WO2002092792A2 - Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation - Google Patents

Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation Download PDF

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WO2002092792A2
WO2002092792A2 PCT/EP2002/005410 EP0205410W WO02092792A2 WO 2002092792 A2 WO2002092792 A2 WO 2002092792A2 EP 0205410 W EP0205410 W EP 0205410W WO 02092792 A2 WO02092792 A2 WO 02092792A2
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cells
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Ahmed Sheriff
Birgit Vogt
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    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)

Definitions

  • the present invention relates to B cells, processes for producing B cells, medicaments containing B cells and use of the B cells.
  • BESTATIGUNGSKOPIE Others experience rashes or even an allergic shock after taking medication such as penicillin. Still others, bee stings cause severe local swelling or severe systemic disorders that affect the entire organism. In extreme cases, allergic attacks can even lead to death. Immediate medical care for asthma patients in the United States consumed an estimated $ 3.6 billion in 1990, accounting for around one percent of all healthcare costs.
  • the allergic reactions manifest themselves differently, they are always set in motion by the same mechanism, the sensitization.
  • an allergen typically a protein
  • the allergenic substance meets so-called phagocytes or macrophages. These absorb the foreign substance, disassemble it and present the fragments on the cell surface with MHC II molecules.
  • T-helper lymphocytes recognize the fragments presented and bind to them.
  • the T helper lymphocytes are activated by the macrophages and then in turn activate some B lymphocytes, which also recognize the allergen.
  • the B cells then mature into plasma cells that produce antibodies. First, these are antibodies of the so-called IgM type; from a certain point in time, however, the plasma cells switch to IgE antibodies.
  • IgE antibodies can take days or weeks for the antibodies to be made available by the organism, and the allergen that started their production may already have disappeared, whereas the IgE molecules remain in the organism. With their Fc region, they attach themselves to IgE receptors of two different classes of immune system cells.
  • mast cells which are usually found in the body tissues near blood vessels and epithelial cells. There is contact with the outside world via the epithelium (this also includes the epithelium of the respiratory tract and gastrointestinal tract).
  • IgE antibodies also bind to basophilic granulocytes (basophils). These cells circulate in the bloodstream. Once production of the IgEs begins, it apparently lasts for months, sometimes even years. As a result, they constantly occupy IgE receptors on mast cells and basophils - ready to take immediate action the next time they come into contact with allergens.
  • the second exposure initiates a stage of hypersensitivity reaction, which also appears externally.
  • the allergy-causing substance binds to the IgEs of the mast cells within seconds of contact with human tissue. If it attaches to two or more IgE molecules at the same time, it forms a bridge between them. Such cross-links allow the affected IgE receptors to move closer together. This activates the cell so that it releases highly effective substances that directly produce allergic symptoms. (The release can also be caused in other ways; allergic reactions are only spoken if IgEs are involved).
  • histamine which can stimulate the formation of mucus in the epithelia and thus contribute to the blockage of the airways, as well as the smooth muscles that contract around the bronchi and intestines like an elastic band. It is also able to dilate the fine blood vessels and make them more permeable so that fluid can seep into the tissue. The result is redness and swelling. If these vascular changes affect large parts of the body, they can cause fatal circulatory failure: With such a shock, the blood pressure suddenly drops so much that the oxygen supply to the heart and brain is no longer guaranteed.
  • the second group of mediators consists mainly of prostaglandins and leukotrienes. They are only released after the allergen molecules have attached to the IgEs on the cells. How to narrow histamine they expand the bronchi and dilate the blood vessels. However, their effects last longer.
  • stimulated mast cells release a large number of potentially toxic enzymes. They also appear to release cytokines that regulate the activities of other immune cells.
  • Antihistamines are usually effective and still serve as standard therapy. The latest variants can no longer easily cross the blood-brain barrier and no longer make the patient tired. When antihistamines are ineffective in severe inflammation, inhalable corticosteroids, which are usually prescribed to relieve chronic inflammation in asthma, often help.
  • Bronchodilators are the most widely used drugs for asthma. They relieve the symptoms caused by histamine and other bronchoconstrictors very quickly, but are unlikely to affect the underlying inflammation. In addition, their excessive use can cause a reaction in the body, so that after their effects have subsided, the Respiratory flow is more hampered than before. In addition, the methods listed under 1. are used.
  • the animal model is currently testing DNA-based immunization with an allergen (Der p 5) of the mite Dermatophagoides pteronyssinus.
  • This immunization results in the production of IgG, but not IgE, and results in a 90% reduction in the amounts of specific IgE, which were caused by classic sensitization with Der p 5 and alum as adjuvant or allergen-induced rhinitis.
  • Another new strategy is the use of humanized monoclonal anti-IgE antibodies against the Fc ⁇ RI binding region for IgE. This prevents the binding of IgE to the IgE receptor, so that no mediators of the allergic reaction from mast cells or basophils can be released.
  • This strategy has shown in clinical studies in patients with allergic rhinitis and allergic asthma that these antibodies are well tolerated and reduce the allergic reactions. (see also LM Lichtenstein: "Allergy and immune system”; in the spectrum of science special: The immune system; 1994; 74-83; SK Huang, KY Chua and KH Hsieh: allergen gene transfer. Current Opinion in Immunology 1997; 800-804; C. Heusser and P. Jardieu: Therapeutic potential of anti-IgE antibodies. Current Opinion in Immunology 1997; 805-814).
  • Leukemia is cancer of the blood cells. 50 out of 1 million people get leukemia every year. When leukemia develops, the body produces large amounts of abnormal blood cells. In most types of leukemia, the abnormal cells are white blood cells. The appearance of leukemia cells differs from normal blood cells and they work properly. leukemias
  • leukemia There are several types of leukemia. They are grouped in two ways. One is how quickly the disease develops and gets worse. The other way is determined by the type of blood cell that is affected.
  • Leukemia is either acute or chronic. In acute leukemia, the abnormal blood cells are very immature blasts that cannot perform their normal functions. The number of blasts increases rapidly and the ailments quickly get worse. Some blasts are present in chronic leukemia, but generally these cells are more mature and can perform some of their normal functions. The number of blasts also increases more slowly than in acute leukemia. With chronic leukemia, the disease progressively gets worse.
  • lymphoid cells can appear in one of two main types of white blood cells: lymphoid cells or myeloid cells. If leukemia affects lymphoid cells, it is called lymphoid leukemia. When myeloid cells are affected, the disease is called myeloid leukemia.
  • the most common leukemias are:
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • AML Acute myeloid leukemia
  • ANLL acute non-lymphatic leukemia
  • CLL Chronic lymphoblastic leukemia
  • CML Chronic myeloid leukemia
  • Leukaemic cells are abnormal cells that do not perform the functions of normal blood cells. They cannot help the body fight infections. Because of this, people with leukemia often develop infections and have a fever.
  • leukemic cells Like all blood cells, leukemic cells travel through the body. Depending on the number of abnormal cells and where these cells gather, patients with leukemia can have a number of symptoms.
  • the abnormal cells can collect in the brain or spinal cord (central nervous system or CNS). The result can be a headache, vomiting, confusion, loss of muscle control, and strokes. Leukaemic cells can also collect in the testes and cause swelling there. Some patients develop painful eyes or skin. Leukemia can also affect the digestive tract, kidneys, lungs, or other parts of the body.
  • Chronic leukemia With chronic leukemia, the abnormal cells can gradually collect in all parts of the body. Chronic leukemia can affect the skin, CNS, digestive tract, kidneys and testicles.
  • Treating leukemia is complex. It varies with the type of leukemia and is not the same in all patients. Treatment also depends on certain characteristics of the leukemic cells, the extent of the disease, and whether the leukemia has been treated before. The patient's age, symptoms and general health are also important. Acute leukemia must be treated immediately. Patients with chronic leukemia who show no symptoms do not need to be treated immediately. Unfortunately, chronic leukemia can rarely be cured.
  • BMT bone marrow transplant
  • removal of the spleen can help.
  • patients receive full body radiation combined with chemotherapy to destroy the leukemia-producing bone marrow.
  • the healthy bone marrow can come from a donor or it can come from the patient. It is then removed and treated outside the body to remove leukemic cells before high dose treatment. After that, a hospital stay of several weeks is necessary so that the graft can produce enough lymphocytes again. In the meantime, patients need to be protected from infection.
  • the biological therapies include treatments with substances that influence the immune response to cancer.
  • Interferons, interleukins and colony stimulating factors are e.g. used in some types of leukemia. They are usually combined with chemotherapy or bone marrow transplantation.
  • GVHD graft versus host disease
  • BMT Allologic bone marrow transplantations
  • CML chronic myeloid leukemia
  • CML is characterized in the early chronic phase by a single transformative genetic abnormality identified. It is the t (9; 22) translocation (Philadelphia Chromosome, Ph) that creates the bcr-abl oncogene, the only factor that is absolutely necessary for the development of the disease (Daley et al 1990). Compared to other tumor types in the chronic phase, CML patients have a relatively intact immune system (Lewalle et al 1996). CML is accessible for a tumor-specific immune response. In the past 20 to 30 years, anti-tumor responses from allologic bone marrow transplants (allo-BMT) and, most recently, donor leukocyte infusions [Donor leukocyte infusion (DLI)] have been used clinically to treat CML.
  • allo-BMT allologic bone marrow transplants
  • DLI donor leukocyte infusion
  • Allo-BMT is a fairly crude approach with significant graft-related morbidity and mortality. The risk of dying is 20-41% (Silver et al 1999). This form of immunotherapy also offers an up to 70% leukemia-free survival rate for transplant recipients (Clift & Anasetti 1997).
  • the product of the mouse PD-1 gene (ACCESSION NM 321893), a member of the IgG superfamily, is a receptor that is common in many tissues. Analyzes carried out by flow cytometry and immunoprecipitation with the monoclonal antibody J43mAk showed that the PD-1 gene product is a 50 to 55 kDa membrane protein. The PD-1 protein appears to be highly glycosylated since the calculated molecular weight of the amino acid sequence is 29310 Da. Normal mouse lymphoid tissue such as thymus, spleen, lymph nodes and bone marrow contains only a small number of PD-1 positive cells.
  • a PD-1 ligand is PD-Ll.
  • the binding of PD-Ll to PD-1 leads to the inhibition of TCR-mediated T cell proliferation and cytokine secretion (Freeman et al 2000).
  • the human and mouse PD-Ll molecule (EMBL / GenBank / DDBS under accession nos. AF233516 and AF233517, (Freeman et al 2000)) are members of the B7 gene family and have a similar structural organization, which consists of an IgV and an IgC domain in the extracellular region (Boussiotis et al 1996), a hydrophobic transmembrane domain, followed by a short, charged intracellular region.
  • PD-Ll and PD-L2 thus have overlapping functions (Latchman et al 2001).
  • mPD-L2 (previous name: Protein AF142780) codes for a polypeptide with 38% amino acid identity with mPD-Ll.
  • Murines and human PD-L2 show 70% amino acid identity.
  • the five members of the B7 family - B7-1, B7-2, ICOS-L, PD-Ll and PD-L2 - have 21-27% amino acid identity and a structural organization consisting of a signal sequence, an IgV-like one IgC-like and a transmembrane domain and a short cytoplasmic see tail.
  • the cytoplasmic tail of PD-Ll is conserved between mice and humans, which is in contrast to the poor conservation of the cytoplasmic tail of PD-L2 of humans and mice (Latchman et al 2001).
  • the PD-L2 tissue distribution is similar to that of PD-Ll.
  • the kinetics of this induction is slower than that of PD-Ll.
  • Autoimmune diseases are chronic diseases. These include rheumatism in a wide variety of clinical forms, diabetes, multiple sclerosis, certain forms of heart muscle inflammation and thyroid disorders. The range of autoimmune diseases could be continued, although approximately 90% epidemiologically only make up a small percentage.
  • autoimmune diseases are antibody-mediated.
  • immunology this means that the organism produces antibodies for mostly unknown reasons, which are directed against the body's own cellular structures (autoantigens). Once these antibodies have been formed, their interaction and binding to the respective organ or cell-specific structures trigger a cell and tissue-destroying reaction of the immune system. Ultimately, this leads to the clinical picture of the disease (Steinman 1994).
  • WO-A-0066715, EP-A-1179587, PCT / EP 02/03292 and EP 00117051.3 disclose methods for reducing specific immune reactions by means of genetically engineered antigen-presenting cells other than B-lymphocytes
  • the problem on which the invention is based consists, inter alia, in making available genetic engineering, therapeutically usable products for the reduction of specific immune reactions in which targets (antigens, autoantigens) and antibodies, autoantibodies are known.
  • B cell B lymphocyte
  • co-stimulatory receptors such as B7 and / or CD40 receptors
  • the B cell according to the invention preferably predominantly presents previously determined antigens (monoantigenic B cell).
  • the invention also relates to a monoantigenic B cell which, by transfecting a B cell with nucleic acid-containing material coding for antigens, shows an increased expression of these antigens and the B cell essentially only presents these antigens.
  • the B cell according to the invention has an increased number of homing receptors, such as CD44.
  • the B cell according to the invention contains, for example, nucleic acids which code for molecules binding PD-1 and / or molecules binding CTLA4 and / or antisense nucleic acids to prevent B7 and / or CD40 receptor expression.
  • the B cell according to the invention can furthermore contain nucleic acids which code for molecules which bind to PD-1 and which remain in the plasma membrane of the cell.
  • the B cell according to the invention can contain nucleic acids which suppress the expression of the B7 and / or CD40 receptors by co-suppression.
  • the B cell according to the invention can contain nucleic acids which bring about an expression of proteins or peptides which have structures affine with B7 and / or CD40 receptors.
  • the B cell according to the invention expresses proteins which have structures affecting B7 receptors CTLA4, CTLA4 derivatives (e.g. CTLA4Ig or CTLA4 dimers, CD28, antibodies, F (ab) 2 , scFv and / or F ab - Fragments are.
  • CTLA4 derivatives e.g. CTLA4Ig or CTLA4 dimers, CD28, antibodies, F (ab) 2 , scFv and / or F ab - Fragments are.
  • the B cell according to the invention can contain nucleic acids which code for a signal sequence or expression products which have a signal sequence which make it possible for the expression products to remain in the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the Trans-Golgi network or intracellular Vesi effect.
  • the monoantigenic B cell according to the invention can be transfected with nucleic acids for the expression of antigens, which enables the transport of the expressed antigens in MHC II compartments of the cells.
  • the B cell according to the invention can contain nucleic acids such as DNA, RNA, oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNA).
  • the DNA can in particular have regulatory elements such as enhancers, promoters, polyA-coding 3 'ends for the transcription of the DNA into RNA and the RNA regulatory elements for the translation of the RNA into protein.
  • regulatory elements such as enhancers, promoters, polyA-coding 3 'ends for the transcription of the DNA into RNA and the RNA regulatory elements for the translation of the RNA into protein.
  • the invention also relates to a method for producing the B cell according to the invention by ex vivo or in vivo methods.
  • a B cell is ex vivo or in vivo by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by viral gene transfer, electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into transfected a monoantigenic B cell.
  • the B cell according to the invention or the monoantigenic B cell according to the invention is treated by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by viral gene transfer, electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into one Transfected cell with increased production of PD-1 binding molecules and / or CTLA4 binding molecules and / or with suppressed function of co-stimulatory receptors and the expression of co-stimulatory receptors is prevented by preventing their expression or the co-stimulatory receptors by reaction with affine structures prevented from stimulating T cells bound to the B cell or monoantigenic B cell.
  • molecules such as antibodies, proteins, peptides, peptidomimetics, PD-L1, PD-L2, PD-1 binding molecules, CTLA4 binding molecules, CTLA4, CTLA4 derivatives (for example CTLA4Ig or CTLA4 dimers), CD28, CD40L and / or components and / or combinations of these molecules, which bind, for example, PD-1, CTLA4, B7-1, B7-2, CD40, which impedes co-stimulation of the T cell taking place in the presence of an antigen presentation, with the monoantigenic B- Cell or the B cell contacted.
  • the molecules can e.g. B. by vehicles such as liposomes, hydrogels, cyclodextrins, nanocapsules, nanoparticles, bio-adhesive microspheres and / or by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into the monoantigenic B cell or the invention B cell can be transferred.
  • vehicles such as liposomes, hydrogels, cyclodextrins, nanocapsules, nanoparticles, bio-adhesive microspheres and / or by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into the monoantigenic B cell or the invention B cell can be transferred.
  • the nucleic acids are in particular transferred by viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by viral gene transfer, electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into the monoantigenic B cell or the B cell.
  • the invention relates to a medicament containing at least one of the B cells or monoantigenic B cells according to the invention.
  • At least one B cell or monoantigenic B cell according to the invention is formulated as an infusion solution for intravenous or intraperitoneal administration.
  • the invention also relates to the use of at least one B cell according to the invention or monoantigenic B cell according to at least one of Claims 1 to 15 for the manufacture of a medicament for the treatment of unwanted immune reactions, such as autoimmune diseases and allergies or deliberately induced immune reactions, such as in immunizations.
  • the cells of the immune system also include the B cells (lymphocytes) as switching points of the adaptable immune system. They can trigger or turn off a T cell-mediated immune response.
  • B cells lymphocytes
  • the antibodies normally play an important role as specific defense molecules ("humoral immune response"). They are produced by mature B lymphocytes. However, the induction and production of soluble antibodies is not independent of the remaining cells in the immune system; rather, this humoral immune response is controlled by other cells in the immune system.
  • the molecular mechanisms of interaction - of cell-cell contact - of B cells with the T helper lymphocytes are known in detail at the receptor level.
  • the antigen is e.g. a bacterial protein
  • the immune response is useful for the organism.
  • the antigen is an endogenous structure, one speaks of a (pathological) autoimmune reaction.
  • the B cell according to the invention has an increased expression of an antigen, the antigen-presenting cell essentially presenting only predefined antigens.
  • the gene therapy method according to the invention is based on genetic engineering interventions on the patient's own B cells.
  • the interventions are carried out by means of suitable probes and bring about the reduction in B7 molecules by hindering or preventing the formation of the molecule on the surface of the B cells and / or, if appropriate, CTLA4-binding molecules, preferably antibodies (not shown), and / or if appropriate the production of PD-1 binding molecules, preferably PD-Ll (not shown) and, if appropriate, at the same time a strong presentation of the autoantigen.
  • CTLA4 For binding to CTLA4 instead of CD28, molecules such as antibodies are used which bind to CTLA4 but not to CD28. These can then induce the T cell response promoted by CTLA4.
  • CTLA4 binding molecules can preferably be antibodies.
  • the co-receptor B7 without which the antigen presentation or the induction cascade for antibody production does not start, can instead or additionally be suppressed in order to suppress preferential binding of CD28.
  • the co-receptor is two different co-receptors called CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2). Their structures are known.
  • the cDNA of a protein that causes the production of pathological autoantibodies as an autoantigen is integrated into the B cell genome. This genetic information then serves to overproduce the autoantigen. Peptides of this autoantigen are then preferably presented on MHC II and / or MHC I. MHC II presents the peptides to the T helper cells and tries to find those that specifically recognize these presented peptides. If a PD-1 binding molecule activates PD-1 instead of CD28 and a CTLA4 binding molecule also activates CTLA4 instead of CD28 and the co-receptor B7 does not appear on the cell surface at the same time, the T helper cells are shut down and may possibly experience premature cell death.
  • the monoantigenic B cell according to the invention can in particular show an increased number of homing receptors, such as CD44.
  • An overexpression of homing receptors will show the monoantigenic B cell the way to the lymph nodes, which means that the genetically modified B cells multiply and accumulate faster in lymph nodes.
  • the lymph nodes are where most of the responses of the adaptive immune system are triggered. There, the genetically modified B cells have a much greater effect than outside the lymph nodes.
  • the CTLA4 binding molecules can preferably be antibodies, monoclonal antibodies. These can be such that they remain in the plasma membrane of the cell.
  • the B7 and / or CD40 receptor expression in the monoantigenic B cell according to the invention can be prevented or reduced.
  • the expression of the B7 and / or CD40 receptors can be suppressed by co-suppression in the monoantigenic B cell according to the invention using nucleic acids.
  • the monoantigenic B cell according to the invention can contain or be transfected with nucleic acids which bring about an expression of proteins or peptides which have structures affine with B7 and / or CD40 receptors. This forms proteins that practically neutralize these receptors by forming complexes with B7 and / or CD40 receptors.
  • CTLA4, CD28, antibodies, F (ab) 2 / scFv and / or F ab fragments can be considered as proteins.
