KR20200002923A - Hiv를 강력하게 저해하는 리포펩티드, 그의 유도체, 그의 약학적 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 HIV를 강력하게 저해하는 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 리포펩티드는 하기 a) 또는 b)이고: a) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되는 리포펩티드; 또는 b) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 말단 보호기 및 친유성 화합물에 연결하여 형성되는 리포펩티드, 상기 말단 보호기는 아미노-말단 보호기 및/또는 카르복실-말단 보호기이며, 상기 폴리펩티드는 28개의 아미노산 잔기의 서열을 가지며, HIV-1 균주 HXB2 유래의 gp41의 서열의 위치 127-154의 아미노산에 해당한다. 본 발명의 리포펩티드의 항-HIV 활성은 T-20의 항-HIV 활성보다 수 천배 또는 심지어 수 만배 만큼 더 크고, 또한 C34-Chol, LP-19 및 유사물과 같은 항-HIV 리포펩티드의 항-HIV 활성보다 유의하게 더 크다.

Description

HIV를 강력하게 저해하는 리포펩티드, 그의 유도체, 그의 약학적 조성물 및 그의 용도
본 발명은 HIV를 강력하게 저해하는 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적 조성물, 및 바이오의약품 분야에서 그의 용도에 관한 것이다.
후천성 면역 결핍 증후군 (acquired immune deficiency syndrome: AIDS)은 현재 인간 건강 및 사회 발전에 심각하게 유해한 감염성 질환이다. AIDS를 유발하는 인간 면역결핍 바이러스는 HIV-1 및 HIV-2의 2개의 타입으로 나뉜다. 세계적으로 약 3,600만 명의 사람이 HIV에 감염되었고, HIV-1이 주요 병원체이다 (www.unaids.org). 현재, 이용가능한 효과적인 AIDS 백신은 없으며, 상이한 단계에서 바이러스 복제를 차단하는 약물이 HIV 감염의 치료 및 예방에서 중요한 역할을 한다. 현재, 임상 치료에서 사용되는 약물은 주로 뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제, 바이러스 진입 저해제 및 인테그라제 (integrase) 저해제를 포함한다 (www.fda.gov). 임상적으로 널리 사용되어진 매우 효과적인 항바이러스 치료 요법, 즉 소위 "칵테일 (cocktail)" 요법은 3-4개의 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제로 주로 구성된다. HIV 감염의 지속성으로 인해, 환자에게 약물을 장기간 투여할 필요가 있고, 이는 쉽게 약물 저항을 초래하여, 임상적 치료 효과에 심각한 영향을 줄 수 있다 [1]. 따라서, 신규한 항-HIV 약물 개발은 항상 AIDS 예방 및 통제를 위한 중요한 전략이었다.
다른 타입의 약물과는 달리, HIV 진입 저해제는 바이러스 복제 초기 단계에서 기능하며, "적은 나라 밖에서 거부하는 것"과 같이 상기 바이러스가 표적 세포로 진입하는 것을 차단하는 작용을 하고, 그러므로 상기 HIV 진입 저해제는 치료 및 예방 모두에서 명백한 이점을 갖는다. 그러나, 현재 2개의 HIV 진입 저해제만이 임상 적용을 위해 승인되었고: 첫 번째 것은 HIV 막 융합 저해제인 엔푸비르티드 (enfuvirtide) (또한 T-20으로 알려짐)로서, 이는 HIV 융합 단백질 gp41로부터 유래되는 36개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 약물이고, 두번째 것은 공동수용체 (coreceptor) CCR5 길항제인 마라비록 (Maraviroc)이다. 2개의 HIV 진입 저해제의 성공적인 개발로 인해, AIDS의 임상적 치료를 위한 신규한 수단이 추가되었다. 불행하게도, T-20은 상대적으로 그의 활성이 낮기 때문에 매일 다량으로 (매일 2회 90 mg 피하 주사) 투여할 필요가 있으므로, T-20은 쉽게 약물 저항을 초래하고, 마라비록은 CCR5-향성 (tropic) 바이러스에 대해 선택적이고, CRCR4-향성 바이러스에 대해 효과가 없다 [2].
HIV의 표적 세포로의 진입은 그의 표면 외피 당단백질 (Env)에 의해 매개되고, 이는 표면 서브유닛 gp120이 막횡단 서브유닛 gp41에 비-공유 결합을 통해 결합함으로써 형성되고, 자연 상태에서는 삼량체 구조이다 [3]. 우선, gp120의 세포 수용체 CD4 수용체 및 공동수용체 (예컨대 CCR5 또는 CXCR4)로의 순차적 결합으로 gp120에서 입체형태적 변화 (conformational change)의 캐스케이드를 유발하고, gp41을 추가로 노출시키며, 상기 gp41의 막 융합 기능을 활성화시킨다. Gp41은 구조적으로 외막 (extraintramembrane) 영역, 막횡단 영역 (TM) 및 내막 (intraintramembrane) 영역의 3부분으로 나뉘고, 상기 외막 영역은 N-말단 소수성 융합 펩티드 (FP) 영역, N-말단 헵타드 반복 영역 (N-terminal heptad repeat region: NHR), C-말단 헵타드 반복 영역 (CHR) 및 막 인접 외부 영역 (membrane proximal external region: MPER)과 같은 몇 개의 중요한 기능 영역을 더 포함한다 (도 1). 1997년 초에, NHR-유래 폴리펩티드 N36 및 CHR-유래 폴리펩티드 C34의 복합체의 결정 구조를 분석하여, 전형적인 6-가닥의 α-나선형 다발 구조 (six-stranded α-helical bundle structure: 6-HB)를 발견하였고, 여기서 3개의 NHR은 a 및 d 위치의 아미노산들의 상호작용에 의해 중심 위치한 나선형 삼량체를 형성하고, e 및 g 위치의 아미노산은 중심 삼량체 외부 주위에 노출되며, a 및 d 위치에서 3개의 CHR 나선과 상호작용한다 [4]. 3개의 적층된 헤어핀 구조와 유사하게, 3개의 CHR 나선은 역병렬 배향 (antiparallel orientation)으로 3개의 NHR 나선에 의해 형성된 홈에서 각각 조합된다. 6-HB 구조에 기반하여, HIV 막 융합 기전은 깊이 이해되었고, 노출된 gp41 융합 펩티드가 먼저 표적 세포 막으로 삽입되고, 그 다음에 CHR이 NHR에 역으로 결합되고, 바이러스 막을 표적 세포 막에 가깝게 하여 안정한 6-HB의 형성에 의해 융합을 야기하고, 이로 인해 HIV 유전 물질이 결국 표적 세포로 진입하였다. 상기 6-HB 구조는 또한 NHR 나선의 C-말단에 형성된 구별되는 소수성 심부 포켓이 존재하고, CHR의 N-말단에서 3개의 아미노산, 즉 소위 포켓-결합 도메인 (pocket-binding domain: PBD)이 NHR 소수성 포켓으로 삽입되며, 이들 사이의 상호작용은 6-HB 구조를 안정화하는데 중요한 역할을 하고, 그러므로 HIV 감염에 필요하다는 것으로 보여준다. 오랜 기간 동안, NHR 소수성 포켓은 항-HIV 약물에 대해 중요한 표적으로 인식되어 왔고, CHR의 PBD 모티프는 항-HIV 펩티드 저해제를 설계하는데 중요하다 [5,6].
이전 연구에서 gp41 CHR 또는 NHR로부터 유래된 폴리펩티드가 유의한 항-HIV 활성을 가지며, 주로 상응하는 NHR 또는 CHR에 경쟁적으로 결합하여 바이러스 자체의 6-HB 구조의 형성을 방해하고, 이에 의해 바이러스와 세포막의 융합을 차단하는 것으로 밝혀졌다 [6]. 전형적으로, 프로토타입 CHR 폴리펩티드의 항바이러스 활성은 프로토타입 NHR 폴리펩티드보다 유의하게 더 높다. T-20 약물은 CHR 폴리펩티드 중 하나에 속하고, 이의 서열은 도 1에 도시되어 있으며, 이는 HIV-1 균주 HXB2 유래 gp41의 위치 127 내지 162의 아미노산 서열에 해당한다. T-20 서열의 구조적 특징 중 하나는 그의 C-말단에 소수성 트립토판-풍부 모티프 (TRM: WASLWNWF)를 갖지만, 그의 N-말단에 PBD 서열 (WMEWDREI)이 결여되어 있다는 것이다. T-20의 TRM이 세포막 지질에 폴리펩티드의 결합을 매개하고, 그러므로 지질-결합 도메인 (lipid-binding domain: LBD)인 것으로 간주되며, 이러한 특성은 T-20의 항바이러스 활성에 있어서 중요하다는 것이 연구로 밝혀졌다. T-20의 임상적 적용에서 명백한 결함으로 인해, 새로운 세대의 HIV 막 융합 저해제의 연구 및 개발은 항상 국제적으로 인기 있는 주제였지만, 대부분의 연구는 주형으로서 34개의 아미노산 함유 CHR 폴리펩티드 C34에 기반하고, 주형으로서 T-20을 사용하는 것은 거의 보고되지 않았다. 그 이유는 하기와 같을 수 있다: 1) C34는 처음에 6-HB 구조 분석을 위해 사용되고, 코어 CHR 서열인 것으로 간주되는 gp41의 위치 117-150의 아미노산 서열에 해당하며; 2) C34는 N-말단에서 중요한 PBD 서열을 함유하고, C34는 NHR 결합 활성 및 항바이러스 활성이 T-20보다 더 높으며; 및 3) C34는 T-20 저항 바이러스 균주에 대해 유의하게 증진된 저해 활성을 갖는다. T2635, SC35EK, SC29EK, 시푸비르티드 (Sifuvirtide: SFT), 알부비르티드 (Albuvirtide: ABT), C34-Chol 및 유사물과 같은 새롭게 개발된 HIV 막 융합 저해제 모두는 C34 서열의 최적화 및/또는 변형에 의해 수득되고 [6,7], 이들은 또한 저해 활성 및 안정성이 T-20보다 더 양호하다.
최근에, CHR 폴리펩티드의 "M-T 후크 (M-T hook)" 구조의 발견은 고활성 HIV 막 융합 저해제를 설계하는 새로운 접근법을 제공하였다 [8-10]. CHR 폴리펩티드의 PBD 전면에서 M-T 후크 구조를 형성할 수 있는 2개의 아미노산 잔기 (즉, Met115 및 Thr116)를 부가하여 표적 서열에 대한 결합 활성 및 저해제의 항바이러스 활성을 유의하게 증가시키고, 구체적으로 T-20 저항 균주에 대한 저해제 활성을 증진시키며, 저해제의 약물 저항에 대한 유전 장벽 (genetic barrier)을 유의하게 증진시키는 것이 연구로 밝혀졌다 [11, 12]. 상기 M-T 후크 구조는 또한 24개의 아미노산 길이를 갖는 MT-SC22EK 및 23개의 아미노산 길이를 갖는 HP23 및 2P23과 같은 NHR 소수성 포켓을 표적으로 하는 짧은 펩티드를 설계하는 것을 가능하게 한다 [13-15]. 이들 짧은 펩티드는 표적 서열에 대한 결합 활성 및 항바이러스 활성이 다른 긴 서열의 폴리펩티드보다 더 높은 것으로 나타났다. 2P23은 HIV-1 및 그의 T-20-저항 균주에 대해 효과적일 뿐만 아니라 HIV-2 및 시미안 면역결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus: SIV)에 대해 매우 효과적이며, 그러므로 2P23은 광범위한 바이러스 막 융합 저해제이다 [13].
세포막의 지질 래프트 (lipid raft)는 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린뿐만 아니라 다수의 막횡단 단백질 및 수용체 (예: HIV 수용체 CD4)가 풍부하며, 바이러스 진입 및 감염에서 중요한 역할을 한다. 한편, 세포막으로부터 유래된 외피 바이러스 지질 이중층 막 구조는 또한 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린이 풍부하며, 바이러스 외피 단백질의 정상 구조 및 기능을 유지하는데 관여한다 [16,17]. HIV의 표적 세포로의 진입 중에, 지질 래프트 및 그 안에 함유된 지질 (예: 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린)은 바이러스의 gp120과 세포 수용체 CD4 또는 공동수용체 사이의 상호작용에 적합한 플랫폼을 제공한다. 연구에 따르면, 바이러스 막 융합 저해제 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 항체 등)를 세포막 표면에 고정시킴으로써, 세포막에서 저해제의 국소 농도가 증가될 수 있고, 이에 의해 그의 항바이러스 활성이 유의하게 증가하는 것으로 밝혀졌다 [18-20]. 사실상, CHR 폴리펩티드 기반 HIV 막 융합 저해제, 예컨대 T-20, T-1249 및 시푸비르티드, 이들 폴리펩티드 자체는 세포막과 상호작용하는 능력을 갖는다 [21-23]. Peisajovich 등은 T-20의 TRM의 아미노산 잔기의 돌연변이 분석 및 그의 C-말단에서 친유성 관능기의 변형에 의해 항바이러스 기능을 나타내는 T-20의 TRM과 세포막 사이의 상호작용에서 TRM의 중요한 역할을 밝혀냈다 [24]. 재조합 제작 기술에 의한 세포막 표면에서 T-20의 발현은 또한 바이러스에 대한 그의 저해 활성을 유의하게 증가시킬 수 있다 [25, 26]. 또한 최근 연구에서 소위 "리포펩티드 (lipopeptides)"로 불리는 지질 사용에 의한 폴리펩티드의 화학적 변형은 세포 막을 표적으로 하는 능력 및 상기 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 증가시키고, 상기 폴리펩티드의 안정성 및 생물학적 반감기를 유의하게 향상시킬 수 있다 [18-20, 27]. HIV 막 융합 저해제에 대한 연구로 CHR 폴리펩티드의 활성 증가는 C-말단 변형에 의존하고, N-말단 변형은 NHR 폴리펩티드에 적합하며, 이는 6-HB의 구조 및 바이러스 막 융합 기전과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 즉, C-말단 고정 (anchoring)은 바이러스의 NHR에 결합하기 위한 CHR 폴리펩티드에 유익하다. NHR 폴리펩티드와는 대조적으로, N-말단 세포막 고정은 바이러스의 CHR에 결합하기 위해 보다 유익하다 [19, 28, 29]. 비-변형된 CHR 폴리펩티드의 설계와 마찬가지로, HIV 막 융합 저해제로서 리포펩티드의 설계는 주형으로서 PBD 함유 C34의 사용에 주목하였다. 대표적인 예는 2009년 Ingallinella 등에 의해 설계된 리포펩티드 C34-Chol이고 (도 1 참조), 이는 콜레스테롤을 C34의 C-말단에 가요성 링커 및 시스테인을 통해 연결하여 수득되고, 항바이러스 결과에 기반하며, 최고 활성을 갖는 HIV 막 융합 저해제인 것으로 간주되고, 동물에서 그의 대사 반감기가 또한 유의하게 연장되었다 [20]. 본 발명자의 실험실에서, 3개의 지질 화합물인, 팔미트산 (C16), 콜레스테롤 및 디히드로스핑고신을 사용하여, NHR 포켓을 표적으로 하는 짧은 펩티드 HP23 및 HP23L을 각각 변형시켜서 높은 활성을 갖는 리포펩티드 그룹을 제조하였고, 상기 LP-11의 인 비보 안정성이 또한 크게 향상되었다 [18]. 최근에, 본 발명자의 실험실에서, 팔미트산-변형된 리포펩티드 LP-19가 광범위한 항-HIV 짧은 펩티드 2P23에 기초하여 수득되고, 이는 보다 높은 항바이러스 활성 및 약물성 (druggability)을 갖는다 [30]. 연구에서 이러한 진보는 신규한 HIV 막 융합 저해제 설계를 위한 이론적 기초 및 기술적 경로를 제시하였다.
