JP2001515873A - Ｔ細胞活性化の調節におけるまたはそれに関する改良 - Google Patents
Ｔ細胞活性化の調節におけるまたはそれに関する改良Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞表面に存在する異なる密度の白血球刺激分子に対し、応答性の異なる白血球を生産する方法を開示する。該白血球は、細胞上の白血球刺激分子と白血球表面に存在する白血球活性化分子との間の相互作用によって活性化されるものである。この方法は、外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において白血球活性化分子の発現を誘導する核酸配列により白血球を形質転換すること、および該白血球がさらされる外因性因子の濃度を変化させることを含む。
Description
【０００１】
本発明は、とりわけ、標的抗原に対する白血球の感受性を変化させる方法に関
する。
する。
【０００２】
抗体分子とは異なって、Ｔ細胞は、微小血管の壁を通って活発にかつ効率的に
移動することができ、それらの細胞溶解作用を発揮する前に固体腫瘍の核に入り
込むことができる。自己由来の腫瘍応答性Ｔ細胞のエクスビボ（ex vivo）増殖 および再注入が、癌治療に対する実験的アプローチとして研究されている。しか
しながら、末梢血から循環するＴ細胞は腫瘍抗原に対する特異性に欠け（１）、
十分な数の腫瘍浸潤リンパ球を得ることは非実用的または不可能であることが多
い（２）。これらの問題を克服するために、抗体の特異性をＴ細胞の効率的な移
動特性およびエフェクター作用と組合せることができる新たなアプローチが開発
されている。いくつかの報告によると、Ｔ細胞を本来の抗原へと向かわせるため
の手段として一本鎖抗体ドメイン（ｓｃＦｖ）をＴＣＲ／ＣＤ３／ζ複合体の種
々のシグナリング部分に結合させるよう、キメラ受容体をコードする遺伝子で培
養Ｔ細胞を形質転換できる可能性が示されている（３−６）。しかしながら、こ
の「Ｔ体」アプローチが長期間臨床的に成功するかどうかは、明らかに、多くの
問題に対する解決策を見出すことにかかっている。
移動することができ、それらの細胞溶解作用を発揮する前に固体腫瘍の核に入り
込むことができる。自己由来の腫瘍応答性Ｔ細胞のエクスビボ（ex vivo）増殖 および再注入が、癌治療に対する実験的アプローチとして研究されている。しか
しながら、末梢血から循環するＴ細胞は腫瘍抗原に対する特異性に欠け（１）、
十分な数の腫瘍浸潤リンパ球を得ることは非実用的または不可能であることが多
い（２）。これらの問題を克服するために、抗体の特異性をＴ細胞の効率的な移
動特性およびエフェクター作用と組合せることができる新たなアプローチが開発
されている。いくつかの報告によると、Ｔ細胞を本来の抗原へと向かわせるため
の手段として一本鎖抗体ドメイン（ｓｃＦｖ）をＴＣＲ／ＣＤ３／ζ複合体の種
々のシグナリング部分に結合させるよう、キメラ受容体をコードする遺伝子で培
養Ｔ細胞を形質転換できる可能性が示されている（３−６）。しかしながら、こ
の「Ｔ体」アプローチが長期間臨床的に成功するかどうかは、明らかに、多くの
問題に対する解決策を見出すことにかかっている。
【０００３】 おそらく最も重要な課題は、真に腫瘍特異的な「癌抗原」がほとんどないため
（７）、腫瘍応答性Ｔ体による治療の成功は、低レベルの標的抗原を発現する正
常な組織に顕著な付帯的損傷をもたらし得るということである。したがって、Ｔ
細胞が、一時的または永久的にそれらの標的抗原に対してアネルギー性となり得
るよう、あるいは標的細胞膜における種々の表面密度の抗原に対して差別的に感
受性となり得るよう、戦略を開発するのが望ましい。
（７）、腫瘍応答性Ｔ体による治療の成功は、低レベルの標的抗原を発現する正
常な組織に顕著な付帯的損傷をもたらし得るということである。したがって、Ｔ
細胞が、一時的または永久的にそれらの標的抗原に対してアネルギー性となり得
るよう、あるいは標的細胞膜における種々の表面密度の抗原に対して差別的に感
受性となり得るよう、戦略を開発するのが望ましい。
【０００４】 真核細胞において導入遺伝子の発現を調節するために種々の戦略が開発されて
いる（８）が、テトラサイクリンにより調節可能な系（ＴＲＳ）は、哺乳類の細
胞においてほとんどまたは全く毒性を生じさせないテトラサイクリン濃度に応じ
て導入遺伝子の発現を実質的に調節することにより、これらの系の多くに関する
問題を回避している（９、１０）。
いる（８）が、テトラサイクリンにより調節可能な系（ＴＲＳ）は、哺乳類の細
胞においてほとんどまたは全く毒性を生じさせないテトラサイクリン濃度に応じ
て導入遺伝子の発現を実質的に調節することにより、これらの系の多くに関する
問題を回避している（９、１０）。
【０００５】 MillerおよびWhelan（1997 Hum. Gene Therapy 8,803-815）は、最近、遺伝子
治療に関する調節可能なベクターの開発に向けての進展を論評している。これら
のベクターの中にも、ＴＲＳを用いるものが記載されている。
治療に関する調節可能なベクターの開発に向けての進展を論評している。これら
のベクターの中にも、ＴＲＳを用いるものが記載されている。
【０００６】 もともとGossenおよびBujard（1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5547-55
51）によって記述されたＴＲＳでは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質
をヘルペス・シンプレックス・ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６−活性化ドメインに
融合させてキメラのテトラサイクリン抑制性トランス活性化（ｔＴＡ）ポリペプ
チドを生成させ、これがｔｅｔオペレーター配列からなるＤＮＡに結合してオペ
レーター下流のコード配列の転写活性をもたらす。テトラサイクリンまたはその
類似体（ドキシサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ミノサイクリンおよ
びオキシテトラサイクリンなど）の存在はこの転写活性を阻害する。これらの化
合物が、ｔＴＡポリペプチドに結合してそのコンホメーションを変化させ、該ポ
リペプチドがｔｅｔオペレーター配列に結合するのを妨げるからである。
51）によって記述されたＴＲＳでは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質
をヘルペス・シンプレックス・ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６−活性化ドメインに
融合させてキメラのテトラサイクリン抑制性トランス活性化（ｔＴＡ）ポリペプ
チドを生成させ、これがｔｅｔオペレーター配列からなるＤＮＡに結合してオペ
レーター下流のコード配列の転写活性をもたらす。テトラサイクリンまたはその
類似体（ドキシサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ミノサイクリンおよ
びオキシテトラサイクリンなど）の存在はこの転写活性を阻害する。これらの化
合物が、ｔＴＡポリペプチドに結合してそのコンホメーションを変化させ、該ポ
リペプチドがｔｅｔオペレーター配列に結合するのを妨げるからである。
【０００７】 元のＴＲＳの変異体も開示されており（ＷＯ９６／０１３１３）、そこにおい
てｔｅｔリプレッサータンパク質の変異体形は、テトラサイクリンまたはその類
似体の存在下でＤＮＡに結合する一方、不在下では結合しない。よって、これら
の系では、ｔｅｔオペレーターに結合した遺伝子の発現はテトラサイクリンまた
はその類似体の存在下で積極的に調節される。
てｔｅｔリプレッサータンパク質の変異体形は、テトラサイクリンまたはその類
似体の存在下でＤＮＡに結合する一方、不在下では結合しない。よって、これら
の系では、ｔｅｔオペレーターに結合した遺伝子の発現はテトラサイクリンまた
はその類似体の存在下で積極的に調節される。
【０００８】 しかしながら、ＴＲＳの使用に関していくつかの難題および／または不確実な
点がある。たとえば、Cooke他（1997 J. Gen. Virol. 78,381-392）は、ＴＲＳ が、ヒトのＴ細胞系Jurkat Ｅ６−１におけるｎｅｆ遺伝子発現の調節に使用で きないことを見出した。さらに、ＨＳＶ ＶＰ１６ドメインは有害な「押え込み
」作用を伴うため、従来、高レベルの調節を得ることができなかった。最近の論
評（MillerおよびWhelan、1997 Hum. Gene Ther. 8,803-815）によると、ＴＲＳ
は「すべての細胞系に適用可能とは言えない」（Ackland-BerglundおよびLeib 1
995 Bio Techniques 18,196-200、ならびにHowe他、 1995 J. Biol. Chem. 270,
14168-14174の研究を引用）。
点がある。たとえば、Cooke他（1997 J. Gen. Virol. 78,381-392）は、ＴＲＳ が、ヒトのＴ細胞系Jurkat Ｅ６−１におけるｎｅｆ遺伝子発現の調節に使用で きないことを見出した。さらに、ＨＳＶ ＶＰ１６ドメインは有害な「押え込み
」作用を伴うため、従来、高レベルの調節を得ることができなかった。最近の論
評（MillerおよびWhelan、1997 Hum. Gene Ther. 8,803-815）によると、ＴＲＳ
は「すべての細胞系に適用可能とは言えない」（Ackland-BerglundおよびLeib 1
995 Bio Techniques 18,196-200、ならびにHowe他、 1995 J. Biol. Chem. 270,
14168-14174の研究を引用）。
【０００９】
第１の局面において、本発明は、細胞表面に存在する異なる密度の白血球刺激
分子に対して反応性が異なる（差別的な）白血球を生産する方法を提供する。こ
こで、白血球は、細胞上の白血球刺激分子と白血球の表面上に存在する白血球活
性化分子との間の相互作用によって活性化されるものである。本発明によるこの
方法は、外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において白血球活性化分子
の発現を誘導する核酸配列で白血球を形質転換すること、および白血球がさらさ
れる外因性作用因子の濃度を変化させることを含む。典型的には、外因性作用因
子は以下に説明するように「調節薬剤」であり、白血球活性化分子の発現を誘導
する核酸配列は、薬剤により調節可能なプロモーターに作動可能に結合されてい
る。
分子に対して反応性が異なる（差別的な）白血球を生産する方法を提供する。こ
こで、白血球は、細胞上の白血球刺激分子と白血球の表面上に存在する白血球活
性化分子との間の相互作用によって活性化されるものである。本発明によるこの
方法は、外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において白血球活性化分子
の発現を誘導する核酸配列で白血球を形質転換すること、および白血球がさらさ
れる外因性作用因子の濃度を変化させることを含む。典型的には、外因性作用因
子は以下に説明するように「調節薬剤」であり、白血球活性化分子の発現を誘導
する核酸配列は、薬剤により調節可能なプロモーターに作動可能に結合されてい
る。
【００１０】 外因性作用因子は、白血球活性化分子の発現に、好ましくは選択的、特異的な
態様で、影響を及ぼす任意の作用因子であり得る。外因性作用因子は、ヒトの患
者に薬理学的な態様で投与できるものが好ましく、たとえば、当該作用因子は、
患者に何らかの顕著な毒性作用をもたらす濃度よりも低い濃度で白血球活性化分
子の発現に適当な作用を及ぼすものである。たとえば、白血球活性化分子は、以
下に十分述べるように、調節可能な態様で（たとえばｔｅｔ Ｏ配列およびｔｅ
ｔ感受性トランスアクチベーターを用いて）発現されるのが好ましい。この具体
例において、外因性作用因子はテトラサイクインまたはその類似体とすることが
できる。
態様で、影響を及ぼす任意の作用因子であり得る。外因性作用因子は、ヒトの患
者に薬理学的な態様で投与できるものが好ましく、たとえば、当該作用因子は、
患者に何らかの顕著な毒性作用をもたらす濃度よりも低い濃度で白血球活性化分
子の発現に適当な作用を及ぼすものである。たとえば、白血球活性化分子は、以
下に十分述べるように、調節可能な態様で（たとえばｔｅｔ Ｏ配列およびｔｅ
ｔ感受性トランスアクチベーターを用いて）発現されるのが好ましい。この具体
例において、外因性作用因子はテトラサイクインまたはその類似体とすることが
できる。
【００１１】 白血球活性化分子を外因性作用因子に対し濃度感受性である態様で発現させる
便利な方法は、好適な「調節薬剤」を外因性作用因子として選択し、白血球活性
化分子をコードする配列を、薬剤により調節可能なプロモーターの制御下に配置
することである。該プロモーターの活性は、薬剤の濃度によって直接的または間
接的に制御される。「薬剤により調節可能なプロモーター」という用語は、核酸
の部分（たとえばエンハンサーまたはより好ましくはプロモーター）であって、
細胞に対して外因性の物質（「調節薬剤」）の存在に応答して核酸のコード領域
の発現を調節する部分を示すことを意図する。調節薬剤は、当該核酸が存在する
細胞に対して致命的でない濃度において、薬剤により調節可能なプロモーターの
活性の変化を引き起こすものである。調節薬剤の作用は、薬剤により調節可能な
プロモーターに対して実質的に特異的であることが好ましく、それにより、この
薬剤を患者に投与する必要がある場合、他の組織または細胞型に対し広範囲な作
用が引き起こされることがなくなる。このような特異性は、合成した調節薬剤の
使用、およびヒトまたは動物の対象に通常存在しない、薬剤により調節可能な対
応のプロモーターの使用により、非常に容易に与えられる。薬剤により調節可能
なプロモーターは、直接的に薬剤により調節可能であるか、またはより典型的に
は、間接的に薬剤により調節可能であり得る。間接的に薬剤により調節可能なプ
ロモーターを含む系の一例は、薬剤により調節可能なオペレーターがプロモータ
ーに対して調節作用を及ぼし、この作用が調節薬剤の濃度に依存するという系で
ある。
便利な方法は、好適な「調節薬剤」を外因性作用因子として選択し、白血球活性
化分子をコードする配列を、薬剤により調節可能なプロモーターの制御下に配置
することである。該プロモーターの活性は、薬剤の濃度によって直接的または間
接的に制御される。「薬剤により調節可能なプロモーター」という用語は、核酸
の部分（たとえばエンハンサーまたはより好ましくはプロモーター）であって、
細胞に対して外因性の物質（「調節薬剤」）の存在に応答して核酸のコード領域
の発現を調節する部分を示すことを意図する。調節薬剤は、当該核酸が存在する
細胞に対して致命的でない濃度において、薬剤により調節可能なプロモーターの
活性の変化を引き起こすものである。調節薬剤の作用は、薬剤により調節可能な
プロモーターに対して実質的に特異的であることが好ましく、それにより、この
薬剤を患者に投与する必要がある場合、他の組織または細胞型に対し広範囲な作
用が引き起こされることがなくなる。このような特異性は、合成した調節薬剤の
使用、およびヒトまたは動物の対象に通常存在しない、薬剤により調節可能な対
応のプロモーターの使用により、非常に容易に与えられる。薬剤により調節可能
なプロモーターは、直接的に薬剤により調節可能であるか、またはより典型的に
は、間接的に薬剤により調節可能であり得る。間接的に薬剤により調節可能なプ
ロモーターを含む系の一例は、薬剤により調節可能なオペレーターがプロモータ
ーに対して調節作用を及ぼし、この作用が調節薬剤の濃度に依存するという系で
ある。
【００１２】 薬剤により調節可能なプロモーターおよび対応する調節薬剤の適当な種々のも
のが知られており（たとえば、MillerおよびWhelan, Hum. Gene Ther. 8,803-81
5を参照）、それらは、グルココルチコイドステロイド類、性ホルモンステロイ ド類、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
によって調節されるプロモーターを含む。対応の薬剤の適当な濃度は、当業者に
明らかである。一般的な指針として、細胞をステロイド類の存在下においてイン
ビトロで培養するとき、ステロイド剤の好ましい濃度は１ｎＭから１ｍＭである
。このステロイド剤をインビボでヒトまたは動物の対象に投与するとき、約０．
０５と１０．０μｇ／ｋｇの間の血清濃度を達成するようにその用量を調節する
のが望ましい。細胞をＩＰＴＧの存在下で培養するとき、その用量は１μＭから
１００ｍＭの範囲にあるのが好ましく、１００μＭから１ｍＭの範囲にあるのが
より好ましい。細胞をＬＰＳの存在下で培養するとき、用量は０．１ｎＭから１
ｍＭの範囲にあるのが好都合であり、１００μＭから１ｍＭの範囲内にあるのが
より望ましい。
のが知られており（たとえば、MillerおよびWhelan, Hum. Gene Ther. 8,803-81
5を参照）、それらは、グルココルチコイドステロイド類、性ホルモンステロイ ド類、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
によって調節されるプロモーターを含む。対応の薬剤の適当な濃度は、当業者に
明らかである。一般的な指針として、細胞をステロイド類の存在下においてイン
ビトロで培養するとき、ステロイド剤の好ましい濃度は１ｎＭから１ｍＭである
。このステロイド剤をインビボでヒトまたは動物の対象に投与するとき、約０．
０５と１０．０μｇ／ｋｇの間の血清濃度を達成するようにその用量を調節する
のが望ましい。細胞をＩＰＴＧの存在下で培養するとき、その用量は１μＭから
１００ｍＭの範囲にあるのが好ましく、１００μＭから１ｍＭの範囲にあるのが
より好ましい。細胞をＬＰＳの存在下で培養するとき、用量は０．１ｎＭから１
ｍＭの範囲にあるのが好都合であり、１００μＭから１ｍＭの範囲内にあるのが
より望ましい。
【００１３】 本発明の方法を適用するにあたって特に有用な別の系は、テトラサイクリンに
より調節可能な系（ＴＲＳ）である。これは広範囲にわたって研究されており、
その変形例もいくつか開発されており、ＴＲＳを非常に適合性の高いものにして
いる。たとえば、テトラサイクリンの不在下では、野生型細菌性ｔｅｔリプレッ
サータンパク質が、細菌性テトラサイクリン耐性遺伝子の負の調節をもたらす。
テトラサイクリンはリプレッサータンパク質に結合し、それがｔｅｔオペレータ
ーＤＮＡ配列に結合するのを抑制し、よって耐性遺伝子の発現が可能となる。逆
に、ｔｅｔリプレッサーの部分を含むキメラポリペプチドおよびＨＳＶ ＶＰ１
６トランス活性化ドメインは、コード配列の正の調節（転写活性）を引き起こす
。他のトランス活性化ドメインも当業者に知られており（たとえばＧＡＬ４のア
ミノ酸残基７５３−８８１、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９、お
よびＩＴＦ１またはＩＴＦ２からのもの）、これらは、キメラのテトラサイクリ
ン感受性ポリペプチドを形成するのに用いられ得ると考えられる。
より調節可能な系（ＴＲＳ）である。これは広範囲にわたって研究されており、
その変形例もいくつか開発されており、ＴＲＳを非常に適合性の高いものにして
いる。たとえば、テトラサイクリンの不在下では、野生型細菌性ｔｅｔリプレッ
サータンパク質が、細菌性テトラサイクリン耐性遺伝子の負の調節をもたらす。
テトラサイクリンはリプレッサータンパク質に結合し、それがｔｅｔオペレータ
ーＤＮＡ配列に結合するのを抑制し、よって耐性遺伝子の発現が可能となる。逆
に、ｔｅｔリプレッサーの部分を含むキメラポリペプチドおよびＨＳＶ ＶＰ１
６トランス活性化ドメインは、コード配列の正の調節（転写活性）を引き起こす
。他のトランス活性化ドメインも当業者に知られており（たとえばＧＡＬ４のア
ミノ酸残基７５３−８８１、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９、お
よびＩＴＦ１またはＩＴＦ２からのもの）、これらは、キメラのテトラサイクリ
ン感受性ポリペプチドを形成するのに用いられ得ると考えられる。
【００１４】 野生型ｔｅｔリプレッサータンパク質の一部を含む従来技術（たとえば上記に
引用したGossenおよびBujard（1992年））に記載のキメラポリペプチドに加えて
、ｔｅｔリプレッサータンパク質の変異形を含む他のポリペプチドも知られてお
り（ＷＯ９６／０１３１３に開示）、これはテトラサイクリンの存在下でｔｅｔ
オペレーター配列に結合する一方、テトラサイクリンの不在下では該配列に結合
しない。
引用したGossenおよびBujard（1992年））に記載のキメラポリペプチドに加えて
