjos.

[000103] A Figura 11 dá uma visão geral simples da instalação para uma modalidade preferida do segundo método diagnóstico para o glaucoma, o qual foi utilizado para os exemplos 1-3: células ganglionares neurorretinianas foram colocadas em placas experimentais e foi adicionado meio de cultura contendo 10% de soro de indivíduos saudáveis ou de pacientes com POAG (glaucoma primário de ângulo aberto), NTG (glaucoma de tensão normal) ou OHT (hipertensão ocular). As células foram incubadas a 37°C durante 48 horas, quer sob uma pressão normal ou a uma pressão elevada de 15000 Pascal. As células foram submetidas à lise e as proteínas separadas por uma precipitação com acetona. Os perfis de proteínas foram medidos com espectroscopia de massa SELDI-TOF e, em seguida, analisados estatisticamente.

[000104] A figura 12a mostra uma fração dos perfis proteicos medidos. O perfil de proteínas totais contou aproximadamente 400 aglomerados de proteínas diferentes. Na fração mostrada o eixo x indica o peso molecular em Dalton e o eixo y a intensidade do nível de expressão da proteína nas células. O perfil total de proteínas muito complexas medido por aglomerados de espectrometria de massa SELDI-TOF de proteína variaram entre 3078 Dalton (Da) a 183.222 Da. A fração mostrada aqui varia de 4943 Da até 21.934 Da e dá uma visão geral sobre a complexidade das proteínas nas células.

[000105] Figura 12b mostra várias medições individuais, revelando a dificuldade de identificar diferenças por mera análise visual dos perfis. Os perfis das amostras derivam de células tratadas com soro saudável ou POAG com e sem a presença de uma pressão elevada. O eixo X mostra o peso molecular das proteínas em Dalton, o eixo Y mostra a intensidade das proteínas medidas nas células. Como mostram os perfis de várias centenas de proteínas que não foi possível analisar as diferenças entre os grupos experimentais apenas por inspeção visual deles.

[000106] Figura 13: mostra gráficos de variabilidade vários dos biomarcadores calculados com os pesos moleculares de 9.192, 12.390 e 12.314 Dalton. O eixo x representa os diferentes grupos de tratamento das células. O eixo y mostra a intensidade da proteína medido por espectrometria de massa SELDI TOF. Cada triângulo em uma trama representa uma amostra do grupo específico. As parcelas de variabilidade revelam que a expressão de proteína destes 3 biomarcadores é alterada (aumentada ou diminuída) em células incubadas com soro POAG em comparação com células incubadas com soro saudável.

[000107] Figura 14: O gráfico mostra a análise de variância. Figura 14a mostra a influência dos diferentes tratamentos das células - com soro de indivíduos saudáveis ou de pacientes com POAG e à pressão ambiente ou elevada, sobre os perfis de proteínas das células. Obviamente, o tipo de soro tem uma influência muito grande de 59,1% sobre o perfil da proteína sobre a qual uma outra de 14% pode ser adicionada em combinação com uma pressão elevada (combinação 1 +2). A pressão em si tem um efeito de 11,6% sobre os perfis de proteínas das células. O gráfico da figura 14b mostra a influência da variação de diferentes tratamentos no que diz respeito a um biomarcador específico selecionado: 9192. O efeito é muito semelhante.

[000108] Figura 15a: mostra uma análise de variância (ANOVA) que calcula a influência da presença de anticorpos no soro POAG nos perfis de proteína com 50,5%. O tipo de soro ou seja, soro POAG ou o soro de indivíduos saudáveis, tiveram um efeito adicional de 13,4%.

[000109] Figura 15b: As distâncias de Mahalanobis mostram a comparação de perfis de proteínas totais das células incubadas com soro POAG com ou sem anticorpos para células incubadas com soro controle em que um aumento da distância a partir do ponto zero indica uma diferença crescente no perfil de proteínas de células incubadas com soro de pacientes com POAG em comparação com o perfil de proteína das células incubadas com soro saudável. Os perfis de proteínas das células incubadas com soro POAG diferem significativamente mais dos perfis de proteína que foram incubados com soro controle tal como indicado por uma distância Mahalanobis de aproximadamente 55 do que os perfis proteicos de células incubadas com soro POAG do qual os anticorpos tenham sido removidos (POAG - anticorpos), como indicado por uma distância Mahalonobis de aproximadamente 20.

[000110] Figura 16a mostra uma fração dos perfis de proteínas medidos a partir de células incubadas com soro saudável, POAG ou NTG na presença ou na ausência de pressão. O eixo X mostra o peso molecular das proteínas em Dalton e o eixo y mostra a intensidade medida da proteína nas células. É óbvio que as células reagem diferentemente ao soro NTG em comparação com o soro POAG .

[000111] A Figura 16b mostra um biomarcador de 9207 Dalton. O eixo X mostra o grupo experimental e o eixo y mostra a intensidade medida da proteína na amostra. O grupo de glaucoma inclui todas as células incubadas com um soro de glaucoma, assim com soro POAG ou NTG. Claramente, o biomarcador 9207 de Dalton é suprarregulado em células incubadas com soro de glaucoma.

[000112] A Figura 17 mostra uma curva ROC (receiver operating characteristic) calculada com base nos perfis de proteína medidos das células incubadas com soro de glaucoma, significando soro POAG ou NTG. Ela mostra uma distinção de um soro de glaucoma de um soro de não-glaucoma com uma sensibilidade de 88% e uma especificidade de 90%. A área sob a curva, o que é um parâmetro para a precisão do teste, é r: 0,92.

[000113] Figura 18: mostra a viabilidade de células RGC5 após incubação com diferentes concentrações de anticorpo 14-3-3 e estresse com estaurosporina 1,5 μΜ (sta). O eixo X mostra o grupo experimental, o eixo Y mostra a viabilidade das células em por cento. As células controle (barra cinza escuro) mostradas foram incubadas sem estresse celular ou anticorpos. As células incubadas com estaurosporina mostram uma perda de viabilidade de 16,1%. As células incubadas com estaurosporina e pré-incubada com anticorpo 14-3-3 mostram um aumento significativo (p <0,05) para altamente significativo aumento (p <0,01) de viabilidade, em comparação com células incubadas com estaurosporina de até 11,6%. (Concentração de anticorpos de 0,5 pg / mmL).

[000114] Figura 19: mostra a viabilidade de células RGC5 após incubação com diferentes concentrações de anticorpo γ-sinucleína e estresse, com H2O2 a 50 pM (1 hora). O eixo X mostra o grupo experimental, o eixo Y mostra a viabilidade das células em por cento. Células controle mostradas foram incubadas sem estresse celular ou anticorpos. As células incubadas com H2O2 mostram uma perda de viabilidade de 17,9%. As células incubadas com H2O2 e pré-incubada com anticorpo γ-sinucleína mostram um aumento significativo (p <0,05) para altamente significativo aumento (p <0,01) de viabilidade, em comparação com células incubadas com H2O2 de até 15,3%. (Concentração de anticorpos 0,05 pg / mL).

[000115] Figura 20: mostra a viabilidade de células RGC5 após incubação com diferentes concentrações de anticorpo GFAP e estresse, com H2O2 a 50 pM (1 hora). O eixo X mostra o grupo experimental, o eixo Y mostra a viabilidade das células em por cento. Células controle mostradas foram incubadas sem estresse celular ou anticorpos. As células incubadas com H2O2 mostram uma perda de viabilidade de 7,4%. As células incubadas com H2O2 e pré-incubadas com o anticorpo GFAP mostram um aumento (p <0,05) significativo de viabilidade, em comparação com células incubadas com H2O2 de até 9,8%. (Concentração de anticorpos de 0,5 pg / mL).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[000116] Exemplos e descrição detalhada sobre o primeiro método para diagnóstico de glaucoma: Exemplo 1: Microarranjos de antigenos comparando autoimunorreatividade no soro e humor aquoso, com diferenças características em pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis: [000117] Soros e humor aquoso de pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto, (POAG, n = 13) e controles saudáveis (CTRL, n = 13) foram utilizados para análise de anticorpos. As matrizes de proteína foram preparadas através da identificação de 40100 diferentes antígenos purificados (biomarcadores conhecidos) para lâminas revestidas de nitrocelulose . As matrizes foram incubadas com soro (1:250) e no humor aquoso (1:20), respectivamente. Para visualização das reações anticorpo-antígeno as matrizes de foram tratadas com um anticorpo IgG anti-humano marcado com fluorescência, seguido de varredura de fluorescência. Os sinais emitidos pelos anticorpos secundários foram digitalizados e as intensidades de pontos foram comparados utilizando técnicas estatísticas multivariadas.

