PT966532E - Material biológico para o tratamento de um mamífero através da transferência de um gene de anticorpo e composição farmacêutica contendo o mesmo. - Google Patents

Description

ΡΕ0966532 ι DESCRIÇÃO "MATERIAL BIOLÓGICO PARA O TRATAMENTO DE DM MAMÍFERO ATRAVÉS DA TRANSFERÊNCIA DE UM GENE DE ANTICORPO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO O MESMO" 0 presente invento diz respeito à área da terapia génica, consistindo na transferência para as células de um individuo de pelo menos um gene codificador de uma proteína terapêutica. Mais particularmente, o invento diz respeito à transferência, para células que naturalmente não produzem anticorpos, de sequências de ácido nucleico contendo a totalidade, parte ou derivados de anticorpos terapêuticos implicando um composto proteico responsável pelo efeito terapêutico, de forma a que as células geneticamente modificadas pelas sequências de ácido nucleico e implantadas num individuo produzam e secretem na circulação sanguínea do referido individuo uma quantidade terapeuticamente eficaz destes anticorpos. A terapia génica consiste em corrigir a deficiência de um gene introduzindo, nas células onde a deficiência do referido gene é a causa de uma patologia, uma sequência de DNA portadora da informação genética que permite ultrapassar a deficiência. As perspectivas de aplicação da terapia génica no domínio das doenças genéticas são numerosas e pode-se citar, por exemplo, as 2 ΡΕ0966532 correcções de talassémias, da drepanocitose, os défices do metabolismo hepático, da mucoviscidose, das miopatias, etc... (W. F. Anderson, 256, 808, 1992; R. C. Mulligan, Science, 260, 926, 1993; D. Miller, Nature, 357, 455, 1992; R. Morgan e W. F. Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62, 191, 1993; B. Dodet, Biofutur, Maio 1992).

Mas a terapia génica permite igualmente lutar contra doenças que não se tratam exclusivamente de uma deficiência genética, tais como cancros ou infecções virais, ao introduzir nas células do órgão ou do tecido atingido um gene codificador de uma proteína ou RNA terapêutico. Tais substâncias terapêuticas são por exemplo citocinas, anticorpos intracelulares, variantes de proteínas virais, RNAs complementares da cadeia codificadora, ribozimas, etc....

As técnicas que permitem a introdução de informação genética nas células estão descritas na literatura. Pode-se, no entanto, considerar duas abordagens principais. A primeira consiste em introduzir a sequência de DNA portadora da informação genética directamente in vivo nas células dos órgãos ou tecidos alvo da terapia ou nas células de órgãos ou tecidos encarregues de produzir a substância terapêutica, quer na vizinhança do local de produção, quer de forma sistémica. A segunda, depende da terapia celular é designada 3 ΡΕ0966532 ex vivo, consiste em colher células de um indivíduo, modificar estas células in vitro, introduzindo a sequência de DNA portadora da informação genética que se pretende transferir, depois introduzir novamente as células modificadas no organismo do indivíduo. Esta estratégia terapêutica está por exemplo descrita na patente americana n° 5 399 346.

As sequências de DNA portadoras da informação genética que se pretende introduzir nas células estão associadas funcionalmente a sequências de DNA que permitem a sua expressão in vivo e podem apresentar-se sob diferentes formas: - No caso de uma transferência de gene directamente in vivo, de acordo com a primeira abordagem atrás referida, elas podem ser utilizadas sob a forma: - livre, ou seja transferidas sob a forma de DNA nu, como um plasmídeo ou um fragmento de restrição, principalmente pela injecção in vivo nas células, como descrito no pedido de patente internacional publicado com o número WO 90 11 092; - complexada ou associada a outras moléculas que favorecem a sua entrada nas células eucarióticas como a lipofectamina, transfectace, transfectam, polietilenimina, etc...; - incorporada num vector virai, o qual será introduzido directamente in vivo nas células do órgão ou do tecido alvo através de infecção. 4 ΡΕ0966532 - No caso de uma transferência de genes de acordo com a segunda abordagem anteriormente referida, dita ex vivo, a sequência de DNA é integrada in vitro nas células que são em seguida introduzidas no organismo do indivíduo; pode-se tratar então, por exemplo, de células de linhas hemato-poiéticas, linfócitos T, hepatócitos, etc... Neste caso, as células geneticamente modificada in vitro pela sequência de DNA, de acordo com as técnicas descritas atrás para a introdução directamente in vivo, podem ter sido colhidas do indivíduo a tratar ou serem provenientes de um outro ser humano ou animal como o porco (E. Cozzi e D.J.G. White, Nature Genetics, 1, 964-966, 1995) .

