JPH04503609A - Ｈｉｖ抗原に特異性を持つキメラマウスひと抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ抗原に特異性を持つキメラマウスひと抗体本発明は特にひと免疫不全ウィ ルス（ＨＩＶ）に対する特異性を有する遺伝子操作された抗体およびその誘導体 、これをコード化するヌクレオチドおよび蛋白質配列、ならびにかかる配列を得 る方法および操作する方法に関する。

先行技術 モノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術は人間の疾病管理に関する通念に大きな影響 を与えた。コーラ−およびミルシュタイン（ネイチャー（ロンドン）　２５６　 ：　４９５　（１９７５）　）による、ｍＡｂの製造のための細胞融合の兄事な 応用は、その影響力において組換えＤＮＡクローニングと同等の生物学における 大変革をもたらした。ハイブリドーマから得られたｍＡｂは既に診断学および基 礎科学研究において広く用いられている。ウィルスおよび細菌性感染を含めた人 の病気の治療におけるその効果は、大部分がまだ証明されていない。

これらは強い特異性を示し、人の病気の進行に影響を与えるが、マウスのｍＡｂ はその性質のためにひと用医薬への応用には制限がある。最も明らかには、これ らはマウスの細胞由来のものであるので、人に導入された場合に外来蛋白質とし て認識され、免疫応答を引き起こす。同様に、これらはひと蛋白質と区別される ので、循環系から迅速に排除される。最後に、マウス抗体はひとエフェクター細 胞または分子によりひと抗体はど効果的に認識されない。

これらの具体的な問題を解決できるヒトｍＡｂを開発する技術には多くの障害が あった。多くの場合、ヒトｍＡｂ−産生セルラインは人の血液由来のエプスタイ ン−パールウィルス（ＥＢＶ）不死化細胞から得られ、従ってひと医薬のスケー ルアップおよび製造に有用ではない。不死化ひと抗体産生セルラインはまたひと 免疫不全ウィルスを含むひとウィルス配列を保有することがあり得る。

更に、ひとウィルスはひと免疫応答の存在にもかかわらず進化してきたと考えら れるので、重要な抗原がひと免疫系によって認識されないことがあり得る。この ような抗原は人において有用な免疫応答を引き起こすことは期待できない。これ に対して、マウスにおいて免疫原性のウィルス性抗原は人において治療的有用性 のあるマウスｍＡｂの製造に用いることができる。

本発明の新規キメラ抗体は、試薬を提供するためにハイブリドーマおよび遺伝子 操作技術の両方を用いて作られた。キメラ抗体およびこれから得られる製品は人 の病気の治療および診断に著しい有用性がある。

発明の要約 本発明は、ＨＩＶによりコード化された特定の抗原を認識するこ２　とのできる 所望の可変（Ｖ）領域特異性および選択されたひと不変（Ｃ）領域性を有し、軽 （Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖のクローニングおよび発現の後に得られる遺伝子操作 されたキメラマウス−ひと抗体を提供する。このキメラ抗体およびその誘導体は 、ひと免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染した人の治療および診断に適用できる 。クローン化された免疫グロブリン遺伝子産物およびその誘導体は哺乳類または 微生物細胞中で製造することができる。

本発明はひとＣ領域および非ひとＶ領域を含む免疫グロブリン鎖をコード化する ｃＤＮＡ配列を提供する。免疫グロブリン鎖は重鎮および軽鎖の両方である。

本発明は前記の、組み替えＤＮＡ分子内、プラスミドベクターなどのビークル内 に存在し、所望の原核生物または真核生物宿主内の発現が可能な配列を提供する 。

本発明は培養によりキメラ抗体を製造することのできる宿主およびこれらの宿主 を用いた方法を提供する。

本発明は、個々のキメラ免疫グロブリン鎖、およびＨＩＶ抗原に対する特異性を 有するひとＣ領域およびマウスＶ領域を有する完全に組み立てられた分子であっ て、両方の■領域が同じ結合特異性を有する分子も提供する。

本発明により提供される他の免疫グロブリン鎮および／または分子は： １、ＨＩＶ抗原に対する一価特異性を有する抗体、即ち（ａ）２つの異なるキメ ラＨ鎖であって、そのうちの一方は抗ウイルス特異性を有する■領域を有するも の、および（ｂ）　Ｈ鎖のＶ領域に相当する特異性を有する２つの異なるし鎖を 含む完全な機能性免疫グロブリン分子。得られる異種二価抗体はウィルス抗原に 対して一価結合性を示す。

２、ＦａｂＳＦａｂ’、およびＦ　（ａｂ’　）　２などの抗体フラグメント前 記のキメラ鎖の組み合わせをコード化する遺伝子配列、特にｃＤＮＡ配列も本発 明により提供される。

本発明は免疫グロブリン鎖と異なるポリペプチド（例えば酵素）をコード化する 配列に結合したひとＣ領域を有するかまたは有さない抗体分子のＨおよび／また はＬ鎖の所望の特異性を有する■領域をコード化する遺伝子配列、特にｃＤＮＡ 配列も提供する。これらの配列は本発明の方法により組み立てられ、発現されて 混合機能分子を得る。

ｃＤＮＡ配列を用いることはｃＤＮＡ配列は適切なＲＮＡスブライシング系が欠 如したバクテリアまたは他の宿主において発現させることができるという点で、 ゲノム配列（イントロンを含む）より特に有利である。

図面の簡単な説明 第１図・２Ｅ１２マウスＬｉＪ［Ｖ領域（ＶＬ）に関するコーディングストラン ドのヌクレオチド配列。ヌクレオチド配列をオリゴｄＣテイルの末端からＪに２ −Ｃに接合点まで図示した。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列も図 示した。太文字で示したのは、部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌク レオチドおよび制限部位修飾が行なわれた部位である。

第２図：２Ｅ１２マウスＨ鎖Ｖ領域（Ｖ、）に関するコーディングストランドの ヌクレオチド配列。ヌクレオチド配列をオリゴｄＣテイルの末端からＪ。２−　 Ｃ，１接合点まで図示した。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列も図 示した。太文字で示したのは部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレ オチドおよび制限部位修飾が行なわれた部位である。

第３図：キメラマウス−ひとキメラＩＨＩＪＩ哺乳類発現プラスミドｐｌＮＧ３ １１２の構築図。ｃＤＮＡクローンｐｃ　Ｉ　Ｇ−１２由来の可変領域を操作し て真核生物発現プラスミドｐｌＮＧ２２２７に適合させた。プラスミドｐｌＮＧ ２２２７は哺乳類細胞中での発現に有用な以下の遺伝子調節エレメントを含有す る：　（１）ＩｇＧ　Ｈ鎖エンハンサ−エレメント、（２）アベルソンＬＴＲプ ロモーター、（３）　ＳＶ４０１６Ｓスプライスサイト、および（４）ＩｇＧ　 ＨＭポリアデニル化シグナル配列。これはまたｐＧＭＨ−６由来の全ひとＩｇＧ ＩＣ領域も含む（リュー、エイ・ワイら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ ル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ、ニー・ニス・エイ、８４　：　３４３９ 〜＆４４３　（１９８７）　）。ｐｌＮＧ３１１２はネオマイシンホスホトラン スフェラーゼ遺伝子を含有し、これによりトランスフェクションされた細胞中で ６４１８の選択が可能になる。

第４図：キメラマウス−ひとキメラＩＬ鎖哺乳類発現プラスミドｐｌＮＧ３１１ ０の構築図。ｃＤＮＡクローンｐｃＩＫ−７由来の■領域を操作して真核生物発 現プラスミドｐｌ！Ｇ１７１２に適合させた。プラスミドｐｌＮＧ１７１２は哺 乳類細胞中での発現に有用な以下の遺伝子調節エレメントを含有する・　（１） ＩｇＨエンハンサ−エレメント、（２）アベルソンＬＴＲプロモーター、（３） Ｓ〜’４０１６Ｓスプライスサイト、および（４）ひとカンバー（に）ポリアデ ニル化／グナル配列。これはまた全ひとＣに領域（リュー、エイ・ワイら、前掲 のとおり）およびトランスフェクションされた細胞中でミコフェノール酸耐性に するＧＰＴ遺伝子を含む。

第５図・キメラＩＦａｂ発現プラスミドｐｌＮＧ３１２７の構築図。プラスミド ｐｌＮＧ３１２７はエシェリキア・コリ中での発現に有用な以下のエレメントを 含有する・　（１）ａｒａＣ遺伝子、（２）誘導性轡）エシェリキア・コリ中で の選択に有用なｔｅｔＲ遺伝子。特定のクローニング段階を詳し〈実施例３に記 載する。

第６図：Ｆａｂ発現用酵母発現プラスミド。（ａ）酵母ＰＧＫプロモーターと融 合したキメラＩＬ鎖遺伝子、インベルターゼシグナル配列およびＰＧＫポリアデ ニル化シグナルを含む酵母発現プラスミドｐｌ　ＮＧ３１１４　：　（ｂ）Ｆｄ 遺伝子を含む類似の酵母プラスミドｐＩＮＧ３１１７およびｐｌＮＧ３１３７； （ｃ）ＰＧＫ転写終止シグナルとＬ鎖プロモーター／リーダー融合を含む酵母プ ラスミドｐ　Ｉ　ＮＧ３１１８　：　（ｄ）Ｆｄ遺伝子を含む類似の酵母プラス ミドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ３１３８（ｅ）　；および最終２遺伝子酵母プラスミドｐ　 Ｉ　ＮＧ３１４２を図示した。

第７図：２Ｇ１２マウス■Ｈ領域のコーディングストランドのヌクレオチド配列 。オリゴ−ｄＣテイルの末端からＪＨ３〜Ｃ，１接合点までのヌクレオチド配列 を図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。太文字で示 したのは、部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制限 部位修飾が行なわれた部位である。

第８図：２Ｇ１２Ｌ鎖マウスＶ領域のコーディングストランドのヌクレオチド配 列。オリゴ−ｄＣテイルの末端からＪに３〜Ｃに接合までのヌクレオチド配列を 図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。太文字で示し たのは、部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制限部 位修飾が行なわれた部位である。

第９図：キメラマウス−ひとキメラ２Ｈ鎖哺乳類発現プラスミドｐｌＮＧ３００ ４の構築図。ｃＤＮＡりＯ−：／Ｉ）Ｃ２Ｇ−６由来の可変領域を操作して真植 生物発現プラスミドｐｌＮＧ２２２７に適合させた。プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ ２２２７は第３図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを含有する。

第１０図：キメラマウス−ひとキメラ２Ｈ鎖哺乳類発現プラスミドｐＩＮＧ３０ ０５の構築図。ｃＤＮＡクローンｐＣ２に一１４由来の可変領域を操作して真核 生物発現プラスミドｐｌＮＧ１７１２に適合させた。

プラスミドｐｌＮＧ１７１２は第４図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを 含有する。

第１１図：細菌性キメラ２Ｆａｂ発現プラスミドｐＩＮＧ３２１１の構築図。プ ラスミドｐＩＮＧ３２１］は第５図の凡例に記載したエシェリキア・コリにおけ る発現に有用なエレメントを含有する。特定のクローニング段階を実施例５に詳 細に記載する。

第１２図：ＩＣ１１マウスＶｏ領域のコーディングストランドのヌクレオチド配 列。オリゴ−ｄＣティルの末端からＪ。３〜Ｃ□１接合点までのヌクレオチド配 列を図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。太文字で 示したのは、部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制 限部位修飾が行なわれた部位である。

第１３図：ＩＣ１１マウスｖＬ領域のコーディングストランドのヌクレオチド配 列。オリゴ−ｄＣテイルの末端からＪに１〜Ｃに接合点までのヌクレオチド配列 を図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。太文字で示 したのは、部位特異的突然、変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制 限部位修飾が行なわれた部位である。

第１４図：キメラマウス−ひとキメラ４Ｈ鎖哺乳類発現プラスミドｐｌＮＧ２２ ５５の構築図。ｃＤＮＡクローンｐＣ４Ｍ−８由来の可変領域を操作して真核生 物発現プラスミドｐｌＮＧ２２２７に適合させた。プラスミドｐｌＮＧ２２２７ は第３図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを含有する。

第１５図二キメラマウス−ひとキメラ４Ｌ鎖哺乳類発現プラスミドｐＩＮＧ２２ ５８の構築図。ｃＩ）ＮＡクローンｐＣ２に一１６由来のＶ領域を操作して真核 生物発現プラスミドｐＩＮＧ１７１２に適合させた。プラスミドｐｌＮＧ１７１ ２は第４図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを含有する。

第１６図・細菌性キメラ４Ｆａｂ発現プラスミドの構築図。このプラスミドは第 ５図の凡例に記載したエシェリキア・コリにおける発現に有用なエレメントを含 有する。特定のクローニング段階を実施例８に詳細に記載する。

！１７図：４Ｄ１２マウスＶ１域のコーディングストランドのヌクレオチド配列 。オリゴ〜ｄＣティルの末端からＪ、４〜ＣＨＩ接合点までのヌクレオチド配列 を図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。大文字で示 したのは、部位指向性突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制限 部位修飾が行なわれた部位である。

第１８図：４Ｄ１２マウスｖＬ領域のコーディングストランドのヌクレオチド配 列。オリゴ−ｄＣテイルの末端からＪに５〜Ｃに接合点までのヌクレオチド配列 を図示した。該ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列も示した。太文字で示 したのは、部位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドおよび制限 部位修飾が行なわれた部位である。

第１９図：キメラマウス−ひとキメラ５Ｈ鎖哺乳類発現プラスミドｐｌＮＧ３１ ２６の構築図。ｃＤＮＡりｏ−ンｐＣ５Ｇ−３０由来ノ可変領域を操作して真核 生物発現プラスミドｐＩＮＧ２２２７と適合させた。

プラスミドｐＩＮＧ２２２７は第３図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを 含有する。

第２０図、キメラマウス−ひとキメラ５Ｌ鎖哺乳類発現プラスミドｐ　Ｉ　ＮＧ ３１３２ノ構築図。ｃＤＮＡりｏ−ンｐＣ５に−４由来ノｖｇｒＩ域ヲ操作して 真核生物発現プラスミドｐＩＮＧ１７１２に適合させた。プラスミドｐｌＮＧ１ ７１２は第４図の凡例に記載した遺伝子調節エレメントを含有する。

第２１図：細菌性キメラ５Ｆａｂ発現プラスミドｐｌＮＧ３１３９の構築図。プ ラスミドｐＩＮＧ３１３９は第５図の凡例に記載したエシエリキア・コリにおけ る発現に有用なエレメントを含有する。

本発明は、単独または他の試薬と組み合わせてＨＩＶに感染した個体の治療およ び診断に用いることができるキメラ抗体を提供する。

キメラ抗体は、ＨＩＶゲノムによりコード化された抗原を認識するマウスＶ領域 を含む。本明細書に記載した実施例のうちでは、キメラ抗体はマウス加Ａｂ　２ Ｅ１２．２Ｇ１２、ＩＣ１１および４Ｄ１２により認識されるこれらの抗体を認 識する場合がある。

製造方法は５つの要素の組み合わせである：１、　モノクローナル抗体を生成す るマウスＢ細胞ハイブリドーマラインからメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を 単離し、クローン化し、これよりｃＤＮＡを製造する。

２、　精製ｍＲＮＡから完全長のｃＤＮＡライブラリーを調製し、これより適切 なＬおよびＨ鎮遺伝子のＶ領域遺伝子セグメントを（ｉ）適切なプローブで同定 ：　（ｉｉ）配列決定；　（ｉｉｉ）Ｃ遺伝子セグメントに適合させる事ができ る。

３、ＣＤＮＡ調製およびクローン化によるＣ領域遺伝子セグメントモジュールの 調製。

４、上記２に記載のクローン化された特定の免疫グロブリンＶ領域遺伝子セグメ ントを上記３に記載のクローン化されたひとＣ領域遺伝子セグメントモジュール と結合させることによる完全ＨまたはＬ鎮コード化配列の構築。

５、原核生物および真核生物細胞を含む選択された宿主中におけるキメラＬおよ びＨ鎖の発現および生成。

すべての免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子およびコード化されたメツセンジャ ーＲＮＡの共通の特徴の一つは所謂Ｊ領域である。