、ｔｅｔリプレッサータンパク質の変異形を含む他のポリペプチドも知られてお
り（ＷＯ９６／０１３１３に開示）、これはテトラサイクリンの存在下でｔｅｔ
オペレーター配列に結合する一方、テトラサイクリンの不在下では該配列に結合
しない。
【００１５】 かくして、本発明の方法は、いくつかの具体例において、テトラサイクリンの
存在がテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）に結合されたコード配列（す
なわち免疫原性ポリペプチドをコードする配列）の発現を阻害する役割を果たす
ものであり、他の具体例において、テトラサイクリンの存在がｔｏｔＯに結合さ
れた配列の発現を促進する役割を果たすものである。
存在がテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）に結合されたコード配列（す
なわち免疫原性ポリペプチドをコードする配列）の発現を阻害する役割を果たす
ものであり、他の具体例において、テトラサイクリンの存在がｔｏｔＯに結合さ
れた配列の発現を促進する役割を果たすものである。
【００１６】 当業者には、多くのテトラサイクリン類似体が知られており、それらが本発明
の方法においてテトラサイクリンに容易に取って代わり得るものであることがわ
かる。確かに、ある特定の類似体が実際にテトラサイクリンより好ましいことも
ある。それらが（テトラサイクリン感受性ポリペプチドに対して）より高い結合
アフィニティーを有し得るので、より低い濃度で調節作用を発揮することができ
るからである。テトラサイクリン類似体は、テトラサイクリンに構造的に関連し
、少なくとも約１０6Ｍ-1、好ましくは１０9Ｍ-1、またはそれより大きいＫaで ｔｅｔリプレッサーに結合する分子をいうものとして理解され得る。好ましい類
似体はドキシサイクリンおよびアンヒドロテトラサイクリンである。その他の類
似体は、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、
エピオキシテトラサイクリンおよびシアノテトラサイクリンを含む。テトラサイ
クリンの他の類似体については、HlavkaおよびBoothe（Handbook of Experiment
al Pharmacology 78、Blackwoodら（eds.）、Springer verlag（1985年）中の「
The Tetracyclines」）により述べられている。
の方法においてテトラサイクリンに容易に取って代わり得るものであることがわ
かる。確かに、ある特定の類似体が実際にテトラサイクリンより好ましいことも
ある。それらが（テトラサイクリン感受性ポリペプチドに対して）より高い結合
アフィニティーを有し得るので、より低い濃度で調節作用を発揮することができ
るからである。テトラサイクリン類似体は、テトラサイクリンに構造的に関連し
、少なくとも約１０6Ｍ-1、好ましくは１０9Ｍ-1、またはそれより大きいＫaで ｔｅｔリプレッサーに結合する分子をいうものとして理解され得る。好ましい類
似体はドキシサイクリンおよびアンヒドロテトラサイクリンである。その他の類
似体は、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、
エピオキシテトラサイクリンおよびシアノテトラサイクリンを含む。テトラサイ
クリンの他の類似体については、HlavkaおよびBoothe（Handbook of Experiment
al Pharmacology 78、Blackwoodら（eds.）、Springer verlag（1985年）中の「
The Tetracyclines」）により述べられている。
【００１７】 ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列は現在、当業者によく知られている。検
討のため、読者はProtein-Nucleic Acid Interaction中のHillenおよびWissmann
（1989年）「Topics in Molecular and Structural Biology」 SaengerおよびHe
inemann編,（Macmillan, London）, Vol. 10, pp143-162）を参照されたい。典 型的に、白血球活性化分子をコードする核酸配列は、複数のｔｅｔＯ配列（一般
的に５から１０のこのようなｔｅｔＯ配列が直接的な繰返しで用いられる）の下
流に配置される。
討のため、読者はProtein-Nucleic Acid Interaction中のHillenおよびWissmann
（1989年）「Topics in Molecular and Structural Biology」 SaengerおよびHe
inemann編,（Macmillan, London）, Vol. 10, pp143-162）を参照されたい。典 型的に、白血球活性化分子をコードする核酸配列は、複数のｔｅｔＯ配列（一般
的に５から１０のこのようなｔｅｔＯ配列が直接的な繰返しで用いられる）の下
流に配置される。
【００１８】 好都合にｔｅｔＯ配列は、「最小限の」（すなわちエンハンサーのない）真核
プロモーター（たとえば［GossenおよびBujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89, 5547］に先に記載された最小限のＣＭＶ前初期プロモーター）に実質的
に近接して（すなわち１００ｂｐ以内、好ましくは５０ｂｐ以内で）融合され、
それにより、トランス活性化テトラサイクリン感受性ポリペプチドのｔｅｔＯ配
列への結合は、ｔｅｔＯに結合されたコード配列の発現を促進させる。
プロモーター（たとえば［GossenおよびBujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89, 5547］に先に記載された最小限のＣＭＶ前初期プロモーター）に実質的
に近接して（すなわち１００ｂｐ以内、好ましくは５０ｂｐ以内で）融合され、
それにより、トランス活性化テトラサイクリン感受性ポリペプチドのｔｅｔＯ配
列への結合は、ｔｅｔＯに結合されたコード配列の発現を促進させる。
【００１９】 白血球活性化分子および／または薬剤により調節可能なプロモーターをコード
する配列の導入のため特に適当な構造はよく知られており、先に開示されている
（たとえばBaron他 1995 Nucl. Acids Res 23、3605-3606、およびSchultze他 1996 Nature Biotechnology 14、499-503頁）。特に好ましい構造（テトラサ イクリンまたはその類似体が調節薬剤である場合）は、ｔｅｔＯ結合配列の発現
を非常に高レベルで調節できることがわかっており、これは、同時係属中のＵＫ
特許出願番号９７１８８７３．４において開示され、また、Mohamadi他（1997 G
ene Therapy 4, 991-997; 1998 Gene Therapy 5, 76-84）およびAlvarez-Vallin
a他（J. Immunol, 5889-5895）により開示される。
する配列の導入のため特に適当な構造はよく知られており、先に開示されている
（たとえばBaron他 1995 Nucl. Acids Res 23、3605-3606、およびSchultze他 1996 Nature Biotechnology 14、499-503頁）。特に好ましい構造（テトラサ イクリンまたはその類似体が調節薬剤である場合）は、ｔｅｔＯ結合配列の発現
を非常に高レベルで調節できることがわかっており、これは、同時係属中のＵＫ
特許出願番号９７１８８７３．４において開示され、また、Mohamadi他（1997 G
ene Therapy 4, 991-997; 1998 Gene Therapy 5, 76-84）およびAlvarez-Vallin
a他（J. Immunol, 5889-5895）により開示される。
【００２０】 この方法は、白血球活性化分子の発現の調節により、相対的に低い密度の白血
球刺激分子を発現する標的でない細胞に比べて相対的に高い密度の白血球刺激分
子を発現する標的分子の方に、白血球を優先的に反応させることを可能にするも
のが望ましい。
球刺激分子を発現する標的でない細胞に比べて相対的に高い密度の白血球刺激分
子を発現する標的分子の方に、白血球を優先的に反応させることを可能にするも
のが望ましい。
【００２１】 白血球は単球、マクロファージまたはリンパ球であるのが好ましく、Ｔリンパ
球が最も好ましい。Ｔリンパ球（またはＴ細胞）について、白血球刺激分子は「
外来の」抗原または腫瘍結合抗原（たとえばＣＥＡ）であるのが都合よく、一方
白血球活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体の鎖の少なくとも１
つの細胞内（細胞質）シグナルドメイン、またはＣＤ２８、ＣＤ４もしくはＣＤ
８などの共同刺激性分子の細胞内シグナルドメインを含むことが好ましい。
球が最も好ましい。Ｔリンパ球（またはＴ細胞）について、白血球刺激分子は「
外来の」抗原または腫瘍結合抗原（たとえばＣＥＡ）であるのが都合よく、一方
白血球活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体の鎖の少なくとも１
つの細胞内（細胞質）シグナルドメイン、またはＣＤ２８、ＣＤ４もしくはＣＤ
８などの共同刺激性分子の細胞内シグナルドメインを含むことが好ましい。
【００２２】 多くの腫瘍結合抗原が、腫瘍細胞に対して固有のものではなく、それらは腫瘍
細胞表面上に相対的に高密度で発現されるが、患者の腫瘍でないある特定の種類
の細胞表面上にもより低い密度で発現され得る。したがって、腫瘍細胞に対し腫
瘍結合抗原を介して、細胞傷害性剤の目標を定めようとするか、または免疫応答
を誘導させようとする治療法の多くは、しばしば腫瘍でない細胞に付帯的損傷を
もたらす。
細胞表面上に相対的に高密度で発現されるが、患者の腫瘍でないある特定の種類
の細胞表面上にもより低い密度で発現され得る。したがって、腫瘍細胞に対し腫
瘍結合抗原を介して、細胞傷害性剤の目標を定めようとするか、または免疫応答
を誘導させようとする治療法の多くは、しばしば腫瘍でない細胞に付帯的損傷を
もたらす。
【００２３】 本発明は、治療効果の目標を、たとえば高密度の腫瘍結合抗原を発現する細胞
に特異的に定める方法を提供する。白血球（治療効果を配達または媒介する）の
表面上における白血球活性化分子の発現を調節することができ、それにより、白
血球が活性化される相互作用のしきい値レベルに到達するのに必要な白血球刺激
分子（たとえば腫瘍結合抗原）の密度を変える。
に特異的に定める方法を提供する。白血球（治療効果を配達または媒介する）の
表面上における白血球活性化分子の発現を調節することができ、それにより、白
血球が活性化される相互作用のしきい値レベルに到達するのに必要な白血球刺激
分子（たとえば腫瘍結合抗原）の密度を変える。
【００２４】 たとえば、腫瘍結合抗原に対し特異的な結合活性を有するキメラＴＣＲ分子の
テトラサイクリン感受性の発現を誘導する核酸配列で、Ｔリンパ球を形質転換す
ることができる。患者に投与されるテトラサイクリン（またはその類似体）の量
の調整は、腫瘍細胞上の腫瘍結合抗原の密度がＴ細胞の活性化を引起こすのに十
分となる一方、腫瘍でない細胞上の腫瘍結合抗原の密度が非常に低くなり、付帯
的損傷が最小になるよう、行うことができる。患者におけるテトラサイクリン濃
度の望ましい調整は、試行錯誤により、臨床的な徴候またはマーカーの分析によ
り、行なうことができる。白血球活性化分子の発現を調節するのに用いられ得る
他の調節可能な系は、たとえばMiller & Whelan（1997 Hum. Gene Ther. 8, 803
-815）によって開示されている。
テトラサイクリン感受性の発現を誘導する核酸配列で、Ｔリンパ球を形質転換す
ることができる。患者に投与されるテトラサイクリン（またはその類似体）の量
の調整は、腫瘍細胞上の腫瘍結合抗原の密度がＴ細胞の活性化を引起こすのに十
分となる一方、腫瘍でない細胞上の腫瘍結合抗原の密度が非常に低くなり、付帯
的損傷が最小になるよう、行うことができる。患者におけるテトラサイクリン濃
度の望ましい調整は、試行錯誤により、臨床的な徴候またはマーカーの分析によ
り、行なうことができる。白血球活性化分子の発現を調節するのに用いられ得る
他の調節可能な系は、たとえばMiller & Whelan（1997 Hum. Gene Ther. 8, 803
-815）によって開示されている。
【００２５】 したがって、白血球刺激分子が腫瘍結合抗原である特定の具体例において、こ
れは、腫瘍標的細胞上に相対的に高い密度で発現される一方、腫瘍でなく標的で
ない細胞上に相対的に低い密度で発現され、それにより、本発明の第１の局面の
方法を実行することによって、腫瘍標的細胞を優先的に認識かつ攻撃することが
でき、しかも腫瘍でない細胞を実質的に攻撃しない、白血球が得られる。
れは、腫瘍標的細胞上に相対的に高い密度で発現される一方、腫瘍でなく標的で
ない細胞上に相対的に低い密度で発現され、それにより、本発明の第１の局面の
方法を実行することによって、腫瘍標的細胞を優先的に認識かつ攻撃することが
でき、しかも腫瘍でない細胞を実質的に攻撃しない、白血球が得られる。
【００２６】 この白血球活性化分子は、膜によって結合されることが好都合であり、典型的
には細胞内（細胞質）ドメイン、トランスメンブラン・ドメイン、および細胞外
ドメインを含む。細胞外ドメインは、白血球刺激分子に対して結合特異性を有す
ることが望ましい。白血球刺激および／または白血球活性化分子は、単量体また
は多量体（たとえば二量体、三量体など）であり得る。
には細胞内（細胞質）ドメイン、トランスメンブラン・ドメイン、および細胞外
ドメインを含む。細胞外ドメインは、白血球刺激分子に対して結合特異性を有す
ることが望ましい。白血球刺激および／または白血球活性化分子は、単量体また
は多量体（たとえば二量体、三量体など）であり得る。
【００２７】 有利には、白血球活性化分子はキメラのポリペプチドである。たとえば、白血
球は、ＴＣＲ分子の少なくとも１つの機能的ドメイン（好ましくは細胞質のシグ
ナルドメイン）を含むＴＣＲ分子またはキメラＴＣＲ分子の、薬剤により調節可
能な発現を誘導する配列で、形質転換され得る。白血球活性化分子がキメラのＴ
ＣＲである場合、トランスメンブラン・ドメイン（Ｔ細胞表面上に該分子を固定
するのに必要な）は、野生型ＴＣＲ分子からのものでもよく、あるいは真核細胞
表面上に存在する任意の他の分子からのトランスメンブラン（ＴＭ）・ドメイン
を含んでもよく、あるいは「人工的」な天然由来でないトランスメンブラン・ド
メインであってもよい。好ましくは、ＴＭドメインはポリペプチドの免疫グロブ
リン族のメンバーからのものである。
球は、ＴＣＲ分子の少なくとも１つの機能的ドメイン（好ましくは細胞質のシグ
ナルドメイン）を含むＴＣＲ分子またはキメラＴＣＲ分子の、薬剤により調節可
能な発現を誘導する配列で、形質転換され得る。白血球活性化分子がキメラのＴ
ＣＲである場合、トランスメンブラン・ドメイン（Ｔ細胞表面上に該分子を固定
するのに必要な）は、野生型ＴＣＲ分子からのものでもよく、あるいは真核細胞
表面上に存在する任意の他の分子からのトランスメンブラン（ＴＭ）・ドメイン
を含んでもよく、あるいは「人工的」な天然由来でないトランスメンブラン・ド
メインであってもよい。好ましくは、ＴＭドメインはポリペプチドの免疫グロブ
リン族のメンバーからのものである。
【００２８】 好ましい具体例において、細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグ
メント（ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）からなるか、あるいはそれらから誘導される。
特定の具体例において、白血球活性化分子は、腫瘍結合抗原である白血球刺激分
子に対して結合アフィニティー（たとえばPardollによる引用文献７に記述）を 有する細胞外ドメインからなる。
メント（ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）からなるか、あるいはそれらから誘導される。
特定の具体例において、白血球活性化分子は、腫瘍結合抗原である白血球刺激分
子に対して結合アフィニティー（たとえばPardollによる引用文献７に記述）を 有する細胞外ドメインからなる。
【００２９】 本発明のその他の具体例（たとえばＢリンパ球の抗原密度特異的活性に関する
もの）は、当業者に明らかである。
もの）は、当業者に明らかである。
【００３０】 第２の局面において、本発明は、外因性の作用因子に対し濃度感受性である態
様において白血球活性化分子を発現する核酸配列で形質転換された白血球を提供
する。この白血球は、白血球活性化分子と細胞表面上に存在する白血球刺激分子
との間の相互作用によって活性化され、そこにおいて、この白血球は、白血球刺
激分子の異なる密度に対して異なる応答性を示し（差別的に応答性であり）、白
血球刺激分子の密度が相対的に高い標的細胞と、白血球刺激分子の密度が相対的
に低い標的でない細胞とを識別する。この白血球は、典型的には本発明の第１の
局面の方法によって処理されたものである。
様において白血球活性化分子を発現する核酸配列で形質転換された白血球を提供
する。この白血球は、白血球活性化分子と細胞表面上に存在する白血球刺激分子
との間の相互作用によって活性化され、そこにおいて、この白血球は、白血球刺
激分子の異なる密度に対して異なる応答性を示し（差別的に応答性であり）、白
血球刺激分子の密度が相対的に高い標的細胞と、白血球刺激分子の密度が相対的
に低い標的でない細胞とを識別する。この白血球は、典型的には本発明の第１の
局面の方法によって処理されたものである。
【００３１】 第３の局面において、本発明は、治療方法に用いるための組成物を提供する。
この組成物は、上述した本発明の第２の局面による複数の白血球、および生理学
的に許容される希釈剤を含む。本発明はさらに、第４の局面において、このよう
な組成物を製造する方法を提供する。この方法は、白血球の試料を得る（好まし
くは治療される対象から得る）こと、外因性の作用因子に対し濃度感受性である
態様において白血球活性化分子の発現を誘導する核酸配列で該白血球を形質転換
すること、および、該白血球を生理学的に許容される希釈剤（たとえば生理食塩
水、リン酸塩緩衝生理食塩水、組織培養培地など）と混合することを含む。
この組成物は、上述した本発明の第２の局面による複数の白血球、および生理学
的に許容される希釈剤を含む。本発明はさらに、第４の局面において、このよう
な組成物を製造する方法を提供する。この方法は、白血球の試料を得る（好まし
くは治療される対象から得る）こと、外因性の作用因子に対し濃度感受性である
態様において白血球活性化分子の発現を誘導する核酸配列で該白血球を形質転換
すること、および、該白血球を生理学的に許容される希釈剤（たとえば生理食塩
水、リン酸塩緩衝生理食塩水、組織培養培地など）と混合することを含む。
【００３２】 本発明はさらに、第５の局面において、ヒトまたは動物の対象を治療する方法
を提供する。この方法は、前述の組成物を調製すること、該組成物を該対象に投
与すること、および、必要であれば、投与された白血球中の白血球活性化分子の
発現レベルを変化させるように、外因性物質を該対象に投与することを含む。
を提供する。この方法は、前述の組成物を調製すること、該組成物を該対象に投
与すること、および、必要であれば、投与された白血球中の白血球活性化分子の
発現レベルを変化させるように、外因性物質を該対象に投与することを含む。
【００３３】 本発明のさまざまな局面は、多くの分野に適用できるが、特に腫瘍および他の
腫瘍性疾患の治療におけるまたはそれに関する分野に適用できる。
腫瘍性疾患の治療におけるまたはそれに関する分野に適用できる。
【００３４】 典型的には、関連の核酸配列はインビトロで細胞に導入される。核酸配列を真
核細胞へ導入する方法は数多く知られており、それらはトランスフェクション、
形質導入（トランスダクション）、電気穿孔、および細胞融合などを含む。これ
らの方法はいずれも本発明において用いることができ、一般にトランスフォーメ
ーション（形質転換）と呼ばれ得る。
核細胞へ導入する方法は数多く知られており、それらはトランスフェクション、
形質導入（トランスダクション）、電気穿孔、および細胞融合などを含む。これ
らの方法はいずれも本発明において用いることができ、一般にトランスフォーメ
ーション（形質転換）と呼ばれ得る。
【００３５】 同様に、形質転換された白血球を対象に導入する方法も周知である。これは対
象の血流中に注入または注射することにより行なうのが好都合である。典型的に
は、１０5から１０8の間（好ましくは１０6から１０7の間）の細胞が対象の血流
