CN111954527A - 治疗移植物抗宿主病的方法和材料 - Google Patents

Abstract

本文提供患有移植物抗宿主病(GVHD)或有发展GVHD风险的哺乳动物(例如人)的治疗中所涉及的方法和材料。例如，提供了表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的T细胞(例如，调节性T细胞)。还提供了将表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的T细胞给予患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的哺乳动物以治疗GVHD的方法。

Description

治疗移植物抗宿主病的方法和材料

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月9日提交的美国临时专利申请系列第62/655,013号的优先权。该在先申请的公开内容视为本申请公开的一部分(且通过引用纳入本文)。

背景技术

1.技术领域

本文涉及患有移植物抗宿主病(GVHD)或有发展GVHD风险的哺乳动物(例如人)的治疗中所涉及的方法和材料。例如，可以将表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的一个或多个T细胞(例如，一个或多个调节性T细胞(Treg))给予患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物(例如，人)，来治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。

2.背景信息

急性GVHD(aGVHD)是同种异体造血细胞移植(HCT)后发病率和死亡率的主要致因(Socie等,Blood,114(20):4327-36(2007)；和Martin等,Bone Marrow Transplant,21(8):1343-59(2014))。除类固醇外，目前没有标准疗法；然而，即使采用类固醇治疗，aGVHD患者的12周死亡率仍为63％(Yalniz等,Biology of Blood and Marrow Transplant,23(9):1478-1484(2017))。

发明内容

本文提供了在治疗患有GVHD或有发展GVHD风险的哺乳动物(例如人)中涉及的方法和材料。例如，可以将表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的一个或多个T细胞(例如，一个或多个Treg)给予(例如，通过过继转移)患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物，来治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。在一些情况下，靶向上皮特异性抗原(例如上皮钙粘蛋白(E-钙粘蛋白，也称为CDH1))的嵌合抗原受体(CAR)可由Treg表达，以将Treg靶向至上皮组织。在一些情况下，靶向上皮特异性抗原(例如，CDH1)的分化簇103(CD103)多肽可在Treg上表达，以靶向或重定向Treg至上皮组织。

如本文所证明，可通过工程改造Treg以使其表达靶向CDH1的CAR(例如CDH1-CAR)，来将供体来源的Treg或自体Treg工程改造为靶向宿主上皮组织。同样如本文所讨论的，可通过工程改造Treg以使其表达CD103多肽，来将供体来源的Treg或自体Treg工程改造为靶向宿主上皮组织。针对宿主上皮组织的Treg可以释放抑制性细胞因子，并减轻移植物抗宿主疾病引起的炎症。因此，可以将针对上皮组织的Treg纳入过继性T细胞疗法(例如，CART细胞疗法)中，以治疗患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物(例如，人)，以治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。

通常，本文的一个方面的特征是一种治疗患有GVHD的哺乳动物的方法。所述方法包括(或基本上由以下内容组成或由以下内容组成)：向哺乳动物给予包含调节性T细胞(Treg)的组合物，所述Treg包含编码靶向上皮特异性抗原的抗原受体的外源核酸，其中所述Treg表达所述抗原受体。哺乳动物可以是人。GVHD可以是急性GVHD或慢性GVHD。GVHD可以是同种异体移植后发生的GVHD。上皮特异性抗原可以是E-钙粘蛋白(CDH1)。抗原受体可为嵌合抗原受体。嵌合抗原受体可包含单链可变片段(scFv)。scFv可包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。抗CDH1抗体可以是hSC10.17。抗原受体可以包含分化簇103(CD103)。Treg在给予之前，可以被工程改造成能够离体表达抗原受体。GVHD的症状可以减少至少10％。

在另一方面，本文的特征在于一种用于治疗具有发展GVHD的风险的哺乳动物的方法。所述方法包括(或基本上由以下内容组成或由以下内容组成)：向哺乳动物给予包含调节性T细胞(Treg)的组合物，所述Treg包含编码靶向上皮特异性抗原的抗原受体的外源核酸，其中所述Treg表达所述抗原受体。哺乳动物可以是人。GVHD可以是急性GVHD或慢性GVHD。哺乳动物可以是接受同种异体移植的哺乳动物。上皮特异性抗原可以是E-钙粘蛋白(CDH1)。抗原受体可为嵌合抗原受体。嵌合抗原受体可包含scFv。scFv可包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。抗CDH1抗体可以是hSC10.17。抗原受体可以包含CD103。Treg在给予之前，可以被工程改造成能够离体表达抗原受体。

在另一方面，本文的特征在于编码靶向上皮特异性抗原的嵌合抗原受体的核酸构建体。上皮特异性抗原可以是E-钙粘蛋白(CDH1)。嵌合抗原受体可包含scFv。scFv可包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。抗CDH1抗体可以是hSC10.17。hSC10.17的重链可由SEQ IDNO:2所示的核酸序列编码。hSC10.17的轻链可由SEQ ID NO:4所示的核酸序列编码。嵌合抗原受体可包含CD8铰链区。CD8铰链区可由SEQ ID NO:5所示的核酸序列编码。嵌合抗原受体可包含CD28跨膜结构域。CD28跨膜结构域可由SEQ ID NO:7所示的核酸序列编码。嵌合抗原受体可以包含CD3ζ信号转导结构域。CD3ζ信号转导结构域可由SEQ ID NO:8所示的核酸序列编码。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然可用与本文所述类似或等同的方法和材料来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。