[000118] Resultados: A comparação intraindividual revelou congruências, mas também diferenças entre os padrões de anticorpos de soros e humor aquoso. Em ambos humor aquoso e soro, os pacientes glaucomatosos mostraram reatividade aumentada mais de duas vezes para α-1-antitripsina e V anexina em comparação com indivíduos saudáveis (P < 0,001). Em contraste, β-L-cristalina revelou um aumento médio significativamente aumentado (ME) de reatividade no humor aquoso (POAG : ME = 5,049, DP = 1638; CTRL: ME = 2,119, DP = 673 e P < 0,01) e uma diminuição da reatividade em soros (P < 0,01) de pacientes glaucomatosos. Para sete antígenos nenhum dos indivíduos incluídos no estudo demonstrou imunomarcação no humor aquoso. Usando um painel de biomarcadores de 10 anticorpos / antígenos a partir de cada fluido corporal, respectivamente, foi possível diferenciar entre o POAG e CTRL com uma especificidade e uma sensibilidade de aprox. 90% (curva ROC-; soro: r = 0,91; humor aquoso: r = 0,93), utilizando um algoritmo especial. Estes resultados confirmam ambas as infra e suprarregulações de reatividade de anticorpos em soros e no humor aquoso de pacientes com glaucoma. Além disso, o aumento das reatividades no humor aquoso vs soro sugerem uma produção local de anticorpos no olho.

Exemplo 2: Aquisição de soro e humor aquoso [000119] Aquisição de amostras foi realizada de acordo com a Declaração de Helsinque sobre a investigação biomédica envolvendo seres humanos. Sangue e humor aquoso foi coletado de todos os voluntários que dão o seu consentimento informado. As amostras de sangue foram centrifugadas a 1000 g e o soro foi armazenado a -80°C para posterior análise. Amostras de humor aquoso foram armazenadas a -80°C imediatamente após a amostragem. Todos os participantes foram submetidos a um exame oftalmológico completo, incluindo aplanação Goldmann, tonometria, tomografia de coerência óptica (OCT) e Tomografia retina Heidelberg (HRT), no Departamento de Oftalmologia (Universidade de Mainz, Alemanha) e foram classificados de acordo com as diretrizes da Sociedade Europeia de Glaucoma. 31 pacientes, submetidos à cirurgia de catarata, com uma idade média de 73 (DP ± 10) e 37 pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (POAG, com idade média: 67, DP ± 10) foram incluídos neste estudo. Pacientes com catarata sem sinais clínicos de glaucoma primário ou secundário ou outras doenças oculares que catarata, serviu como grupo controle (CTRL), de acordo com outros estudos 42. POAG -pacientes tiveram uma PIO> 21 mmHg sem medicação (determinado pela tonometria de aplanação Goldmann), típicos defeitos de campo visual (examinados por perimetria, Perímetro POLVO 101; Haag-Streit, Wedel, Alemanha) e do nervo óptico escavação. Os pacientes com doenças autoimunes ou que sofram de doenças neurológicas tais como a doença de Parkinson foram excluídos deste estudo.

Exemplo 3: Preparação de Microarranjos [000120] Usamos as proteínas altamente purificadas, obtidas na Sigma-Aldrich (Alemanha) e Biomol (Hamburgo, Alemanha), como antígenos. Antígenos foram diluídos para 1pg/pL com tampão PBS contendo 1,5% de trealose para as condições de impressão ótimas. O spotting de antígenos foi realizado tanto com a tecnologia de impressão sem contato (sciFLEXARRAYER S3, Scienion, Berlim, Alemanha), com base em distribuição piezo e a técnica comumente usada baseada em pino de impressão por contato (OmniGrid100, Soluções Genomic Digilab, Ann Arbor, EUA). Os resultados foram avaliados comparativamente a morfologia local e local para detectar variabilidade. Para a impressão de todo o conjunto de microarranjos de estudo, a técnica baseada em piezo spotting foi usada. Cada antígeno foi spotted em triplicata em lâminas de nitrocelulose (Oncyte, nitrocelulose 16 pad multi-slides, Graça Bio-Labs, Bend, EUA). Como controle positivo e negativo foram utilizados anticorpos de camundongo anti-IgG / A / M humana (10 pg / pL) e tampão de spotting. O processo de spotting foi realizado à temperatura ambiente e com uma umidade de 30%. 1 nL de cada diluição de antígeno, foi aplicado sobre a superfície de nitrocelulose por spotting quatro vezes pl 250 na mesma posição. A exatidão do volume de spotting e o correto posicionamento das gotículas foram monitorizados antes e após o processo de spotting de cada antígeno usando o software VOLUME-sciDrop e detecção autodrop (Scienion, Berlin, Alemanha).

[000121] As etapas de incubação e de lavagem foram realizadas a 4°C em um agitador orbital (100 Titramax, Heidolph, Schwabach, Alemanha). As lâminas foram cobertas com câmaras de hibridização 16-pad FAST frame (Whatmann, Maidstone, UK) e bloqueadas com PBS contendo BSA a 4% durante uma hora. Em seguida as lâminas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,5% de Tween (PBS-T). Soros de pacientes foram diluídos 1:250 em PBS e humor aquoso em uma proporção de 1:10 em PBS. 120 pL de diluições foram aleatoriamente estas incubadas em lâminas preparadas de antígeno durante a noite. Após várias etapas de lavagem com PBS-T, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário marcado com fluorescência Cy-5 (1:500 diluído em PBS-T, de anticorpo de cabra anti-IgG humano, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, EUA) durante uma hora, no escuro. Duas etapas de lavagem com PBS-T foi seguida por dois últimas etapas de lavagem com água de grau HPLC. Todos os microarranjos foram secos ao ar antes da digitalização, usando um scanner de microarranjo (Affymetrix 428 Scanner matriz TM, High Wycombe, UK). Geradas imagens de 16-bit TIFF (formato de arquivo Tagged Informação) de lâminas foram analisadas usando o software 3.1.1 Spotfinder (TM4, Dana-Faber Cancer Institute, Boston, EUA). Subtração de fundo foi realizada de acordo com a fórmula: = média intensidade local SP - (. (Soma bkg -soma top5bkg) / (número de pixelSP - número de pixelstop5bkg)) onde SP representa qualquer local, o BKG fundo correspondente e top5bkg a cinco por cento superior do pixel de plano de fundo. O coeficiente de variação (CV) foi calculada do seguinte modo: CV = SDSP3 / meanSPX ... SPn, onde SDSP3 representa o desvio padrão em três pontos em duplicado com um antígeno de uma amostra, e significa SPX ... SPn a média de todas as intensidades de amostragem.

Exemplo 4: A análise estatística dos dados [000122] Para oferecer comparação a distorção dos resultados causados por preconceitos através normalização de dados e manipulação, nós primeiro contraste dois tipos diferentes de transformação de dados - área sob a curva (AUC) e Z-escore - com dados brutos. Para a análise dos dados do estudo, foi aplicado Z-escore de transformação, de acordo com a fórmula: Z-escore = (intensidade SP - significa intensidade SP1 ... SPX) / SDSPX ... SPn, onde SP representa qualquer intensidade de manchas e SP1 ... SPX intensidade geral de todos os pontos 46. Detecção de potenciais biomarcadores e estimativa de mudanças significativas na reatividade de anticorpos foi realizada por diversas técnicas estatísticas. Para comparação entre grupos foi utilizado uma análise de variância e análise multivariada de discriminação (por exemplo, distâncias de Mahalanobis, raízes canônicas) para ambos os materiais de amostra separadamente. Na segunda etapa, as redes neurais artificiais (ANN) foram realizados para determinação da classificação de padrões de poder de autoanticorpos a partir de um conjunto específico de antígenos. Portanto, os conjuntos de dados foram aleatoriamente espetado em duas partes com os números igualou de pacientes por grupo. Uma metade foi usado para o treinamento da RNA e no segundo semestre para testar a RNA treinada sobre o seu poder de classificação. Portanto, não há amostras incluídas no conjunto de dados de treinamento foram utilizados para fins de classificação. Os resultados foram visualizados por conspirar contra a sensibilidade especificidade (ROC-curva). Uma descrição detalhada dos métodos utilizados para a análise estatística pode ser encontrada em publicações anteriores de nosso grupo. Para comparação intraindividual e, a fim de exemplificar a proporção dos níveis de anticorpos do humor aquoso para aqueles a partir de amostras correspondentes de soro foi calculada a diferença entre os dois percentual base de valores séricos para cada paciente, seguido de calcular o valor médio sobre todas as disciplinas das diferentes pacientes-grupos. Diferença entre soro e humor aquoso maior que 100% foram considerados significativos. Além disso, correlacionamos dados medidos com todos os registros coletados clínicos. Análises estatísticas foram realizadas utilizando Statistica 8.0 (Statsoft, Tulsa, AZ, EUA).

Exemplo 5: Análise GO

[000123] A fim de obter um conhecimento mais profundo dos processos biológicos de antígenos com diferenças significativas entre os grupos de pacientes-que usamos Cytoscape 2.6.2 em combinação com o plugin de 2,3 Bingo 50. Para atribuir Gene Ontology (GO) anotações para cada antígeno, o banco de dados da anotação completa GO foi utilizado e para o organismo / anotação Homo sapiens foi o escolhido. O modelo hipergeométrico e Benjamini & Hochberg correção taxa de falsos Discovery (P < 0,05) assegurou significado das funções das proteínas sobre-representados.