ＨおよびＬ鎖ｊ領域は異なる配列を有するが、各グループ間では、特にＣ領域付 近で高度の配列相同性（８０％より大）がある。この相同性は本発明において利 用され、ＨおよびＬ鎖Ｊ領域の共通塩基配列は、続いてひとＣ領域セグメントに 〜７領域セグメントを結合させるためのＪ領域に有用な制限部位を導入するため のプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドをデザインするのに用いら れた。

ひと細胞から調製され、制限部位をひと配列におけるのと同様の位置に配置する ため部位特異的突然変異により修飾されたＣ領域ｃＤＮＡモジュールベクターを 用いた。例えば、完全ひとＣに領域および完全ひとＣγ１領域をクローン化する ことができる。Ｃ領域モジュールベクター源としてゲノムＣ領域クローンを用い た別法ではこれらの遺伝子は介在配列を除去する必要のある酵素が存在しないバ クテリアなどの系において発現されない。クローン化された■領域セグメントを 切除し、ＬまたはＨ鎖Ｃ領域モジュールベクターに結合させる。更に、ひとＣγ １領域を終止コドンを導入することにより修飾し、それによりＦａｂ分子のＨ鎖 部分をコード化する遺伝子配列を生成させることができる。

結合したＶおよびＣ領域を有するコーディング配列を次に適切な宿主（原核生物 または真核生物）中で発現させるため、適切な発現ビークル中に転移させる。

２つのコーディングＤＮＡ配列は結合により三文字解読フレームの変更または中 断無しに連続的に翻訳可能な配列が得られる場合に「操作可能に結合している」 といわれる。ＤＮＡコーディング配列は結合により遺伝子発現エレメントの適切 な機能が得られその結果コーディング配列の発現が得られる場合、操作可能に遺 伝子発現エレメントに結合されている。

発現ビークルはプラスミドまたは他のベクターを包含する。これらのうち好まし いものは、適切な付着末端を有するＣ１またはＣＬ鎖配列を容易にその中に挿入 できるように操作された適切な制限部位をもつ機能的に完全なひとＣ８またはＣ ５鎖配列担うビークルである。

ひとＣ１またはＣＬ鎖配列含有ビークルはこのように本発明において重要な一例 である。これらのビークルはあらゆる適切な宿主中におけるあらゆる所望の完全 ＨまたはＬ鎖の発現の中間体として用いることができる。

好ましい宿主の一つとして酵母がある。酵母は免疫グロブリンＨおよびＬ鏑の生 成に実質的に有利である。酵母はグリコジル化を包含する翻訳後のペプチド修飾 を行なう。現在多くの組換えＤＮＡ法があるが、これらは酵母中で所望の蛋白質 の製造に用いることのできる強力なプロモーター配列および高複写数のプラスミ ドを用いるものでｂる。酵母はクローン化された哺乳類遺伝子生成物のリーダー 配列を認識し、リーダー配列を担うペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する［ ヒララマンら、酵母に関する第１１回国際会議、ジェネティクス・アンド・モレ キュラ・バイオロジイ、フランス、モンペリエ、９月１３〜１７日（１９８２） コ。

酵母遺伝子発現系はキメラＨおよびＬ鎖蛋白の生成、分泌および安定性のレベル 並びに組立てられたキメラ抗体に関して定形作業で評価することができる。酵母 をグルコースリッチな培地上で成育した場合に大量に生成する解糖酵素をコード 化する有効に発現された遺伝子由来のプロモーターおよび終止エレメントを組み 込んだ一連の酵母遺伝子発現系のいずれも用いることができる。公知の解糖遺伝 子も非常に有効な転写調節シグナルを提供することができる。例えば、ホスフォ グリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネータ−シ グナルを用いることができる。酵母中にクローン化された免疫グロブリンｃＤＮ Ａの発現のために最適の発現プラスミドを評価するために多くの方法を試みるこ とができる（グローバー、ディー・エム編、ＤＮＡクローニング、第１１巻、４ ５〜６６頁、アイアールエル・プレス　（１９８５））。

細菌株も本発明に記載の抗体分子または抗体フラグメント生成の宿主として用い ることができ、エシェリキア・コリＷ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）などの エシェリキア・コリに１２株、およびサルモネラ・−　チフィムリウムまたはセ ラチア・マルセッセンスなどの他の腸内細菌、および種々のシュードモナス種を 用いることができる。

宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび調節配列を含有するプラスミドベ クターをこれらの細菌宿主と関連して用いる。ベクターは複製部位、ならびに形 質転換された細胞中で表現形選択を提供することのできる特異遺伝子を有する。

細菌中にクローン化された免疫グロブリンｃＤＮＡによりコード化されたキメラ 抗体または抗体鎖の生成に関する発現プラスミドの評価のために多くの方法を試 みることができる（グローバー、ディー・エム編、ＤＮＡクローニング、第１巻 、アイアールエル・プレス（１９８５）参照）。

他の好ましい宿主はインビトロまたはインビボで成育された哺乳類細胞である。

哺乳類細胞により、リーダーペプチド除去、折り畳みおよびＨおよびＬ鎖の組立 、抗体分子のグリコジル化、および機能性抗体蛋白質の分泌を含む免疫グロブリ ン蛋白質分子の翻訳後の修飾が得られる。

抗体蛋白質の生成のための宿主として有用である哺乳類細胞としてはハイブリド ーマＳｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）、または骨髄種Ｐ３Ｘ ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ９）　、およびその誘導体などのリンパ球起源の細 胞が挙げられる。他のものとしてはＶｅｒｏ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１）または ＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　６１）などの線維芽細胞起源の細胞が挙げら れる。

多くのベクター系は哺乳類細胞中クローンされたＨおよびＬ鎖遺伝子の発現に利 用できる（グローバー、ディー・エム編、ＤＮＡクローニング、第１Ｉ巻、１４ ３〜２３８頁、アイアールエル・プレス（１９８５）参照）。異なる方法に従っ て、完全Ｈ２Ｌ、抗体を得ることができる。同じ細胞中でＨおよびＬ鎖を共発現 して細胞内会合およびＨおよびＬ鎖の完全４量体Ｈ，Ｌ２抗体中への結合を達成 することが可能である。共発現は、同一または異なるプラスミドを同一宿主中で 用いることにより起こる。ＨおよびＬ鎖の両方の遺伝子は同一のプラスミド中に 配置することができ、これを次に細胞中にトランスフェクションさせ、それによ り両鏡を発現する細胞を直接選択する。

あるいは、細胞をまず１つの鎖、例えばＬＭをコード化するプラスミドでトラン スフェクションし、続いてえられるセルラインの第２選択マーカを含有するＨ鎖 プラスミドのトランスフェクションを行なう。いずれかの経路でＨ，Ｌ２分子を 産生ずるセルラインは別の選択マーカーとともに更に他のＨ，ＬまたはＨ＋ＩＪ Ｊｌの複写をコード化するプラスミドでトランスフェクションして、組み立てら れたＨＩＬ２抗体分子の生産性の向上または形質転換セルラインの安定性の向上 など性質が向上したセルラインを得ることができる。

ポリペプチド生成物 本発明はひと免疫不全ウィルスＨＩＶのウィルス抗原に対する特異性を有するＨ またはしいずれかのキメラ免疫グロブリン鎖を提供する。キメラ鎖は天然のひと 免疫グロブリン中に存在するものに実質的に類似したＣ領域、および本発明の所 望の抗ウイルス特異性を有する非ひと■領域を含有する。本発明は分子全体が所 望の結合および認識性を発揮するように会合したＨおよびＬ鎖を有する免疫グロ ブリン分子も提供する。

種々の免疫グロブリン分子が提供される・即ち所望の機能を有する成分に結合し た本発明のＶ領域結合領域を有する一価、二価、または分子。本発明は、Ｆａｂ 、　Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）２分子を包含するキメラ免疫グロブリン 分子の「フラグメント」も提供する。本発明はキメラ免疫グロブリンの「誘導体 」も提供し、この用語は免疫グロブリンフラグメントと機能的に類似した分子種 を産生ずる端を切り取ったまたは修飾された遺伝子によりコード化された蛋白質 を包含する。修飾としては、これに限定されるわけではないが、植物および細菌 性毒素および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの細胞傷害蛋白質をコード化する遺伝 子配列の添加が挙げられる。フラグメントおよび誘導体は本発明のいかなる宿主 からも製造される。

同一または異なるＶ領域結合特異性を有するキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体 、フラグメントまたは誘導体は個々のポリペプチド鎖を例えばシアーズら、（プ ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ、ニー ・ニス・エイ、７２．３５３〜３５７頁　（１９７５））により示唆されるよう に適切に会合させて調製することができる。この方法では、キメラＨ鎖（または その誘導体）を発現する宿主をキメラＬ鎮（またはその誘導体）を発現する宿主 と別に培養し、免疫グロブリン鎖を別々に回収して、次いで会合させる。あるい は、宿主を共培養し、鎖を培地中で自発的に会合させ、次に組み立てられた免疫 グロブリン、フラグメントまたは誘導体を回収する。

本発明のキメラ抗体（例えばＣｈｉｍｅｒｌ、Ｃｈｉｍｅｒ２、Ｃｈｉｍｅｒ４ 、およびＣｈｉｒ５ｅｒ５）は、コア抗原、逆転写酵素、およびエンベロープ糖 蛋白質を含むＨＩ　Ｖゲノムによりコード化された抗原のエピトープを認識する 。これらのＨＩ　Ｖ抗原としては、感染した細胞表面上に発現するものもあるが 、ウィルスｅｎＶ遺伝子によりコード化された糖蛋白質（ｇｐ１６０、ｇｐ１２ ０、ｇｐ４１）　、ウィルス聾遺伝子（ｐ５５、ｐ４５、ｐ３９、ｐ２４、およ びｐ１８）および凪遺伝子（ｐ６５、ｐ５１）によりコード化された蛋白質（ミ ュージング、エム・エイら、ネイチャー、３１３．４５（］−４４５８頁１９８ ５））が挙げられる。Ｃｈｉｍｅｒｌ、Ｃｈｉｍｅｒ２、Ｃｈｉｍｅｒ４、およ びＣｈｉｍｅｒ５抗体は種々のこれらの抗原を認識しく以下の実施例を参照）、 単独または他のウィルス成分を認識する抗体と組み合わせて用いることができる 。

キメラ抗体はウィルス、サブウィルス粒子、ウィルス蛋白質、ウィルスペプチド 、およびウィルス抗原を発現しているＨ１〜′感染細胞と反応し、正常免疫また は宿主防衛機構により、感染した個体中で治療活性を示す。本発明の抗体は、無 症候のＨＩＶに感染した個体を治療して、感染プロセスの進行を妨げるのに有用 モ、またウィルス住の負荷を軽減し、循環ウィルス抗原またはウィルス感染細胞 に関連した症状を緩和することによりＨＩＶ感染症状（後天的免疫不全症候群（ ＡＩＤＳ））およびＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ関連症候群（ＡＲＣ））の症状の個体の治療 に有用である。ｇｐ１２０およびｐ２４を含む循環Ｈ１■蛋白質は免疫学的機能 異常に関係すると考えられる。Ｃｈｉｍｅｒｌ、Ｃｈｉｍｅｒ２、Ｃｈｉｍｅｒ ４、およびＣｈｉｍｅｒ５を単独または組み合わせて治療投与することは抗１３ ＩＶ抗体の力価が低い個体に効果がある。

ＨＩＶに感染した個体の本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体を用いた治療 は、−回または複数回抗体、フラグメントまたは誘導体を非経口投与することか らなる。効果的な用量は個々のキメラ抗体、結合した治療薬（下記参照）の存在 および性質、患者およびその症状の関数であり、体重１ｋｇあたり約１０ｎｇか ら約１１００ｎまでの間で変化し得る。投与経路としては、静脈内、皮下、筋肉 内、肺内、腹腔内、鼻腔内、鞘内、経皮または他の公知の経路が挙げられる。

本発明の抗体はＨＩＶに感染した細胞に対して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ） および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介する能力のために治療効果 を調節することができる。これらの活性に対して、エフェクターセル（Ａ　Ｄ　 ＣＣに対して）の内因性源または外因性源または補体（ＣＤＣに対して）のいず れかを用いることができる。ＡＤＣＣを効果的に媒介するか、別の方法で感染し た細胞を宿主エフェクター細胞による破壊のためにマークする抗体は、比較的少 ない宿生細胞がウィルスを有する急性Ｈ１ｖ感染後に特に有用である。

本発明のキメラ抗体、そのフラグメント、および誘導体は免疫共役体として治療 に用いることができる（ディルマン、アール・オー、アニュアル・メジシン、１ １１．５９２〜６０３（１９８９）参照）。これらは、細胞毒性蛋白質と結合す ることができ、該細胞毒性蛋白質としてはりチンＡ１シュードモナス毒素、ジフ テリア毒素、およびＴＮＦが挙げられるがこれに限定されるわけではない。抗体 または他のリガンドと共役した毒素は当該技術分野で公知である（例えばオルス ンズ、ニスら、イムノロシイ・トウディ、１０．２９１〜２９５　（１９８９） 参照）。植物または細菌毒素は典型的には蛋白質合成機構を破壊することにより 細胞を殺す。

本発明のキメラ抗体はＨＩＶに感染した個体を治療するために、更に別の種類の 治療的成分と結合することができ、かかる成分としては放射性ヌクレオチド、細 胞毒性試薬および抗ウイルス性薬剤が挙げられるが、これに限定されるわけでは ない。抗体と結合し、抗原の部位にインビボで送られうる放射性ヌクレオチドの 例としては、２１２Ｂｉ、　１３１　Ｌ　１８８Ｒ，９０Ｙが挙げられるがこれ がすべてではない。放射性ヌクレオチドは放射線療法の分野で公知のように細胞 を一局部的に照射することによりその細胞毒性効果を発揮し、種々の細胞内傷害 がおこる。

抗体と接合しその結果インビボ療法に用いられる細胞毒性薬剤としては、これに 限定されるわけではないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサー ト、およびマイトマイシンＣが挙げられる。細胞毒性薬剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡお よび蛋白合成を含む重要な細胞プロセスを妨害する。抗体と接合しその結果イン ビボ療法に用いられる抗ウィルス薬としては、これに限定されるわけではないが 、アシクロビル、アジドチミジン１、アデニンアラビノシド、ジデオキシイノシ ン、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。抗ウィルス薬は、逆転写酵素など のウィルス特異性酵素、ウィルス性プロテアーゼ、およびヌクレオチドの代謝お よび核酸へのとりこみを妨害する事により作用する。当該技術分野で公知のこれ らの種類の薬剤のより詳しい説明、およびその作用機序は、グツドマン、エイ・ シイら、グツドマン・アンド・ギルマンズ・ザ・ファーマコロジカル・ベイシス ・オブ・セラビューティクス、第７版、マクミラン出版社（１９８５）参照）。

本発明のキメラ抗体、フラグメントまたは誘導体はキメラ抗体、または抗体と反 応するエフェクター細胞の数または活性を増大させる働きをするリンホカインま たは造血性成長因子などと組み合わせて有利に用いることができる。

ＨＩＶ感染細胞に特異性を有する抗体は個体においてＨＩＶの拡散を制限するの に有効な働きをする。感染プロセスの初期に介在することにより、感染した個体 において、後のより病因性のＨＩＶ種または変異株の発生を遅らせるかまたは防 ぐことができる。ウィルスの複製を調節することにより、本発明の抗体、フラグ メントまたは誘導体が感染した個体の寿命を延ばすより長い無症候過程の確立お よび管理ができる。

本発明のキメラ抗体を用いた介入治療は単独または他の抗ウイルス療法と組み合 わせて偶発的にウィルスにさらされることが症候性疾患に発展することを防ぐの にも有効である。本発明の抗体を用いた予防免疫により試験でのウィルス感染の 危険性を効果的に軽減することができ、肝炎およびサイトメガロウィルス感染の 管理に他の抗体調製物と同じように用いられる。