참고문헌:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명에 의해 해결하려는 기술적 과제는 HIV를 강력하게 저해하는 방법이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 강력한 HIV 막 융합 저해제를 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 강력한 HIV 막 융합 저해제는 HIV에 대해 강력한 저해 활성을 갖는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체이며, 상기 리포펩티드는 하기 a) 또는 b)이고:
a) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성된 리포펩티드;
b) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 말단 보호기 및 친유성 화합물에 연결하여 형성된 리포펩티드, 상기 말단 보호기는 아미노 말단 보호기 및/또는 카르복실 말단 보호기이며;
상기 a) 및 b)에서, 상기 폴리펩티드는 P1 내지 P5 중 어느 하나이고;
상기 P1은 하기 화학식 I로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며,
화학식 I
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28
상기 화학식 I에서,
X1 내지 X28은 각 아미노산 잔기이고, X1은 W, L 또는 Y이며, X2는 E 또는 T이고, X3은 Q, A 또는 S이며, X4는 K, N 또는 L이고, X5는 I 또는 L이며, X6은 E, D, K, R 또는 A이고, X7은 E, D, K, R 또는 A이며, X8은 L 또는 I이고, X9는 L 또는 I이며, X10은 K, R, E, D 또는 A이고, X11은 K, R, E, D 또는 A이며, X12는 A 또는 S이고, X13은 E, D, K, R 또는 A이며, X14는 E, D, K, R 또는 A이고, X15는 Q이며, X16은 Q이고, X17은 K, R, E, D 또는 A이며, X18은 K, R, E, D 또는 A이고, X19는 N이며, X20은 E 또는 D이고, 및 X21은 E, D, K, R 또는 A이며, X22는 E, D, K, R 또는 A이고, X23은 L 또는 I이며, X24는 K, R, E, D 또는 A이고, X25는 K, R, E, D 또는 A이며, X26은 L 또는 I이고, X27은 E 또는 D이며, X28은 K 또는 R이고;
상기 P2는 상기 P1의 아미노-말단에서 1 내지 4개의 아미노산 잔기 (즉, 상기 화학식 I에서 X1, X2, X3 및 X4의 4개의 아미노산 잔기 중 1 내지 4개)를 결실시켜서 수득되는 폴리펩티드이며;
상기 P3은 상기 P1의 카르복실-말단에서 1 내지 3개의 아미노산 잔기 (즉, 상기 화학식 I에서 X26, X27 및 X28의 3개의 아미노산 잔기 중 1 내지 3개)를 결실시켜서 수득되는 폴리펩티드이고;
상기 P4는 상기 P1의 카르복실-말단에 시스테인 잔기를 부가하여 수득되는 폴리펩티드이며;
상기 P5는 하기 화학식 II로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며,
화학식 II
X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25
상기 화학식 II에서, X5 내지 X25의 정의는 상기 화학식 I에서의 정의와 동일하고;
상기 폴리펩티드는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는다:
v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
v2: HIV-1 및 HIV-2;
v3: HIV-1 및 SIV;
v4: HIV-2 및 SIV;
v5: HIV-1;
v6: HIV-2; 및
v7: SIV.
상기 P5는 본 발명의 리포펩티드의 핵심 서열임이 실험적으로 입증되었다. 상기 핵심 서열의 항바이러스 활성은 그의 N-말단에서 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 부가하고 및/또는 그의 C-말단에서 1-3개의 아미노산 잔기를 부가하여 효과적으로 향상되었다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 그의 유도체에서, 상기 리포펩티드는 항바이러스 활성이 LP-19 및/또는 T-20 및/또는 C34-Chol보다 더 높다.
상기 P1은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다:
X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
상기 P2는 P2-1, P2-2, P2-3 또는 P2-4이고,
상기 P2-1은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
상기 P2-2는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
상기 P2-3은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
상기 P2-4는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
상기 P3은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKK;
상기 P4는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEKC;
상기 P1, P2-1, P2-2, P2-3, P2-4, P3 및 P4에서, X1, X2, X3, X4, X9 및 X12의 정의는 상기 화학식 I에서의 정의와 동일하다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 그의 유도체에서, 폴리펩티드의 서열에서 Xn (n은 1 내지 28 중 임의의 자연수임)을 제외하고, 각 대문자는 아미노산의 약어이며, 상기 아미노산의 약어는 당 분야에 잘 알려져 있는 의미를 가지며, 예를 들어: Y는 티로신이고, T는 트레오닌이며, S는 세린이고, L은 류신이며, I는 이소류신이고, E는 글루탐산이며, K는 리신이고, Q는 글루타민이며, N은 아스파라긴이고, A는 알라닌이며, W는 트립토판이다. 상기 폴리펩티드의 서열 중 아미노산 모두는 L-형 아미노산, 및 D-형 아미노산(들), 인위적으로 변형된 아미노산(들), 자연계에 존재하는 희귀 아미노산(들) 등으로 대체되어 폴리펩티드의 생체이용률, 안정성 및/또는 항바이러스 활성을 향상시킬 수 있는 하나 이상 (예: 2-5개, 2-4개 또는 2-3개)의 아미노산일 수 있으며, 상기 D-형 아미노산은 단백질을 구성하는 L-형 아미노산에 해당하는 아미노산을 나타내고; 상기 인위적으로 변형된 아미노산은 단백질을 구성하고 메틸화, 인산화 등에 의해 변형되는 통상의 L-형 아미노산을 나타내며; 자연계에 존재하는 희귀 아미노산은 단백질을 구성하는 통상적이지 않은 아미노산 및 단백질을 구성하지 않는 아미노산, 예를 들어 5-히드록시리신, 메틸히스티딘, 감마 아미노부티르산, 호모세린 등을 포함한다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 유도체에서, 상기 P1은 P-80/84/85/52, P-87/51 또는 P50이고, 상기 P-80/84/85/52는 서열목록에서 서열번호: 1의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-80, LP-84, LP-85 또는 LP-52의 위치 1 내지 28에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이며, P-87/51은 서열목록에서 서열번호: 2의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-87 또는 LP-51의 위치 1 내지 28에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이고, P50은 서열목록에서 서열번호: 3의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-50의 위치 1-28에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P2-1은 P-88/62이고, 상기 P-88/62는 서열목록에서 서열번호: 4의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-88 또는 LP-62의 위치 1 내지 27에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P2-2는 P63 또는 P60이며, 상기 P63은 서열목록에서 서열번호: 5의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-63의 위치 1 내지 26에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이고, P60은 서열목록에서 서열번호: 6의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-60의 위치 1 내지 26에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P2-3은 P-89/64이며, 상기 P-89/64는 서열목록에서 서열번호: 7의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-89 또는 LP-64의 위치 1 내지 25에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P2-4는 P-90/65 또는 P61이며, 상기 P-90/65는 서열목록에서 서열번호: 8의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-90 또는 LP-65의 위치 1 내지 24에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이고; P61은 서열목록에서 서열번호: 9의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-61의 위치 1 내지 24에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P3은 P-91/55이며, 상기 P-91/55는 서열목록에서 서열번호: 10의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-91 또는 LP-55의 위치 1 내지 25에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다. 상기 P4는 P83 또는 P86이며, 상기 P83은 서열목록에서 서열번호: 11의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-83의 위치 1 내지 29에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이고, P86은 서열목록에서 서열번호: 12의 서열로 표시되는 폴리펩티드 (즉, 도 2에서 LP-86의 위치 1 내지 29에서의 아미노산 잔기로 표시되는 폴리펩티드)이다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 그의 유도체에서, 상기 친유성 화합물은 8 내지 20개의 탄소 원자 함유 지방산, 콜레스테롤 (Chol), 디히드로스핑고신 (DHS), 비타민 E (토코페롤, Toc) 등일 수 있다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에서, 8 내지 20개의 탄소 원자 함유 지방산은 팔미트산 (또한 헥사데카노산으로 알려짐) (C16) 또는 스테아르산 (C18)일 수 있다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에서, 상기 친유성 화합물은 말단 아미노산의 곁사슬에 연결될 수 있거나 또는 펩티드 사슬에 직접 연결될 수 있다. C-말단에 연결된 친유성 화합물로서 지방산, 디히드로스핑고신 또는 비타민 E에 의한 변형은 폴리펩티드의 말단에서 리신 (Lys)의 곁사슬 아미노기와 그의 아미드화 (amidation) 반응에 의해 달성될 수 있고, 콜레스테롤에 의한 변형은 콜레스테릴 브로모아세테이트와 폴리펩티드의 말단에서 시스테인 (Cys)의 곁사슬 티올기 사이에서 수행되는 높은 화학적 선택성을 갖는 티오에테르-형성 반응에 의해 상기 콜레스테롤을 상기 폴리펩티드 사슬에 그래프트 (grafting)하여 달성될 수 있다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에서, 상기 리포펩티드는 LP-80/84/85/52, LP-90/65, LP-87/51, LP-88/62, LP-50, LP-83, LP-91/55, LP-86, LP-63, LP-89/64, LP-60 및 LP-61의 12개의 리포펩티드 중 어느 하나일 수 있다.
상기 LP-80/84/85/52는 LP-80/84/85/52a 또는 LP-80/84/85/52b이며, 상기 LP-80/84/85/52a는 P-80/84/85/52를 상기 P-80/84/85/52의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-80/84/85/52b는 상기 LP-80/84/85/52a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; LP-80/84/85/52a 및 LP-80/84/85/52b에서, 상기 친유성 화합물은 스테아르산, 디히드로스핑고신, 비타민 E 또는 팔미트산이다.
상기 LP-90/65는 LP-90/65a 또는 LP-90/65b이며, 상기 LP-90/65a는 P-90/65를 상기 P-90/65의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-90/65b는 상기 LP-90/65a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; LP-90/65a 및 LP-90/65b에서, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이다.
상기 LP-87/51은 LP-87/51a 또는 LP-87/51b이며, 상기 LP-87/51a는 P-87/51을 상기 P-87/51의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-87/51b는 상기 LP-87/51a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; 상기 LP-87/51a 및 LP-87/51b에서, 상기 친유성 화합물은 디히드로스핑고신 또는 팔미트산이다.
상기 LP-88/62는 LP-88/62a 또는 LP-88/62b이며, 상기 LP-88/62a는 P-88/62를 상기 P-88/62의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-88/62b는 상기 LP-88/62a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; 상기 LP-88/62a 및 LP-88/62b에서, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이다.
상기 LP-50은 LP-50a 또는 LP-50b이며, 상기 LP-50a는 P-50을 상기 P-50의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되고; LP-50b는 상기 LP-50a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다.
상기 LP-83은 LP-83a 또는 LP-83b이며, 상기 LP-83a는 P-83을 상기 P-83의 카르복실-말단에 연결된 콜레스테롤에 연결하여 형성되고; LP-83b는 상기 LP-83a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다.
상기 LP-91/55는 LP-91/55a 또는 LP-91/55b이며, 상기 LP-91/55a는 P-91/55를 상기 P-91/55의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-91/55b는 상기 LP-91/55a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; LP-91/55a 및 LP-91/55b에서, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이다.
상기 LP-86은 LP-86a 또는 LP-86b이며, 상기 LP-86a는 P-86을 상기 P-86의 카르복실-말단에 연결된 콜레스테롤에 연결하여 형성되고; LP-86b는 상기 LP-86a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다. 상기 LP-63은 LP-63a 또는 LP-63b이며, 상기 LP-63a는 P-63을 상기 P-63의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되고; LP-63b는 상기 LP-63a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다. 상기 LP-89/64는 LP-89/64a 또는 LP-89/64b이며, 상기 LP-89/64a는 P-89/64를 상기 P-89/64의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되고; LP-89/64b는 상기 LP-89/64a를 말단 보호기에 연결하여 형성되며; 상기 LP-89/64a 및 LP-89/64b에서, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이다.
상기 LP-60은 LP-60a 또는 LP-60b이며, 상기 LP-60a는 P-60을 상기 P-60의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되고; LP-60b는 상기 LP-60a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다. 상기 LP-61은 LP-61a 또는 LP-61b이며, 상기 LP-61a는 P-61을 상기 P-61의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되고; LP-61b는 상기 LP-61a를 말단 보호기에 연결하여 형성된다.
상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에서, 본 발명의 리포펩티드는 아미노-말단에서 N-말단 보호기를 함유할 수 있고, 상기 N-말단 보호기는 아세틸, 아미노, 말레오일 (maleoyl), 숙시닐, tert-부톡시카르보닐, 벤질옥시, 다른 소수성 기 및 거대분자 담체 기 (macromolecular carrier group)로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나일 수 있으며; 본 발명의 리포펩티드는 카르복실-말단에서 C-말단 보호기를 함유할 수 있고, 상기 C-말단 보호기는 아미노, 아미드, 카르복실, tert-부톡시카르보닐, 다른 소수성 기 및 거대분자 담체 기로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나일 수 있다.
상기 P1 내지 P4로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 폴리펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체가 또한 본 발명의 범위내에 있다.
상기 폴리펩티드의 유도체는 구체적으로 하기 1) 내지 5)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다:
1) N-말단 보호기를 폴리펩티드의 아미노-말단에 연결하고 및/또는 C-말단 보호기를 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
2) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
3) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 폴리펩티드의 아미노-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
4) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 폴리펩티드의 카르복실-말단 및 아미노-말단 모두에 연결하여 수득되는 유도체; 및
5) 폴리펩티드를 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 또는 말레이미드로 변형시켜서 수득되는 유도체.
PM1 또는 PM2의 다량체 (multimer)가 또한 본 발명의 범위 내에 있으며,
상기 PM1은 상기 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에 의해 형성되는 다량체이고;
상기 PM2는 상기 폴리펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에 의해 형성되는 다량체이다.
하기 조성물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 조성물은 하기 C1) 및 C2)를 포함하며,
상기 C1)은 C11), C12) 또는/및 C13)이고, 상기 C11)은 상기 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이며, 상기 C12)는 상기 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이고, 상기 C13)은 상기 다량체이며;
상기 C2)는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트이고;
상기 조성물은 하기 기능 F1)-F5) 중 적어도 하나의 기능을 가지며:
F1) 바이러스에 대한 활성을 가짐;
F2) 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적 치료함;
F3) 바이러스와 세포의 융합을 저해;
F4) 바이러스의 세포로의 진입을 저해; 및
F5) 바이러스의 복제를 저해;
상기 F1)-F5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스이다:
v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
v2: HIV-1 및 HIV-2;
v3: HIV-1 및 SIV;
v4: HIV-2 및 SIV;
v5: HIV-1;
v6: HIV-2; 및
v7: SIV.
하기 E1)-E5)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제품의 제조에 있어서 C11), C12), C13) 및/또는 C14)의 용도가 또한 본 발명의 범위내에 있으며,
상기 C14)는 조성물이고;
상기 E1)은 바이러스에 대한 제품, 예컨대 약물 또는 백신이며;
상기 E2)는 AIDS와 같은 바이러스 감염에 의해 유발된 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적 치료용 제품, 예컨대 약물 또는 백신이고;
상기 E3)은 바이러스와 세포의 융합 저해용 제품, 예컨대 약물 또는 백신이며;
상기 E4)는 바이러스의 세포로의 진입 저해용 제품, 예컨대 약물 또는 백신이고;
상기 E5)는 바이러스 복제 저해용 제품, 예컨대 약물 또는 백신이며;
상기 E1)-E5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스이다:
v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
v2: HIV-1 및 HIV-2;
v3: HIV-1 및 SIV;
v4: HIV-2 및 SIV;
v5: HIV-1;
v6: HIV-2; 및
v7: SIV.