Exemplo 6: Esquema de um método exemplar de determinação de contagens de glaucoma [000124] Em uma primeira etapa para determinar contagens de glaucoma, a diferença percentual entre os valores de intensidade normalizados de reatividades de autoanticorpos de amostras de teste e uma amostra de referência é calculado. Estas diferenças percentuais são utilizadas como dados de entrada para a análise de rede neural para determinar um escore de glaucoma. Dependendo da sensibilidade requerida, e a especificidade do método para o diagnóstico de glaucoma, o soro da etapa b) foram incubadas com uma das três opções exemplares de amostras: 1) ou 2) ou 3), que foram fornecidos de acordo com a etapa a) do primeiro método diagnóstico: [000125] Amostra 1) compreende todos os 48 antígenos oculares do Grupo 1, pelo menos parcialmente purificados, a amostra 2), e a amostra 3) compreendem 12 e 5 antígenos oculares pelo menos parcialmente purificados, respectivamente.

[000126] Tal como esperado, o maior número de antígenos oculares composta pela amostra de acordo com a etapa a), o melhor é o primeiro método diagnóstico com respeito à sensibilidade e especificidade. Na amostra 3), com apenas 5 antígenos oculares, ainda uma sensibilidade e especificidade de, aproximadamente, 90% foi obtido.

[000127] Além disso, os antígenos individuais compreendidos nas amostras 1, 2 e 3 foram designadas fatores de ponderação diferentes para o cálculo do escore de glaucoma, de tal modo que os antígenos altamente ponderadas (por exemplo, antígenos do grupo A) têm um maior impacto na pontuação glaucoma.

[000128] Pontuações glaucoma diferentes a partir de um valor de referência definido - por exemplo, exceder um valor limiar definido -identificar as amostras de teste, em que os fluidos corporais foram recolhidos a partir de um paciente com glaucoma.

Valores de intensidade normalizados reatividades de autoanticorpos l Cálculo da diferença de percentagem de intensidade valores aos valores de referência, pela fórmula: diferença % = (valor intensidadeDaciente - valor intensidadereferência) * 100 valor intensidadereferência | Escore de Glaucoma [000129] Avaliação de um escore de glaucoma usando o algoritmo de rede neural com diferenças percentuais calculados como dados de entrada: 1) Escore com base em todos os antígenos testados Sensibilidade: 96% Especificidade: 97% 2) de pontuação baseado em um subconjunto de 12 antígenos testados, incluindo: MBP, GST, HSP27, inibidor de proteína quinase C, GFAP, Jo-1, ubiquitina, actina, beta-S-cristalina, superóxidodismutase, HSP70, transtirretina Sensibilidade: 92% Especificidade: 94% 3) A pontuação baseado em um subconjunto de 5 antígenos testados, incluindo: Actina, HSP70, beta-S-cristalina, HSP27, GFAP Sensibilidade: 91% Especificidade: 88% [000130] De acordo com o seu impacto sobre o diagnóstico de glaucoma e de dados de análise estatística, considerando como teste post hoc de análise ou de discriminação, os antígenos são subdivididos em três grupos distintos, com pesos diferentes para o cálculo do escore de glaucoma. Antígenos que mostram uma forte diferença entre grupos são atribuídos ao grupo de antígenos, com uma forte diferença são atribuídos ao grupo B e antígenos com uma diferença distinta entre grupos são atribuídos ao grupo C: Grupo A (altamente relevante): [000131] actina, alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, beta-S-cristalina, gama-cristalina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutationa-S-transferase, HSP27, HSP60, HSP70, Jo-1, proteínas de ligação a mielina (MBP), enolase neuronal específica (NSE), inibidor da proteína quinase C, superóxido dismutase, transferrina, transtirretina, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina Grupo B (altamente relevante).

[000132] anexina I-IV, beta-2-adrenérgico, calreticulina, proteína de choque térmico hsp10, insulina, superóxido-peróxido, proteína quinase C, alfa-sinucleína, gama-sinucleína Grupo C (antígenos relevantes): [000133] albumina, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), cardiolipina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, lisozima, glicoproteína da mielina de oligodrendrócito (MOG) , mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, 3-fosfoserina, tireoglobulina, inibidor de topoisomerase.

[000134] Antígenos revelando uma relevância muito alta para o diagnóstico de glaucoma são mais fortes ponderados de antígenos do grupo B ou C, o que resulta em um maior impacto na pontuação glaucoma. Antígenos com uma alta relevância são mais fortes do que ponderado antígenos do grupo C, resultando em um impacto médio sobre a pontuação glaucoma. Antígenos relevantes obteve o menor impacto sobre a pontuação glaucoma avaliados.

I

[000135] Indivíduos que excedam um limiar definido são diagnosticados como paciente com glaucoma [000136] Figura 1: Três manchas em duplicado com anti-IgG / A / M humana gerado pela impressão de contato (A) e a técnica de spotting baseada em piezelétrico (B) são mostrados. Os números representam as médias respectivas intensidades de pixel por mancha. A: A intensidade média em todos os pontos é 7173,32 + / - 1.473,27 unidades. O coeficiente de variação (CV) é de 0,21. B: A intensidade média é 11,716 + / - 374,78 unidades. O CV é de 0,03.

[000137] Dois diferentes tecnologias de spotting foram comparados a fim de encontrar a melhor abordagem para o spotting específico de proteínas com diferentes características físicas de uma forma reprodutível. Um método vulgarmente utilizado para descrever a variação de intensidades entre os pontos replicados local é a determinação do coeficiente de variância 45. Usando a tecnologia de impressão baseada pino contato conseguimos um CV médio de 0,32 pontos em três réplicas técnicas para todos os antígenos. A morfologia local e intensidade varia entre os pontos idênticos, como se mostra na figura A. 1 Em contraste, microarranjos spotted sem contato , técnica de spotting baseada em piezo mostrou um ponto mais de 10 vezes menor que a variabilidade local (CV médio = 0,029) e uma constância de muito melhor na morfologia do ponto (figura 1 B). Estes resultados são consistentes com os dados obtidos a partir do software VOLUME-sciDrop e detecção autodrop. O software de detecção de uma variação da queda de volume de apenas 0,8% (equivalente a 2 pl de 250 pl de uma gota) em todos os antígenos. Em consequência, a tecnologia de impressão sem contato, foi escolhido para a impressão de todo o conjunto de lâminas de microarranjos de estudo, a fim de assegurar focagem spotting de volumes exatamente iguais de soluções de antígeno. Similar à estimativa do CV para a validação tecnologias de spotting foi calculado o coeficiente médio de variação para técnicas de spotting idênticas dos microarranjos de estudo. Estes microarranjos exibiu um CV médio de 0,031, com um desvio padrão de 0,061 (para distribuição de CV para antígenos simples ver Figura 2.a), enquanto que o desvio padrão para a média intensidade medidos em pontos replicados em todas as amostras varia 44-480, dependendo no antígeno e suas intensidades médias local (ver a figura 2.B).

[000138] Figura 2A e Figura 2B: A Figura 2A mostra os coeficientes de variação (CV) de dados brutos, discriminados para cada antígeno em microarranjos de estudo. O eixo x representa os diferentes antígenos, o eixo y os valores de VC. O CV mediana em todos os antígenos é 0,031 + / - 0,061. Figura 2B mostra os desvios padrão (SD) de dados brutos, discriminados para diferentes antígenos em microarranjos de estudo. O eixo x representa os diferentes antígenos e o eixo y os valores para os desvios padrão (SD).

[000139] Para perfil de anticorpos dos pacientes do estudo e indivíduos teste de comparação de algoritmo diferente para a normalização dos dados revelou a transformação Z-escore é mais aplicável a nossa abordagem, devido a seu viés baixo em proporções entre grupos de estudo (figura 3) e a possibilidade de comparar as medidas de uma forma quantitativa através de diferentes experimentos e testes de glaucoma.

[000140] Figura 3: Comparação dos dados obtidos a partir de manipulações de dados diferentes para quatro diferentes antígenos. Listados são: dados brutos (A), a dados de AUC (B) e dados de Z-escore (C).

[000141] Poderíamos detectar padrões de reatividade de anticorpos complexos em todos os pacientes do estudo e as diferenças entre os vários pacientes com glaucoma e indivíduos controle, no soro, bem como no humor aquoso (Figura 4A e B). Não houve correlação entre o nível de IgG / A / M e a idade ou o sexo dos pacientes, e não encontramos diferenças significativas nos níveis de IgG / A / M- de grupos de estudo, nem no soro (P > 0,9, Figura 5 A) nem no humor aquoso (P > 0,6, Figura 5B).

[000142] Figura 4: Perfis das intensidades médias de anticorpos de soro (A) e no humor aquoso (B). São mostradas as intensidades médias de indivíduos controle (CTRL) e pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (POAG), por 20 antígenos. Padrão de linha representam grupos de pacientes (vermelho = POAG, azul = CTRL), X-eixo representa um subconjunto de 20 anticorpos que mostraram mais fortes diferenças entre os grupos, e o eixo Y representa o valor de Z-escores computados.

[000143] Figura 5: São mostrados os valores determinados para anti-IgG / A / M humano como Box-Plot. O eixo X representa os diferentes grupos (grupo controle (CON); grupo glaucoma (POAG )) e o eixo y a intensidade medidos e normalizados (Z-escore). Não houve diferença significativa entre os dois grupos pode ser detectada (P > 0,05) no soro (5A) ou no humor aquoso (5B).