に導入される。対象への外来細胞の導入により、その細胞上で外来抗原に対する
免疫応答が創り出される可能性が高く、よって一般に、白血球は、受容体である
対象と組織適合する。最も好都合には、細胞は、対象（たとえば末梢血液または
骨髄から）から元々得られるオートロガス細胞であり、インビトロで関連の核酸
配列によって形質転換され、その後対象に再導入される。典型的には、この方法
のインビトロの段階は、一般に、うまく形質転換されたそれらの細胞を選択する
ための選択プロセス、および／または形質転換された細胞の数を増やすための増
殖段階を含む。細胞の選択および増殖の方法は当業者に周知であり、本発明の本
質部分を構成するものではない。
象の血流中に注入または注射することにより行なうのが好都合である。典型的に
は、１０5から１０8の間（好ましくは１０6から１０7の間）の細胞が対象の血流
に導入される。対象への外来細胞の導入により、その細胞上で外来抗原に対する
免疫応答が創り出される可能性が高く、よって一般に、白血球は、受容体である
対象と組織適合する。最も好都合には、細胞は、対象（たとえば末梢血液または
骨髄から）から元々得られるオートロガス細胞であり、インビトロで関連の核酸
配列によって形質転換され、その後対象に再導入される。典型的には、この方法
のインビトロの段階は、一般に、うまく形質転換されたそれらの細胞を選択する
ための選択プロセス、および／または形質転換された細胞の数を増やすための増
殖段階を含む。細胞の選択および増殖の方法は当業者に周知であり、本発明の本
質部分を構成するものではない。
【００３６】 白血球活性化分子が対象内で免疫原性であり得る可能性もある。この発明が、
潜在的に免疫原性の白血球活性化分子の発現を調節することを伴う場合、以下に
より詳細に説明する理由により、細胞が対象に導入された後、該分子の発現を遅
らせることが望ましい。したがって、細胞は通常、免疫原性ポリペプチドの発現
が十分に抑制されるインビトロでの条件から、白血球活性化分子の発現がもはや
ダウンレギュレーションされない対象におけるインビボの条件に移される。一方
、本発明は、十分に抑制された状態から十分に発現される状態に細胞を移すため
、大事な期間（典型的には２〜１０日間、好ましくは４日またはそれ以上）をと
るようにする。
潜在的に免疫原性の白血球活性化分子の発現を調節することを伴う場合、以下に
より詳細に説明する理由により、細胞が対象に導入された後、該分子の発現を遅
らせることが望ましい。したがって、細胞は通常、免疫原性ポリペプチドの発現
が十分に抑制されるインビトロでの条件から、白血球活性化分子の発現がもはや
ダウンレギュレーションされない対象におけるインビボの条件に移される。一方
、本発明は、十分に抑制された状態から十分に発現される状態に細胞を移すため
、大事な期間（典型的には２〜１０日間、好ましくは４日またはそれ以上）をと
るようにする。
【００３７】 細胞は、調節薬剤（たとえばテトラサイクリンまたはその類似体）の適当な（
非毒性の）濃度にさらすことにより、インビトロで白血球活性化分子が十分に抑
制される状態とすることができ、調節薬剤のない対象に導入されるとき、最終的
に、白血球活性化分子が発現される状態に入る。これに代えて、上述したように
、ＴＲＳおよびその変異体、ならびに当業者に入手可能な、薬剤により調節可能
な別のプロモーター系の可変性によって、白血球を、調節薬剤の不在下において
インビトロで十分に抑制された状態に維持してもよく、その後、適当な用量の調
節薬剤を受け入れる対象に導入して、（適当な遅延の後）白血球活性化分子を発
現させることができる。
非毒性の）濃度にさらすことにより、インビトロで白血球活性化分子が十分に抑
制される状態とすることができ、調節薬剤のない対象に導入されるとき、最終的
に、白血球活性化分子が発現される状態に入る。これに代えて、上述したように
、ＴＲＳおよびその変異体、ならびに当業者に入手可能な、薬剤により調節可能
な別のプロモーター系の可変性によって、白血球を、調節薬剤の不在下において
インビトロで十分に抑制された状態に維持してもよく、その後、適当な用量の調
節薬剤を受け入れる対象に導入して、（適当な遅延の後）白血球活性化分子を発
現させることができる。
【００３８】 一般的に、必須ではないが、調節薬剤の存在によって白血球活性化分子の発現
を阻害することが好ましく、これは、その後、調節薬剤への暴露から細胞を取除
くことにより、通常、白血球活性化分子の発現の誘発前に、より長い遅滞期また
は遅延が得られるからである。
を阻害することが好ましく、これは、その後、調節薬剤への暴露から細胞を取除
くことにより、通常、白血球活性化分子の発現の誘発前に、より長い遅滞期また
は遅延が得られるからである。
【００３９】 導入された白血球による腫瘍の攻撃の効率は、細胞がその表面に標的物を発現
するように仕向けることによって向上させることができる（たとえば、Eshar他 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720）、 Hwu他 1993 J. Exp. Med. 1
78, 361、Stancovski他 1993 J. Immunol. 151, 6577、およびBrocker他 1996
Eur. J. Immunol. 26, 1770参照）。一旦腫瘍内に入ると、白血球は、その治療
効果（たとえば細胞傷害性作用、またはマクロファージおよびリンパ球の補給）
を発揮することができる。
するように仕向けることによって向上させることができる（たとえば、Eshar他 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720）、 Hwu他 1993 J. Exp. Med. 1
78, 361、Stancovski他 1993 J. Immunol. 151, 6577、およびBrocker他 1996
Eur. J. Immunol. 26, 1770参照）。一旦腫瘍内に入ると、白血球は、その治療
効果（たとえば細胞傷害性作用、またはマクロファージおよびリンパ球の補給）
を発揮することができる。
【００４０】 血液が運ぶ白血球により接近可能な固体腫瘍はいずれも、本発明の方法により
治療することが可能となり得る。また対象に導入される白血球は、腫瘍細胞の表
面に発現されるマーカーに白血球がねらいを定めるような細胞表面成分を含むと
好都合である。これらは、たとえば、キメラ「Ｔ体」ターゲッティング成分であ
り、当業者に知られている（上記で引用したEshar他、Hwu他、Stancovski他、お
よびBrocker他の開示を参照）。
治療することが可能となり得る。また対象に導入される白血球は、腫瘍細胞の表
面に発現されるマーカーに白血球がねらいを定めるような細胞表面成分を含むと
好都合である。これらは、たとえば、キメラ「Ｔ体」ターゲッティング成分であ
り、当業者に知られている（上記で引用したEshar他、Hwu他、Stancovski他、お
よびBrocker他の開示を参照）。
【００４１】 しかしながら、導入された白血球の腫瘍へのターゲッティングにはいくらか時
間がかかる。したがって、この時間中の免疫原性ポリペプチドの発現は、回避さ
れるのが好ましい。というのも、免疫原性ポリペプチドの発現が、（ａ）悪性で
ない細胞に対する付帯的損傷および／または（ｂ）免疫原性タンパク質と対象の
免疫系（特に循環抗体）の成分との相互作用を引き起こし得るからである。後者
の点は、白血球の投与を繰返し行なう必要がある場合とくに問題である。という
のは、これが、投与された白血球と相互作用する傾向にあり、当該白血球が標的
の腫瘍に届くのを阻害するであろう免疫原性ポリペプチドに対して、免疫応答を
効率的に誘導する可能性が高いからである。これらの問題は、本発明の方法によ
って克服することができる。この方法では、潜在的に免疫原性の白血球活性化分
子は、重要な時間遅延の後、高レベルで発現されることが許容されるだけである
ことが望ましい。この点により、投与される白血球は標的の腫瘍に入り込むよう
になり、よって免疫系による妨害を防ぎ、悪性でない細胞に対する付帯的損傷を
最小限にすることができる。したがって、本発明の方法は、白血球活性化分子に
対して既に免疫応答を形成しており、また、たとえば白血球活性化分子と反応す
る循環抗体または白血球活性化分子に特異的な免疫コンピテント記憶細胞を有し
得る対象において行うことができる。
間がかかる。したがって、この時間中の免疫原性ポリペプチドの発現は、回避さ
れるのが好ましい。というのも、免疫原性ポリペプチドの発現が、（ａ）悪性で
ない細胞に対する付帯的損傷および／または（ｂ）免疫原性タンパク質と対象の
免疫系（特に循環抗体）の成分との相互作用を引き起こし得るからである。後者
の点は、白血球の投与を繰返し行なう必要がある場合とくに問題である。という
のは、これが、投与された白血球と相互作用する傾向にあり、当該白血球が標的
の腫瘍に届くのを阻害するであろう免疫原性ポリペプチドに対して、免疫応答を
効率的に誘導する可能性が高いからである。これらの問題は、本発明の方法によ
って克服することができる。この方法では、潜在的に免疫原性の白血球活性化分
子は、重要な時間遅延の後、高レベルで発現されることが許容されるだけである
ことが望ましい。この点により、投与される白血球は標的の腫瘍に入り込むよう
になり、よって免疫系による妨害を防ぎ、悪性でない細胞に対する付帯的損傷を
最小限にすることができる。したがって、本発明の方法は、白血球活性化分子に
対して既に免疫応答を形成しており、また、たとえば白血球活性化分子と反応す
る循環抗体または白血球活性化分子に特異的な免疫コンピテント記憶細胞を有し
得る対象において行うことができる。
【００４２】 この方法において採用される薬剤調節可能なプロモーター系の成分を変えるこ
とによって（たとえば特定のエピトープを除去するように何らかのＤＮＡ結合タ
ンパク質を変更することによって）それらの免疫原性を減じることが望ましい場
合もある。好都合には、存在していれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、核局在化シ
グナル（ＮＬＳ）を含み、それによって対象の免疫系に現われ得る量を最小限に
する。有用な他の技術は、ＷＯ９６／０１３１３に開示されている。
とによって（たとえば特定のエピトープを除去するように何らかのＤＮＡ結合タ
ンパク質を変更することによって）それらの免疫原性を減じることが望ましい場
合もある。好都合には、存在していれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、核局在化シ
グナル（ＮＬＳ）を含み、それによって対象の免疫系に現われ得る量を最小限に
する。有用な他の技術は、ＷＯ９６／０１３１３に開示されている。
【００４３】 もちろん、本発明によって得られる別の利点は、白血球がさらされる外因性作
用因子の濃度を制御することにより、白血球における白血球活性化分子の発現レ
ベルを制御できるという能力である。これは、白血球の活性化を引起こすのに必
要な白血球刺激分子の密度も制御する。本発明者らは、白血球における白血球活
性化分子の量を制御することによって、その活性化のために、細胞上の白血球刺
激分子の、あるしきい値密度を白血球が要求するよう仕向けることができ、その
細胞が十分な密度の白血球刺激分子を持たない場合、それは白血球を活性化させ
ず、該細胞は白血球によって攻撃されない、ということを見出した。逆に、細胞
がしきい値密度を超える密度の白血球刺激分子を有する場合、該細胞に遭遇する
白血球は活性化され、該細胞を攻撃する。
用因子の濃度を制御することにより、白血球における白血球活性化分子の発現レ
ベルを制御できるという能力である。これは、白血球の活性化を引起こすのに必
要な白血球刺激分子の密度も制御する。本発明者らは、白血球における白血球活
性化分子の量を制御することによって、その活性化のために、細胞上の白血球刺
激分子の、あるしきい値密度を白血球が要求するよう仕向けることができ、その
細胞が十分な密度の白血球刺激分子を持たない場合、それは白血球を活性化させ
ず、該細胞は白血球によって攻撃されない、ということを見出した。逆に、細胞
がしきい値密度を超える密度の白血球刺激分子を有する場合、該細胞に遭遇する
白血球は活性化され、該細胞を攻撃する。
【００４４】 ほとんどの具体例において、調節薬剤は、対象に投与されるとき認容されるも
のである。したがって、必要であれば、白血球活性化分子の発現を抑制するよう
形質転換細胞がインビトロで調節薬剤にさらされる場合、形質転換細胞の導入前
、導入中、または導入後に調節薬剤を患者に投与してもよい。これは、遅延イン
ターバルを延ばすために望ましいことであり得る他、白血球活性化分子の発現を
調節するように細胞を調節薬剤の中間濃度にさらすために望ましいことであり得
る。また、患者が白血球活性化分子の発現に対して有害な作用をこうむる場合、
調節薬剤を十分な用量で投与し、白血球活性化分子のさらなる発現を防ぐことも
できる。
のである。したがって、必要であれば、白血球活性化分子の発現を抑制するよう
形質転換細胞がインビトロで調節薬剤にさらされる場合、形質転換細胞の導入前
、導入中、または導入後に調節薬剤を患者に投与してもよい。これは、遅延イン
ターバルを延ばすために望ましいことであり得る他、白血球活性化分子の発現を
調節するように細胞を調節薬剤の中間濃度にさらすために望ましいことであり得
る。また、患者が白血球活性化分子の発現に対して有害な作用をこうむる場合、
調節薬剤を十分な用量で投与し、白血球活性化分子のさらなる発現を防ぐことも
できる。
【００４５】 調節薬剤を（必要に応じて）対象に投与する方法は当業者に周知であり、これ
は、（任意の形態の）経口投与、除放性ペレット、および拡散ポンプの植え込み
を含む他、より通常的な方法、たとえば注射、注入、吸入または経口摂取を含む
。一例として、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体が対象に投与さ
れる場合、その用量は０．０５から１．０μｇ／ｍｌの間の血清濃度を達成する
ように都合よく調整される。
は、（任意の形態の）経口投与、除放性ペレット、および拡散ポンプの植え込み
を含む他、より通常的な方法、たとえば注射、注入、吸入または経口摂取を含む
。一例として、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体が対象に投与さ
れる場合、その用量は０．０５から１．０μｇ／ｍｌの間の血清濃度を達成する
ように都合よく調整される。
【００４６】 この方法において、白血球の活性化に必要な白血球刺激分子のしきい値密度は
、白血球がさらされる外因性作用因子（すなわち調節薬剤）の濃度に依存する。
したがって、外因性作用因子の濃度を所望のレベルに調整することにより、対象
に導入される形質転換された白血球が、相対的に高い密度の白血球刺激分子（た
とえば腫瘍結合抗原）を発現する標的細胞（たとえば腫瘍細胞）と、相対的に低
い密度の白血球刺激細胞を発現する標的でない細胞（腫瘍でない細胞）とを区別
するように仕向けることができる。この方法では、標的細胞のみが白血球を活性
化させるので、標的でない細胞への「付帯的損傷」は最小限になる。
、白血球がさらされる外因性作用因子（すなわち調節薬剤）の濃度に依存する。
したがって、外因性作用因子の濃度を所望のレベルに調整することにより、対象
に導入される形質転換された白血球が、相対的に高い密度の白血球刺激分子（た
とえば腫瘍結合抗原）を発現する標的細胞（たとえば腫瘍細胞）と、相対的に低
い密度の白血球刺激細胞を発現する標的でない細胞（腫瘍でない細胞）とを区別
するように仕向けることができる。この方法では、標的細胞のみが白血球を活性
化させるので、標的でない細胞への「付帯的損傷」は最小限になる。
【００４７】 本発明を、例を挙げかつ添付の図面を参照して、さらに説明する。
【００４８】
例１ 本発明者らは、ヒトＴ細胞系における表面分子の発現を一時的に調節するため
の手段として、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター系の
有用性を評価した。トランスアクチベーターおよび発現遺伝子ユニットの両方を
含むベクターを用いて、キメラＴＣＲ（ｃｈＴＣＲ）分子の発現が効率よく調節
され得る安定して形質転換されたJurkat Ｔ細胞系を生成させることができた。 使用されるテトラサイクリン類似体およびその濃度に依存して、ｃｈＴＣＲの誘
発は、より大きくまたはより小さく可逆的に抑制することができる。さらに、本
発明者は、完全に抑制されたＴ細胞がキメラ受容体を介してＩＬ−２を生産する
ように活性化され得ないことを明らかにし、このことは、再誘導Ｔ細胞の可逆的
な機能的不活性化が可能であるということを示している。
の手段として、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター系の
有用性を評価した。トランスアクチベーターおよび発現遺伝子ユニットの両方を
含むベクターを用いて、キメラＴＣＲ（ｃｈＴＣＲ）分子の発現が効率よく調節
され得る安定して形質転換されたJurkat Ｔ細胞系を生成させることができた。 使用されるテトラサイクリン類似体およびその濃度に依存して、ｃｈＴＣＲの誘
発は、より大きくまたはより小さく可逆的に抑制することができる。さらに、本
発明者は、完全に抑制されたＴ細胞がキメラ受容体を介してＩＬ−２を生産する
ように活性化され得ないことを明らかにし、このことは、再誘導Ｔ細胞の可逆的
な機能的不活性化が可能であるということを示している。
【００４９】 遺伝子発現を基底レベルに抑制するための時間経過は、薬剤の除去後、遺伝子
発現が最高レベルに到達するための時間経過より顕著に短く、また、プロモータ
ー活性の回復における遅延は、抑制に用いられたドキシサイクリン（テトラサイ
クリン類似体）の濃度に依存してかなり変化した。これらのデータとＴ細胞によ
って媒介される免疫治療における現在の認識との関連について論じる。
発現が最高レベルに到達するための時間経過より顕著に短く、また、プロモータ
ー活性の回復における遅延は、抑制に用いられたドキシサイクリン（テトラサイ
クリン類似体）の濃度に依存してかなり変化した。これらのデータとＴ細胞によ
って媒介される免疫治療における現在の認識との関連について論じる。
【００５０】 材料および方法 試薬： 使用したｍＡｂは、それぞれヒトＣＤ３εおよびＣＤ２８分子に特異
的なＳＰｖＴ３ｂ（マウスＩｇＧ２ａ）（１１）およびＹＴＨ９１３．１２（ラ
ットＩｇＧ２ｂ）（Serotec Ltd., Oxford, UK）を含んだ。直接染色のために、
次のＦＩＴＣ抱合抗体を用いた。ＵＣＨＴ−１（抗ＣＤ３ε、マウスＩｇＧ１ S
erotec、マウスλ軽鎖に対するヤギポリクローナル抗血清（Southern Biotechno
logy Associates, Inc. Birmingham AL）、およびマウスＩｇＧに対するヤギポ リクローナル抗血清（γ鎖特異的）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフ
ェニルアセチル（ＮＩＰ）（Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK
）と、モル比１０：１（ＮＩＰ10−ＢＳＡ）で抱合した（１２）。テトラサイク
リン塩酸塩（Sigma）を培養培地中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ドキ シサイクリン塩酸塩（「Ｄｏｘ」）（Sigma）を０．０２ＮのＨＣｌ中に１ｍｇ ／ｍｌの濃度で溶解し、さらに培養培地で希釈した。この抗生物質溶液は、使用
当日に新しく調製し、適当な濃度に希釈した。
的なＳＰｖＴ３ｂ（マウスＩｇＧ２ａ）（１１）およびＹＴＨ９１３．１２（ラ
ットＩｇＧ２ｂ）（Serotec Ltd., Oxford, UK）を含んだ。直接染色のために、
次のＦＩＴＣ抱合抗体を用いた。ＵＣＨＴ−１（抗ＣＤ３ε、マウスＩｇＧ１ S
erotec、マウスλ軽鎖に対するヤギポリクローナル抗血清（Southern Biotechno
logy Associates, Inc. Birmingham AL）、およびマウスＩｇＧに対するヤギポ リクローナル抗血清（γ鎖特異的）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフ
ェニルアセチル（ＮＩＰ）（Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK
）と、モル比１０：１（ＮＩＰ10−ＢＳＡ）で抱合した（１２）。テトラサイク
リン塩酸塩（Sigma）を培養培地中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ドキ シサイクリン塩酸塩（「Ｄｏｘ」）（Sigma）を０．０２ＮのＨＣｌ中に１ｍｇ ／ｍｌの濃度で溶解し、さらに培養培地で希釈した。この抗生物質溶液は、使用