Entre as substâncias capazes de interferir com uma patologia, e que se procura produzir no organismo do doente para uma terapia génica, pode-se citar determinados antigénios ou anticorpos. A expressão de sequências de DNA codificadoras de proteínas antigénicas tem como objectivo permitir a produção, pelas células geneticamente modificadas com este DNA, de antigénios susceptíveis de induzir uma imunização no indivíduo. Tal estratégia de vacinação foi, por exemplo, realizada para diferentes agentes patogénicos, como seja o vírus da gripe (Tang, D., De Vit, M., e Johnston, Nature, 356, 152-154, 1992) . A produção in vitro de anticorpos, fragmentos de 5 ΡΕ0966532 anticorpos ou derivados de anticorpos, tais como anticorpos quiméricos, por engenharia genética em células eucarióticas foi igualmente já descrita, por exemplo nas patentes europeias publicadas com os números 120 694 e 125 023. A injecção de doentes com anticorpos terapêuticos tendo como alvo antigénios implicados numa patologia para neutralizar, quer directamente quer através de uma cascata de acontecimentos metabólicos ou imunitários, um dos agentes causadores da doença. Pode-se citar como exemplos de tais estratégias terapêuticas, o tratamento ou a prevenção de linfomas B (Yefenof, E., Picker, L.I., Scheuermann, R.N., Vitetta, E.S., Street, N.E., Tucker, T., Uhr, J.W., Current Opinion in Immunology, 5, 740-744, 1993). O pedido de patente internacional publicado com o número WO 94 29 446 descreve a expressão intracelular de sequências de DNA codificadoras de anticorpos. Esta abordagem permite considerar uma terapia génica da patologia directamente in vivo, implicando compostos celulares não acessíveis por métodos de vacinação tradicionais, ou baseada na produção in vivo de antigénios recombinantes. As sequências de DNA expressas pelas células geneticamente modificadas de acordo com o método descrito no pedido de patente internacional WO 94 29 446 são portanto essencialmente caracterizados pelo facto de compreenderem um gene de anticorpo modificado de forma a que o anticorpo não possa ser secretado O presente invento, pelo contrário, tem por ΡΕ0966532 objectivo realizar a expressão in vivo de genes de anticorpos pelas células que secretarão os referidos anticorpos na circulação sanguínea do mamífero portador das células geneticamente modificadas pelo gene do anticorpo.

Este invento baseia-se na evidência de que diversos tipos celulares, outros que não os produtores naturais de anticorpos, são capazes, após modificação genética, de produzir anticorpos de forma estável in vivo.

Com efeito, os plasmócitos, que são células especializadas na produção de anticorpos, constituem maus candidatos à produção de longa duração de anticorpos terapêuticos através da transferência de genes; os plasmócitos têm um tempo de vida reduzido, da ordem de alguns dias, e o facto de produzirem já um outro anticorpo pode conduzir a associações ou recombinações entre as cadeias do anticorpo naturalmente produzido e o anticorpo expresso pelo gene transferido, o que é altamente prejudicial para o efeito terapêutico procurado. É pois importante mostrar que estes tipos celulares não especializados na produção natural de anticorpos são susceptíveis de aceitar uma transferência de gene, expressar in vivo um anticorpo terapêutico e secretar níveis sustentados vantajosamente regulados de ancicorpos na circulação sanguínea de um mamífero.

Consequentemente, o presente invento diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma 7 ΡΕ0966532 célula de mamífero de um tipo celular que não produz naturalmente anticorpos, tais como os queratinócitos, os hepatócitos, os fibroblastos da pele, os mioblastos, as células endoteliais e as células das linhas hemato-poiéticas, geneticamente modificada in vitro por uma sequência de ácido nucleico, caracterizada por a referida sequência de ácido nucleico conter um gene de um anticorpo do tipo igG e elementos que asseguram a expressão in vivo do referido gene de anticorpo e a secreção na circulação sanguínea de um mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz deste anticorpo ou de um fragmento deste, pelas referidas células geneticamente modificadas.