본 발명은 약학적 화합물을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 약학적 화합물은 C11), C12) 또는 C13)이다.
상기 약학적 화합물에서, 상기 약학적 화합물은 하기 용도 U1)-U5) 중 적어도 하나를 갖는다:
U1) 바이러스에 대항하는 용도
U2) 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환 (예컨대 AIDS)을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적으로 치료하는 용도;
U3) 바이러스와 세포의 융합을 저해하는 용도;
U4) 바이러스의 세포로의 진입을 저해하는 용도; 및
U5) 바이러스의 복제를 저해하는 용도;
상기 U1)-U5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스이다:
v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
v2: HIV-1 및 HIV-2;
v3: HIV-1 및 SIV;
v4: HIV-2 및 SIV;
v5: HIV-1;
v6: HIV-2; 및
v7: SIV.
동물에서 바이러스에 의해 유발되는 감염을 치료 또는/및 예방하는 방법이 또한 본 발명의 보호 범위내에 있다.
동물에서 바이러스에 의해 유발되는 감염을 치료 또는/및 예방하는 방법은 대상 동물에게 C11), C12), C13) 또는/및 C14)를 투여하여 상기 동물에서 바이러스 감염을 저해하는 단계를 포함하며,
상기 C14)는 조성물이고;
상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 바이러스이다:
v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
v2: HIV-1 및 HIV-2;
v3: HIV-1 및 SIV;
v4: HIV-2 및 SIV;
v5: HIV-1;
v6: HIV-2; 및
v7: SIV.
본 발명에 따른 리포펩티드의 약학적으로 허용가능한 염 및 폴리펩티드의 약학적으로 허용가능한 염은 아세테이트, 락토비오네이트, 벤젠술포네이트, 라우레이트, 벤조에이트, 말레이트, 비카르보네이트, 말레에이트, 비술페이트, 만델레이트, 비타르트레이트, 메실레이트, 보레이트, 메틸브로미드, 브로미드, 메틸니트레이트, 칼슘 에데테이트, 메틸술페이트, 캄실레이트 (camsylate), 무케이트 (mucate), 카르보네이트, 납실레이트 (napsylate), 클로리드, 니트레이트, 클라불라네이트 (clavulanate), N-메틸글루카민, 시트레이트, 암모늄 염, 디히드로클로리드, 올레에이트, 에데테이트, 옥살레이트, 에디실레이트, 파모에이트, 엠보네이트, 에스톨레이트, 팔미테이트, 에실레이트, 판토테네이트, 푸마레이트, 포스페이트/디포스페이트, 글루셉테이트 (gluceptate), 폴리갈락투로네이트, 글루코네이트, 살리실레이트, 글루타메이트, 스테아레이트, 글리콜릴아르사닐레이트 (glycollylarsanilate), 술페이트, 헥실레소르시네이트, 수바세테이트 (subacetate), 히드라바민 (hydrabamine), 숙시네이트, 히드로브로미드, 탄네이트 (tannate), 히드로클로리드, 타르트레이트, 히드록시나프토에이트, 테오클레이트 (teoclate), 요오디드, 토실레이트, 트리에티오디드 (triethiodide), 락테이트 및 발레레이트 등을 포함한다. 상기 용도에 따라, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 아연 및 비스무트와 같은 양이온으로부터 형성될 수 있거나, 또는 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸-글루타민, 리신, 아르기닌, 오르니틴 (ornithine), 콜린, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, 디에틸아민, 피페라진, 트리스(히드록시메틸아미노메탄) 및 테트라메틸암모늄 히드록시드와 같은 염기로부터 형성될 수 있다. 상기 염은 표준 방법, 예를 들어 유리산과 유기 염기 또는 무기 염기와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 염기성 기 (예: 아미노기)의 존재하에, 산성 염 예컨대 히드로클로리드, 히드로브로미드, 아세테이트, 파모에이트 또는 유사물이 약물의 형태로 사용될 수 있고; 산성 기 (예: -COOH) 또는 알콜 기의 존재하에, 용해도 및 가수분해성을 향상시키기 위해 문헌에 알려져 있는 약학적으로 허용가능한 에스테르 예컨대 아세테이트, 말레에이트, 피발로일옥시메틸 및 에스테르가 서방형 약물 또는 프로드러그의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항바이러스 활성은 또한 바이러스에 대한 저해 활성으로 나타낼 수 있고, 구체적으로 바이러스와 세포의 융합을 저해 및/또는 바이러스의 세포로의 진입을 저해 및/또는 바이러스의 복제를 저해하는 활성으로 나타낼 수 있다. 중요하게도, 장기-작용하는 항바이러스 효과가 비-인간 영장류 (원숭이)에서 나타났다.
본 발명에 의해 제공되는 리포펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물 또는 약학적 화합물은 HIV 감염 및/또는 SIV 감염의 다양한 단계로, 예컨대 AIDS의 발병 단계 (onset stage), 교감 단계 (sympathetic stage) 및 무증상 단계 (asymptomatic stages)를 포함하는, HIV (HIV-1 및/또는 HIV-2) 감염 및/또는 SIV 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 리포펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물 또는 약학적 화합물은 또한 HIV (HIV-1 및/또는 HIV-2) 감염 및/또는 SIV 감염으로, 이의 노출 전 또는 의심스러운 노출 후, 예컨대 수혈, 장기 이식, 체액 교환 (body fluid exchange), 교상 (bite), 사고로 주사 바늘에 찔림 또는 수술 중 환자 혈액에 노출을 포함하는 이의 감염을 예방하는데 사용될 수 있다.
실제로, 본 발명에 따른 리포펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물, 또는 약학적 화합물은 HIV 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 목적으로 환자에게 약제로서 직접 투여되거나 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합하여 투여될 수 있다. 본원에서 담체 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 수-용해성 담체 물질 (예: 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 유기산 등), 난용성 (poorly soluble) 담체 물질 (예: 에틸 셀룰로스, 콜레스테롤 스테아레이트 등), 장용성 (enteric soluble) 담체 물질 (예: 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시메틸 셀룰로스 등)을 포함하며, 상기 수-용해성 담체 물질이 바람직하다. 상기 물질을 사용하여, 이에 한정되는 것은 아니지만 정제, 캡슐, 점적 환제 (dripping pill), 에어로졸, 환제, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 과립, 리포좀, 경피 제제, 구강정 (buccal tablet), 좌약, 주사용 동결건조 분말 및 유사물을 포함하는 다양한 제제 형태가 제조될 수 있으며, 상기 좌약은 질 좌약, 질 링 (vaginal ring), 또는 질 적용에 적합한 연고, 크림 또는 겔일 수 있다. 상기 제제 형태는 통상의 제제, 서방형 제제, 제어 방출 제제 및 다양한 입자 전달 시스템일 수 있다. 단위 제제 형태를 정제로 제제화하기 위해, 당분야에 알려져 있는 다양한 담체가 사용될 수 있다. 담체의 예로는 예를 들어 희석제 및 흡수제, 예컨대 전분, 덱스트린, 칼슘 술페이트, 락토스, 만니톨, 수크로스, 소듐 클로리드, 글루코스, 우레아, 칼슘 카르보네이트, 카올린, 미세결정 셀룰로스 및 알루미늄 실리케이트; 습윤제 및 결합제, 예컨대 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 전분 슬러리, 덱스트린, 시럽, 꿀, 글루코스 용액, 아라비아 검, 젤라틴 페이스트, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 셀락 (shellac), 메틸셀룰로스, 포타슘 포스페이트 및 폴리비닐 피롤리돈; 붕해제, 예컨대 건조 전분, 알기네이트, 아가 분말, 갈조류 전분, 소듐 비카르보네이트 및 시트르산, 칼슘 카르보네이트, 폴리옥시에틸렌, 소르비톨 지방산 에스테르, 소듐 도데실술페이트, 메틸 셀룰로스 및 에틸 셀룰로스; 붕해 저해제, 예컨대 수크로스, 글리세릴 트리스테아레이트, 코코아 버터, 수소화 오일 및 유사물; 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 염 및 소듐 라우릴 술페이트; 윤활제, 예컨대 탈크, 실리카, 옥수수 전분, 스테아레이트, 붕산, 액체 파라핀 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 상기 정제는 또한 당의정 (sugar-coated tablet), 필름-피복정 (film-coated tablet), 장용-피복정 (enteric-coated tablet), 또는 이중층 또는 다중층 정제 (multiple layer tablet)와 같은 피복정으로 추가로 제제화될 수 있다. 단위 제제 형태를 환제로 제제화하기 위해, 당분야에 알려져 있는 다양한 담체가 사용될 수 있다. 상기 담체의 예로는 예를 들어, 희석제 및 흡수제, 예컨대 글루코스, 락토스, 전분, 코코아 버터, 수소화 식물 오일, 폴리비닐 피롤리돈, 글루시르 (Gelucire), 카올린 및 탈크; 결합제, 예컨대 아라비아 검, 트라가칸트, 젤라틴, 에탄올, 꿀, 액상 당 (liquid sugar), 라이스 페이스트 (rice paste) 및 밀가루 페이스트 (flour paste); 붕해제, 예컨대 아가 분말, 건조 전분, 알지네이트, 소듐 도데실 술페이트, 메틸 셀룰로스 및 에틸 셀룰로스이다. 단위 제제 형태를 좌약으로 제제화하기 위해, 당분야에 알려져 있는 다양한 담체가 사용될 수 있다. 상기 담체의 예로는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 레시틴, 코코아 버터, 고급 알콜, 고급 알콜 에스테르, 젤라틴 및 반-합성 글리세리드이다. 단위 제제 형태를 용액, 에멀젼, 동결건조 분말 및 현탁액과 같은 주사용 제제로 제제화하기 위해, 모든 기존의 희석제, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 1,3-프로판디올, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 주사용 제제로 등장성 주사 (isotonic injection)를 제조하기 위해, 적당한 양의 소듐 클로리드, 글루코스 또는 글리세린이 첨가될 수 있고, 기존의 보조용매 (cosolvent), 버퍼 (buffer), pH-조정제가 또한 첨가될 수 있다. 그 외에, 필요하다면 착색제, 보존제, 향료 (perfume), 풍미제 (flavor), 감미제 및 다른 물질이 선택적으로 상기 약학적 제제로 첨가될 수 있다.
상기 제제 형태는 피하 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사 및 복강내 주사, 수조내 주사 또는 인퓨젼 등을 포함하는 주사, 경직장 (transrectal), 질 및 설하 투여와 같은 관내 (intraluminal) 투여, 비강 투여와 같은 호흡기 투여; 및 점막 투여로 투여될 수 있다. 상기 투여 경로 중에, 주사에 의한 투여가 바람직하고, 바람직한 주사 경로는 피하 주사이다.
본 발명의 리포펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물, 또는 약학적 화합물의 투여 용량은 다양한 요인, 예를 들어 예방 또는 치료되는 질환의 특성 및 중증도, 환자 또는 동물의 성별, 연령, 체중 및 개별 반응, 사용된 특정 활성 성분, 투여 경로 및 투여 빈도 등에 의존한다. 상기 용량은 단회-단위 제형 또는 다회- (예: 2회, 3회 또는 4회) 단위 제형으로 투여될 수 있다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 치료적으로 유효한 용량 수준은 치료되는 장애 및 그의 중증도; 사용된 특정 활성 성분의 활성; 사용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식단; 사용된 특정 활성 성분의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 활성 성분 함께 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다. 예를 들어, 당분야에서 통상적인 실시는 원하는 치료적 효과를 달성하는데 요구되는 수준보다 적은 수준의 활성 성분의 투여량으로 시작하여, 상기 투여량을 원하는 효과가 달성될 때까지 점차로 증가시킨다. 일반적으로, 본 발명의 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물 또는 약학적 화합물은 포유동물, 구체적으로 인간에게, 0.001 내지 1000 mg/kg 체중/일의 투여량, 예컨대 0.01 내지 100 mg/kg 체중/일, 및 예컨대 0.1 내지 10 mg/kg 체중/일 및 1-2회/일, 1회/2일, 1회/3일, 1회/4일, 1회/5일, 1회/6일 또는 1회/7일, 바람직하게는 1회/1-2일 또는 1-2회/주의 빈도로 투여될 수 있다.
본 발명의 리포펩티드 또는 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물, 또는 약학적 화합물은 HIV 감염된 환자의 치료 또는 예방을 위해 단독으로 직접 사용될 수 있거나, 또는 전체 치료적 효과를 향상시키기 위해 하나 이상의 항-HIV 약물과 조합하여 동시에 또는 간격을 두고 사용될 수 있다. 상기 항-HIV 약물은 이에 한정되는 것은 아니지만, 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제, 진입 저해제, 통합 저해제, 돌연변이화 저해제 및 유사물을 포함한다. 상기 역전사효소 저해제는 하나 이상의 뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 예컨대 지도부딘 (Zidovudine) (AZT), 라미부딘 (Lamivudine) (3TC), 디다노신 (Didanosine) (ddI), 잘시타빈 (Zalcitabine) (ddC), 스타부딘 (Stavudine) (d4T), 테노포비르 (Tenofovir) (TDF), 아바카비르 (Abacavir) (ABC), 엠트리시타빈 (Emtricitabine) (FTC) 등일 수 있고, 또한 하나 이상의 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 예컨대 네비라핀 (Nevirapine) (NVP), 에파비렌즈 (Efavirenz) (EFV), 델라비르딘 (Delavirdine) (DLV), 에트라비린 (Etravirine) (ETR) 등일 수 있다. 상기 프로테아제 저해제는 사퀴나비르 (Saquinavir) (SQV-HGC), 인디나비르 (Indinavir) (IDV), 리토나비르 (Ritonavir) (RTV), 암프레나비르 (Amprenavir) (APV), 로피나비르 (Lopinavir) 및 리토나비르 (Ritonavir) (LPV/RTV), 넬피나비르 (Nelfinavir) (NFV), 포삼프레나비르 칼슘 (Fosamprenavir calcium) (FPV), 레야타즈 (Reyataz) (ATV), 프레지스타 (Prezista) 및 유사물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제일 수 있다. 상기 통합 저해제는 랄테그라비르 (Raltegravir), 돌루테그라비르 (Dolutegravir), 엘비테그라비 (Elvitegravi) 및 유사물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제일 수 있다. 상기 침입 저해제는 하나 이상의 마라비록, T-20, TAK-779, T2635, VIRIP (VIR-576), 시푸비르티드, 알부비르티드, 가용성 CD4 단백질 및 그의 유사체, 공동수용체 CCR5에 대한 항체 (예: PRO140), gp120/gp41에 대한 모노클로날 항체 (예: VRC01 및 10E8), 수용체 CD4에 대한 모노클로날 항체 (예: TNX-355) 및 유사물일 수 있다.