当日に新しく調製し、適当な濃度に希釈した。
【００５１】 ベクターの構築： ヒトＣＭＶ前初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーター／エンハ
ンサーから転写されたｔＴＡトランスアクチベーター遺伝子を含むプラスミドｐ
ＵＨＤ１５−１、およびｔＴＡ−応答性プロモーター（ＴＲＰ、ヒトＣＭＶ前初
期最小プロモーター［ＰｈＣＭＶ*−１］に融合された七量体化ｔｅｔＯ配列（ ＴｅｔＯ）７）を含むｐＵＨＤ１０−３は、H. Bujard（９）から好意により提 供されたものである。プラスミドｐＣＳは、 ＣＭＶ ＩＥプロモーター、多重 クローニング部位およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む１３０８ｂｐの
ＳａｌＩフラグメントをｐＣＥＰ４バックボーン（Invitrogen, San Diego, CA ）から取出すことにより構築した。ｐＣＳからの６７２３ｂｐ ＮｒｕＩ−Ｃｌ
ａＩ消化フラグメントをクレノウ（Cambio, Cambridge, UK）で平滑末端にし、 この部位をクレノウおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP, Boehringer
Mannheim GmbH, Germany）で処理した後、プラスミドｐＵＨＤ１５−１のＸｈｏ
Ｉ部に挿入した。得られたプラスミドは、ｔＴＡとハイグロマイシン転写ユニッ
トの両方を対向する方向で含み、ｐＣＲＡＺＹと呼んだ。
ンサーから転写されたｔＴＡトランスアクチベーター遺伝子を含むプラスミドｐ
ＵＨＤ１５−１、およびｔＴＡ−応答性プロモーター（ＴＲＰ、ヒトＣＭＶ前初
期最小プロモーター［ＰｈＣＭＶ*−１］に融合された七量体化ｔｅｔＯ配列（ ＴｅｔＯ）７）を含むｐＵＨＤ１０−３は、H. Bujard（９）から好意により提 供されたものである。プラスミドｐＣＳは、 ＣＭＶ ＩＥプロモーター、多重 クローニング部位およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む１３０８ｂｐの
ＳａｌＩフラグメントをｐＣＥＰ４バックボーン（Invitrogen, San Diego, CA ）から取出すことにより構築した。ｐＣＳからの６７２３ｂｐ ＮｒｕＩ−Ｃｌ
ａＩ消化フラグメントをクレノウ（Cambio, Cambridge, UK）で平滑末端にし、 この部位をクレノウおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP, Boehringer
Mannheim GmbH, Germany）で処理した後、プラスミドｐＵＨＤ１５−１のＸｈｏ
Ｉ部に挿入した。得られたプラスミドは、ｔＴＡとハイグロマイシン転写ユニッ
トの両方を対向する方向で含み、ｐＣＲＡＺＹと呼んだ。
【００５２】 キメラＮＩＰ特異的ｓｃＦｖ−ＴＣＲζ分子を、前述のように構築し（１２）
、プラスミドｐＵＨＤ１０−３中へクローン化した。これを行なうために、ｐＵ
ＨＤ１０−３からのＨｉｎｄIII部位をＨｉｎｄIIIによる開裂によって取出し、
その後クレノウ補填および平滑末端連結を行い、ｐＬＡＶ５を得た。ｐＬＡＶ６
構築のため、プラスミドｐＶＡＣｌ．ａＮＩＰ．ＴＣＲζ（引用文献１１に記載
）から誘導される１３４２ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ Ｉフラグメントは、ヒ トＶＨ１リーダー配列およびキメラＮＩＰ特異的ＴＣＲζ分子を含むものであり
、これをｐＬＡＶ５のＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ Ｉポリリンカー部位へクローン化 した。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター部分配列を含む９１ｂｐのＥ
ｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消 化することによりｐＬＡＶ６から取出し、クレノウ補填および平滑末端連結を行
って、プラスミドｐＬＡＶ７を得た。ベクター構築物、Ｈｉｎｄ III−Ｂｇｌ I
I−ＥｃｏＲＶ−Ｃｌａ Ｉに固有の制限部位を含むポリリンカー（５８２６：５
’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧ
ＣＴＴＡＡＴ−３’配列ＩＤ Ｎｏ．１）および５８２７：５’−ＡＴＴＡＡＧ
ＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣ
ＧＴ−３’配列ＩＤ Ｎｏ．２）を、ｐＬＡＶ７のＳｓｐ Ｉ−ＡａｔＩＩ部位 中に連結し、ｐＬＡＶ８を得た。ＴＲＰの制御下で、ｔＴＡトランスアクチベー
ター遺伝子とキメラＮＩＰ特異的ｓｃＦｖ−ＴＣＲζ遺伝子の両方を有する単体
プラスミドをアンチセンス配向（ｔＴＡ転写ユニットに対して）で構築するため
に、プラスミドｐＣＲＡＺＹをＸｍｎＩで消化し、この部位にＢｇｌ IIリンカ ー（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）を導入した。Ｂｇｌ IIおよび Ｈｉｎｄ IIIでの消化後、９３８６ｂｐのフラグメントをｐＬＡＶ８のＢｇｌ I
I−Ｈｉｎｄ III部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＬＡＶ１２と呼んだ （図１Ａ）。
、プラスミドｐＵＨＤ１０−３中へクローン化した。これを行なうために、ｐＵ
ＨＤ１０−３からのＨｉｎｄIII部位をＨｉｎｄIIIによる開裂によって取出し、
その後クレノウ補填および平滑末端連結を行い、ｐＬＡＶ５を得た。ｐＬＡＶ６
構築のため、プラスミドｐＶＡＣｌ．ａＮＩＰ．ＴＣＲζ（引用文献１１に記載
）から誘導される１３４２ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ Ｉフラグメントは、ヒ トＶＨ１リーダー配列およびキメラＮＩＰ特異的ＴＣＲζ分子を含むものであり
、これをｐＬＡＶ５のＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ Ｉポリリンカー部位へクローン化 した。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター部分配列を含む９１ｂｐのＥ
ｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消 化することによりｐＬＡＶ６から取出し、クレノウ補填および平滑末端連結を行
って、プラスミドｐＬＡＶ７を得た。ベクター構築物、Ｈｉｎｄ III−Ｂｇｌ I
I−ＥｃｏＲＶ−Ｃｌａ Ｉに固有の制限部位を含むポリリンカー（５８２６：５
’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧ
ＣＴＴＡＡＴ−３’配列ＩＤ Ｎｏ．１）および５８２７：５’−ＡＴＴＡＡＧ
ＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣ
ＧＴ−３’配列ＩＤ Ｎｏ．２）を、ｐＬＡＶ７のＳｓｐ Ｉ−ＡａｔＩＩ部位 中に連結し、ｐＬＡＶ８を得た。ＴＲＰの制御下で、ｔＴＡトランスアクチベー
ター遺伝子とキメラＮＩＰ特異的ｓｃＦｖ−ＴＣＲζ遺伝子の両方を有する単体
プラスミドをアンチセンス配向（ｔＴＡ転写ユニットに対して）で構築するため
に、プラスミドｐＣＲＡＺＹをＸｍｎＩで消化し、この部位にＢｇｌ IIリンカ ー（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）を導入した。Ｂｇｌ IIおよび Ｈｉｎｄ IIIでの消化後、９３８６ｂｐのフラグメントをｐＬＡＶ８のＢｇｌ I
I−Ｈｉｎｄ III部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＬＡＶ１２と呼んだ （図１Ａ）。
【００５３】 細胞培養およびトランスフェクション： JurkatＴ細胞系（クローンＥ６−１
）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／
ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２５ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（すべてＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Gaitersburg, MD）からのもの） で補足されたＲＰＭＩ１６４０（完全培地（ＣＭ）と呼ぶ）中に維持した。安定
な細胞系を生成させるため、前述のように（１３）、Jurkat細胞を、電気穿孔法
により、２５０ｍＶおよび９６０μＦで、線状にされたプラスミドＤＮＡ（１０
μｇ）で形質転換した。形質導入体を、０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ
（Calbiochem, San Diego, CA）で補足されたＣＭ中において選択した。安定な 細胞系は、３〜４週間後に樹立され、ＦＡＣＳによってｃｈＴＣＲの発現につい
て分析された。ｃｈＴＣＲζ発現細胞の個体群を選択するため、線状化ｐＬＡＶ
１２ＡまたはｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζにより誘導されたプラスミドフラ
グメントで形質転換された安定なJurkat細胞を、ＦＡＣＳ分類した（下記参照）
。得られた個体群を、限界希釈により２回クローン化し、フローサイトメトリー
によってタンパク質の発現についてスクリーニングした。
）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／
ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２５ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（すべてＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Gaitersburg, MD）からのもの） で補足されたＲＰＭＩ１６４０（完全培地（ＣＭ）と呼ぶ）中に維持した。安定
な細胞系を生成させるため、前述のように（１３）、Jurkat細胞を、電気穿孔法
により、２５０ｍＶおよび９６０μＦで、線状にされたプラスミドＤＮＡ（１０
μｇ）で形質転換した。形質導入体を、０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ
（Calbiochem, San Diego, CA）で補足されたＣＭ中において選択した。安定な 細胞系は、３〜４週間後に樹立され、ＦＡＣＳによってｃｈＴＣＲの発現につい
て分析された。ｃｈＴＣＲζ発現細胞の個体群を選択するため、線状化ｐＬＡＶ
１２ＡまたはｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζにより誘導されたプラスミドフラ
グメントで形質転換された安定なJurkat細胞を、ＦＡＣＳ分類した（下記参照）
。得られた個体群を、限界希釈により２回クローン化し、フローサイトメトリー
によってタンパク質の発現についてスクリーニングした。
【００５４】 フローサイトメトリーおよびセルソート： 細胞表面タンパク質の発現を、（
１４）に記載の標準直接免疫蛍光によってＦＩＴＣ抱合抗体の飽和量を用いて行
った。死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウムと前方光散乱の組合せを用い、分析か
ら排除した。すべての実験において、適当なＦＩＴＣアイソタイプに合致する、
関連性のないＡｂを用いた。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）装置（Becton
Dickinson, Mountain View, CA）を用いて分析した。各試料について最低２０ ，０００の細胞を分析した。その後、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（バージ
ョン１．２）（Becton Dickinson）を用いてデータの再解析を行なった。さらに
、マウスλ光鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清で染色した細胞を、セルソータ
ー（ＦＡＣScalibur，Becton Dickinson）において無菌条件下で分類した。
１４）に記載の標準直接免疫蛍光によってＦＩＴＣ抱合抗体の飽和量を用いて行
った。死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウムと前方光散乱の組合せを用い、分析か
ら排除した。すべての実験において、適当なＦＩＴＣアイソタイプに合致する、
関連性のないＡｂを用いた。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）装置（Becton
Dickinson, Mountain View, CA）を用いて分析した。各試料について最低２０ ，０００の細胞を分析した。その後、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（バージ
ョン１．２）（Becton Dickinson）を用いてデータの再解析を行なった。さらに
、マウスλ光鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清で染色した細胞を、セルソータ
ー（ＦＡＣScalibur，Becton Dickinson）において無菌条件下で分類した。
【００５５】 ＩＬ−２放出アッセイ： 細胞を、５×１０5／ｍｌの濃度でＣＭ中４８時間 、指定された濃度のテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの不在下もしくは
存在下で予め培養した。その後、細胞を洗浄し、計数し、プラスチック固定化Ｎ
ＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体（ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ）またはプラスチック固定化抗
ＣＤ３ε ｍＡｂ（ianti-ＣＤ３）を用いて、新鮮なＣＭ単独において、または
薬剤（１２）の存在下において、３連で刺激した（１０5／ウェル）。プレート は、５％のＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。２０時間後、上澄み液を採 取し、ＥＬＩＳＡキット（Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA）を用いてＩＬ
−２活性について検定した。
存在下で予め培養した。その後、細胞を洗浄し、計数し、プラスチック固定化Ｎ
ＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体（ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ）またはプラスチック固定化抗
ＣＤ３ε ｍＡｂ（ianti-ＣＤ３）を用いて、新鮮なＣＭ単独において、または
薬剤（１２）の存在下において、３連で刺激した（１０5／ウェル）。プレート は、５％のＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。２０時間後、上澄み液を採 取し、ＥＬＩＳＡキット（Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA）を用いてＩＬ
−２活性について検定した。
【００５６】 結果 ｔｅｔ調節可能なベクターの設計 ｃｈＴＣＲの発現がＴ細胞において薬理学的に調節され得るかどうかを判断す
るため、本発明者らはプラスミドｐＬＡＶ１２およびｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．Ｔ
ＣＲζ（図１、およびAlvarez-Vallina他、1997 J.Immunol 159, 5889）を構築 した。図１Ａおよび１Ｂは、実験に用いられる典型的なプラスミドフラグメント
の概略地図であり、宿主ゲノムへの統合の後予測される構造、それぞれ（Ａ）ｐ
ＬＡＶ１２および（Ｂ）ｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζを示す。転写の方向は
矢印で示す。
るため、本発明者らはプラスミドｐＬＡＶ１２およびｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．Ｔ
ＣＲζ（図１、およびAlvarez-Vallina他、1997 J.Immunol 159, 5889）を構築 した。図１Ａおよび１Ｂは、実験に用いられる典型的なプラスミドフラグメント
の概略地図であり、宿主ゲノムへの統合の後予測される構造、それぞれ（Ａ）ｐ
ＬＡＶ１２および（Ｂ）ｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζを示す。転写の方向は
矢印で示す。
【００５７】 両者の構造物とも、すでに説明された（１２）キメラＴＣＲ分子をコードし、
これは、ヒトＴＣＲζ鎖（１６）の細胞質領域およびトランスメンブランに融合
されるハプテン特異的（ＮＩＰ）ｍＡｂ Ｂ１．８（１５）の抗原結合部位を含
む。ｐＬＡＶ１２（図１Ａ）は、テトラサイクリンにより調節可能な構造物であ
り、構造的ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にあるｔＴＡ遺伝子およびｔＴＡ
応答プロモーターの制御下で挿入されたｃｈＴＣＲをコードする遺伝子とともに
、ＴＲＳのすべての要素を含む。ＴＲＰ活性の潜在的なシス調節の増強を減じる
ための試みにおいて、ベクターに存在する他のエンハンサーおよびプロモーター
要素の接近のため、ｔＴＡ応答カセットを、ｐＵＣ誘導ＣｏｌＥ１複製起点およ
びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む２５００ｂｐのフラグメントによって他の転写
ユニットから分離した（図１Ａ）。対照構造物において、ｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ
．ＴＣＲζ、ｃｈＴＣＲ分子は、構造的ＣＭＶ ＩＥプロモーター（図１Ｂ）の
制御下に置かれた。
これは、ヒトＴＣＲζ鎖（１６）の細胞質領域およびトランスメンブランに融合
されるハプテン特異的（ＮＩＰ）ｍＡｂ Ｂ１．８（１５）の抗原結合部位を含
む。ｐＬＡＶ１２（図１Ａ）は、テトラサイクリンにより調節可能な構造物であ
り、構造的ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にあるｔＴＡ遺伝子およびｔＴＡ
応答プロモーターの制御下で挿入されたｃｈＴＣＲをコードする遺伝子とともに
、ＴＲＳのすべての要素を含む。ＴＲＰ活性の潜在的なシス調節の増強を減じる
ための試みにおいて、ベクターに存在する他のエンハンサーおよびプロモーター
要素の接近のため、ｔＴＡ応答カセットを、ｐＵＣ誘導ＣｏｌＥ１複製起点およ
びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む２５００ｂｐのフラグメントによって他の転写
ユニットから分離した（図１Ａ）。対照構造物において、ｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ
．ＴＣＲζ、ｃｈＴＣＲ分子は、構造的ＣＭＶ ＩＥプロモーター（図１Ｂ）の
制御下に置かれた。
【００５８】 これらの構造物は両者とも、構成的プロモーターによって転写されるハイグロ
マイシン耐性マーカー遺伝子をコードする。形質転換Ｔ細胞においてこれらのＤ
ＮＡ構築物が設計された構成で安定に統合されるのを促進するため、プラスミド
ｐＬＡＶ１２からの線状化Avr II-Sap I ９９７５ｂｐＤＮＡフラグメント（図 １Ａ）およびプラスミドｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζから誘導された線状化
Avr II-EcoRV７５５１ｂｐフラグメント（図１Ｂ）（両者ともＥＢＶ複製起点お
よびＥＢＮＡ−１遺伝子（図１）を欠く）が、Jurkat細胞を形質転換するために
用いられた。
マイシン耐性マーカー遺伝子をコードする。形質転換Ｔ細胞においてこれらのＤ
ＮＡ構築物が設計された構成で安定に統合されるのを促進するため、プラスミド