  • the monoantigenic B cell according to the invention contains nucleic acids which code for a signal sequence or expression products of a signal sequence which causes the expression products to remain in the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the Trans-Golgi network or intracellular vesicles.
  • the monoantigenic B cell according to the invention is transfected for the expression of antigens with nucleic acids which enable the transport of the expressed antigens in MHC II compartments of the cells.
  • All genetically modified B cells present the autoantigen on most of their MHC complexes, while very few "normal" APCs present the autoantigen at all and then only on a few MHC complexes.
  • the aim of the treatment is to displace the "normal" APCs which present the autoantigen and activate the T helper cells by means of the genetically manipulated B cells which have been programmed to switch off the antibody products.
  • the corresponding nucleic acids can be DNA, RNA, oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • the DNA preferably has regulatory elements such as enhancers, promoters, polyA-coding 3 ends for the transcription of the DNA into RNA, and the RNA regulatory elements for translating the RNA into protein.
  • the regulatory elements ensure efficient expression of the genes.
  • the monoantigenic B cell according to the invention is produced, for example, by ex vivo or in vivo methods.
  • a B cell is preferably ex vivo or in vivo by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids, which are produced by electroporation techniques, iontopho- Rese, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a monoantigenic B cell transfected.
  • a B cell or a monoantigenic B cell can be enhanced by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a cell Amount of PD-1 binding molecules and / or with increased amount of CTLA4 binding molecules and / or suppressed function of co-stimulatory receptors are transformed or the expression of co-stimulatory receptors by preventing their expression or the co-stimulatory receptors are reacted with affine structures prevented from stimulating T cells bound to the monoantigenic B cell.
  • Re 1 In this case, antisense nucleic acids are brought into contact with the mRNA of the co-stimulatory molecule. You will then likely bind the molecule and prevent translation. Various types of molecules, such as RNAs, DNAs, PNAs, ribozymes, can be used as nucleic acids. Here too, a genetic engineering intervention ensures greater sustainability of the effect.
  • Re 2. According to the invention, the production of a gene product is also achieved by integrating a homologous sense gene sequence. The mechanism is still completely unknown.
  • Re 3 The binding of the co-stimulatory molecule e.g. by specific antibodies prevents this molecule from contacting the intended receptor on a T cell and thus prevents activation of the T cell.
  • the external addition of such binding molecules has the disadvantage that they act on all B cells and thus prevent any immune reaction.
  • the present invention brings about a specific obstruction of immune reactions in that the co-stimulatory molecules are already bound in the cell, in an intracellular compartment. Furthermore, it is ensured that the binding molecule is retained in the intracellular compartment so that the stimulatory receptor does not reach the plasma membrane in the first place.
  • the desired effects can also be achieved if only one of the two goals is carried out with a genetic engineering intervention.
  • z. B. the following other molecules are used:
  • Nucleic acids (mostly complementary to the target sequence), which are e.g. B. can be oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNAs), Antibodies or other molecules that bind the co-stimulatory molecules.
  • PNAs peptide nucleic acids
  • molecules such as antibodies, proteins, peptides, peptidomimetics, PD-L1, PD-L2, CTLA4 or CTLA4 dimers, CD28, CD40L and / or constituents and / or combinations of these molecules, which e.g. B7-1, B7-2, CD40 bind, which impedes co-stimulation of the T cell taking place in the presence of an antigen presentation, brought into contact with the monoantigenic B cell or the B cell.
  • molecules such as liposomes, hydrogels, cyclodextrins, nanocapsules, nanoparticles, in particular biodegradable nanocapsules or particles, bio-adhesive microspheres and / or by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques to transfer molecules into the monoantigenic B cell or the B cell.
  • Nucleic acids can in particular be transferred into the monoantigenic B cell or the B cell by viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids which are transferred by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for the introduction of molecules.
  • a medicament containing at least one monoantigenic B cell according to the invention is further claimed.
  • the medicament according to the invention is preferably formulated as an infusion solution for intravenous or intraperitoneal administration.
  • the formulation is chosen so that when the medicament is administered there is no significant impairment of the effectiveness of the monoantigenic B cell according to the invention.
  • physiological saline is preferred as the infusion solution.
  • other solutions with a pH of 5.5 to 8.5 are also suitable.
  • Serum for example human serum, autologous serum or serum of other species, solutions with plasma substitutes, such as polyvinylpyrrolidone, are also suitable.
  • immune reactions to be treated are related to antigens or their gene sequences and / or parts thereof and are selected from the group consisting of
  • Enzymes their gene sequences and / or partial sequences, in particular glutamic acid decarboxylase (GAD), receptor type protein tyrosine phosphatase IA-2Beta, antigen: H + K + ATPase, U1RNP, transglutaminase, argininosuccinate lyase (ASL), tyrosinase related protein-2, thyroid peroxidase, factor VIII, factor IX; Receptors, their gene sequences and / or partial sequences, in particular acetylcholine receptor of the nicotine type, ⁇ 1-adrenergic receptor, ⁇ l-adrenergic receptor, angiotensin-2-ATl receptor, glutamate receptor, thyrotropin-stimulating hormone (TSH) receptor, LFA receptor 1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP) -3 glycoprotein,
  • GAD glutamic acid decarboxylase
  • ZP Zona Pellucida
  • FSH Follide-Stimulating Hormone
  • Structural proteins their gene sequences and / or partial sequences, in particular myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), ⁇ -fodrin, non-erythroid ⁇ -spectrin, beta-amyloid precursor protein (beta-APP ), Type 2 collagen,
  • Antigens their gene sequences and / or partial sequences, in particular CENP-A autoantigen, Beta2GP-I, ribosomal P protein, Ro / SSA, La / SSB, Sm / RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, albumin Glucagon
  • the invention claims a use in which the immune reactions to be treated are associated with allologic and / or xenological tissue characteristics, their gene sequences and / or partial sequences, in particular MHC I, MHC II, rhesus factor.
  • these are diseases with autoantibody-mediated autoimmune reactions, ie diseases in which the “binding structures” of these autoantibodies (autoantigens, targets) are known and have pathogenetic significance.
  • diseases with known molecular structures (epitopes) that bind autoantibodies are:
  • DCM Dilated cardiomyopathy
  • the method according to the invention is based on at least two parallel interventions on the patient's own B cells.
  • the interventions are carried out using suitable probes and have an effect
  • a PD-1 binding molecule e.g. PD-Ll
  • PD-1 a PD-1 binding molecule which via the action of PD-1, which occurs in T cells, prevents the T cells from activation and proliferation
  • CTLA4 binding molecule e.g. Antibodies that have the effect of CTLA4, which occurs in T cells
  • the cells that are B cells are manipulated ex vivo, the cells are returned to the donor's bloodstream.
  • the genetically manipulated B cells now switch the corresponding T cells in the organism Helper lymphocytes.
  • the genetically manipulated cells compete directly with the autoantigen-presenting APCs that are already present in the organism (preferably bloodstream and lymphatic system), but which carry B7 and no additional PD-1 binding molecule, CTLA4 binding molecule on the cell surface and normally the T-helper - Activate lymphocytes and, among other things, antibody production.
  • autoimmune diseases and allergies do not exist. With a few exceptions (extracorporeal elimination of the antibodies from the patient's blood or plasmapheresis), autoimmune diseases and allergies are treated with medication by inhibiting immune system reactions.
  • Immunosuppressive preparations such as cortisone and its derivatives, as well as cyclosporin, beta interferon or cytostatics (methotrexate)
  • cytostatics metalhotrexate
  • antibodies, antagonists and oligonucleotides against various signal components of the immune system are tested with the purpose of preventing the activation of T cells.
  • Such drugs are at best selective, but never specifically directed against the wrongly programmed autoimmune reactions.
  • Immunosuppressants therefore have a negative effect on important, necessary and useful parts of the immune system; for this reason and their side effects, their use is limited.
  • the gene therapy method according to the invention for reducing specific immune reactions differs fundamentally from the immunosuppressive therapies.
  • a specific shutdown of misdirected immunological reactions by genetically reprogrammed patient's own blood cells is carried out.
  • the methodology shown is intended as a generally applicable concept for reducing immune responses. With this basic concept it should be possible to stop any immune reaction of the adaptable immune system. In addition, such immune reactions can be triggered at will and then switched off again.
  • Concanavalin A (ConA) (Boehringer Mannheim) as a mitogen
  • OVA 323-339 peptide stock mg / ml (effective: 0.74 mg / ml) in PBS, sterile
  • PBA PBS, 0.5% BSA, 0.2% NaN 3
  • RPMI 1640 medium with 10% deactivated FCS (Sigma Lot No. 38H8408 30min / 56 ° C) and 4 mM glutamine (200 mM stock biochrom) / l: 50), 50 ⁇ M mercaptoethanol (50mM stock / 1: 1000), 1 mM NaPyruvate (lOOmM
  • RPMI 1640 medium with 5% deactivated FCS (Sigma Lot No. 38H8408 30min / 56 ° C) and 4 mM glutamine (200 mM stock biochrom) / l: 50), 50 ⁇ M mercaptoethanol (50mM stock / 1: 1000), 1 mM NaPyruvate (lOOmM
  • washing medium (Hereinafter referred to as washing medium) 1. Antigen-specific reduction of immune responses
  • Untransfected A20 should be compared with CTLA-4-Ig transfected A20 (A20 / CTLA4Ig), which were selected for reduced B-7.2 expression after transfection, in their ability to induce antigen-specific T cell proliferation.
  • LxlO 6 A20 cells with 25 ⁇ g plasmid DNA (CTLA4-Ig in pCMV / myc / ER [Invitrogen]) were electroporated (450V, 3 msec) and cultured in the incubator for 4 hours. Subsequently, 2 ml of 3 ml of medium were carefully sucked off and filled with fresh medium. After 24 hours, the cells were placed under selection by placing them in fresh medium with 800 ⁇ g / ml neomycin. The clones remained for a week with neomycin selection, were then separated via a dilution series, multiplied and measured for expression of B7.2 in the FACS.
  • mice were killed in the 2 liter standing cylinder on dry ice and paper towels (the filled standing cylinder was left to stand 10 minutes beforehand with aluminum cover so that enough CO 2 is formed. Immediately afterwards, the mice were immersed in ethanol and opened stretched over the dissecting board. All of the following work was carried out under sterile conditions.
  • mice were immediately transferred to the sterile bench and cut open longitudinally on the abdominal side.
  • the spleen was prepared and transferred to a stainless steel sieve that was freshly boiled and cooled in ultrapure water.
  • the sieve was placed in a petri dish filled with approx. 5 ml of medium. Then the organ was crushed with a sterile tip stamp and rubbed over the sieve. The sieve was immersed several times in the medium and so all the cells released from the
  • the cell suspension was then removed from the culture dish using a 25 ml pipette.
  • the culture dish was held slightly inclined.
  • the upper part of the bowl was rinsed off again with a pipette.
  • the suspension obtained was then pipetted into a cell trainer (on a 50 ml tube).
  • the cell-containing suspension was adjusted to a volume of 30 ml.
  • the spleen cells were layered on approximately 12-15 ml of Ficoll 1083 in a 50 ml Falcon tube and at 650 g, 18 ° C. for 20 min. centrifuged, (Eppendorf 5810R swivel rotor A-4-62). The tubes were then gently removed from the centrifuge and placed under the sterile bench. There the supernatants were aspirated up to approx. 2 cm above the clearly recognizable phase boundary with the milky-looking cell layer (using a membrane pump for aspiration, using a sterile 2 ml pipette, which you can touch without touching the front).
  • the cell suspensions were adjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / 40 ⁇ l in degassed MACS buffer. Then 20 ⁇ l anti-CD45 (B220) beads, 20 ⁇ l anti-CDllb beads and 20 ⁇ l anti-CDllc beads were pipetted into the cell suspension per 40 ⁇ l cell suspension, mixed well (by gently pipetting up and down three times with a 1 ml Pipette) and then incubated for 15 minutes in the refrigerator. After that, the mixture was washed twice with MACS buffer. When the supernatant was completely aspirated after the last wash, the cells were resuspended in a maximum concentration of 1 x 10 8 cells / 500 ⁇ l.
  • APC T cell
  • the negative control contained only spleen T cells. (2 ml total volume) The plates were then incubated for 5 days in the CO 2 incubator. After this time, a FACS analysis was carried out (anti-CD8PE / anti-CD4Cy5 / propidium lodide), the absolute amounts of the proliferated CD4 and CD8 cells being measured using TruCount beads from Becton Dickinson.
  • the CD4 and CD8 T cells were separated from each other in the incubation batches and were only considered separately in the analysis.
  • CD4 positive T cells CD4 positive T cells
  • the absolute number of proliferated CD4 T cells (FIG. 3) that were incubated with untransfected, unloaded A20 increases from 4 ⁇ 10 3 (1:20) to 6 ⁇ 10 3 (1:10) to 15 ⁇ 10 3 (1: 2).
  • T cell ratio from 7 ⁇ 10 3 to 9 ⁇ 10 3 to 20 x 10 3 .
  • the numbers of proliferated CD4 T cells which had previously been incubated with the loaded A20 / CTLA4Ig, remain below 2 ⁇ 10 3 CD4 T cells in all mixing ratios.
  • A20 / CTLA4Ig cells were incubated (Fig. 5), remains relatively constant from lowest to highest APC: T line mixing ratio (between 2.9 x 10 4 and 3.2 x 10 4 ) while the CD8 T incubated with untransfected, loaded A20 Cells show a slight increase in the total number in the highest APC: T cell ratio (4.5 x 10 4 at 1: 2 compared
  • CD8 T cells incubated with untransfected, unloaded A20 show a slight increase in their total number from the lowest to the highest APC: T cell mixing ratio, from 3.5 x 10 4 (1:20) to 3 , 7 x 10 4 (1:10) to 4.1 x 10 4 (1: 2).
  • CD8 T cells incubated with unloaded A20 / CTLA4Ig show total numbers of 2.9 x 10 4 (1:20), 2.6 x 10 4 (1:10) and 3.7 x 10 4 (1: 2) ,
  • the proliferated CD8 T cells which were incubated with untransfected, unloaded A20 (FIG. 8), are below their absolute numbers in all mixing ratios below 1 ⁇ 10 4 .
  • the numbers for all mixing ratios are below 0.6 x 10 4 .
  • the CD4 positive T cells show a clear proliferation-suppressing effect of the loaded A20 / CTLA4Ig on the CD4 positive T cells, which does not occur with the normal loaded A20. This effect can also be seen in the approach without antigen (peptide), but the level of stimulation is 1/4 lower in the untransfected A20 than in the loaded, untransfected A20.
  • antigen-specific (OVA-peptide) CD4 positive T cells were turned off, as well as proliferating T cells in the background, which also occur in the approach without antigen.
  • the approaches with unloaded A20 / CTLA4Ig prolife- in all mixing ratios are significantly higher than for the batches with loaded A20 / CTLA4Ig.
  • the aim of the experiment was to use B7 reduced B cells from BalbC mice to induce an allogen-specific anergy in T cells from C3H mice in vitro.
  • A20 cells a B-cell lymphoma line originating from BalbC mice, served as APCs (H-2 d ). These cells trigger allogen-specific proliferation in T cells from C3H mice (H-2 k ), which should not occur if the costimulatory signal is suppressed by B7.
  • A20 cells were transfected with CTLA4Ig and a clone was generated by selection that had significantly reduced B7.2 as a surface protein.
  • mice 12 C3H mice were killed by CO 2 . Immediately afterwards, the mice are immersed in ethanol and clamped on a dissecting board. All of the following work was carried out under sterile conditions. Preparation of a spleen cell suspension
  • mice were immediately transferred to the sterile bench and cut longitudinally on the abdominal side, the spleens were prepared and transferred to a nylon sieve which had just been boiled and cooled in ultrapure water.
  • the sieve was placed in a petri dish filled with approx. 5 ml medium. Then the organs were crushed with a sterile tip stamp and rubbed over the sieve. The sieve was immersed several times in the medium and so all the cells released from the sieve were rinsed into the medium. The cell suspension was then removed from the culture dish using a 25 ml pipette.
  • the culture dish was held slightly inclined. The upper part of the bowl was rinsed off again with a pipette. The suspension obtained was then pipetted into a cell trainer (on a 50 ml tube). The cell-containing suspension was adjusted to a volume of 30 ml.
  • the spleen cell suspension was layered on 15 ml of Ficoll 1083 in a 50 ml Falcon tube and centrifuged at 650 g, 18 ° C. for 20 minutes (Eppendorf 5810R swivel rotor A-4-62). The tubes were then carefully removed from the centrifuge and placed under the sterile bench. There the supernatants were aspirated with the milky-looking cell band up to approx. 2 cm above the clearly recognizable phase boundary. The pipette on the suction tube is not immersed in the supernatant, but is slowly sucked down from the surface in order to remove floating cell debris and other tissue fat. The cell bands were then removed using a 5 or 10 ml pipette under the sterile bench.
  • the removed interphase is washed twice with 50 ml of washing medium each (300g, 18 ° C, 10 minutes, Eppendorf 5810R + A-4-62 rotor). The supernatant is suctioned off and the cells are taken up in approximately 20 ml of complete medium and counted. Isolation of T cells by MACS sorting
  • the cell suspensions were adjusted to a concentration of 1 x 10 7 cells / 40 ⁇ l degassed MACS buffer. Then, per 40 ⁇ l cell suspension, 20 ⁇ l anti-CD45 (B220) beads, 20 ⁇ l anti-CDllb beads and 20 ⁇ l anti-CDllc beads were pipetted into the cell suspension, mixed well and then incubated for 15 minutes in the refrigerator. After that, the mixture was washed twice with MACS buffer. When the supernatant was completely aspirated after the last wash, the cells were resuspended in a concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / 500 ⁇ l. A 25 ⁇ l aliquot was removed and placed on ice in PBA (cleaning control).
  • PBA cleaning control
  • the rest was then added to the LS column (capacity up to 10 8 positive cells) which had been rinsed beforehand with at least 3 ml of MACS buffer and provided with a sieve and 21G needle and allowed to run through. It was rinsed 4 times with 3 ml of MACS buffer. The run contains the T cells. This was centrifuged off in approx. 10 ml sterile
  • Cells / CTLA4-Ig were plated at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml in uncoated petri dishes (9 cm) (10 ml). These Petri dishes were then irradiated with a dose of 127.5 gray (for 900 seconds) in the cobalt radiation source [delivers 8.5 gray / minute at 130 mm height (cell culture plate holder)] and then twice with
  • T cells (1 ml / well, 3xl0 5 cells / ml, MLR), resulting in the following mixing ratios of A20 cells: T cells: a) 1: 6 b) 1: 3 c) 1: 1.2
  • the plates were placed in the C0 2 incubator for 3 days. After this time, a FACS analysis was carried out (anti-CD4Cy5 / propidium iodide), the absolute amounts of the proliferated CD4 cells being measured with TruCount Beads from Becton Dickinson.
  • Fig. 9 Absolute number of proliferating CD4 + T cells (3 days after pipetting the batches)
  • Fig. 10 Absolute number of total CD4 + T cells (3 days after pipetting the batches)
  • CHO-CTLA-Ig-24 cells contain a construct for a fusion protein which consists of the extracellular domain of human CTLA-4 (exon 2), which has the hinge, CH2 and CH # region of human IgC-gammal is merged. This construct was amplified by PCR and cloned into an expression vector which carried an ER retention signal (pCMVmycER).
  • Fig. 12 Schematic representation of the CTLA-4 constructs. The complete cloning cassette is only shown in pCTLA-4Ig. The other constructs contained the same 5 'upstream and 3' downstream regions, but not the Ig domain.
  • the plasmid pCTLA-4 was generated by extending the cDNA for the full length of the human CTLA-4 (extracellular domain, transmembrane domain and internal tracellular domain) (Fig. 12) cloned into pCMVmycER. This corresponds to exons 2 to 4 of the genomic sequence, whereby only the leader sequence (exon 1) is missing [Ling, 1999 # 19].
  • pCTLA-4Ex only the cDNA for the extracellular domain of human CTLA-4 was cloned into the same vector (exon 2). This resulted in the expression of amino acids 36 to 153 of CTLA-4, the only one of our CTLA-4 constructs that should not be able to dimerize.
  • CTLA-4Cys spans amino acids 36 to 160 and contains the cysteine at position 157, which triggers the dimerization.
  • CTLA-4 transfected cells were stained intra- and extracellularly on CTLA-4.