Por sequência de ácido nucleico, entende-se também sequências de DNA ou RNA ou sequências contendo nucleótidos modificados. A sequência de ácidos nucleicos que entra na composição do invento compreende: - pelo menos um gene de anticorpo terapêutico, ou seja um gene codificador de um anticorpo nativo não modificado, portanto natural, ou um fragmento de anticorpo, tais como os fragmentos Fab ou F(ab)'2 ou os fragmentos ScFv, ou ainda um derivado de anticorpo, como seja um anticorpo quimérico ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo fundido com uma substância efectora, por exemplo uma toxina ou uma hormona; - pelo menos um elemento que assegura a expressão do gene ΡΕ0966532 anterior; tratam-se de sequências promotoras da transcrição colocadas a montante do gene do anticorpo e que controlam a sua expressão nas células que não produzem naturalmente anticorpos.

Para além do gene do anticorpo e do seu promotor, a sequência de ácidos nucleicos pode conter uma sequência de terminação da transcrição, situada a jusante do gene do anticorpo e que permite a secreção do produto do gene de anticorpo na circulação sanguínea do mamífero cujas células foram geneticamente modificadas pela sequência de ácidos nucleicos. 0 promotor utilizado pode ser qualquer promotor que permita uma expressão eficaz do gene que controla no tipo celular geneticamente modificado pela sequência de ácidos nucleicos. Pode assim ser um promotor virai, um promotor ubíquo ou específico de tecido ou ainda um promotor sintético. A composição do invento é constituída por células que não produzem naturalmente anticorpos, e que se apresentam sob uma forma que permite a sua incorporação no organismo de um mamífero, assim como eventualmente a sua cultura prévia, as referidas células sendo geneticamente modificadas por pelo menos uma sequência de ácido nucleico contendo um gene de anticorpo do tipo igG e elementos que asseguram a expressão in vivo do referido gene de anticorpo 9 ΡΕ0966532 e a secreção na circulação sanguínea de um mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz deste anticorpo ou de um fragmento do mesmo.

Este modo de realização pode ser concretizado segundo duas variantes:

No caso das células que não produzem naturalmente anticorpos e que entram na composição do invento serem provenientes do mamífero a tratar. Nesta variante, as células são preparadas por técnicas convencionais da biologia celular e molecular, como por exemplo, a partir de biópsias do doente a tratar, seguindo-se a modificação genética com a sequência de ácido nucleico portadora do gene do anticorpo, quer por transfecção quer por infecção com um vector como descrito atrás no caso de uma transferência de gene directamente in vivo. As composições farmacêuticas produzidas a partir deste material biológico são administradas de volta ao doente de onde as células foram colhidas. - No caso das células que não produzem naturalmente anticorpos que entram na composição do invento serem provenientes de um outro mamífero humano ou animal diferente do que será tratado. As células foram preparadas como na variante anterior. Nas células de origem humana, estas são provenientes de dadores compatíveis; no caso de células de origem não humana utiliza-se células animais geneticamente 10 ΡΕ0966532 modificadas, como o porco, tornadas compatíveis através de um enxerto de órgão.

As células anteriores apresentam-se sob uma forma que permite a sua implantação, através de qualquer meio conhecido, no organismo ou mamífero receptor. Por outro lado, podem-se apresentar sob uma forma que permite a sua cultura antes do enxerto. Pode ser usado qualquer suporte ou meio de cultura compatível com a sua administração e a sua incorporação no receptor, como por exemplo uma matriz do tipo descrito no pedido de patente europeia publicada com o número 378 576 respeitante a fibroblastos.

Pode-se escolher células que não produzem naturalmente anticorpos mas que possuem: - capacidade de poder secretar proteínas na circulação sanguínea de um mamífero; - uma longa duração de vida no organismo do mamífero, vantajosamente vários meses a vários anos ou até a vida inteira do doente.

Mais particularmente, estas células são escolhidas pela sua capacidade de aceitarem facilmente serem colhidas, modificadas geneticamente ex vivo e implantadas num mamífero.