본 발명의 리포펩티드를 설계하는 전략은 하기와 같다: T-20 폴리펩티드의 8개의 아미노산 (WASLWNWF)의 C-말단 TRM 서열을 친유성 화합물, 예컨대 장쇄 지방산 (예: 팔미트산 또는 스테아르산), 콜레스테롤, 디히드로스핑고신 또는 비타민 E로 치환하여 T-20의 처음 28개의 아미노산, 즉 HIV-1 균주 HXB 2 유래의 gp41의 위치 127-154에서의 아미노산에 해당하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 리포펩티드를 생성하며; 또한, 이온쌍 형성에 기여하는 EE**KK 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드 서열의 비-NHR 결합 표면에서의 아미노산 (즉, b, c, 및 f, g 위치에서 해당하는 아미노산)을 돌연변이화하여 도입되고, HIV-2 및/또는 SIV의 해당하는 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드 서열의 NHR 결합 표면에서의 아미노산 (즉, a 및 d의 위치에서 해당하는 아미노산)을 돌연변이화하여 도입된다. 또한, 생성된 리포펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단 서열을 절단하여 (truncated) 28개 미만의 아미노산을 갖는, 즉 24 내지 27개의 아미노산을 함유하는 리포펩티드 세트를 생성하며, T-20의 위치 5 내지 25에서의 아미노산에 해당하는, 즉 HXB2 균주 유래의 gp41의 위치 131 내지 151에서의 아미노산에 해당하는 서열이 본 발명의 강력한 HIV 저해제의 핵심 서열 (즉, P5 서열)인 것으로 결정되었다. 본 특허의 폴리펩티드는 우수한 서열 구조적 특성을 가지며, C-말단에 연결된 친유성 화합물을 갖는 화학적 약제를 가지며, 표적 서열에 결합하는 능력이 현저하게 증진되었고, HIV (HIV-1 및/또는 HIV-2) 및/또는 SIV에 대한 매우 강력한 저해 활성을 가지며, HIV 외피 단백질 (Env)에 의해 매개되는 세포-세포 융합, 바이러스 진입 및 감염을 저해하는 매우 강력한 능력을 가졌다. 본 발명의 리포펩티드의 항-HIV 활성은 T-20의 항-HIV 활성보다 수 천배 또는 심지어 수 만배 만큼 더 높고, 또한 C34-Chol, LP-11, LP-19 및 유사물과 같은 보다 높은 활성을 갖는 항-HIV 리포펩티드의 활성보다 유의하게 더 높았다. 한편, 본 발명의 리포펩티드는 안정한 장기-작용 효과, 용이한 합성 및 저비용과 같은 많은 이점을 갖는다. 본 발명의 리포펩티드는 다양한 HIV-1 서브타입 (예컨대 A, B, C, A/E 및 B/C 서브타입), T-20 저항 균주, HIV-2 균주 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)에 대해 매우 강한 저해 활성을 갖는다.
도 1은 HIV 융합 단백질 gp41의 구조 및 기능 및 폴리펩티드-기반 막 융합 저해제를 나타낸다. 여기에서, FP는 gp41 융합 펩티드를 나타내고; NHR은 N-말단 반복 서열을 나타내며; CHR은 C-말단 반복 서열을 나타내고; TM은 막횡단 영역을 나타낸다. 화살표로 나타낸 위치는 "M-T 후크" 위치 또는 트립토판-풍부 모티프 (TRM) 위치이다. NHR 폴리펩티드의 N36 및 N39 서열은 gp41의 개략도 위에 있고, T-20 저항성 부위 및 소수성 포켓-형성 부위가 각각 표시되며, CHR의 서열 및 CHR 서열-기반 저해제의 서열은 gp41의 개략도 아래에 있고, 여기서 M-T 및 PBD 서열은 밑줄로 표시하고, TRM 서열은 이탤릭체로 표시하며, 본 발명의 폴리펩티드 서열의 돌연변이된 아미노산은 굵은 글씨체로 표시하였다. 본 도면에서 모든 폴리펩티드 또는 리포펩티드의 아미노산은 아미노-말단에서 아세틸화 변형 (Ac-) 및 카르복실-말단에서 아미드화 변형 (-NH2)을 갖는다.
도 2는 HIV 막 융합 저해제의 서열 구조 및 그의 항바이러스 활성을 나타낸다. 여기에서, T-20의 TRM 서열은 이탤릭체로 표시하고, M-T 후크 및 PBD 서열은 밑줄로 표시하였다. 폴리펩티드 링커 암 (arm)에서, AHX는 6-아미노카프로산을 나타내고, AEEA는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산을 의미하며, PEG4, PEG8 및 PEG12는 상이한 길이의 폴리에틸렌 글리콜을 나타내고, 상기 PEG4는 Fmoc-NH-PEG4-CH2CH2COOH이며, PEG 8은 Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH이고, PEG 12는 Fmoc-NH-PEG12-CH2CH2COOH이다. C16은 팔미트산을 나타내고, C18은 스테아르산을 나타내며, Chol은 콜레스테롤을 나타내고, DHS는 디히드로스핑고신을 나타내며, Toc는 비타민 E를 나타내고, C12는 도데카노산 (라우르산)을 나타내며, C8은 옥타노산 (카프릴산)을 나타낸다. NL4-3 슈도바이러스는 D36G를 갖는 gp41의 돌연변이체이다. 실험은 3회 반복되고, 평균 IC50 값이 산출되었다. 일부 강력한 리포펩티드는 굵은 글씨체로 표시하였다. "HXB2-세포 융합"은 HIV-1에 의해 매개된 세포 융합을 저해하는 실험 결과를 나타내고, "NL4-3의 진입"은 HIV-1 슈도바이러스에 의해 매개된 세포 진입을 저해하는 실험 결과를 나타내며, "JRCSF의 복제"는 HIV-1 복제를 저해하는 결과를 나타낸다.
도 3은 HIV-1 균주의 다양한 서브타입에 대한 HIV 막 융합 저해제의 저해 효과를 나타낸다. 실험은 3회 반복되고, 평균 IC50 값이 산출되었다.
도 4는 T-20 저항성 돌연변이체 균주, HIV-2 균주 및 SIV 균주에 대한 HIV 막 융합 저해제의 저해 효과를 나타낸다. T-20 저항성 돌연변이체 균주 및 SIV 균주는 슈도바이러스이고, HIV-2 균주는 감염성 ROD 균주이다. 실험은 3회 반복되고, 평균 IC50 값이 산출되었다.
도 5는 HIV 막 융합 저해제 주사 후에 마카크 (macaque) 혈청에서 항바이러스 활성을 나타낸다. 본 도면에서, M248, M249, M250, M252, M253 및 M254는 마카크 일련 번호이다. 도 5에서, A는 T-20 주사 후에 마카크 혈청에서 항바이러스 활성을 나타내고; B는 LP-19 주사 후에 마카크 혈청에서 항바이러스 활성을 나타내며; C는 LP-51 주사 후에 마카크 혈청에서 항바이러스 활성을 나타내고; D는 LP-52 주사 후에 마카크 혈청에서 항바이러스 활성을 나타내며; E는 LP-80 주사 후에 마카크 혈청에서 항바이러스 활성을 나타내고; F는 혈청에서 저해제의 항바이러스 활성의 비교 결과를 나타내었다.
도 6은 HIV 막 융합 저해제와 NHR 사이의 상호작용의 원편광 이색성 분석 (circular dichroism analysis) 결과를 나타낸다. 저해제의 서열 구조는 본 발명의 도 2에서의 구조와 동일하며, 본 발명의 강력한 리포펩티드는 굵은 글씨체로 표시하였다. 저해제 및 N39 폴리펩티드를 pH 7.2의 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 중에 용해시켜서 최종 농도 10 μM에 도달하였다.
도 7은 NHR과 T-20 또는 대표적인 리포펩티드 사이의 상호작용의 원편광 이색성 분석 결과를 나타낸다. 도 7에서, A는 CD 스캔 결과를 나타내고; B는 온도 스캔 결과를 나타낸다.
도 8은 T-20 및 대표적인 리포펩티드 자체의 2차 구조 분석 결과를 나타낸다. 도 8에서, A 및 B는 각각 10 μM의 저해제의 CD 스캔 및 온도 스캔 결과를 나타내고; C 및 D는 각각 20 μM의 저해제의 CD 스캔 및 온도 스캔 결과를 나타내며; E 및 F는 각각 40 μM의 저해제의 CD 스캔 및 온도 스캔 결과를 나타낸다.
도 9는 래트 (rats)에서 LP-80의 약동학적 분석 결과를 나타낸다. 도 9에서, A는 LP-80의 투여 후에 혈청 약물 농도의 검출 결과를 나타내고; B는 LP-80의 대사 키네틱 파라미터 (metabolic kinetic parameters)를 나타내며, 여기서 T1/2는 말단 반감기를 나타내고, Cmax는 피크 농도를 나타내며, Tmax는 피크 시간을 나타내고, AUC (0-216h)는 곡선 (0-216h) 아래 면적을 나타내며, Vz는 겉보기 분포 부피를 나타내고, CL은 청소율 (clearance)을 나타내며, MRT는 평균 체류 시간을 나타내고, Fabs는 절대 생체이용률이다.
도 10은 원숭이 감염 모델에서 LP-80의 치료적 효과를 나타낸다.
본 발명의 구현예는 실시예를 참고로 하기에서 상세히 기재될 것이며, 당업자라면 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 조건이 실시예에서 언급되지 않은 경우, 실시예는 기존의 조건 또는 제조자가 권장하는 조건으로 수행된다. 제조자가 언급되지 않은 본원에 사용된 시약 또는 기기는 상업적으로 이용가능한 기존의 제품이다. 하기 실시예에서 모든 폴리펩티드의 아미노산은 L-타입 아미노산이다.
실시예 1 리포펩티드의 제조
본 구현예에서 제공되는 리포펩티드의 구조식은 하기이다: Ac-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X21X17X18X19X20X26X27X28Z-NH2, 상기 X1-X28은 HIV-1 균주 HXB2 유래의 gp41 서열의 위치 127 내지 154의 아미노산에 해당하는 폴리펩티드 서열 (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK)을 나타내고, 상기 X1은 위치 127의 Y에 해당하며, X2는 위치 128의 T에 해당하고, X3은 위치 129의 S에 해당하며, ... X28은 위치 154의 K에 해당한다. 다수의 돌연변이화에 의해 수득된 신규한 서열은 강력한 저해제의 성분이었다. 대표적인 펩티드는 LP-50, LP-51, LP-52, LP-80, LP-83, LP-84, LP-85, LP-86 및 LP-87 등을 포함하였다. X1-X28의 정의는 화학식 I에서의 정의와 동일하며, Z는 친유성 화합물이고, Ac는 아세틸기이며, NH2는 아미노기이다.
본 실시예에서, 도 2에 도시된 바와 같은 리포펩티드 또는 폴리펩티드를 합성하였고, 각 리포펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노-말단은 아미노 말단 보호기로서 아세틸기에 의해 연결되고, 카르복실-말단은 카르복실 말단 보호기로서 아미노기에 의해 연결되었다.
상기에서, 폴리펩티드의 팔미트산에 의한 변형 (팔미트산-변형된 리포펩티드: LP-40, LP-41, LP-42, LP-43, LP-44, LP-45, LP-50, LP-51, LP-52, LP-53, LP-54, LP-55, LP-56, LP-57, LP-58, LP-59, LP-60, LP-61, LP-62, LP-63, LP-64, LP-65, LP-66, LP-67, LP-68, LP-69, LP-70, LP-71, LP-72, LP-73, LP-74, LP-75, LP-11, LP-19, C34-C16), 폴리펩티드의 스테아르산에 의한 변형 (스테아르산-변형된 리포펩티드: LP-80, LP-88, LP-89, LP-90, LP-91, LP-92), 폴리펩티드의 디히드로스핑고신에 의한 변형 (디히드로스핑고신-변형된 리포펩티드: LP-84, LP-87), 폴리펩티드의 비타민 E에 의한 변형 (비타민 E-변형된 리포펩티드: LP-85), 폴리펩티드의 도데카노산에 의한 변형 (도데카노산-변형된 리포펩티드: LP-81) 및 폴리펩티드의 옥타노산에 의한 변형 (옥타노산-변형된 리포펩티드: LP-82)은, 상기 폴리펩티드의 C-말단에서 리신 (Lys)의 곁사슬 아미노기와 그의 아미드화 반응에 의해 수행되었고, 배경 기술에 열거된 참조문헌 18 및 27을 참조한다. 이하에, LP-52 및 LP-80이 상기 리포펩티드의 합성을 예시하기 위한 예로서 채택되었다.
Rink 아미드 MBHA 수지, 다양한 Fmoc 아미노산, 팔미토일 클로리드, 스테아로일 클로리드, 비타민 E 숙시네이트, D-에리트로-디히드로스핑고신, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트, N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), 트리플루오로아세트산 (TFA), 에탄디티올 (EDT), 닌히드린 (ninhydrin), 헥사히드로피리딘 (PIPE), 페놀, N,N'-디메틸포름아미드 (DMF), 크로마토그래피로 순수한 (chromatographically pure) 아세토니트릴 등과 같은 사용된 화학 시약 모두는 주요 화학 시약 공급처로부터 구입하였고, 사용 전에 추가로 정제하지 않았다.
폴리펩티드의 합성: 수동 Fmoc 고체상 합성 방법을 사용하여 개시 물질로서 Rink 아미드 MBHA 수지 (치환 상수 0.34 mmol/g)로 C-말단에서 N-말단까지 합성을 수행하였다. 상기 Rink 수지 상에 Fmoc 보호기를 25% 헥사히드로피리딘/DMF (부피 비율)로 제거하고, 그 다음에 상기 수지를 2 당량의 Fmoc-Lys(Dde)-OH/HOBt/DIC로 그래프트하여 제1 아미노산 잔기를 C-말단에 도입하였다. 그 후에, N-말단 Fmoc 보호기를 다시 25% 헥사히드로피리딘/DMF (부피 비율)로 제거하여 N-말단에 아미노기를 유리시켰다. 다양한 아미노산 잔기가 상기 방식에 의해 순차적으로 연결되었다. 사용된 물질 및 그의 양은 하기와 같다: Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Leu-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Leu-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Asn (Trt)-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Gln(Trt)-OH (3eq), Fmoc-Gln(Trt)-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Ala-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Leu-OH (3eq), Fmoc-Leu-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3 eq), Fmoc-Glu (OtBu)-OH (3 eq), Fmoc-Ile-OH (3 eq), Fmoc-Lys(Boc)-OH (3eq), Fmoc-Gln(Trt)-OH (3eq), Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3eq), Fmoc-Trp(Boc)-OH (3eq). 마지막으로, N-말단을 아세틸화 (3 당량의 Ac2O, 6 당량의 디이소프로필에틸아민)에 의해 말단-캡화하여 주사슬 합성을 완료하였다. 각 단계의 반응 시간은 하기와 같다: 탈보호 8분, 2회; 통상의 아미노산의 그래프팅 60분.
상기 반응의 각 단계 후에, 상기 수지를 DMF로 6회 이상 세척할 필요가 있고, 상기 반응은 카이저 테스트 (Kaiser Test)에 의해 제어되었다. 아미노산의 축합 반응이 불완전하다면, 관심있는 원하는 펩티드 세그먼트가 수득될 때까지 축합 반응을 다시 한번 반복하였다.
폴리펩티드의 변형: 상기 수지를 2% 히드라진 히드레이트/DMF 용액 (부피 비율)으로 처리하여 C-말단 Lys의 곁사슬 Dde 보호기를 제거하고, 그 다음에 3 당량의 팔미토일 클로리드 또는 스테아로일 클로리드 및 6 당량의 디이소프로필 에틸아민과 혼합하여 C-말단 Lys의 곁사슬 아미노기와 아미드화 반응을 수행하고 (60분), 이에 의해 C-말단 Lys 잔기의 팔미토일화 변형 (LP-52) 또는 스테아로일 변형 (LP-80)을 달성하였다. 폴리펩티드의 디히드로스핑고신에 의한 변형 (LP-84, LP-87)은 Lys의 곁사슬 Dde 보호기를 제거한 후에 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트를 먼저 첨가하고, 그 다음에 디히드로스핑고신을 첨가하고, 상기 반응을 48시간 동안 수행하여 실시하였다. 폴리펩티드의 비타민 E에 의한 변형 (LP-85)은 Lys의 탈보호된 곁사슬 아미노기와 비타민 E 숙시네이트의 직접 아미드화에 의해 수행되었다.