  • the intracellular staining showed the expression of all CTLA-4 constructs, while the extracellular staining with the exception of pCTLA-4 (FIG. 13) showed no (pCTLA-4Ig, pCTLA-4EX and pCTLA-4Cys) CTLA-4 expression ,
  • the complete CTLA-4 with the ER targeting signal was almost evenly distributed between the plasma membrane and the cytoplasm.
  • Protein A-enriched supernatants from CHO-CTLA-4Ig-24 cells served as a positive control.
  • Fig. 13 The intra- and extracellular staining of 293 cells which were transfected with different CTLA-4 constructs. All constructs were transfected in 293 at least three times with similar results. Table 2
  • transgenic A20 cell lines The lymphoma cell line A20 (Balb / c), the CD86 (B7.2) and MHC II were used in an expressed manner. These cells were transfected with the CTLA-4 constructs. Electroporation of A20 with pCTLA-4Ig or pCTLA-4 and selection with G418 generated mass cultures (MC) in which some of the cells (3 to 30%) had a reduced B7.2. Expression (A20 produces no detectable amounts of B7.1; data not shown). After subcloning, stable cell lines with different levels of B7.2. Reduction can be isolated (Fig. 14). CTLA-4 expression in individual A20 clones was confirmed by RT-PCR.
  • Electroporation with pCTLA-4Ex showed very little B7.2-reduced cells, although intracellular CTLA-4 could be detected.
  • electroporation with pCTLA-4Cys and pCTLA-4Ig produced comparable mass cultures and, after subcloning, comparable B7.2. reduced clones (Table 3 and Fig. 14). A smaller number of reduced clones were generated with pCTLA-4, and the B7.2. Reduction was not enough.
  • Figure 14 Surface CD86 expression and intracellular CTLA-4 expression in A20 transfected with various CTLA-4 constructs. All constructs were transfected at least three times with similar results. In (a) and (b) the analysis was carried out with mass cultures (mc) or an isolated CTLA-4Ig clone (b).
  • A20 cells were electroporated with various plasmids and selected for 2 weeks. After subcloning, individual clones were analyzed for B7.2 by FACS analysis. Expression tested.
  • Example III shows the intracellular retention of B7-costimulatory molecules from APCs.
  • blocking costimulation is an essential prerequisite for the development of tolerance [Takayama, 2000 # 3], [Kirk, 1997 # 17], [Croxford, 1998 # 18], Ling, 1999 # 19 ], [Tomasoni, 2000 # 4].
  • proteins such as blocking antibodies to B7 molecules, soluble CTLA-4Ig [8Kirk, 1997 # 17], or cells that have been genetically modified to secrete CTLA-4Ig [Takayama, 2000 # 3], [Croxford, 1998 # 18]. All of these approaches suffer from systemic effects [Guillot, 2000 # 20]. Due to the short half-life of proteins, repeated infusions of CTLA-4Ig or antibodies are necessary. Since these methods are not antigen-specific, they can also lead to the elimination of necessary and useful immune reactions [Guillot, 2000 # 20].
  • the present invention has the advantage that only the transfected cells are able to induce tolerance, while other cells maintain their normal phenotype.
  • CTLA-4Ig was that of CHO-CTLA-4Ig-24 cells (intracellularly) comparable, but 293 / CTLA-4Ig cells did not secrete CTLA-41g (which contained the ER retention signal) or only in amounts that were below the detection limit.
  • CTLA-4Ig is a potent inhibitor of costimulation in vitro and in vivo by blocking the binding between B7 and CD28.
  • ER-localized CTLA-4Ig was able to efficiently express B7 surface expression on A20 cells.
  • CTLA-4 dimerization is important for the binding of B7 in vivo.
  • the plasmid pCTLA-4Ex which contains only the extracellular part of CTLA-4 (amino acids 36 to 153 without the Cys responsible for the dimerization), is expressed efficiently and can be detected in transgenic cells by FACS analyzes in similar amounts to the others constructs. However, no reduction of B7 could be achieved with this construct.
  • the extracellular domain of CTLA-4 was extended by seven amino acids in the transmembrane part (pCTLA-4Cys, cysteine in position 157), the ability to bind B7 in vivo returned.
  • CTLA-4 dimerization was analyzed on a large scale without a cellular context [Greene, 1996 # 5].
  • Monomeric CTLA-4 CD80 / CD86 was shown to bind with low affinity and rapid dissociation. Therefore, covalent dimerization of CTLA-4 is required for binding with high avidity in vitro. Our data are the first to show that dimerization in vivo is important. Of the constructs capable of dimerization, those containing only the extracellular part of CTLA-4 (pCTLA-4Cys and pCTLA-4Ig) produced a larger amount of reduced clones than that with the full length construct ( pCTLA-4). One reason for this could be the better mobility of the soluble molecules. Another possibility is that the additional transmembrane region of the full length construct leads to a different distribution of this molecule.
  • B7-reduced cells always also reduced the number of molecules that were detectable with the anti-CTLA-4 antibody. Proper binding between B7 and CTLA-4 and subsequent reduction of B7 on the cell surface appeared to affect the amount of detectable CTLA-4.
  • CTLA-4 expression could only be detected by RT-PCR or by staining CTLA-4Ig on the Fc part, although the staining was only very weak.
  • the ER-localized B7 / CTLA-4 complex appears to be rapidly degraded and is therefore hardly detectable.
  • One of the B7-reduced CTLA-4Ig clones was used for T cell proliferation assays. These clones were shown not to support T cell stimulation against specific antigens (Ova), although the T cells were generated from Ova-immunized mice.
  • the B7 reduction also increased the in vivo viability of the transgenic A20 (B lymphoma cells from Balb / c). While A20 showed little growth in Balb / c mice, A20-CTLA-4Ig cells grew vigorously in Balb / c mice and produced solid tumors. The in vivo growth rate of the cells in immunodeficient SCID mice was also determined for control purposes. The B7 reduction was found to be an advantage in immunocompetent Balb / c mice, but not in SCID mice. This example shows that B7 on the A20 lymphoma cells is an important factor for the activation of the immune system. These results contradict the results of [Sotomayor, 2001 # 22], who found that A20 induces strong immune responses in the absence of B7.
  • B7-H1 a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med 5: 1365-9.
  • ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature 397: 263-6.
  • CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sei U S A 94 (16), 8789-94.
  • CTLA-4 ligation suppresses CD28-induced NF-kappaB and AP-1 activity in mouse T cell blasts [published erratum appears in J Biol Chem 1999 Jul 23; 274 (30): 21490]. J Biol Chem. 274: 14400-14405.
  • Complementarity determining region 1 (CDR1) - and CDR3- analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med. 180: 2049-2058.
  • CTLA4Ig gene transfer prolongs survival and induces donor-specific tolerance in a rat renal allograft. J Am Soc Nephrol 11 (4), 747-52.

Abstract

Die Erfindung beruht auf einer Reduktion von Immunreaktionen. Bei dem Verfahren wird die Co-Stimulation von B-Zellen manipuliert und die B-Zellen werden gegebenenfalls gleichzeitig zur Präsentation von definierten Antigenen veranlasst.

Description

Antigen-abhängige Reduktion von spezifischen Immunreaktionen durch Beeinflussung der Co-Stimulation
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind B-Zellen, Verfahren zur Herstellung von B-Zellen, Arzneimittel enthaltend B-Zellen sowie Verwendung der B- Zellen.
Beschreibung
Seit knapp 10 Jahren werden für verschiedene Krankheiten und in Tiermodellen gentherapeutische Verfahren entwickelt und angewendet. Bisher sind sie noch nicht in die Routine überführt. Meist handelt es sich dabei um die Behandlung von genetisch bedingten, schweren Erkrankungen, für die andere Therapien nicht zur Verfügung stehen. Weiterhin werden Gentherapien zur Be- handlung von schweren und ebenfalls nicht therapierbaren Krebserkrankungen eingesetzt.
Wenig Aufmerksamkeit hat die experimentelle Medizin bisher der Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen mittels gentechnischer Methoden geschenkt.
Allgemeines zu Allergien
Allergien verursachen beträchtliche Kosten im Gesundheitswesen der Indust- rieländer. Immerhin sind schätzungsweise mindestens 20% der Bevölkerung gegen irgendeine Substanz allergisch. Die meisten Betroffenen leiden an allergischer Rhinitis, zu der insbesondere der Heuschnupfen zählt, oder an Bronchialasthma: Sie niesen oder ringen nach Luft, nachdem sie bestimmte Pollen oder andere im allgemeinen harmlose Substanzen eingeatmet haben. Viele Kinder und einige Erwachsene reagieren auch allergisch auf Nahrungsmittel.
BESTATIGUNGSKOPIE Andere erleiden Hautausschläge oder sogar einen allergischen Schock, nachdem sie Medikamente wie Penizillin erhalten haben. Bei wieder anderen rufen Bienenstiche starke lokale Schwellungen oder schwere systemische - den gesamten Organismus erfassende - Störungen hervor. Im Extremfall können al- lergische Anfälle sogar zum Tod führen. Allein die unmittelbare medizinische Versorgung von Asthmapatienten hat in den USA 1990 schätzungsweise 3,6 Milliarden Dollar verschlungen und damit rund ein Prozent aller Kosten im Gesundheitswesen ausgemacht.
Mittlerweile ist bekannt, dass einige der zellulären und molekularen Wechselwirkungen bei unterschiedlichen allergischen Reaktionen oft ähnlich ablaufen, unabhängig davon, auf welche Substanzen der einzelne anspricht und welche Symptome er entwickelt. Gewisse Begleiterscheinungen der Allergien treten normalerweise ausschließlich auf, wenn das Immunsystem Parasiten be- kämpft. So reagiert der Körper auf Schmarotzer ebenso wie auf Allergene mit der massiven Produktion von Molekülen, die als Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) bezeichnet werden. Die Produktion dieser Antikörper wird durch T- Helfer-Zellen induziert, die wiederum von B-Zellen aktiviert werden.
Sensibilisierung
Unterschiedliche Allergene rufen unter anderem deswegen verschiedenartige Symptome hervor, weil sie mit dem Immunsystem in verschiedenen Körperregionen in Berührung kommen. In den oberen Luftwegen führt die fehlgeleitete Immunreaktion zu Niesen und einer verstopften Nase. In den unteren Luftwegen können sich dagegen die Bronchien verengen und verschleimen, so dass typische asthmatische Symptome auftreten. Entsprechend rufen Immunaktivitäten in den Geweben des Magen-Darm-Traktes Übelkeit, Bauchkrämpfe, Durchfall oder Erbrechen hervor. Schließlich vermag ein Allergen, das auf irgendeinem Weg ins Blut gelangt, eine allergische Reaktion in weit von seiner Eintrittsstelle entfernten Körperregionen auszulösen. Anaphylaktische Schocks können letale Auswirkungen haben.
Auch wenn sich die allergischen Reaktionen unterschiedlich äußern, werden sie doch stets durch den gleichen Mechanismus, die Sensibilisierung, in Gang gesetzt. Dazu kann bereits der einmalige Kontakt mit einem Allergen, typischerweise einem Eiweißstoff, genügen. In den Luftwegen oder anderen Geweben trifft die allergieauslösende Substanz auf sogenannte Fresszellen oder Makrophagen. Diese nehmen den Fremdstoff auf, zerlegen ihn und präsentieren die Fragmente auf der Zelloberfläche mit MHC II-Molekülen. Im weiteren Verlauf erkennen einige T-Helfer-Lymphozyten die dargebotenen Bruchstücke und binden daran. Die T-Helfer-Lymphozyten werden von den Makrophagen aktiviert und aktivieren dann ihrerseits einige B-Lymphozyten, die gleichfalls das Allergen erkennen. Die B-Zellen reifen dann zu Antikörper produzierenden Plasmazellen aus. Zunächst sind dies Antikörper vom sogenannten IgM-Typ; ab einem bestimmten Zeitpunkt schalten die Plasmazellen jedoch auf IgE- Antikörper um.
Bis die Antikörper vom Organismus bereitgestellt sind, können Tage oder Wochen vergehen, und das Allergen, welches ihre Produktion in Gang gesetzt hat, ist dann möglicherweise bereits verschwunden, wohingegen die IgE-Moleküle im Organismus verbleiben. Mit ihrer Fc-Region heften sie sich an IgE- Rezeptoren zweier unterschiedlicher Klassen von Immunsystemzellen. Bei der einen handelt es sich um Mastzellen, die sich im Körpergewebe für gewöhnlich in der Nähe von Blutgefäßen und Epithelzellen ansiedeln. Über das Epithel besteht Kontakt mit der Außenwelt (darunter fällt auch das Epithel der Atemwege und des Magen-Darm-Traktes). IgE-Antikörper binden außerdem an basophile Granulozyten (Basophile). Diese Zellen zirkulieren im Blutstrom. Hat die Produktion der IgEs einmal begonnen, hält sie offenbar Monate, ja manchmal sogar Jahre an. Folglich besetzen sie unablässig IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen - bereit, beim nächsten Allergenkontakt augenblicklich in Aktion zu treten.
Akute Symptome
Während also die erste Begegnung mit einem Allergen selbst bei Personen, die sich später als Allergiker entpuppen, keine Symptome hervorruft, leitet die Zweitexposition ein Stadium der Uberempfindlichkeitsreaktion ein, welches auch äußerlich in Erscheinung tritt. Innerhalb von Sekunden nach dem Kontakt mit menschlichem Gewebe bindet der allergieauslösende Stoff an die IgEs der Mastzellen. Heftet er sich dabei an zwei oder mehr IgE-Moleküle zugleich, bildet er eine Brücke zwischen ihnen. Solche Quervernetzungen lassen die be- troffenen IgE-Rezeptoren dichter zusammenrücken. Dies aktiviert die Zelle, so dass sie hochwirksame Substanzen ausschüttet, die auf direktem Wege allergische Symptome erzeugen. (Die Freisetzung kann auch auf andere Weise hervorgerufen werden; von allergischen Reaktionen spricht man nur, wenn IgEs beteiligt sind). Die wichtigste dieser Substanzen ist Histamin, das sowohl die Schleimbildung in den Epithelien anregen und so zur Verstopfung der Luftwege beitragen kann als auch die glatte Muskulatur, die wie ein elastisches Band Bronchien und Därme umschlingt, kontrahieren lassen. Ferner vermag es die feinen Blutgefäße zu weiten und durchlässiger zu machen, so dass Flüssigkeit ins Gewebe sickern kann. Rötungen und Schwellungen sind die Folge. Betref- fen diese Gefäßveränderungen große Teile des Körpers, können sie ein tödliches Kreislaufversagen auslösen: Bei einem solchen Schock fällt der Blutdruck jäh so stark ab, dass die Sauerstoffversorgung von Herz und Gehirn nicht mehr gewährleistet ist.
Die zweite Gruppe von Mediatoren besteht hauptsächlich aus Prostaglandinen und Leukotrienen. Sie werden erst ausgeschüttet, nachdem die Allergenmole- küle sich an die IgEs auf den Zellen angelagert haben. Wie Histamin verengen sie die Bronchien und erweitern die Blutgefäße. Ihre Wirkung hält allerdings länger an.
Zusätzlich stoßen stimulierte Mastzellen eine Vielzahl potentiell toxischer En- zyme aus. Offenbar setzen sie ferner Cytokine frei, die die Aktivitäten anderer Immunzellen regulieren.
1. Die allergische Rhinitis
Antihistaminika erweisen sich in der Regel als wirksam und dienen immer noch als Standardtherapie. Die neuesten Varianten können die Blut-Hirn-Schranke nicht mehr ohne weiteres passieren und machen die Patienten nicht mehr müde. Wenn bei einer schweren Entzündung Antihistaminika wirkungslos bleiben, helfen oft inhalierbare Corticosteroide, die gewöhnlich zur Linderung der chro- nischen Entzündung bei Asthma verschrieben werden.
In schweren Fällen kann die schon im Jahre 1911 eingeführte Immuntherapie oder Hyposensibilisierung (auch als Allergiespritzen oder Desensibilisierung bekannt) auf lange Sicht Erleichterung verschaffen. Bei dieser Behandlung inji- zieren Ärzte den Patienten steigende Dosen des Allergens, auf das diese empfindlich reagieren. In allen Fällen ist die Dosis ausschlaggebend: Zu wenig Allergen verleiht keine Toleranz. Außerdem ist der Schutz selten vollständig.
2. Asthma
Bronchodilatatoren sind die meistverwendeten Arzneimittel bei Asthma. Sie lindern die durch Histamin und andere Bronchokonstriktoren hervorgerufenen Symptome sehr schnell, beeinflussen die zugrundeliegende Entzündung jedoch wahrscheinlich nicht. Außerdem kann ihr übermäßiger Gebrauch eine Gegen- reaktion des Körpers hervorrufen, so dass nach Abklingen ihrer Wirkung der Atemstrom stärker behindert ist als zuvor. Zusätzlich kommen die unter 1. aufgezählten Methoden zur Anwendung.
3. Anaphylaktische Reaktionen
Insektenstiche rufen bei manchen Menschen Anaphylaxien aus. In schweren Fällen führen diese zum Tod durch z.B. Kreislaufversagen oder Ersticken. Jede schwere Anaphylaxie - gleich ob sie zum ersten oder fünfzehnten Mal auftritt - ist ein Notfall, bei dem zunächst versucht werden muss, die bedrohlichsten Symptome zu beherrschen. Meist geschieht das durch Injektion von Adrenalin, welches die Freisetzung der Mediatoren hemmt, die Luftwege öffnet und der Erweiterung der Blutgefäße entgegenwirkt. Man kann vorbeugend durch eine Immunisierung mit dem Gift des gesundheitsbedrohenden Insekts agieren.
Neue Ansätze
In der Erprobung im Tiermodell befindet sich die auf DNA basierende Immunisierung mit einem Allergen (Der p 5) der Milbe Dermatophagoides pteronyssi- nus. Diese Immunisierung resultiert in einer Produktion von IgG, aber nicht IgE, und resultiert in einer 90%igen Reduktion der Mengen an spezifischem IgE, welche durch klassische Sensibilisierung mit Der p 5 und Alaun als Adju- vant oder allergen-induzierte Rhinitis hervorgerufen wurden.
Eine weitere neue Strategie ist die Verwendung von humanisierten monoklo- nalen Anti-IgE-Antikörpern gegen die FcεRI-Binderegion für IgE. Dadurch wird die Bindung von IgE an den IgE-Rezeptor verhindert, so dass keine Mediatoren der allergischen Reaktion von Mastzellen oder Basophilen ausgeschüttet werden können. Diese Strategie hat in klinischen Studien bei Patienten mit allergischer Rhinitis und allergischem Asthma gezeigt, dass diese Antikörper gut to- leriert werden und die allergischen Reaktionen reduzieren. (siehe auch L.M. Lichtenstein: "Allergie und Immunsystem"; in Spektrum der Wissenschaft Spezial: Das Immunsystem; 1994; 74-83; S-K Huang, K-Y Chua und K-H Hsieh: Allergen gene transfer. Current Opinion in Immunology 1997; 800-804; C. Heusser und P. Jardieu: Therapeutic potential of anti-IgE antibo- dies. Current Opinion in Immunology 1997; 805-814).
Allgemeines zu Transplantationen
Die Transplantation von Geweben, um kranke Organe zu ersetzen, ist heute eine wichtige medizinische Therapie. In den meisten Fällen stellt eine Reaktion des anpassungsfähigen Immunsystems gegen das Transplantat die größte Bedrohung für eine erfolgreiche Behandlung dar. Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems werden von Antigen-präsentierenden Zellen durch Aktivierung von T-Helfer-Lymphozyten induziert. Bei der Transfusionen von Blut, welches das erste und am häufigsten verwendete Transplantat ist, müssen die ABO und Rh Blutgruppenantigene abgeglichen werden, damit die schnelle Zerstörung unpassender Erythrozyten vermieden wird. Bei anderen Geweben müssen die sehr polymorphen Haupthistokompatibilätskomplexe (MHC) aufeinander abgeglichen werden, da diese fast immer die Immunreaktion auslö- sen. Leider ist der perfekte Abgleich der MHCs außer bei Verwandten fast unmöglich.
Stammzelltransplantate bei Leukämien
Leukämie ist Krebs der Blutzellen. Pro Jahr bekommen 50 von 1 Million Menschen Leukämie. Wenn sich eine Leukämie entwickelt, produziert der Körper große Mengen abnormaler Blutzellen. Bei den meisten Arten von Leukämie, sind die abnormalen Zellen weiße Blutzellen. Das Erscheinungsbild der Leukämiezellen unterscheidet sich von normalen Blutzellen und sie funktionieren richtig. Leukämiearten
Es gibt etliche Leukämiearten. Sie werden auf zwei Wegen gruppiert. Der eine ist, wie schnell die Krankheit sich entwickelt und schlimmer wird. Der andere Weg wird durch den Blutzelltyp, der betroffen ist, bestimmt.