固体担体に付着した本発明のキメラ抗体、フラグメント、または誘導体は、ウィ ルス、ウィルス抗原、またはウィルス感染細胞を体液または組織または細胞申出 物から除去するのに用いることができる。好ましい態様においては、これらはＨ ＩＶを血液または血漿生酸物から除去するのに用いられる。他の好ましい態様１ 士おいては、キメラ抗体は当該技術分野で公知の体外免疫吸着剤において有利に 用いられる（例えば、セミナーズ・イン・ヘマトロジイ、第２６巻、（２補追１ ）（１９８９）参照）。患者の血液または他の体液を付着した抗体にさらすと、 循環ＨＩＶピリオン、ウィルス抗原（遊離または免疫複合体）、またはウィルス 感染細胞を部分的または完全に除去でき、続いて体液を身体に戻す。この免疫吸 着を細胞遠心分離段階を間において、またはおかずに連続的流量設定に行われる （例えば、ターマン、ディー・ニスら、ジャーナル・オブ・イムノロシイ、■、 １９７１〜１９７５（１９７６）参照）。

具体的には、本発明のキメラ抗体はネズミのｍＡｂを用いることができるいかな るそしてあらゆる用途に用いることができ、マウス−ひとキメラ抗体がより人の からだに適合する利点が得られる。

本発明を一般的に記載したが、実施例を参照すると本発明は更に理解される。た だしこれらは例示のみの目的として含ませたもので、特記しないかぎり制限する ことを意図しないものである。

実施例１ 哺乳類細胞により産生されるＨＩＶエンベロープ蛋白質特異性キメラマウス−ひ と免疫グロブリン（Ｃｈｉｍｅｒｌ）マウスｍＡｂ２Ｅ１２　（ヨシハラ、ビイ ら、ＡＩＤＳに関する第４回国際会議会報、２３７頁、１９８８年６月に記載さ れている抗−ｇｐ１２０．１６０ｍＡｂ）を、ＨＩＶウィルス溶解物で免疫化し たＢＡＬＢ／ｃマウス由伝子生成物の存在下にクローン化した。Ｓ　ｐ２／　Ｏ 骨髄種系を融合相手として用いた。クローン２Ｅ１２はＩｇＧ１サブクラスの免 疫グロブリンを産生する。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析によるとｍＡｂ　２Ｅ１２はクロ ーン化−されたｅｎｖ遺伝子生成物に対して反応性をもっていた。さらに２Ｅ１ ２はＨＮ７感染細胞の免疫蛍光染色が可能であった。ウィルス溶解物に対する２ Ｅ１２　ｍＡｂのウェスタンプロット分析で、用いた溶解物によって異なるが、 優勢な１２０ｋＤバンドならびに弱い１６０ｋＤバンドが示された。

１、組換えプラスミドおよびバクテリオファージＤＮＡオリゴｄＧテイルを有す るｐＢＲ３２２、ｐＵ　Ｃ１８、ｐｔ：　Ｃ１９、Ｍ１３ｍｐ１８、およびＭ１ ３ｍｐ１９をＢＲＬ　（ガイテルスブルグ、Ｍ　Ｄ　）より購入した。浮遊密度 遠心分離によるプラスミドＤ　Ｎ　Ａの精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、ア ガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの精製、連結およびエシェリキ ア・コリの形質転換を含むＤＮＡ操作は、マニアナイス、ティーら、モレキュラ ・クローニングア・ラボラトリ−・マニュアル（１９８２）に記載されているか 、または他の標準的方法のように行なった。制限エンドヌクレアーゼおよび他の ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素をベーリンガーーマンノ＼イム（インディアナポリス、 ＩＮ）　、ＢＲＬ、およびニューイングランド・バイオラブズ（ビバリー、ＭＡ ）より購入した。

２、ＲＮＡ精製およびｃＤＮＡライブラリー構築約１　ｘ　１０’細胞／ｍｌの ２Ｅ１２ハイブリドーマ細胞１リツトルを遠心分離により集め、ＰＢＳ（１リツ トルにつき３ｇ　ＮａＣ１，０，２ｇＫＨ２Ｐ○４．１．１５ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ ２、および０．２ｇ　ＫＣＩ）　１００ｍ１中で洗浄した。細胞を再び遠心分離 にかけ、細胞ペレットをグアニジンチオノアネート溶液中に懸濁し、全細胞ＲＮ 　Ａをマニアナイス、ティーら（前掲のとおり）により記載された方法により組 織培養細胞から調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製はマニアナイス、ティーら （前掲のとおり）により記載されたように行なった。オリゴｄＴプライムｃＤＮ Ａライブラリーをガブラー、ヴイら（ジーン、２５．２６３（１９８３））の方 法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡは末端デオキシヌクレオチ ドトランスフエラーゼでｄＣテイル化し、ｄＧテイルを有するｐＢＲ，３２２に アニールした。ｃＤＮＡライブラリーを３２ｐでラベルしニック翻訳されたＤＮ Ａフラグメントで、すなわちにクローンに関してはＣに領域プローブを用い、お よびＨ鎖りローンに関してはマウスＩｇＧＩＣ領域プローブを用いたハイブリダ イゼーションによりスクリーンニングした（マニアナイス、ティーら、前掲のと おり）。

ヌクレオチド配列分析のために完全長ｃＤＮＡクローン由来のＶ＋および■４フ ラグメント（それぞれｐｃＩＫ−７、ｐｃＩＧ−１２）をＭ１３バクテリオファ ーンベクターに挿入した。これらのクローンの■領域の完全ヌクレオチド配列を ジデオキシチェーンターミネーション法により決定した（第１図および第２図） 。これらの配列により観察組成物とよく一致するＶ領域アミノ酸組成物が予示さ れ、■領域の部分の直接アミノ酸配列決定により証明されたペプチド配列が予示 される。

ｃＤＮ、Ａクローンのヌクレオチド配列は、これらがＶ領域の特徴的なアミノ酸 残基を含有するのでこれらが免疫グロブリンＶ領域クローンであることを示して いる（カバットら、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル ・インチレスト、ニー・ニス、デパートメント・オブ・エイチェイチェス（１９ ８３））。

３、キメラ発現プラスミドの構築 ｖＭおよびＶＬ遺伝子モジュールを挿入してＣｈｉｍｅｒｌを得るのに適切な発 現ベクターを構築した。まず試験キメラＬ鎖遺伝子（ｐ　Ｉ　ＮＧ　２１２２） を含有するプラスミドＤＮＡを作り、マウスアベルソンＬＴＲプロモーター、ス プライス領域、およびマウスゲノムカッパー領域３゛をポリアデニル化シグナル にを添加することによりＬ鎖ベクターｐＩＮＧ１７１２を調製した。Ｈ鎖マウス エンハンサ−ｏ、　７ｋｂＭｌａＭ８ａＲＸ１２由来のＸｂａＩからＥｃｏＲＩ フラグメント（ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり）をＸｂａＩ＋Ｅ ｃｏＲＩで切ったＭ１３ｍｐ１９に挿入した。エンハンサ−を含有する旦１ｎｄ ＩＩＩか９ＢｇｌＩＩフラグメントを独自のＸ　ｈｏＩ、旦ｇｌＩＬおよび旦１ ｎｄＩＩＩ部位をこの順番に含有するエシェリキア・コリ組換えプラスミドＤＮ Ａであるｐｓ　Ｈ６ドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２１２１ｂのエンハンサ−に坤工からＸ 　ｈｏＩ領域に挿入した（リュー、エイ、ワイら、ジャーナル・オブ・イムノロ シイ、１’３９　：　３５２１、（１９８７）ただし２Ｈ７ＶＬ領域の代ｔ）　 ’）　ｌ：　Ｌ　６Ｖ　Ｌ［域（’）　ニー、エイ。

ワイら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ、ニー・ニス・エイ、８４　：　３４３９　（１９８７）　）を構築に用い た）。得られるプラスミドはｐｌＮＧ２１２２であった。

マウスアベルソンウイルスＬＴＲをｐｅｌｉｎ２　（オーエン・ウィッチ博士（ ＵＣＬＡ）から提供された）から得た。ｐｅｌｉｎ２はｐ１２０ウィルス３’Ｌ ＴＲ（レディー、イー、ピーら、プロシーディングズ・すブ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシズ、ニー・ニス・エイ、靭：　３６２３　（１９８３ ））　（ただしウィルス位置４６２３の見計ＩＩ部位が見回ＲＩオリゴヌクレオ チドリンカーＧＧＡＴＴＣＣの挿入により修飾されている）を含有する。ｐ１２ ０３°　ＬＴＲプロモーターを含有するｐｅｌｉｎ２の０．８ｋｂの旦ｃｏＲＩ からＫｐｎＩフラグメントをＫｐｎＩ十旦ｃｏＲＩで切ったｐＵ　Ｃ１８に挿入 した。ＬＴＲをＥｃｏＲＩから５ａｌＩフラグメその結果ＬＴＲプロモーターが Ｌ６Ｌ鎖遺伝子（ｐＩＮＧ２１２６）のとなりにあるプラスミドが得られた。５ Ｖ４０１６Ｓスプライスドナーおよびアクセプタ一部位を含有するＸ　ｈｏＩか らＳ　ａｉｒフラグメントをｐＵＣ１２／ｐＬ１　（ロビンソン、アール・アー ルら、前掲のとおり）から切除し、ｐＩＮＧ２１２６のＳ　ａｌＩ部位に挿入し 、スプライスドナーがＬＴＲおよびＬ鎖遺伝子（ｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ２１３３）間に ある配向に関してスクリーニングした。カッパ発現ベクターのポリアデニル化転 写終同じプラスミドＩ）ＩＮＧ２１２１ａの再連結である（リュー・エイ・ワイ ら、前掲のとおり）。ただし２Ｈ７ＶＬの代わりにＬ６ＶＬを構築に用いて、ｐ ｉ　ＮＧ２１２１ａ−δＨを形成した。マウスゲノムＤＮＡ末端の１゜１ｋｂ　 ＢｇｌＩＩからＢａｍＨＩフラグメントポリアデニル化部位（化部−、エムら、 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６１：　３８３８　（１ ９８６乃をｐＳ１０７Ａ　（ランドルフ・ウオール博士（ＵＣＬＡ）から入手） から単離し、ｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２１２１ａ−δＨのＢａｍＨＩ部位に挿入し、固 有遺伝子と相同な配向に関してスクリーニングした。この修飾３゛形成した。修 飾された３°領域およびキメラカッパーコーディング配列を有するｐｌＮＧ１７ ０３の堕１１から旦１エフラグメントをｐｌＮＧ２１３３の大ＢｇｌＩＩから５ ａｉｌフラグメントと連結し、その結果第４図に示す９．　ｌｋｂカッパー発現 ベクターｐＩＮＧ１７１２が得られた。

アベルソンＬＴＲプロモーターもキメラＨ鎖発現ベクターｐＩＮＧ　１７１４に 用いた。ΔａｔＩＩオリゴヌクレオチドリンカーをＸｂａＩ部位に挿入し、続い てΔａｔＩＩ切断および再連結を行なって、ｐｌＮＧ２１１１（ロビンソン、ア ール・アールら、前掲のとおり）を修飾し、ｐ■７の大ΔａｔｌＩから５ａｌＩ フラグメントに連結してｐｌＮＧ１７１１を形成績によりＨ鎮エンハンサ−をｐ ｌＮＧ１７１１から欠失させ、７．７ｋｂ発現ベクターｐｌＮＧ１７１４を形成 した。

同様のプラスミドｐｌＮＧ２２２７は２つと更に別の調節エレメント、ＩｇＨエ ンハンサ−およびひとゲノムＩｇＧポリアデニル化配列を含有する。ｐｌＮＧ２ ２２７はＩｇＨエンハンサーアベルソンＬＴＲプロモーターを含有するＢｇｌＩ ＩからＳ　ａｌＩ領域、および１６Ｓスライストナーおよびアクセプタ一部位は ｐｌＮＧ１７１２と同じである。ひとゲノに連結した。ゲノムγ３°末端を含有 する１３００ｂｐＸｍａＩＩＩフラグメントをｐＨＧ３Ａの誘導体から単離した （エリソンら、ヌクレイツク。

アンッズ・リサーチ、１０　：　４０７１（１９ｇ２））。

４、キメラＨおよびＬ鎖発現プラスミドの構築２Ｅ１２Ｈ鎖を含有するｃＤＮＡ クローンｐＣＩＧ−１２を部位特異的突然変異誘発（クレーマー、ダブり二一ら 、ヌクレイツク、アシッズ・リサーチ、１２　：　９４４１）により適切な制限 エンドヌクレアーゼ部位を適切なＭ１３サブクローンに導入することにより哺乳 類発現に応用した（第３図）。オリゴヌクレオチドをサイクロンＤＮＡシンセサ イザー（二ニー・プランスウィック・サイエンティフィック、カンパ具−）で合 成し、アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。Ｊ領域突然変異誘発プライ マー５−ＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧ＾ＣＣＧＴＧＧ−３’を用制限部位 をｐＣＩＧＢｓｔＥＩＩの開始コドンＡＴＧの上流に挿入した。

グメントを次に発現ヘクターｐｌＮＧ２２２７中にクローン化した。

２Ｅ１２Ｌ鎖を含有するｃＤＮＡクローンｐｃＩＫ−７を哺乳類発現に同様の方 法で応用した（第４図）。Ｊ領域突然変異誘発プライマー５−ＧＴＴＴＴＡＴＴ ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ−３°旦王樽ＩＩＩ部位をＭ１３サブクローンｐＣ ＩＫＳＤＭ中に挿入するのに用い、オリゴヌクレオチド５“−ＴＧＡＧＡＡ結合 した２Ｅ１２Ｖ１領域を含有する制限フラグメントを次に発現ベクターｐｌＮＧ １７１２中にクローン化した。

５、キメラ抗体生成のためのマウスリンパ球細胞の安定トランスフェクション セルライン５ｐ２１０（アメリカンタイプ力ルチャーコレクション＃ＣＲＬ１５ ８１）をダルベツコの修飾イーグル培地＋４．５ｇ／ｌグルコース（ＤＭＥＭ、 ギブコ）＋１０％胎児牛血清中で成育させた。培地をグルタミン／ペニンジン／ ストレプトマイシン（アービン・サイエンティフィック、アービン、カリフォル ニア）で補足した。ボタ−、エイチらのエレクトロボレー／コン法（プロシーデ ィングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ、ニー・ニス・ エイ、８１ニア１６１　（１，９８４）　）を用いた。トランスフェクションの 後、細胞を完全Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中２４時間で回収し、次に９６ウエルの培養平板 中１ウェルにつき細胞１〜３ｘｌＯ’個の割合で選択培地の存在下に接種した。

Ｇ４１８　（ギブコ）選択は０．８ｍｇ／ｌ、ミコフェノール酸（カルビオケム ）は６μｇ／ｍｌ＋０．２５ｍｇ／ｓｌキサンチ〉てあった。エレクトロポーレ ーション技術により、５Ｐ２１０に関して１〜１０ｘｌＯ−５のトランスフェク ション頻度が得られた。

キメラＬ鎖発現プラスミドｐＩＮＧ３１１０をｐ　ｖｕｌ制限エンドヌクレアー ゼでの消化により線状化し、Ｓ　＋）２１０細胞に形質転換してミコフェノール 酸耐性クローンを得、これをＬ鎖合成に関してスクリーンした。発芽後成育およ びそれに続くサブクローニング後の最良のプロデューサーをＰｖｕｌ−直線化ｐ ｌＮＧ３１１２でトランスフェクションした。Ｇ４１８での選択の後、Ｌ＋Ｈ鎖 の大部分を生成するクローン５ｐ２１０−３３１０１１Ｅ１０＋３３１２５Ｃ１ １，４Ｃ９は約５μｇ／ｌの抗体を分泌した。

６、組織培養において分泌されたキメラ抗体の精製５ｐ２１０−３３１０１１Ｅ １０．　ＩＢ２’−、３３１２５Ｃ１１，４Ｃ９細胞を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、Ｌ Ｘグルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（アービン・サイエンティフィ ック　＃　９３１６）で補足した培地ＨＢＩＯＩ（／＼す・バイオロジクス）＋ １％胎児牛血清中で成育した。使用済培地を約５０００ｘｇで２０分間遠心分離 した。抗体レベルをＥＬＩＳＡで測定した。