附图和以下说明进一步详细说明了本发明的一种或多种实施方式。从本文说明、附图以及权利要求书还可清楚地看出本发明的其他特征、目的和优势。

附图说明

图1包含用于治疗aGVHD的示例性方法的示意图。表达CDH1-CAR或过表达CD103的Treg能够在人源化小鼠模型和急性GVHD患者中预防和治疗GVHD，而表达CDH1-CAR或过表达CD103的效应T细胞会在人源化小鼠模型和急性GVHD患者中加剧GVHD。

图2包含用于扩增和/或工程改造Treg的示例性方法的示意图。T细胞从健康供体中分离，使用负选择珠(STEM CELL)分离出CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺细胞。然后，T细胞在第0天用CD3/CD28珠刺激，在IL-2存在下培养，并在第1天用表达感兴趣转基因(CDH1-CAR或CD103)的慢病毒转导。T细胞扩增可以持续6-14天或7-21天。在扩增结束时，通过流式细胞仪分析证实Treg保持其表型和抑制功能。冻存的Treg用于体外和体内实验。在使用之前，将细胞解冻并静置12小时。

图3A和3B包含的图显示从人外周血单核细胞(PBMC)分离的Treg体外扩增(图3A)，以高纯度(图3B)。

图4包含的图表显示，用编码CDH1-CAR核酸的慢病毒颗粒转导的Jurkat细胞表达了含有hSC10.17克隆(CDH1特异性scFv)的CAR，其连接至CD8铰链(CD8H)、CD28跨膜结构域(CD28 TM)和CD3ζ信号转导结构域(CD3z)。

图5包含用于评估CDH1-CAR疗法的示例性人源化小鼠模型的示意图。

图6.调节性T细胞抑制效应T细胞增殖。效应T细胞用CFSE标记，并在刺激性珠(比例为4:1或1:1)存在下与从同一供体分离的调节性t细胞混合。4:1的比例用于扩增效应T细胞，而1:1的比例用于活化T细胞。在两种情况下，调节性T细胞均抑制效应T细胞的扩增，其具有细胞剂量依赖性。调节性T细胞与效应T细胞的比率越高，对效应T细胞的抑制作用越彻底。

图7.调节性T细胞抑制效应CD8⁺T细胞增殖。效应T细胞用CFSE标记，并在刺激性珠(比例为4:1或1:1)存在下与从同一供体分离的调节性T细胞混合。4:1的比例用于扩增效应T细胞，而1:1的比例用于活化T细胞。在两种情况下，调节性T细胞均抑制效应T细胞的扩增，其具有细胞剂量依赖性。调节性T细胞与效应T细胞的比率越高，对效应CD8⁺T细胞的抑制作用越彻底。

图8显示了通过调节上皮细胞上的CDH1与T细胞上的其配体(CD103)之间的相互作用来治疗和/或预防GVHD的示例性方法的示意图。该方法涉及荧光素酶阳性人上皮细胞系(MCF7)的异种移植模型。小鼠被注射对异种移植物具有杀伤作用的CDH1-CAR-Teff，并随机接受以下处理之一以抑制杀伤作用：1)CDH1-CAR-Treg，2)CD103^高-Treg，3)UTD-Treg，和4)盐水。在第5、10、15和20天使用连续生物发光成像测量并比较各组对异种移植物的杀伤作用。

图9显示了通过调节上皮细胞上的CDH1与T细胞上的其配体(CD103)之间的相互作用来治疗和/或预防GVHD的另一示例性方法的示意图。该方法涉及人造血细胞的异种移植模型，其中向未经辐照的NSG(NOD-SCID-γ链-/-)小鼠注射1000万个人PBMC。这些小鼠通常会在大约4-5周后发展异种GVHD。为了预防GVHD，小鼠也被随机分配以接受以下处理之一：1)抗CD103-CAR-Teff，2)CD103^高-Treg，3)UTD-Treg，和4)盐水。通过每2-3天对小鼠进行连续测量来评估小鼠中的GVHD。

图10A-10D是流式细胞术图，显示了Treg(图10C和10D)与PBMC(图10A和10B)的分离，如各种不同标志物所示。Treg约占外周T细胞的5％。Treg的典型表型标志物是CD4+，CD25+和FoxP3+，但是由于FoxP3是胞内标志物，因此替代性地使用CD127低表达。

图11A和11B是流式细胞术图，显示了天然Treg的分离。体外扩增后Treg的稳定性是已知问题(Hoffmann等,Blood,108(13):4260-4267(2006))。为了克服这个问题，分离了以CD45RA+/CD4+/CD25+/CD127低表达为特征的天然Treg的特定亚群。

图12是绘制体外Treg扩增的图，其通过以下方式进行：Treg用抗CD3/CD28珠刺激一周，以3:1的珠:细胞的比率，补充有IL2(400IU/ml)，然后是静息(无珠和100IU/ml的低剂量IL2)条件，然后用抗CD3/CD28珠第二次刺激另一周，以1:1的珠:细胞比率，补充有IL2(400IU/ml)。使用这种技术，在21天结束时实现了30到300倍的扩增。