Leukämie ist entweder akut oder chronisch. Bei der akuten Leukämie sind die abnormalen Blutzellen sehr unreife Blasten, die ihre normalen Funktionen nicht ausfüllen können. Die Anzahl von Blasten steigt schnell an und die Leiden wird schnell schlimmer. Bei chronischer Leukämie sind einige Blasten präsent, aber im allgemeinen sind diese Zellen reifer und können einige ihrer normalen Funktionen erfüllen. Die Anzahl von Blasten steigt auch langsamer an als bei der akuten Leukämie. Bei der chronischen Leukämie wird die Erkrankung gra- duell schlimmer.
Leukämie kann in einer von zwei Haupttypen von weißen Blutzellen erscheinen: lymphoide Zellen oder myeloide Zellen. Wenn die Leukämie die lymphoi- den Zellen beeinflusst, wird sie lymphatische Leukämie genannt. Wenn mye- loide Zellen beeinflusst werden, wird die Krankheit myeloische Leukämie genannt.
Die am häufigsten vorkommenden Leukämien sind:
_ Die akute Lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Leukämie bei kleinen Kindern. Diese Erkrankung trifft auch Erwachsene insbesondere ab dem 65 Lebensjahr. _ Akute myeloische Leukämie (AML) kommt bei Erwachsenen und Kindern vor. Dieser Leukämietyp wird manchmal Akute Nicht-Lymphatische Leukä- mie (ANLL) genannt. _ Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) trifft meistens Erwachsene ab dem 55. Lebensjahr. Sie tritt manchmal auch bei jüngeren Erwachsenen auf, betrifft aber so gut wie nie Kinder.
_ Die Chronische Myeloische Leukämie (CML) kommt meist bei Erwachsenen vor. Eine geringe Zahl von Kindern entwickelt diesen Krebs auch.
Symptome für Leukämie
Leukämische Zellen sind abnormale Zellen , welche die Funktionen normaler Blutzellen nicht wahrnehmen. Sie können dem Körper nicht helfen, Infektionen zu bekämpfen. Aus diesem Grund entwickeln Menschen mit Leukämie oft Infektionen und haben Fieber.
Menschen mit Leukämie haben oft auch weniger gesunde rote Blutzellen und Blutplättchen, so dass nicht genug rote Blutzellen für den Sauerstofftransport durch den Körper. Unter diesen Umständen, Anämie genannt, können die Patienten bleich aussehen und sich matt und müde fühlen. Wenn die Anzahl der Blutplättchen zu gering ist, bluten die Patienten leicht und entwickeln schnell blaue Flecken.
Wie alle Blutzellen reisen leukämische Zellen durch den Körper. Abhängig von der Anzahl der abnormalen Zellen und wo diese Zellen sich sammeln, können Patienten mit Leukämie eine Reihe von Symptomen aufweisen.
Bei der akuten Leukämie erscheinen und verschlechtern sich die Symptome schnell. Bei der chronischen Leukämie erscheinen die Symptome lange nicht. Wenn Symptome erscheinen, sind sie normalerweise zuerst mild und verschlechtern sich graduell.
Symptome für Leukämie:
* Fieber, Frösteln und andere grippeartige Symptome; * Schwäche und Ermüdung;
* häufige Infektionen;
* Verlust des Appetites und/oder Gewichtes;
* geschwollene oder empfindliche Lymphknoten, Leber, oder Milz;
* schnelles Bluten oder blaue Flecken;
* kleine rote Flecken unter der Haut;
* geschwollenes oder blutendes Zahnfleisch;
* Schwitzen, besonders nachts; und/oder
* Knochen- oder Gelenkschmerzen.
Bei der akuten Leukämie können sich die abnormalen Zellen im Gehirn oder im Rückenmark (zentrales Nervensystem oder CNS) sammeln. Das Resultat können dann Kopfschmerzen, sich übergeben, Konfusion, Verlust der Kontrolle über die Muskeln und Schlaganfälle sein. Leukämische Zellen können sich auch in den Hoden sammeln und verursachen dort eine Schwellung. Einige Patienten entwickeln schmerzende Augen oder Haut. Leukämie kann auch den Verdauungstrakt, die Nieren, Lunge oder andere Teile des Körpers beeinflussen.
Bei der chronischen Leukämie können sich die abnormalen Zellen graduell in allerlei Teilen des Körpers sammeln. Chronische Leukämie kann die Haut, das CNS, den Verdauungstrakt, die Nieren und die Hoden beeinflussen.
Behandlung von Leukämie:
Die Behandlung von Leukämie ist komplex. Sie variiert mit der Art der Leukämie und ist nicht bei allen Patienten gleich. Die Behandlung hängt auch von bestimmten Eigenarten der leukämischen Zellen ab, und dem Ausmaß der Erkrankung, und ob die Leukämie schon mal behandelt wurde. Auch das Alter des Patienten, die Symptome und der generelle Gesundheitszustand sind wichtig. Die akute Leukämie muss sofort behandelt werden. Patienten mit chronischer Leukämie, die keine Symptome zeigen, müssen nicht sofort behandelt werden. Leider kann die chronische Leukämie selten geheilt werden.
Behandlungsmethoden:
Die meisten Patienten mit Leukämie werden mit Chemotherapien behandelt. Einige werden zusätzlich bestrahlt und/oder erhalten eine Knochenmarkstransplantation (BMT) oder biologische Therapien. In einigen Fällen kann eine Entfernung der Milz helfen. Vor einer Knochenmarkstransplantation erhalten die Patienten eine Ganzkörperbestrahlung in Verbindung mit einer Chemotherapie, um das Leukämie-produzierende Knochenmark zu zerstören.
Das gesunde Knochenmark kann von einem Spender kommen oder es kann vom Patienten stammen. Dann wird es vor der Hochdosisbehandlung entnommen und außerhalb des Körpers behandelt, um leukämische Zellen zu entfernen. Danach ist ein mehrwöchiger Krankenhausaufenthalt nötig, damit das Transplantat wieder genug Lymphozyten produzieren kann. In der Zwischenzeit müssen die Patienten vor Infektionen geschützt werden.
Die biologischen Therapien beinhalten Behandlungen mit Substanzen, die die Immunantwort gegen den Krebs beeinflussen. Interferone, Interleukine und Kolonie-stimulierende Faktoren werden z.B. bei einigen Leukämietypen verwendet. Sie werden meist mit Chemotherapie oder Knochenmarkstransplanta- tion kombiniert.
Knochenmarkstransplantation
Patienten mit Knochenmarkstransplantat haben ein erhöhtes Risiko für Infekti- onen, Blutungen und andere Nebeneffekte der hohen Dosen der Chemothera- peutika und der Bestrahlung, die sie erhalten. Zusätzlich kann es zu Trans- plantat-gegen-Empfänger-Antworten [graft versus host disease (GVHD)] kommen. Die Leber, die Haut und der Verdauungstrakt sind dabei die am hau- figsten betroffenen Organe. GVHD kann mild oder schwerwiegend sein und jederzeit nach der Transplantation auftreten (auch Jahre später). Immun- suppressiva werden verabreicht, um das Risiko des GVHD zu vermindern und zu behandeln. [Entnommen aus den Informationen des: National Cancer In- stitute, one of the National Institutes of Health (NIH)]
Chronische Myeloide Leukämie
Am Beispiel der Chronischen Myeloiden Leukämie wird im folgenden die Wirkungsweise der Knochenmarkstransplantate erläutert: Allologe Knochenmarkstransplantationen [bone-marrow transplantation (BMT)] stellten in den vergangenen 20 - 30 Jahren Behandlungsmöglichkeiten für die chronische myeloide Leukämie (CML) bereit. Allerdings lassen sich für etwa 60% der Patienten keine geeigneten Spender finden.
CML ist in der frühen chronischen Phase durch eine einzelne ermittelte transformierende genetische Abnormalität charakterisiert. Es handelt sich dabei um die t(9;22) Translokation (Philadelphia Chromosome, Ph), die das bcr-abl On- cogen kreiert, den einzigen Faktor, der unbedingt für die Entwicklung der Krankheit benötigt wird (Daley et al 1990). Verglichen mit anderen Tumorty- pen in der chronischen Phase besitzen CML Patienten ein relativ intaktes Immunsystem (Lewalle et al 1996). CML ist für eine tumorspezifische Immunantwort zugänglich. In den vergangenen 20 - 30 Jahren wurden Anti-Tumor- Antworten von allologen Knochenmarkstransplantaten (allo-BMT) und zuletzt auch von Spender-Leukozyten-Infusionen [Donor leukocyte infusion (DLI)] klinisch zur Behandlung von CML ausgenutzt.
Die Erkennung und Auslöschung von verbleibenden Tumorzellen durch Spenderimmunzellen scheint essentiell für die Induktion einer molekularen Remission zu sein. Transplantate, aus denen die T-Zellen entfernt wurden, vergrößern das Risiko des Rückfalls zur CML (Champlin et al 1988; Horowitz et al 1990). Eine stringente Demonstration, des durch allo-BMT generierten Anti-Leukämie- Effektes kann man beobachten, wenn DLI verabreicht wird, sobald die Krankheit wiedererscheint. In dieser Konstellation kann DLI eine anhaltende mole- kulare Remission in bis zu 70% der Fälle wiedereinsetzen (MacKinnon 2000). DLI steht aber auch mit einer signifikanten Toxizität, verursacht durch eine GVHD in Verbindung. Diese begleitet oft den Transplantat-gegen-Leukämie- (GVL) -Effekt. Die Mortalität liegt hierbei bei 50-90% (MacKinnon 2000).
Hinweise für Immunregulationen bei der CML:
_ Erhöhtes Risiko eines Rückfalls bei T-Zell-Exklusion aus dem Transplantat _ Erhöhtes Risiko eines Rückfalls bei Abwesenheit von GVHD _ BMT von syngenen Zwillingen ist weniger effektiv als passendes BMT von Geschwistern
_ Der Rückfall reagiert auf eine Absetzung einer Immunsuppression _ Spender-Leukozyten-Infusionen sind bei einem Rückfall effektiv
Die Allo-BMT stellt einen ziemlich groben Ansatz mit signifikanter Transplantat- bedingter Morbidität und Mortalität dar. Das Risiko zu sterben liegt bei 20 - 41% (Silver et al 1999). Diese Form der Immunotherapie bietet aber auch eine bis zu 70% Leukämie-freie Überlebensrate für die Transplantatempfänger (Clift & Anasetti 1997).
Behandlung der Abstoßungsreaktionen
Obwohl die Immunreaktion Organtransplantationen schwierig macht, gibt es wenige Alternativen bei Organausfällen. Die Verwendung von potenten im- munsuppressiven Drogen, besonders Cyclosporin A und FK-506, die die Akti- vierung von T-Zellen verhindern, macht Organtransplantationen erfolgreich. Trotzdem laufen hier einige Probleme auf, da das Leiden, welches das eigene Organ zerstört hat, auch das fremde Organ zerstört. Außerdem steigt durch die Unterdrückung des Immunsystems, das Risiko an Krebs oder Infektionen zu erkranken. Zudem ist die Prozedur sehr kostspielig (Janeway and Travers 1997). Co-stimulatorische Moleküle
Das Produkt des Maus PD-1 Gens (ACCESSION NM 321893), einem Mitglied der IgG-Superfamilie, ist ein Rezeptor mit Verbreitung in vielen Geweben. Analysen, die mittels Durchflusszytometrie und Immunopräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper J43mAk durchgeführt wurden, zeigten, dass das PD- 1 Genprodukt ein 50 bis 55 kDa großes Membranprotein ist. Das PD-1 Protein scheint stark glycosyliert zu sein, da das berechnete Molekulargewicht der A- minosäuresequenz 29310 Da ist. Normales lymphoides Gewebe der Maus wie Thymus, Milz, Lymphknoten und Knochenmark enthält nur eine geringe Anzahl an PD-1-positiven Zellen. Trotzdem erscheint eine signifikante PD-1-positive Population in Thymozyten ebenso wie auf T-Zellen in Milz- und Lymphknoten durch die in vivo -Behandlung mit Anti-CD3 monoklonalen Antikörpern. Weiterhin wurde die PD-1-Antigenexpression durch in vitro - Stimulation in ver- schiedenen Untergruppen von Thymozyten und Milz-T-Zellen stark induziert, entweder mit Anti-CD3 mAk oder Concanavalin A, welches T-Zellen sowohl zur Aktivierung als auch zum Zelltod bringen kann. Die PD-1-Expression auf Milz- B-Zellen wurde in ähnlicher Weise mit Anti-IgM Ak stimuliert. Im Gegensatz dazu wurde PD-1 nach Behandlungen wie Wachstumsfaktorentzug, Dexa- methason oder Lipopolysaccharid nicht signifikant exprimiert. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die Expression von PD-1 strikt reguliert ist und durch Signaltransduktion über den Antigenrezeptor induziert wird. Dies schließt nicht die Möglichkeit aus, dass das PD-1 Antigen in der klonalen Selektion von Lymphozyten eine Rolle spielt, obwohl für den normalen Ablauf der Apoptose PD-1 Expression nicht erforderlich ist (Agata et al 1996; Ishida et al 1992; Nishimura et al 1996).
Der PD-1 Rezeptor induziert die Verminderung von Immunantworten und sein Verlust führt zum Zusammenbruch der Toleranz in peripheren Geweben. PD-1 defiziente Mäuse entwickeln Lupus-artige proliferative Arthritis und Glomerulo- nephritis mit prädominater IgG3 Ablagerung während des Alterns. PD-1 ist von der Struktur ähnlich zum CTL-assozierten Antigen 4 (CTLA-4), welches B7-1 und B7-2 bindet und eine entscheidende Rolle bei der Instandhaltung der T- Zell-Homoeostase spielt ( Reviews, in Sperling & Bluestone 1996; Thompson & Allison 1997). PD-1 enthält das MYPPPY Motiv nicht, welches kritisch für die B7-1 und B7-2 Bindung ist. Die extrazellulären Regionen von PD-1 und CTLA-4 bestehen jeweils aus einer IgV-Domäne mit 23% Identität. Ein PD-1-Ligand ist PD-Ll. Die Bindung von PD-Ll an PD-1 führt zur Inhibition der TCR- vermittelten T-Zell-Proliferation und Cytokinsekretion (Freeman et al 2000). Das humane und Maus PD-Ll Molekül (EMBL/GenBank/DDBS unter accession nos. AF233516 und AF233517, (Freeman et al 2000)) sind Mitglieder der B7 Genfamilie und haben eine ähnliche strukturelle Organisation, die aus einer IgV und einer IgC Domäne in der extrazellulären Region (Boussiotis et al 1996), einer hydrophoben Transmembrandomäne, gefolgt von einer kurzen, geladenen intrazellulären Region besteht. Das humane PD-Ll ist mit 290 Aminosäuren identisch mit B7-H1, von welchem berichtet wird, dass es die T-Zell- Stimulation aktiviert (Dong et al 1999). Die Maus PD-Ll cDNA kodiert ein Po- lypeptid mit 70% Aminosäureidentität zum humanen PD-Ll. PD-Ll weist Aminosäureidentitäten von 21, 20, und 23% zu B7-1, B7-2, und ICOS (ligand of inducible co-stimulator) auf (Boussiotis et al 1996; Ling et al 2000; Swallow et al 1999; Yoshinaga et al 1999). Die Expressionsmuster von B7-1, B7-2, und PD-Ll sind unterschiedlich. B7-2, einer der Liganden von CD28 und CTLA-4, wird konstitutiv auf Monozyten exprimiert. Die konstitutive Expression von B7-1 und B7-2 kann allerdings in keinem Organ beobachtet werden. Die B7-1 und B7-2 Expression kann in Dendritischen Zellen, Macrophagen und B-Zellen (Boussiotis et al 1996), sowie einigen Typen von Fibroblasten und Epithelzellen induziert werden. Im Kon- trast dazu wird PD-Ll konstitutive von nicht-lymphoiden, parenchymalen Organen wie dem Herzen, der Placenta, Skeletmuskeln und Lunge, nicht aber dem Dünndarm exprimiert (Dong et al 1999). PD-Ll wird auch bei einigen Krebsarten exprimiert. Möglicherweise benutzen diese Tumoren PD-Ll, um Antitumorimmunantworten zu inhibieren. Da PD-1 sowohl auf aktivierten T- als auch B-Zellen exprimiert wird (2), könnte die Expression von PD-Ll in nicht- lymphoiden Geweben, sowie auf dendritischen Zellen die Regulation von potentiell autoreaktiven Lymphozyten ermöglichen. Das könnte ein wichtiger Mechanismus sein, um Aktivitäten von T- und B-Zellen im Herzen, in der Lunge, in den Nieren und in der Placenta zu limitieren, wo PD-Ll hoch ex-primiert ist (Freeman et al 2000).
PD-1 Ligand 2 (PD-L2) ist ein weiterer Ligand des PD-1-Rezeptors. Die Bindung von PD-L2 an PD-1 inhibiert die T-Zellrezeptor (TCR)-vermittelte Prolife- ration und Cytokinproduktion durch CD4 T-Zellen dramatisch. Bei niedriger Antigenkonzentration inhibieren PD-L2-PD-l-Interaktionen starke B7-CD28- Signale. Bei hohen Antigenkonzentration reduzieren sie die Cytokinproduktion aber inhibieren nicht die T-Zellproliferation. PD-L/PD-1-Interaktionen führen zum Zellzyclusarrest in G0 /Gj (Zellzyklusphasen) erhöhen aber nicht die An- zahl der toten Zellen. Die PD-L2-Expression auf APCs wird durch Behandlung mit Interferon γ erhöht und konnte auch in einigen anderen Geweben und Tu- morzellinien detektiert werden. PD-Ll und PD-L2 haben also überlappende Funktionen (Latchman et al 2001). mPD-L2 (bisheriger Name: Protein AF142780) kodiert für ein Polypeptid mit 38% Aminosäureidentität mit mPD-Ll. Murines und humanes PD-L2 zeigen 70% Aminosäureidentität. Die fünf Mitglieder der B7-Familie — B7-1, B7-2, ICOS-L, PD-Ll und PD-L2— haben 21-27% Aminosäureidentität und eine strukturelle Organisation, die aus einer Signalsequenz, einer IgV-artigen, einer IgC-artigen und einer transmembran Domäne und einem kurzen cytoplasmati- sehen Schwanz besteht. Der cytoplasmatische Schwanz von PD-Ll ist zwischen Mäusen und Menschen konserviert, was im Kontrast zu der geringen Konservierung des cytoplasmatischen Schwanz von PD-L2 von Menschen und Mäusen steht (Latchman et al 2001). Die PD-L2 Gewebeverteilung ist ähnlich wie die von PD-Ll. Man findet eine Ex- pression in Plazenta, Herz, Pankreas, Lunge und Leber, eine niedrige Expression in Milz, Lymphknoten und Thymus, keine Expression in unstimulierten Monozyten, die aber durch Interferon γ induziert werden konnte. Die Kinetik dieser Induktion ist allerdings langsamer als die von PD-Ll. Allgemeines zu Autoimmunerkrankungen
Autoimmunerkrankungen gehören zu den chronischen Erkrankungen. Zu ihnen zählen Rheuma in verschiedensten klinischen Ausprägungen, Diabetes, Mul- tiple Sklerose, bestimmte Formen von Herzmuskelentzündungen und von Schilddrüsenerkrankungen. Die Reihe von Autoimmunerkrankungen ließe sich fortsetzen, wobei ca. 90% allerdings epidemiologisch nur einen kleinen Prozentsatz ausmachen.
Die klinischen Verläufe von Autoimmunerkrankungen selbst bei ein- und derselben Diagnose können sehr unterschiedlich sein. Z. T. werden schubartige Krankheitsverläufe beobachtet. Entsprechend werden die Behandlungen vom Arzt individuell gestaltet.
Einige der Autoimmunerkrankungen sind antikörpervermittelt. Darunter wird in der Immunologie verstanden, dass der Organismus aus meist nicht bekannten Ursachen Antikörper produziert, welche sich gegen körpereigene zelluläre Strukturen (Autoantigene) richten. Sind diese Antikörper einmal gebildet, lösen sie durch ihre Interaktion und Bindung an die jeweiligen organ- oder zell- spezifischen Strukturen eine zell- und gewebszerstörende Reaktion des Immunsystems aus. Letztendlich führt diese dann zu dem klinischen Bild der Erkrankung (Steinman 1994).