約２３リツトルの細胞培養上清を５１０Ｙ３０カートリツジでＤＣ−１０濃縮器 （アミコン・コーポレイシジン）を用いて１４倍に濃縮した。約１４ｍｇの抗体 を含有する上清を０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８，４）中２ｍｌｍｌプロティンカーカラムァーマシア）にかけた。キメラ抗体 を段階ｐＨ勾配（ｐＨ５，６およびｐＨ３，５）で溶出した。抗体を含有するフ ラクション（収率７５％）を合し、限外濾過（７Ｍ３０膜、細胞を攪拌、アミコ ン・コーポレイション）で２２．２５倍に濃縮し、ＰＢＳで２５倍に希釈し、１ ０倍に再濃縮し、ＰＢＳで１０倍に希釈し、最後に５倍に再濃縮した。抗体を１ ．Ｏｍｌずつ一２０℃で貯蔵した。

７、キメラ抗体に関する考察 Ｃｈｉｍｅｒｌがマウス２Ｅ１２抗体の抗原結合性を保持することを示すために これを用いて試験を行なった。試験により、２Ｅ１２およびｃｈｉｍｅｒｌの両 方が同一のウィルス抗原を認識することが示された。市販のＨＩＶウェスタンス トリップ（デュポンまたは等価なもの）をＣｈｉｍｅｒｌ　（２μｇ／ｌ）また は２Ｅ１２　（１０〜２０μｇ／ｌ）のいずれかを用いて培養した。２Ｅ１２マ ウス抗体で培養したストリップをウサギ抗マウス抗体、続いてプロティンＡ−金 、続いて銀促進（バイオラド）を用いて培養した。Ｃｈｉｍｅｒｌを用いて培養 したストリップは直接プロティンＡ−金を用いて培養した。約１２０ｋＤ分子量 のウィルス抗原、に対する特異的結合は各抗体を用いて検出した。

第二試験においては、ｃｈ釉ｅｒｌおよび２Ｅ１２をＥＬＩ　ＳＡテストで比較 した。ジエネティクス・システム（シアトル、ＷＡ）ＨＩＶ−ＩＥＬＩＳＡキッ トを製造者の指定どおりに用いた（ただし検出に用いた第二抗原がマウスのＣ領 域（２Ｅ１２）またはひとのＣ領域（Ｃｈｉｍｅｒｌ）のいずれかを認識した） 。本発明の抗体および２Ｅ１２が同様に反応することを示す結果を第１表に示す 。

第１表 抗体　濃度　Ａ　４５　、’　第二抗体特異性陽性対照２１／４００　＞２．０ 　ヒトＩｇ陰性対照２１／４００　０．１２　ヒトＩｇＣｈｉｍｅｒ１　１０μ ／ｍ１　０．４１　ヒトＩｇ５０μｇ／ｍ１　０．５７　ヒトＩｇ Ｃｈｉｍｅｒ２　１０Ｍｇ／ｍｌ　＞２．０　ヒトＩｇ５０　ｕ　ｇ／ｍｌ　＞ 　２．０　ヒトＩｇ正常マウスＩｇＧ　１０Ｍｇ／ｍ　０．２１　ヒトＩｇ５０ μｇ／口１　０．２２　ヒトＩｇ ２Ｅ１２　１０Ｍｇ／ｍｌ　Ｏ，９７ヒトＩｇ５０　ｕ　ｇ／ｍｌ　１．３　ヒ トＩｇ２Ｇ１２　１０Ｍｇ／ｍｌ　＞　２．０　ヒトｒｇ５０μｇ／ｍｌ　＞　 ２．０　ヒトＩｇ１吸光度は４５０ｎｍにて測定 ２ジエネテイツク・システムの陽性および陰性ひと対照実施例２ エシェリキア・コリにおいて生成されるＨＴＶエンベロープ蛋白特異性キメラマ ウス−ひとＦａｂフラグメント全コーディング配列が充分同定されたプロモータ ーから発現されうるので細菌は哺乳類ｃＤＮＡから発現されるキメラ抗体の生産 に適している。エシェリキア・コリはその遺伝子発現の最適化のための豊富な遺 伝子情報が用いられうるので外来蛋白質生産のための多数の有用な細菌種の一つ である。エシェリキア・コリは外来蛋白質の内部的生成または蛋白質がベリプラ スミック空間に多く蓄積する場合に細胞質外へ分泌するために用いることができ る（グレイら、ジーン、３９：２４７　（１９８５））；才力ら、プロシーデイ ングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ、ニー・ニス・エ イ、８２　：　７２１２　（１９８５）　）。エシェリキア・コリ細胞質からの 分泌は多くの蛋白質において観察され、シグナル配列を要する。細菌中で生成す る蛋白質はしばしば適切に折り畳まれていない（ショーナーら、バイオチクノロ シイ、３　：　１５１　（１９８５）　）。しかしながら細菌から分泌される蛋 白質は、しばしば適切に畳まれ、天然の第二次および第三次構造を呈している（ ンユングら、バイオチクノロシイ、４・９９１　（１９８６）　）。

Ｆａｂ分子はジスルフィドブリッジにより結合した２つの同一でない蛋白質鎖か らなる。これらの２つの鏑は完全な抗体り鎮および抗体重鎖のＶＳＪおよびＣｏ １部分Ｆｄである。Ｃｈｉｍｅｒｌ　ＬおよびＦｄ遺伝子の適切なｃＤＮＡクロ ーンは既に確認されている。本実施例において、これらのｃＤＮＡクローンはエ ルウィニア・力ロトボーラ遺伝子融合物として単一細菌オペロン（ジシストロン 性メツセージ）に構成され、強力な調整プロモーターから発現される。結果は、 工／エリキア・コリ中２つの蛋白質鎖が同時発現され、免疫学的に活性で、適切 に組み立てられたＣ　ｈｉｍｅｒｌ抗体のＦａｂが分泌される系である。以下の 項にエシェリキア・コリ由来のＣｈｉｍｅｒｌ　Ｆ　ａｂの分泌を詳細に記載す る。

１、ｐｅｌＢリーダー配列カセットの組立エルウィニア・カロトボーラ（ＥＣ） はいくつかのペクチン酸リアーゼ（ポリガラクツロン酸トランスエリミナーゼ） （レイら、ジーン、３５　：　６３　（１９８５））をコード化する。ペクチン 酸リアーゼ遺伝子は既にクローン化され、これらの遺伝子のＤＮＡ配列は決定さ れている。強いプロモーターの制御下にエシェリキア・コリ中にクローシグナル 配列はエシェリキア・コリ中で効果的に機能し、本実施例においては抗体遺伝子 の分泌シグナルとして用いた（他のシグナルは−いづれもこの応用において有用 である）。ｍｌＢ遺伝子のシグナル配列を取り囲むヌクレオチド配列は開示され ている（レイら、前掲するプラスミドｐｓ　３１．００４　（レイら、前掲のと おり）をＨａｅＩＩＩおよニア・カロトボーラＤＮＡを含むａｏｏｂｐのフラグ メントを含有していた。このプラスミドｐｌＮＧ１７３は５ｓｔＩでのｌ肖化お よびＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理により任意の遺伝子の成熟コーディング配 列第一アミノ酸が隣接するＤＮＡフラグメントと直接連結されて枠内の機能性リ ーダー配列と挿入遺伝子を含有する蛋白質融合物を生グ配列（リポソーム結合部 位を含む）を含有する。ｐＲＲ１７５由来のプラスミドｐＩＮＧ１５００はｐｅ ｌＢリーダーの−４８からｐｅｌＢリーダーのむ。

２、インビトロ突然変異誘発 部位特異的インビトロ突然変異誘発をクレイマーら（前掲のとおり）により記載 されているようにして行ない、Ｂ　ｓｍＩ制限部位を２Ｅ１２Ｌ鎖ｃＤＮＡ配列 （第１図）中に、オリゴヌクレオチドブライマー５−ＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＧ ＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴ−３°を用いてリーダーペプチドおよび成熟 コーディング領域の接合点に導入した（第１図）。

Ｋｐｎ１部位を同様にオリゴヌクレオチドブライマー５’　−ＧＴＴＧＣＡＣＣ ＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧ−３’　（第２図）でリーダーペプチ ドおよび２Ｅ１２Ｈ鎖の成熟コーディング領域の接合点に導入した。

３　細菌発現のためのＬ鎖の調製 ｐｃｌＫＨＢのＪ領域中シグナル配列プロセシング部位および見知領域を含有す る３２０ｂｐフラグメントを精製し、ｐＩＮＧ１５００に連結し、これをＳ　ｓ ｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ひとＣｋ十ｐＩＮＧ３１０２由来の ３°ゲノムＤＮ、Ａ１５ヌクレオチドを含有するＨ　１ｎｄＩＩＩからＸ　ｈｏ ＩフラグメントにそってＸ　ｈｏＩで切断した（第５Ｂ図）。

得られたｐｅｌ　Ｂ　：　：　Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｌ鎖融合物を含有するプラスミ ドを配列決定して、適切なインフレーム融合が形成されたことを決定した。

このグラ４スミドはｐＩＮＧ３１１１と呼ばれる。

４、細菌発現用のＦｄの調製 Ｆｄ遺伝子は細菌発現の開始点として機能する。プラスミドｐｃ　ＩＧＢＫをＫ ｐｎＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＢｓｔＥＩＩで消化した（第５Ｄ 図）。ＦｄＶ領域を含有する約３３５ｂｐフラグメントを導入することによりあ らかじめ生成させた、ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり）に添って ｐＦ３０（第５Ｆ図）から切断した。ｐｅｌＢ　：　Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆｄ融合 物を含有する得られたプラスミドを配列決定して適切なインフレーム融合物が形 成されたことを確かめた。このプラスミドをｐｌＮＧ３１１５と呼ぶ。

５、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子のマルチシストロン性発現系細菌由来のＦａｂの生成 の場合、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子の両方を細胞内で同時に生成する必要がある。こ れらの遺伝子をそれぞれ別々に用いて構築したプラスミドを用いて、一連の発現 ベクターを１つのプロモーターが両方の遺伝子を特定するように並んだ両方の遺 伝子を含有するように構築した。これを２つの遺伝子間の非コーディングＤＮＡ を最小にするような方法で行なった。各遺伝子は翻訳開始−に必要なリポソーム 結合部位および−４８から２！！Ｂリーダー：：抗体遺伝子接合点までの同一の ＤＮＡ配列を有する。

グメントを精製した（第５Ｈ図）。これらの２つの精製されたＤＮＡフラグメン トを連結してｐｌＮＧ３１１６を生成し、これは緊密に結合した２つのＣｈｉｍ ｅｒｌ遺伝子融合物を含有する。２遺伝子シストロンをａｒａ　Ｂプロモーター の制御下にｐｌＮＧ３１０４中に配置した。プラスミドｐＩＮＧ３１１６を５ｐ ｈＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ドルｌＮＧ３１０４由来のベクター フラグメントと連結した。ＦｄＣ領域中の独自のＢｓｔＥＩＩフラグメントを制 限分析により不正確な配列にあること、即ちＦｄ遺伝子を組み立てた場合、不適 切に組み立てられることを示した。これを修正するためには、プラスミドｐｌＮ Ｇ３１１９をＢｓｔＥＩＩで切断し、再連結して最終Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂベ クターｐＩＮＧ３１２７を生成した（第５に図）。このベクターはエシェリキア ・コリにおけるＣｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂの発現に関するすべての必要な特性を有 する。

６、細菌中のＣｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂの生成エシェリキア・コリにおけるｐｌＮ Ｇ３１２７由来のＣｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂ（７）発現はａｒａＢプロモーターの 誘発制御下である。アラビノース誘発により、生育培地中に分泌されるＦａｂは １０培以上に増加する。ｐｉＮ　Ｇ　３１２７を含有するエシェリキア・コリ種 を、炭素源として１．７％グリセリンで補足した１０リツトルの最小培地中３２ ℃にて培養した。

グリセリン補足最小培地の５倍濃縮物を添加することにより溶解酸素を２０％に 維持した。培養物を０．０５％アラビノースで１６時間以上１４リツトル発酵器 （シエマップ）中、０Ｄａｏｏ＝５０で誘発した。Ｆａｂを、発酵ブロス中で、 マウス坑ひとに鎮坑血清をＦａｂと結合した固相剤として用いた抗体サンドウィ ッチＥＬＩＳＡにより検出し、続いてモノクローナル坑ひとＦｄおよび坑ヤギＩ ｇＧパーオキシダーゼ結合による検出を行なった。

約７リツトルの培養上清を５ＩＯＹＩＯカートリツジ（ＤＣ−１０濃縮器、アミ コン・コーポレイション）を用いて２リツトルに濃縮した。

濃縮物を１０ｍＭ燐酸ナトリウムでｐＨ８，０にあらかじめ平衡化した５００ｇ 　ＤＥＡＥセルロース型（ＤＥ５２、ワットマン）カラムに通した。

十分な０．２Ｍ燐酸−ナトリウムを添加してｐＨを６．８に調節し、サンプルを ＹＭＩＯ膜上（スタート・セル２０００、アミコン・コーポレイション）で濃縮 した。サンプルを十分な水で希釈し、２００ｍ１に再濃縮して伝導率を１，１ｍ Ｓ／ｃ口にした。比色形分析により蛋白質総量を評価し、サンプルをＣＭ５２　 （１０ｍＭ燐酸ナトリウムでｐＨ８，０にあらかじめ平衡化Ｎｇにつき総蛋白質 １０ｍｇの割合でカルホキ／メチルセルロース型（ＣＭ５２、ワットマン）カラ ムにかけた。同じ緩衝液中ＣＭ５２カラムを直線勾配で次第に増加するＮａＣ１ 濃度（０〜０．ＩＮ）で溶出した。合したＦａｂフラクションをＹ　Ｍ　１０膜 上Ｆａｂ濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるように濃縮し、凍結して貯蔵した。

エンエリキア・コリから精製したＣｈｉｍｅｒｌ　ＦａｂはＳＤＳゲル電気泳動 で評価したところエンエリキア・コリから産生じた他のＦａｂ分子と同一の分子 量特性を有する。ＦａｂはそのＥＬ　Ｉ　ＳＡ検出分子中カッパおよびＦｄ両方 の決定基との正反応のためにカッパ＋Ｆｄ鎖二量体のように正しく組み立てられ 、ＦａｂがｇＰ１２０とウェスタンイムノプロット試験片と反応するので両端は 正しく折り畳まれている。

７、キメラＦａｂに関する考察 Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆ　ａｂを２Ｅ１２抗体マウス抗体およびＣｈｉｍｅｒｌ抗体 を用いて市販のＨＩＶウェスタンイムノプロット試験片（デュポン又は同等のも の）に固定された抗原への結合性に関して試験した。（：　ｈｉｍｅｒｌ　Ｆ　 ａｂを試験片と共に培養し、続いてヤギ坑ひとＦａｂ抗体、次にウサギ坑ヤギＩ ｇＧと反応させる。結合抗体の検出をプロティンＡ金、続いて銀促進（バイオラ ド）で行なった。約１２０ｋＤの抗原を特異的に認識するＣ　ｈｉｍｅｒｌ全抗 体と同様に、Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆ　ａｂは試験片上同寸法の抗原を特異的に認識 した。

実施例３ エンニリキア・コリにおいて産生されるＨ　Ｉ　Ｖエンベロープ蛋白質特異性キ メラマウス−ひとＦａｂフラグメント酵母細胞は外来蛋白質を発現することがで きる。本実施例においては、酵母はマウス−ひとキメラＦａｂの産生の宿主とし て機能した。

］　酵母種および成育条件 サツカロミセス・セレビシェ種Ｐ　Ｓ６　（ｕｒａ３１ｅｕ２　ＭΔＴａ）をＩ ＮＧＥＮＥて発育させ、イトウら、ジャーナル、サブ・バイオチクノロシイ、１ ５３　：　１６３〜１６８　（４９８３）により記載されているように行なう酵 母形質転換の宿主として用いた。酵母形質転換体をＳＤ寒天（２％グルコース、 ０．６７％酵母窒素ベース、２％寒天）上で選択し、５０＋ｎＭ／ユウ酸ナトリ ウムでｐＨ５，５に緩衝したＳＤジブロス中成育させた。