Entre os tipos celulares que apresentam as cara-cterísticas anteriores, o invento tem por objectivo mais ΡΕ0966532 especificamente os queratinócitos, os hepatócitos, os fibroblastos da pele, os mioblastos, as células endoteliais e as células de linhagens hematopoiéticas.

Surpreendentemente, encontrou-se (Fenjves, E.S.,

Smith, J • f Zaradic, S., e Teichman, L.B., Human Gene Therapy, 5, 1241-1248, 1994) que os queratinócitos podem produzir de forma relativamente eficaz proteínas para o organismo e não só para o exterior. Por outro lado, a sua cultura é fácil e de rotina após vários anos nos serviços hospitalares dos enxertos de pele. A manipulação de hepatócitos é mais difícil que a dos queratinócitos. No entanto, foi demonstrado (Grossamn, M., Raper, S.E., Kozarsky, K., Stein, E.A., Engelhart, J.F., Miiller, D., Lupien, P.J., Wilson, J.M., Nature Genetics, 6, 335-341, 1994; Ferry, N., Duplessis, O., Houssin, D., Danos, 0., Heard J-M., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 88, 8277-8381, 1991) que os hepatócitos podem ser infectados por retrovirus recombinantes ex vivo e in vivo. A cultura e a transdução por retrovirus dos fibroblastos da pele são fáceis (Moullier, P., Maréchal, V., Danos, 0, Heard, J-M., Transplantation, 56, 427-432, 1993) . A manipulação de organóides está facilitada (Moulier et al., Nature Genetics, 4 Junho 1993, 154-159). Os fibroblastos apresentam a vantagem de serem facilmente colhidos de um indivíduo através de uma operação cirúrgica simples. Por outro lado, estão em preparação os protocolos ΡΕ0966532 de terapia génica para a correcção das deficiências lisossomais em crianças.

Os mioblastos, que são células musculares não diferenciadas, podem também ser purificados, e serão provavelmente utilizados sem modificação genética no quadro do tratamento de determinadas doenças degenerativas (Yao, S-N., Smith, K.J., e Kurachi, K., Gene Therapy, 1, 99-107, 1994) . A modificação genética das células endoteliais foi já realizada para produzir proteínas terapêuticas, por exemplo no pedido de patente internacional PCT publicado com o número WO 90 06997. As células endoteliais, que constituem a parede dos vasos sanguíneos, são portanto particularmente adaptadas para aplicação ao material biológico do invento, sendo a finalidade fazer secretar pelas células geneticamente modificadas os anticorpos na circulação sanguínea de um mamífero.

Outros tipos celulares podem ser considerados, tais como as células de linhas hematopoiéticas, desde que preencham as características definidas atrás. A composição do invento encontra a sua aplicação na preparação de composições farmacêuticas destinadas a tratar ou a prevenir as recaídas de cancros e as infecções ou disseminações virais, mais particularmente a SIDA. 13 ΡΕ0966532 0 cancro atinge cerca de uma pessoa em quatro nas populações ocidentais e os tratamentos actualmente disponíveis só são realmente satisfatórios para um em cada dois doentes.

As doenças virais graves atingem de forma cada vez mais importante as populações humanas, pensamos obviamente de forma particular no virus Hiv, para o qual ainda não existe qualquer tratamento eficaz para prevenir ou tratar a infecção. 0 material biológico do invento é importante por permitir considerar uma nova abordagem terapêutica destas doenças tão graves.

Efectivamente, no caso dos cancros, permite ao organismo dispor a longo prazo de anticorpos específicos das células tumorais, quer sejam citocidas, quer induzam a dormência celular. Este objectivo é conseguido usando sequências de ácido nucleico portadoras de um gene codificador de anticorpos dirigidos contra um antigénio específico de células tumorais.