Beispiel hierfür ist die Schilddrüsenerkrankung Morbus Basedow, aber auch eine Form der Herzmuskelentzündung, die zur Dilatativen Cardiomyopathie führt. In einigen Fällen sind sowohl die Targets, gegen die sich die Autoantikörper richten, als auch die Autoantikörper selbst, genau charakterisiert.
WO-A-0066715, EP-A-1179587, PCT/EP 02/03292 und EP 00117051.3 offen- baren Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen mittels gentechnisch manipulierter Antigen-präsentierender Zellen außer B-Lymphozyten Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem besteht unter anderem darin, gentechnologische, therapeutisch nutzbare Produkte für die Reduktion von spezifischen Immunreaktionen zur Verfügung zustellen, bei denen Targets (Antigene, Autoantigene) und Antikörper, Autoantikörper bekannt sind.
Gelöst wird das Problem durch B-Zelle (B-Lymphozyt), dadurch gekennzeichnet, dass in der B-Zelle eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren, wie B7- und/oder CD40-Rezeptoren supprimiert sind und/oder ein CTLA4 bin- dendes Molekül produziert wird und/oder ein PD-1 bindendes Molekül produziert wird.
Vorzugsweise präsentiert die erfindungsgemäße B-Zelle überwiegend vorher bestimmte Antigene (monoantigene B-Zelle).
Gegenstand der Erfindung ist auch eine monoantigene B-Zelle, die durch Transfektion einer B-Zelle mit für Antigene kodierendem nukleinsäurehaltigem Material eine erhöhte Expression dieser Antigene zeigt und die B-Zelle im we- sentlichen nur diese Antigene präsentiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung weist die erfindungsgemäße B-Zelle eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, auf.
Insbesondere bewirkt die eine Transfektion der erfindungsgemäßen B-Zelle eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40- Rezeptoren und/oder von CTLA4 bindenden Molekülen und/oder eine Expression von PD-1 bindenden Molekülen und gegebenenfalls eine Erhöhung der Anzahl von Homing- Rezeptoren.
Die erfindungsgemäße B-Zelle enthält beispielsweise Nukleinsäuren, die für PD-1 bindende Moleküle und/oder CTLA4 bindende Moleküle kodieren und/oder Antisense-Nukleinsäuren zur Verhinderung der B7-und/oder CD40- Rezeptor Expression.
Die erfindungsgemäße B-Zelle kann weiterhin Nukleinsäuren enthalten, die für PD-1 bindende Moleküle kodieren, die in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
Bei der erfindungsgemäßen B-Zelle können die PD-1 bindenden Moleküle vorzugsweise PD-Ll, PD-L2, Antikörper, monoklonale Antikörper sein.
Die erfϊndungsgemäße B-Zelle kann Nukleinsäuren, die eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression bewirken, enthalten.
Des Weiteren kann die erfindungsgemäße B-Zelle Nukleinsäuren enthalten, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40-Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewirken.
Insbesondere exprimiert die erfϊndungsgemäße B-Zelle Proteine, die affine Strukturen zu B7-Rezeptoren aufweisen CTLA4, CTLA4-Derivate (z. B. CTLA4Ig oder CTLA4-Dimeren, CD28, Antikörper, F(ab)2, scFv und/oder Fab-Fragmente sind.
Die erfindungsgemäße B-Zelle kann Nukleinsäuren enthalten, die für eine Sig- naisequenz kodieren oder Expressionsprodukte, die eine Signalsequenz besitzen, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retiku- lum, dem Golgi-Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesi- keln bewirken.
Die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle kann mit Nukleinsäuren transfi- ziert sein zur Expression von Antigenen, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglicht. Die erfϊndungsgemäße B-Zelle kann Nukleinsäuren wie DNA, RNA, Oligonukle- otide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNA) enthalten.
Die DNA kann insbesondere Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3'-Enden zur Transkription der DNA in RNA und die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfϊn- dungsgemäßen B-Zelle durch ex vivo oder in vivo Verfahren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine B-Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmi- den, die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene B-Zelle transfiziert.
Insbesondere wird die erfϊndungsgemäße B-Zelle oder die erfϊndungsgemäße monoantigene B-Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteri- eilen Vektoren, Plasmiden die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit erhöhter Produktion von PD-1 bindenden Molekülen und/oder CTLA4 bindenden Molekülen und/oder mit supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transfiziert und die Ex- pression co-stimulatorischer Rezeptoren wird durch Verhinderung deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die B-Zelle oder monoantigene B-Zelle gebunden sind, verhindert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, PD-Ll, PD-L2, PD-1 bindende Moleküle, CTLA4 bindende Moleküle, CTLA4, CTLA4-Derivate (z.B. CTLA4Ig oder CTLA4-Dimere), CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. PD-1, CTLA4, B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der erfindungsgemäßen monoan- tigenen B-Zelle oder der B-Zelle in Kontakt gebracht.
Dabei können die Moleküle z. B. durch Vehikel, wie Liposomen, Hydrogele, Zyklodextrine, Nanokapseln, Nanopartikel, bio-adhäsive Mikrokugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die erfin- dungsgemäße monoantigene B-Zelle oder die B-Zelle transferiert werden.
Die Nukleinsäuren werden insbesondere durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Ein- Schleusung von Molekülen in die monoantigene B-Zelle oder die B-Zelle transferiert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen B-Zellen oder monoantigenen B-Zellen.
Insbesondere ist bei dem erfindungsgemäßen Arzneimittel mindestens eine erfindungsgemäße B-Zelle oder monoantigene B-Zelle als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen B-Zelle oder monoantigenen B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen.
Auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen B-Zelle oder monoantigenen B-Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale ist Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung wir im Folgenden näher erläutert:
Zu den Zellen des Immunsystems gehören auch die B-Zellen (Lymphozyten) als Schaltstellen des anpassungsfähigen Immunsystems. Sie können eine T- Zell-vermittelte Immunantwort auslösen oder abstellen.
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper normalerweise als spezifische Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten produziert. Die Induktion und Produktion der löslichen Antikörper erfolgt allerdings nicht unabhängig von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunre- aktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert.
Die Antikörperproduktion - und so auch die Produktion der pathologischen Autoantikörper - lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von APCs und T-Helfer-Lymphozyten, die ihrerseits antigenspezifisch die B-Lymphozyten aktivieren.
Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zell-Zell-Kontakts - von B-Zellen mit den T-Helfer-Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt.
Handelt es sich bei dem Antigen z.B. um ein Bakterienprotein, ist die Immunreaktion für den Organismus nützlich. Ist das Antigen allerdings eine körpereigene Struktur, spricht man von einer (pathologischen) Autoimmunreaktion.
Neben dem zu präsentierenden Antigen (gegen welches sich die zu produzierenden Antikörper richten) sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellaktivierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenprä- sentation (Kontakt von Monozyt mit den T-Helfer-Lymphozyten) ist ein costi- mulierender Rezeptor mit der Bezeichnung B7.
Die erfindungsgemäße B-Zelle weist durch eine Transfektion mit nukleinsäu- rehaltigem Material, eine erhöhte Expression eines Antigens auf, wobei die An- tigen-präsentierende Zelle im wesentlichen nur vordefinierte Antigene präsentiert.
Das erfindungsgemäße gentherapeutische Verfahren beruht auf gentechnolo- gischen Eingriffen an patienteneigenen B-Zellen. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken die Verminderung von B7-Molekülen durch die Behinderung bzw. Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der B-Zellen und/oder gegebenenfalls CTLA4 bindenden Molekülen, vorzugsweise Antikörper (nicht abgebildet), und/oder gegebenenfalls die Produk- tion von PD-1 bindenden Molekülen vorzugsweise PD-Ll (nicht abgebildet) und gegebenenfalls gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens.
Verminderung der spezifischen Antikörperproduktion durch Gentherapie
Die Produktion pathologischer Immunreaktionen wird durch die Manipulation von B-Zellen und die daraus resultierende Abschaltung pathologischer T-Zellen spezifisch beendet. Hierbei wird ausgenutzt, dass T-Zellen den Rezeptor PD-1 produzieren. Dieser sorgt bei Bindung an PD-Ll dafür, dass T-Zellen nicht mehr proliferieren. Eine Bindung von PD-1 kann also für das Abstellen von T- Zeil-Antworten sorgen. Hierfür können auch andere Bindemoleküle als PD-Ll eingesetzt werden.
Es kann stattdessen oder zusätzlich ausgenutzt werden, dass T-Zellen zwei Rezeptoren produzieren, die B7 (1 oder 2) erkennen. Der eine Rezeptor ist CD28, der andere ist CTLA4. CD28 entfaltet eine stimulierende Wirkung, während CTLA4 eine solche Wirkung nicht entfaltet. Der Kontakt von CTLA4 mit B7 sorgt für das Abschalten der jeweiligen T-Zelle. Diese geht dann entweder in die Apoptose über programmierten Zelltod, wird abgeschaltet, oder wird in eine toleranzerzeugende T-Zelle umgewandelt. Die Toleranz wird in diesem Fall gegen das spezielle von dieser T-Zelle erkannte Antigen erzeugt. (Gribben et al., 1994; Judge et al., 1999; Lee et al., 1998; Lin et al., 1998; Metzler et al., 1997; Olsson et al., 1999; Oosterwegel et al., 1999a; Oosterwegel et al., 1999b; Peach et al., 1994; Walunas et al., 1996; Wu et al., 1997; Wulfing and Davis, 1998).
Zur Bindung an CTLA4 anstatt von CD28 werden Moleküle, wie Antikörper, eingesetzt, die an CTLA4, nicht aber an CD28 binden. Diese können dann die von CTLA4 beförderte Reaktion der T-Zellen induzieren. Diese CTLA4 bindenden Moleküle können vorzugsweise Antikörper sein.
Der Co-Rezeptor B7, ohne den die Antigenpräsentation bzw. die Induktions- kaskade zur Antikörperproduktion nicht anläuft, kann stattdessen oder zusätzlich unterdrückt werden, um eine präferentielle Bindung von CD28 zu unterdrücken. Der Co-Rezeptor stellt zwei unterschiedliche Co-Rezeptoren, die als CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) bezeichnet werden, dar. Ihre Strukturen sind bekannt.
Nach dem Abschalten der Antikörperproduktion verschwinden die im Blut zirkulierenden Autoantikörper aufgrund des natürlichen Abbaus und des fehlenden Nachschubs.
Nach der in vitro Manipulation der B-Zellen werden die Zellen in die Blutbahn des Patienten zurückgegeben. Die veränderten B-Zellen schalten nunmehr die im Organismus befindlichen pathologischen T-Helfer-Lymphozyten ab. Die gentechnisch veränderten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vor- handenen Pathoantigen-präsentierenden APCs, die allerdings B7 auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T-Helfer-Lymphozyten und damit die Antikörperproduktion aktivieren. Antigenpräsentation bei qentechnisch veränderten B-Zellen
Die cDNA eines Proteins, das als Autoantigen die Produktion pathologischer Autoantikörper hervorruft, wird in das B-Zellgenom integriert. Diese Erbinformation dient dann zur Überproduktion des Autoantigens. Peptide dieses Autoantigens werden daraufhin bevorzugt an MHC II und/oder MHC I präsentiert. MHC II präsentiert die Peptide den T-Helferzellen und versucht solche zu finden, die spezifisch diese präsentierten Peptide erkennen. Wenn gleichzeitig durch ein PD-1 bindendes Molekül PD-1 anstelle von CD28 aktiviert wird und eventuell zusätzlich ein CTLA4 bindendes Molekül CTLA4 anstelle von CD28 aktiviert und eventuell zusätzlich der Co-Rezeptor B7 nicht gleichzeitig an der Zelloberfläche erscheint, werden die T-Helferzellen stillgelegt und können e- ventuell einen vorzeitigen Zelltod erleiden.
Die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle kann insbesondere eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, aufzeigen. Eine Überexpression von Homing-Rezeptoren wird der monoantigenen B-Zelle den Weg in die Lymphknoten weisen, wodurch die gentechnisch veränderten B-Zellen sich vermehrt und schneller in Lymphknoten ansammeln. Die Lymphknoten sind der Ort, an dem die allermeisten Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems hervorgerufen werden. Dort entfalten die gentechnisch veränderten B-Zellen daher eine um ein vielfaches höhere Wirkung als außerhalb der Lymphknoten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen monoantigenen B-Zelle bewirkt eine Transfektion eine Erhöhung der Anzahl von Homing- Rezeptoren und oder eine Erhöhung der Anzahl von PD-1 bindenden Molekülen und/oder eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren und/oder eine Erhöhung der Anzahl von CTLA4 bindenden Molekülen. Die PD-1 bindenden Moleküle können vorzugsweise PD-Ll, PD-L2, Antikörper, monoklonale Antikörper sein. Diese können so geartet sein, dass sie in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
Die CTLA4 bindenden Moleküle können vorzugsweise Antikörper, monoklonale Antikörper sein. Diese können so geartet sein, dass sie in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
Insbesondere mit Antisense-Nukleinsäuren kann die B7- und/oder CD40- Rezeptorexpression in der erfindungsgemäßen monoantigenen B-Zelle verhindert oder reduziert werden.
Alternativ kann mit Nukleinsäuren eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression in der erfindungsgemäßen monoantigenen B-Zelle bewirkt werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle kann Nukleinsäuren enthalten oder damit transfiziert sein, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40- Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewir- ken. Damit werden Proteine gebildet, die durch Komplexbildung mit B7 - und/oder CD40-Rezeptoren diese Rezeptoren praktisch neutralisieren. Insbesondere kommen dazu CTLA4, CD28, Antikörper, F(ab)2/ scFv und/oder Fab- Fragmente als Proteine in Betracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle Nukleinsäuren, die für eine Signalsequenz kodieren oder Expressionsprodukte einer Signalsequenz, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, dem Trans- Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesikeln bewirkt. Die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle wird zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transfiziert, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglichen.
Alle gentechnisch veränderten B-Zellen präsentieren an den meisten ihrer MHC-Komplexe das Autoantigen, während nur sehr wenige "normale" APCs überhaupt das Autoantigen präsentieren und dann auch nur an wenigen MHC- Komplexen. Es ist Ziel der Behandlung, die "normalen" APCs, die das Autoantigen präsentieren und die T-Helfer-Zellen aktivieren, zu verdrängen durch die auf Abschaltung der Antikörperprodukte programmierten, genmanipulierten B- Zellen. Es ist vorteilhaft, das Antigen (die Antigene) auch in einer Form zu verabreichen, die den Transport in die MHC II-Endosomen ermöglicht. Nur so kann zuverlässig eine Präsentation an MHC II erreicht werden. Bei einem gentechnischen Eingriff erfolgt dies in der Regel durch Manipulation des offenen Leserasters, so dass dem Leseraster eine Signalsequenz für dieses Komparti- ment vorgeschaltet wird. Die genetische Manipulation hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie eine viel längere Halbwertzeit hat, als z.B. Oligonukleotide oder Peptide. Eine stabile Integration von Genen führt sogar zu einer permanenten Veränderung der Eigenschaft der Zielzellen.
Die entsprechenden Nukleinsäuren können dabei DNA, RNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNA) sein.
Vorzugsweise besitzt die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3 -Enden zur Transkription der DNA in RNA, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein. Die Regulationselemente sorgen für eine effiziente Expression der Gene.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen monoantigenen B-Zelle erfolgt zum Beispiel durch ex vivo oder in vivo Verfahren. Dabei wird vorzugsweise eine B- Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektroporationstechniken, Iontopho- rese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene B-Zelle transfiziert.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine B-Zelle oder eine monoantigene B-Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit erhöhter Menge von PD-1 bindenden Molekülen und/oder mit erhöhter Menge von CTLA4 bindenden Molekülen und/oder supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transformiert werden oder die Expression co-stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung von deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren werden durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die monoantigene B-Zelle gebunden sind, gehindert.
Für die Unterdrückung der Co-Stimulation, die letztendlich ein Unterdrücken der Produktion eines oder mehrerer Proteine oder die Behinderung des Proteins oder der Proteine bedeutet, kommen verschiedene Strategien in Frage:
1. Antisense-Ansatz
2. Co-Suppression
3. Bindung des co-stimulatorischen Moleküls.
Zu 1. : In diesem Fall werden Antisense-Nukleinsäuren in Kontakt mit der mRNA des co-stimulatorischen Moleküls gebracht. Sie binden dann wahrscheinlich das Molekül und verhindern die Translation. Als Nukleinsäuren können verschiedene Arten von Molekülen, wie RNAs, DNAs, PNAs, Ribozyme, eingesetzt werden. Auch hier sorgt ein gentechnischer Eingriff für eine größere Nachhaltigkeit des Effekts. Zu 2. : Erfindungsgemäß erreicht man die Produktion eines Genproduktes auch durch Integration einer möglichst homologen Sense-Gensequenz . Der Mechanismus ist noch völlig unbekannt.
Zu 3. : Die Bindung des co-stimulatorischen Moleküls z.B. durch spezifische Antikörper verhindert, dass dieses Molekül Kontakt mit dem avisierten Rezeptor auf einer T-Zelle aufnimmt und verhindert so die Aktivierung der T-Zelle. Die externe Zugabe solcher Bindemoleküle hat den Nachteil, dass sie auf alle B-Zellen wirken und damit jede Immunreaktion verhindern. Die vorliegende Erfindung bewirkt eine spezifische Behinderung von Immunreaktionen in dem die co-stimulatorischen Moleküle bereits in der Zelle, in einem intrazellulären Kompartiment gebunden werden. Weiterhin wird dafür gesorgt , dass das Bindemolekül im intrazellulären Kompartiment zurückgehalten wird, so dass der co- stimulatorische Rezeptor erst gar nicht zur Plasmamembran gelangt.
Hierfür sind an sich bekannte Signalsequenzen verwendbar, die dem offenen Leseraster des Bindemoleküls zugefügt werden müssen. Dieser intrazelluläre Ansatz lässt sich Vorteilhafterweise an isolierten Zellen durchführen. Auch hier ist ein gentechnischer Eingriff zu bevorzugen.
Die gewünschten Effekte können erfindungsgemäß auch erreicht werden, wenn nur eines der beiden Ziele mit einem gentechnischen Eingriff vorgenommen wird. In diesem Fall können statt der Gene z. B. folgende andere Moleküle eingesetzt werden:
1. Behinderung der Co-Stimulation durch
Nukleinsäuren (zumeist komplementär zur Zielsequenz), bei denen es sich z. B. um Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNAs) handeln kann, Antikörper oder andere Moleküle, die die co-stimulatorischen Moleküle binden.
2. Antigen Kontaktierung durch
Proteine, Peptide, Peptidomimetica.
Es werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, PD-Ll, PD-L2, CTLA4 oder CTLA4-Dimere, CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen B-Zelle oder der B-Zelle in Kontakt gebracht.
Es kann vorteilhaft sein, die Moleküle mittels Vehikeln, wie Liposomen, Hydro- gelen, Zyklodextrinen, Nanokapseln, Nanopartikel, insbesondere biologisch abbaubaren Nanokapseln oder -partikel, bio-adhäsiven Mikrokugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoanti- gene B-Zelle oder die B-Zelle zu transferieren.
Nukleinsäuren können insbesondere durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide, die durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene B-Zelle oder die B-Zelle transferiert werden.
Erfindungsgemäß beansprucht wird weiterhin ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle. Vorzugsweise ist das erfϊndungsgemäße Arzneimittel als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert. Die Formulierung ist so gewählt, dass bei Verabreichung des Arzneimittels keine wesentliche Beeinträchtigung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen monoantigenen B-Zelle erfolgt. So kommt als Infusionslösung vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung in Betracht. Grundsätzlich sind auch andere Lösungen, die einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 aufweisen, geeignet. Auch Serum, beispielsweise humanes Serum, autologes Serum oder Serum anderer Spezies, Lösungen mit Plasmaersatzstoffen, wie Polyvinylpyrrolidon, kommen in Betracht. Typischerweise sollen 0,5 ml bis 500 ml appliziert werden. Diese Mengen und pH-Werte sind selbstverständlich nicht absolut bindend, sondern können vom Fachmann, je nach Bedingungen und Anforderungen, variiert und an die spezifischen Be- dürfnisse eines Patienten angepasst werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle kann insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Im- munreaktionen, wie bei Immunisierungen verwendet werden.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße monoantigene B-Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale verwendet werden.