ｐＬＡＶ１２からの線状化Avr II-Sap I ９９７５ｂｐＤＮＡフラグメント（図 １Ａ）およびプラスミドｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζから誘導された線状化
Avr II-EcoRV７５５１ｂｐフラグメント（図１Ｂ）（両者ともＥＢＶ複製起点お
よびＥＢＮＡ−１遺伝子（図１）を欠く）が、Jurkat細胞を形質転換するために
用いられた。
【００５９】 キメラｓｃＦｖ遺伝子構造物のｔＴＡ依存性発現 ｐＬＡＶ１２およびｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζの線状化フラグメントで
JurkatＥ６−１細胞を形質転換した。ｃｈＴＣＲのより高い発現について選択す
るために、安定に形質転換されたハイグロマイシン耐性細胞を、 ＦＩＴＣ標識 ヤギ抗マウスλ軽鎖抗血清で染色した後、ＦＡＣＳ分類した。分離されたｐＬＡ
Ｖ１２形質導入体（ＪＬＡＶ１２Ｓ）およびｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζ形
質導入体（ＪＮ３Ｓ細胞）のほとんどは、ｃｈＴＣＲを発現したが、発現の絶対
レベルにおいてかなりの不均一性が見られた（図２Ａ、２Ｂ）。
JurkatＥ６−１細胞を形質転換した。ｃｈＴＣＲのより高い発現について選択す
るために、安定に形質転換されたハイグロマイシン耐性細胞を、 ＦＩＴＣ標識 ヤギ抗マウスλ軽鎖抗血清で染色した後、ＦＡＣＳ分類した。分離されたｐＬＡ
Ｖ１２形質導入体（ＪＬＡＶ１２Ｓ）およびｐＣＥＰ４．ａＮＩＰ．ＴＣＲζ形
質導入体（ＪＮ３Ｓ細胞）のほとんどは、ｃｈＴＣＲを発現したが、発現の絶対
レベルにおいてかなりの不均一性が見られた（図２Ａ、２Ｂ）。
【００６０】 図２は、テトラサイクリン類似体によるｃｈＴＣＲ遺伝子発現の調節を確認す
る典型的結果を示す。図２Ａでは、安定な形質転換された非クローン化ＪＬＡＶ
１２Ｓ（左手側）およびＪＮ３ＳJurkat（右手側）細胞の個体群を、テトラサイ
クリンのない培地中で（ＣＭ、パネルの上列）または１μｇ／ｍｌのＴｅｔ（破
線）もしくはＤｏｘ（実線）の存在下で（パネルの下列）４８時間培養し、マウ
スλ軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清での染色後、ｃｈＴＣＲの表面発現を
調べた。図２Ｂは、Ｄｏｘを１μｇ／ｍｌで添加した後のＪＬＡＶ１２Ｓ細胞に
おけるｃｈＴＣＲ遺伝子発現の不活性化の時間経過を、０時間（左上）、８時間
（右上）、１２時間（左下）または２４時間（右下）について示している。図２
Ａおよび２Ｂの両方において、陰性の対照（マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ抱合
ヤギ抗血清）は重ね合わせている（塗りつぶした部分）。蛍光チャンネル数がｘ
軸に沿ってプロットされ、ｙ軸は対応の細胞数を表わす。
る典型的結果を示す。図２Ａでは、安定な形質転換された非クローン化ＪＬＡＶ
１２Ｓ（左手側）およびＪＮ３ＳJurkat（右手側）細胞の個体群を、テトラサイ
クリンのない培地中で（ＣＭ、パネルの上列）または１μｇ／ｍｌのＴｅｔ（破
線）もしくはＤｏｘ（実線）の存在下で（パネルの下列）４８時間培養し、マウ
スλ軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清での染色後、ｃｈＴＣＲの表面発現を
調べた。図２Ｂは、Ｄｏｘを１μｇ／ｍｌで添加した後のＪＬＡＶ１２Ｓ細胞に
おけるｃｈＴＣＲ遺伝子発現の不活性化の時間経過を、０時間（左上）、８時間
（右上）、１２時間（左下）または２４時間（右下）について示している。図２
Ａおよび２Ｂの両方において、陰性の対照（マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ抱合
ヤギ抗血清）は重ね合わせている（塗りつぶした部分）。蛍光チャンネル数がｘ
軸に沿ってプロットされ、ｙ軸は対応の細胞数を表わす。
【００６１】 ｐＬＡＶ１２形質導入体（ＪＬＡＶ１２Ｓ）の選択された個体群をその後限界
希釈によってクローン化し、ｃｈＴＣＲを低いレベル（２Ｅ１１）および中間レ
ベル（ＩＦ５）で発現する２つのサブクローン（図３）を、さらなる研究のため
に選択した。
希釈によってクローン化し、ｃｈＴＣＲを低いレベル（２Ｅ１１）および中間レ
ベル（ＩＦ５）で発現する２つのサブクローン（図３）を、さらなる研究のため
に選択した。
【００６２】 キメラｓｃＦｖ−ＴＣＲζ遺伝子発現の調節 ｃｈＴＣＲの発現がテトラサイクリンによって抑制され得るかどうかを判断す
るため、ＪＬＡＶ１２ＳおよびＪＮ３Ｓ細胞（５×１０5／ｍｌ）を１μｇ／ｍ ｌのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）またはその類似体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）
の存在下で４８時間インキュベートした。この濃度で、表面ｃｈＴＣＲの大部分
（９０％）がＪＬＡＶ１２Ｓ細胞においてダウンレギュレーションされたが、Ｊ
Ｎ３Ｓ細胞においては影響を受けなかった（図２Ａ）。また、抗ＣＤ３ε ｍＡ
ｂを用いる表面染色によって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の量が両方の細胞個体群に
おいて一定なままであることがわかった（図示せず）。トリパンブルー染色を用
いて検定したこの濃度では、細胞生存能力における変化は観察されなかった（デ
ータは示さず）。
るため、ＪＬＡＶ１２ＳおよびＪＮ３Ｓ細胞（５×１０5／ｍｌ）を１μｇ／ｍ ｌのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）またはその類似体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）
の存在下で４８時間インキュベートした。この濃度で、表面ｃｈＴＣＲの大部分
（９０％）がＪＬＡＶ１２Ｓ細胞においてダウンレギュレーションされたが、Ｊ
Ｎ３Ｓ細胞においては影響を受けなかった（図２Ａ）。また、抗ＣＤ３ε ｍＡ
ｂを用いる表面染色によって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の量が両方の細胞個体群に
おいて一定なままであることがわかった（図示せず）。トリパンブルー染色を用
いて検定したこの濃度では、細胞生存能力における変化は観察されなかった（デ
ータは示さず）。
【００６３】 遺伝子発現の不活性化の時間経過を研究するため、１μｇ／ｍｌで抗生物質を
添加した後、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞を異なる時間において分析した（図２Ｂ）。薬
剤にさらして８時間以内でわずかな減少が観察され、２４時間以内で最大の抑制
が達成され、このときｃｈＴＣＲの発現は、テトラサイクリンの不在下において
同時点で観察されるレベルの１０パーセント未満に落ちた（図２Ｂ）。１Ｅ５ク
ローンおよび２Ｅ１１クローンにおいても同様の結果が見られ、ｃｈＴＣＲのレ
ベルは、その最大発現の約１０％（１Ｅ５）および２０％（２Ｅ１１）まで減少
した（図３）。遺伝子抑制の時間経過は、すべての分析された個体群において両
方の抗生物質（ＴｅｔまたはＤｏｘ）に対し非常に類似していた。留意すべき重
要なことは、テトラサイクリンがｃｈＴＣＲの発現をダウンレギュレーションし
なかった細胞の百分率は＜０．５％であり、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞の全個体群にお
ける全体の調節には影響を与えなかった（図２Ａ）ことである。
添加した後、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞を異なる時間において分析した（図２Ｂ）。薬
剤にさらして８時間以内でわずかな減少が観察され、２４時間以内で最大の抑制
が達成され、このときｃｈＴＣＲの発現は、テトラサイクリンの不在下において
同時点で観察されるレベルの１０パーセント未満に落ちた（図２Ｂ）。１Ｅ５ク
ローンおよび２Ｅ１１クローンにおいても同様の結果が見られ、ｃｈＴＣＲのレ
ベルは、その最大発現の約１０％（１Ｅ５）および２０％（２Ｅ１１）まで減少
した（図３）。遺伝子抑制の時間経過は、すべての分析された個体群において両
方の抗生物質（ＴｅｔまたはＤｏｘ）に対し非常に類似していた。留意すべき重
要なことは、テトラサイクリンがｃｈＴＣＲの発現をダウンレギュレーションし
なかった細胞の百分率は＜０．５％であり、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞の全個体群にお
ける全体の調節には影響を与えなかった（図２Ａ）ことである。
【００６４】 遺伝子抑制の用量−応答曲線を、異なる濃度のＴｅｔまたはＤｏｘを用いて測
定した。４８時間の処理後、細胞を採取し、ｃｈＴＣＲの発現をＦＡＣＳ分析に
よって研究した。典型的結果を図３に示す。
定した。４８時間の処理後、細胞を採取し、ｃｈＴＣＲの発現をＦＡＣＳ分析に
よって研究した。典型的結果を図３に示す。
【００６５】 安定的に形質転換されたクローン化されていない（ＪＬＡＶ２Ｓ（左手欄））
およびクローン化された（１Ｆ５（中央欄）および２Ｅ１１（右手欄））Jurkat
細胞個体群を、異なる濃度（上列０ｎｇ／ｍｌ、２番目の列０．１ｎｇ／ｍｌ、
３番目の列１ｎｇ／ｍｌ、および１番下の列１０ｎｇ／ｍｌ）のＴｅｔ（破線）
またはＤｏｘ（実線）の存在下で４８時間培養し、ｓｃＦｖ−ＴＣＲζ分子の表
面発現を調べた。陰性の対照（マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清）
は重ね合わせている（塗りつぶした部分）。蛍光チャンネル数はｘ軸に沿ってプ
ロットされ、ｙ軸は対応の細胞数を表わす。
およびクローン化された（１Ｆ５（中央欄）および２Ｅ１１（右手欄））Jurkat
細胞個体群を、異なる濃度（上列０ｎｇ／ｍｌ、２番目の列０．１ｎｇ／ｍｌ、
３番目の列１ｎｇ／ｍｌ、および１番下の列１０ｎｇ／ｍｌ）のＴｅｔ（破線）
またはＤｏｘ（実線）の存在下で４８時間培養し、ｓｃＦｖ−ＴＣＲζ分子の表
面発現を調べた。陰性の対照（マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清）
は重ね合わせている（塗りつぶした部分）。蛍光チャンネル数はｘ軸に沿ってプ
ロットされ、ｙ軸は対応の細胞数を表わす。
【００６６】 図３を参照して、両方のクローン個体群（１Ｅ５および２Ｅ１１）において、
ｃｈＴＣＲの発現は１００ｐｇ／ｍｌ（０．１ｎｇ／ｍｌ）のＤｏｘで最大に抑
制され、より高い濃度において抑制レベルにさらなる増加は見られなかった。Ｔ
ＲＰの部分活性を１ｐｇ／ｍｌから１００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲のＤｏｘにおい
て観察した（データは図示せず）。ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞においては、１ｎｇ／ｍ
ｌに等しいかそれより高いＤｏｘ濃度で最大抑制が観察された。テトラサイクリ
ンについては、分析した細胞系のすべてにおいて１０ｎｇ／ｍｌに等しいかそれ
より高い濃度で最大抑制が起こった。ｃｈＴＣＲ遺伝子の誘発は１００ｐｇ／ｍ
ｌから１ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリン濃度で部分的にのみ抑制された。
ｃｈＴＣＲの発現は１００ｐｇ／ｍｌ（０．１ｎｇ／ｍｌ）のＤｏｘで最大に抑
制され、より高い濃度において抑制レベルにさらなる増加は見られなかった。Ｔ
ＲＰの部分活性を１ｐｇ／ｍｌから１００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲のＤｏｘにおい
て観察した（データは図示せず）。ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞においては、１ｎｇ／ｍ
ｌに等しいかそれより高いＤｏｘ濃度で最大抑制が観察された。テトラサイクリ
ンについては、分析した細胞系のすべてにおいて１０ｎｇ／ｍｌに等しいかそれ
より高い濃度で最大抑制が起こった。ｃｈＴＣＲ遺伝子の誘発は１００ｐｇ／ｍ
ｌから１ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリン濃度で部分的にのみ抑制された。
【００６７】 テトラサイクリンの投与を中止した後の、ＴＲＰ駆動遺伝子発現回復の動力学
を研究するため、安定的な形質転換されたクローン化されていないＪＬＡＶ１２
Ｓ細胞を、異なる濃度のＤｏｘ（１ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ）の存在下で４
８時間培養した。３回の洗浄後、細胞を新しいプレートでテトラサイクリンのな
いＣＭ中においてインキュベート（５×１０5／ｍｌ）し、ｃｈＴＣＲの表面発 現を、マウスλ軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清での染色後、２４〜４８時
間毎に調べた。その結果を図４に示す。また、同様の実験を１Ｆ５細胞を用いて
行なった（データは示さず）。
を研究するため、安定的な形質転換されたクローン化されていないＪＬＡＶ１２
Ｓ細胞を、異なる濃度のＤｏｘ（１ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ）の存在下で４
８時間培養した。３回の洗浄後、細胞を新しいプレートでテトラサイクリンのな
いＣＭ中においてインキュベート（５×１０5／ｍｌ）し、ｃｈＴＣＲの表面発 現を、マウスλ軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清での染色後、２４〜４８時
間毎に調べた。その結果を図４に示す。また、同様の実験を１Ｆ５細胞を用いて
行なった（データは示さず）。
【００６８】 １００％の値は、マウス軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清での染色後にお
ける、対照未処理細胞の蛍光のメジアンに対応する。数値は、各細胞個体群から
のテトラサイクリンで処理された細胞に発現したキメラＴＣＲζ分子を、対照未
処理細胞におけるキメラＴＣＲζ分子の量（１００％とする）と比較した百分率
である。図４を参照して、細胞を１μｇ／ｍｌのＤｏｘで処理した後（黒丸）、
薬剤除去後１９２時間ではｃｈＴＣＲ発現の回復ははっきりせず、２１６時間後
に細胞表面上で初めて検出され、発現が完全に回復したのは２８８時間後であっ
た。一方、ＴＲＰは薬剤の除去後２４時間だけ抑制を維持し、細胞を１μｇ／ｍ
ｌのＴｅｔで予め処理したとき、７２時間後にｃｈＴＣＲ発現は最高レベルに到
達した（データは図示せず）。より低い濃度のＴｅｔ（図示せず）またはＤｏｘ
（１ｎｇ／ｍｌ−白四角、１０ｎｇ／ｍｌ−黒四角、１００ｎｇ／ｍｌ−白丸）
で細胞を処理した結果、ＴＲＰの活性はより早く回復した。
ける、対照未処理細胞の蛍光のメジアンに対応する。数値は、各細胞個体群から
のテトラサイクリンで処理された細胞に発現したキメラＴＣＲζ分子を、対照未
処理細胞におけるキメラＴＣＲζ分子の量（１００％とする）と比較した百分率
である。図４を参照して、細胞を１μｇ／ｍｌのＤｏｘで処理した後（黒丸）、
薬剤除去後１９２時間ではｃｈＴＣＲ発現の回復ははっきりせず、２１６時間後
に細胞表面上で初めて検出され、発現が完全に回復したのは２８８時間後であっ
た。一方、ＴＲＰは薬剤の除去後２４時間だけ抑制を維持し、細胞を１μｇ／ｍ
ｌのＴｅｔで予め処理したとき、７２時間後にｃｈＴＣＲ発現は最高レベルに到
達した（データは図示せず）。より低い濃度のＴｅｔ（図示せず）またはＤｏｘ
（１ｎｇ／ｍｌ−白四角、１０ｎｇ／ｍｌ−黒四角、１００ｎｇ／ｍｌ−白丸）
で細胞を処理した結果、ＴＲＰの活性はより早く回復した。
【００６９】 例２ 機能研究 この研究に使用されるｃｈＴＣＲが、可溶性のまたはプラスチック固定化され
たそのコグネイト抗原（ＢＳＡに抱合されたＮＩＰ）の特異的認識を媒介でき、
形質転換されたＴ細胞によるＩＬ−２の生産をもたらすということは以前から示
されている（１２）。本研究において、本発明者らは、ｃｈＴＣＲ発現細胞（Ｊ
Ｎ３Ｓ、ＪＬＡＶ１２Ｓ、１Ｆ５および２Ｅ１１）をプラスチック固定化ＮＩＰ 10 −ＢＳＡ抱合体で刺激すると、ＩＬ−２分泌（データは図示せず）が誘発され
ることを一貫して見出した。ＩＬ−２の生産レベルは、形質導入細胞の種々の個
体群間で変化するが、概して、マイクロタイターウェルに固定化された抗ＣＤ３
εｍＡｂによる標準化刺激に応答して同じ細胞個体群で観察されるものと同様で
あった（図示せず）。
たそのコグネイト抗原（ＢＳＡに抱合されたＮＩＰ）の特異的認識を媒介でき、
形質転換されたＴ細胞によるＩＬ−２の生産をもたらすということは以前から示
されている（１２）。本研究において、本発明者らは、ｃｈＴＣＲ発現細胞（Ｊ
Ｎ３Ｓ、ＪＬＡＶ１２Ｓ、１Ｆ５および２Ｅ１１）をプラスチック固定化ＮＩＰ 10 −ＢＳＡ抱合体で刺激すると、ＩＬ−２分泌（データは図示せず）が誘発され
ることを一貫して見出した。ＩＬ−２の生産レベルは、形質導入細胞の種々の個
体群間で変化するが、概して、マイクロタイターウェルに固定化された抗ＣＤ３
εｍＡｂによる標準化刺激に応答して同じ細胞個体群で観察されるものと同様で
あった（図示せず）。
【００７０】 高濃度のテトラサイクリンがＴ細胞活性化のプロセスを妨害することは示され
ている（１７）として、本発明者らは、ＴｅｔおよびＤｏｘの濃度を増していく
ことが、抗ＣＤ３εにより誘発されるJurkat細胞のＩＬ−２の分泌に与える効果
を研究した。ＩＬ−２の分泌は、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれより低いドキシサ
イクリン濃度では影響を受けなかったが、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン濃度
では２５％阻害された（図示せず）。１μｇ／ｍｌに等しいかそれより低い濃度
のテトラサイクリンは、抗ＣＤ３εにより誘発されるＩＬ−２の分泌に影響を与
えなかったが、これは未処理の細胞において観察されたものと同様であった（図
示せず）。これらの結果は、ヒトＴ細胞に対する免疫調節効果が最初に現れるし
きい値より１０００倍以上低い濃度のドキシサイクリンで、最大のＴＲＰ抑制を
誘発することが可能であることを示している。
ている（１７）として、本発明者らは、ＴｅｔおよびＤｏｘの濃度を増していく
ことが、抗ＣＤ３εにより誘発されるJurkat細胞のＩＬ−２の分泌に与える効果
を研究した。ＩＬ−２の分泌は、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれより低いドキシサ
イクリン濃度では影響を受けなかったが、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン濃度
では２５％阻害された（図示せず）。１μｇ／ｍｌに等しいかそれより低い濃度
のテトラサイクリンは、抗ＣＤ３εにより誘発されるＩＬ−２の分泌に影響を与
えなかったが、これは未処理の細胞において観察されたものと同様であった（図
示せず）。これらの結果は、ヒトＴ細胞に対する免疫調節効果が最初に現れるし
きい値より１０００倍以上低い濃度のドキシサイクリンで、最大のＴＲＰ抑制を
誘発することが可能であることを示している。
【００７１】 本発明者らは次に、テトラサイクリンによって媒介されるｃｈＴＣＲの抑制が
、形質転換されたJurkat細胞において抗原非応答性の可逆的状態を誘発し得るか
どうか検討した。ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞およびＪＮ３Ｓ細胞を、ＤｏｘおよびＴｅ
ｔの濃度を増加させて４８時間予めインキュベートし、次いで固定化ＮＩＰ−Ｂ
ＳＡで刺激し、それに続いてそれらのＩＬ−２生産を測定した。完全なＴＲＰ抑
制の状態において、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞は、表面ｃｈＴＣＲの９０％がダウンレ
ギュレーションされ（図３参照）、ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体での刺激に対し
て完全に非応答性であった（図５Ａ参照）。
、形質転換されたJurkat細胞において抗原非応答性の可逆的状態を誘発し得るか
どうか検討した。ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞およびＪＮ３Ｓ細胞を、ＤｏｘおよびＴｅ