图13A的示意图显示具有CD28共刺激信号的第二代抗CDH1 scFv CAR构建体的结构。图13B-13E是流式细胞术图，显示了CDH1-CAR-T细胞的产生。使用慢病毒，用图13A所示的构建体转导Teff(图13B和13C)和Treg(图13D和13E)。

图14A-14D是流式细胞术图，显示了CD103^高T细胞的产生。采用类似于第一代CAR的慢病毒技术来产生高表达CD103的Teff(图14A和14B)和Treg(图14C和14D)，无共刺激信号。

图15A和15B是流式细胞术图，显示了在第0天的Treg纯度(图15A)和体外扩增9天后的Treg纯度(图15B)。这些研究表明，Treg在扩增结束时保持其调节表型。

图16A和16B是绘制体外Treg抑制功能的图。效应细胞用CFSE染色，用抗CD3/CD28珠刺激，并与不同比例的Treg共培养，并在四天后测量增殖细胞的数量。这在第0天(图16A)用新鲜分离的Treg进行测试，第9天(图16B)在第一次扩增结束时进行测试。如两幅图所示，效应细胞的增殖随着更高比例的Treg而减少。值得注意的是，使用体外扩增的Treg，抑制功能更加明显。

图17是在绘制CDH-1-CAR-Treg体外功能的图。为了证明Treg的CDH-1特异性抑制功能，进行了增殖试验，其中将CAR19(用作效应细胞)与不同比例的CDH1-CAR-Treg共培养。这允许对CAR19采用与对Treg所用不同的刺激。如图所示，CDH1-CAR-Treg在存在MCF7细胞的情况下对CAR19发挥抑制作用，而在不存在MCF7细胞的情况下不发挥作用。

图18是绘制CD103^高体外功能的图。当CD103^高Treg与效应T细胞共培养时，它们比转导的Treg具有更强的抑制功能。

图19是显示CDH1-CAR-teff和CD103^高-Teff的体外功能的图像。具体地，在杀伤试验中评估了CDH-1-CAR-Teff和CD103^高Teff的体外功能，其中荧光素酶+人上皮细胞(在该例中为MCF7)与不同比例的CDH1-CAR-Teff或CD103^高Teff混合。48小时后，从CDH1-CAR-Teff观察到了明显的杀伤作用，而从UTD或CD103^高Teff观察不到。

图20A显示了NSG小鼠的生物发光成像，表明MCF7肿瘤细胞在皮下注射后1周的成功植入(左图)，和，用CDH1-CAR-Teff处理后7天根除了MCF7肿瘤(右图)。图20B是通过生物发光成像测量的用未转导的T细胞、CDH-1-CAR Teff或CD103^高Teff细胞处理的MCF7异种移植物的肿瘤负荷的图。

图21的图描绘了来自GVHD异种移植模型的数据，其中未经辐照的NSG小鼠被注射了1000万个PBMC并监测GVHD的发展。小鼠在第28天左右开始出现急性GVHD征象，如图表中第28天后体重迅速减轻所显示。

图22描绘了抗CD103 CAR构建体的一般结构，其中将抗CD103 scFv构建在具有CD28共刺激信号的第二代CAR中。在该结构下方提供了编码轻链和重链的序列(分别为SEQID NO:9和10)。

图23是显示抗CD103-CAR转导的流式细胞术图；使用慢病毒技术成功地用抗CD103-CAR转导了效应T细胞。

具体实施方式

本文提供了在治疗患有GVHD或有发展GVHD风险的哺乳动物(例如人)中涉及的方法和材料。例如，可以将表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的一个或多个T细胞(例如，一个或多个Treg)给予(例如，通过过继转移)患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物，来治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。在一些情况下，可在Treg上表达靶向上皮特异性抗原(例如CDH1)的CAR，以将Treg靶向上皮组织。例如，可以将表达靶向CDH1的一种或多种CAR(例如CDH1-CAR)的一个或多个T细胞(例如通过过继转移)给予患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物，以治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。在一些情况下，可在Treg上表达靶向上皮特异性抗原(例如CDH1)的CD103多肽，以将Treg靶向上皮组织。例如，可以将表达一种或多种CD103多肽的一个或多个T细胞(例如通过过继转移)给予患有GVHD(或有发展GVHD风险)的哺乳动物，以治疗GVHD(或降低发展GVHD的风险)。在一些情况下，可在Treg上表达靶向上皮特异性抗原(例如CDH1)的CD103多肽，以将Treg靶向上皮组织，以治疗上皮疾病和/或自身免疫性疾病(例如，涉及例如皮肤、肠组织和/或肝组织中的上皮炎症的自身免疫性疾病)。

本文所述的T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞)可以是任何合适的T细胞。在一些情况下，T细胞可以是原初T细胞。在一些情况下，T细胞可以是免疫抑制性T细胞。可以如本文所述使用的T细胞的实例包括但不限于Treg。例如，表达靶向一种或多种上皮特异性抗原的一种或多种抗原受体的T细胞可以是Treg。在一些情况下，本文所述的方法和材料可用于重定向具有抑制信号的CAR T细胞或重定向干细胞(例如，间充质干细胞)。