[000144] No soro, os pacientes glaucomatosos mostraram vários imunorreatividades aumentadas em comparação com indivíduos CTRL, mas revelou que algumas reatividades também diminuíram (figura 4A). Como demonstrado, HSP27, HSP70, proteína básica de mielina (MBP) ou anexina V exibiram reatividades elevadas de anticorpos de pacientes com POAG em comparação com o grupo controle. Para outros antígenos, tais como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou ubiquitina, pacientes com POAG apresentaram reatividade de anticorpos mais baixos do que os indivíduos normais. Pouco frequente ou muito pequenas, até não detectável, intensidades foram encontrados para a mioglobina, a glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) e DNA topoisomerase 1. Análise ANOVA oneway e multivariada de discriminação não só revelam uma diferença significativa entre as reatividades de anticorpos inteiros em soros de pacientes POAG e controles saudáveis (P < 0,002), mas também uma diferença estatisticamente significante para vários antígenos individuais. Por exemplo, pacientes com POAG mostrou um aumento significativo da reatividade contra MBP (P < 0,0028), HSP27 (P < 0,019), HSP70 (P < 0,0033) ou α-fodrina (P < 0,0027) (Tabela 3.). Reatividades de anticorpos significativamente diminuídos foram observados para GFAP (P < 0,001), ubiquitina (P < 0,0038) e β-L-cristalina (P < 0,03).

[000145] No contexto de uma utilização potencial da reatividade de autoanticorpo como uma ferramenta de diagnóstico para o glaucoma, testou-se a sua classificação de energia mediante a aplicação de redes neurais artificiais (ANN). Treinamento da rede foi efetuada utilizando um subconjunto de pacientes (CTRL N = 18, POAG N = 17) e os dados das nove mais significativas reatividades anticorpo-antígeno no soro (14-3-3, alfa-1-antitripsina, beta - L-cristalina, GFAP, HSP 27, HSP 70, MBP, alfa-fodrina, Ubiquitina). Posteriormente, a rede treinada foi aplicada a amostras de soro desconhecidas. Os valores de saída ANN personalizados para cada paciente, mostrando a classificação do grupo através da ANN, foram utilizadas como um escore combinada de anticorpos (CTRL > 0,5, POAG < 0,5). Contagens de anticorpo calculadas a partir de amostras de soro dos dados de treino conjunto revelaram uma forte correlação positiva com pontuações calculadas a partir de amostras de humor aquoso dos mesmos pacientes (R < 0,74, P < 0,001, Figura 6A). Além disso, para amostras prospectivas (CTRL N = 13, POAG N = 20; dados de teste), não incluído no conjunto de dados de treinamento, foi detectada uma correlação entre o humor aquoso soro e anticorpos pontos (R < 0,72, P < 0,001, Figura 6B). Usando os escores de anticorpos calculados para classificação de pacientes apenas um sujeito (CTRL) foi incorretamente classificados como sujeito POAG pelo soro e o escore de anticorpos do humor aquoso (Figura 6B). A forte correlação positiva dos escores calculados de ambos os tipos de amostras sublinha as diferenças menores entre imunorreatividades humor aquoso e soro detectados através da comparação intraindividual. A sensibilidade e especificidade para uma discriminação de sujeitos prospectivos de glaucoma e de controle foi de 93% (figura 6C; AUC r = 0,93).

[000146] Figura 6A, B: diagramas de dispersão de reatividades de anticorpos séricos e humor aquoso. O eixo X mostra os valores de contagens de anticorpos séricos, os valores do eixo Y a partir de amostras de humor aquoso. Cada ponto representa um único paciente (pontos azuis = POAG, pontos vermelhos = CTRL). A: Dispersão de amostras incluídas no conjunto de dados de treinamento (R = 0,74), B: gráfico de dispersão para todas as amostras do estudo (R = 0,72). C: característica operacional do receptor para as amostras de soro em perspectiva (eixo dos X: 1-especificidade, eixo Y: sensibilidade, r = 0,93).

[000147] O exame de amostras de humor aquoso exibiram várias diferenças entre os grupos de estudo, de igual modo (Figura 4B). Mas ao contrário de amostras de soro, apenas alguns poucos apareceu diminuição das reatividades. A maior parte dos antígenos, tal como PAM, HSP70, anexina V ou a glutationa-S-transferase revelaram reatividades maiores para o grupo POAG, e vários destes são de acordo com as amostras de soro. Para outros, como a insulina de cadeia B ou MOG, reatividades de anticorpos raros puderam ser detectadas no humor aquoso e, em parte, estes são os mesmos antígenos que mostraram reatividade raras no soro (por exemplo, DNA topoisomerase 1ou MOG, tabela 3). Além disso, a análise estatística fortifica o aparecimento de semelhanças entre os dois tipos de amostra. Os dados assim obtidos, por exemplo, mostraram um P < 0,022 para MBP e um P < 0,03 para anexina V no humor aquoso -ambos os antígenos apresentam valores significativamente aumentados no soro de pacientes POAG, também. Coincidindo com o menor número de uni diferenças estatisticamente significativas entre os indivíduos e POAG CTRL, o poder de classificação verificada de humor aquoso foi menor (ROC-curva; AUC r = 0,7) do que a das amostras de soro.

[000148] Figura 7: Comparação de intraindividual de imunorrea-tividades do humor aquoso e no soro. Antígenos são listados no eixo X. O eixo Y representa os valores medidos de Z-escore. Barras acima da linha zero representam imunorreatividades mais elevados no humor aquoso, barras abaixo da linha zero representam intensidades mais elevadas no soro. São mostrados os resultados para o grupo de controle e as amostras de POAG. De modo geral, pode-se observar que apenas poucos antígenos apresentam diferenças nas imunorreatividades superiores a 100% (= aumento de 2 vezes).

[000149] A comparação intraindividual de imunorreatividades de amostras de soro com os das correspondentes amostras de humor aquoso revelou apenas algumas poucas diferenças significativas. Em relação aos indivíduos CTRL significativos níveis mais elevados de reatividade dos anticorpos do soro (por exemplo, PAM, HSP60, GFAP) pode ser observado, em comparação com amostras aquosas correspondentes humor, bem como significativamente mais elevados imunorreatividades do humor aquoso (por exemplo, α-1- antitripsina). Mas, na sua totalidade, mais de 80% dos antígenos testados revelou imunorreatividades quase semelhantes em soro e no humor aquoso de indivíduos controle. Pacientes com POAG revelou também algumas diferenças significativas entre soro e humor aquoso (Figura 7b). Por exemplo, a albumina e α-1-antitripsina mostrou imunorreatividades mais elevadas em amostras de soro, e no último caso, se tal for contrário ao controlar as amostras que apresentaram uma maior imunorreatividade de α-1-antitripsina no humor aquoso. Amostras de humor aquoso do grupo de glaucoma revelou algumas reatividades de anticorpos mais elevados em comparação com as amostras de soro correspondentes, bem (por exemplo, fibronectina, transtirretina). Porém, como com o grupo de controle, apenas algumas poucas diferenças significativas entre imunorreatividades do humor aquoso e no soro apareceu no grupo glaucoma, e mais de 80% dos antígenos testados revelou padrões de anticorpos quase congruentes.

[000150] Figura 8: Análise das funções biológicas por anotações GO revelou vários super-representados termos. Através do modelo de cálculo hipergeométrica para antígenos mostraram diferenças significativas entre os grupos de estudo em amostras de soro. Sobre o eixo-x o número de proteínas atribuídos aos diferentes grupos funcionais são mostrados. Os grupos funcionais estão listados no eixo y. As barras azuis representam antígenos com uma maior imuno-rreatividade em indivíduos com POAG, as barras vermelhas representam antígenos com uma menor imunorreatividade em pacientes com glaucoma. O asterisco indica grupos funcionais, que também pode ser encontrado no humor aquoso.

[000151] É interessante notar que termos como resposta ao estresse, citoesqueleto, o tráfico vesicular e apoptose estão significativamente sobre-representados (figura 8). Termos como citoesqueleto ou tráfico vesicular são fortemente ligado a processos neurológicos e outros como resposta ao estresse ou apoptose deve ser considerada em conjunto com as doenças neurodegenerativas.

[000152] Figura 9: A) modelo de autoanticorpos típico de um paciente com glaucoma. Proteínas foram eluídas de lágrima a partir de uma tira seca de Schirmer usando solução salina tamponada com fosfato, seguindo-se a incubação da amostra com um microarranjo da proteína. B) curva de funcionamento do receptor característica (curva ROC). Rasgue padrões de autoanticorpos de pacientes com glaucoma e indivíduos saudáveis foram usados para a formação de uma rede neural artificial em matéria de reconhecimento padrão de pacientes com glaucoma. O eixo y representa a sensibilidade e o eixo-x o 1-especificidade. Usando estes padrões de autoanticorpos uma especificidade e sensibilidade > 90% pode ser conseguido (área sob a curva: r = 0,93).

[000153] Figura 10: Variabilidade de dados semana a semana de microarranjos. Um soro padrão foi incubado em sete semanas consecutivas, seguido de cálculo dos coeficientes de variância (CV). Para vários diferentes antígenos do CV (barras pretas), incluindo o desvio padrão está representado.