No caso das infecções virais, o material biológico do invento permite ao organismo manter a longo prazo um nível basal de anticorpos neutralizantes para os vírus ou citocidas para as células infectadas. Este objectivo é atingido usando sequências de DNA codificadoras de anticorpos dirigidos contra um antigénio específico do vírus 14 ΡΕ0966532 responsável pela referida infecção ou contra um antigénio específico das células infectadas pelo referido vírus. A composição do invento pode conter, entre outros, veículos ou adjuvantes classicamente utilizados. As doses de células que entram nestas composições farmacêuticas estão adaptadas ao modo de administração utilizado, à patologia alvo, sequência de ácido nucleico usada e forma da sua apresentação, para induzir a produção e secreção de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo na circulação sanguínea do indivíduo tratado.

As células constituem um material biológico particularmente adaptado à preparação de composições farmacêuticas destinadas à terapia celular ex vivo de um indivíduo.

As células humanas anteriores, desde que não sejam provenientes do doente no qual são implantadas, ou células animais, são obviamente, antes da sua implantação, tratadas por todos os meios, físicos ou genéticos, conhecidos dos familiarizados com a matéria, para serem protegidas do sistema imunitário do doente que as recebe. 0 invento tem ainda como objectivo a utilização da composição farmacêutica anterior, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de cancros ou infecções virais. 15 ΡΕ0966532

Para além das características anteriores, o invento possui outras que surgirão no decurso da descrição que se segue e que se referem aos exemplos experimentais de realização e de produção do presente invento, sendo entendido que estes exemplos não constituirão qualquer limitação às reivindicações apensas.

Os trabalhos aqui relatados permitiram demonstrar que: - in vitro, células colhidas de um doente, modificáveis geneticamente ex vivo e reimplantáveis, que não produzem naturalmente anticorpos, são capazes de secretar anticorpos recombinantes conservando as propriedades dos anticorpos de origem, - pelo menos um dos tipos de células referidos é capaz de secretar in vivo anticorpos recombinantes mantendo as propriedades do anticorpo de origem, - o material biológico do invento não induz no organismo modificado qualquer resposta imunitária neutralizante do anticorpo recombinante. I- Definição do anticorpo recombinante. 0 modelo de anticorpo recombinante usado nas experiências de transferência de genes de anticorpos a seguir descritas é um anticorpo monoclonal anti-tiroglobulina humana (TglO) (Piechaczyk et ai., Hybridoma, vol. 4, 4, (1985), 361-367). A sua clonagem molecular e a ΡΕ0966532 caracterização funcional dos DNAs complementares da sua cadeia pesada foram efectuados como indicado a seguir. A tiroglobulina é uma glicoproteina iodada de alto peso molecular implicada na síntese, armazenamento e secreção das hormonas da tiróide T3 e T4 (Marriq, C., C. Arnaud, M. Rolland e S. Lissitzky, 1980. Eur. J. Biochem. 111:3347). Um anticorpo monoclonal de ratinho, designado daqui em diante TglO, dirigido contra uma região antigénica (região II) frequentemente reconhecida por anticorpos naturais nos doentes atingidos pela doença de Grave, da tiróidite de Hashimoto e carcinomas da tiróide, foi estabelecido pelos membros do laboratório CNRS UMR 9921 da Faculdade de farmácia de Montpellier, Avenue Charles Flahaut, 34060, Montpellier Cedex 01, França(Piechaczyk et al., Hybridoma, vol. 4, 4, (1985), 361-367). Os DNAs complementares das cadeias leves (kapa) e pesada (IgGl) do anticorpo TglO foram clonados no vector pSPORTl (Gibco/BRL) por técnicas convencionais de engenharia genética (Sambrook, J, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). As sequências nucleotídicas das partes variáveis das cadeias pesadas e leves que especificam cada uma das cadeias de anticorpos foram determinadas e estão apresentadas respectivamente nas figuras 1 e 2 em anexo. A clonagem e a sequenciação dos cDNAs do anticorpo TglO foram efectuadas no laboratório atrás referido. 17 ΡΕ0966532