本文所述的T细胞可以表达(例如，可以被工程改造以表达)结合上皮特异性抗原(例如，存在于上皮细胞上的抗原，在其它细胞类型上具有最小表达或不表达)的任何合适的抗原受体。例如，可以将T细胞工程改造成表达抗原受体，所述抗原受体靶向由患有GVHD或具有发展GVHD风险的哺乳动物中的上皮细胞表达的抗原(例如，细胞表面抗原)。在一些情况下，抗原受体可为异源抗原受体。在一些情况下，抗原受体可以是CAR。在一些情况下，抗原受体可以是重组抗原受体。在一些情况下，抗原受体可以包括抗体或其片段。例如，抗原受体可以包括来自靶向上皮特异性抗原的抗体的抗原结合(Fab)片段。在一些情况下，抗原受体可包含来自靶向上皮特异性抗原的抗体的重链的一个或多个可变区(VH)和轻链的一个或多个可变区(VL)(例如，重组蛋白或融合蛋白形式)。例如，抗原受体可以是靶向上皮特异性抗原的单链可变片段(scFv)。结合上皮抗原的抗原受体的示例包括但不限于：CD103、hSC10.17、CD234、EPCAM、EMA、MUC1、细胞角蛋白、CA125、ALCAM、HLA、肌间线蛋白、上皮(Eputheliam)抗原抗体、CD227、ESA、半乳糖蛋白3、GGT、HLA-DR、凝集素、LAMP-1、MMR、MOC-31、p16、p63、p-钙粘蛋白、PSA、表面活性剂、运甲状腺素蛋白、VAT-1和波形蛋白。例如，经工程改造以靶向上皮组织的T细胞可以表达CD103多肽。在这种情况下，经工程改造的T细胞可以包括编码和表达CD103多肽的外源核酸。作为另一个实例，经工程改造以靶向上皮组织的T细胞可以表达抗CDH1抗体的抗体片段(例如，hSC10.17 scFv)或抗体。在这种情况下，经工程改造的T细胞可以包括编码和表达hSC10.17 scFv的外源核酸。在一些情况下，经工程改造以靶向上皮组织的T细胞可以同时表达CD103多肽和抗CDH1抗体的抗体片段(例如，hSC10.17 scFv)或抗体。

上皮抗原可以是任何合适的上皮抗原。上皮抗原可以在任何适当类型的上皮细胞(例如，皮肤细胞，胃肠道细胞，肺细胞，肝细胞，脑细胞，肾细胞，卵巢细胞，子宫细胞，膀胱细胞和胰腺细胞)上表达。在一些情况下，上皮抗原可以是细胞粘附分子(CAM)。上皮抗原的示例包括但不限于：CDH1、CD103、hSC10.17、CD234、EPCAM、EMA、MUC1、细胞角蛋白、CA125、ALCAM、HLA、肌间线蛋白、上皮(Eputheliam)抗原抗体、CD227、ESA、半乳糖蛋白3、GGT、HLA-DR、凝集素、LAMP-1、MMR、MOC-31、p16、p63、p-钙粘蛋白、PSA、表面活性剂、运甲状腺素蛋白、VAT-1和波形蛋白。例如，经工程改造以靶向上皮组织的T细胞可以与CDH1结合。在一些情况下，T细胞可经工程改造以表达CDH1-CAR，以靶向由患有GVHD或有发展GVHD风险的哺乳动物中的上皮细胞表达的CDH1。在一些情况下，T细胞可经工程改造以表达CD103多肽，以靶向由患有GVHD或具有发展GVHD风险的哺乳动物中的上皮细胞表达的CDH1。

可以使用任何合适的方法在本文所述的T细胞上表达本文所述的抗原受体(例如，靶向一种或多种上皮特异性抗原的抗原受体)。例如，可以将编码抗原受体的核酸引入T细胞。在一些情况下，可以通过转导(例如病毒转导)或转染将编码抗原受体的核酸引入T细胞。在一些情况下，可将编码抗原受体的核酸离体引入一个或多个T细胞。例如，离体工程改造T细胞以表达抗原受体可包括用编码抗原受体的慢病毒载体转导分离的T细胞。在T细胞经离体工程改造以表达抗原受体的情况下，所述T细胞可获自任何合适的来源(例如哺乳动物，如待治疗的哺乳动物或供者哺乳动物，或细胞系)。在一些情况下，可以如本文所述制备CAR T细胞(参见例如图2和实施例1)。例如，通过将含有编码CAR(例如，靶向CDH1的CAR)的核酸的一种或多种构建体引入Treg，可以在Treg上表达CDH1-CAR以将Treg导向至上皮组织。在一些情况下，可以如他处所述制备CAR T细胞(参见例如，Blat等,Mol.Ther.,22(5):1018-28(2014)；MacDonald等,J.Clin.Invest.,126(4):1413-24(2016)；和Yoon等,Blood,129(2):238-245(2017))。