[000154] Utilizando a abordagem de microarranjo de proteína, pode-se confirmar as diferenças de reatividade de anticorpos em soros e humor aquoso de pacientes com glaucoma, tal como é conhecido na arte. Além disso, vários novos antígenos, tais como a α-1-antitripsina ou anexina V, foram encontrados a ter um impacto no glaucoma. Em comparação com os controles foi detectada imunorreatividades significativamente aumentadas no soro e no humor aquoso de pacientes com POAG bem como reatividades significativamente diminuídos nos soros de indivíduos com glaucoma. Para antígenos, por exemplo, várias anexina V, chaperonina, HSP27, HSP60, HSP70 ou MBP mesmos tipos de diferenças entre os grupos de pacientes podem ser observadas no humor aquoso e amostras de soro de pacientes com glaucoma - dar um primeiro sinal para a semelhança entre os dois tipos de amostra. Em geral, as diferenças entre os indivíduos controle e pacientes com glaucoma pareceu ser menos em amostras de humor aquoso, em que apenas oito univariadas diferenças significativas entre os dois grupos podem ser detectados, em contraste com 11 diferenças significativas nas amostras de soro. A comparação intraindividual do humor aquoso e soros revelou apenas alguns poucos antígenos, por exemplo, MBP, GFAP ou α-1-antitripsina, para expor imunorreatividades significativamente diferentes entre ambos os tipos de amostras de indivíduos controle. Além disso, nas amostras de glaucoma sujeita, por exemplo, poucos antígenos albumina ou transtirretina, apresentam diferenças estatisticamente significativas entre os padrões de imunorreatividade de ambos os fluidos corporais. Em comparação com amostras de soro, transtirretina exibiu uma maior reatividade de autoanticorpo no humor aquoso de pacientes POAG, um resultado que é muito interessante, considerando o fato de que os valores mais elevados de transtirretina em si poderia ser encontrado no humor aquoso de POAG pacientes. Em sua totalidade, mais de 80% das reatividades de antígeno-anticorpo revelou ser congruente em ambos os fluidos, em indivíduos saudáveis, bem como em pacientes com POAG. Este resultado indica que imunorreatividades em um fluido ocular como o humor aquoso, o qual está em contato estreito com a retina - o local de patogênese glaucoma, que não são muito diferentes das imunorreatividades sistêmicas no soro, em termos de anticorpos. Assim, este resultado sublinha a especificidade de alterações detectadas nos padrões de anticorpos no soro de pacientes com glaucoma e pode ser importante para outras doenças oculares também.

Descrição detalhada e exemplos sobre o segundo método para diagnóstico de glaucoma: [000155] De acordo com as modalidades preferidas do segundo método para a detecção de glaucoma para a etapa a) de uma cultura de células da linha de células R28 neurorretiniana ou o precursor da retina linha celular RGC 5 foi fornecido e na etapa b), as células são tratadas sob uma pressão normal ou elevada de 15000 Pascal (Pa), com soro de indivíduos normais e de pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (POAG), glaucoma de tensão normal (NTG) e hipertensão ocular (OHT) pacientes. Pacientes hipertensão ocular (OHT) têm uma pressão intraocular, que é mais elevado do que o normal na ausência de sintomas de glaucoma, tais como danos do nervo óptico ou perda de campo visual.

[000156] Nos exemplos os seguintes materiais e métodos foram utilizados. No entanto, a invenção não está limitada à combinação de materiais e métodos, tal como descrito abaixo, e os métodos descritos a seguir podem ser substituídos por métodos alternativos utilizados para fins correspondentes.

[000157] Cultura de células: A linhagem celular R28 neurorretiniana foi usada [fornecido a partir de G M. Siegel; Ross Eye Institute, Universidade de Buffalo]. Esta é uma linhagem celular neurorretiniana derivada de ratos Sprague-Dawley de 6 dias pós-natais e imortalizadas com 12S porção de gene E1A. A linhagem celular que possui características de células precursoras da retina, tais como as células ganglionares da retina, fotorreceptores, células de Müller, bem como células da glia [Seigel, GM, AL Mutchler, e EL Imperato, A expressão de marcadores gliais em uma linhagem de células de precursor da retina. Mol. Vis, 1996. 2: p. 2]. As culturas foram mantidas em Dulbecco modificado por Eagles (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; Cambrex BioScience, Verviers, Belgien), 5mg/ml de solução de gentamicina-Glutamina (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim), 10% de vitaminas MEM (100x (Invitrogen)) e 10% de MEM aminoácidos não essenciais (100x (Invitrogen)). As células foram passadas a cada 4-5 dias com uma solução de dissecção celular não enzimática (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim) e cultivadas em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 a 37°C. A linhagem de células de precursor da retina RGC 5 [fornecido a partir de N. Agarwal, UNT Health Science Center, Fort Worth] é uma linhagem de células da retina também imortalizada com a porção do gene 12S E1A expressando marcadores de células neuronais, bem como as células da retina [Krishnamoorthy, RR, P. Agarwal, et al. (2001). "Caracterização de uma linhagem celular transformada ganglionar da retina de rato". Brain Res Mol Brain Res. 86 (1-2): 1-12; Van Bergen, NJ, JP Wood, et al. (2009). "Recaracterização da linhagem celular RGC-5 ganglionar da retina." Invista Ophthalmol Vis Sci 50 (9): 42674272]. As culturas foram mantidas em Meio de Dulbecco Eagels modificado (DMEM) contendo 10% FBS, 100U/ml penicilina, estreptomicina 100 ug e glutamina 2 mM e cultivadas em uma atmosfera umidificada a 37°C com CO2 a 5%. O meio foi mudado cada dois dias e as células foram passadas a cada 4-5 dias com uma Solução de Dissecção celular não enzimática.

[000158] Preparação de lisados celulares: Em alguns experimentos, o meio foi descarregado após 48 horas e as células que crescem na parte inferior da placa experimental de 5 mL foram lavadas duas vezes com 5 ml de fosfato tamponado salino (PBS; Invitrogen). 100 pL de tampão de lise (Ureia 9.5M, Chaps a 2%, DTT a 1%) com uma mistura de inibidor de proteinase adicionado (P 1860 (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim)) em uma proporção de 400:1 foi pipetada para as células. Estes foram, em seguida, descartado da placa e fornecido em um tubo Eppendorf resfriado com gelo. As células foram, então, submetidas à lise com um instrumento de ultrassons de impulsos de eco (Labsonic ® M (Sartorius, Gottingen)), com uma amplitude de 80% e frequência / Ciclo de 0,5 para 3x25 vezes. Após lavagem das células nas placas de 24 poços, duas vezes com 150 pL de PBS, 60 pL de tampão SELDI com a mistura de inibidor de proteinase-suplementar foi adicionada. As células foram novamente descartadas do fundo do poço e submetidas à lise como mencionado acima. As células foram colocadas em gelo após cada ciclo de lise com o instrumento de ultrassons de impulsos de eco. A concentração de proteína da célula a partir dos lisados de poços experimentais de 5 mL foram, então, medidas usando o método de Lowry [Lowry, OH, et al., Proteína medida com o reagente de Folin fenol. J Biol Chem, 1951. 193 (1): p. 265-75].

[000159] Em outras experiências, o meio foi descarregado e as células lavadas com PBS morno livre de cálcio. As células foram, em seguida, desprendidas da placa de cultura de células utilizando uma Solução de Dissecção celular não enzimática. As células isoladas foram centrifugadas a 300 g durante 10 min a 4°C. O sobrenadante foi removido e o sedimento de células foi lavado com PBS. As células foram novamente centrifugadas, o sobrenadante foi removido e as células congeladas a -80°C. Depois de congelar as células foram descongeladas e tampão de lise com 0,1% Dodecil Maltosid D-β e inibidor de proteinase foi adicionado. A lise celular foi aumentada colocando as células com o tampão de lise em um banho de sonicação resfriado com gelo durante 1 minuto. A concentração de proteína também foi medida utilizando o método de Lowry.

[000160] O preparo de proteínas totais de lisados celulares: A fim de medir os perfis de proteína das células de um equivalente de proteína 150pg foi removido do lisados celulares preparados como acima, e as proteínas foram precipitadas com acetona por adição de 8 vezes o volume de acetona de - 80°C para a amostra e incubou-se em gelo durante 30 minutos. As amostras foram, então, centrifugadas a 14.000 rpm a 4°C durante 30 minutos. A acetona foi então descarregada e PBS foi adicionada ao sedimento de proteína deixar a concentração final de proteínas no 8pg/pL. Para dissolver as proteínas do PBS, o tubo foi colocado em um banho de gelo ultrassons durante 30 minutos. 2pL da amostra, em seguida, foram vistos nas fichas de proteína do SELDI-TOF-MS.

[000161] A análise dos fragmentos peptídicos por Orbitrap: O equivalente a 60 pg de proteína foi tomada a partir de lisados celulares do preparado de acordo com o método que utiliza Dodecil-D-β-Maltosid e separados com um gel de eletroforese Bis Tris 12% (Invitrogen). As raias foram divididas em 16 pedaços de igual tamanho e as proteínas destes pedaços foram digeridos com tripsina. Após a digestão, as proteínas foram extraídas do gel e as proteínas de cada pedaço foram ainda fracionadas em oito frações diferentes usando C 18 ZipTips. Os ZipTips foram carregados com as amostras e os peptídeos foram liberados a partir da ponta (Tip), utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10% a 50%. As frações foram, então, carregadas para um alvo Orbitrap e coberto com uma matriz de ácido sinápico. Os peptídeos foram medidos com o Orbitrap seguindo o protocolo do fabricante. As informações, por exemplo, sobre a massa dos peptídeos obtida através da medição dos peptídeos com Orbitrap foi enviada para várias bases de dados e comparação com fragmentos peptídicos conhecidos das proteínas registradas na base de dados. Uma lista de proteínas medidos foi gerado. A intensidade das proteínas medidos nos diferentes grupos experimentais foi gerado e comparado.