Para a sua caracterização funcional, os cDNAs da cadeia leve e da cadeia pesada do anticorpo TglO foram clonados no vector retroviral pLXPXSN (Morgan, R.A., L. Couture, 0. Elroy-Stein, J. Ragheb, B. Moss e W.F. Anderson. 1992. Nucl. Acids Res 20:1293-199) de um lado e doutro da sequência IRES do poliovirus endógeno deste vector para formar os vectores PM130, individualmente a montante da sequência IRES para formar os vectores PM117 e PM124, como apresentado na figura 3 em anexo). As células simias COS-7 (ATCC CRL 1651) foram em seguida transfectadas pela técnica do fosfato de cálcio, quer por apenas PM130, quer pela combinação PM117-M124. A presença nos sobrenadantes da cultura de anticorpos que reagem com a tiroglobulina humana foi testada pela técnica de ELISA (Piechaczyk et al., Hybridoma, vol. 4, 4, (1985), 361-367). Por outro lado, as constantes cinéticas de associação e dissociação do anticorpo recombinante TglO, produzido pelas células COS-7, com a tiroglobulina foram determinadas a partir de sobrenadantes de cultura por ressonância plasmónica de superfície (Fagerstam, L.G., e R. Karlsson, 1993, Biosensor techniques. Em Immunochemistry. V. Oss e M. vanRegenmortel, eds. M Dekker Inc. p.949-970) seguindo a técnica Biacore desenvolvida pela sociedade Pharmaci Biosensor.

Os valores destas constantes estão descritas na tabela 1 abaixo. ΡΕ0966532 18

Tabela 1

Anticorpos Constante cinética de associação KondYTV1) Constante cinética de dissociação Koff (s-1) Constante de afinidade Ka Anticorpo TglO natural 4, 6±0,1 x 105 5, 3±0, 2 x 10~5 8, 6±0, 4 x 109 Anticorpo TglO re- combinante (PM117+PM124) 1, 4±0,3 x 105 4, 3±1, 0xl0~5 3,2±1,4 x 109 Anticorpo TglO re- combinante (PM117+PM124) 2,1±1,5 x 105 6, 0±0, 4 x 10~5 3,5+2,7 x 109 Cadeia pesada do anticorpo TglO re-combinante (PM117+PM124) 1,0±0,3 x 105 3, 0±0, 2 x 10~4 3,3+1,2 x 108

Surpreendentemente, a tabela 1 mostra que a cadeia pesada sintetizada sozinha a partir de PM124 é secretada pelas células COS-7 e reconhece a tiroglobulina humana com uma afinidade apenas 10 vezes inferior ao anticorpos completos. II- Linhas produtoras de retrovírus A maior parte das células primárias são extremamente sensíveis aos métodos de transfecção clássicos. Por outro lado, o tempo de vida, e portanto a expressão do DNA transfectado é em geral muito curta na maior parte das células transfectadas 19 ΡΕ0966532

Para permitir uma infecção eficaz de vários tipos de células e uma expressão de longa duração do anticorpo TglO nas células geneticamente modificadas, foi estabelecida uma linha celular produtora de retrovirus recom-binantes transportando e expressando os cDNAs do anticorpo TglO.

As células de montagem de retrovirus anfotrópicas PA 317 (Miller, D. e Buttimore, 1986, Molec. Cell Biol. 6, 2895-2902) foram transfectadas, pela técnica de precipitação com fosfato de cálcio, pelo vector retroviral PM130. Foram estabelecidos vários clones produtores estáveis. A linha PA130.10 foi utilizada para experiências de infecção posteriores. O título virai, doseado na linha indicadora NIH 3T3 (Miller, D. e Buttimore, 1986, Molec. Cell Biol. 6, 2895-2902) foi de 104 cfu/ml. III- Experiências in vitro

Os retrovirus produzidos pela linha PA130.10 foram usados para infectar diferentes linhas celulares estabelecidas, representativas de diferentes tipos celulares disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC) : - linha NIH3T3 de fibroblastos murinos; - linha A431 de queratinócitos humanos; - linha HpeG2 de hepatócitos humanos; linha C2C12 de mioblastos. 20 ΡΕ0966532

Foram obtidos diferentes clones celulares para cada tipo de transdução retroviral e o anticorpo TglO produzido no sobrenadante de cultura foi doseado por ELISA. Os resultados obtidos estão descritos na tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Linhas Anticorpos TglO Linha NIH3T3 88 +/- 65 ng/105 células/24 hrs Linha A431 3,5 +/- 6 ng/105 células /24 hrs Linha HepG2 3,5 + /- 1,5 ng/105 células /24 hrs Linha C2C12 2 +/- 0,6 ng/105 células /24 hrs

Por outro lado, no caso de mioblastos C2C12, diferenciados in vitro em miotubos, a produção é conservada.