本文还提供了CAR和编码本文所述的CAR(例如，靶向上皮特异性抗原(例如，CDH1)的CAR)的构建体(例如，核酸构建体)。例如，编码靶向CDH1的CAR(例如，CDH1-CAR)的构建体可以包括编码结合本文所述的CDH1的一个或多个分子的核酸序列。在一些情况下，CDH1-CAR可包含抗CDH1抗体(例如hSC10.17)重链和抗CDH1抗体(例如hSC10.17)轻链。本文所述的CAR(例如，CDH1-CAR)也可以包括一种或多种另外的组分。可以包含在CAR中的其它组分的示例包括但不限于：前导序列(例如CD8前导序列)，铰链(例如CD8铰链)，跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域)，信号转导结构域，例如CD3ζ信号转导结构域或用于生成第三代CART或CAR Treg的信号转导结构域，其能够提高免疫抑制作用，从而可增加免疫抑制细胞因子(如PD1，CTLA4，TIM3或其它抑制分子)的分泌。在一些情况下，可以使用一个或多个接头来将编码编码CAR的构建体的组分的核酸与编码另一组分的核酸分离。核酸可以在编码CAR的构建体中以任何顺序存在。例如，编码CHD1-CAR的构建体可以scFv的轻到重取向或scFv的重到轻取向产生。可以包含在本文所述的构建体中的一些其它组分的示例性核酸序列如下。

CD8前导序列(SEQ ID NO:1)

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

hSC10.17重链(HC)(SEQ ID NO:2)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTACTACTAGAAGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACTAGAGAACCCCTAACTGGATACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG

接头(SEQ ID NO:3)

GGAGGTGGCGGATCAGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGTGGATCAGGAGGCGGAGGGTCA

hSC10.17轻链(LC)(SEQ ID NO:4)

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCATCGTACACAGTGATGGAAACACCTACTTGGAATGGTATCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGTTCTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAC

CD8铰链(SEQ ID NO:5)

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT

CD8跨膜结构域(SEQ ID NO:6)

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC

CD28信号转导结构域(SEQ ID NO:7)

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

CD3ζ信号转导结构域(SEQ ID NO:8)

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

在一些情况下，编码CDH1-CAR的核酸构建体可以包括CD8前导序列、hSC10.17重链、接头、hSC10.17轻链、CD8铰链、CD28跨膜结构域和CD3ζ信号转导结构域。例如，编码CHD1-CAR的核酸构建体可以包括：CD8前导序列，其包含SEQ ID NO:1所示的序列；hSC10.17重链，其包含SEQ ID NO:2所示的序列；接头，其包含SEQ ID NO:3所示的序列；hSC10.17轻链，其包含SEQ ID NO:4所示的序列；CD8铰链，其包含SEQ ID NO:5所示序列；CD28跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:7所示的序列；和CD3ζ信号转导结构域，其包含SEQ ID NO:8所示的序列。

本文还提供了用于治疗患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的哺乳动物(例如人)的材料和方法。例如，可以将本文所述的T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞)给予(例如，通过过继转移给予)患有GVHD或具有发展GVHD风险的哺乳动物，以降低该哺乳动物中GVHD的严重性。在一些情况下，降低哺乳动物中GVHD的严重性可包括减轻或消除GVHD的一种或多种症状(例如皮疹，免疫介导的肺炎，肠道炎症，肠粘膜脱落，严重腹泻，腹痛，恶心，呕吐和/或胆红素水平升高)。在一些情况下，降低哺乳动物中GVHD的严重性可包括降低GVHD的等级(stage)。GVHD的等级可以如他处所述进行评估(参见例如，Jacobsohn等,Orphanet.J.Rare Dis.,2:35(2007))。

可以如本文所述治疗患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的任何合适的哺乳动物。例如，可以将本文所述的T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞)给予(例如通过过继转移给予)人类和其它灵长类动物，例如患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的猴子，以治疗GVHD。在一些情况下，可以如本文所述治疗狗，猫，马，牛，猪，绵羊，小鼠和大鼠。

任何合适的GVHD均可以如本文所述治疗。GVHD可以是急性GVHD(aGVHD)或慢性GVHD。GVHD可以是同种异体GVHD(allo-GVHD)或自体GVHD(auto-GVHD)。GVHD可以是任何等级的GVHD。在一些情况下，GVHD可以与移植相关联(例如在移植之后)。移植可以是同种异体移植，例如HCT。移植可以是自体的，例如自体造血祖细胞移植(HPCT)。

在一些情况下，哺乳动物可被鉴别为患有GVHD(或具有发展GVHD的风险)。可使用用于鉴定哺乳动物为患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的任何合适的方法。一旦哺乳动物被鉴定为患有GVHD(或具有发展GVHD的风险)，就可以给予该哺乳动物(例如通过过继转移给予)或指导其自我施用本文所述的一种或多种T细胞(例如表达上皮特异性抗原受体的T细胞)来治疗该哺乳动物体内的GVHD。

任何合适的方法均可以用于将本文所述的T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞)给予哺乳动物(例如，患有GVHD或具有发展GVHD的风险的哺乳动物)。将本文所述的T细胞给予哺乳动物的方法的示例可包括但不限于注射(例如，IV，ID，IM或皮下注射)。例如，可以通过静脉内注射向人给予表达上皮特异性抗原受体的T细胞。