２、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築施例１に記載のとおり）お よびシグナル配列プロセッシング部位にトとしてｐｌＮＧ１１４９中に連結した 。プラスミドｐｌＮＧ］１４９は酵母ＰＧＫプロモーター（タウンッヒ、アール ら、ヌクレイツク・アンッヅ・リサーチ、１１．　：　１９４３〜１９５４　（ １９８３））の制御下、酵母インベルターゼシグナル配列（ヒララマン、アール ・エイら、ヌクレイツク・アシソヅ・リサーチ、１０　：　７７９１〜７８０　 （１９８２））をコード化する遺伝子配列を含有する。得られたプラスミドｐｉ 　ＮＧ３１１４　（第６Ａ図）はインベルターゼシグナル配列（Ｓ）と共にＣｈ ｉｍｅｒｌコーディング配列と融合したＰＧＫプロモーター（Ｐ）を含有する。

この融合の結果、Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｌ鎖の成熟形をコード化する遺伝子配列をイ ンフレームに酵母インベルターゼシグナル配列をコード化する遺伝子配列と融合 した。ＰＧＫプロモーター（Ｐ）　−インベルターゼシグナル配列−Ｃｈｉｍｅ ｒｌ　Ｌ鎮（ＶＳＣに）融合物を、２ミクロン円（２μ）、ＰＧＫポリアデニル 化シグナル（Ｔｍ）を含有するｕｒａ３酵母発現ベクターの一部中にクローン化 してｐｌＮＧ３１１８（第６Ｃ図）を産生じた。Ｊ領域（実施例１に記載のとお り）中にＢｓｔＥＩＩ部位およびｐｃＩＧＢＫ由来のシグナル配列プロセッシン グ部位に導入されたＫｐｎ１部位を含有するＣｈｉｍｅｒｌのｖ８領域の成熟形 をコード化する遺伝子配列をｐＦ３０由来のひとＣＨ領領域蝶番部分に終始コド ンを導入することによりあらかじめ産生、ロビンソン、アール・アーールら、前 掲のとおり）とともに唾ユＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｘ　ｈｏＩ で切断したｐＩＮＧ１１４９中に融合した。これはプラスミドｐｌＮＧ３１１７ およびｐｌＮＧ３１３７を産生じた。プラスミドｐｌＮＧ３１１７はインベルタ ーゼリーダー配列および成熟Ｖ領域コーディング配列間に正しい融合接合点を有 するが、ｐＦ３ＤのＣ１１領域由来のＢｓｔＥＩＩフラグメントは正しくない配 列であった。プラスミドｐｒＮＧ３１３７はインベルターゼリーダー配列をＣｈ ｉｍｅｒｌ　Ｖ、領域と付適切に融合するが、正しい配列のＣ領域ＢｓｔＥＩＩ フラグメントを有する。

ＰＧＫプロモーター、インベルターゼリーダー配列およびＣｈｉｍｅｒｌＶ領域 の一部を含有するｐｌＮＧ３１３７由来のＢａｍＨＩからＰ　ｓｔＩフラグメン トをＣｈｉｍｅｒｌ　Ｖ領域のリマインダーおよびＪ−ＣＨ１部分を含有するｐ ｌＮＧ３１３７由来のＰ　ｓｔＩからＸ　ｈｏＩフラグメントとともにＰＧＫポ リアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有する２ミクロン円（２μ）発現ベクターの 一部と連結し、ｐｌＮＧ３１３８（第６Ｄ図）を産生じた。

キメラＬ鎮およびＦｄｌｌｌ遺伝子およびその各々の発現シグナルの両方を含有 する１つの酵母発現ベクターをｐｌＮＧ３１１ｇおよびｐＩＮ０３１３８から構 築した。この最終ベクターｐｌＮＧ３１４２（第６Ｅ図）′は２ミクロン円（ｏ ｒｉＹ、　Ｒ旦Ｐ３）、および２つの選択マーカー奥２ｄおよびｕｒａ３を含有 する。

４、　Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂの酵母分泌プラスミドｐｌＮＧ３１４２をサツカ ロミセス・セレビシェＰＳ６中に形質転換し、形質転換体を前記の選択条件下に ブロス中で成育させた。培養上清をＥＬＩＳＡにより分析したところ、約９００ ｎｇ／ｍｌのレベルのＦａｂを含有していた。この物質は発酵ブロスから精製で き、実施例２に記載したように産生されるＦａｂの性質と同一の性質を宵するこ とが期待される。即ち酵母Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂはエンエリキア・コリにおい て産生されるＦａｂと同じ結合特異性を有することが期待される。

実施例４ 哺乳類細胞において産生されるＨ　Ｉ　Ｖｇａｇ蛋白質特異性キメラマウス−ひ と免疫グロブリン（Ｃｈｉｍｅｒ２）マウスｍＡｂ２Ｅ１２　（ヨシハラ、ビイ ら、ＡＩＤＳに関する第４回国際会議会報、２３７頁、１９８８年６月：マルカ セクラ、シイ・ジエイら、バイオケミストリイ・アンド・バイオフィジックス・ アクタ、９４９：　２１３〜２２３　（１９８ｇ））に記載されている抗−ｐ２ ４　ｍＡｂ）を、精製阿遺伝子生成物で免疫化したＢＡＬＢ／ｃ由来の膵臓細胞 を用いたハイブリドーマ融合物から得た。Ｓ　ｐ２ＩＯ骨髄種系を融合相手とし て用いた。

ＥＬＩ　ＳＡ分析によるとｍＡｂ　２Ｇ１２はクローン化された釘す遺伝子生成 物に対して反応性であった。さらに２Ｇ１２はＨＩＶ感染細胞の免疫蛍光染色が 可能であった。ウィルス溶解物に対する２Ｅ１２ｍＡｂウェスタンプロット分析 で、ウィルス溶解物に対して優勢なバンドが５５．４５．３９、および２４に示 された。

１、ＲＮＡ精製およびｃＤＮＡライブラリー構築約１　ｘ　１０’細胞／ｍｌの ２６１２ハイブリドーマ細胞１リツトルを遠心分離により集め、ＰＢ５１００ｍ ｌ中で洗浄した。ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーをｐＢＲ３２２中に構 築し、ＬおよびＨ＠ＪｃＤＮＡクローンを実施例１に記載のとおり同定した。

ヌクレオチド配列分析のために完全長ｃＤＮＡクローン由来のＶＬおよびＶｏフ ラグメントをＭ１３バクテリオファージベクターに挿入した。これらのクローン のＶ領域の完全ヌクレオチド配列をジデオキシチェーンターミネーション法によ り決定した（第７図および第８図）。これらの配列により観察組成物とよく一致 するＶ領域アミノ酸組成物が予言され、■領域の部分の直接アミノ酸配列決定に より証明されたペプチド配列が予言される。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、これらがＶ領域の特徴的なアミノ酸残 基を含有するので、これらが免疫グロブリン■領域クローンであることを示して いる（カバットら、前掲のとおり）。

２、Ｃｈｉｍｅｒ２ＨおよびＬ鎖発現プラスミドの構築２Ｇ１２Ｈ鎖を含有する ｃＤＮＡクローンｐＣ２Ｇ−６を適切なりローン化および部位特異的突然変異誘 発（クレーマー、ダブリューら、前掲のとおり）により適切な制限エンドヌクレ アーゼ部位を適切なＭ１３サブクローンに導入することにより哺乳類発現に応用 した（第９図）。オリゴヌクレオチドをサイクロンＤＮＡノン上サイザーにュー ・プランスウィック・サイエンテイフインク、カンパニー）で合成し、アクリル アミドゲル電気泳動により精製した。開始コドンの４５ｂｐの上流に位置するＮ ｄｅＩ部位を抗体■領域の５ａｌＩ制限部位５゛の導入のために用いた。Ｊ領域 突然変異誘発プライマー５−ＧＡＧＡＣＧＧＴＧを含有する制限フラグメントを 次に発現ベクターｐｉ　ＮＧ２２４０　（ｐＩＮ　Ｇ　２２４０は異なる抗体〜 ７領域を含有する以外はｐｌＮＧ２２２７と同一）中にクローン化した。

２Ｇ１２Ｌ鎖を含有するｃＤＮＡクローンｐＣ２に−１４を同様にして哺乳類発 現に応用した（第１０図）。Ｊ領域突然変異誘発プライマー５’−ＧＴＴＴＧＡ ＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ−３°を用いて旦力世ＩＩＩ部位をＭ１３サブ クローンｐＣ２−Ｋに挿入するのに用い、オリゴヌクレオチド５“−ＴＧＴＣＴ Ｇた２Ｇ１２ＶＬ領域を含有する制限フラグメントを次に発現ベクターｐ　Ｉ　 Ｎ　Ｇ　２２１６　（１）　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２２１６ハ！ナル抗体Ｖ領域を含有す る以外はｐＩＮＧ１７１２と同一）中にクローン化した。

３、キメラ抗体生成のためのマウスリンパ球細胞の安定トランスフェクション セルライン５ｐ２１０（アメリカンタイプカルチャーコレクション＃ＣＲＬ　１ ５８１）を実施例１に記載のとおりに成育させ、トランスフェクションし、選択 した。

Ｃｈｉｍｅｒ２Ｌ鎖発現プラスミドｐｌＮＧ３００５を実施例１に記載のとおり 線状化した。発芽後成育およびそれに続（サブクローニング後の最良のプロデュ ーサーをＰｖｕＩ−直線化ｐｌＮＧ３００４でトランスフェクションした。Ｇ４ １８での選択の後、Ｌ＋Ｈ鎮の大部分を生成するクローンＳ　ｐ２１０−３００ ５÷３００４３Ｅ９は約５μｇ／ｌの抗体を分泌した。

４、組織培養において分泌されたＣ　ｈｉｍｅｒ２抗体の精製５ｐ２１０−３０ ０５＋３００４３Ｅ９細胞を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｘグルタミン−ペニシリン −ストレプトマイシン（アービン・サイエンティフィック　＃　９３１６）で補 足した培地ＨＢＩＯＩ（ハナ・バイオロシクス）＋６％胎児牛血清中で成育した 。使用済培地を約１４０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を０．４５μミリ ポアニトロセルロース膜フィルターを通して＃過し、凍結して貯蔵した。抗体レ ベルをＥＬＴＳＡで測定した。約１１．３リツトルの細胞培養上清を３１０Ｙ３ ０カートリツジでＤＣ＝１０濃縮器（アミコン・コーポレイション）を用いて７ 倍に濃縮した。

約５０ｍｇの抗体を含有する上清を０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ燐酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ８，４）中２ｍｌｍｌプロティンカーカラムァーマシア）に数 回かけた。Ｃｈｉｍｅｒ２抗体を種々のｐＨ勾配（ｐＨ７〜２）で溶出し、ｐＨ ３５〜４０間で溶出した。抗体を含有するフラクション（収率４６％）を合し１ 、限外濾過（ＹＭ３０膜、細胞を攪拌、アミコン・コーポレイション）で８５倍 に濃縮し、ＰＢＳで２５倍に希釈し、１０倍に再濃縮し、ＰＢＳで１０倍に希釈 し、最後に４倍に再濃縮した。抗体を１０ｍ１ずつ一２０℃で貯蔵した。

５　、（：　ｈｉｍｅｒ２抗体に関する研究Ｃｈｉｍｅｒ２がマウス２Ｇ１２抗 体の抗原結合性を保持することを示すためにこれを用いて試験を行なった。試験 により、両方の抗体が同一のウィルス抗原を認識することが示された。市販のＨ ＩＶウェスタンストリップ（デュポンまたは等価なもの）をＣｈｉｍｅｒ２　（ ２μｇ／ｌ）または２Ｇ１２　（１０〜２０μｇ／ｌ）のいずれかを用いて培養 した。２Ｇ１２マウス抗体で培養したストリップをウサギ抗マウス抗体、続いて プロティン、八−金、続いて銀促進（バイオラド）を用いて培養した。

Ｃｈｉｍｅｒ２を用いて培養したストリップは直接プロティンＡ−金を用いて培 養した。約２４ｋ　Ｄ分子量のウィルス抗原に対する特異的結合は各抗体を用い て検出された。

第二試験においては、Ｃｈｉｍｅｒ２および２Ｇ１２を実施例１に記載のとおり ＥＬＩＳＡテストで比較した。Ｃｈｉｍｅｒ２および２Ｇ１２が同様に反応する ことを示す結果を第１表に示す。

実施例５ エシェリキア・コリにおいて産生されるＨｒＶら蛋白質特異性キメラマウス−ひ とＦａｂフラグメント全コーディング配列は充分同定されたプロモーターから発 現されるので細菌は哺乳類ｃＤＮＡから発現されるキメラ抗体の産生に適してい る。つぎの項にエシェリキア・コリ由来のＣｈｉｍｅｒ２　Ｆａｂの分泌を詳細 に記載する。

１、インビトロ突然変異誘発 部位特異的インビトロ突然変異誘発をクレイマーら（前掲のとおり）により記載 されているようにして行ない、ＢｓｍＩ制限部位を２Ｇ−１２ＬＭｃＤＮＡ配列 （第８図）中にオリゴヌクレオチドブライマー５’−ＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡ ＧＣＡＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＴＡＡＧ−３’でリーダーペプチドおよび成熟コー ディング領域の接合点に導入した。

Ｂｓ＋ａＩ部位を同様にオリゴヌクレオチドブライマー５°−ＣＴＧＧＡＣＣＴ ＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴ−３°でリーダーペプチドおよび２に １２Ｌ鎖の成熟コーディング領域の接合点に導入した（第７図）。

２、細菌発現のためのし鎖の調製 ｐＳＷ８のＪ領域中シグナル配列プロセシング部位および独自のＨｉｎｄＩＩＩ 部位に旦ｓｍＩ制限部位を含有するＣ　ｈｉｍｅｒ２Ｖ　Ｌ領域は細菌発現の出 発点として機能した。プラスミドｐＳＷ８をＢｓｍＩて切断し、Ｔ４ポリメラー ゼで処理し、Ｈ１ｎｄＩＩＩで消化した（第１１Ａ図）。■。

領域を含有する約３２０ｂｐフラグメントを精製し、ｐｌＮＧ１５００に連結し 、これをＳ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ひとＣＫ＋１５ヌク レオチドｐｌＮＧ３１０２由来のゲノムＤ　Ｎ　Ａ　１５ヌクレオチドを含有す るＨｉｎｄＩＩＩからＸ　ｈｏｌフラグメントとＸ　ｈｏＩで切断した（第１１ Ｃ図）。得られたｐｅｌＢ：：Ｃｈｉｍｅｒ２　Ｌ＠融合を含有するプラスミド を配列化して、適切なインフレーム融合が形成されたことを決定した。このプラ スミドはｐｓＷｌｏ−Ｂと呼ばれる。

３、細菌発現用のＦｄの調製 ｐＳＷ２のＪ領域中シグナル配列プロセッシング部位およびＢｓｔＥＩＩ制限部 位にＢｓｍＩ制限部位を含有する完全なＣｈｉｍｅｒ２キメラＦｄ遺伝子は細菌 発現の開始点として機能する。プラスミドｐＳＷ２を旦ｓｍＩで切断し、Ｔ４ポ リメラーゼで処理し、Ｂ　ｓｔ　Ｅ　ＩＩで消化した（第１１Ｄ図）。ＦｄＶ領 域を含有する約３３６ｂｐフラグメントを精製し、ることによりあらかじめ生成 させた、ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり）に添ってｐＦ３Ｄ（第 １１Ｆ図）から切断した。ｍｌＢ・Ｃｈｉｍｅｒ２　Ｆｄ融合を含有する得られ たプラスミドを配列させて適切なインフレーム融合が形成されたことを確かめた 。このプラスミドをｐ　Ｓ　Ｗ４−　Ｂと呼ぶ。