곁사슬의 절단 및 탈보호: 리포펩티드의 합성을 완료한 후에, 상기 수지를 진공하에 건조시켰다. 절단 시약 (트리플루오로아세트산 : 1,2-에탄디티올 : 티오아니솔 : 페놀 : H2O: 트리이소프로필실란 = 68.5 : 10 : 10 : 5 : 3.5 : 1, v/v)을 상기 건조된 수지에 첨가하고, 30℃에서 3시간 동안 절단을 수행하고, 이에 의해 관심있는 폴리펩티드를 수지로부터 절단하고, 곁사슬 보호기를 제거하였다. 여과 작업을 수행하였다. 여과물을 다량의 차가운 무수 디에틸 에테르에 첨가하여 폴리펩티드를 침전시키고, 그 다음에 원심분리하고, 상기 폴리펩티드를 디에틸 에테르로 수회 세척하고, 건조하여 미정제의 리포펩티드 산물을 수득하였다.
리포펩티드의 정제 및 특성규명: 상기 미정제의 리포펩티드 산물의 정제를, 입자 크기 10 μm 및 공극 직경 100 옹스트롬 (Å)의 역상 C18 또는 C4 실리카겔 함유 100 × 250 mm 컬럼을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피에서 수행하였다. 크로마토그래피 작동 조건: 선형 구배 용출을 수행하고, 용출액은 이동상 A 및 이동상 B로 구성되고, 상기 이동상 A는 20 mM 암모늄 아세테이트 (pH 4.5) 및 5% 아세토니트릴 함유 수성 용액이며, 상기 이동상 B는 80% (부피 퍼센트 농도) 아세토니트릴의 수성 용액이고; 유속은 250 ml/분이며; 자외선 검출 파장은 220 nm이다. 용매를 동결-건조한 후에, 플러피 (fluffy) 상태의 폴리펩티드의 순수한 산물을 수득하고, 이의 화학 구조는 MALDI-TOF 질량 분광계로 특성규명하고, 이의 순도는 분석용 고성능 액체 크로마토그래피 (C18-10 × 250 mm, 유속: 1 ml/분)로 결정하였다. 결과는 합성된 리포펩티드가 95% 이상의 순도를 갖는 것을 보여주었다.
콜레스테롤-변형된 리포펩티드 (LP-83, LP-86, C34-Chol)를 합성하는 방법은 배경 기술에 열거된 참고문헌 18 및 참고문헌 20을 참조하여 수행하였다. 먼저, 콜레스테릴 브로모아세테이트를 문헌에 기재된 기술적 경로에 따라 합성하고, 그 다음에 폴리펩티드의 C-말단 시스테인 (Cys)의 곁사슬 티올기와 콜레스테릴 브로모아세테이트 사이에서 수행되는 매우 화학적으로 선택적인 티오에테르-형성 반응에 의해 폴리펩티드 사슬로 그래프트하고, 즉 미정제의 폴리펩티드 산물을 기존의 방식으로 합성한 후에, 이를 순수한 DMSO에 용해시키고, 소량의 트리플루오로아세트산 (TFA) 중에 용해된 1 당량의 콜레스테롤 브로모아세테이트를 상기에 첨가하고, 그 다음에 순수한 디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 첨가하여 pH를 알칼리성으로 조정하였다. 상기 반응을 RP-HPLC를 수행하고, 일반적으로 1시간 내에 완료하였다. 상기 리포펩티드는 상기에서와 같이 정제하고, 특성규명하고, 수득된 리포펩티드의 순도는 95% 이상이다.
실시예 2 강력한 HIV 막 융합 저해제의 동정
2.1 실험 물질 및 방법
도 2에서 각 리포펩티드 및 폴리펩티드를 시험 물질로 사용하고, 그의 항-바이러스 활성을 배경 기술에 열거된 참고문헌 18에 따라 세포 융합 저해 분석, 슈도바이러스 저해 분석 및 바이러스 복제 저해 분석에 의해 확인하였다. 특정 방법은 하기와 같다.
HIV-1 매개된 세포 융합 저해 분석: NIH (National Institutes of Health)의 AIDS Reagent Program이 이펙터 세포 (HL2/3 세포) 및 표적 세포 (TZM-b1 세포)를 제공하였다 (카탈로그 번호: 각각 1294 및 8129). 상기 세포 모두는 부착 세포이고, 암피실린/스트렙토마이신 이중 항생제 및 10% 우태아 혈청 (FBS) 함유 DMEM 세포 배양 배지에서 배양하였다. TZM-b1을 먼저 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고 (1×104 세포/웰), 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 상기 시험 물질을 DMEM 세포 배양 배지로 3배로 희석하고, HL2/3 이펙터 세포 (3×104 세포/웰)와 혼합하고, 그 다음에 TZM-b1 표적 세포에 첨가하고, 6시간 동안 더 배양하여 완전히 융합시켰다. 그 다음에 루시퍼라제의 활성 (상대 형광 유닛, RLU)을 Promega company의 설명서에 따라 루시퍼라제 리포터 유전자 키트를 사용하여 결정하였다. 각 농도의 각 시료의 저해율을 산출하고, 절반 유효 저해 농도 (IC50 값)는 GraphPad Prism 소프트웨어 2.01를 사용하여 산출하였다.
HIV-1 슈도바이러스-매개된 세포 진입 저해 분석: 하기 기본 단계를 포함한다: (1) HIV-1 슈도바이러스의 제조: HIV-1 균주 NL4-3의 외피 단백질 (Env) 발현 플라스미드 (즉, 배경 기술에 열거된 참고문헌 14의 표 2에서 HIV-1 균주 NL4-3의 D36G 돌연변이체의 외피 단백질 (ENV)을 코딩하는 유전자를 벡터 pcDNA3.1(-)로 삽입하여 수득되는 재조합 발현 플라스미드) 및 HIV-1 백본 플라스미드 pSG3Δenv (NIH (National Institutes of Health)의 AIDS Reagent Program에 의해 제공됨, 카탈로그 번호: 11051)로 293T 세포를 세포 형질감염 시약을 사용하여 공동-형질감염시키고, 37℃ 및 5% CO2의 세포 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 배지를 교환하고, 세포를 48시간 동안 더 인큐베이션하였다. 슈도바이러스 입자 함유 세포 배양 상등액을 피펫팅하고, 0.45 μm 필터로 여과하여 상등액을 수집하고, 그 다음에 20% 우태아 혈청 (FBS)을 상기에 첨가하고, 최종 용액을 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 사용 준비를 위해 -80℃로 저장하거나 또는 직접 바이러스 역가를 측정하였다. (2) HIV-1 슈도바이러스의 역가 측정: 상기 바이러스를 96-웰 플레이트에서 5배로 희석하고, 8개 구배를 갖는 4개의 복제 웰 (replicate wells)은 최종 부피를 100 마이크로리터로 설정하였다. TZM-bl 세포를 트립신화 (trypsinized)하고, 계수하고, 세포를 DMEM 완전 배지로 1 × 105 세포/ml로 희석하고; 웰 당 100 μl의 세포 희석물 (15 μg/ml DEAE-덱스트란 함유)을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음에 상기 96-웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로부터 꺼냈다. 상등액을 상기 웰로부터 버렸다. 각 웰에, 30 μl의 세포 용해물을 첨가하고, 10분 후에, 100 μl의 루시퍼라제 검출 시약을 첨가하였다. 각 웰로부터 100 μl의 액체를 피펫팅하고, 해당하는 96-웰 화이트 플레이트에 첨가하고, 발광 값은 마이크로플레이트 광도계 (microplate photometer)로 판독하였다. 바이러스 역가 (titer)는 Reed-Muench 방법에 의해 산출하였다. (3) 항바이러스 활성 분석: 시험 물질을 DMSO에 용해시키고, 세포 배양 용액으로 3배 희석하고, 96-웰 플레이트에 최종 부피 50 μL로 넣었다. 50 μl의 DMEM 배지를 시험 물질 대신에 사용하여 네가티브 대조군으로 하였다. 각 웰에, 농도 1Х105 세포/ml로 100 μl의 TZM-bl 표적 세포 용액 (15μg/ml DEAE-덱스트란 함유)을 첨가하고, 그 다음에 50 μl (웰 당 100 TCID50에 해당함)의 상기에서 수득된 HIV-1 슈도바이러스를 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후에, 각 웰의 상대 광 유닛 (relative light units: RLU)을 루시퍼라제 검출 시약 (Promega)을 사용하여 결정하였다. 저해율 (%) 및 IC50 값을 산출하였다.
HIV-1 복제 저해 분석: HIV-1 균주 JRCSF를 코딩하는 분자 클로닝 플라스미드 pYK-JRCSF는 NIH의 AIDS Reagent Program (카탈로그 번호: 2708)에 의해 제공되었다. 293T 세포를 pYK-JRCSF로 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시키고, 37℃ 및 5% CO2의 세포 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하고; 그 다음에 배지를 교체하고, 세포를 48시간 동안 더 인큐베이션하였다. JRCSF 바이러스 입자 함유 세포 배양 상등액을 온화하게 피펫팅하고, 0.45 μm 필터로 여과하여 상등액을 수집하고, 그 다음에 20% 우태아 혈청 (FBS)을 상기에 첨가하고, 최종 용액을 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 사용 준비를 위해 -80℃로 저장하거나 또는 직접 바이러스 역가 측정을 수행하였다. 바이러스 역가 측정은 상기 HIV-1 슈도바이러스의 역가 측정과 동일하게 수행하였다. 항바이러스 활성을 검출하기 위해, 시험 물질을 DMSO에 용해시키고, 세포 배양 용액으로 3배 희석하고, 96-웰 플레이트에 최종 부피 50 μL로 넣었다. 50 μL의 DMEM 배지를 시험 물질 대신에 사용하여 네가티브 대조군으로 하였다. 각 웰에, 100 μl의 TZM-bl 표적 세포 용액 (105 세포/ml을 가지며, 15 μg/ml DEAE-덱스트란을 함유함)을 첨가하고, 그 다음에 50 μl (웰 당 100 TCID50)의 상기에서 수득된 바이러스를 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후에, 각 웰의 상대 광 유닛 (RLU)을 루시퍼라제 검출 시약 (Promega)을 사용하여 결정하였다. 저해율 (%) 및 IC50 값을 산출하였다.
2.2 실험 결과 및 분석
2.2.1 T-20-기반 리포펩티드 (LP-40)는 강한 항바이러스 활성을 가짐.
강력한 HIV 막 융합 저해제를 스크리닝 및 동정하기 위해, 본 발명은 NHR 포켓-결합 도메인 (PBD)을 함유하지 않는 폴리펩티드 약물 T-20을 설계 주형 (design template)으로서 사용하는 신규한 방법을 개발하였다. HIV-1 매개된 세포 융합, 슈도바이러스 진입 및 바이러스 복제에 대한 저해제의 저해 활성을 3가지 항바이러스 분석법을 사용하여 평가하였다 (도 2). 먼저, T-20의 C-말단에서 8개의 아미노산을 직접 제거하여, TRM 모티프를 함유하지 않는 폴리펩티드 T20-TRM을 합성하고, 2000 nM 고농도에서 유의한 항바이러스 활성을 갖지 않는 것을 발견하였고, 이는 T-20의 기능에서 TRM의 역할이 중요하다는 것을 입증하였다. 또한, 리포펩티드 LP-40은 T-20의 TRM을 팔미트산 (C16)으로 대체하여 합성하였다. 놀랍게도 LP-40은 T-20과 비교하여 유의하게 향상된 항바이러스 활성을 가지며, HXB2-매개된 세포 융합, NL4-3 슈도바이러스 진입 및 JRCSF 복제에 대한 그의 저해 활성은 T-20의 저해 활성에 대해 각각 약 59배, 21배 및 18배인 것을 발견하였고, 이는 T-20의 TRM에 대한 친유성 화합물의 치환은 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 유의하게 향상시킬 수 있음을 입증하였고, 이는 HIV 막 융합 저해제를 설계하는 중요한 전략일 수 있다.
2.2.2 링커 암의 부가로 LP-40의 항바이러스 활성의 유의한 감소를 유도함.
본 발명자는 NHR 포켓을 표적으로 하는 짧은 펩티드 (HP23 또는 2P23)의 변형에 기반한 고활성인 항-HIV 리포펩티드 세트를 설계하고, 지질 화합물 C16, 콜레스테롤 및 디히드로스핑고신을 폴리펩티드의 C-말단에 직접 연결하여 상기 폴리펩티드의 항-HIV 활성의 유의한 감소를 유도하면서, 폴리펩티드 서열과 화합물 변형제 사이의 링커 암의 도입으로 상기 폴리펩티드 활성의 유의한 증가를 유도하고, 상기 항바이러스 활성은 링커 암의 길이가 증가하면 증가하는 것을 발견하였다 (배경 기술에 열거된 참고문헌 18 및 30 참조). LP-11 및 LP-19와 같은 최종적으로 설계된 고활성 리포펩티드는 보다 긴 PEG8 링커 암을 가졌고, 이는 링커 암의 부가로 리포펩티드가 입체 장애를 극복하도록 촉진하여 기능을 발휘할 수 있음을 시사한다. LP-40의 활성을 더 향상시키기 위해, LP-41, LP-42, LP-43, LP-44 및 LP-45의 5개의 리포펩티드를 설계 및 합성하고, 각각에 링커 암으로서 AHX, AEEA, PEG4, PEG8 및 PEG12를 부가하였다 (도 2). 놀랍게도, 링커 암의 부가로 리포펩티드의 활성이 유의하게 감소하고, 활성의 감소는 링커 암 길이의 증가로 보다 유의했고, 이는 HP23- 및 2P23-기반 리포펩티드에 대한 결과와는 정확하게 반대되었다. 이러한 결과는 HP23- 및 2P23-기반 리포펩티드가 T-20-기반 리포펩티드와 비교하여 상이한 작용 기전을 가지며, 이는 NHR에서 이의 상이한 결합 부위에 기인할 수 있음을 시사하였다.
2.2.3 이온쌍의 부가로 LP-40의 항바이러스 활성의 매우 유의한 증가를 유도함.
본 발명은 또한 이온쌍을 도입하여 LP-40의 항바이러스 활성 및 나선 구조를 촉진시키려고 시도하였다. 본 기술에서, "염 브릿지 구조 (salt bridge structure)"의 형성에 기여하는 EE**KK 아미노산 잔기는 폴리펩티드 서열의 비-NHR 결합 표면 (즉, b, c 및 f, g의 위치)에서 아미노산을 돌연변이화하여 도입되었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, LP-40 폴리펩티드 서열에서 11개의 아미노산을 E 또는 K로 치환하고, 이에 의해 EE**KK 모티프의 3개의 쌍을 i 및 i+4의 위치에 도입하고, 합성된 리포펩티드를 LP-50이라고 하였다. LP-50의 저해 활성은 3가지 항바이러스 분석법에 의해 결정되고, 결과는 놀라웠다. 도 2에 도시된 바와 같이, 세포 융합, 슈도바이러스 및 복제 바이러스를 저해하는 LP-50의 IC50 값은 각각 21 pM, 7pM 및 23pM이고, 이는 T-20과 비교하여 각각 1151배, 1345배 및 226배이며, LP-40과 비교하여 20배, 63배 및 12배이다. 그러므로, 이온쌍의 도입으로 "염 브릿지 구조"를 형성하여 리포펩티드의 나선 구조의 안정성을 증가시키고, 이에 의해 리포펩티드의 항바이러스 활성을 크게 증가시켰다. 이는 후속하는 원편광 이색성 분석법에 의해 확인되었다 (하기 실시예 7의 실험 결과를 참조한다).