[000162] A análise das proteínas celulares totais por Espectrometria de Massa SELDI-TOF: Para analisar os perfis de proteínas uma espectrometria de massa PBS-II SELDI-TOF com laser de dessorção / ionização tempo-de-vôo de superfície melhorada foi utilizado (por exemplo, disponível comercialmente em BioRad, Hercules, CA, EUA ou Ciperhgen Biosystems Inc Fremont). Este espectrômetro de massa usa chips de proteínas com superfícies químicas diferentes. Cada amostra foi carregada em vários chips de oito pontos com um permutador catiônico fraco (CM10) ou de uma superfície de fase reversa (H50) [após tratamento destes de acordo com o protocolo do fabricante]. Depois de deixar a amostra seca, 1 pL de ácido sinápico-matriz, uma molécula absorvente de energia, (ácido sinápico 20 mg, 750 pL ACN, 750 pL H2O-HPLC, 15 pL TFA) foi pipetado para cada ponto duas vezes sempre permitindo a cristalizar. As amostras foram, então, submetidas à lise utilizando um leitor de Chip Proteína PBS-IIc com um carregador automático de matriz de proteína do Chip que é capaz de analisar 24 chips de cada vez utilizando o Protein Chip Software versão 3.2. As amostras foram medidas a uma intensidade do laser de até 200, uma configuração de deflector de 2800 Da, a sensibilidade do detector, de 9 e um alcance de detecção molecular em massa de 3000-200000 Da, otimizada a partir de 3000 -. 15.000 Da.

[000163] Detecção de pico dos perfis de proteína medido por SELDI-TOF-MS: Os perfis de proteínas medidos então foram enviados para o Ciphergen Express Data Manager Software versão 3.0 (EC; Ciphergen Biosystems). A linha de base foi subtraída e os picos detectados de acordo com o protocolo dos fabricantes.

[000164] A partir dos picos detectados uma lista de conjuntos de pico para cada montagem experimental foi gerado. As listas de cluster foram exportados para um programa de análise estatística (Statistica, versão 8.0;. Statsoft, Tulsa, OK). O programa foi utilizado para o cálculo de uma análise discriminante multivariada baseados em combinações de picos de biomarcadores múltiplos. Pode mostrar quais picos de proteína são significativamente diferentes entre os grupos experimentais individuais e podem ser usados para discriminar entre os grupos. No primeiro estudo comparando células incubadas com soro POAG para células incubadas com soro saudável um painel de biomarcadores de 10 massas de proteína foi detectada que mostrou os picos mais capaz de discriminação entre os diferentes grupos.

[000165] Comparando-se os resultados da análise da expressão de proteínas de células incubadas com diferentes soros na presença ou na ausência de uma pressão elevada através de análise estatística: Utilizando estatísticas, um componente de variância e misturado modelo ANOVA foi calculada de modo a determinar a influência das variáveis dependentes (tipo de soro / pressão-altura), bem como as variáveis independentes sobre os perfis de proteínas das células. O cálculo foi baseado nas raízes canônicas do existente painel de biomarcador. A influência das variáveis também foi calculada para cada biomarcador de proteína único. Esta análise foi também efetuada para calcular a influência dos anticorpos no soro sobre os perfis de proteínas. Também as distâncias de Mahalanobis foram calculadas para mostrar a direção dos perfis de proteínas alteradas após a remoção de anticorpos.

[000166] Usando os biomarcadores calculados uma curva de funcionamento do receptor (ROC) foi calculado. Era capaz de documentar a detecção de um soro de glaucoma com uma sensibilidade de 88% e uma especificidade de 90%. A área sob a curva é r: 0,92, como mostrado na Figura 17.

[000167] Além disso, uma rede neural foi gerada. Trata-se de uma ferramenta de modelagem estatística de dados que é alimentada com as informações de pico dos perfis proteicos. Se o dado é significativo / potente o suficiente, a rede tem a capacidade de aprender a diferenciar entre os grupos experimentais e é capaz de localizar / associar novas amostras para o grupo de acordo.

[000168] Identificação de proteínas: Uma MS MALDI-TOF-TOF foi utilizada para identificar os biomarcadores de proteínas medidos com SELDI-TOF MS. As proteínas nos lisados celulares foram separados através de SDS-PAGE utilizando um equivalente de 200 pg de proteína para cada corrida após seu preparo, com uma precipitação com acetona. O sedimento remanescente foi dissolvido em 5 pL de tampão de amostra ® NuPage LDS 4x (Invitrogen) diluído em 15 pL de H2O. Após desnaturar as proteínas a 90°C durante 5 minutos estas foram separadas com um Gel Bis-Tris 12% (Invitrogen), utilizando um tampão de corrida NuPage ® MES SDS 20x Invitrogen. Após a corrida, os géis foram incubados com uma solução de fixação (40 mL de H2O, 50 mL de metanol, 10 mL de ácido acético) durante dez minutos, seguido de solução de coloração (kit de coloração azul coloidal, Invitrogen) (55 mL de metanol, 20 mL de H2O, 20 mL Corante A, 5 mL Corante B) de acordo com o protocolo do fabricante de um dia pro outro. As proteínas nas bandas do gel que contém os biomarcadores foram eluídas de acordo com o seguinte protocolo: 2x 1 milímetro partes da banda foram cortadas do gel e transferidas para solução de lavagem 100 pL (Metanol a 50%, 40% de H2O, ácido acético a 10% ) e incubadas durante 30 minutos com agitação vigorosa, em seguida desidratado com ACN a 100% durante 20 minutos. Em seguida, 50 pL da solução de eluição (50% de ácido fórmico, 25% ACN, 15% Isopropanol 10% de H2O) foi adicionado aos pedaços de gel seco e incubou-se durante 4 horas. Uma amostra de 2 pL foi medida com SELDI-TOF MS para mostrar as proteínas eluídas. Depois de mostrar as proteínas com SELDI-MS, a digestão foi realizada. O resto da banda foi cortada em pequenos pedaços e adicionou-se 50 pL ACN durante 15 minutos. Após centrifugação curta e descarga do ACN os pedaços de gel foram secos com secador Speed-Vac durante 10 minutos e cobertas com 50 pL de tampão Tripsina (50 mM NH4HCO3, 14,8 ng/pL tripsina) e deixada a 37°C durante aproximadamente 12 horas. 20 pL de NH4HCO3 a 25mM foi adicionado às proteínas digeridas e, subsequentemente, as proteínas digeridas foram extraídas por incubação durante 30 minutos com uma solução de extração de 20 pL (5% de ácido fórmico; ACN a 50%, 45% H2O). Usando o método de dupla camada, 1mL das proteínas digeridas foram carregadas em uma âncora MALDI alvo usando 2x0,5 pL de matriz de ácido cinâmico. As proteínas fracionadas foram medidas com um MALDI-MS TofTof (Bruker Ultra Flex II) de acordo com o protocolo do fabricante.

[000169] A configuração dos exemplos 1-4 do teste de diagnóstico para o glaucoma de acordo com uma modalidade preferida é descrita na Figura 11. O Exemplo 1 foi realizado em placas experimentais de 5 mL (nunclon Surface) de acordo com as condições de cultura de células descritas acima. Exemplos 2 e 3 foram realizados com placas de 24 poços e as condições de cultura de células ligeiramente adaptado: As células foram colocadas em placas com uma confluência de cerca de 40% e tratadas com o meio DMEM conforme listado acima, contendo 10% do soro experimental em vez de FBS. Elas foram, então, incubadas em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 a 37°C com ou sem uma pressão elevada de 15000 Pascal (112mmHg), durante 48 horas. Para gerar uma pressão [hidrostática] elevada foi utilizada uma câmara de pressão de vidro especialmente concebida. Foi colocado em uma incubadora a 37°C e ligado a um dispositivo de fornecimento de ar comprimido, contendo 95% de ar sintético, bem como 5% de CO2 (AirLiquide, Ludwigshafen). As células no exemplo 4 foram cultivadas em placas de 10 mL de cultura de células de acordo com as condições de cultura de células descritas acima.