４、　Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子のマルチシストロン性発現系細菌由来のＦａｂの生 成に関して、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子の両方を細胞内で同時に生成する必要がある 。これらの遺伝子をそれぞれ別々に用いて構築したプラスミドを用いて、一連の 発現ベクターを１つのプロモーターが両方の遺伝子を特定するように並んだ両方 の遺伝子を含有するように構築した。これを２つの遺伝子間の非コーディングＤ ＮＡを最小にするような方法で行なった。各遺伝子は翻訳開始に必要なリポソー ム結合部位および−４８か９ｐｅｌＢリーダー：抗体遺伝子接合点までの同一の ＤＮＡ配列を有する。

ントを精製した（第１１Ｈ図）。これらの２つの精製されたＤＮＡフラグメント を連結してｐＭＢｌを生成し、これは結合した２つのＣｈｉｍｅｒ２遺伝子融合 を含有していた。２遺伝子シストロンをａｒａＢプロモーターの制御下にｐ　Ｉ 　Ｎ　Ｇ　３１．０７中に配置した。プラスミドｐＭＢ１を５ｐｈｌで切断し、 Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｘ　ｈｏＩで切断し、Ｆｄおよびに遺伝子を含有す るフラグメントを精製した（第１１Ｊ図）。こターフラグメントと連結した。こ のベクターはエシェリキア・コリにおけるＣｈｉｍｅｒ２　Ｆａｂの発現に関す る必要な特性をすべて宵する。

５、細菌中のＣｈｉｍｅｒ２　Ｆａｂの生成エシェリキア・コリにおけるｐｌＮ Ｇ３２１１由来のＣｈｉｍｅｒ２　Ｆａｂ（７）発現はａｒａＢプロモーターの 誘発制御下にある。アラビノース誘発により、生育培地中に分泌されるＦａｂは １０培以上に増加する。ｐｌＮ　Ｇ　３２１１を含有するエシェリキア・コリ種 を、炭素源として１．７％グリセリン補足した１０リツトルの最小培地中３７℃ にて培養した。グリセリン補足最小培地の５倍濃縮物（濃縮物３リツトル中２０ ｇのアラビノースを含有する）を添加することにより溶解酸素を２０％に維持し た。誘発溶液を約２８時間かけて添加し、つぎに最小培地を含有しない５倍濃縮 物を約４時間で添加した。ＦａｂをＥＬＩ　ＳＡにより発酵−ブロス中で検出し た。

約７リツトルの培養上清を濃縮し、分析し、実施例２と同様に貯蔵した。

エシェリキア・コリから精製したＣｈｉｍｅｒ２　ＦａｂはＳＤＳゲル電気泳動 で評価したところエシェリキア・コリから産生じた他のＦａｂ分子と同一の分子 量特性を有する。ＦａｂはそのＥＬＩＳＡ検出分子中におよびＦｄ両方の決定基 との正反応のため、また市販の試験片と反応するので、に＋Ｆｄ鎖二鎖体量体う に正しく組み立てらでいる。

６、Ｃｈｉｍｅｒ２Ｆａｂに関する考察Ｃｈｉｍｅｒ２ＦａｂをＣｈｉｍｅｒ２ Ｇ　１２抗体マウス抗体およびＣｈｉｍｅｒ２抗体を用いて市販のＨＩＶウェス タンイムノプロット試験片（デュポン又は同等のもの）に固定された抗原への結 合性に関して試験した。

Ｃｈｉｍｅｒ２Ｆ　ａｂを試験片と共に培養し、続いてヤギ坑ひとＦａｂ抗体、 次にウサギ坑ヤギＩｇＧと反応させた。結合抗体の検出をプロティンＡ−金（バ イオラド）、続いて銀促進で行なった。約２４ｋ　Ｄの抗原を特異的に認識する Ｃ　ｈｉｍｅｒ２全抗体と同様に、Ｃｈｉｍｅｒ２　Ｆ　ａｂは試験片上同寸法 の抗原を特異的に認識した。

実施例６ 酵母において産生される）（ＩＶｇａｇ蛋白質特異性キメラマウス−ひとＦａｂ フラグメント 酵母細胞は外来蛋白質を発現することができる。本実施例においては、酵母はマ ウス−ひとキメラＦａｂの産生の宿主として機能した。

酵母種および生育条件は実施例３と同様である。

１、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築２Ｇ］２の〜ｒＬ領域の成 熟形をコード化し、Ｊ領域のＨｉｎｄＩＩＩ部位（実施例４に記載のとおり）お よびシグナル配列プロセ・ノンング部位に導入されたＢｓｍＩ部位を含有する遺 伝子配列をひとＣに領域と融合した。プラスミドｐＳＷ８をＢｓｍＩで切断し、 Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＴで切断した。■領域フラグメントを ｐ３Ｑ２から調製したひとＣ０領域とともに旦１ｎｄＩＩＩか９ＸｈｏＩフラグ メントとしてｐｌＮＧ１１４９中に連結した。プラスミドｐｌＮＧ１１４９は酵 母ＰＧＫプロモーター（タウンッヒ、アールら、前掲のとおり）の制御下、酵母 インベルターゼシグナル配列（ヒララマン、アール・エイら、前掲のとおり）を コード化する遺伝子配列を含有する。得られたプラスミドｐｓＷ１１−Ｙ　（第 ６Ａ図に類似）はインベルターゼシグナル配列（Ｓ）と共にＣｈｉｍｅｒ２コー ディング配列と融合したＰＧＫプロモータ−（Ｐ）を含有する。この融合の結果 、Ｃｈｉｍｅｒ２Ｌ鎖の成熟形をコード化する遺伝子配列をインフレームに酵母 インベルターゼシグナル配列をコード化する遺伝子配列と融合した。ＰＧＫプロ モーター−インベルターゼシグナル配列　−キメラＬ鎖（ＶＳＣに）融合を、２ ミクロン円（２μ）、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有するｕｒａ ３酵母発現ベクターの一部中にクローン化してｐＷ１３−Ｙ（第６Ｃ図に類似） を産生じた。ｖＨ領領域実施例４に記載のと成熟形をコード化する遺伝子配列を ｐＦ３Ｄ由来のびとＣＨ１領域（蝶番部分に終始コドンを導入することによりあ らかじめ産生、コドンに融合した。これはプラスミドｐＳＷ５−Ｙ　（第６Ｂ図 に類似）を産生じた。ＰＧＫプロモーター　−インベルターゼシグナル配列　− キメラＦｄ鎖（■、ＣＨＩ）融合を、２ミクロン円（２μ）、ＰＧＫポリアデニ ル化シグナル（Ｔｍ）を含有するｕｒａ３酵母発現ベクターの一部中にクローン 化してｐｓＷ１２−Ｙ　（第６Ｄ図に類似）を産生じた。

キメラＬ鎖およびＦｄ鎖遺伝子の両方およびその各々の発現シグナルを含有する １つの酵母発現ベクターをｐｓＷ１３−ＹおよびｐｓＷ１２−Ｙから構築した。

この最終ベクターｐＩＮＧ３２０８（第６Ｅ図）は２２、　Ｃｈｉｍｅｒ２　Ｆ ａｂの酵母分泌プラスミドｐＩＮＧ３２０８をサツカロミセス・セレビシェＰＳ ａ中に一形質転換し、形質転換体を前記の選択条件下にブロス中で生育させた。

培養上清をＥＬＩ　ＳＡにより分析したところ、約１１００ｎ／ｍｌのレベルの Ｆａｂを含有していた。この物質は発酵ブロスから精製でき、実施例３に記載し たように産生されるＦａｂの性質と同一の性質を有することが期待される。即ち 酵母Ｃｈｉｍｅｒｌ　Ｆａｂはエシェリキア・コリにおいて産生されるＦａｂと 同じ結合特異性を有することが期待される。

実施例７ 哺乳類細胞において産生されるＨＩＶ逆転写酵素蛋白質特異性キメラマウス−ひ と免疫グロブリン（Ｃｈｉｍｅｒ４）マウスＩＩＩＡｂＩＣ１１（エピトープ・ インコーホレイテッド二より開発され、市販されている）を、ＨＩｖウィルス溶 解物で免疫化したＢＡＬＢ／ｃ由来の膵臓細胞を用いたハイブリドーマ融合物か ら得た。

Ｓ　ｐ２１０骨髄種系を融合相手として用いた。クローンＩＣ１１はＩｇＭサブ クラスの免疫グロブリンを産生じた。ウェスタンプロット分析によるとｍＡｂ　 ＩＣＩＩはクローン化されたｐｏｌ遺伝子生成物に対して反応性であった。さら にＩＣ１１はＨＩＶ感染細胞の免疫蛍光染色が可能であった。ウィルス溶解物に 対するＩＣＩＩ　ｍＡｂウェスタンプロット分析で、ウィルス溶解物に対して優 勢なバンドが５１および６５ｋ　Ｄに示された。

１、ＲＮＡ精製およびｃＤＮＡライブラリー構築約１ｘｌＯ’細胞／ｍｌのＩＣ １１ハイブリドーマ細胞１リツトルを遠心分離により集め、ＰＢ５１００ｍｌ中 で洗浄した。ＲＮＡを調製し、実施例１に記載のとおりｃＤＮＡライブラリーを ｐＢＲ３２２中に構築した。

ＣＤＮ、Ａライブラリーを３２ｐでラベルしニック翻訳されたＤＮＡフラグメン トで、すなわちにクローンに関してはＣに領域プローブを用い、およびＨ鎖りロ ーンに関してはマウスＩｇＧＩ　Ｃ領域プローブを用いたハイブリダイゼーショ ン（マニアナイス、ティーら、前掲のとおり）によりスクリーンニングした。

ヌクレオチド配列分析のために完全長ｃＤＮＡクローン由来のＶｌおよびＶ。フ ラグメントｐＣ４に−１６およびｐＣ４Ｍ−８をＭ１３バクテリオファージベク ターに挿入した。これらのクローンの〜７領域の完全ヌクレオチド配列をジデオ キシチェーンターミネーション法により決定した（第１２図および第１３図）。

これらの配列により観察組成物とよく一致する■領域アミノ酸組成物が予示され 、■領域の部分の直接アミノ酸配列決定により証明されたペプチド配列が予言さ れる。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、これらがＶ領域の特徴的なアミノ酸残 基を含有するので、これらが免疫グロブリンＶ領域クローンであることを示して いる（カバットら、前掲のとおり）。

２．　Ｃｈｉｍｅｒ４ＨおよびＬ鎖発現プラスミドの構築Ｉ　ＣＩＬＨ鎖を含有 するｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐＣ４Ｍ−８を適切なりローン化法により哺乳類発 現に応用した。ＩＣＩＩＨ鎮遺伝子のＤＮＡ配列は、あらかじめクローン化し、 キメラ化した抗癌ＡＩＯ抗体遺伝子に非常に類似している。■領域中開始コドン ＡＴＧの最低４５ｂｐの上流から抗体リーダー配列を経てＢａｍＨＩ制限部位ま でのアミノ酸１６および１７の領域は同一のＤＮＡを含有する。あらかじめ、Ｓ ａ］ユニ制限部位をプライマー５°−＾ＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＧ ＡＡＧＡＧＡ−３’を用いた部位特異的突然変異誘発によりＡ　ＩＯＨ鎖ｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａ配列のＡＴＧ開始コドンの上流に導入した。

ＩＣＩＩＨ鎖はその３′末端にＰ　ｓｔＩ部位を含有するＪＨ３配列を含有する 。Ｃ４Ｍ−８（第１２図において下線を引き、太文字で現す）にあるＨｉｎｄｌ ＩＩ部位（アミノ酸３および４）およびｐｓｔＩ部位（Ｊ領域）を用いて５゛未 翻訳領域、リーダー配列、および共有〜ｒ領域アミノ酸配列を共有するｐＴＫ７ 由来の−Ｓ　ａｌＩから±ｎｄＩＩＩ　ＤＮＡフラグメントに隣接する独自のＣ ｈｉｍｅｒ４　Ｖ領域配列を動員した。得られたプラスミドｐｙ　Ｚ　１２４は 完全Ｃｈｉｍｅｒ４　ＶＨ領領域リーダー配列およびそＣｈｉｍｅｒ４　Ｈ鎖ベ クターｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２２５５　（第１４図）を産生じた。

ＩＣＩＬ　Ｌ鎖を含有するｃＤＮＡクローンｐＣ４に−１６をポリメラーゼ連鎖 反応（ホルトン、アール・エムら、ジーン、７７　：　６１（１９８９））を用 いた部位特異的突然変異誘発を利用した哺乳類発現に応用した。

基質としてＣ４に−１６を用いてＤＮＡフラグメントを増幅し、これはオリゴヌ クレオチド５−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴ−３’お よび５−＾ＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’を有するＪ 領域中、開始コドンＡＴＧ（ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり）中 にクローン化し、インフレームＶ−Ｊ−Ｃにキメラ遺伝子融合物を産生じた。最 終ＬＭベクターｐＩＮＧ２２５８を得るための次のクローン化は第１５図に記載 のとおり行なった。

３、キメラ抗体生成のためのマウスリンパ球細胞の安定トランスフェクション セルライン５ｐ２１０（アメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン＃　ＣＲＬ　 １５８１）　を前記実施例１に記載のとおりに生育させ、トランスフェクション し、選択した。

Ｃｈｉｍｅｒ４　Ｌ　ｔＪ１発現プラスミドｐＩＮＧ２２５８およびＨ鎖発現プ ラスミドｐｌＮＧ２２５５をＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、５ｐ２ １０細胞中に共トランスフェクションすることによりそれぞれ線状化し、ミコフ ェノール酸耐性クローンを得、これをＬ＋Ｈ鎖合成および６４１８に関してスク リーニングした。Ｌ＋Ｈ鎖の大部分を産生するＭＰＡ−およびＧ４１８耐性クロ ーン５ｐ２１０−２２５８＋２２５５１１Ｆ３．１ＤＩＯをＣｈｉｍｅｒ４産生 試験に用いた。

４、組織培養において分泌されたＣ　ｈｉｍｅｒ４抗体の精製および試験５ｐ２ １０−２２５８＋２２５５１１Ｆ３．１ＤＩＯ細胞を５％退治牛血清、ＨＥＰＥ Ｓ緩衝液、グルタミン、ベニンジン、およびストレプトマイシン（アービン・サ イエンティフィック　アービンＣＡ）で補足した培地ＤＭＥＭ　（ギブコ）中で 成育した。Ｃｈｉｍｅｒ４を実施例１および４１：おいてそれぞれＣｈｉｍｅｒ ｌおよびＣｈｉｍｅｒ２に関して記載したのと同様の方法で精製した。精製Ｃｈ ｉｍｅｒ４がマウスＩＣ１１抗体の抗原結合性を保持することを示すために市販 のＨＩＶウェスタンストリップ（デュポンまたは等価なもの）を用いてＣｈｉｍ ｅｒｌおよびＣｈｉｍｅｒ２に関して記載したように試験を行なった。Ｃｈｉｍ ｅｒ４およびマウスＩＣ１１抗体は両方とも同一のＨＩＶ逆転写酵素抗原を認識 した。

実施例８ エシェリキア・コリにおいて産生されるＨ　Ｉ　Ｖ逆転写酵素蛋白質特異性キメ ラマウス−ひとＦａｂフラグメント全コーディング配列が充分同定されたプロモ ーターがら発現されるので細菌は哺乳類ｃＤＮＡから発現されるキメラ抗体の産 生に適している。つぎの項にエシェリキア・コリ由来のＣｈｉｍｅｒ４　Ｆａｂ の分泌を詳細に記載する。

１、細菌発現用のＦｄの調製 Ｃｈｉｏｅｒ４　Ｈ鎖Ｖ領域はＡＩＯと相同なの使用はｐｅｌ　Ｂ　：　：　Ｃ ｈｉｍｅｒ４Ｆｄ融合の構築のためにｐＴＫ１５中でｐｅｌＢ　：：Ａ１０　Ｂ 鎖融合物を作ることからなる。■領域（Ａ１０およびＣｈｉｍｅｒ４間の配列差 の領域を含有する）をｐ”ｒ　Ｋ　１５から旦ａｍＨＩおよびλｈｏＩ切断し、 ベクターを精製することにより除去した。ｐＴ　Ｋ　１５中に残存する対象の配 列は、ＡＩＯ第一フレームワーク領域（ＦＲＩ）の初めの１６アミノ酸に結合Ｈ １フラグメント（終止コドンを蝶番部分に導入することによりあらかじめ生成さ せた、ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり）をＡｐａＩからＸｈｏＩ フラグメントとしてＩ）Ｑ１６Ｄから精製した。