2.2.4 HIV-2/SIV 아미노산 잔기의 부가로 LP-50의 활성을 더 향상시킴.
LP-50의 항바이러스 활성을 더 향상시키기 위해, 본 발명은 폴리펩티드의 NHR 결합 표면에서, 즉 a 및 d의 위치, 또는 인접한 위치에서 HIV-2 및/또는 SIV 유래의 해당하는 아미노산 잔기를 도입하여 리포펩티드 LP-51 및 LP-52를 합성하려고 추가적으로 시도하였다. 돌연변이된 아미노산은 도 1에 도시되어 있다. LP-51 및 LP-52의 폴리펩티드 서열은 gp41의 10개의 원래의 아미노산 잔기만을 보유하고, T-20의 서열과는 28% 미만으로 동일하였다. 항바이러스 분석법의 결과는 LP-51의 활성이 LP-50의 활성에 필적하고, HIV-1 균주 HBX2-매개된 세포 융합, NL4-3 슈도바이러스 및 복제 JRCSF 바이러스에 대한 LP-52의 저해 활성은 각각 약 2배, 2배 및 5배 만큼 더 향상된 것을 보여주었다. T-20과 비교하여, 3가지 분석 시스템에서 HIV 활성에 대한 LP-52의 저해 활성은 T-20의 저해 활성에 대해 각각 1859배, 2353배 및 1038배이다. 그러므로, LP-50, LP-51 및 LP-52는 매우 강력한 HIV 막 융합 저해제라는 결론을 내릴 수 있었다.
2.2.5 강력한 항-HIV 리포펩티드의 핵심 서열의 확인
상기 강력한 HIV 저해제의 폴리펩티드 서열은 28개의 아미노산 길이이다. 본 발명에서 더 짧은 서열 함유 리포펩티드를 설계할 가능성 및 주요 서열을 확인하기 위해서, LP-40에 기반한 C-말단 절단된 리포펩티드 LP-53을 먼저 합성하고, LP-50에 기반한 C-말단 절단된 리포펩티드 LP-54를 합성하며, 이는 그의 항바이러스 능력이 현저하게 감소된 것을 발견하였다 (도 2). 또한, LP-55 및 LP-56은 주형으로서 LP-52를 사용하여 합성하고, 상기 LP-56은 C-말단에서 3개의 아미노산 잔기 (LEK)를 치환하기 위해 링커 암으로서 AEEA를 함유하였다. 상기 항바이러스 분석법으로, HXB2-세포 융합에 대한 LP-55 및 LP-56의 저해 활성이 본질적으로 변화되지 않았음에도 불구하고, NL4-3 및 JRCSF 감염에 대한 그의 저해 활성이 감소 (약 2배 만큼)함을 나타내었다. 이들 실험 결과는 리포펩티드의 C-말단에서 3개의 아미노산 잔기 (LEK)가 항바이러스 활성에서 중요한 역할을 하는 것을 나타내었다.
N-말단 절단된 리포펩티드 세트 (LP-60 내지 LP-68)를 추가로 합성하였다. 항바이러스 분석법으로 LP-50에 기반한 2개의 절단된 리포펩티드, 즉 LP-60 및 LP-61의 활성이 또한 유의하게 감소되었지만; 놀랍게도, LP-52에 기반한 절단된 리포펩티드, 즉 LP-62, LP-63 및 LP-65의 활성은 크게 변화되지 않았고, 특히 24개의 아미노산 만을 갖는 LP-65의 활성은 LP-52의 활성과 동등하며, 25개의 아미노산을 함유하는 LP-64의 활성, 구체적으로 세포 융합에 대한 저해 활성이 유의하게 감소됨을 나타났다. 연구에서 추가의 N-말단 절단 (truncation)으로 리포펩티드 (LP-66, LP-67)의 활성이 유의하게 감소 또는 심지어 그의 항바이러스 능력의 손실 (LP-68)을 초래하는 것으로 밝혀졌다. LP-69는 LP-65에 기초하여 C-말단 LEK를 절단하여 합성되었다. LP-69의 항바이러스 활성이 유의하게 감소되었음에도 불구하고, 21개의 아미노산 만을 갖는 리포펩티드와 비교하여 바이러스에 대해 여전히 강력한 저해 활성을 가졌다. 상기 연구의 결과는 21개의 아미노산으로 구성된 서열 "IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKK"는 본 발명의 강력한 리포펩티드의 핵심 서열임을 보여주었고, 이는 T-20의 위치 5 내지 25의 아미노산 서열에 해당하며, 즉 HIV-1 균주 HXB2 유래의 gp41의 위치 131 내지 151의 아미노산 서열 (IHSLIEESQNQQEKNEQELLE)에 해당한다. 핵심 서열의 N-말단으로 WEQK (또는 LEAN 또는 YTSL)의 부가 또는 그의 C-말단으로 LEK의 부가로 항바이러스 활성을 효과적으로 증가시킬 수 있고; 상기 아미노산 모티프를 양쪽 말단에 보유하는 경우 (예: LP-52), 이러한 리포펩티드의 활성이 추가적으로 향상될 수 있다.
상기 결과는 또한 LP-57의 항바이러스 활성이 LP-55의 활성과 비교하여 약 15 내지 150배 만큼 감소되었음을 보여주었고, 이는 LP-55의 3개의 말단 아미노산 LKK가 중요하고, 적절하게 추가적으로 절단되지 않음을 나타내고; LP-66의 항바이러스 활성은 LP-65의 항바이러스 활성보다 약 54 내지 158배 더 낮고, 이는 LP-65의 처음 아미노산 (Ile)이 중요하고, 적절하게 추가적으로 절단되지 않음을 나타낸다. 동시에, 2개의 절단된 리포펩티드 LP-65와 LP-61 사이의 차이는 단 하나의 아미노산 (위치 8에서 각각 S 및 A)이지만, 그의 활성은 5 내지 9배 만큼 상이하고, 이는 S에 대한 A의 치환이 본 발명의 강력한 리포펩티드에 있어서 매우 중요하다는 것을 나타낸다.
한편, 본 발명에서 강력한 항바이러스 리포펩티드의 서열 구조와 기능 사이의 상관관계를 밝히기 위해서, N-말단 연장된 리포펩티드 세트 (도 2에서 LP-70 내지 LP-75)를 추가로 설계 및 합성하고, 여기서 LP-74는 포켓-결합 도메인 (PBD) 서열을 포함하고, LP-75는 PBD 서열 및 M-T 후크 형성 서열을 포함하였다. 놀랍게도, 상기 폴리펩티드 서열이 N-말단과 함께 연장되면, 리포펩티드의 항바이러스 활성은 증가되지 않고 감소되었으며, 구체적으로 LP-74 및 LP-75의 활성이 유의하게 감소되었다.
2.2.6 강력한 항-HIV 리포펩티드의 유도체 및 그의 항바이러스 활성
본 발명에서 강력한 항-HIV 리포펩티드의 서열 및 구조적 특이성을 밝히기 위해서, 다양한 사슬 길이의 지방산, 콜레스테롤, 디히드로스핑고신 및 비타민 E를 포함하는 상이한 친유성 화합물로 변형된 리포펩티드를 계속 설계 및 합성하였다. 항바이러스 분석법의 결과는 도 2에 도시하였다. NL4-3 진입 및 JRCSF 복제에 대한 스테아르산 (C18)-변형된 LP-80의 저해 활성은 C16-변형된 LP-52의 저해 활성보다 심지어 더 컸지만, 도데카노산 (C12)-변형된 LP-81 및 옥타노산 (C8)-변형된 LP-82의 저해 활성은 유의하게 감소되었다. 이들 4개의 리포펩티드는 동일한 폴리펩티드 서열을 가졌지만, 상기 리포펩티드의 저해 활성은 지방산 사슬의 길이로 결정되었다. 그러므로, 사슬 길이 C18 및 C16의 장쇄 지방산은 폴리펩티드 서열을 변형하는데 보다 적합했다. 항바이러스 분석법의 결과는 또한 콜레스테롤에 의해 변형된 리포펩티드 (LP-83 및 LP-86), 디히드로스핑고신에 의해 변형된 리포펩티드 (LP-84 및 LP-87) 및 비타민 E에 의해 변형된 리포펩티드 (LP-85)가 또한 강한 항바이러스 효과를 가짐을 나타내었다. 또한, C18-변형된 N-말단 절단된 리포펩티드 LP-88, LP-89 및 LP-90이 또한 강력한 항바이러스 활성을 가졌다. 흥미롭게도, 25개의 아미노산을 갖는 LP-89는 24개의 아미노산을 갖는 LP-90보다 활성이 더 낮았다. 이러한 현상은 C16-변형된 LP-64 및 LP-65와 유사하였다. 따라서, N-말단 리신 (K)은 핵심 서열에 기반한 강력한 짧은 리포펩티드에 필수적이지는 않았다. 21개의 아미노산의 핵심 서열에 대해, C16- 및 C18-변형된 리포펩티드 (LP-69 및 LP-92)의 활성은 실질적으로 동일하였다.
한편, 본 발명에서, LP-11, LP-19, C34-Chol 및 C34-C16을 포함하는 몇 개의 대조군 리포펩티드의 항바이러스 활성이 결정되었다 (도 2 참조). 대조군 리포펩티드는 HIV-1 매개된 세포 융합, 진입 및 복제를 효과적으로 저해할 수 있고, 그의 활성은 T-20의 활성보다 유의하게 더 높았지만, 그러나 C16-변형된 LP-52, LP-55 및 LP-65 및 C18-변형된 LP-80, LP-90 및 LP-91 및 유사물과 같은 본 발명의 일부 강력한 리포펩티드의 활성보다는 유의하게 더 낮은 것을 볼 수 있다.
실시예 3 HIV -1의 다양한 서브타입에 대한 강력한 HIV 막 융합 저해제의 저해 활성
AIDS는 주로 HIV-1에 의해 유발되고, 다수의 서브타입이 A-D, F-H, J 및 K 서브타입 및 유사물을 포함하는 바이러스 변이로 인해 생성되었다. 이들 중에, 상기 A, B 및 C 서브타입는 세계적으로 AIDS 전염병을 일으키는 주요 바이러스이고, B/C 및 A/E 재조합 바이러스는 중국에서의 주요 바이러스이다. 본 발명에서 강력한 HIV 막 융합 저해제의 활성을 추가적으로 평가하기 위해서, 국제적으로 대표적인 균주 및 중국에서 현재 만연하는 HIV-1 균주를 포함하는 35개의 HIV-1 슈도바이러스 그룹이 준비되었고, 상기 균주는 3개 서브타입의 A 균주, 8개 서브타입의 B 균주, 4개 서브타입의 B' 균주, 7개 서브타입의 C 균주, 1개 서브타입의 G 균주, 1개의 재조합 A/C 균주, 5개의 재조합 A/E 균주 및 6개의 재조합 B/C 균주를 포함하였다. 슈도바이러스 제조에 사용되는 Env 발현 플라스미드 중에, PVO, Du156 및 CAP 210.2.00.E8의 제조에 사용되는 Env 발현 플라스미드가 미국 NIH의 AIDS Reagent Program으로부터 입수된 것을 제외하고, 다른 플라스미드는 Chinese Academy of Medical Sciences, Institute of Pathogen Biology의 Prof. He Yuxian 연구실에 보존되었고, 배경기술에 열거된 참고문헌 13, 14 및 18 및 논문 Chong et al. (Chong H, Yao X, Zhang C, Cai L, Cui S, Wang Y, He Y. Biophysical property and broad anti-HIV activity of Albuvirtide, a 3-maleimimidoproprotionic acid-modified peptide fusion inhibitor. PLoS One, 2012; 7 (3): e 32599)를 참조한다. 슈도바이러스 제조 및 항바이러스 분석법은 실시예 2의 실시예 2.1 (HIV-1 슈도바이러스-매개된 세포 진입 저해 분석법)에서와 동일하였다. 본 실시예에서 비교 및 분석을 위해, 상기에 기재된 35개의 슈도바이러스에 대해 T-20, LP-40, LP-50, LP-51, LP-52, LP-55, LP-65, LP-80, LP-85, LP-90 및 대조군 리포펩티드 LP-19, C34-Chol을 포함하는 12개의 저해제의 저해 활성이 결정되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 다양한 타입의 HIV-1 슈도바이러스의 저해에 대한 T-20, LP-40, LP-50, LP-51, LP-52, LP-55, LP-65, LP-80, LP-85 및 LP-90의 평균 IC50 값은 각각 41410 pM, 6369 pM, 41 pM, 33 pM, 16 pM, 34 pM, 52 pM, 6 pM, 44 pM 및 14 pM이다. HIV-1의 다양한 서브타입에 대한 본 발명의 새롭게 합성된 리포펩티드의 저해 활성은 T-20의 저해 활성보다 유의하게 더 높았고, 이는 T-20의 저해 활성보다 7배, 1010배, 1255배, 2588배, 1218배, 796배, 6902배, 941배 및 2958배임을 볼 수 있다. 이들 중에, LP-80은 상기 바이러스에 대해 가장 강력한 저해 활성을 보였고, 35개의 슈도바이러스에 대한 평균 IC50 값은 6 pM이고, 다수의 균주에 대한 IC50 값은 심지어 1 pM 미만이다. 다양한 HIV-1 슈도바이러스를 저해하는 대조군 LP-19 및 C34-Chol의 평균 IC50 값은 각각 439 pM 및 66 pM이고, 그의 활성은 LP-50, LP-51, LP-55, LP-65 및 LP-85의 활성보다 더 낮았고, LP-52, LP-80 및 LP-90의 활성보다 유의하게 더 낮았다. LP-52와 LP-80, LP-65와 LP-90의 IC50 값을 비교함으로써, C18-변형된 리포펩티드의 항바이러스 활성이 C16-변형된 리포펩티드의 항바이러스 활성보다 우수하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 4 T -20-저항 균주에 대한 강력한 HIV 막 융합 저해제의 저해 활성
T-20은 현재 임상 사용이 승인된 유일한 HIV 막 융합 저해제이지만, 그의 활성은 새로운 세대의 폴리펩티드 활성보다 더 낮을 뿐만 아니라 약물-저항성 돌연변이를 쉽게 유발하여, 종종 임상적 치료 실패로 이어졌다. 본 발명의 강력한 리포펩티드의 항바이러스 광범위한 스펙트럼 및 이점을 충분히 반영하기 위해, NHR의 통상의 T-20 저항성 돌연변이 부위 보유 NL4-3 슈도바이러스를 본 실시예에서 준비하였다 (도 4에 도시된 바와 같이, 도 4에서 균주명은 배경기술에 열거된 참고문헌 14의 표 2에서의 균주명임). 플라스미드 및 슈도바이러스의 제조 방법 및 사용된 항바이러스 활성 분석은 본 발명자에 의해 공개된 문헌 (배경기술에 열거된 참고문헌 11, 12, 14 및 18 참조) 및 상기 실시예 2와 3에 기재되어 있다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. 대표적인 NL4-3D36G 돌연변이체와 비교하여, 야생형 NL4-3WT 자체는 T-20에 대한 저항성을 보였고, 그의 해당하는 IC50 값은 각각 13.65 nM 및 152.23 nM이다. 그러나, T-20에 대한 단일 또는 이중 돌연변이를 함유하는 균주의 약물 저항성은 수배만큼 유의하게 증가하였다. 상기 결과는 LP-40에 대한 이들 T-20 저항성 균주의 민감도가 향상되었음을 보여주었다. 실험 결과로부터, T-20 저항성 균주에 대한 염 브릿지 구조를 형성하기 위해 LP-40에 기반한 이온쌍을 도입하여 설계된 리포펩티드 LP-50의 저해 활성이 수백배 또는 심지어 수천배 만큼 더 향상되는 것을 발견하였다. 저항성 균주를 극복하기 위한 HIV-2/SIV 서열로 변형된 리포펩티드 LP-51, LP-52, LP-80 및 LP-85의 능력이 크게 향상되었고, 이는 LP-40의 능력보다 수천 내지 수만배 더 양호했다. LP-52, LP-55 및 LP-65, LP-80 및 LP-90을 비교하여, 이전의 항바이러스 활성 분석법에서 우수한 것으로 밝혀졌던 C-말단 절단된 리포펩티드 LP-55 및 N-말단 절단된 리포펩티드 LP-65 및 LP-90은 LP-52 및 LP-80의 저해 활성에도 필적하는 다수의 HIV-1 균주에 대한 저해 활성을 가졌지만, 이들은 T-20 저항성 돌연변이체 균주에 대한 활성이 LP-52 및 LP-80보다 훨씬 낮다는 것을 발견하였다. LP-50, LP-51, LP-52, LP-55, LP-65, LP-80, LP-85 및 LP-90을 포함하는 본 발명의 강력한 저해제로서의 대표적인 리포펩티드는 대부분의 T-20 저항성 균주에 대해 유의하게 감소된 저해 능력을 가졌지만, 이들은 여전히 강한 항바이러스 활성을 가졌고, 특히 LP-52 및 LP-80의 활성은 여전히 현장에서 드물다는 것이 특히 강조될 가치가 있다. 본 실시예는 또한 일 양상으로부터 gp41의 NHR 서열이 여전히 본 발명의 강력한 리포펩티드의 주요 표적이라는 것을 나타내었다.