Erfindungsgemäß beansprucht werden insbesondere Verwendungen, bei denen die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein Tyro- sin Phosphatase IA-2Beta, Antigen: H+K+ATPase, U1RNP, Transglu- taminase, Argininosuccinatlyase (ASL), Tyrosinase-related protein-2, Thyroid Peroxidase, Faktor VIII, Faktor IX; Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, ßl-adrenerger-Rezeptor, αl-adrenerger-Rezeptor, Angiotensin-2-ATl-Rezeptor, Glutamat- Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)-Rezeptor, LFA-1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein,
Zona Pellucida (ZP)-4 Glycoprotein, Follide-Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP- 10;
Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follide-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gona- dotrophin (CG), Interieukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone
Morphogenetic Factors, ß-Interferon, Estradiol;
Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht-erythroides α- Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen,
Sperm Plasma Membran Protein PH-20;
Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP-A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albumin, Glucagon,
Inselzellantigene, Retinal S Ag;
Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d
1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major aller- gen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
Weiterhin wird erfindungsgemäß beansprucht eine Verwendung, bei der die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenolo- gen Gewebsmerkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor stehen.
Gentherapie
Das erfϊndungsgemäße Verfahren zur Reduzierung von Immunantworten, z. B. zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit klar definiertem Autoantikörperprofil, basiert vorzugsweise auf der gentechnischen Manipulation von B-Zellen vorzugsweise außerhalb des Körpers, die dann anschließend wieder in den Organismus zurückgeführt werden. Ziel dieser Behandlung ist unter anderem das spezifische Abschalten einer chronischen, durch das Immunsystem getriebenen Produktion von Autoantikörpern, welche die Krankheit auslösen.
Anwendungsgebiete der Gentherapie
Das Verfahren zur spezifischen Abschaltung von Immunreaktionen ist insbesondere dort sinnvoll, wo ein oder mehrere molekular definierte Targets (Antigene, Autoantigene) bekannt sind. Diese können beispielsweise mit einer Autoimmunerkrankung oder Allergie assoziiert sein.
Z. B. handelt es sich dabei um Krankheiten mit Autoantikörper-vermittelten Autoimmunreaktionen, d. h. um Krankheiten, bei denen die "Bindungsstrukturen" dieser Autoantikörper (Autoantigene, Targets) bekannt sind und pathogenetische Bedeutung haben. Beispiele für Krankheiten mit bekannten, die Autoantikörper-bindenden molekularen Strukturen (Epitope) sind:
• Myasthenia gravis (Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor)
• Morbus Basedow (Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor der Schilddrüse)
• Dilatative Cardiomyopathie (DCM, Autoantikörper gegen den ßl-adrenergen Rezeptor der Herzmuskelzellen)
• bestimmte Formen des insulinabhängigen Diabetes (Autoantikörper gegen Insulin)
• bestimmte Formen des malignen Bluthochdrucks (Autoantikörper gegen den Angiotensin- und/oder αl-adrenergen-Rezeptor).
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper als Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten (B-Zellen) produziert. Die Induktion und Produktion der Anti- körper erfolgt allerdings nicht losgelöst von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunreaktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert. Die Immunreaktion lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von Antigen-präsentierenden Zellen und T-Helfer-Lymphozyten. Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zell-Zell-Kontakts - von Antigen-präsentierenden Zellen mit den T-Helfer- Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt.
Neben dem zu präsentierenden Antigen sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellakti- vierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenpräsentation (Kontakt von Antigen-präsentierenden Zellen mit den T-Helfer-Lymphozyten) sind costimulierende Rezeptoren mit den Bezeich- nungen PD-Ll, PD-L2, B7h (LICOS), B7-1 und B7-2. Auch CD40 spielt bei dieser Signaltransduktion eine Rolle.
Die Funktionen von ICOS, PD-1, CD28, CTLA4 oder CTLA4-Dimeren, B7 und CD40 sind Inhalt zahlreicher Publikationen (Daikh et al., 1997; Greenfield et al., 1998; Johnson-Leger et al., 1998; McAdam et al., 1998; Vyth-Dreese et al., 1995, (Freeman et al 2000; Hutloff et al 1999; Köpf et al 2000; Tamatani et al 2000)) und werden (außer ICOS, PD1) auch umfangreich in Lehrbüchern abgehandelt [s. z.B. (Janeway and Travers, 1997)].
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf mindestens zwei parallelen Eingriffen an patienteneigenen B-Zellen. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken
• die Produktion eines PD-1 bindenden Moleküls, wie z.B. PD-Ll, die über die Wirkung von PD-1, welches in T-Zellen vorkommt, die T-Zellen an der Aktivierung und Proliferation hindert
• und/oder die Produktion eines CTLA4 bindenden Moleküls, wie z.B. Antikör- pern, die über die Wirkung von CTLA4, welches in T-Zellen vorkommt, die
T-Zellen an der Aktivierung hindert
und/oder die Abschaltung von B7 und damit die Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der B-Zellen und/oder die Abschal- tung von CD40.
• gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens/der Autoantigene auf den B-Zellen
Erfolgt die Manipulation der Zellen, die B-Zellen sind, ex vivo , werden die Zellen in die Blutbahn des Spenders zurückgegeben. Die genmanipulierten B- Zellen schalten nunmehr die im Organismus befindlichen entsprechenden T- Helfer-Lymphozyten ab. Die genmanipulierten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vorhandenen Autoantigen-präsentierenden APCs, die allerdings B7 und kein zusätzliches PD-1 bindendes Molekül, CTLA4 bindendes Molekül auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T-Helfer-Lymphozyten und damit unter anderem die Antikörperproduktion aktivieren.
Kausaltherapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien existieren nicht. Von wenigen Ausnahmen abgesehen (extrakorporale Elimina- tion der Antikörper aus dem Blut der Patienten bzw. Plasmapherese), erfolgt die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien medikamentös durch eine Hemmung von Reaktionen des Immunsystems.
Nach wie vor am gebräuchlichsten ist die medikamentöse Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantationen mit immunsuppres- siven Präparaten wie Cortison und dessen Abkömmlingen, sowie Cyclosporin, Beta-Interferon oder Zytostatika (Methothrexat). Desweiteren werden Antikörper, Antagonisten und Oligonukleotide gegen verschiedene Signalkomponenten des Immunsystems mit dem Zweck erprobt, die Aktivierung von T- Zellen zu verhindern. Solche Arzneimittel sind bestenfalls selektiv, nie aber spezifisch gegen die falsch programmierten Autoimmunreaktionen gerichtet. Immunsuppressiva haben daher auf wichtige, notwendige und nützliche Teile des Immunsystems eine negative Wirkung; aus diesem Grund und ihrer Nebenwirkungen wegen ist ihr Einsatz begrenzt.
Von den immunsuppressiven Therapien unterscheidet sich das vorgelegte erfindungsgemäße Gentherapieverfahren zur Reduktion von spezifischen Immunreaktionen grundlegend. Es wird eine spezifische Abschaltung fehlgeleiteter immunologischer Reaktionen durch gentechnisch umprogrammierte pati- enteneigene Blutzellen durchgeführt. Die aufgezeigte Methodik ist als allgemein gültiges Konzept zur Reduzierung von Immunantworten gedacht. Es sollte mit diesem Grundkonzept möglich sein, jede Immunreaktion des anpassungsfähigen Immunsystems wieder abzustellen. Außerdem können nach Belieben solche Immunreaktionen hervorgerufen und dann wieder abgestellt werden.
Beispiele
Puffer und Medien:
Concanavalin A (ConA) (Boehringer Mannheim) als Mitogen
OVA323-339-Peptid Stock : lmg/ml (effektiv: 0,74 mg/ml) in PBS,steril
(entspricht einer Molarität von 400μM)
Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE) , 5 mM Stock in
DMSO (Molecular Probes)
PBS (Steril)
PBA (PBS, 0,5% BSA, 0,2% NaN3)
MACS-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 2mM EDTA)
RPMI 1640 Medium mit 10% deaktiviertem FCS (Sigma Lot Nr. 38H8408 30min/56°C) und 4 mM Glutamin (200 mM Stock Biochrom)/l :50), 50 μM Mercaptoethanol (50mM Stock/1 : 1000), 1 mM NaPyruvat (lOOmM
Stock Biochrom/ 1 : 100) und 30ml 7,5%iges NaHC03 auf lüter.
(Im Text auch als Voll-Medium bezeichnet!)
RPMI 1640 Medium mit 5% deaktiviertem FCS (Sigma Lot Nr. 38H8408 30min/56°C) und 4 mM Glutamin (200 mM Stock Biochrom)/l :50), 50 μM Mercaptoethanol (50mM Stock/1 : 1000), 1 mM NaPyruvat (lOOmM
Stock Biochrom/ 1: 100) und 30ml 7,5%iges NaHC03 auf lüter.
(Im folgenden als Waschmedium bezeichnet) 1. Antigenspezifϊsche Reduktion von Immunantworten
Zielsetzung:
Messung der Proliferation von murinen CD4 und CD8-T Lymphozyten aus OVA immunisierten BALB/c -Mäusen (H-2d) stimuliert mit bestrahlten, OVA323-33g- Peptid beladenen/unbeladenen und transfizierten/untransfizierten A20 (H-2d) als stimulierende APCs.
Untransfizierte A20 sollten dabei mit CTLA-4-Ig transfizierten A20 (A20/CTLA4Ig), die nach der Transfektion auf eine reduzierte B-7.2-Expression selektiert wurden, in ihrer Fähigkeit verglichen werden, eine antigenspezifi- sehe T Zell-Proliferation hervorzurufen.
Durchführung :
Herstellung eines B7.2 reduzierten A20-Klons
Es wurden lxlO6 A20-Zellen mit 25 μg Plasmid-DNA (CTLA4-Ig in pCMV/myc/ER [Invitrogen]) elektroporiert (450V, 3 msec) und 4h im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden von 3 ml Medium 2ml vorsichtig abgesaugt und mit frischem Medium aufgefüllt. Nach 24 h wurden die Zellen unter Selektion gesetzt, indem sie in frisches Medium mit 800 μg/ml Neomycin gegeben wurden. Die Klone verblieben eine Woche unter Neomycin-Selektion, wurden dann über eine Verdünnungsreihe vereinzelt, vermehrt und auf Expression von B7.2 im FACS gemessen.
Dafür wurden lxlO5 Zellen von den vermehrten Klonen abgenommen, mit Anti-mCD86-PE markiert. Der Klon mit der stärksten Reduktion von B7.2 wurde vermehrt und als APC im Experiment verwendet.
Töten der Mäuse Die Mäuse wurden in dem 2 Liter Standzylinder auf Trockeneis und Papiertüchern getötet (der befüllte Standzylinder wurde mit Alu- Abdeckung 10 Minuten vorher stehen lassen, damit sich genug C02 bildet. Unmittelbar danach wurden die Mäuse in Ethanol getaucht und auf dem Präparierbrett aufgespannt. Alle folgenden Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Präparation einer Milz-Zellsuspension
Die Mäuse wurden sofort in die Sterilbank überführt und longitudinal auf der Bauchseite aufgeschnitten. Die Milz wurde präpariert und in ein frisch in ultrareinem Wasser abgekochtes und erkaltetes Edelstahlsieb transferiert. Das Sieb wurde in eine Petrischale, die mit ca. 5ml Medium gefüllt ist, gestellt. Dann wurde das Organ mit einem sterilen Spitzenstempel zerdrückt und über das Sieb gerieben. Das Sieb wurde mehrmals in das Medium getaucht und so alle freigesetzten Zellen vom
Sieb ab in das Medium gespült. Danach wurde die Zellsuspension mit einer 25 ml Pipette von der Kulturschale abgenommen. Die Kulturschale wurde dazu leicht schräg gehalten. Mit einer Pipette wurde der obere Teil der Schale nochmals abgespült. Die erhaltene Suspension wurde dann in einen Zellstrainer (auf einem 50ml Röhrchen) pipettiert. Die zellhaltige Suspension wurde auf ein Volumen von 30 ml eingestellt.
Isolation der Lymphozyten
Die Milzzellen wurden, nachdem sie mit Voll-Medium auf ein Volumen von 30 ml eingestellt worden sind, auf ca. 12-15 ml Ficoll 1083 in einem 50 ml Falcon-Röhrchen geschichtet und bei 650g, 18°C 20 min. zentri- fugiert, (Eppendorf 5810R Schwenkrotor A-4-62). Danach wurden die Röhrchen sachte aus der Zentrifuge genommen und unter die Sterilbank gebracht. Dort wurden die Überstände bis ca. 2 cm über die deutlich zu erkennende Phasengrenze mit dem milchig aussehenden Zell-Layer ab- gesaugt (mittels Membranpumpe zum Absaugen, dazu benutzte man eine sterile 2 ml-Pipette, der man, ohne sie vorne zu berühren, hinten den Teil mit dem Stopfen abbricht und dann so bei laufender Absaugpumpe in den Absaugschlauch hineinsteckt). Man tauchte die Pipette am Absaugschlauch nicht in den Überstand hinein, sondern saugte von der O- berfiäche her langsam nach unten, um so auch obenschwimmenden
Zelldebris und sonstiges Gewebefett zu entfernen. Danach wurden die Zell-Layer mit einer 5 oder 10 ml Pipette unter der Sterilbank abgenommen. Die abgenommene Interphase wurde zweimal mit je 50 ml Waschmedium gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor). Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in ca. 20 ml Vollmedium aufgenommen und gezählt.
Isolation von T-Zellen durch MACS-Sorting
Die Zellsuspensionen wurden auf eine Konzentration von 1 x 107 Zel- len/40μl in entgastem MACS-Puffer eingestellt. Danach wurden pro 40μl Zellsuspension 20μl anti-CD45 (B220)-Beads, 20μl anti-CDllb-Beads sowie 20μl anti-CDllc-Beads zu der Zellsuspension hinzupipettiert, gut gemischt (durch dreimaliges sachtes Hoch- und Runter-Pipettieren mit einer 1 ml-Pipette) und dann 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Hiernach wurde zweimal mit MACS-Puffer gewaschen. Wenn der Überstand nach dem letzten Waschgang vollständig abgesaugt wurde, wur- den die Zellen in einer Konzentration von maximal 1 x 108 Zellen/500μl resuspendiert. Es wurde ein 25 μl Aliquot (Vor-Säule-Aliquot) abgenommen und in PBA (PBS, 0,5% BSA, 0,2% NaN3) auf Eis gestellt. Dann wurde der Rest auf die vorher mit mindestens 3 ml MACS-Puffer gespülten und mit Sieb und 21G Nadel (Kanüle) versehenen LS-Säule (MACS-Kit; Kapazität bis zu 108 positive Zellen) gegeben und durchlaufen gelassen. Es wurde 4 mal mit 3 ml MACS-Puffer gespült. Der Durchlauf enthält die T-Zellen. Dieser wurde abzentrifugiert, in ca. 10 ml sterilem PBS aufgenommen und gezählt. Dann wurden ca. 1 x 106 Zellen als Aliquot abgenommen und auf Eis gestellt. Die Zellen dieses Aliquots wurden mit den Zellen des Vor-Säule-Aliquots anhand von Oberflä- chenmarkern im FACS verglichen, um die Anreicherung der T-Zellen zu dokumentieren.
Färben der T-Zellen mit CFSE
Die restlichen Zellen wurden abzentrifugiert und erneut mit 10 ml PBS gewaschen und dann in einer Zellkonzentration 2 x 107 Zellen/ml in PBS aufgenommen. Dieses Volumen wurde dann in ein 15 ml Falcon- Röhrchen überführt, falls man nicht schon vorher eins benutzt hat (höchstens 1 ml/ Röhrchen). In der Zwischenzeit stellt man sich genügend Volumen (mind. das Gesamtvolumen der Zellproben mit 2 x 107 Zellen/ml) einer 1:5000 Verdünnung der DMSO- 5mM Vorratslösung des Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE) in PBS her. Starke
Lichteinwirkungen wurden dabei vermieden. Diese 1 μM Lösung wurde 1 : 1 auf die Zellsuspensionen der entsprechenden Proben in den 15 ml Falcon-Röhrchen pipettiert. Nach 4 Minuten wurde die Färbereaktion durch Hinzugabe von Vollmedium gestoppt. Alle Röhrchen wurden bis auf 12 ml aufgefüllt. Danach wurden die Zellen zweimal mit Vollmedium gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor). Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen wieder auf eine Zellkonzentration von 1 x 106 eingestellt.
Vorbereitung der B-Zellen: Die verschiedenen A20 Klone wurden mit einer OVA-Peptid-
Konzentration von 6μM 6h lang im C02-Inkubator vorinkubiert. Die verschiedenen A20 Klone wurden mit einer Konzentration von ca. 1 x 106/ml auf sterilen Bakterien-Petrischalen (0 10 cm, 10 ml/Platte) ausplattiert und dann mit einer Dosis von 127,5 Grey (900 Sekunden lang) in einer Cobalt-Bestrahlungsquelle (liefert 8,5 Grey/Minute in 130 mm Höhe (Zellkulturplattenhalter)) bestrahlt und danach zweimal mit Medium (in 50 ml FALCON-Röhrchen) gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor), wobei nach der letzten Waschung der Überstand möglichst vollständig abgenommen wurde. Diese Zellen wurden dann gezählt, auf eine Konzentration von 2 x 106/ml eingestellt.
Mixed Lymphocyte Reaction (MLR):
Die A20 wurden vorgelegt und pro A20-Typ (Wt und A20/CTLA4Ig) in folgenden Ansätzen auf eine 12 Lochplatte vorgelegt. Zusätzlich wurde pro Vertiefung eine konstante Anzahl an aufgereinigten T Zellen hinzu- gegeben. Alle Vertiefungen wurden mit einer entsprechenden Menge an Medium auf das gleiche Volumen gebracht: APC:T Zelle
1. 250μl (5 x 105 Zellen) + 750μl Medium + lOOOμl T Zeil-Suspension 1:2
2. 50μl (1 x 105 Zellen) + 950μl Medium + lOOOμl T Zeil-Suspension 1:10
3. 25μl (0,5 x 105 Zellen) + 975μl Medium + lOOOμl T Zeil-Suspension 1 :20
Die Negativ-Kontrolle enthielt nur Milz-T-Zellen. (2ml Gesamtvolumen) Dann wurden die Platten für 5 Tage im C02-Brutschrank inkubiert. Nach dieser Zeit wurde eine FACS-Analyse durchgeführt (Anti-CD8PE / Anti-CD4Cy5 / Propidiumlodid), wobei mit TruCount Beads von Becton Dickinson die absoluten Mengen der proliferierten CD4 und CD8 Zellen gemessen wurden.
Diskussion und Schlussfolgerung:
Die CD4 und CD8 T Zellen befanden sich voneinander unsepariert in den Inkubationsansätzen und wurden erst in der Analyse getrennt voneinan- der betrachtet.
CD4 positive T Zellen:
Die Gesamtanzahl der CD4 positiven T Zellen (Fig. 1), die mit den OVA- Peptid beladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden bleibt zum Untersuchungszeitpunkt nach 5 Tagen bei allen drei Mischungsverhältnissen zwischen 2,2 x 105 und 2,4 x 105 und damit relativ konstant. Bei den mit untransfizierten, beladenen A20 inkubierten, CD4 positiven T Zellen gibt es beim größten APC:T Zeil-Mischungsverhältnis eine Steigerung der Gesamt-CD4-Zahl von 1,6-1,7 x 105 CD4 T Zellen (bei APC:T Zellen 1:20 und 1: 10) auf 2,3 x 105 CD4 T Zellen. Bei den Gesamtzahlen der mit untransfizierten, unbeladenen A20 inkubierten CD4 positiven T Zellen (Fig. 2) gibt es beim höchsten APC:T Zeil- Mischungsverhältnis eine leichte Steigerung der Gesamtzellzahl von 1,5 x 105 (1:20 und 1 : 10) auf 1,9 x 105 CD4 positive T Zellen. Bei den mit unbeladenen A20/CTLA4Ig inkubierten CD4 T Zellen ist die Steigerung der Absolutzahl beim höchsten Mischungsverhältnis drastischer und zwar von 1,5-1,6 x 105 (1:20 und 1: 10) auf 2,9 x 105 CD4 positive T Zellen.
Die Absolutzahl der proliferierten CD4 T Zellen (Fig. 3), die mit untransfizierten, unbeladenen A20 inkubiert wurden steigt von 4 x 103 (1:20) über 6 x 103 (1 : 10) auf 15 x 103 (1:2).