これらの精製したフラグメントｐＹ１１１７の３通りの連結を第１６図に示す。

２、細菌発現のためのＬｆｉＪｌの調製ｐＣ４に−１６からＣｈｉｍｅｒ４　Ｖ 　Ｌ領域を第１６図に示す細菌発現のために応用した。ポリメラーゼ連鎖反応に よりオリゴヌクレオチドを得るために２つのプライマー＋　５’　−ＧＡＴＡＴ ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣ−３゜および５°−ＡＧＣＧＣ ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３′を用い、これは、一端に平−滑 末端を有し、他端のＪ領域中にＢｇｌＩＩ部位を含有するＤＮＡフラグメントを 産生じた。ＤＮＡフラグメントを次にＳ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで 処理し、Ｂ　ａｍＩで切断したｐｌＮＧ１５００中にクローン化してｐｌＮＧ３ ３１４を産生した。プラスミドｐｌＮＧ３３１４はＣｈｉｍｅｒ４　Ｖに−Ｊに 領域を有するインフレームと融合したｐｅ］ユＢリーダーを含有する。

３、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子のマルチ／ストロン性発現系細菌由来のＦａｂの生成 の場合、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子の両方を細胞内で同時に生成する必要がある。こ れらの遺伝子をそれぞれ別々に用いて構築したプラスミドを用いて、一連の発現 ベクターを１つのプロモーターが両方の遺伝子を特定するように並んだ両方の遺 伝子を含有するように構築した。これを２つの遺伝子間の非コーディングＤＮＡ を最小にするような方法で行なった。各遺伝子は翻訳開始に必要なリポソーム結 合部位および−４８からｍｌＢリーダー：：抗体遺伝子接合点までの同一のＤＮ Ａ配列を有する。

ｐｌＮＧ３３１４を５ｐｈＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｅｃ。

ＲＩで切断し、ｐＹＺ１１７由来のＦｄ遺伝子をその中Ｘ　ｈｏＩ、Ｔ４ポリメ ラーゼ処理、ＥｃｏＲＩで切断フラグメントとしてクローン化してｐＴＮ　Ｇ　 ３３１５を得ることにより、完全ｐｅｌＢ：：Ｆｄ遺伝子およびｐｅｌＢ　−Ｖ に−Ｊに領域を含む２遺伝ベクターを構築した。

ｐｌＮＧ３３１５由来のＦｄおよびに遺伝子融合をｐｌＮＧ３３０３中引上Ｂの 制御下に配置した。プラスミドｐＩＮＧ３３１５を５上りで切断し、Ｔ４ポリメ ラーゼで処理し、Ｘ　ｈｏＩで切断し、Ｆｄおよびに遺伝子を含有するフラグメ ントを精製した。このＤＮＡフラグメントをあらかじめｐｓＴＩで切断し、Ｔ４ ポリメラーゼで処理し、Ｘ　ｈｏＩで切断したプラスミドｐｌＮＧ３３０３のベ クターフラグメントと連結して、プラスミドｐｌＮＧ３３１６を産生した。最終 二遺伝子発現ベクターｐｌＮＧ３４０５をＩ）ＩＮＧ３３］６由来の２つのフラ グメントで３通りの連結中に２１２５はｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ２０１６Ｅｇｐｔ由来の Ｃに領域と融合したＣ　ｈｉｍｅｒ４のＶに領域を含有する〕。これらの段階の 概要を第１６図に示す。

５、細菌中のＣｈｉｍｅｒ４　Ｆａｂの生成Ｃｈｉｍｅｒ４　Ｆａｂを実施例２ から５にＣｈｉｍｅｒｌおよびＣｈｉｍｅｒ２　Ｆａｂに関して記載のとおりに 産生じ、精製する。精製したＣｈｉｍｅｒ４　Ｆａｂを実施例２から５に記載し たとおり、抗原結合に関して試験する。

Ｃｈｉｍｅｒ４　ＦａｂハマウスＩＣＩＩ抗体のＦａｂフラグメントと同じ結合 特異性を有することが期待される。

実施例９ 酵母において産生されるＨＩＶ逆転写酵素蛋白質特異性キメラマウス−ひとＦａ ｂフラグメント 酵母細胞は外来蛋白質を発現することができる。本実施例においては、酵母はマ ウス−ひとキメラＦａｂの産生の宿主として機能する。

このＦａｂ分子は２３位の１つのアミノ酸が変わっている（イソロイシンからロ イシンにかわる）以外は実施例８に概要を記載したエシェリキア・コリにおいて 産生されるＦａｂと同じである。これは部位特異的突然変異誘発中のＤＮＡポリ マー化の予期せぬ結果である。このアミノ酸の変化により抗原結合能力は変化し ないと考えられる。

酵母種および生育条件は実施例３と同様である。

１、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築】Ｃ】】の■】領域の成熟 形をコード化する遺伝子配列を以下のようにして酵母発現に応用した。Ｊ領域プ ライマー５−ＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴＡＧ＾ＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ−３” およびリーダー成熟プライマー５’　−ＣＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴ ＧＧＴＡＣＣＴＴＧＡ＾−３°を用いたｐＣ４に−１，６のＭ１３サブクローン の逐次部分特異性突然変異誘発二よりｐＹ１２２が産生され、これはを成熟接合 点にＰ　ｓｔＩ部位をリーダー、Ｊ領域に旦魁ＩＩ部位を含有していた。

プラスミドｐｙ　１２２をＰ　ｓｔｌで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、旦 ｊｎｄＩＩＩ　（Ｖ領域に位置する部位：第１３図参照）で切断した。■領域フ ラグメントをｐＹ１２５　（実施例８参照）から調製したＶＪＣＫ領域とともに ＨｊｎｄＩＩＩからＸ　ｈｏＩフラグメントとしてｐｌＮＧ］１４９中に連結し た。プラスミドｐＩＮＧ１１４９は酵母ＰＧＫプロモーター（ヒララマン、アー ル・エイら、前掲のとおり）の制御下、酵母インベルターゼシグナル配列（タウ シッヒ、アールら、前掲のとおり）をコード化する遺伝子配列を含有する。

−得られたプラスミドｐｌＮＧ３１５７（第６Ａ図に類似）はインベルターゼシ グナル配列（Ｓ）と共にＣｈｉｍｅｒ４コーディング配列と融合したＰＧＫプロ モーター（Ｐ）を含有する。この融合の結果、Ｃｈｉｍｅｒ４Ｌ鎖の成熟形をコ ード化する遺伝子配列をインフレームに酵母インベルターゼシグナル配列をコー ド化する遺伝子配列と融合した。ＰＧＫプロモーター　−インベルターゼシグナ ル配列　−キメラＬ鎖（Ｖ、Ｃに）融合物を、２ミクロン円（２μ）、ＰＧＫポ リアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有する胆３酵母発現ベクターの一部中にクロ ーン化してｐＩＮ０３１５８（第６Ｃ図に類似）を産生じた。

Ｆｄ酵母ベクターに対して、実施例７および８に記載したＩＣＩＩＨａおよびＡ ｌＯ抗体間のＤＮＡ配列の類似性を利用した。哺乳類Ｈ鎖ベクターｐｌＮＧ２２ ５５をＢａｍＨＩで切断し、子ウノ腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）と ともに培養し、Δｐａｒで切断した。ＰＧＫプロモーター　−インベルターゼシ グナル配列　−キメラＡＩＯＦｄ鎖融合を含有するプラスミドｐＴＫ１４を、Ｂ ａｍＨＩで切断し、Ｃ１，ＡＰで処理し、ΔｐａＩで切断した。別の反応で、ｐ ＴＫ］４をＢａｍＨＩで切断した。前者の反応から得たベクターフラグメントお よび後者の反応から得たＰＧＫ−インベルターゼ−■領域をＩ）　Ｔ　Ｎ　Ｇ２ ２５５由来のＢａｍＨＩからΔｐａＩ　Ｖ−Ｊ領域フラグメントと連結し、ｐＹ Ｚ１１６を産生した。ＰＧＫプロモーター　−インベルターゼシグナル配列　− キメラＦｄ鎖（Ｖ−Ｊ−ＣＨＩ）融合（第６Ｂ図に類似）を２ミクロン円（２μ ）、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有する里１３酵母発現ベクター の一部中にクローン化してｐＹＺｌｌｇ（第６Ｄ図に類似）を産生じた。

キメラＬ鎖およびＦｄ鎖遺伝子の両方およびその各々の発現シグナルを含有する １つの酵母発現ベクターをｐｙ　２１１ｇおよびｐｌ？、！Ｇ３１５８から構築 した。この最終ベクターｐｌＮＧ３１５９（第６Ｅ図に類似）２、Ｃｈｉｍｅｒ ２　Ｆａｂの酵母分泌プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ３１５９をサツカロミセス・セ レビンエＰＳＳ中に形質転換し、形質転換体を前記の選択条件下にブロス中で生 育させる。培養上清はＦａｂを含有する。この物質を発酵ブロスから精製し、実 施例８に記載したように産生されるＦａｂの性質と同一の性質を有することが期 待される。即ち酵母Ｃｈｉｖｌｅｒ４　Ｆａｂはエシェリキア・コリにおいて産 生されるＦａｂと同じ結合特異性を有することが期待される。

実施例１０ ウス−ひと免疫グロブリン（Ｃｈｉｍｅｒｌ）マウスｍＡｂ４Ｄ１２　（ヨシハ ラ、ビイら、ＡＩＤＳに関する第４回国際会議会報、２３７頁、１９８８年６月 に記載されている抗−ｐｉ８　ｍＡｂ）を、精製した再遺伝子生成物で免疫化し たＢＡＬＢ／ｃマウス由来の膵臓細胞を用いてハイブリドーマ融合から得た。Ｓ 　ｐ２１０骨髄種系を融合相手として用いた。クローン４Ｄ１２はＩｇＧ１サブ クラスの免疫グロブリンを産生ずる。ＥＬＩ　ＳＡ分析によるとｍＡｂ　４Ｄ１ ２はクローン化された再遺伝子生成物に対して反応性をもっていた。さらに４Ｄ １２はＨＩＶ感染細胞の免疫蛍光染色が可能であった。ウィルス溶解物に対する ４Ｄ１２　ｍＡｂのウェスタンブロンド分析で、優勢なバンドが５５．４５、お よび３９ｋ　Ｄに示された。溶解物を用いた場合、さらに弱いバンドが１８ｋＤ に示された。

１、ＲＮＡ精製およびｃＤＮＡライブラリー構築約１ｘｌＯ６細胞／ｍｌの４Ｄ １２ハイブリドーマ細胞１リツトルを遠心分離により集め、ＰＢ３１００ｍｌ中 で洗浄したｃＲＮＡを調製し、実施例１に記載のとおりｃＤＮＡライブラリーを ｐＢＲ３２２中に構築し、ＬおよびＨ鎮ｃＤＮＡクローンを同定した。完全長ｃ ＤＮＡクローン由来のＬＶＨ領域フラグメントｐＣ５に−４およびｐＣ５に−４ をヌクレオチド配列分析のためにＭ１３バクテリオファージベクター中に挿入し た。これらのクローンのＶ領域の完全ヌクレオチド配列をジデオキシチェーンタ ーミネーション法により決定した（第１７図および篤１８図）。これらの配列に より観察組成物とよく一致するＶ領域アミノ酸組成物が予言され、■領域の部分 の直接アミノ酸配列決定により証明されたペプチド配列が予示される。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、これらが■領域の特徴−的なアミノ酸 残基を含有するので、これらが免疫グロブリン■領域クローンであることを示し ている（カバットら、前掲のとおり）。

２　、Ｃｈｉｍｅｒ５ＨおよびＬ鎖発現プラスミドの構築４Ｄ１２Ｈ鎖を含有す るｃＤＮＡクローンｐＣ５Ｇ−３０を適切なりローン化法および適切なＭ１３サ ブクローン（第１９図）の部位特異的突然変異誘発（クレーマー、ダブり二一ら 、前掲のとおり）により哺乳類発現に応用した。オリゴヌクレオチドをサイクロ ンＤＮＡノン上サイザーにュー・プランスウイック・サイエンティフィック・コ ーポレイション）で合成し、アクリルアミドケル電気泳動で精製した。開始コド ンＡＴＧの約４５ｂｐの上流に位置する二〇１部位（第１７図）を、抗体■領域 の５ａｌＩ制限部位５′を導入するのに用いた。Ｊ領域突然変異誘発プライマー ５’−ＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＣＴ−３’を用いてｐ　Ｉ　Ｎ Ｇ　２２４０　（ｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２２４０は異なる抗体Ｖ領域を含有する以外 はｐｌＮＧ　２２２７と同じである）中にクローンかした。

４Ｄ１２　Ｌ鎮を含有するｃＤＮＡクローンｐＣ５に−４を同様にして哺乳類発 現に応用した（第２０図）。Ｊ領域突然変異誘発プライマー５−ＣＡＧＣＴＣＡ ＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’を用いて±剰ＩＩＩ部位をＭ１３サブクローンｐ ｌＮＧ３１２３に挿入した。開始コドンＡ　Ｔ　Ｇの約３０ｂｐの上流に位Ｓａ ］、Ｉおよび旦１ｎｄＩＩＩにより結合した４Ｄ１２ＬＶ領域を次に発現ベクタ ーｐｉ　ＮＧ１７１２　（ｐｉ　ＮＧ２２１６は異なる抗体■領域を含有する以 外はｐｌＮＧ１７１２と同じである）中にクローン化した。

３、キメラ抗体生成のためのマウスリンパ球細胞の安定トランスフェクション Ｃｈｊｍｅｒ５　Ｌ鎖発現プラスミドｐＩＮＧ３１３２およびＨ鎖発現プラスミ ドｐｌＮＧ３１２６を旦叩１制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｓ　ｐ２１０細 胞中に共トランスフェクションすることによりそれぞれ線状化し、ミコフェノー ル酸耐性クローンを得、これをＬ＋Ｈ鎖合成およびＧ４１８耐性に関してスクリ ーニングした。Ｌ十Ｈ饋の大部分を産生ずるＭＰ、Ａ−およびＧ４１８耐性クロ ーン５ｐ２１０−３１３２＋３１２６１Ｇ４をＣｈｉｍｅｒ５産生試験に用いた 。

４、組織培養において分泌されたＣ　ｈｉｍｅｒ５抗体の精製および試験５ｐ２ １０−３１３２＋３１２６１Ｇ４細胞を５％退治牛血清、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グ ルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（アービン・サイエンティフ ィック　アービンＣＡ）で補足した培地ＤＭＥＭ（ギブコ）中で生育させた。Ｃ ｈｉｍｅｒ５を実施例７においてＣｈｉｍｅｒ４に関して記載したのと同様の方 法で精製した。精製Ｃｈｉｍｅｒ５がマウス４Ｄ１２抗体の抗原結合性を保持す ることを示すために市販のＨＩＶウェスタンストリップ（デュポンまたは等価な もの）を用いてＣｈｉｍｅｒｌおよびＣｈｉｍｅｒ２、およびＣｈｉｍｅｒ４に 関して先に記載したように試験を行なった。Ｃｈｉｍｅｒ５およびマウス４Ｄ１ ２抗体は両方とも同一のＨＩ　Ｖｇａｇ抗原を認識した。

実施例１１ エシェリキア・コリにおいて産生されるＨＩＶ遡蛋白質特異性キメラマウス−ひ とＦａｂ 全コーディング配列がよく特質化されたプロモーターから発現されるので細菌は 哺乳類ｃＤＮＡから発現されるキメラ抗体の産生に適している。つぎの項にエシ ェリキア・コリ由来のＣｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂの分泌を詳細に記載する。