실시예 5 HIV -2 및 SIV에 대한 강력한 HIV 막 융합 저해제의 저해 활성
본 발명의 강력한 리포펩티드의 항바이러스 이점을 추가적으로 반영하기 위해, HIV-2 및 SIV에 대한 이의 저해 활성이 본 실시예에서 결정되었다. 사용된 항바이러스 활성 분석법의 방법은 본 발명자에 의해 공개된 문헌 (배경기술에 열거된 참고문헌 13 및 30 참조)에 기재되어 있다. HIV-2 균주 ROD (HIV-2ROD)의 분자 클로닝 플라스미드 pROD는 포르투갈 University of Lisbon의 Nuno Taveira 교수가 친절하게 제공하였고, SIV 균주 SIVpbj (SIVPBJ) 및 SIV239 외피 단백질 발현 플라스미드 (각각 pSIVpbj-Env 및 pSIV239)는 Fudan University의 Xu Jianqing 교수가 친절하게 제공하였다. 감염성 ROD의 제조는 상기 섹션 2.1에서 감염성 JRCSF의 제조와 동일하고, 슈도바이러스 SIVpbj 및 SIV239는 상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 동일한 방법에 의해 준비되었다. 상기 결과는 도 4에 도시되어 있고, 이로부터 HIV-2 및 SIV 균주에 대한 T-20의 저해 활성은 매우 약했고, LP-40의 활성은 약간만 향상되었음을 볼 수 있었다. 그러나, LP-50, LP-51, LP-52, LP-65, LP-80, LP-85 및 LP-90을 포함하는 강력한 리포펩티드가 결정되고, HIV-2 및 SIV 모두에 대한 매우 강력한 저해 활성을 가졌다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 강력한 리포펩티드는 HIV-1의 다양한 서브타입에 대해 매우 효과적일 뿐만 아니라 T-20 저항성 균주, HIV-2 및 SIV 균주에 대해 매우 효과적이며, 매우 강력하고 광범위한 스펙트럼의 항바이러스 활성을 가졌다. LP-52, LP-55 및 LP-65를 비교하여, N-말단 아미노산 WEQK의 절단은 HIV-2 및 SIV에 대한 저해 활성에 거의 영향이 없었고, C-말단 아미노산 LEK의 절단은 활성에 유의하게 영향을 주는 것을 발견하였다.
실시예 6 강력한 HIV 막 융합 저해제의 인 비보 항바이러스 활성
최근의 연구에서 리포펩티드-기반 HIV 막 융합 저해제는 향상된 항바이러스 활성을 가질뿐만 아니라 인 비보에서 안정한 대사작용을 나타내므로, 이들은 보다 긴 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 강력한 리포펩티드의 적용 값 및 약물-형성 이점을 추가적으로 입증하기 위해, 리포펩티드 LP-51, LP-52 및 LP-80의 인 비보 항바이러스 활성을 본 실시예에서 주로 분석하였고, 상기 방법은 본 발명자에 의해 공개된 문헌에 기재되어 있고 (배경기술에 열거된 참고문헌 18 및 30을 참조함), 여기서 저해제를 원숭이에게 피하 경로로 주사하고, 상이한 시점에서 혈액 시료를 수집하고, 상기 저해제의 항바이러스 활성을 인 비트로에서 측정하고; 상기 방법에 의해, 저해제의 인 비보 활성이 학습될 수 있을 뿐만 아니라 그의 인 비보 안정성이 간접적으로 반영되었다. 상기에 기재된 3개의 강력한 리포펩티드 외에, 본 실시예는 비교 및 분석을 위해 2개의 대조군인, T-20 및 LP-19를 포함하였다. 특정 방법은 하기와 같다: 6마리의 실험 마카크 (rhesus monkeys)를 선택하고, 반은 수컷이고 반은 암컷이며, 연령은 3-4세이고, 체중은 3.4-4.7 kg이다. 상기 T-20, LP-19, LP-51, LP-52 또는 LP-80 (모두 멸균 증류수에 용해시킴)을 3 mg/kg 체중으로 피하로 주사하고, 0.4 ml의 정맥 혈액 시료를 주사 전 (0 hr) 및 주사 후 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 60 및 72시간에 각각 수집하였다. LP-80에 있어서, 전술한 혈액 수집 시점 외에, 주사 후에 96, 120, 144 및 168시간에서 4회의 혈액 수집 시점을 추가하였다. 혈청은 기존 방법에 따라 분리하였다. 각 저해제의 주사 간격은 이전 분석물의 잔류물이 없음을 보장하기 위해 2주 이상이다. HIV-1 균주 NL4-3 (NL4-3D36G)에 대한 혈청 활성은 상기 실시예에서 슈도바이러스-기반 분석의 실험 방법에 따라 측정되었다. 상기 혈청을 3배 희석하였다. 실험 결과는 도 5에 도시되어 있다. T-20의 피하 주사에 있어서, 저해 피크는 주사하고 2 및 4시간 후에 나타났고, 여기에서 NL4-3 감염성의 50%를 저해하는 최대 혈청 희석 배수는 각각 45배 및 46배이고 (도 5의 A); LP-19의 피하 주사에 있어서, 저해 피크는 주사하고 6 및 8시간 후에 나타났고, 여기에서 최대 혈청 희석 배수는 각각 5396배 및 4720배이다 (도 5의 B). 그러나, 놀랍게도: LP-51 또는 LP-52의 피하 주사에 있어서, 저해 피크는 주사하고 4 및 6시간 후에 나타났고, 최대 혈청 희석 배수는 LP-51에 대해 각각 700482배 및 584381배이고, 최대 혈청 희석 배수는 LP-52에 대해 700802배 및 669112배이고 (도 5의 C 및 D); LP-80의 피하 주사에 있어서, 저해 피크는 주사하고 6 및 8시간 후에 나타났고, 최대 혈청 희석 배수는 각각 491409배 및 537206배이다 (도 5의 E). 강력한 리포펩티드의 혈청 저해 피크는 T-20의 혈청 저해 피크에 대해 11678배 내지 15235배, 및 LP-19의 혈청 저해 피크에 대해 100배 내지 130배일 수 있음을 알 수 있다 (최대값에 따라 산출됨). 보다 흥미로운 결과는 3개의 리포펩티드인, LP-51, LP-52 및 LP-80의 인 비보 장기-작용 효과가 있고, 이들은 주사후 72시간 (3일)에서 보다 높은 혈청 저해 피크를 각각 가지며, 이의 최대 혈청 희석 배수는 각각 1122배, 182배 및 16157배이다. 구체적으로, LP-80의 혈청 저해 피크는 주사후 96시간 (4일)에 1980배, 주사후 120시간 (5일)에 211배, 주사후 144시간 (6일)에 유지되고, 그의 혈청 저해 피크는 4시간에 T-20의 혈청 저해 피크와 동일했다 (46배) (도 5의 F). 그러므로, 본 발명의 리포펩티드는 강력할 뿐만 아니라 장기-지속 효과가 있었다.
실시예 7 강력한 HIV 막 융합 저해제와 NHR 표적 서열의 상호작용
강력한 항-HIV 리포펩티드의 작용 기전을 조사하기 위해서, 형성된 복합체의 2차 구조 (α-나선) 및 나선 안정성 (Tm)을 포함하는, 원편광 이색성 (CD) 분석을 사용하여 저해제와 NHR 표적 서열 사이의 상호작용을 결정하였다. 원편광 이색성 분광광도계는 JASCO Inc.의 Jasco-815이고, 분석 방법은 본 발명자에 의해 공개된 논문이 언급되어 있다 (배경기술에 열거된 참고문헌 18 및 30을 참조한다). NHR 유래의 표적 서열 폴리펩티드는 N39이고 (도 1 참조), 그의 서열은 Ac-STMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL-NH2이고, 이는 T-20이 결합되는 NHR 상의 표적 부위에 해당한다. N39 및 저해제를 개별적으로 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에 용해시켜서 농도 20 μM의 PBS 용액 (pH 7.2)을 제조하였다. 상기 N39는 저해제와 부피 비율 1 : 1로 혼합하고 (최종 농도 각 10 μM), 혼합된 시료를 37℃에서 30분 동안 두어서 완전히 반응시키고, 그 다음에 결과의 복합체의 나선 함량 및 Tm 값은 원편광 이색성 분광광도계로 측정하였다. 상기 장치의 스캔 파장 범위는 195-260 nm로, 파장 간격은 1 nm이고, 3회 스캔하여 측정된 값들을 평균하였다. CD 신호에 기반하여, 폴리펩티드와 나선 함량 사이의 상호작용을 결정하였다. 그 다음에, CD 신호 측정을 위한 시료를 온도 스캔 시료 셀로 옮기고, CD 장치의 프로그램은 검출 파장 220 nm 및 스캔 범위 20-98 ℃로 온도 스캔을 설정하고, 프로그램 스캔을 수행하여, CD 신호 대 온도의 곡선을 수득하고, 이에 기반하여 Tm 값을 산출하였다. Tm 값에 기반하여, 저해제와 N39의 형성된 나선 구조의 안정성을 판단하였다.
CD 분석의 결과는 도 6에 도시되어 있다. 상기 T-20은 N39와 상호작용할 수 있고, 결과의 복합체는 나선 함량 48.6% 및 Tm 값 43.9℃를 갖는 것을 볼 수 있고; 그러나, T20-TRM과 N39 사이의 상호작용은 매우 약하고, 그러므로 Tm 값은 장치로 검출되지 않았고, 이는 T-20에서 TRM의 역할이 중요하다는 것을 추가적으로 입증하였다. 리포펩티드 LP-40과 N39 사이의 상호작용은 유의하게 증진되었고, 결과의 복합체는 나선 함량 57.7% 및 Tm 값 51.3℃를 갖는다. 링커 암의 부가로 나선 함량의 감소를 초래하였지만, 대부분의 링커 암은 Tm 값에 거의 영향을 주지 않았고, 가장 긴 링커 암 (PEG12)을 갖는 LP-45 만이 유의하게 감소된 Tm 값을 가졌다. 놀랍게도, EE**KK 이온쌍의 도입은 리포펩티드의 결합 안정성을 크게 향상시켰고, 이는 LP-50/N39 복합체의 Tm 값이 63.3℃로 증가되는 것에 의해 반영되고; HIV-2/SIV 아미노산의 부가는 리포펩티드의 결합 능력을 추가로 향상시킬 수 있고, LP-51/N39 및 LP-52/N39 복합체의 Tm 값은 각각 72℃ 및 79.1℃이고, 이는 도 7에 도시된 바와 같이 T-20 및 LP-40 복합체의 Tm 값과 비교하여 유의하게 증가하였다. 따라서, 3개의 강력한 항바이러스 리포펩티드는 표적 서열, 구체적으로 LP-52를 갖는 매우 안정한 나선 구조를 형성할 수 있다. 더욱이, 상기 LP-52/N39 복합체는 또한 최대 나선 함량 (63.8%)을 가졌다.
본 실시예에서, 리포펩티드의 C-말단 또는 N-말단 절단은 리포펩티드의 결합 능력에 다양한 정도로 영향을 줄 수 있다는 것이 밝혀졌고, 일부 리포펩티드는 Tm 값의 감소를 보였고, 일부는 나선 함량 및 Tm 값 모두에서의 감소를 나타내었다. C-말단 절단된 리포펩티드 (LP-53 내지 LP-59)의 Tm 값은 유의하게 감소하였고, 이는 리포펩티드의 NHR로의 결합에 있어서 C-말단에서 3개의 아미노산 (LEK)의 역할이 중요하다는 것을 나타낸다. 강력한 항바이러스 활성을 갖는 LP-55 및 LP-56의 Tm 값은 또한 현저하게 감소되었지만 (79.1℃에서 63.1℃), 상기 Tm 값은 LP-53, LP-54, LP-57, LP-58 및 LP-59의 값보다 훨씬 더 높았다. 구체적으로, LP-58 및 LP-59의 Tm 값은 나선 함량이 더 낮기 때문에 결정될 수 없었다. N-말단 절단된 리포펩티드 (LP-60 내지 LP-68)의 Tm 값은 또한 유의하게 감소되었다. LP-52에 기반한 N-말단 절단은 리포펩티드 (LP-62 내지 LP-65)의 결합 안정성에 영향을 주었지만, 해당하는 복합체의 Tm 값은 여전히 70℃보다 높았고, 이는 상기 리포펩티드가 여전히 강한 결합 능력을 갖는 것을 나타내며, 이들이 강한 항바이러스 능력을 보유하는 이유일 수 있다. 24개의 아미노산 서열을 갖는 리포펩티드 LP-65는 보다 높은 나선 함량 (63%) 및 Tm 값 (72.1℃)을 가지며, 추가적인 절단으로 LP-66, LP-67 및 LP-68과 같은 해당하는 리포펩티드의 결합 능력에 심각하게 영향을 줄 수 있으며, 이는 그의 항바이러스 활성과 일치하였다. 비교에서, 결합 안정성 (Tm 값)에 있어서 C-말단에서 3개의 아미노산 (LEK)의 제거 효과는 N-말단에서 1-4개의 아미노산 (WEQK)의 제거 효과보다 더 유의했고, 이는 상기 리포펩티드의 C-말단이 표적에의 결합에 있어서 보다 중요한 역할을 하는 것을 시사한다. 그러나, C-말단 및 N-말단 모두에서 아미노산이 제거된 핵심 서열 리포펩티드 LP-69는 유의하게 감소된 결합 안정성 및 Tm 값 51℃를 가졌고, 이는 LP-52보다 28.1℃ 만큼 더 낮았다.
또 다른 흥미로운 현상은 N-말단 연장된 리포펩티드가 LP-70 내지 LP-75의 성능과 같이 증가된 Tm 값을 가졌다는 것이고, 이는 그의 감소된 항바이러스 활성과 일치하지 않았다. LP-74 및 LP-75는 NHR 포켓-결합 도메인 (PBD) 및 M-T 후크 모티프를 함유하며, 이는 N39에 완벽하게 매치시키는 것은 불가능하다는 것을 주목해야 한다.