ｔの濃度を増加させて４８時間予めインキュベートし、次いで固定化ＮＩＰ−Ｂ
ＳＡで刺激し、それに続いてそれらのＩＬ−２生産を測定した。完全なＴＲＰ抑
制の状態において、ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞は、表面ｃｈＴＣＲの９０％がダウンレ
ギュレーションされ（図３参照）、ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体での刺激に対し
て完全に非応答性であった（図５Ａ参照）。
【００７２】 図５Ａおよび５Ｂは、ＴｅｔまたはＤｏｘの不在下または存在下において、ｉ
ＮＩＰ１０−ＢＳＡで刺激された形質転換ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞（５Ａ）またはＪ
Ｎ３Ｓ細胞（５Ｂ）によるＩＬ−２生産を（ｐｇ／ｍｌで）示す棒グラフである
。細胞は、薬剤の不在下または存在下（示された濃度（ｎｇ／ｍｌ））で４８時
間予めインキュベートされ、洗浄され、新鮮なＣＭ単独（塗りつぶした棒）中に
おいて、または示された濃度のＴｅｔ（影をつけた棒）もしくはＤｏｘ（白い棒
）の存在下で、プラスチック固定化ＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体（５０μｇ／ｍｌ
）で刺激された（１０5／ウェル）。２つの同様の実験のうち１つを示す。
ＮＩＰ１０−ＢＳＡで刺激された形質転換ＪＬＡＶ１２Ｓ細胞（５Ａ）またはＪ
Ｎ３Ｓ細胞（５Ｂ）によるＩＬ−２生産を（ｐｇ／ｍｌで）示す棒グラフである
。細胞は、薬剤の不在下または存在下（示された濃度（ｎｇ／ｍｌ））で４８時
間予めインキュベートされ、洗浄され、新鮮なＣＭ単独（塗りつぶした棒）中に
おいて、または示された濃度のＴｅｔ（影をつけた棒）もしくはＤｏｘ（白い棒
）の存在下で、プラスチック固定化ＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱合体（５０μｇ／ｍｌ
）で刺激された（１０5／ウェル）。２つの同様の実験のうち１つを示す。
【００７３】 ｃｈＴＣＲの約７５％のダウンレギュレーションに伴ってＩＬ−２の生産は低
くなる一方、ｃｈＴＣＲ発現レベルがテトラサイクリンの不在下で観察されるも
のの約５０％であった場合、阻害作用は見られなかった（図５Ａ）。これらの結
果は、完全ＴＲＰ抑制の状況にあるＪＬＡＶ１２Ｓ細胞によって発現される表面
ｃｈＴＣＲ分子の数が、最適なＴ細胞機能に必要な活性化しきい値に到達するに
は十分でないことを示している。一方、ＪＮ３Ｓ細胞がｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱
合体で刺激されると、１μｇ／ｍｌ未満の濃度のテトラサイクリンおよびドキシ
サイクリンの阻害作用は見られなかった（図５Ｂ）。
くなる一方、ｃｈＴＣＲ発現レベルがテトラサイクリンの不在下で観察されるも
のの約５０％であった場合、阻害作用は見られなかった（図５Ａ）。これらの結
果は、完全ＴＲＰ抑制の状況にあるＪＬＡＶ１２Ｓ細胞によって発現される表面
ｃｈＴＣＲ分子の数が、最適なＴ細胞機能に必要な活性化しきい値に到達するに
は十分でないことを示している。一方、ＪＮ３Ｓ細胞がｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱
合体で刺激されると、１μｇ／ｍｌ未満の濃度のテトラサイクリンおよびドキシ
サイクリンの阻害作用は見られなかった（図５Ｂ）。
【００７４】 この例は、白血球の表面における白血球活性化分子の発現を調節することによ
り、標的細胞の表面に存在する異なる密度の白血球刺激分子（抗原など）に対し
、当該白血球の感受性を異ならしめることが可能である、ということを示してい
る。
り、標的細胞の表面に存在する異なる密度の白血球刺激分子（抗原など）に対し
、当該白血球の感受性を異ならしめることが可能である、ということを示してい
る。
【００７５】 例３ Jurkat Ｅ６−１ Ｔ細胞を線状化ｐＬＡＶ１２により安定に形質転換し、上
述のように、高レベルのテトラサイクリン抑制性発現を有するクローン（１Ｄ９
および２Ｄ６）を選択した。この系は受容体密度の研究に最適である。なぜなら
これは、細胞内シグナルを生成させかつ細胞応答性を調節し得るＴＣＲ連動状態
なしで、ｃｈＴＣＲ発現の転写的調節を可能にするからである（２１）。適当な
範囲のテトラサイクリン濃度を用いると、ｃｈＴＣＲ発現レベルの微妙な変化は
、容易に誘導することができ、しかも、固定されたテトラサイクリン濃度で連続
培養することによって、ある特定のレベルに安定に維持することができる（図６
Ａおよび６Ｂ）。
述のように、高レベルのテトラサイクリン抑制性発現を有するクローン（１Ｄ９
および２Ｄ６）を選択した。この系は受容体密度の研究に最適である。なぜなら
これは、細胞内シグナルを生成させかつ細胞応答性を調節し得るＴＣＲ連動状態
なしで、ｃｈＴＣＲ発現の転写的調節を可能にするからである（２１）。適当な
範囲のテトラサイクリン濃度を用いると、ｃｈＴＣＲ発現レベルの微妙な変化は
、容易に誘導することができ、しかも、固定されたテトラサイクリン濃度で連続
培養することによって、ある特定のレベルに安定に維持することができる（図６
Ａおよび６Ｂ）。
【００７６】 図６Ａは、マウスλ軽鎖に対するＦＩＴＣ抱合抗血清での染色後に、さまざま
な濃度のテトラサイクリンの存在下で４８時間培養された１Ｄ９（白丸）細胞お
よび２Ｄ６（黒丸）細胞の平均蛍光強度値を示す。
な濃度のテトラサイクリンの存在下で４８時間培養された１Ｄ９（白丸）細胞お
よび２Ｄ６（黒丸）細胞の平均蛍光強度値を示す。
【００７７】 図６Ｂは、テトラサイクリンのない培地（「未処理」と示された曲線）または
０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲（「未処理」および「対照」のグラフ間の塗りつ
ぶされていない曲線部分）におけるさまざまな濃度のテトラサイクリンの存在下
において、４８時間培養された１Ｄ９細胞（上のパネル）および２Ｄ６細胞（下
のパネル）のＦＡＣＳプロファイルを示している。陰性の対照（マウスＩｇＧに
対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清）は重ね合わせている（グラフの左端の塗りつぶ
された部分）。
０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲（「未処理」および「対照」のグラフ間の塗りつ
ぶされていない曲線部分）におけるさまざまな濃度のテトラサイクリンの存在下
において、４８時間培養された１Ｄ９細胞（上のパネル）および２Ｄ６細胞（下
のパネル）のＦＡＣＳプロファイルを示している。陰性の対照（マウスＩｇＧに
対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清）は重ね合わせている（グラフの左端の塗りつぶ
された部分）。
【００７８】 クローン１Ｄ９および２Ｄ６は、プラスチック固定化ＮＩＰ１０−ＢＳＡ抱合
体（ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ）により、それらのｃｈＴＣＲの抗原媒介連結の際に
ＩＬ−２を分泌するよう、活性化できることがわかった。マイクロタイタープレ
ートをＮＩＰ１０−ＢＳＡでコーティングし、次のように検査した。
体（ｉＮＩＰ１０−ＢＳＡ）により、それらのｃｈＴＣＲの抗原媒介連結の際に
ＩＬ−２を分泌するよう、活性化できることがわかった。マイクロタイタープレ
ートをＮＩＰ１０−ＢＳＡでコーティングし、次のように検査した。
【００７９】 組織培養処理される丸底の９６ウェルプレートのウェルを、１００μｇ／ｍｌ
から出発してＮＩＰ10−ＢＳＡの１０倍希釈を連続して３段階行ないそれぞれ得
られる希釈物１００μｌで、受動的にコーティングした。ウェルに結合されたＮ
ＩＰ10−ＢＳＡの相対量を、可溶性Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体フラグメント（１５）
を用いてＥＬＩＳＡにより算定した。この結合は、マウスλ鎖に対するヤギ抗血
清およびペルオキシダーゼ抱合抗ヤギ／ヒツジｍＡｂ ＧＴ−３４を用いて検出
した。その結果を図７Ａにグラフで示す。
から出発してＮＩＰ10−ＢＳＡの１０倍希釈を連続して３段階行ないそれぞれ得
られる希釈物１００μｌで、受動的にコーティングした。ウェルに結合されたＮ
ＩＰ10−ＢＳＡの相対量を、可溶性Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体フラグメント（１５）
を用いてＥＬＩＳＡにより算定した。この結合は、マウスλ鎖に対するヤギ抗血
清およびペルオキシダーゼ抱合抗ヤギ／ヒツジｍＡｂ ＧＴ−３４を用いて検出
した。その結果を図７Ａにグラフで示す。
【００８０】 本発明者らはこの後、ＮＩＰ10−ＢＳＡによりコーティングされたプレートが
１Ｄ９細胞および２Ｄ６細胞におけるＩＬ−２の生産を刺激する能力について調
べた。約５×１０4の細胞を、さまざまな量のＮＩＰ10−ＢＳＡ抱合体でコーテ ィングされた丸底９６−ウェルプレート中のテトラサイクリンを含まない培地に
おいて、刺激した。データは３つのうち１つの典型的な実験からのものであり、
図７Ｂに示す。ＩＬ−２測定値の標準誤差は１５％未満であった。図７Ｂでは、
１Ｄ９細胞についてのデータを白丸で示し、２Ｄ６細胞についてのデータを黒四
角で示している。
１Ｄ９細胞および２Ｄ６細胞におけるＩＬ−２の生産を刺激する能力について調
べた。約５×１０4の細胞を、さまざまな量のＮＩＰ10−ＢＳＡ抱合体でコーテ ィングされた丸底９６−ウェルプレート中のテトラサイクリンを含まない培地に
おいて、刺激した。データは３つのうち１つの典型的な実験からのものであり、
図７Ｂに示す。ＩＬ−２測定値の標準誤差は１５％未満であった。図７Ｂでは、
１Ｄ９細胞についてのデータを白丸で示し、２Ｄ６細胞についてのデータを黒四
角で示している。
【００８１】 図７Ｃおよび７Ｄは、クローン１Ｄ９（白丸）および２Ｄ６（黒四角）をさま
ざまな量のｉＮＩＰ１０−ＢＳａに２４時間さらした実験の結果を示す。図７Ｃ
には、生存能力を維持する細胞の数を示している（これはBoehmeおよびLenardo
1993 Leukemia（Baltimore）7,845 に記述された細胞蛍光測定法で測定された ）。細胞損失の割合は、１００×［１−（抗原性の刺激を受ける生存能力を有す
る細胞の数／何の処置も受けない生存能力を有する細胞の数）］として計算した
。
ざまな量のｉＮＩＰ１０−ＢＳａに２４時間さらした実験の結果を示す。図７Ｃ
には、生存能力を維持する細胞の数を示している（これはBoehmeおよびLenardo
1993 Leukemia（Baltimore）7,845 に記述された細胞蛍光測定法で測定された ）。細胞損失の割合は、１００×［１−（抗原性の刺激を受ける生存能力を有す
る細胞の数／何の処置も受けない生存能力を有する細胞の数）］として計算した
。
【００８２】 図７Ｄは、Vermes他（1995 J. Immunol. Methods 180, 39）に記述されるよう
に、アポトーシス細胞に結合するアネキシン（Annexin）Ｖによって測定した、 アポトーシスの評価を示す。膜の完全性を失った細胞を区別するために、分析の
前に最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるまでヨウ化プロピジウムを加えた。
に、アポトーシス細胞に結合するアネキシン（Annexin）Ｖによって測定した、 アポトーシスの評価を示す。膜の完全性を失った細胞を区別するために、分析の
前に最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるまでヨウ化プロピジウムを加えた。
【００８３】 本発明者らは、細胞をある範囲のさまざまな濃度のｉＮＩＰ１０−ＢＳＡにさ
らすと（図７Ａ）、低密度から中間密度の抗原密度でＩＬ−２の最適な分泌が見
られ、抗原密度がこのレベルを超えて増加するとその分泌が低下することを見出
した（図７Ｂ）。高い抗原密度でのＩＬ−２分泌の抑制は、細胞の生存能力に対
する明らかな用量−応答作用と関連性があった（図７Ｃ）。アネキシンＶ染色に
よって、この細胞生存能力の消失の根底にあるメカニズムがアポトーシスである
ことが明らかになり、両方のクローンは、アポトーシスに対して類似する用量−
応答を示すことが明らかになった（図７Ｄ）。
らすと（図７Ａ）、低密度から中間密度の抗原密度でＩＬ−２の最適な分泌が見
られ、抗原密度がこのレベルを超えて増加するとその分泌が低下することを見出
した（図７Ｂ）。高い抗原密度でのＩＬ−２分泌の抑制は、細胞の生存能力に対
する明らかな用量−応答作用と関連性があった（図７Ｃ）。アネキシンＶ染色に
よって、この細胞生存能力の消失の根底にあるメカニズムがアポトーシスである
ことが明らかになり、両方のクローンは、アポトーシスに対して類似する用量−
応答を示すことが明らかになった（図７Ｄ）。
【００８４】 ｃｈＴＣＲ受容体密度と、標的抗原の濃度と、Ｔ細胞応答との間の関係をさら
に探るため、さまざまな濃度のテトラサイクリン中に維持された（したがってさ
まざまな密度のｃｈＴＣＲを発現する）１Ｄ９細胞によるＩＬ−２の分泌を、さ
まざまな濃度のｉＮＩＰ１０−ＢＳＡの存在下で測定した。典型的な実験からの
データを図８のグラフに示す。これはいくつかの興味深い特徴を明らかにしてい
る。
に探るため、さまざまな濃度のテトラサイクリン中に維持された（したがってさ
まざまな密度のｃｈＴＣＲを発現する）１Ｄ９細胞によるＩＬ−２の分泌を、さ
まざまな濃度のｉＮＩＰ１０−ＢＳＡの存在下で測定した。典型的な実験からの
データを図８のグラフに示す。これはいくつかの興味深い特徴を明らかにしてい
る。
【００８５】 予想したとおり、細胞が高密度のｃｈＴＣＲを発現する場合、それを下回ると
きは最大のＩＬ−２応答を誘導することが不可能な抗原のしきい値濃度が存在す
る。同様に、それを下回ると、たとえ細胞を非常に高い濃度の抗原にさらしたと
してもＩＬ−２の分泌を誘導することが不可能な、低いしきい値のｃｈＴＣＲ受
容体密度が存在する。これら２つの極値の間には、ＩＬ−２分泌の刺激に必要な
しきい値抗原濃度がｃｈＴＣＲ発現レベルの増加につれて漸進的に低下していく
、中間の範囲のｃｈＴＣＲ密度が存在する。所定の抗原濃度で、ＩＬ−２応答の
強度は、ｃｈＴＣＲの細胞表面密度が該しきい値レベルを超えて増加すると、最
大レベルまで増加する。受容体の密度が、最大ＩＬ−２生産を与えるレベルを超
えてさらに増加すると、Ｔ細胞応答は次第に落込み、それに伴ってＴ細胞の生存
能力が失われ、おそらく結果としてｃｈＴＣＲを介する過剰なシグナル変換がも
たらされる。ＩＬ−２応答の受容体に依存する抑制は、ＴＣＲ発現の最も高いレ
ベルにおいてさえ、低い抗原濃度では見られなかった。また、図８は、Ｔ細胞を
最適に刺激することが可能なある所定の抗原濃度に対し、対応する狭い範囲の受
容体密度が存在し、それは、最適なＴ細胞応答の誘導と相関関係があるというこ
とを示している。この「理想の」受容体密度は、抗原濃度が低いと高い。一方、
それを下回ると抗原濃度に関係なく最大のＩＬ−２応答を引き出すことができな
くなる臨界最小受容体密度に達するまで、抗原濃度が増加すると、「理想の」受
容体密度は減少する。別の興味深い特徴は、高い抗原濃度でのｃｈＴＣＲ密度と
Ｔ細胞応答の抑制との関係である。グラフは、ｃｈＴＣＲ密度が低下すると、そ
れは、Ｔ細胞応答が広範囲の高い抗原濃度にわたって最適のままである範囲に入
るということを示している。抗原により媒介されるこの応答の抑制は、これらの
中間密度では達成されず、それは抗原濃度が達成可能な最も高い濃度であっても
達成されない。これらのデータは、Ｔ細胞の活性化に必要な抗原しきい値濃度を
ＴＣＲ密度が決めているということを確かなものにするとともに、過剰のＴＣＲ
誘発がＴ細胞応答を抑制するということをさらに明らかにしている（Critchfiel
d他、1994 Science 263, 1139）。しかしながら、この研究の最も重要な発見は 、周囲の抗原濃度に最適に応答するようにＴＣＲ密度が正しく合わせられた場合
にのみ、最適なＴ細胞の活性化が可能になることが明らかになったという点であ
る。したがって、このデータは、免疫応答の過程においてＴ細胞が受容体密度の
成熟を経験するという仮説に対して強力な支えとなる。
きは最大のＩＬ−２応答を誘導することが不可能な抗原のしきい値濃度が存在す
る。同様に、それを下回ると、たとえ細胞を非常に高い濃度の抗原にさらしたと
してもＩＬ−２の分泌を誘導することが不可能な、低いしきい値のｃｈＴＣＲ受
容体密度が存在する。これら２つの極値の間には、ＩＬ−２分泌の刺激に必要な
しきい値抗原濃度がｃｈＴＣＲ発現レベルの増加につれて漸進的に低下していく
、中間の範囲のｃｈＴＣＲ密度が存在する。所定の抗原濃度で、ＩＬ−２応答の
強度は、ｃｈＴＣＲの細胞表面密度が該しきい値レベルを超えて増加すると、最
大レベルまで増加する。受容体の密度が、最大ＩＬ−２生産を与えるレベルを超
えてさらに増加すると、Ｔ細胞応答は次第に落込み、それに伴ってＴ細胞の生存
能力が失われ、おそらく結果としてｃｈＴＣＲを介する過剰なシグナル変換がも
たらされる。ＩＬ−２応答の受容体に依存する抑制は、ＴＣＲ発現の最も高いレ
ベルにおいてさえ、低い抗原濃度では見られなかった。また、図８は、Ｔ細胞を
最適に刺激することが可能なある所定の抗原濃度に対し、対応する狭い範囲の受
容体密度が存在し、それは、最適なＴ細胞応答の誘導と相関関係があるというこ
とを示している。この「理想の」受容体密度は、抗原濃度が低いと高い。一方、
それを下回ると抗原濃度に関係なく最大のＩＬ−２応答を引き出すことができな
くなる臨界最小受容体密度に達するまで、抗原濃度が増加すると、「理想の」受
容体密度は減少する。別の興味深い特徴は、高い抗原濃度でのｃｈＴＣＲ密度と
Ｔ細胞応答の抑制との関係である。グラフは、ｃｈＴＣＲ密度が低下すると、そ
れは、Ｔ細胞応答が広範囲の高い抗原濃度にわたって最適のままである範囲に入
るということを示している。抗原により媒介されるこの応答の抑制は、これらの
中間密度では達成されず、それは抗原濃度が達成可能な最も高い濃度であっても
達成されない。これらのデータは、Ｔ細胞の活性化に必要な抗原しきい値濃度を
ＴＣＲ密度が決めているということを確かなものにするとともに、過剰のＴＣＲ
誘発がＴ細胞応答を抑制するということをさらに明らかにしている（Critchfiel
d他、1994 Science 263, 1139）。しかしながら、この研究の最も重要な発見は 、周囲の抗原濃度に最適に応答するようにＴＣＲ密度が正しく合わせられた場合
にのみ、最適なＴ細胞の活性化が可能になることが明らかになったという点であ
る。したがって、このデータは、免疫応答の過程においてＴ細胞が受容体密度の
成熟を経験するという仮説に対して強力な支えとなる。
【００８６】 Ｔ細胞生物学の研究に対する関心および関連性に加えて、本発明者の知見は、
Ｔ細胞の標的を癌抗原に定めるための手段として、１本鎖抗体ドメインがＴＣＲ
／ＣＤ３／ζ複合体の種々のシグナル部分に結合される、キメラ受容体を発現す
るＴ細胞の養子免疫伝達（Eshar他 1993、Brocker他 1996、ともに上記で引用
）を用いる、治療戦略の開発に関わってくる。このアプローチに対する主な理論
的異論として、通常の組織よりも豊富に癌細胞に発現されるにもかかわらず、癌
抗原の多くは真に腫瘍特異的ではないということである。しかしながら、本発明
者らのデータが示唆するところにより、キメラＴＣＲの発現レベルを固定するこ
とができるはずであり、それによって、工作されたＴ細胞は、高密度の標的抗原
を発現する癌細胞によって（同じ抗原を低い密度で発現する通常の細胞によって
ではなく）最適に活性化される。
Ｔ細胞の標的を癌抗原に定めるための手段として、１本鎖抗体ドメインがＴＣＲ
／ＣＤ３／ζ複合体の種々のシグナル部分に結合される、キメラ受容体を発現す
るＴ細胞の養子免疫伝達（Eshar他 1993、Brocker他 1996、ともに上記で引用
）を用いる、治療戦略の開発に関わってくる。このアプローチに対する主な理論
的異論として、通常の組織よりも豊富に癌細胞に発現されるにもかかわらず、癌
抗原の多くは真に腫瘍特異的ではないということである。しかしながら、本発明
者らのデータが示唆するところにより、キメラＴＣＲの発現レベルを固定するこ
とができるはずであり、それによって、工作されたＴ細胞は、高密度の標的抗原
を発現する癌細胞によって（同じ抗原を低い密度で発現する通常の細胞によって
ではなく）最適に活性化される。
【００８７】 例４ この例において、発明者らは、テトラサイクリンにより調節可能なキメラＴＣ
Ｒ分子を発現し、ＮＩＰハプテンでコーティングされた標的（ＨｅＬａ Ｓ３）