As propriedades termodinâmicas e cinéticas dos anticorpos produzidos pelos diferentes tipos celulares, determinadas por ressonância plasmónica de superfície de acordo com a tecnologia BiAcore (Pharmacia Biosensor), revelaram-se idênticas às do anticorpo TglO de partida.

Os vectores retrovirais foram, numa segunda fase, utilizados para infectar fibroblastos primários de pele de ratinho (infecção retroviral) e de hepatócitos humanos (transfecção). As produções em anticorpos foram respec-tivamente de: - 10 a 20 ng/105 células/3 dias e - 1 a 10 ng/105 células/4 dias. 21 ΡΕ0966532

Desta forma, as características dos anticorpos produzidos foram as mesma dos anticorpos de partida. III- Experiência in vivo

As células C2C12 modificadas geneticamente e que conservam a capacidade de se diferenciar em miotubos foram implantadas por injecção nos membros inferiores de 4 ratinhos singeneicos C3H, numa proporção de 107 células por membro.

Em 3 dos 4 ratinhos, a produção e anticorpos re-combinantes conservou as propriedades termodinâmicas e a propriedade de reconhecimento do antigénio do anticorpo de partida foi seguida durante dois meses. A quantidade de anticorpos produzida foi regularmente aumentada relativamente ao nível basal até uma produção de cerca de 100 ng/ml de soro. V- Ausência de resposta imunitária neutralizadora do anticorpo recombinante.

Um dos objectivos essenciais do invento é produzir de forma sistémica um anticorpo recombinante, vantajosamente terapêutico, por células geneticamente modificadas de mamífero.

Um risco possível desta abordagem é a indução de 22 ΡΕ0966532 uma resposta imunitária por parte do organismo modificado, podendo levar à neutralização do anticorpo recombinante.

Este obstáculo foi descartado pelos resultados experimentais apresentados a seguir. 2 x 107 células miogénicas primárias expressando de forma estável o anticorpo monoclonal TglO, após transdução retroviral, foram implantadas ao nivel do tibialis anterior de ratinhos C3H.0 soro dos ratinhos foi obtido com intervalos de uma semana durante vários meses. A quantidade de anticorpo TglO secretado foi doseada pelo método de ELISA. Paralelamente, a quantidade de anticorpo anti-idiotipo foi determinada por ELISA.

Numa série de 5 ratinhos, a secreção de anticorpo TglO situa-se entre 100 e 300 ng/ml de soro durante 4 meses. Nestas condições não foi detectada qualquer resposta anti-idiotipo.

Lisboa, 19 de Junho de 2007

Claims (7)

1. ΡΕ0966532 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica, compreendendo pelo menos uma célula de mamífero de um tipo celular que não produz naturalmente anticorpos, como sejam queratinócitos, hepatócitos, fibroblastos da pele, mioblastos, células endoteliais e células de linhagens hematopoiéticas, geneticamente modificada in vitro por uma sequência de ácido nucleico, caracterizada por a referida sequência de ácido nucleico conter um gene de anticorpo do tipo IG e elementos que asseguram a expressão in vivo do referido gene do anticorpo e a secreção na circulação sanguínea de um mamífero, numa quantidade terapeuticamente eficaz deste anticorpo ou de um fragmento desde, pelas referidas células geneticamente modificadas.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por as célula que não produzem naturalmente anticorpos derivarem do mesmo mamífero a tratar ou de um outro mamífero diferente, tendo sofrido um tratamento que as torna compatíveis.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por as células que não produzem naturalmente anticorpos serem escolhidas entre as que possuem: 2 ΡΕ0966532 - capacidade de poder secretar proteínas na circulação sanguínea de um mamífero; - um longo tempo de vida no organismo de um mamífero, entre vários meses e vários anos até à vida inteira do doente.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o gene do anticorpo ser um gene codificador de um anticorpo nativo, um fragmento ou um derivado deste anticorpo, como seja um anticorpo quimérico.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido anticorpo, fragmento ou derivado do anticorpo ser dirigido contra um antigénio específico de células tumorais.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de cancros ou de infecções virais. Lisboa, 19 de Junho de 2007