Bei den mit unbeladenen A20/CTLA4Ig inkubierten CD4 T Zellen bleiben die Zahlen der proliferierten CD4 T Zellen bei allen APC: T Zeil Verhält- nissen auf einem Niveau und zwar zwischen 5 xlO3 und 6 x 103.
Die Absolutzahlen der proliferierten CD4 T Zellen, die mit untransfizierten, beladenen A20 inkubiert wurden (Fig. 4), weisen eine hohe Steigerung vom niedrigsten zum höchsten APC:T Zeil-Verhältnis auf: Von 7 x 103 über 9 x 103 auf 20 x 103.
Die Zahlen der proliferierten CD4 T Zellen, die vorher mit den beladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden, bleiben bei allen Mischungsverhältnissen unter 2 x 103 CD4 T Zellen.
ositive T Zellen Die Gesamtzahl der CD8 positiven T Zellen, die mit beladenen
A20/CTLA4Ig Zellen inkubiert wurden (Fig. 5), bleibt vom niedrigsten zum höchsten APC:T Zeil Mischungsverhältnis relativ konstant (zwischen 2,9 x 104 und 3,2 x 104) während die mit untransfizierten, beladenen A20 inkubierten CD8 T Zellen eine leichte Steigerung der Gesamtzahl im höchsten APC:T Zeil-Verhältnis zeigen (4,5 x 104 bei 1:2 gegenüber
2,9 x 104 und 3,2 x 104 bei 1:20 und 1:10). CD8 T Zellen, die mit untransfizierten, unbeladenen A20 inkubiert wurden (Fig. 6), zeigen eine leichte Steigerung in ihrer Gesamtzahl vom niedrigsten zum höchsten APC:T Zeil-Mischungsverhältnis, von 3,5 x 104 (1:20) über 3,7 x 104 (1: 10) bis 4,1 x 104 (1 :2).
CD8 T Zellen, die mit unbeladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden zeigen Gesamtzahlen von 2,9 x 104 (1 :20), 2,6 x 104 (1: 10) und 3,7 x 104 (1:2).
Bei den proliferierten CD8 T Zellen, die mit den untransfizierten, beladenen A20 inkubiert wurden (Fig. 7), sieht man eine Zunahme der Proliferation vom niedrigsten zum höchsten APC:T Zeil-Verhältnis [4,5 x 103 (1:20) über 6,7 x 103 (1: 10) bis 1,5 x 104 (1 :2)].- Die Gesamtzahl der proliferierten CD8 T Zellen, die mit beladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden, liegt bei allen Ansätzen unter 0,17 x
103.
Die proliferierten CD8 T Zellen, die mit untransfizierten, unbeladenen A20 inkubiert wurden (Fig. 8), liegen in ihren Absolutzahlen in allen Mi- schungsverhältnissen unter 1 x 104 . Bei den proliferierten CD8 T Zellen, die mit den unbeladenen A20/CTLA4Ig Zellen inkubiert wurden, liegen die Zahlen bei allen Mischungsverhältnissen unter 0,6 x 104.
Bei den CD4 positiven T Zellen sieht man einen deutlichen proliferati- onssupprimierenden Effekt der beladenen, A20/CTLA4Ig auf die CD4 positiven T Zellen, der nicht mit den normalen beladenen A20 auftritt. Dieser Effekt ist auch bei dem Ansatz ohne Antigen (Peptid) zu sehen, allerdings ist die Höhe der Stimulation bei den untransfizierten A20 um 1/4 niedriger als bei den beladenen, untransfizierten A20. Hier wurden antigenspezifische (OVA-Peptid) CD4 positive T Zellen abgestellt, wie auch im Hintergrund proliferierende T Zellen, die auch im Ansatz ohne Antigen auftreten. Die Ansätze mit unbeladenen A20/CTLA4Ig prolife- rieren in allen Mischungsverhältnissen deutlich höher als bei den Ansätzen mit beladenen A20/CTLA4Ig. Das heißt, daß die wenig B-7.2 (A20 exprimiert keine meßbaren B-7.1-Mengen) exprimierenden A20 keinen Kostimulus geben und dadurch eine Proliferation der CD4 positiven T Zellen unterdrücken. Wobei in dem antigenspezifischen Ansatz auch nicht OVA-Peptid-spezifische CD4 T Zellen an der Proliferation gehindert werden.
Die Schwankungen in den absoluten Gesamtzahlen, die bestimmt wurden, um sicherzustellen, dass kein massives Zellsterben in einem Ansatz das Ergebnis verfälscht, entstehen unser Meinung nach durch unterschiedliche Sterberaten der T Zellen (bei den niedrigen Mischungsverhältnissen sterben generell mehr T Zellen mangels APC-T Zeil- Kontakten) und nicht durch ein ungenaues Abnehmen der Zellen aus den Vertiefungen. Die Proliferationshemmung durch einem mangelnden Kostimulus über B-7.2 scheint besonders in Verbindung mit einem Antigen zu wirken.
Die Gesamtzahlen der CD8 T-Zellen scheinen über die verschiedenen Ansätzen konsistenter, als bei den CD4 T Zellen. Bei den proliferierten CD8 T Zellen sieht man deutlich, daß die beladenen A20/CTLA4Ig die
Proliferation der CD8 T Zellen vollständig unterbinden während bei den untransfizierten, beladenen A20 eine deutliche Zunahme der Proliferation (wie erwartet) vom niedrigsten APC:T Zeil-Verhältnis zum höchsten hin zu sehen ist. Bei den unbeladenen Ansätzen ist beim untransfizierten Ansatz keine Steigerung der Proliferation zu sehen. Die Proliferati- onssteigerung der CD8 T Zellen beim beladenen, untransfizierten Ansatz ist also vom präsentierten Antigen abhängig.
Die CD8 T Zellen, die mit unbeladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden proliferierten mehr als die, die mit beladenen A20/CTLA4Ig inkubiert wurden. Diesen Effekt konnte man schon bei den CD4 positiven T Zellen beobachten. Auch bei den CD8 T Zellen wirkt die Proliferationshemmung über B-7.2 Suppression am besten in Verbindung mit einem Antigen. Es lässt sich also sagen, dass sowohl CD4 als auch CD8 besonders effektiv in Ihrer Proliferation gehemmt werden, wenn der mangelnde Kostimulus in Verbindung mit einem präsentierten Antigen auf den A20 APCs zusammenkommt.
2. Induktion allogen-spezifischer T-Zell Anergie durch Expression von CTLA4Ig in Antigen präsentierenden Zellen
Ziel:
Ziel des Experimentes war es, mit Hilfe von B7 reduzierten B-Zellen von BalbC-Mäusen eine allogen-spezifische Anergie bei T-Zellen von C3H-Mäusen in vitro zu induzieren. Als APCs dienten dabei A20-Zellen, einer B-Zell Lymphoma Linie, die aus BalbC-Mäusen stammt (H-2d). Diese Zellen lösen bei T- Zellen von C3H-Mäusen (H-2k) allogen-spezifische Proliferation aus, die bei Unterdrückung des costimulierenden Signals durch B7 ausbleiben sollte. Zum Nachweis der Induktion dieser T-Zell Anergie wurden A20-Zellen mit CTLA4Ig transfiziert und über Selektion ein Klon generiert, der B7.2 als Oberflächenprotein erheblich reduziert hatte.
Durchführung des Experimentes:
I. Präparation von T-Zellen aus der Milz:
Töten der Mäuse
Es wurden 12 C3H-Mäuse durch C02 getötet. Unmittelbar danach werden die Mäuse in Ethanol getaucht und auf einem Präparierbrett aufge- spannt. Alle folgenden Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Präparation einer Milz-Zellsuspension
Die Mäuse wurden sofort in die Sterilbank überführt und longitudinal auf der Bauchseite aufgeschnitten, man präpariert die Milzen heraus und transferiert diese in ein frisch in ultrareinem Wasser abgekochtes und erkaltetes Nylonsieb. Das Sieb wurde in eine Petrischale, die mit ca. 5 ml Medium gefüllt ist, gestellt. Dann wurden die Organe mit einem sterilen Spitzenstempel zerdrückt und über das Sieb gerieben. Das Sieb wurde mehrmals in das Medium getaucht und so alle freigesetzten Zellen vom Sieb in das Medium gespült. Danach wurde die Zell- Suspension mit einer 25 ml Pipette von der Kulturschale abgenommen.
Die Kulturschale wurde dazu leicht schräg gehalten. Mit einer Pipette wurde der obere Teil der Schale nochmals abgespült. Die erhaltene Suspension wurde dann in einen Zellstrainer (auf einem 50ml Röhrchen) pi- pettiert. Die zellhaltige Suspension wurde auf ein Volumen von 30 ml eingestellt.
Isolation der Lymphozyten
Die Milzzellsuspension wurde auf 15 ml Ficoll 1083 in einem 50 ml Fal- con-Röhrchen geschichtet und bei 650g, 18°C, 20 Minuten zentrifugiert (Eppendorf 5810R Schwenkrotor A-4-62). Danach wurden die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge genommen und unter die Sterilbank gebracht. Dort wurden die Überstände bis ca. 2 cm über die deutlich zu erkennende Phasengrenze mit der milchig aussehenden Zellbande abgesaugt. Man taucht die Pipette am Absaugschlauch nicht in den Überstand hinein, sondern saugt von der Oberfläche her langsam nach un- ten, um so auch obenschwimmenden Zelltrümmer und sonstiges Gewebefett zu entfernen. Danach wurden die Zellbanden mit einer 5 oder 10 ml Pipette unter der Sterilbank abgenommen. Die abgenommene Inter- phase wird zweimal mit je 50 ml Waschmedium gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor). Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen in ca. 20 ml Vollmedium aufgenommen und gezählt. Isolation von T-Zellen durch MACS-Sorting
Die Zellsuspensionen wurden auf eine Konzentration von 1 x 107 Zel- len/40μl entgastem MACS-Puffer eingestellt. Danach wurden pro 40μl Zellsuspension 20μl anti-CD45 (B220)-Beads, 20μl anti-CDllb-Beads sowie 20μl anti-CDllc-Beads zu der Zellsuspension hinzupipettiert, gut gemischt und dann 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Hiernach wurde zweimal mit MACS-Puffer gewaschen. Wenn der Überstand nach dem letzten Waschgang vollständig abgesaugt wurde, wurden die Zellen in einer Konzentration von 1 x 108 Zellen/500μl resuspendiert. Es wurde ein 25 μl Aliquot abgenommen und in PBA auf Eis (Reinigungskontrolle) gestellt. Dann wurde der Rest auf die vorher mit mindestens 3 ml MACS-Puffer gespülten und mit einem Sieb und 21G Nadel versehenen LS-Säule (Kapazität bis zu 108 positive Zellen) gegeben und durchlaufen gelassen. Es wurde 4 mal mit 3 ml MACS-Puffer gespült. Der Durchlauf enthält die T-Zellen. Dieser wurde abzentrifugiert, in ca. 10 ml sterilem
PBS aufgenommen und gezählt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in einer Konzentration von lxlO7 Zellen/ml Medium eingestellt, ca. 1 x 106 Zellen als Aliquot abgenommen (Kontrolle der Reinigung durch Färbung der Zellsuspension vor und nach MACS-Reinigung mit Antikörpern des gleichen Typs der Aufreinigung und Messung im FACS) und je lxlO7
Zellen in 9 cm Zellkultur-Petrischalen gegeben (10 ml Gesamtvolumen). Die T-Zellen verbleiben über Nacht im C02-Brutschrank.
Färben der T-Zellen mit CFSE
Die T-Zellen wurden von den Platten abgenommen, abzentrifugiert, 2 mal mit 10 ml PBS gewaschen, gezählt und dann in einer Zellkonzentration von 2 x 107 Zellen/ml in PBS aufgenommen. Dieses Volumen wurde dann in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt (höchstens 1 ml/ Röhrchen). In der Zwischenzeit stellt man sich genügend Volumen (mind. das Gesamtvolumen der Zellproben mit 2 x 107 Zellen/ml) einer 1:5000 Verdünnung der DMSO- 5mM Vorratslösung des CFSE in PBS her. Dann sorgt man dafür, dass keine hellen Lichtquellen auf den Arbeitsplatz scheinen, man macht das Licht der Sterilbank aus. Diese 1 μM Lösung wurde in dem gleichen Volumen, wie die Zellsuspension auf die entsprechenden Proben in den 15 ml Röhrchen (1 :2 Verdünnung, somit 0,5 μM CFSE im Endansatz) gegeben. Nach genau 4 Minuten wurde die Färbe- reaktion durch Zugabe von Vollmedium gestoppt. Alle Röhrchen wurden bis auf 12 ml aufgefüllt. Danach wurden die Zellen zweimal mit Vollmedium gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor). Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen wieder auf eine Zellkonzentration von 3 x 105 Zellen/ml eingestellt. Davon wurde je 1 ml auf die wie unter "II. Bestrahlung der A20-Zellen" beschriebenen A20
Ansätze verteilt. Zusätzlich wurde ein Ansatz pro Zeitpunkt nur mit T- Zellen ohne A20 Zellen angesetzt (Negativkontrolle).
II. Vorbereitung der B-Zellen
Bestrahlung der A20-Zellen Die verschiedenen A20-Klone (a. A20-Zellen unbehandelt, b. A20-
Zellen/CTLA4-Ig), wurden in einer Konzentration von 5xl05 Zellen/ml in unbeschichteten Petrischalen (9 cm) ausplattiert (10 ml). Diese Petri- schalen wurden dann mit einer Dosis von 127,5 Grey (900 Sekunden lang) in der Cobalt-Bestrahlungsquelle [liefert 8,5 Grey/Minute in 130 mm Höhe (Zellkulturplattenhalter)] bestrahlt und danach zweimal mit
Medium (2 ml/well) gewaschen (300g, 18°C, 10 Minuten, Eppendorf 5810R+ A-4-62 Rotor/Plattenhalter). Nach der letzten Waschung wurde der Überstand möglichst vollständig abgenommen und die Zellen in 10 ml wieder auf 9cm Petrischalen (unbeschichtet) ausgesät. Die bestrahl- ten Zellen verblieben so 24h im Brutschrank. Die Zellen wurden nach
24h erneut gezählt, auf eine Konzentration von 2,5xl05 Zellen/ml eingestellt und in folgenden Mengen auf 12-well-Platten verteilt: 2,5xl04 Zellen 5 xlO4 Zellen _ 1 xlO5 Zellen 2,5xl05 Zellen Jeder Ansatz wurde dreifach (Dreifachwerte) pipettiert.
Jetzt werden die gefärbten Milz-T-Zellen dazu gegeben (1 ml / well, 3xl05 Zellen/ml, MLR) woraus sich folgende Mischungsverhältnisse von A20 Zellen: T-Zellen ergeben: a) 1:6 b) 1 :3 c) 1 : 1,2
Die Platten wurden für 3 Tage in den C02-Inkubator geschoben. Nach dieser Zeit wurde eine FACS-Analyse durchgeführt (Anti-CD4Cy5 / Pro- pidium-Iodid), wobei mit TruCount Beads von Becton Dickinson die absoluten Mengen der proliferierten CD4 Zellen gemessen wurden.
Ergebnisse und Diskussion:
Die folgenden Graphiken zeigen die Absolutzahlen der gesamten CD4+ T- Zellen und die Proliferation der CD4+ T-Zellen, 3 Tage nach Ansetzen der in der Durchführung beschriebenen MLR. Die Fehlerbalken ergeben sich aus den angesetzten Dreifachwerten, bei der Nullkontrolle handelt es sich um den Ansatz ohne A20 Stimulation.
Fig. 9: Absolutzahl der proliferierenden CD4+ T-Zellen (3 Tage nach dem pipettieren der Ansätze) Fig. 10: Absolutzahl der gesamten CD4+ T-Zellen (3 Tage nach pipettieren der Ansätze)
Es ergibt sich bei allospezifischer Stimulation von C3H-T-Zellen mit A20-Zellen (BalbC) eine deutliche Titrationskurve bei den verschiedenen Mischungsver- hältnissen (Fig. 9). Dabei lässt sich die Proliferation der CD4+ T-Zellen von ca. 250 proliferierten bei einem Mischungsverhältnis von 1 :6, über ca. 320 prolife- rierte T-Zellen bei einem Mischungsverhältnis von 1 :3, bis hin zu einer Proli- feration von ca. 890 proliferierten T-Zellen bei einem Mischungsverhältnis von 1: 1,2 signifikant steigern.
Dahingegen bleibt die T-Zell-Proliferation bei Stimulation mit B7.2 reduzierten A20-Zellen (A20/CTLA4Ig) innerhalb der Fehlertoleranz bei den verschiedenen Mischungsverhältnissen (vgl. Fig. 9) aus. Daraus lässt sich folgern, dass aufgrund des fehlenden Co-Stimulus durch B7.2 allospezifische T-Zell Anergie induziert wurde.
3. Messung der Reduktion von B7.2 in transgenen A20 In diesem Versuch wurde bestimmt, wie stark B7.2 (CD86) in dem getesteten transgenen A20-Klon reduziert ist (Fig. Fig. 11). Der Klon enthält ein CTLA4Ig- Konstrukt mit ER-Retentionssignal, wodurch B7 (1 + 2)-Moleküle im ER-Lumen zurückgehalten werden. Bei der Bestimmung der CD86-Menge (durch PE markierte monoklonale Antikörper gegen das mCD86) im FACS zeigte sich, dass die Oberflächenpräsenz des Moleküls auf 14,7% der MFI (Mean Fluorescent Intensity) in den transgenen A20-Zellen reduziert wurde.
Erzeugung und Charakterisierung von Plasmiden
CHO-CTLA-Ig-24-Zellen enthalten ein Konstrukt für ein Fusionsprotein, das aus der extrazellulären Domäne von humanem CTLA-4 (Exon 2) besteht, die mit dem Scharnier-, CH2- und CH#-Bereich von humanem IgC-gammal fusioniert ist. Dieses Konstrukt wurde durch PCR amplifiziert und in einen Expressionsvektor, der ein ER-Retentionssignal trug (pCMVmycER), einkloniert.
Fig. 12: Schematische Darstellung der CTLA-4-Konstrukte. Die vollständige Klonierungscassette ist nur in pCTLA-4Ig gezeigt. Die anderen Konstrukte enthielten denselben 5'-Upstream- und 3'-Downstream-Bereich, aber nicht die Ig- Domäne.
Das Plasmid pCTLA-4 wurde erzeugt, indem man die cDNA für die volle Länge des humanen CTLA-4 (extrazelluläre Domäne, Transmembrandomäne und in- trazelluläre Domäne) (Fig. 12) in pCMVmycER einklonierte. Dies entspricht den Exons 2 bis 4 der genomischen Sequenz, wobei nur die Leadersequenz (Exon 1) fehlt [Ling, 1999 #19]. Für pCTLA-4Ex wurde nur die cDNA für die extrazelluläre Domäne von humanem CTLA-4 in denselben Vektor einkloniert (Exon 2). Dies führte zur Expression der Aminosäuren 36 bis 153 von CTLA-4, des einzigen unserer CTLA-4-Konstrukte, das nicht zur Dimerisierung befähigt sein sollte. Da das native CTLA-4-Molekül ein Dimer ist, wurde ein zweites Konstrukt erzeugt, das den extrazellulären Anteil von CTLA-4 enthielt (Exon 2 sowie 21 bp von Exon 3). pCTLA-4Cys überspannt die Aminosäuren 36 bis 160 und enthält das Cystein auf Position 157, das die Dimerisierung auslöst.
Die Expression aller Konstrukte wurde in 293-Zellen durch Antikörperfärbung getestet, und pCMVmycER-GFP diente als Transfektionskontrolle. Die Expression aller CTLA-4-Konstrukte wurde auch durch RT-PCR bestätigt.
Um die ER-Retention zu bestätigen, wurden vorübergehend transfϊzierte Zellen intra- und extrazellulär auf CTLA-4 angefärbt. Die intrazelluläre Färbung zeigte die Expression aller CTLA-4-Konstrukte, während mit der extrazellulären Färbung mit Ausnahme von pCTLA-4 (Fig. 13) keine (pCTLA-4Ig, pCTLA-4EX und pCTLA-4Cys) CTLA-4-Expression nachgewiesen wurde. Das vollständige CTLA- 4 mit dem ER-Zielsteuerungssignal war fast gleichmäßig zwischen der Plasma- membran und dem Cytoplasma verteilt. Mit einem ELISA-Test wurden Überstände dieser Kulturen auf die Sekretion von CTLA-4- Protein getestet (Tabelle 2). In Überständen von Zellen, die mit pCMV-myc-ER-Vektoren transfiziert waren, konnte kein CTLA-4 nachgewiesen werden. Mit Protein A angereicherte Überstände von CHO-CTLA-4Ig-24-Zellen dienten als positive Kontrolle.