１、インビトロ突然変異誘発 部位特異的インビトロ突然変異誘発をクレイマーら（前掲のとおり）により記載 されているようにして行ない、Ｐ　ｓｔＩ制限部位を４Ｄ１２　Ｌ　１ＪｌｃＤ 　Ｎ　Ａ配列（第１８図）中オリゴヌクレオチドプライマー５−ＴＣＡＴＣＡＣ ＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡ−３’でリーダーペプチドおよ び成熟コーディング領域の接合点に導入した。

ΔｐａＩ部位を同様にオリゴヌクレオチドプライマー５’　−ＴＧＧＡＣＣＴＧ ＧＧＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’　（第１７図）でリーダーペプチドおよ び２Ｇ１２Ｌ鎖の成熟コーディング領域の接合点に導入した。

２、細菌発現のためのし鎖の調製 ｐｌＮＧ３１２８のＪ領域中シグナル配列プロセシング部位および独自のＨｉｎ ｄＩＩｒ部位にＰ　ｓｔＩ制限部位を含有する（　ｈｉｍｅｒ５　Ｌ鎖Ｖ領域− は細菌発現の出発点として機能した。プラスミドｐｌＮＧ３１２８をろｔＩで切 断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄｌＩＩで消化した（第２１Ａ図）。

■Ｌ領領域含有する３２０ｂｐフラグメントを精製し、ｐｌＮＧ１５００に連結 し、Ｓ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ｐＩＮＧ３１０２由来の ３°ゲノムＤＮＡのひとＣに＋１５ヌクレオチドｐｌＮＧ３】０２（第２１Ｃ図 ）を含有するＨｉｎｄＩＩｒからＸ　ｈｏＩ制限フラグメントと、＼ｈｏＴで切 断した。得られたｐｅｌＢ：・Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｌ鎖融合を含有するプラスミド を配列決定して、適切なインフレ−ム融合物が形成されたことを決定した。この プラスミドはｐｌＮＧ３１３３と呼ばれる。

３、細菌発現用のＦｄの調製 ｐＩＮＧ３１２９のＪ領域中シグナル配列プロセッンング部位および旦５ｔＥＩ Ｉ制限部位にΔｐａＩ制限部位を含有する完全なＣｈｉｍｅｒ５キメラＦｄ遺伝 子は細菌発現の開始点として機能する。プラスミドｐｌＮＧ　３１２９をＡｐａ ｌで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＢｓｔＥＩＩで消化した（第２１Ｄ図 ）。Ｆｄ〜７領域を含有する約３３５ｂｐフラグメントを精製し、Ｊ）ＩＮＧ１ ５００に連結し、これをＳ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｘｈ ｏＩ　（第２１Ｅ図）でひとＣＨＩ領域（終止コドンを蝶番部分に導入すること によりあらかじめ生成させた、ロビンソン、アール・アールら、前掲のとおり） に添ってｐＦ３Ｄ　（第２１Ｆ図）から切断した。ｐｅｌ　Ｂ　：　Ｃｈｉｍｅ ｒ５　Ｆ　ｄ融合を含有する得られたプラスミドを配列決定して適切なインフレ ーム融合物が形成されたことを確かめた。このプラスミドをｐｌＮＧ３１３１と 呼ぶ。

４、Ｌ鎮およびＦｄ遺伝子のマルチシストロン性発現系細菌由来のＦａｂの生成 の場合、Ｌ鎖およびＦｄ遺伝子の両方を細胞内で同時に生成する必要がある。こ れらの遺伝子をそれぞれ別々に用いて構築したプラスミドを用いて、一連の発現 ベクターを１つのプロモーターが両方の遺伝子を特定するように並んだ両方の遺 伝子を含有するように構築した。これを２つの遺伝子間の非コーディングＤＮＡ を最小にするような方法で行なった。各遺伝子は翻訳開始に必要なりホソーム結 合部位および−４８からｐｅｌ　Ｂリーダー：：抗体遺伝子接合点までの同一の ＤＮＡ配列を有する。

プラスミドｐＩＮＧ３１３３を５ｐｈＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、 Ｅ　ｃｏＲＩで切断し、ベクターフラグメントを精製した（第２１Ｇ図）。同様 に、プラスミドｐｌＮＧ３１３２をＸ　ｈｏＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処 理し、ＥｃｏＲＩで切断し、Ｆｄ遺伝子を含有するフラグメントを精製した（第 ２１Ｈ図）。これらの２つの精製されたＤＮＡフラグメントを連結してｐｌＮＧ ３１３６を生成し、これは結合した２つの緊密に結合したＣ　ｈｉｍｅｒ５遺伝 子融合を含有していた。２遺伝子シストロンをａｒａ　Ｂプロモーターの制御下 にｐＩＮＧ３１０７中に配置で処理し、）（ｈｏＩで切断し、Ｆｄおよびに遺伝 子を含有するフラグメントを精製した（第２１Ｉ図）。このＤＮＡフラグメント をあらがじプラスミドルｌＮＧ３１０フ由来のベクターフラグメントと連結し、 ｐｌＮ　Ｇ　３］３９を産生した。このベクターはエシェリキア・コリにおける Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂの発現に関する必要な特性をすべて有する。

５　細菌中のＣｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂの生成エシェリキア・コリにおけるｐＩＮ Ｇ３１３９由来のＣｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂノ発現はａｒａＢプロモーターの誘発 制御下にある。アラビノース誘発により、生育培地中に分泌されるＦａｂは１０ 培以上に増加する。ｐｌＮＧ３１３９を含有するエシェリキア・コリ種を、炭素 源として１７％グリセリンで補足した１０リツトルの最小培地中３２℃にて培養 した。

グリセリン補足最小培地の５倍濃縮物（ａ縮物３リットル中２０ｇのアラビノー スを含有する）を添加することにより溶解酸素を２０％に維持した。培地を濃縮 物２リツトルに対して５ｇのアラビノースを含有するグリセリンで補足した最小 培地を添加することにより、５倍濃縮物を０Ｄｓｏｏ＝５０に誘発した。誘発溶 液を２０時間がけて添加し、つぎに最小培地を含有しない５倍濃縮物を約４時間 で添加した。ＦａｂをＥＬＩＳＡにより発酵ブロス中で検出した。

約７リツトルの培養上清を濃縮し、分析し、実施例２と同様に貯蔵した。

エシェリキア・コリから精製したＣｈｉｍｅｒ５　ＦａｂはＳＤＳゲル電気泳動 で評価したところエシェリキア・コリから産生じた他のＦａｂ分子と同一の分子 量特性を有していた。Ｆａｂはそのエンザイムイムー　ノアッセイ検出分子中に およびＦｄ両方の決定基との正反応のため、また市販の試験片と反応するので、 に十Ｆｄ鎖二量体として正しく組み立てらでいる。

５、Ｃｈｉｍｅｒ５Ｆａｂに関する考察Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｆ　ａｂをＣｈｉｍｅ ｒ４Ｄ１２抗体マウス抗体およびＣｈｉｍｅｒ５抗体を用いて市販のＨＩ　Ｖウ ェスタンイムノプロット試験片（デュポン又は同等のもの）に固定された抗原へ の結合性に関して試験した。

Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｆ　ａｂを試験片と共に培養し、続いてヤギ坑ひとＦａｂ抗体 、次にウサギ坑ヤギＩｇＧと反応させた。結合抗体の検出をプロティンＡ−金（ バイオラド）、続いて銀促進で行なった。Ｃｈｉｍｅｒ５全抗体と同様に、Ｃｈ ｉｍｅｒ５　Ｆ　ａｂは試験片上同寸法の抗原５５．４５、および３９ｋ　Ｄを 特異的に認識した。

実施例１２ 酵母において産生されるＨ　Ｉ　Ｖ河蛋白質特異性キメラマウス−ひとＦａｂフ ラグメント 酵母細胞は外来蛋白質を発現することができる。本実施例においては、酵母はマ ウス−ひとキメラＦａｂの産生の宿主として機能した。

酵母種および生育条件は実施例３と同様である。

１、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築４Ｄ１２のＶＬ領領域成熟 形をコード化し、Ｊ領域のＨｉｎｄＩＩＩ部位（実施例１１に記載のとおり）お よびシグナル配列プロセ・ソンング部融合した。プラスミドｐｌＮＧ３１２８を Ｐ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。

■領域フラグメントをｐｌＮＧ３１０２から調製したひとＣＬ領領域ともにＨ１ ｎｄＩＩＩからＸ　ｈｏＩフラグメントとしてｐｌＮＧ１１４９中に連結した。

プラスミドｐｌＮＧ１１４９は酵母ＰＧＫプロモーター（ヒララマン、アール・ エイら、前掲のとおり）の制御下、酵母インベルターゼシグナル配列（タウンッ ヒ、アールら、前掲のとおり）をコード化する遺伝子配列を含有する。

得られたプラスミドｐｌＮＧ３１３４（第６Ａ図に類似）はインベルターゼシグ ナル配列（Ｓ）と共にＣｈｉｍｅｒ５コーディング配列と融合したＰＧＫプロモ ーター（Ｐ）を含有する。この融合の結果、Ｃｈｉｍｅｒ５Ｌ鎮の成熟形をコー ド化する遺伝子配列をインフレームに酵母インベルターゼシグナル配列をコード 化する遺伝子配列と融合した。ＰＧＫプロモーター　−インベルターゼシグナル 配列　−キメラＬ鎖（■、Ｃに）融合物を、２ミクロン円（２μ）、ＰＧＫポリ アデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有する塁３酵母発現ベクターの一部中にクロー ン化してｐｌＮＧ３１４０（第６Ｃ図に類似）を産生じた。Ｊ領域（実施例１１ に記載のとおり）中ＢｓｔＥＩＩおよびＩ）ＩＮＧ３１２９由来するＣ　ｈｉｍ ｅｒ５のＶ。領域の成熟形をコード化する遺伝子配列をｐＦ３Ｄ由来のひとＣＨ Ｉ領域（蝶番部分に終始コドンを導入することによりあらかじめ産生、ロビンソ ン、アール・アールら、前掲のとおり）とともにＰ　ｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリ メラーゼで処理し、Ｘｈｏｌで切断したｐＩＮＧ１１４９中に融合した。これは プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ３１３５を産生した。ＰＧＫプロモーター　−インベ ルターゼシグナル配列−キメラＦｄ鎮（■、Ｃ，１）融合を、２ミクロン円（２ μ）、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含有するｕｒａ３酵母発現ベク ターの一部中にクローン化してｐｌＮＧ３１４１（第６Ｄ図に類似）を産生じた 。

キメラＬ鎖およびＦｄ鎖遺伝子の両方およびその各々の発現シグナルを含有する １つの酵母発現ベクターをｐＩＮＧ３１４０およびｐｌＮＧ３１４１から構築し た。この最終ベクターｐＩＮＧ３１４３　（第６Ｅ図）は２ミクロン円（ｏｒｉ ＹＳＲＥ　Ｐ３）、および２つの選択マーカー］ｅｕ２ｄおよび史上３を含有す る。

２、　Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂ（Ｄ酵母分泌プラスミドルｌＮＧ３１４３をサツ カロミセス・セレビシェＰＳＳ中に形質転換し、形質転換体を前記の選択条件下 にブロス中で生育させた。形質転換された酵母培養物は培地中にＣｈｉｍｅｒ４ 　Ｆａｂを分泌し、この物質を発酵ブロスから精製し、これは実施例３に記載し たように産生されるＦａｂの性質と同一の性質を有することが期待される。

即ち酵母Ｃｈｉｍｅｒ５　Ｆａｂはエンエリキア・コリにおいて産生されるＦａ ｂと同じ結合特異性を有することが期待される。

結論 、前記の実施例により、本発明のＣｈｉｍｅｒｌ、Ｃｈｉｍｅｒ２、Ｃｈｉｍｅ ｒ４、およびＣｈｉｍｅｒ＋抗体および遺伝し操作されたフラグメントおよびそ の誘導体の多くの重要な性質が示される。まず、キメラ抗体、フラグメントおよ び誘導体は母細胞マウスｍＡｂと同じ抗原に結合する。

これはＨＩＶの溶解物で調製したウェスタンイムノプロット試験片にキメラ抗体 、フラグメントおよび誘導体が直接結合することにより証明される。

今日まで、ＨＩ　Ｖに感染した患者の治療のための抗体療法の試験は非常に限ら れていた。これらの患者のためた高力価ひと血清での受身免疫によりある程度臨 床的進歩が得られた。マウスｍＡｂでの直接療法は、マウス抗体がそれ自身に対 して強い免疫応答を示すことが知られているので実行されにくい。本発明のキメ ラ抗体はＨＩ　Ｖ感染の治療に潜在的に重要な薬剤の代表である。Ｃｈｉｍｅｒ ｌ、Ｃｈｉｍｅｒ２、Ｃｈｉｍｅｒ４、およびＣｈｉｍｅｒ５などの抗体又は対 応するフラグメントおよび誘導体は、単独、免疫複合体、又はたの薬剤と組み合 わせてＨＩＶ治療に有利に用いることができる。

本発明のキメラ抗体は、類似のマウス抗体又はその誘導体を用いることができる いかなる診断目的のためにも用いることができる。

さらに、キメラ抗体、フラグメントおよび誘導体をウィルス、ウィルス抗原、又 はウィルス感染細胞のエクスビボ吸収用の固定化試薬として用いることができる 。

キメラ抗体分子、たとえば本発明のキメラ抗体分子、およびその誘導体は、マウ スおよびひとｍ、Ａｂの有利な特性の組み谷わせを具体化するものである。マウ スｍＡｂのように、これらはウィルス抗原を認識し、結合することができるが、 マウスｍＡｂと異なって、キメラ抗体の「ひと特異性」は抗体に体する免疫応答 の可能性を低減し、排除率が軽減されているため循環系において生存が延長され る。これらの性質は、主要マーカーに対するキメラ抗体を患者に導入した場合に 観察される（ロブグリオら、プロシーディングズ・サブ・ナショナル・アカデミ イ・サブ・サイエンシズ、ニー・ニス・エイ、８６・４２２０〜４２２４（１９ ８９））。

キメラ抗体のひと成分はひとエフェクター細胞又は補体と組み合わせてその目的 の例えばウィルス感染細胞の破壊を仲介する能力を高めることができる。さらに 本発明に開示された方法を用いて、あらゆる所望の抗体アイソタイプを特定の抗 原結合部位と結合させることができる。本発明は、抗体分子の１又はそれ以上の 領域を機能的に活性な形態で直接産生ずることもできる。

ＦＩＧ、６ａ　ＦｆＧ、６ｂ づ　「）　Ｃ）　消　（）　○　り　ｄ　○ｋ　ＩＩＩ／−Ｉ　Ｆ？１−ｒ１／ ＋＋１１ｆｉ　１１門”ｗ　／　ｆｆ１１　「リ　ｒ）　ω　ｒ）　ｎ　−「リ 　Ｃ）ＭＥ−ｔ（）　＋Ｅ−ｔ０　ｐ、：で冗ｔｅｒｍ 国際調査報告 ＰＣＴ；ＵＳ９０Ｉｎ５６：ｌ！？

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．２Ｅ１２、２Ｇ１２、１Ｃ１１および４Ｄ１２で示されるモノクローナル抗 体類からなる群から選ばれた抗体に由来する免疫グロブリン鎖の可変領域の少な くとも部分をコード化するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
2. ２．組換え体ＤＮＡ分子である請求項１記載の分子。
3. ３．２本鎖ＤＮＡ形である請求項２記載の分子。
4. ４．発現ビークルである請求項３記載の分子。
5. ５．ビークルがブラスミドである請求項４記載の分子。
6. ６．請求項１記載の分子で形質転換した原核生物宿主。
7. ７．細菌である請求項６記載の宿主。
8. ８．請求項１記載の分子で形質転換した真核生物宿主。
9. ９．酵母細胞またはほ乳類細胞である請求項８記載の宿主。
10. １０．免疫グロブリン鎖が重鎖である請求項１記載の分子。
11. １１．免疫グロブリン鎖が軽鎖である請求項１記載の分子。