在一些情况下，如本文所述被治疗(例如，通过给予本文所述的一个或多个T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞))的患有GVHD(或具有发展GVHD的风险)的哺乳动物还可以用一种或多种治疗剂治疗。与本文所述的T细胞组合使用的治疗剂可以是任何合适的治疗剂。在一些情况下，治疗剂可以是GVHD剂。在一些情况下，治疗剂可以是免疫抑制剂。可以与本文所述的T细胞组合使用的治疗剂的示例包括但不限于：全身性类固醇(例如皮质类固醇)，局部类固醇，英夫利昔单抗(infliximab)，托珠单抗(tocilizumab)，那他珠单抗(natalizumab)，依鲁替尼(ibrutinib)，鲁索替尼(ruxolitinib)，免疫球蛋白(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG))，ECP(胞外光穿刺术)，TNF-α阻断剂，阿来珠单抗(alemtuzumab)，IVIG，钙调磷酸酶抑制剂(例如他克莫司(tacrolimus)和/或环孢素)，西罗莫司，IL-2阻断剂，低剂量IL-2，霉酚酸酯(mycophenolae mofetil)，喷司他丁(pentostatin)，T细胞消耗型化疗药物，利妥昔单抗(rituximab)，本妥昔单抗(brentuximab)和间充质干细胞。

本文还提供了包含一种或多种本文所述材料的试剂盒。例如，本文所述试剂盒中提供的材料可用于治疗患有GVHD(或具有发展GVHD风险)的哺乳动物(例如人)。

在一些情况下，本文所述的一个或多个T细胞(例如，表达上皮特异性抗原受体的T细胞)可以与包装材料组合并作为试剂盒出售。这种试剂盒中包括的包装材料通常包含说明书或标签，其描述如何在例如过继转移中使用所述组合物以如本文所述治疗GVHD。在一些情况下，可以将本文所述的一种或多种构建体(例如，核酸构建体)(例如，其编码结合一种或多种上皮特异性抗原的CAR)与包装材料组合并作为试剂盒出售。此类试剂盒中包含的包装材料通常包含说明书或标签，其说明如何使用该组合物，例如，以在T细胞(例如Treg)中表达一种或多种CAR，从而工程改造T细胞以使其表达与一种或多种上皮特异性抗原结合的CAR(例如CDHa-CAR)。试剂盒还可包括说明书或标签，其说明如何使用经工程改造的T细胞，例如，在过继转移中使用，以如本文所述治疗GVHD。试剂盒还可以包括用于过继转移操作的材料。

以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。

实施例

实施例1：用嵌合抗原受体调节性T细胞靶向E-钙粘蛋白(CDH1)，用于治疗急性移植物抗宿主病

方法

细胞系和原代样品(primary sample)

细胞系获自ATCC(K-562，MCF-7和NALM6)。实验前测试所有细胞系的无菌性。对于一些实验，MCF-7和NALM-6细胞用zsGreen/GFP慢病毒转导，然后分选以获得>99％阳性的群体。如相关附图所示，将细胞系MOLM-14和K562用作对照。用补充了10％FBS(Gemini，100-106)和50U/mL青霉素/链霉素(Gibco，生命科技公司(Life Technologies)，15070-063)的RPMI1640(Gibco，11875-085，生命科技公司)维持细胞系的培养。对于所有功能性研究，在实验前至少12小时将原代细胞解冻，然后在37℃静置。

CAR构建体和CAR T细胞的产生

从头产生抗CDH1嵌合抗原受体(衍生自克隆hSC10.17的单链可变片段、CD8铰链、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域)，并将其克隆到第三代慢病毒中。正常的供体T调节细胞用负选择试剂盒(干细胞公司(Stem Cell))选择，并使用抗CD3/CD28免疫磁珠Dynabeads(英杰公司(Invitrogen)，生命科技公司(Life Technologies)，美国纽约州格兰德岛，在培养的第一天添加)和不同浓度(100、500和1000IU/mL)的IL-2体外扩增。刺激后一天，在感染复数3之下，用慢病毒上清液转导T细胞。在第6天去除抗CD3/CD28免疫磁珠Dynabeads，并使T细胞在T细胞培养基(X-vivo 15培养基，人血清5％，青霉素，链霉素和Glutamax)中生长。然后，CART细胞在第8天冻存，以备后续实验之用。在所有实验之前，将T细胞解冻，并在37℃下静置过夜。

多参数流式细胞术

抗人抗体购自白乐津公司(Biolegend)(美国加利福尼亚州圣地亚哥)，电子生物科学公司(eBioscience)(美国加利福尼亚州圣地亚哥)或BD生物科技公司(BDBiosciences)(美国加利福尼亚州圣何塞)。细胞从体外培养物或动物分离，在补充有2％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中清洗一次，并在阻断Fc受体后于4℃染色。对于细胞数定量，根据制造商的说明(英杰公司)使用Countbright磁珠(英杰公司)。在所有分析中，根据时间门控对感兴趣的群体进行门控，然后对前向与侧向散射特征进行门控，然后进行单线门控，并使用Live Dead Aqua(英杰公司)对活细胞进行门控。抗CDH1 CAR的表面表达通过用AlexaFluor 647偶联的山羊抗小鼠F(ab')2抗体(来自杰克森免疫研究公司(JacksonImmunoresearch)(美国宾夕法尼亚州西格罗夫))染色或用蛋白L染色来检测。流式细胞术在四激光分析仪(BD Canto-II)上进行。所有分析均使用FlowJo X10.0.7r2进行。