細胞によって刺激される、Ｔ細胞の能力を調査した。
Ｒ分子を発現し、ＮＩＰハプテンでコーティングされた標的（ＨｅＬａ Ｓ３）
細胞によって刺激される、Ｔ細胞の能力を調査した。
【００８８】 Jurkat Ｅ６−１細胞を、１０％ＦＣＳ、３ｍＭのＬ−グルタミン、抗生物質
、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（すべてGIBCO-BRL, Gaitersburg, MDより）、お
よび０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（上述のCalibiochem, San Diego,
CA）で補足されたＲＰＭＩ１６４０中に維持した。ヒーラＳ３細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２．２）を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質（
ＧＩＢＣＯ）で補足されたＤＭＥＭ中に維持した。
、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（すべてGIBCO-BRL, Gaitersburg, MDより）、お
よび０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（上述のCalibiochem, San Diego,
CA）で補足されたＲＰＭＩ１６４０中に維持した。ヒーラＳ３細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２．２）を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質（
ＧＩＢＣＯ）で補足されたＤＭＥＭ中に維持した。
【００８９】 標的細胞のハプテン修飾 ヒーラＳ３細胞をＰＢＳ中で入念に洗浄し、計数し、１０7／ｍｌの濃度に調 整した。乾燥ジメチルホルムアミド中５０ｍｇ／ｍｌの新鮮なＮＩＰ−ＣＡＰ−
Ｏｓｕ［アクプリン酸で隔てられた３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフ
ェニル酢酸のスクシンイミドエステル］溶液（Genosys Biotechnoligies Inc.,
Cambridge, UK）を、さまざまな量で細胞懸濁液に加え、その最終的な濃度範囲 を１〜１０μｇ／ｍｌとした。これらの細胞を３７℃で１時間インキュベートし
、その後１０％ＦＣＳで補足された冷ＰＢＳ１５ｍｌで３回洗浄した。
Ｏｓｕ［アクプリン酸で隔てられた３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフ
ェニル酢酸のスクシンイミドエステル］溶液（Genosys Biotechnoligies Inc.,
Cambridge, UK）を、さまざまな量で細胞懸濁液に加え、その最終的な濃度範囲 を１〜１０μｇ／ｍｌとした。これらの細胞を３７℃で１時間インキュベートし
、その後１０％ＦＣＳで補足された冷ＰＢＳ１５ｍｌで３回洗浄した。
【００９０】 フローサイトメトリー ｃｈＴＣＲ分子の発現は、マウスλ鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清を用い
て標準直接免疫蛍光法によりモニターした（Southern Biotechnology Associate
s, Inc., Birmingham, AL）。ハプテンにより修飾されたヒーラＳ３細胞に結合 されたＮＩＰの相対量を、飽和量の可溶性Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体フラグメントお
よびマウスλ鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清（Southern Biotechnology Ass
ociates, Inc., Birmingham, AL）を用いて間接的免疫蛍光法により算定した。 最低２０，０００個の細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）により分析し
た。
て標準直接免疫蛍光法によりモニターした（Southern Biotechnology Associate
s, Inc., Birmingham, AL）。ハプテンにより修飾されたヒーラＳ３細胞に結合 されたＮＩＰの相対量を、飽和量の可溶性Ｂ１．８ｓｃＦｖ抗体フラグメントお
よびマウスλ鎖に対するＦＩＴＣ抱合ヤギ抗血清（Southern Biotechnology Ass
ociates, Inc., Birmingham, AL）を用いて間接的免疫蛍光法により算定した。 最低２０，０００個の細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）により分析し
た。
【００９１】 Ｔ細胞の刺激 Jurkat １Ｄ９細胞（５×１０5／ｍｌ）を、テトラサイクリン塩酸塩（Sigma
Chemical CO., St Louis, MO）の不在下または存在下において４８時間予めイン
キュベートし、ｃｈＴＣＲの表面発現をＦＡＣＳ分析によって調べた。各アッセ
イにおいて、種々のｃｈＴＣＲ密度を発現する、５×１０4のエフェクターJurka
t１Ｄ９細胞を、種々のレベルのＮＩＰ修飾細胞表面タンパク質を発現する標的 ヒーラＳ３細胞とともに、培地単独において、あるいは抑制のために本来用いら
れるのと同じ濃度のテトラサイクリンの存在下において、さまざまなエフェクタ
ー：標的（Ｅ：Ｔ）比で、共培養した。これらの細胞を、丸底９６ウェルプレー
ト（Corning, NY, USA）において、３７℃、５％ＣＯ2、最終容量２００μｌに おいて、２連で培養し、２０時間後、細胞フリーの上澄み液を採取し、ＥＬＩＳ
Ａキット（Genzyme Diagnostic, Cambridge, MA）を用いてＩＬ−２の活性につ き検定した。
Chemical CO., St Louis, MO）の不在下または存在下において４８時間予めイン
キュベートし、ｃｈＴＣＲの表面発現をＦＡＣＳ分析によって調べた。各アッセ
イにおいて、種々のｃｈＴＣＲ密度を発現する、５×１０4のエフェクターJurka
t１Ｄ９細胞を、種々のレベルのＮＩＰ修飾細胞表面タンパク質を発現する標的 ヒーラＳ３細胞とともに、培地単独において、あるいは抑制のために本来用いら
れるのと同じ濃度のテトラサイクリンの存在下において、さまざまなエフェクタ
ー：標的（Ｅ：Ｔ）比で、共培養した。これらの細胞を、丸底９６ウェルプレー
ト（Corning, NY, USA）において、３７℃、５％ＣＯ2、最終容量２００μｌに おいて、２連で培養し、２０時間後、細胞フリーの上澄み液を採取し、ＥＬＩＳ
Ａキット（Genzyme Diagnostic, Cambridge, MA）を用いてＩＬ−２の活性につ き検定した。
【００９２】 結果 ヒーラＳ３細胞をさまざまな濃度のＮＩＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕで標識することに
より、ハプテンにより修飾された細胞表面タンパク質をさまざまなレベルで発現
する、生存能を有する細胞の個体群が、均一なパターンで生成された（図９）。
より、ハプテンにより修飾された細胞表面タンパク質をさまざまなレベルで発現
する、生存能を有する細胞の個体群が、均一なパターンで生成された（図９）。
【００９３】 図９には、さまざまなヒーラ細胞個体群のＧＡＣＳプロファイルを示している
。この最も左端のプロファイル（「ｃｏｎ」と印される）は、ＮＩＰ−ＣＡＰ−
Ｏｓｕ標識を何ら持たない負の対照細胞である。プロファイル１〜４は、それぞ
れ１、２．５、５または１０μｇ／ｍｌのハプテンで標識されたヒーラＳ３細胞
のＦＡＣＳ分析により得られたものである。
。この最も左端のプロファイル（「ｃｏｎ」と印される）は、ＮＩＰ−ＣＡＰ−
Ｏｓｕ標識を何ら持たない負の対照細胞である。プロファイル１〜４は、それぞ
れ１、２．５、５または１０μｇ／ｍｌのハプテンで標識されたヒーラＳ３細胞
のＦＡＣＳ分析により得られたものである。
【００９４】 既に述べたように、この研究において分析されたｃｈＴＣＲは、溶液中または
プラスチックへの固定化のいずれにおいても、そのコグネイト抗原（ＢＳＡに抱
合されたＮＩＰ）の特異的認識を媒介することができ、形質転換されたＴ細胞に
よるＩＬ−２の生産をもたらす。この例で一貫してわかったことは、テトラサイ
クリンにより処理されていないｃｈＴＣＲ発現１Ｄ９細胞は、ＮＩＰにより修飾
された刺激因子であるＨｅｌａ Ｓ３細胞とのインキュベーションの後、特異的
に誘発され、用量に依存する態様でＩＬ−２を生産し得るということである（図
１０Ａ〜１０Ｃ参照）。興味深いことに、ＩＬ−２分泌のレベルは、プラスチッ
ク固定化ＮＩＰ−ＢＳＡ抱合体に応答して同じ細胞個体群で観察されるものより
も、高かった。このことは、さらなる相乗的なまたは共同刺激性のシグナルが存
在することを示唆する。標識されていないヒーラＳ３細胞は、Jurkat１Ｄ９細胞
を活性化せず（図示せず）、ＮＩＰに対する応答の特異性を示した。形質導入さ
れていない親Jurkat細胞は、ＮＩＰ標識された（図１０）または標識されていな
い（図示せず）ヒーラＳ３細胞によりＩＬ−２を分泌するよう、刺激することが
できなかった。１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下で２４〜４８時間イ
ンキュベートされたJurkat１Ｄ９細胞は、表面ｃｈＴＣＲ発現の大部分をダウン
レギュレーションし（１）、その結果、それらの細胞は、Ｅ：Ｔ比が高くとも、
細胞結合ハプテンによる刺激に非応答性であった（図１０）。
プラスチックへの固定化のいずれにおいても、そのコグネイト抗原（ＢＳＡに抱
合されたＮＩＰ）の特異的認識を媒介することができ、形質転換されたＴ細胞に
よるＩＬ−２の生産をもたらす。この例で一貫してわかったことは、テトラサイ
クリンにより処理されていないｃｈＴＣＲ発現１Ｄ９細胞は、ＮＩＰにより修飾
された刺激因子であるＨｅｌａ Ｓ３細胞とのインキュベーションの後、特異的
に誘発され、用量に依存する態様でＩＬ−２を生産し得るということである（図
１０Ａ〜１０Ｃ参照）。興味深いことに、ＩＬ−２分泌のレベルは、プラスチッ
ク固定化ＮＩＰ−ＢＳＡ抱合体に応答して同じ細胞個体群で観察されるものより
も、高かった。このことは、さらなる相乗的なまたは共同刺激性のシグナルが存
在することを示唆する。標識されていないヒーラＳ３細胞は、Jurkat１Ｄ９細胞
を活性化せず（図示せず）、ＮＩＰに対する応答の特異性を示した。形質導入さ
れていない親Jurkat細胞は、ＮＩＰ標識された（図１０）または標識されていな
い（図示せず）ヒーラＳ３細胞によりＩＬ−２を分泌するよう、刺激することが
できなかった。１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下で２４〜４８時間イ
ンキュベートされたJurkat１Ｄ９細胞は、表面ｃｈＴＣＲ発現の大部分をダウン
レギュレーションし（１）、その結果、それらの細胞は、Ｅ：Ｔ比が高くとも、
細胞結合ハプテンによる刺激に非応答性であった（図１０）。
【００９５】 考察 本発明者らは、ヒトＴ細胞系に発現する外来遺伝子の薬理学的調節のため、Ｔ
ＲＳの要素すべてを含む単一のベクターを用いてきた。ＴＲＳは、通常構成的プ
ロモーターによって駆動されるｔＴＡ遺伝子と、ｔＴＡ応答性プロモーター（９
）のすぐ下流にある必要な遺伝子とを含む。ＴＲＳをＴ細胞へ適用しやすくする
ために、本発明者らは、構成的プロモーターの制御下で、ハイグロマイシン選択
可能マーカー遺伝子とともにＴＲＳの両要素をコードする自己充足型プラスミド
ベクターを構築した。この新規なベクターは、本来の２プラスミドに基づくＴＲ
Ｓ系（９）での協働トランスフェクションにつきものである効率の損失を克服し
、等しい複製数のｔＴＡおよびレポーター遺伝子ユニットを、同じ染色体の遺伝
子座に直接的なシス立体配置で組込むことを確実にする。
ＲＳの要素すべてを含む単一のベクターを用いてきた。ＴＲＳは、通常構成的プ
ロモーターによって駆動されるｔＴＡ遺伝子と、ｔＴＡ応答性プロモーター（９
）のすぐ下流にある必要な遺伝子とを含む。ＴＲＳをＴ細胞へ適用しやすくする
ために、本発明者らは、構成的プロモーターの制御下で、ハイグロマイシン選択
可能マーカー遺伝子とともにＴＲＳの両要素をコードする自己充足型プラスミド
ベクターを構築した。この新規なベクターは、本来の２プラスミドに基づくＴＲ
Ｓ系（９）での協働トランスフェクションにつきものである効率の損失を克服し
、等しい複製数のｔＴＡおよびレポーター遺伝子ユニットを、同じ染色体の遺伝
子座に直接的なシス立体配置で組込むことを確実にする。
【００９６】 この安定した発現系を組込み遺伝子治療法のためのモデルとして用い、本発明
者らは、ｓｃＦｖ−ＴＣＲζキメラ分子がヒトＴ細胞系において機能的に発現さ
れ得ること、および、その発現が薬理学的に下方に調節され得、遺伝子修飾され
たＴ細胞において標的抗原に対する応答性の損失につながることを実証した。テ
トラサイクリンの不在下において、ｃｈＴＣＲの発現レベルは、キメラ遺伝子が
強いＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターによって駆動されるときに観察さ
れるものに匹敵するものであった。遺伝子発現の効率的なテトラサイクリン依存
的抑制は、研究されたＴ細胞形質導入体すべてにおいて見られた。使用される用
量および類似体に応じて、ｃｈＴＣＲの発現は、より大きいまたはより小さい程
度に抑制できた。このことは、ＴＲＳが、Ｔ細胞に適用可能であり、ＶＰ１６ド
メインの明らかに有害な押え込み作用を伴うことなく、トランスアクチベーター
発現の機能的レベルを達成するということを示している。
者らは、ｓｃＦｖ−ＴＣＲζキメラ分子がヒトＴ細胞系において機能的に発現さ
れ得ること、および、その発現が薬理学的に下方に調節され得、遺伝子修飾され
たＴ細胞において標的抗原に対する応答性の損失につながることを実証した。テ
トラサイクリンの不在下において、ｃｈＴＣＲの発現レベルは、キメラ遺伝子が
強いＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターによって駆動されるときに観察さ
れるものに匹敵するものであった。遺伝子発現の効率的なテトラサイクリン依存
的抑制は、研究されたＴ細胞形質導入体すべてにおいて見られた。使用される用
量および類似体に応じて、ｃｈＴＣＲの発現は、より大きいまたはより小さい程
度に抑制できた。このことは、ＴＲＳが、Ｔ細胞に適用可能であり、ＶＰ１６ド
メインの明らかに有害な押え込み作用を伴うことなく、トランスアクチベーター
発現の機能的レベルを達成するということを示している。
【００９７】 テトラサイクリンより１００倍高い効力を示すドキシサイクリンを用いたＴＲ
Ｓに関する従来の研究では、種々のテトラサイクリン類似体について効力が変化
することが示されている（１８）。本発明の系においては、１０ｎｇ／ｍｌの濃
度のテトラサイクリンで最大の抑制が起こった一方、ドキシサイクリンは１００
ｐｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの範囲にわたってＴＲＰの完全な抑制を引起こした
。
Ｓに関する従来の研究では、種々のテトラサイクリン類似体について効力が変化
することが示されている（１８）。本発明の系においては、１０ｎｇ／ｍｌの濃
度のテトラサイクリンで最大の抑制が起こった一方、ドキシサイクリンは１００
ｐｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの範囲にわたってＴＲＰの完全な抑制を引起こした
。
【００９８】 ＴｅｔまたはＤｏｘにさらされたときのｃｈＴＣＲ発現の低下に対する時間経
過は短く、このことは、野生型ＴＣＲζ鎖のように、キメラＴＣＲζ鎖が急速な
代謝回転を示すということを示唆している（１９）。この点に関し、Jurkat細胞
におけるζ鎖の代謝回転は本来のＴ細胞におけるものと同様であることに注目す
ると興味深い（１９）。遺伝子発現の急速な抑制とは対照的に、ドキシサイクリ
ン除去後のその回復は非常に遅かった。ｃｈＴＣＲ遺伝子発現の回復の開始まで
の遅延は、抑制に用いられるドキシサイクリンの濃度に直接比例して変化した。
このように持続される抑制、およびテトラサイクリン類似体の除去時に起こる遺
伝子発現の比較的遅い回復は、他の細胞型においても見られ、新たなＴ細胞免疫
治療法および新たな免疫回避戦略の開発において重要となり得る。
過は短く、このことは、野生型ＴＣＲζ鎖のように、キメラＴＣＲζ鎖が急速な
代謝回転を示すということを示唆している（１９）。この点に関し、Jurkat細胞
におけるζ鎖の代謝回転は本来のＴ細胞におけるものと同様であることに注目す
ると興味深い（１９）。遺伝子発現の急速な抑制とは対照的に、ドキシサイクリ
ン除去後のその回復は非常に遅かった。ｃｈＴＣＲ遺伝子発現の回復の開始まで
の遅延は、抑制に用いられるドキシサイクリンの濃度に直接比例して変化した。
このように持続される抑制、およびテトラサイクリン類似体の除去時に起こる遺
伝子発現の比較的遅い回復は、他の細胞型においても見られ、新たなＴ細胞免疫
治療法および新たな免疫回避戦略の開発において重要となり得る。
【００９９】 キメラＴＣＲの発現は、抗原への暴露に対するＩＬ−２分泌によって明らかに
されるとおり、ＮＩＰ−ＢＳＡ抱合体に応答性を与えた。ドキシサイクリンは、
ヒトＴ細胞に対して他の免疫調節作用を有さない濃度において、さらに感染症の
治療（２０）にドキシサイクリンを用いるとき臨床的にもたらされる組織での濃
度よりずっと低い濃度において、この抗原応答性を完全に排除することがわかっ
た。かくして、これらの結果が示すことは、ＴＲＳベクターを使用することによ
り、自己免疫病が引き起こされる場合に備えて、再注入される遺伝子組み換えＴ
細胞をその標的抗原に対して非応答性になるようにする手段を提供できるという
ことである。同様に、工作されたＴ細胞をそれらの投与前にドキシサイクリンで
処理することにより、所定の時間の間、導入遺伝子の発現を消すことが可能にな
り、これによって、低いレベルの標的抗原を発現し得る正常な組織に対して付帯
的損傷を限定することができる。
されるとおり、ＮＩＰ−ＢＳＡ抱合体に応答性を与えた。ドキシサイクリンは、
ヒトＴ細胞に対して他の免疫調節作用を有さない濃度において、さらに感染症の
治療（２０）にドキシサイクリンを用いるとき臨床的にもたらされる組織での濃
度よりずっと低い濃度において、この抗原応答性を完全に排除することがわかっ
た。かくして、これらの結果が示すことは、ＴＲＳベクターを使用することによ
り、自己免疫病が引き起こされる場合に備えて、再注入される遺伝子組み換えＴ
細胞をその標的抗原に対して非応答性になるようにする手段を提供できるという
ことである。同様に、工作されたＴ細胞をそれらの投与前にドキシサイクリンで
処理することにより、所定の時間の間、導入遺伝子の発現を消すことが可能にな
り、これによって、低いレベルの標的抗原を発現し得る正常な組織に対して付帯
的損傷を限定することができる。
【０１００】 興味深いことに、抑制が、標的抗原に対する応答性を完全に排除するのに十分
なときでも、ＴｅｔまたはＤｏｘにより処理されたJurkatＴ細胞においてｃｈＴ
ＣＲの発現がいくらか残留することが、ＦＡＣＳ分析によって常に検出可能であ
った。これは、細胞が高濃度の多価抗原にさらされた実験系を用いる場合でさえ
も、「オフ」状態で発現されるｃｈＴＣＲ分子の数は、効率的なＴ細胞活性化（
２１）を達成するのに十分でないことを示している。ＴＣＲ分子の発現を所定の
レベルで容易に調節できる能力は、Ｔ細胞活性化プロセスの化学量論の研究に関
連し得る。治療的レベルに関し、このことは、標的細胞膜上の異なる表面密度の
抗原に対しＴ細胞が異なる感受性を示すようにすることができる可能性を示して
いる。
なときでも、ＴｅｔまたはＤｏｘにより処理されたJurkatＴ細胞においてｃｈＴ
ＣＲの発現がいくらか残留することが、ＦＡＣＳ分析によって常に検出可能であ
った。これは、細胞が高濃度の多価抗原にさらされた実験系を用いる場合でさえ
も、「オフ」状態で発現されるｃｈＴＣＲ分子の数は、効率的なＴ細胞活性化（
２１）を達成するのに十分でないことを示している。ＴＣＲ分子の発現を所定の
レベルで容易に調節できる能力は、Ｔ細胞活性化プロセスの化学量論の研究に関
連し得る。治療的レベルに関し、このことは、標的細胞膜上の異なる表面密度の
抗原に対しＴ細胞が異なる感受性を示すようにすることができる可能性を示して
いる。
【０１０１】 トランス遺伝子発現の完全な抑制は、本研究において完全には達成されなかっ
た。使用されるベクターおよび／または細胞型特異的因子の特性は、非誘発状態