Exemplo A

[000170] Um exemplo foi realizado em placas experimentais de 5 mL (nunclon Surface). Os perfis de proteínas das células incubadas com soro sadio, na presença de um ou outro de pressão normal ou elevada foram comparados com os perfis proteicos de células incubadas com o soro de pacientes que sofrem de POAG. O número de amostras em cada grupo foi n = 8 usando 4 diferentes amostras de soro. Os pacientes foram classificados de acordo com as diretrizes da Sociedade Europeia de Glaucoma (European Glaucoma Society. Terminologia e Diretrizes para Glaucoma. Http://www.eugs.org. 2004). [000171] Análise de discriminação mostrou um painel de 10 proteínas que foram significativamente supra ou infrarreguladas em células, dependendo do tratamento das células antes da análise do perfil de proteínas: A: o tratamento com o soro de indivíduos saudáveis e com pressão, B: o tratamento com soro a partir de indivíduos sadio sem pressão, C: o tratamento com o soro de pacientes com POAG e com pressão; D: o tratamento com o soro de pacientes com POAG sem pressão. A Figura 13 mostra três exemplos de biomarcadores de proteínas com os pesos moleculares 9.192, 12.390, 12.314 Da, que todos apresentam diferenças significativas em alguns dos grupos. Figura 13 mostra o biomarcador em 9192 Da (p = 0,000058), o qual é suprarregulado em células tratadas com soro de pacientes que sofrem de POAG tanto na presença como na ausência de pressão. O biomarcador de 12390 Dalton é significativamente (p = 0,000086) infrarregulado apenas nas células que foram incubadas com soro POAG e com uma pressão elevada de 15000 pa como mostrado na Figura 13. A análise de discriminação de biomarcadores também revelou que eram significativamente (p = 0,000000) infrarregulada nas células que foram tratadas com pressão, independentemente do tipo de soro. Como exemplo a Figura 13 mostra o biomarcador de 12.314 Dalton.

[000172] A Figura 14a mostra a contribuição para diferenças no perfil de proteína por vários tratamentos A, B, C ou D, tal como descrito acima. Uma análise de variância foi calculada a olhar para a influência global do tipo soro, a pressão, bem como a combinação de ambos os tipos de soro e de pressão sobre os perfis de proteínas das células. A Figura 14 mostra que o tipo de soro teve o maior efeito sobre os perfis de proteína ou seja 59,1%. A própria pressão tinha um efeito de 11,6% sobre os perfis de proteína. Assim, a influência sobre a expressão da proteína como evidenciado por diferenças nos perfis de proteínas é muito maior por tratamento das células com soro de pacientes com POAG em vez de soro de indivíduos saudáveis, em comparação com o tratamento das células com uma pressão elevada em comparação com a pressão ambiente.

[000173] A grande influência do tipo de soro não podia ser visto apenas para o perfil de proteínas em geral, mas também quando o cálculo da análise de variância para biomarcadores selecionados. Por exemplo, Figura 14 b mostra a análise de variância para o biomarcador em 91.92 Dalton: Novamente, a influência do tipo de soro é mais importante, e pode ser demonstrado ter um efeito significativo de 55,1%.

[000174] Estes resultados mostram a partir de um exemplo de que a análise de perfis de proteínas das células tratadas com soro de indivíduos teste, em comparação com as células tratadas com soro de indivíduos normais e / ou pacientes com POAG serve como um teste sensível para o diagnóstico da doença de POAG .

[000175] Como descrito acima, em biomarcadores variantes preferenciais ou antígenos são selecionados, dos quais se sabe que o seu nível de expressão é aumentada ou diminuída em pacientes com glaucoma, em comparação com indivíduos saudáveis ou em outras doenças autoimunes ou neurodegenerativas ou durante a apoptose, em comparação com o crescimento normal das células . Um exemplo de tal biomarcador é a histona H4: A proteína de 9.192 Dalton no Exemplo A (Figura 13) foi identificado por MALDI-TOF-TOF-MS como um fragmento da proteína histona H4.

[000176] No exemplo 1, o nível de expressão da histona H4, o biomarcador 9.192 Dalton - foi significativamente aumentado nas células incubadas com o soro de pacientes que sofrem de glaucoma. Este efeito foi aumentado adicionalmente pela incubação com uma pressão elevada.

[000177] As histonas H3 e H4 pertencem às histonas centrais, que se reúnem em partículas de núcleo de nucleossomas de cromossomas nas células eucarióticas e estão também envolvidos na regulação de genes. Histonas, especialmente H3 e H4 podem ser modificadas, por exemplo, pós-traducionalmente por acetilação ou de metilação. Resultados da pesquisa médica têm revelado que as alterações no nível de expressão, modificação e localização de histonas estão associadas a várias outras doenças neurodegenerativas também, por exemplo, com a doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Curiosamente, histonas não apenas desempenham um papel no mecanismo patológico de várias doenças neurodegenerativas, mas também em células de câncer, tais como células de câncer de cólon, que são afetadas por alterações na expressão e modificação de histona. Considerando o papel fisiológico das histonas, alterações no nível de expressão de histona pode muito bem levar a apoptose. Isto está de acordo com o fato o glaucoma é acompanhado por apoptose de células ganglionares da retina. Portanto, os biomarcadores ou antígenos conhecidos por estarem associados com a doença glaucoma - ou ainda de modo mais geral, que são conhecidos por estarem associados com uma doença autoimune ou uma doença neurodegenerativa ou apoptose - são candidatos promissores para a análise de expressão de proteína direcionada a biomarcadores selecionados na etapa c).

[000178] Outro resultado interessante é que, durante a incubação de 48 horas, com pressão elevada de até 35% das células, as quais foram incubadas com soro POAG perderam a sua viabilidade, enquanto que apenas cerca de 10% das células, as quais foram incubadas com soro saudável, morreu.

Exemplo B

[000179] Exemplo B foi realizado com placas de 24 poços. Os perfis de proteínas das células incubadas com soro saudável como um controle foram comparados com os perfis proteicos de células incubadas com o soro de pacientes que sofrem de glaucoma primário de ângulo aberto (POAG), pacientes com glaucoma de tensão normal (NTG) e hipertensão ocular (OHT).

[000180] Os perfis de proteínas de novo mostraram um padrão muito complexo, a Figura 16 mostra uma vista ampliada de um conjunto de proteínas medidas. A análise de discriminação revelou novamente um painel de biomarcadores significativos. Vários dos biomarcadores encontrados no primeiro estudo com soro POAG poderia ser encontrado de novo neste experimento que mostra o mesmo efeito em termos de uma suprarregulação ou infrarregulação, como visto acima. Um desses biomarcadores está em 9.207 Dalton, que pode visto como o equivalente do biomarcador em 9.192 Dalton encontrado no primeiro experimento utilizando apenas soro POAG e foi aumentado em células incubadas com o soro de pacientes com glaucoma. O biomarcador pode ser observado na Figura 16b. Como mostrado nos exemplos anteriores o biomarcador é suprarregulado regulado nestas células incubadas com soro de glaucoma.

[000181] Exemplo B produz outro resultado interessante: As células tratadas com soros de pacientes que sofrem de OHT têm perfis de expressão de proteínas muito semelhantes para ambos os perfis de proteínas inteiras, bem como para os biomarcadores selecionados como as células tratadas com soro de indivíduos saudáveis. Este resultado está de acordo com a observação clínica de que apenas cerca de 1% das pessoas com uma pressão intraocular elevada desenvolver glaucoma e a vantagem do método de acordo com a invenção é a de que este método é capaz de identificar as pessoas com hipertensão ocular que irá desenvolver glaucoma.

Exemplo C

[000182] C Exemplo foi realizado em placas de 24 poços. Os perfis de proteínas das células incubadas com soro saudável como um controle foram comparados com os perfis proteicos de células incubadas com o soro de pacientes que sofrem de POAG ou ainda contendo os anticorpos ou após a remoção dos anticorpos do soro. Os anticorpos foram removidos utilizando esferas magnéticas de proteína G (Dynabeads ® Proteína G; Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega) que são revestidas com uma matriz de afinidade para as imunoglobulinas. 20 pL de esferas foram utilizadas para purificar 35 pL de soro. A fim de utilizar as esferas, essas foram lavadas duas vezes com 600 pL NaAc, pH 5, durante 2 minutos e uma vez durante 5 minutos. As esferas puderam ser então adicionadas ao soro e incubadas a 12°C em um agitador orbital durante 6 horas.

[000183] A análise da variância para as alterações no perfil de proteínas das células tratadas com soro de pacientes com POAG e com o soro de pacientes com POAG a partir do qual os anticorpos tenham sido removidos como descrito acima, em comparação com os perfis proteicos de células tratadas com soro de indivíduos saudáveis, é apresentado na Figura 15. A influência dos anticorpos sobre os perfis de proteína foi tão elevada quanto 50,5%. O cálculo de distâncias de Mahalanobis revelaram que os perfis proteicos de células incubadas com o soro POAG após a remoção do anticorpo alterou de forma significativa em relação as células incubadas com soro saudável: Os perfis de proteínas das células incubadas com soro POAG diferem mais dos perfis de proteína que foram incubadas com soro saudável, como indicado por uma distância Mahalonis de aproximadamente 55. Os perfis de proteínas das células incubadas com o soro POAG que os anticorpos tenham sido removidos (POAG -anticorpos) diferem menos dos perfis de proteína que foram incubadas com soro saudável conforme indicado por uma distância Mahalonis de aproximadamente 20.

[000184] Estes resultados estão de acordo com os dados apresentados no primeiro método para o diagnóstico de glaucoma com base em uma diferença de reatividade autoimune em fluidos corporais provenientes de pacientes com glaucoma versus indivíduos saudáveis controle.