T细胞功能试验

T细胞脱粒和胞内细胞因子试验

简言之，将T细胞与靶细胞以1:5的比率孵育。在对CAR表达进行染色之后，在孵育时添加针对CD107a，CD28，CD49d和莫能菌素的抗体。4小时后，收获细胞并进行CD3染色和Live Dead染色(英杰公司)。细胞经固定和透化(FIX&PERM细胞固定和细胞透化试剂盒，生命科技公司)，然后按照特定实验中的指示进行胞内细胞因子染色。

增殖试验

T细胞经洗涤，然后以1×10⁷/mL的浓度重悬于100μL的磷酸盐缓冲盐水中，并用100μL的2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(生命科技公司)在37℃下标记5分钟。然后反应物用冷R10淬灭，并将细胞清洗3次。靶标用100Gy的剂量辐照。T细胞与被辐照的靶细胞以1:1的比率孵育120小时。细胞然后被收集，针对CD3、CAR和Live Dead aqua(英杰公司)染色，并在流式细胞仪分析之前添加Countbright珠(英杰公司)。

Treg抑制试验

在低浓度的CD3/CD28珠存在下，将调节性T细胞与CFSE标记的效应T细胞共培养5天。CFSE标记的T效应细胞的增殖通过流式细胞术计算，使用CountBright珠进行绝对计数。

在其靶标存在的情况下，通过将调节性T细胞与CFSE标记的CART19细胞孵育，来测量调节性T细胞对CART细胞功能的抑制作用。使用CountBright珠进行绝对计数，通过流式细胞术分析CART细胞的增殖。

细胞毒性试验

MCF-7细胞用于细胞毒性试验。简言之，将靶标以指定的比率与CDH1-CAR T效应细胞或CDH1-CART调节性细胞一起孵育4或16小时或24至48小时。通过在Xenogen IVIS-200频谱相机(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，美国麻萨诸塞州霍普金顿)上进行生物发光成像来计算杀伤作用。

分泌细胞因子测量

按照指示，将效应细胞和靶细胞以1:1的比例在T细胞培养基中孵育24或72小时。收集上清液，并根据制造商的方案(密理博(Millipore))，通过30重Luminex阵列进行分析。

体内实验

从杰克森实验室公司原始获得的NOD-SCID-γ链^-/-(NSG)按照IACUC批准的育种方案保存在我们的实验室中。在图1，图2，图8和图9中详细讨论了所用的异种移植模型的示意图。将细胞以指定浓度在200μL磷酸盐缓冲盐水中注入小鼠的尾静脉。使用Xenogen IVIS-200频谱相机进行生物发光成像。使用Living Image 4.4版(卡利帕生物科技公司(CaliperLifeSciences,Inc.)，珀金埃尔默)采集并分析图像。

人源化NSG小鼠购自杰克森实验室公司。简言之，向这些小鼠注射CD34⁺细胞作为新生形式。它们发展出完整的人类造血功能。8周后，通过这些小鼠的出血证实了植入。然后，它们用CDH1-CAR T效应细胞或CDH1-CAR T调节细胞处理。

统计学分析

如使用适用于Windows的GraphPad Prism 6版本6.04所示，进行所有统计学分析。斯氏t检验用于比较两组；在将多个组进行比较的分析中，采用Holm-Sidak校正进行单向方差分析，以进行多个比较。当比较多个时间点/比率的多个组时，使用每个时间点/比率的斯氏t检验或方差分析。使用对数秩检验比较存活率曲线。在附图中，星号表示P值(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)，而“ns”表示“不显著”(P>0.05)。图例中列出了每个实验的统计学信息的更多详细信息。

结果

Treg

Treg从人外周血单核细胞(PBMC)分离，并在第7天以高纯度(96％)体外扩增。Treg使用CD3/CD28和IL-2扩增6-8天。在扩增结束时，Treg保持其表型(CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺)。参见例如图3A-3B，图10A-10D，图11A-11B和图12。

CARTreg

构建了第二代CDH1-CAR，并用编码该构建体的慢病毒颗粒转导了Jurkat细胞。

CDH1 CAR从头产生，并且包含hSC10.17克隆，其连接至CD8铰链，CD28跨膜结构域和CD3ζ信号转导结构域(参见图13A)。使用scFv的轻到重和重到轻取向产生了两个构建体。用该构建体转导T细胞以产生CDH1-CART细胞。参见，例如图4。

其它结果显示在图6，图7，图13A-13E和图14A-14D中。

实施例2：CDH1-CAR-Treg的免疫调节功能

CDH1-CAR-Treg细胞继续表现出抑制和免疫调节功能，以治疗GVHD。

为了产生CDH1-CAR-Treg，用编码CDH1-CAR的慢病毒颗粒转导离体扩增的Treg，以产生CDH1-CAR-Treg，并且分析扩增前后CDH1-CAR-Treg的纯度和免疫表型。生成CDH1-CAR-T效应细胞(Teff)作为阳性对照。结果显示在图15A-15B中。

为了评估离体扩增的CDH1-CAR-Treg细胞的抑制和免疫调节功能，分析了存在或不存在CDH1-CAR-Treg细胞时CDH1-CAR Teff细胞的增殖。结果显示在图16A-16B，图17和图18中。CDH1-CAR Treg和CDH1-CAR Teff细胞与CDH1⁺荧光素⁺细胞系MCF7共培养，并且评估共培养中的细胞因子产生情况和靶细胞的杀伤情况。结果显示在图19中。在进一步的研究中，测量细胞因子的产生以评估离体扩增的CDH1-CAR-Treg细胞的抑制和免疫调节功能。