において見られる転写の基底レベルに寄与し得る（２２、２３）。さらに、ｔＴ
Ａタンパク質の潜在的な免疫原性も考慮する必要がある。本発明者らが使用した
ベクターにおいて、トランスアクチベーターは、テトラサイクリンの存在と関係
なく一定の発現を確実にする構成的プロモーターによって駆動されており、した
がって抑制状態においても、遺伝子修飾されたＴ細胞に対する免疫応答を誘導す
る可能性がある。しかしながら、エンハンサーのないテトラサイクリン応答性ベ
クターの新世代についてはこの限りではなく、その場合、テトラサイクリンはｔ
ＴＡタンパク質がＴＲＰに結合するのを防ぎ、よって、自動調節回路によりそれ
自体の発現およびレポーター遺伝子の発現を抑制する（１８、２４）。この構成
は、トランス遺伝子発現の抑制を向上させ（予備実験において無視できるレベル
まで）、多量のｔＴＡタンパク質が完全抑制状態において顕著に減少するのを確
実にする（２４）。
た。使用されるベクターおよび／または細胞型特異的因子の特性は、非誘発状態
において見られる転写の基底レベルに寄与し得る（２２、２３）。さらに、ｔＴ
Ａタンパク質の潜在的な免疫原性も考慮する必要がある。本発明者らが使用した
ベクターにおいて、トランスアクチベーターは、テトラサイクリンの存在と関係
なく一定の発現を確実にする構成的プロモーターによって駆動されており、した
がって抑制状態においても、遺伝子修飾されたＴ細胞に対する免疫応答を誘導す
る可能性がある。しかしながら、エンハンサーのないテトラサイクリン応答性ベ
クターの新世代についてはこの限りではなく、その場合、テトラサイクリンはｔ
ＴＡタンパク質がＴＲＰに結合するのを防ぎ、よって、自動調節回路によりそれ
自体の発現およびレポーター遺伝子の発現を抑制する（１８、２４）。この構成
は、トランス遺伝子発現の抑制を向上させ（予備実験において無視できるレベル
まで）、多量のｔＴＡタンパク質が完全抑制状態において顕著に減少するのを確
実にする（２４）。
【０１０２】 要約すると、本発明者らは、単一のテトラサイクリン応答性ベクターを用いる
ことにより、JurkatＴ細胞においてテトラサイクリンにより抑制可能なキメラＴ
ＣＲ遺伝子の発現が達成されることを明らかにし、さらに、このことが、工作さ
れたＴ細胞の標的抗原に対する応答性を薬理学的に調節するための便利な方法を
もたらすことを示した。
ことにより、JurkatＴ細胞においてテトラサイクリンにより抑制可能なキメラＴ
ＣＲ遺伝子の発現が達成されることを明らかにし、さらに、このことが、工作さ
れたＴ細胞の標的抗原に対する応答性を薬理学的に調節するための便利な方法を
もたらすことを示した。
【０１０３】
本明細書中で引用されたすべての刊行物をここに引用により援用する。 1. Mule et al, 1984 Science 225:1487. 2. Rosenberg et al, 1986 Science 233:1318. 3. Eshhar et al, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 720. 4. Hwu et al, 1993 J. Exp. Med. 178. 361. 5. Stancovski et al. 1993 J. Immunol. 151: 6577. 6. Brocker et al. 1996 Eur. J. Immunol. 26:1770. 7. Pardoll 1994 Cancer. Curr. Opin. Immunol. 6:705. 8. Yarranton 1992 Curr. Opin. Biotechnol. 3:506. 9. Gossen & Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5547. 10. Gossen et al. 1993 Trends Biol. Sci. 18:471. 11. Spits et al. 1985 Eur. J. Immunol. 15:88. 12. Alvarez-Vallina & Hawkins 1996 Eur. J. Immunol. 26: 2304. 13. Patten et al. 1992 J. Immunol. 150:2281. 14. Alvarez-Vallina et al. 1993 J. Immunol.l50: 8. 15. Hawkins et al. 1992 J. Mol. Biol. 226: 889. 16. Weissman et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 9709. 17. Kloppenburg et al. 1995 Clin. Exp. Immunol. 102:635-641, 18. Hofmann et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 5185-5190. 19. Ono et al. 1995 immunity 2:639-644. 20. Houin et al. 1983 Br. J. Clin. Pharmac. 16:245. 21. Valitutti et al. 1995 Nature. 375:148. 22. Shockett & Schatz 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:5173. 23. Ackland-Berlund & Leib 1995 BioTechniques. 18:196. 24. Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:6522
【０１０４】
【図１】 ＡおよびＢは、前掲の例で述べられた核酸構造の概略図である。
【図２Ａ】 典型的なＦＡＣＳデータを表わす図である。
【図２Ｂ】 典型的なＦＡＣＳデータを表わす図である。
【図３の１】 典型的なＦＡＣＳデータを表わす図である。
【図３の２】 典型的なＦＡＣＳデータを表わす図である。
【図４】 時間に対するキメラポリペプチドの発現を（対照細胞における発
現の百分率として）示すグラフである。
現の百分率として）示すグラフである。
【図５】 ＡおよびＢは、さまざまな濃度のテトラサイクリンまたはテトラ
サイクリン類似体、ドキシサイクリンにさらされたＴリンパ球によるＩＬ−２生
産（ピコグラム／ｍｌ）のレベルを示す棒グラフである。
サイクリン類似体、ドキシサイクリンにさらされたＴリンパ球によるＩＬ−２生
産（ピコグラム／ｍｌ）のレベルを示す棒グラフである。
【図６Ａ】 外因性作用因子の濃度によって調節されるキメラＴＣＲ白血球
活性化分子の発現を示す、［テトラサイクリン］（ｎｇ／ｍｌ）に対する平均蛍
光強度のグラフである。
活性化分子の発現を示す、［テトラサイクリン］（ｎｇ／ｍｌ）に対する平均蛍
光強度のグラフである。
【図６Ｂ】 ２つの白血球クローンのＦＡＣＳプロファイルを示す図である
。
。
【図７Ａ】 マイクロタイタープレートをコーティングするのに用いられる
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフで
ある。
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフで
ある。
【図７Ｂ】 マイクロタイタープレートをコーティングするのに用いられる
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対する、ＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ）
により測定されたＴ細胞活性化のグラフである。
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対する、ＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ）
により測定されたＴ細胞活性化のグラフである。
【図７Ｃ】 マイクロタイタープレートをコーティングするのに用いられる
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対する生存細胞（％）のグラフである
。
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対する生存細胞（％）のグラフである
。
【図７Ｄ】 マイクロタイタープレートをコーティングするのに用いられる
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対するアネキシンＶ結合（％）のグラ
フである。
ＮＩＰ10−ＢＳＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対するアネキシンＶ結合（％）のグラ
フである。
【図８Ａ】 種々の標的抗原（ＮＩＰ10−ＢＳＡ）密度および種々のｃｈＴ
ＣＲ密度（平均蛍光強度、ＭＦＩによって測定）でのＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ
）のカルトグラム地図である。
ＣＲ密度（平均蛍光強度、ＭＦＩによって測定）でのＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ
）のカルトグラム地図である。
【図８Ｂ】 種々の標的抗原（ＮＩＰ10−ＢＳＡ）密度および種々のｃｈＴ
ＣＲ密度（平均蛍光強度、ＭＦＩによって測定）でのＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ
）のカルトグラム地図である。
ＣＲ密度（平均蛍光強度、ＭＦＩによって測定）でのＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ
）のカルトグラム地図である。
【図９】 ＮＩＰ含有ハプテンによる標識がある場合（１−４）とない場合
（「ｃｏｎ」）のヒーラＳ３細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である（抗Ｎ
ＩＰ抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｂ１．８）、およびマウスλ鎖に対するＦＩＴ
Ｃ抱合ヤギ抗血清での染色が続く）。
（「ｃｏｎ」）のヒーラＳ３細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である（抗Ｎ
ＩＰ抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｂ１．８）、およびマウスλ鎖に対するＦＩＴ
Ｃ抱合ヤギ抗血清での染色が続く）。
【図１０】 Ａ、ＢおよびＣは、異なるエフェクタ：標的比で、１、５また
は１０μｇ／ｍｌ（それぞれＡ、ＢおよびＣ）のＮＩＰ含有ハプテンでコーティ
ングされたヒーラＳ３標的細胞により刺激を行った後、ＮＩＰ応答性Ｔ細胞によ
るＩＬ−２の生産（ｐｇ／ｍｌ）を示す連続した３つのパネルである（最後部の
棒は、テトラサイクリン抑制のないＴ細胞についての結果を示し、中央の棒は、
テトラサイクリンにより誘導される抑制を用いて得られた結果を示し、最前列の
棒は、ＮＩＰ特異的キメラＴ細胞受容体を発現しない負の対照細胞の非応答性を
示す）。
は１０μｇ／ｍｌ（それぞれＡ、ＢおよびＣ）のＮＩＰ含有ハプテンでコーティ
ングされたヒーラＳ３標的細胞により刺激を行った後、ＮＩＰ応答性Ｔ細胞によ
るＩＬ−２の生産（ｐｇ／ｍｌ）を示す連続した３つのパネルである（最後部の
棒は、テトラサイクリン抑制のないＴ細胞についての結果を示し、中央の棒は、
テトラサイクリンにより誘導される抑制を用いて得られた結果を示し、最前列の
棒は、ＮＩＰ特異的キメラＴ細胞受容体を発現しない負の対照細胞の非応答性を
示す）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０７６，４４８ (32)優先日 平成10年３月２日(1998．3．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 GA11 HA17 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA44 4C084 AA02 AA13 BA03 CA26 MA67 NA14 ZB262 4C085 AA35 BB01 CC03 CC12 CC21 DD62 EE01 4C087 AA01 AA02 BB43 NA14 ZB26
Claims (18)
- 【請求項１】 細胞の表面に存在する異なる密度の白血球刺激分子に対して
反応性が異なる白血球であって、前記細胞上の前記白血球刺激分子と前記白血球
の表面に存在する白血球活性化分子との間の相互作用によって活性化される白血
球を生産する方法であって、 外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において前記白血球活性化分子の
発現を誘導する核酸配列により、白血球を形質転換すること、および 前記白血球がさらされる外因性作用因子の濃度を変化させることを含む、方法
。 - 【請求項２】 前記核酸配列は、薬剤により調節可能なプロモーターに作動
可能に結合されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記白血球活性化分子の発現の調節は、相対的に低い密度の
白血球刺激分子を発現する標的でない細胞と比べて、相対的に高い密度の白血球
刺激分子を発現する標的細胞に、前記白血球が優先的に反応するのを可能にする
ものである、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記白血球刺激分子は、腫瘍でなく標的でない細胞において
よりも腫瘍標的細胞において、より高い密度で発現される腫瘍結合抗原である、
請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記白血球刺激分子は癌胎児性抗原である、請求項１〜４の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記白血球はＴリンパ球である、請求項１〜５のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記白血球活性化分子はキメラのポリペプチドである、請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 前記白血球活性化分子は、細胞内シグナルドメイン、白血球
細胞膜に該分子を保持しているトランスメンブラン・ドメイン、および細胞外ド
メインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記白血球活性化分子は、ＣＤ３複合体の鎖の少なくとも１
つの細胞内シグナルドメイン、または共刺激性分子の細胞内シグナルドメインを
含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記白血球活性化分子は、前記白血球刺激分子に特異的な
結合を有するドメインを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記外因性作用因子は、テトラサイクリンまたはその類似
体（本明細書中に定義される）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１２】 外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において白血
球活性化分子を発現する核酸配列で形質転換された白血球であって、 前記白血球活性化分子と細胞の表面に存在する白血球刺激分子との間の相互作
用により活性化されるものであり、 異なる密度の白血球刺激分子に対し、反応性が異なるものであり、かつ、 白血球刺激分子の密度が相対的に高い標的細胞と、白血球刺激分子の密度が相
対的に低い標的でない細胞とを識別するものである、白血球。 - 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生産
されるものである、請求項１２に記載の白血球。 - 【請求項１４】 Ｂリンパ球またはＴリンパ球である、請求項１２または１
３に記載の白血球。 - 【請求項１５】 生理学的に許容される希釈剤中に請求項１２、１３または
１４のいずれか１項に記載の複数の白血球を含む、治療方法に用いるための組成
物。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の組成物を製造する方法であって、 治療される対象から白血球の試料を得ること、 外因性作用因子に対し濃度感受性である態様において白血球活性化分子の発現
を誘導する核酸配列で前記白血球を形質転換すること、および 前記形質転換された白血球を生理学的に許容される希釈剤と混合することを含
む、方法。 - 【請求項１７】 ヒトまたは動物の対象を治療する方法であって、 請求項１５に記載の組成物を調製すること、 前記対象に前記組成物を投与すること、および 必要に応じて、前記投与された白血球中の白血球活性化分子の発現レベルを変
化させるよう、前記対象に外因性作用因子を投与することを含む、方法。 - 【請求項１８】 ヒトの対象において不要な細胞を排除するための組成物の
製造における、請求項１２に記載の白血球の使用。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9718872.6A GB9718872D0 (en) | 1997-09-06 | 1997-09-06 | Improvements in or relating to expression of immunogenic substances |
| GBGB9723448.8A GB9723448D0 (en) | 1997-09-06 | 1997-11-07 | Improvements in or relating to expression of immunogenic substances |
| US7644898P | 1998-03-02 | 1998-03-02 | |
| US9718872.6 | 1998-03-02 | ||
| US60/076,448 | 1998-03-02 | ||
| US9723448.8 | 1998-03-02 | ||
| PCT/GB1998/002689 WO1999012573A1 (en) | 1997-09-06 | 1998-09-07 | Improvements in or relating to regulation of t cell activation |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001515873A true JP2001515873A (ja) | 2001-09-25 |
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ID=27269003
Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2000510470A Withdrawn JP2001515873A (ja) | 1997-09-06 | 1998-09-07 | Ｔ細胞活性化の調節におけるまたはそれに関する改良 |
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|---|---|---|---|
| JP2000510471A Withdrawn JP2001515709A (ja) | 1997-09-06 | 1998-09-07 | 免疫原性物質の発現におけるまたはそれに関する改良 |
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-
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- 1998-09-07 WO PCT/GB1998/002693 patent/WO1999012574A1/en not_active Application Discontinuation
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- 1998-09-07 AT AT98940480T patent/ATE237360T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-07 DE DE69813573T patent/DE69813573T2/de not_active Expired - Fee Related
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