Exemplo D: [000185] O Exemplo D foi realizado em placas de cultura de células de 10 mL, utilizando células RGC5 que foram incubadas com o soro saudável ou POAG durante um período de 24 horas. O padrão de proteínas ou peptídeos foi medido com o Orbitrap. Os lisados celulares eram também muito complexos e, em um estudo piloto, mais de 150 proteínas foram detectadas com o Orbitrap. Após analisar as diferenças na intensidade das proteínas medida pelo Orbitrap, pudemos detectar diferenças significativas entre os grupos experimentais. Fomos capazes de detectar proteínas que estavam significativamente suprarreguladas nas células incubadas com soro saudável, por exemplo, Proteína de Choque Térmico 60, Filamina B ou beta actina, bem como proteínas que estavam suprarreguladas nas células incubadas com soro POAG, por exemplo, fator de alongamento 1 alfa, subunidade alfa-B de proteína 1 do complexo T, fosfoglicerato quinase 1.

[000186] Exemplos referentes à aplicações terapêuticas dos anticorpos para o glaucoma: Exemplo i: [000187] Células RGC5 foram colocadas em placas de 24 poços com um número de 45.000 células por poço. As células foram, então, pré-incubadas com diferentes concentrações do anticorpo 14-3-3 (inibidor da proteína quinase C) durante 3 horas, conhecido por ter um potencial diagnóstico (anticorpo do grupo 1) para o glaucoma. A fim de provocar estresse celular e morte celular, as células RGC5 foram incubadas com 1,5 μΜ de estaurosporina. Após 5 horas, a viabilidade das células foi medida utilizando cristal violeta. Fomos capazes de detectar um aumento significativo, bem como viabilidade muito significativa de células que sofreram estresse quando incubadas com diferentes concentrações do anticorpo 14-3-3. Viabilidade significativamente aumentada (p <0,05) de 7,4% pode ser detectada para células incubadas com 1 μg/mL do anticorpo 14-3-3. Um aumento muito significativo da viabilidade (p <0,01) de 11,6% foi detectado em células incubadas com 0,5 μg/mL do anticorpo 14-3-3 (Figura 18). Exemplo ii: [000188] Células RGC5 foram colocadas em placas de 24 poços com um número de 45.000 células por poço. As células foram então, pré-incubadas com diferentes concentrações de anticorpo anti-γ-sinucleína durante 3 horas, conhecido por ter um potencial diagnóstico (anticorpo do grupo 1) para o glaucoma. A fim de provocar estresse celular e morte celular, as células RGC5 foram incubadas com H2O2 a 50 μM. Após 1 hora, a viabilidade das células foi medida utilizando cristal violeta. Fomos capazes de detectar um aumento significativo, bem como altamente significativo de viabilidade de células que sofreram estresse quando incubadas com diferentes concentrações do anticorpo anti-Y-sinucleína. Viabilidade significativamente aumentada (p <0,05) de até 15,3% pode ser detectada para células incubadas com diferentes concentrações de anticorpo (0,05, 0,5, 1 e 5 μg / mL) de anticorpo anti-Y-sinucleína. Um aumento muito significativo da viabilidade (p <0,01) de 13,2 foi detectado em células incubadas com 1 pg/mL de anticorpo anti-Y-sinucleína (Figura 19).

Exemplo iii: [000189] Células RGC5 foram colocadas em placas de 24 poços com um número de 45.000 células por poço. As células foram então, pré-incubadas com diferentes concentrações do anticorpo para GFAP por 3h, conhecido por ter um potencial diagnóstico (anticorpo do grupo 1) para o glaucoma. A fim de provocar estresse celular e morte celular, as células RGC5 foram incubadas com H2O2 a 50 pM. Após 1 hora, a viabilidade das células foi medida utilizando cristal violeta. Fomos capazes de detectar um aumento significativo da viabilidade das células que sofreram estresse quando incubadas com diferentes concentrações do anticorpo GFAP. Viabilidade significativamente aumentada (p <0,05) de até 9,8% pode ser detectada para células incubadas com diferentes concentrações de anticorpos (0,1, 0,5 e 1 pg/mL) de anticorpo para GFPA (Figura 20).

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. Método para o diagnóstico de glaucoma, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecimento de uma amostra compreendendo pelo menos cinco antígenos oculares parcialmente purificados, em que a referida amostra de antígeno ocular compreende HSP70, actina, beta-S-cristalina, HSP27 e GFAP, (b) contatar um fluido corporal com a referida amostra de antígeno ocular fornecida na etapa a), (c) detecção e/ou quantificação das reações da etapa b) entre os autoanticorpos no fluido corporal e os antígeno da referida amostra de antígeno ocular para determinar um valor de reatividade autoimune para a referida amostra de antígeno ocular, (d) comparação dos valores de reatividade autoimune medidos com os dados padrões obtidos de pacientes com glaucoma e/ou de indivíduos saudáveis para determinar um escore de glaucoma para a referida amostra de antígeno ocular, e (e) opcionalmente, determinação de um resultado diagnóstico por meio de avaliação do pelo menos um escore de glaucoma, em que na etapa (a) pelo menos duas amostras compreendendo pelo menos um antígeno ocular parcialmente purificado ou pelo menos uma amostra compreendendo pelo menos dois antígenos oculares parcialmente purificados é fornecida; e em que, opcionalmente, em pelo menos uma das etapas (a) a (e), um fator de ponderação é atribuído à contribuição da modulação para o resultado diagnóstico da reatividade autoimune contra pelo menos um antígeno ocular.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um fator de ponderação é atribuído a pelo menos uma das amostras de antígeno ocular por um algoritmo aplicado durante pelo menos uma das etapas (c), (d), (e) e/ou em que pelo menos um fator de ponderação é introduzido por valores de ponderação de antígenos oculares individuais fornecidos para a reação com o fluido corporal.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de antígeno ocular ainda compreende um ou mais antígenos selecionados a partir do seguinte Grupo de pelo menos antígenos oculares parcialmente purificados: albumina, alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, receptor beta-2-adrenérgico, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, α-fodrina (= espectrina), glutationa-S-transferase, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), HSP60, insulina, jo-1, lisozima, proteína de ligação de mielina (MBP), glicoproteína de mielinade oligodendrócito (MOG), mioglobina, enolase neuronal específica (NSE), neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor de proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as amostras de antígeno ocular ainda compreendem um ou mais antígenos selecionados do seguinte grupo de antígenos oculares: alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B-cristalina, beta-L-cristalina, gama-cristalina, α-fodrina (= espectrina), glutationa-S-transferase, HSP60, jo-1, a proteína de ligação de mielina (MBP), enolase neuronal específica (NSE), inibidor da proteína quinase C, superóxido dismutase, transferrina, transtirretina, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), vimentina ou em que pelo menos uma amostra de antígenos oculares compreende pelo menos dois antígenos selecionados do grupo A e/ou do grupo B compreendendo os seguintes 9 antígenos oculares adicionais: anexina I IV-, receptor beta-2-adrenérgico, calreticulina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, peróxido dismutase, proteína quinase C, alfa-sinucleína, gama-sinucleína.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de antígeno ocular ainda compreende um ou mais dos seguintes antígenos oculares: albumina, alfa-1 -antitripsina, anexina I-IV, anexina V, receptor beta-2-adrenérgico, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-L-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor da proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, gama-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtirretina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF).

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de antígeno ocular ainda compreende um ou mais dos seguintes antígenos oculares: albumina, alfa-1 -antitripsina, anexina I-IV, anexina V, receptor beta-2-adrenérgico, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-L-cristalina, gama-cristalina, DNA topoisomerase 1, fibronectina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, peróxido dismutase, 3-fosfoserina, pré-albumina, inibidor da proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, inibidor de topoisomerase, ubiquitina.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de antígeno ocular ainda compreende um ou mais dos seguintes antígenos oculares: alfa-1-antitripsina, anexina I-IV, anexina V, calreticulina, beta-L-cristalina, gama-cristalina, proteína de choque térmico hsp10 (= chaperonina), insulina, jo-1, mielina, peróxido dismutase, pré-albumina, inibidor da proteína quinase C, proteína quinase C, superóxido dismutase, alfa-sinucleína, transferrina, ubiquitina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal reage com antígenos em chip de microarranjo, em uma tira de teste de fluxo lateral, em um chip microfluídico ou ensaios com base em esferas, e particularmente, em que menos de 10 antígenos oculares são transportados em um elemento carreador de antígeno, e particularmente, em que o fluido corporal são lágrimas e/ou em que o fluido corporal é coletado, seco e, opcionalmente, armazenado e subsequentemente reconstituído para utilização na etapa b.

9. Elemento carreador de antígeno, caracterizado pelo fato de que carrega pelo menos cinco antígenos oculares parcialmente purificados compreendendo HSP70, actina, beta-S-cristalina, HSP27 e GFAP.

10. Elemento carreador de antígeno, caracterizado pelo fato de que ainda carrega um ou mais dos antígeno, como definidos na reivindicação 5 ou 6 ou 7.

11. Elemento carreador de antígeno de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma zona antigênica e uma zona de recepção para um fluido corporal, e particularmente, em que a zona de recepção compreende material absorvente para a coleta de lágrimas ou outro fluido corporal e é opcionalmente destinado a contatar diretamente o paciente.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que é para o diagnóstico de glaucoma para um método de diagnóstico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e/ou que compreende um elemento carreador de antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.