实施例3：工程改造Treg以过表达CD103

过表达CD103多肽的Treg细胞治疗aGVHD。

为了研究CDH1-CAR Treg治疗aGVHD的能力，使人源化小鼠模型随机接受CDH1-CARTreg，对照Treg，CDH-1-CAR Teff，对照Teff，CD103^高Treg或CD103^高Teff(图5)。CDh1-CARTreg改善了GVHD，而CDh1-CAR-Teff细胞则加剧了GVHD。结果示于图20A-20B和图21中。

实施例4：用抗CD103-CAR转导的效应T细胞

生成了抗CD103 CAR构建体，其中，将CD103 scF构建到具有CD28共刺激信号的第二代CAR中(图22)。使用慢病毒技术，用抗CD103-CAR成功转导了效应T细胞。参见图23。

其它实施方式

应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。

序列表

<110> 梅约医学教育与研究基金会（Mayo Foundation for Medical Education andResearch）

<120> 治疗移植物抗宿主病的方法和材料

<130> 07039-1769WO1

<150> US 62/655,013

<151> 2018-04-09

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggttgcatac attactacta gaagtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtac tagagaaccc 300

ctaactggat actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

g 361

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

ggaggtggcg gatcaggcgg aggaggcagc ggcggaggtg gatcaggagg cggagggtca 60

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca aagcatcgta cacagtgatg gaaacaccta cttggaatgg 120

tatcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccggttc 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt attactgctt tcaaggttca catgctccgt 300

ggacgttcgg tggaggcacc aaggtggaaa tcaaac 336

<210> 5

<211> 135

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 7

<211> 123

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

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tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 9

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 9

aaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

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caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 10

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctattgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctgg tcccagatac 180

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ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gcgactgtcg 300

tataccagca cctggtaccc gtactacttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360

gtctcctca 369

Claims (36)

1.一种用于治疗患有移植物抗宿主病(GVHD)的哺乳动物的方法，其中，所述方法包括：向所述哺乳动物给予包含调节性T细胞(Treg)的组合物，所述Treg包含编码靶向上皮特异性抗原的抗原受体的外源核酸，其中所述Treg表达所述抗原受体。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述GVHD是急性GVHD。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述GVHD发生在同种异体移植之后。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述上皮特异性抗原是E-钙粘蛋白(CDH1)。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述抗原受体是嵌合抗原受体。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体包含单链可变片段(scFv)。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述scFv包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述抗CDH1抗体是hSC10.17。

10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述抗原受体包含分化簇103(CD103)。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，在所述给予之前，所述Treg经工程改造以离体表达所述抗原受体。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述GVHD的症状减少了至少10％。

13.一种用于治疗具有发展移植物抗宿主病(GVHD)的风险的哺乳动物的方法，其中，所述方法包括：向所述哺乳动物给予包含调节性T细胞(Treg)的组合物，所述Treg包含编码靶向上皮特异性抗原的抗原受体的外源核酸，其中所述Treg表达所述抗原受体。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。

15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述GVHD是急性GVHD。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物接受了同种异体移植。

17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，所述上皮特异性抗原是E-钙粘蛋白(CDH1)。

18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中，所述抗原受体是嵌合抗原受体。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体包含单链可变片段(scFv)。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述scFv包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述抗CDH1抗体是hSC10.17。

22.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中，所述抗原受体包含分化簇103(CD103)。

23.如权利要求13-22中任一项所述的方法，其中，在所述给予之前，所述Treg经工程改造以离体表达所述抗原受体。

24.一种核酸构建体，其编码靶向上皮特异性抗原的嵌合抗原受体。

25.如权利要求24所述的核酸构建体，其中，所述上皮特异性抗原是E-钙粘蛋白(CDH1)。

26.如权利要求24-25中任一项所述的核酸构建体，其中，所述嵌合抗原受体包含单链可变片段(scFv)。

27.如权利要求26所述的核酸构建体，其中，所述scFv包含来自抗CDH1抗体的轻链和重链。

28.如权利要求27所述的核酸构建体，其中，所述抗CDH1抗体是hSC10.17。

29.如权利要求28所述的核酸构建体，其中，所述hSC10.17的重链由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。

30.如权利要求28-29中任一项所述的核酸构建体，其中，所述hSC10.17的轻链由SEQID NO:4所示的核酸序列编码。

31.如权利要求24-30中任一项所述的核酸构建体，其中，所述嵌合抗原受体包含CD8铰链区。

32.如权利要求31所述的核酸构建体，其中，所述CD8铰链区由SEQ ID NO:5所示的核酸序列编码。

33.如权利要求24-32中任一项所述的核酸构建体，其中，所述嵌合抗原受体包含CD28跨膜结构域。

34.如权利要求33所述的核酸构建体，其中，所述CD8跨膜结构域由SEQ ID NO:7所示的核酸序列编码。

35.如权利要求24-34中任一项所述的核酸构建体，其中，所述嵌合抗原受体包含CD3ζ信号转导结构域。

36.如权利要求35所述的核酸构建体，其中，所述CD3ζ信号转导结构域由SEQ ID NO:8所示的核酸序列编码。

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