Fig. 13: Die intra- und extrazelluläre Anfärbung von 293-Zellen, die mit verschiedenen CTLA-4-Konstrukten transfiziert waren. Alle Konstrukte wurden wenigstens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen in 293 transfiziert. Tabelle 2
Durch ELISA nachgewiesene Konzentration von CTLA-4 im Überstand von 293- Zellen, die mit verschiedenen Plasmiden transfiziert waren
Figure imgf000055_0001
Erzeugung und Charakterisierung transgener A20-Zelllinien Die Lymphomzelllinie A20 (Balb/c), die CD86 (B7.2) und MHC II wurden exprimiert verwendet. Diese Zellen wurden mit den CTLA-4-Konstrukten transfiziert. Die Elektroporation von A20 mit pCTLA-4Ig oder pCTLA-4 und die Selektion mit G418 erzeugte Massenkulturen (MC), bei denen ein Teil der Zellen (3 bis 30%) eine reduzierte B7.2. Expression aufwiesen (A20 erzeugt keine nachweisbaren Mengen an B7.1; Daten nicht gezeigt). Nach der Subklonierung konnten stabile Zelllinien mit verschiedenen Niveaus der B7.2. Reduktion isoliert werden (Fig. 14). Die CTLA-4-Expression bei einzelnen A20-Klonen wurde durch RT-PCR bestätigt.
Die Elektroporation mit pCTLA-4Ex ergab sehr wenig B7.2-reduzierte Zellen, obwohl intrazelluläres CTLA-4 nachgewiesen werden konnte. Dagegen erzeugte die Elektroporation mit pCTLA-4Cys und pCTLA-4Ig vergleichbare Massenkulturen und nach der Subklonierung vergleichbare B7.2. reduzierte Klone (Tabelle 3 und Fig. 14). Mit pCTLA-4 wurde eine kleinere Zahl von reduzierten Klonen erzeugt, und die B7.2. Reduktion war nicht ausreichend. Fig. 14: Oberflächen-CD86-Expression und intrazelluläre CTLA-4-Expression in A20, die mit verschiedenen CTLA-4-Konstrukten transfiziert waren. Alle Konstrukte wurden wenigstens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen transfiziert. In (a) und (b) wurde die Analyse mit Massenkulturen (mc) oder einem isolierten CTLA-4Ig-Klon (b) durchgeführt.
Tabelle 3
A20-Zellen wurden mit verschiedenen Plasmiden elektroporiert und 2 Wochen lang selektiert. Nach der Subklonierung wurden einzelne Klone durch FACS- Analyse auf B7.2. Expression getestet.
Figure imgf000056_0001
Die CTLA-4-Expression bei einzelnen Klonen wurde durch RT-PCR bestätigt (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung von Antikörperfärbung wurde CTLA-4 nur in nichtreduzierten Klonen und in Kulturen, die mit pCTLA-4Ex elektroporiert waren, nachgewiesen (Fig. 14). Die Bindung von intrazellulärem CTLA-4 an B7.2 schien den Nachweis von CTLA-4 durch Antikörper gegen CTLA-4 zu beeinträchtigen (dies wurde mit Hilfe von 293-Zellen bestätigt, die für die CTLA- 4 -Konstrukte transgen waren und die vorübergehend mit B7- Konstrukten transfiziert wurden; Daten nicht gezeigt). Die durch ELISA analysierte CTLA-4-Sekretion war in Überständen von B7.2-reduzierten A20-CTLA- 4-Klonen ebenfalls nicht nachweisbar (Tabelle 4). In Mischexperimenten zwischen Wildtyp-A20 und reduzierten CTLA-4-Klonen wurde die B7.2-Reduktion nicht auf die Wildtyp-A20-Zellen übertragen. Tabelle 4
Nachweis von CTLA-4 durch ELISA im Überstand von A20-Zellen, die mit verschiedenen Plasmiden transfiziert waren.
Figure imgf000057_0001
B? '-reduziertes A20 kann die T-Zell-Proliferation in vitro reduzieren
Mäuse (Balb/c) wurden mit Ovalbumin immunisiert. T-Zellen aus diesen immunisierten Mäusen wurden durch MACS getrennt, mit CFSE angefärbt und als APCs mit Wildtyp-A20 (Fig. 15A) oder A20-CTLA-4Ig (Fig. 15B) inkubiert. Die T-Zell-Proliferation wurde nach fünf Tagen gemessen. Die absoluten Zellzahlen wurden unter Verwendung von TruCount Beads analysiert. Im Vergleich zu Wildtyp-A20 wurde die Proliferation von T-Zellen durch die costimulationsblo- ckierten A20-CTLA-4Ig-Zellen reduziert. Für die antigenspezifϊsche Proliferation wurden A20 und A20-CTLA4-Ig mit OVA323-339-Peptid, einem größeren T- Zell-Epitop von OVA, beladen (Fig. 15C und D). Wiederum wurde die T-Zell- Proliferation nach fünf Tagen gemessen. Außerdem waren bei dieser Einstellung A20-Wildtypzellen stimulationskompetent, während die costimulationsre- duzierten A20-CTLA-4Ig-Zellen die Proliferation von T-Zellen reduzierten.
Fig. 15: Proliferationsassay mit CFSE-markierten MACS-sortierten T-Zellen. A20/Klonl7 wurden entweder mit OVA323-339-Peptid gefüttert (C und D) o- der nicht (A und B). Balb/c-T-Zellen aus immunisierten Mäusen wurden 5 Tage lang zusammen mit diesen Zellen gezüchtet. FACS-Analysen wurden in Bezug auf CSFE, Propidiumiodid, CD8 und CD4 durchgeführt. Die durch TruCount Beads analysierten absoluten Zellzahlen wurden verwendet, um die Menge der proliferierten T-Zellen zu berechnen. Tumorwachstum in vivo
Um die in-vivo-Bedeutung der Reduktion der Costimulation zu testen, wurden immunkompetenten Balb/c-Mäusen subkutan 107 Wildtyp-A20 oder A20CTLA- 4Ig-Zellen injiziert. Die Entwicklung fester Tumoren wurde als Zeichen für re- duzierte B7-abhängige Immunreaktionen überwacht (Fig. 15A). Als Kontrollexperiment injizierten wir immunschwachen NOD/SCID-Mäusen subkutan 106 A20-Zellen oder A20CTLA-4Ig-Zellen, um die in-vivo-Wachstumsrate dieser Zellen zu analysieren (Fig. 15B). Die A20-Zellen wuchsen schneller als die transgenen, was darauf hindeutete, dass die transgenen Zellen keinen Wachstumsvorteil gegenüber den Wildtyp-A20-zellen hatten. Andererseits wuchsen A20-Tumoren erheblich langsamer als A20CTLA-4Ig-Tumoren, wenn man sie in immunkompetente BALB/c-Mäuse injizierte. Dieses Experiment zeigte, dass B7-2 an der Abstoßung des A20-Tumors beteiligt ist.
Fig. 16: Entwicklung von A20-Lymphomzellen als feste Tumoren in vivo. Dia- gramm A zeigt die zeitabhängige Tumorentwicklung von A20- oder A20CTLA- 4Ig-Lymphomzellen in immunschwachen NOD/SCID-Mäusen. Den Mäusen wurden subkutan jeweils 106 Zellen injiziert (N = 5). Diagramm B zeigt die zeitabhängige Tumorentwicklung von A20- oder A20CTLA-4Ig-Lymphomzellen in immunkompetenten BALB/c-Mäusen. Den Mäusen wurden subkutan jeweils 107 Zellen injiziert (N = 5). Die Zahl der Mäuse, die einen Tumor entwickelten, ist für jede Gruppe am Ende der Kurven angegeben. Eine Varianzanalyse (MANOVA) wurde durchgeführt. Signifikante Änderungen zwischen A20- und A20CTLA-4Ig-Mäusen sind auf der Zeitachse angezeigt (*,**). Die F-Werte für Diagramm A am Tag 20 und 25 betragen: F(l,8) = 8,22 und 6,20. Die zeitab- hängige F-Zunahme für A20 ist signifikant: F(l,8) = 23,41; p = 0,001. Die zeitabhängige F-Zunahme für A20CTLA-4Ig ist signifikant: F(l,8) = 11,17; p = 0,01. Die F-Werte für Diagramm B an Tag 11 bis 20 betragen : F(l,8) = 14,87 bis 22,44. Die zeitabhängige F-Zunahme für A20 ist nicht signifikant: F(4,32) = 1,41; p = 0,254. Die zeitabhängige F-Zunahme für A20CTLA-4Ig ist signifi- kant: F(4,32) = 44,09; p = 0,001. Diskussion
Das Beispiel III zeigt die intrazelluläre Retention von B7-costimulatorischen Molekülen von APCs. Wie von anderen gezeigt wurde, ist eine Blockade der Costimulation eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung von Tole- ranz [Takayama, 2000 #3], [Kirk, 1997 #17], [Croxford, 1998 #18], Ling, 1999 #19], [Tomasoni, 2000 #4]. Bis jetzt wurden Studien unter Verwendung von entweder Proteinen, wie blockierenden Antikörpern gegen B7-Moleküle, von löslichem CTLA-4Ig [8Kirk, 1997 #17]] oder von Zellen, die genetisch so modifiziert waren, dass sie CTLA-4Ig sezernieren [Takayama, 2000 #3], [Croxford, 1998 #18], durchgeführt. Alle diese Ansätze leiden unter systemischen Effekten [Guillot, 2000 #20]. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Proteinen sind wiederholte Infusionen von CTLA-4Ig oder von Antikörpern notwendig. Da diese Verfahren nicht antigenspezifisch sind, können sie auch zur Abschaffung notwendiger und nützlicher Immunreaktionen führen [Guillot, 2000 #20].
Die vorliegende Erfindung hat den Vorteil, dass nur die transfizierten Zellen in der Lage sind, Toleranz zu induzieren, während andere Zellen ihren normalen Phänotyp beibehalten.
Erfindungsgemäß wurde die Reduktion der Costimulation in A20 durch Retenti- on von B7 im Endoplasmatischen Retikulum erreicht. Unter Verwendung des ER-Retentionsvektors von Invitrogen wurden Konstrukte hergestellt, die entweder für vollständiges CTLA-4 oder den extrazellulären Anteil codierten. Mit Ausnahme des Konstrukts pCTLA-4 mit der vollen Länge konnte durch Western Blot oder FACS-Analyse kein CTLA-4 extrazellulär nachgewiesen werden. Das Transmembransignal in pCTLA-4 schien das ER-Retentionssignal in gewissem Maße zu überlagern, was zur Expression einer kleinen Menge an CTLA-4 führte, das in der Zellmembran lokalisiert war. Dies war das einzige Konstrukt, das auch B7 auf der Zelloberfläche oder im Golgi-Apparat hätte blockieren können, während die anderen Konstrukte B7 nur intrazellulär blockieren konnten. Die Expression von CTLA-4Ig war mit der von CHO-CTLA-4Ig-24-Zellen (intrazellulär) vergleichbar, aber 293/CTLA-4Ig-Zellen sezernierten kein CTLA- 41g (welches das ER-Retentionssignal enthielt) oder nur in solchen Mengen, die unter der Nachweisgrenze lagen.
Der extrazelluläre Teil von CTLA-4 enthält die B7-bindende Domäne. CTLA-4Ig ist ein starker Inhibitor der Costimulation in vitro und in vivo durch Blockierung der Bindung zwischen B7 und CD28. ER-Iokalisiertes CTLA-4Ig konnte effizient die B7-Oberflächenexpression auf A20-Zellen.
Die Dimerisierung von CTLA-4 ist in vivo bedeutsam für die Bindung von B7. Das Plasmid pCTLA-4Ex, das nur den extrazellulären Anteil von CTLA-4 enthält (Aminosäuren 36 bis 153 ohne das für die Dimerisierung verantwortliche Cys), wird effizient exprimiert und kann in transgenen Zellen durch FACS-Analysen in ähnlichen Mengen nachgewiesen werden wie die anderen Konstrukte. Dennoch konnte mit diesem Konstrukt keine Reduktion von B7 erreicht werden. Bei Verlängerung der extrazellulären Domäne von CTLA-4 durch sieben Amino- säuren des Transmembranteils (pCTLA-4Cys, Cystein in Position 157) kehrte die Fähigkeit zurück, B7 in vivo zu binden. Die CTLA-4-Dimerisierung wurde im großen Rahmen ohne zellulären Kontext analysiert [Greene, 1996 #5]. Es wurde gezeigt, dass monomeres CTLA-4 CD80/CD86 nur mit geringer Affinität und schneller Dissoziation band. Daher ist für eine Bindung mit hoher Avidität in vitro eine kovalente Dimerisierung von CTLA-4 erforderlich. Unsere Daten sind die ersten, die zeigen, dass die Dimerisierung in vivo wichtig ist. Von den Konstrukten, die zur Dimerisierung befähigt sind, erzeugten diejenigen, die nur den extrazellulären Teil von CTLA-4 enthielten (pCTLA-4Cys und pCTLA-4Ig), eine größere Menge an reduzierten Klonen als das mit dem Konstrukt der vol- len Länge (pCTLA-4). Ein Grund dafür könnte die bessere Beweglichkeit der löslichen Moleküle sein. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass der zusätzliche Transmembranbereich der Konstrukts der vollen Länge zu einer anderen Verteilung dieses Moleküls führt.
Überraschenderweise war die Reduktion von B7 nicht in allen transgenen Zel- len zu sehen, obwohl sie CTLA-4 exprimierten. Bei B7-reduzierten Zellen war stets auch die Zahl der Moleküle reduziert, die mit dem Anti-CTLA-4- Antikörper nachweisbar waren. Eine richtige Bindung zwischen B7 und CTLA-4 und anschließende Reduktion von B7 auf der Zelloberfläche schien die Menge des nachweisbaren CTLA-4 zu beeinträchtigen. Bei B7-reduzierten Klonen konnte die CTLA-4-Expression nur durch RT-PCR oder durch Anfärben von CTLA-4Ig am Fc-Teil nachgewiesen werden, obwohl die Färbung nur sehr schwach war. Der ER-Iokalisierte B7/CTLA-4-Komplex scheint rasch abgebaut zu werden und ist daher kaum nachweisbar. Einer der B7-reduzierten CTLA- 4Ig-Klone wurde für T-Zell-Proliferationsassays verwendet. Es wurde gezeigt, dass diese Klone die T-Zellstimulation gegen spezifische Antigene (Ova) nicht unterstützten, obwohl die T-Zellen von Ova-immunisierten Mäusen erzeugt wurden.
Die B7-Reduktion erhöhte auch die in-vivo-Lebensfähigkeit der transgenen A20 (B-Lymphomzellen aus Balb/c). Während A20 in Balb/c-Mäusen nur ein geringes Wachstum zeigte, wuchsen A20-CTLA-4Ig-Zellen in Balb/c-Mäusen kräftig und erzeugten feste Tumoren. Zu Kontrollzwecken wurde auch die in- vivo-Wachstumsrate der Zellen in immunschwachen SCID-Mäusen bestimmt. Die B7-Reduktion erwies sich als ein Vorteil in immunkompetenten Balb/c- Mäusen, aber nicht in SCID-Mäusen. Dieses Beispiel zeigt, dass B7 auf den A20-Lymphomzellen ein wichtiger Faktor für die Aktivierung des Immunsystems ist. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen von [Sotomayor, 2001 #22], der fand, dass A20 in Abwesenheit von B7 starke Immunantworten induziert.
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Claims

Patentansprüche
1. B-Zelle (B-Lymphozyt), dadurch gekennzeichnet, dass in der B-Zelle eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren, wie B7- und/oder CD40-Rezeptoren supprimiert sind und/oder ein CTLA4 bindendes Molekül produziert wird und/oder ein PD-1 bindendes Molekül produziert wird.
2. B-Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zelle ü- berwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene B- Zelle).
3. Monoantigene B-Zelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass durch Transfektion einer B-Zelle mit nukleinsäurehaltigem Material eine erhöhte Expression der so vordefinierten Antigene erfolgt und die B- Zelle im wesentlichen nur diese Antigene präsentiert.
4. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene B-Zelle eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, aufweist.
5. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transfektion eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren und/oder eine Expression von CTLA4 bindenden Molekülen und/oder von PD-1 bindenden Molekülen und gegebenenfalls eine Erhöhung der Anzahl von Homing-Rezeptoren bewirkt.
6. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend Nukleinsäuren, die PD-1 bindende Moleküle kodieren und/oder CTLA4 bindende Moleküle kodieren und/oder Antisense-Nukleinsäuren zur Verhinderung der B7- und/oder CD40-Rezeptor Expression.
7. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 enthaltend Nukleinsäuren, die für PD-1 bindende Moleküle kodieren, die in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
8. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 bei denen die PD- 1 bindenden Moleküle vorzugsweise PD-Ll, PD-L2, Antikörper, monoklonale Antikörper sind.
9. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression bewirken.
10. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40-Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewirken.
11. B-Zelle nach Anspruch 10, wobei die Proteine, die affine Strukturen zu B7-Rezeptoren aufweisen CTLA4, CTLA4-Dimere, CTLA4-Derivate (z.B. CTLA4Ig und deren Dimere), CD28, Antikörper, F(ab)2; scFv und/oder
Fa -Fragmente sind.
12. B-Zelle nach Anspruch 10 und/oder 11, wobei die Nukleinsäuren für eine Signalsequenz kodieren oder die Expressionsprodukte eine Signalsequenz besitzen, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk o- der intrazellulären Vesikeln bewirkt.
13. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene B-Zelle zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transfiziert ist, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglicht.
14. B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren DNA, RNA, Oligonukleotide, Poly- nukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNA) sind.
15. B-Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3 '- Enden zur Transkription der DNA in RNA enthält, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein enthält.
16. Verfahren zur Herstellung der B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 durch ex vivo oder in vivo Verfahren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei eine B-Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, I- ontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine B-Zelle transfiziert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 und/oder 17, wobei eine B-Zelle oder eine monoantigene B-Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit erhöhter Produktion von PD-1 bindenden Molekülen und/oder CTLA4 bindenden Molekülen und/oder mit supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transfiziert wird, die Expression co-stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die B-Zelle oder monoantigene B-Zelle gebunden sind, verhindert wird.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, PD-Ll, PD-L2, PD-1 bindende Moleküle, CTLA4 bindende Moleküle, CTLA4, CTLA4- Dimere, CTLA4- Derivate (z.B. CTLA4Ig sowie deren Dimere), CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. PD-1, CTLA4, B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen B-Zelle oder der B-Zelle in Kontakt gebracht werden.
20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Moleküle gemäß Anspruch 17 durch Vehikel, wie Liposomen, Hydrogele, Zyklodextrine, Nanokapseln, Nanopartikel, bio-adhäsive Mikrokugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die B-Zelle oder monoantigene B-Zelle transferiert werden.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei Nukleinsäuren durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die B-Zelle oder die B-Zelle transferiert werden.
22. Arzneimittel enthaltend mindestens eine B-Zelle oder monoantigene B- Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15.
23. Arzneimittel nach Anspruch 22, wobei mindestens eine B-Zelle oder monoantigene B-Zelle als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert ist.
24. Verwendung mindestens einer B-Zelle oder monoantigenen B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arznei- mittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen.
25. Verwendung mindestens einer B-Zelle oder monoantigenen B-Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale.
26. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein Tyrosin Phosphatase IA-2Beta, H+K+ATPase, U1RNP, Transglutaminase, Argininosuccinatelyase (ASL), Tyrosinase- related protein-2, Thyroid Peroxidase, Faktor VIII, Faktor IX;
Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, Myasthenia gravis, ßl-adrenerger Rezeptor, αl-adreneger-Rezeptor, Angiotensin-2- ATl-Rezeptor, Glutamat-Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)-Rezeptor, LFA-1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein, Zona Pellucida (ZP)-4 Glycoprotein, Follide-Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP-10;
Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follide-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gonadotrophin (CG), Interieukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone Morphogenetic Factors, ß-Interferon, Estradiol;
Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht-erythroides α-Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen, Sperm Plasma Membran Protein PH- 20;
Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP- A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albumin, Glucagon, Inselzellantigene, Retinal S Ag;
Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major allergen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenologen Gewebs- merkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor steht.
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