본 실시예의 결과는 또한 스테아르산 (C18)-변형된 리포펩티드 LP-80이 또한 N39에 대해 강한 결합 안정성을 갖는다는 것을 보여주었다 (Tm 값 = 79℃). 그러나, 짧은 사슬 길이의 지방산으로 변형된 리포펩티드, 예컨대 C12 지방산으로 변형된 LP-81 및 C8 지방산으로 변형된 LP-82는 유의하게 감소된 나선 함량 및 결합 능력을 가지며, 그의 Tm 값은 각각 74.1℃ 및 65.1℃이고, 그의 항바이러스 활성은 보다 유의하게 감소하였다 (도 2 참조). 콜레스테롤-변형된 리포펩티드 LP-83 및 LP-86, 비타민 E-변형된 리포펩티드 LP-85, 디히드로스핑고신-변형된 리포펩티드 LP-84 및 LP-87은 모두 강한 나선 결합 안정성을 가지며, 이는 그의 항바이러스 활성과 일치하였다. 유사하게, LP-80에 기반한 N-말단 절단된 리포펩티드 (LP-88, LP-89, LP-90)는 또한 강한 결합 능력을 가지며, Tm 값은 각각 76.5℃, 70℃ 및 71.1℃이다. 그러나, C-말단 LEK 제거된 리포펩티드 LP-91 및 양쪽 말단이 절단된 핵심 서열 리포펩티드 LP-92는 유의하게 감소된 나선 안정성을 가지며, Tm 값은 각각 61℃ 및 55.1℃이다.
본 실시예는 상기 저해제의 서열 구조, 결합 안정성 및 항바이러스 활성 사이의 상관관계를 다수의 실험 결과에 의해 나타내었고, 본 발명의 강력한 리포펩티드의 작용 기전을 이해하는데 중요한 정보를 제공하였다. 소정의 저해제의 결합 능력은 때때로 그의 항바이러스 활성과 불충분하게 일치함에도 불구하고, 일반적으로 본 발명의 강력한 리포펩티드는 매우 높은 Tm 값을 가졌다. 본 실시예는 또한 이러한 리포펩티드의 항바이러스 활성이 이의 폴리펩티드 서열 및 친유성 화합물의 특성에 의존하는 것을 입증하였다.
실시예 8 강력한 HIV 막 융합 저해제의 2차 구조 분석
강력한 항-HIV 리포펩티드의 작용 기전을 조사하기 위해서, 원편광 이색성 (CD) 분석을 사용하여 실시예 7에 기재된 것과 동일한 방식으로 용액 중 T-20 및 대표적인 리포펩티드의 2차 구조적 특성을 분석하였다. 용이한 분석을 위해서, 상기 저해제의 α-나선 함량 및 Tm 값을 농도 10 μM, 20 μM 및 40 μM (PBS 용액)에서 각각 측정하였다. 상기 결과는 도 8에 도시되어 있다. T-20은 3가지 농도에서 불규칙한 장애 구조를 나타내었고, LP-40은 20 μM 및 40 μM에서 소량의 나선 구조를 나타내었으며, 4개의 강력한 리포펩티드 (LP-50, LP-51, LP-52, LP-80)는 구별되는 나선 구조를 나타내었고, 이중 LP-80은 보다 높은 나선 함량 및 Tm 값을 가졌다. 그러므로, 본 발명의 강력한 리포펩티드 자체는 전형적인 나선 구조를 형성할 수 있고, 이는 T-20과는 상당히 상이했다.
실시예 9 래트에서 강력한 리포펩티드 LP-80의 약동학적 분석
상기 연구 결과로부터 LP-80은 보다 높은 인 비보 항바이러스 활성을 갖는 리포펩티드이고, 본 발명의 강력한 리포펩티드 중에 매우 안정하다는 것을 보여주었다. 본 실시예에서, SD 래트에서 그의 약동학적 특성을 분석하기 위한 대표예로서 LP-80을 사용하였다. 5-8주령, 체중 182-219 그람의 12마리의 SD 래트를 시험에서 사용하였고, 정맥내 그룹과 피하 주사 그룹으로 나누고, 각 그룹은 6마리이고, 반은 수컷이고 반은 암컷이다. LP-80의 용량은 6 mg/kg 체중 (mg/kg)이고, 상기 LP-80을 멸균 증류수에 용해시켰다. 각 그룹의 동물에 있어서, 혈청 시료를 투여 전 및 투여 후 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 168시간 및 216시간의 시점에서 수집하였다. 래트 혈청 중 LP-80의 농도는 액체 크로마토그래피-질량 분광계 (LC-MS/MS)로 정량적으로 결정되었고, 하한은 1 ng/ml (ng/ml)으로 정량화되었다. 상기 약동학적 파라미터는 비-구획 분석 모델 (non-compartmental analysis model: NCA)을 사용하여 산출되었다. 실험 결과는 도 9에 도시되어 있다. 정맥내 그룹 및 피하 주사 그룹에서 LP-80의 평균 말단 반감기 (T1/ 2)는 각각 6.04시간 및 6.28시간이다. 그러나, 정맥내 주사 및 피하 주사 후 3일 (72시간)에 혈청 중 LP-80의 농도는 각각 7.75 ng/ml 및 6.86 ng/ml, 즉 몰 농도 2021.12 pM 및 1789.02 pM이고, 상기 농도는 HIV-1 균주 NL4-3 및 JRCSF를 저해하는 LP-80의 IC50 값 (2 pM)의 각각 1010.56배 및 894.51배이었다. 이 결과는 약동학적 관점에서 마카크에서 상기 실시예 6에서 LP-80의 강력하고 장기-지속되는 항바이러스 능력을 추가로 확인하였다.
실시예 10 원숭이 AIDS 모델에서 강력한 리포펩티드 LP-80의 치료적 효과의 평가
본 실시예에서, 원숭이 HIV 감염 모델에 있어서 LP-80의 치료적 효과를 추가로 조사하고, 기술적 경로에 관해서는, LP-19를 평가하기 위해 본 발명자가 사용한 방법을 참조한다 (즉, 배경기술에 열거된 참고문헌 30). 6마리의 성체 붉은털 원숭이 (Chinese rhesus monkeys) (번호 A 내지 F, 반은 수컷, 반은 암컷)를 시험에서 사용하고, SIV, 헤르페스바이러스 B 및 시미안 T-림프친화 (lymphotropic) 바이러스에 대한 항체는 음성인 것으로 결정되었다. SHIV 균주 SF162P3은 미국 NIH의 AIDS Reagent Program이 제공하고, 원숭이의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)에서 증폭하고, TCID50이 결정되었다. 원숭이에게 1,000 TCID50의 SF162P3 바이러스를 정맥내로 접종하고, 상기 원숭이에서 혈장중 바이러스 로드 (plasma viral load) (RNA 카피수/ml)의 변화를 주기적으로 측정하였다. 원숭이를 SF162P3으로 감염시키고 197일 차에, LP-80 (멸균 증류수에 용해시킴)을 피하 경로를 통해 투여하고, LP-80은 체중 1 kg당 2 mg (2mg/kg)으로, 2주 동안 1일 1회, 그 다음에 4주 동안 4일 1회 투여하였다. 미리결정된 시점에서 수집된 원숭이 혈액으로부터 혈장 시료를 분리하고, 혈장중 바이러스 로드 (RNA 카피수/ml)를 정량적 실시간 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)으로 결정하였다. 혈장 RNA는 기존의 방법으로 추출하고, cDNA 시료는 역전사 반응에 의해 합성하였다. PCR 프라이머는 SIV의 gag477에 대한 것이다 (업스트림 프라이머는 GCAGAGGAGGAAATTACCCAGTAC이고, 다운스트림 프라이머는 CAATTTTACCCAGGCATTTAATGTT이며, 검출 프로브는 FAM-ACCTGCCATTAAGCCCGA-MGB이다). 사용된 PCR 장치는 PE ABI7500이다. 분석 민감도는 혈장 시료 밀리리터 당 100개의 RNA 카피이다.
상기 실험 결과는 도 10에 도시되어 있다. 치료 4일 차에 6마리의 원숭이 중 3마리의 바이러스 로드는 검출가능한 수준 이하로 감소되었고; 치료 8일 차에 5마리의 원숭이의 바이러스 로드가 검출되지 않았으며; 치료 14일 차에 6마리 원숭이 모두에서 바이러스 로드는 검출되지 않았다. 모든 원숭이에서 바이러스 로드는 4일에 한번 약물 투여에 의한 후속하는 치료 중에 검출가능한 수준 이하로 제어되었다. 상기 바이러스는 약물 투여가 중단되고 4일 후에 반등하지 않았고; 약물 투여가 중단되고 10일 후에 원숭이들 중 1마리의 원숭이 (원숭이 A)에서 바이러스의 반등이 있었고; 약물 투여가 중단되고 17일 후에 원숭이 C를 제외하고 다른 5마리의 원숭이에서 바이러스의 반등이 있었으며; 약물 투여가 중단되고 24일 후에 모든 원숭이에서 바이러스 로드의 반등이 있었다. 이러한 결과는 LP-80의 강력한 항바이러스 치료적 효과를 입증하였다
산업상 이용가능성
본 발명에 의해 제공되는 강력한 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물 또는 약학적 화합물은 HIV (HIV-1 및/또는 HIV-2) 및/또는 SIV 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 실제 적용 시에, 본 발명에 따른 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 다량체, 조성물 또는 약학적 화합물은 HIV 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 목적으로, 약물로서 환자에게 직접 투여될 수 있거나, 또는 적당한 담체 또는 부형제와 혼합하여 환자에게 투여될 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
<110> Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of Medical Sciences Shanxi Kangbao Biological Product Co., Ltd. <120> Lipopeptide for potently inhibiting HIV, derivative thereof, pharmaceutical composition thereof and use thereof <130> PM036760PCT <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Trp Glu Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Leu Glu Ala Asn Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Tyr Thr Ser Leu Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Glu Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln Lys 1 5 10 15 Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln Lys Lys 1 5 10 15 Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 Ser Leu Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys 1 5 10 15 Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 25 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys 20 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 Trp Glu Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 Trp Glu Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys Cys 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 Leu Glu Ala Asn Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Ala Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys Cys 20 25

Claims (15)

  1. 하기 a) 또는 b)인 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체:
    a) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성된 리포펩티드;
    b) 항바이러스 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결된 말단 보호기 및 친유성 화합물에 연결하여 형성된 리포펩티드, 상기 말단 보호기는 아미노 말단 보호기 및/또는 카르복실 말단 보호기이며;
    상기 a) 및 b)에서, 상기 폴리펩티드는 P1 내지 P5 중 어느 하나이고:
    상기 P1은 하기 화학식 I로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며,
    화학식 I
    X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28
    상기 화학식 I에서,
    X1 내지 X28은 각 아미노산 잔기이고, X1은 W, L 또는 Y이며, X2는 E 또는 T이고, X3은 Q, A 또는 S이며, X4는 K, N 또는 L이고, X5는 I 또는 L이며, X6은 E, D, K, R 또는 A이고, X7은 E, D, K, R 또는 A이며, X8은 L 또는 I이고, X9는 L 또는 I이며, X10은 K, R, E, D 또는 A이고, X11은 K, R, E, D 또는 A이며, X12는 A 또는 S이고, X13은 E, D, K, R 또는 A이며, X14는 E, D, K, R 또는 A이고, X15는 Q이며, X16은 Q이고, X17은 K, R, E, D 또는 A이며, X18은 K, R, E, D 또는 A이고, X19는 N이며, X20은 E 또는 D이고, 및 X21은 E, D, K, R 또는 A이며, X22는 E, D, K, R 또는 A이고, X23은 L 또는 I이며, X24는 K, R, E, D 또는 A이고, X25는 K, R, E, D 또는 A이며, X26은 L 또는 I이고, X27은 E 또는 D이며, X28은 K 또는 R이고;
    상기 P2는 상기 P1의 아미노-말단에서 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 결실시켜서 수득되는 폴리펩티드이며;
    상기 P3은 상기 P1의 카르복실-말단에서 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 결실시켜서 수득되는 폴리펩티드이고;
    상기 P4는 상기 P1의 카르복실-말단에 시스테인 잔기를 부가하여 수득되는 폴리펩티드이며;
    상기 P5는 하기 화학식 II로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며,
    화학식 II
    X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25,
    상기 화학식 II에서, X5 내지 X25의 정의는 상기 화학식 I에서의 정의와 동일하고;
    상기 폴리펩티드는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는다:
    v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
    v2: HIV-1 및 HIV-2;
    v3: HIV-1 및 SIV;
    v4: HIV-2 및 SIV;
    v5: HIV-1;
    v6: HIV-2; 및
    v7: SIV.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 리포펩티드는 항바이러스 활성이 LP-19 및/또는 T-20 및/또는 C34-Chol보다 더 높고;
    상기 리포펩티드의 유도체는, 상기 리포펩티드의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 하나 이상을 L-형 또는 D-형 아미노산, 인위적으로 변형된 아미노산 및/또는 자연계에 존재하는 희귀 아미노산으로 대체하여 수득되고, 생체이용률, 안정성 및/또는 항바이러스 활성이 상기 폴리펩티드보다 더 높은 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 P1은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
    상기 P2는 P2-1, P2-2, P2-3 또는 P2-4이고,
    상기 P2-1은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
    상기 P2-2는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
    상기 P2-3은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
    상기 P2-4는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEK;
    상기 P3은 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKK;
    상기 P4는 하기 서열로 나타낸 바와 같은 서열을 가지며:
    X1X2X3X4IEELX9KKX12EEQQKKNEEELKKLEKC;
    상기 P1, P2-1, P2-2, P2-3, P2-4, P3 및 P4에서, X1, X2, X3, X4, X9 및 X12의 정의는 상기 화학식 I에서의 정의와 동일한 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 P1은 P-80/84/85/52, P-87/51 또는 P50이고, 상기 P-80/84/85/52는 서열목록에서 서열번호: 1의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, P-87/51은 서열목록에서 서열번호: 2의 서열로 표시되는 폴리펩티드이고, P50은 서열목록에서 서열번호: 3의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 P2-1은 P-88/62이고, 상기 P-88/62는 서열목록에서 서열번호: 4의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 P2-2는 P63 또는 P60이고, 상기 P63은 서열목록에서 서열번호: 5의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, P60은 서열목록에서 서열번호: 6의 서열로 표시되는 폴리펩티드이고;
    상기 P2-3은 P-89/64이고, 상기 P-89/64는 서열목록에서 서열번호: 7의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 P2-4는 P-90/65 또는 P61이고, 상기 P-90/65는 서열목록에서 서열번호: 8의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며; P61은 서열목록에서 서열번호: 9의 서열로 표시되는 폴리펩티드이고;
    상기 P3은 P-91/55이고, 상기 P-91/55는 서열목록에서 서열번호: 10의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 P4는 P83 또는 P86이고, 상기 P83은 서열목록에서 서열번호: 11의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, P86은 서열목록에서 서열번호: 12의 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 친유성 화합물은 8 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 지방산, 콜레스테롤, 디히드로스핑고신 또는 비타민 E인 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 8 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 지방산은 스테아르산 또는 팔미트산인 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 리포펩티드는 LP-80/84/85/52, LP-90/65, LP-87/51, LP-88/62, LP-50, LP-83, LP-91/55, LP-86, LP-63, LP-89/64, LP-60 및 LP-61의 12개의 리포펩티드 중 어느 하나이고;
    상기 LP-80/84/85/52는 LP-80/84/85/52a 또는 LP-80/84/85/52b이고, 상기 LP-80/84/85/52a는 P-80/84/85/52로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-80/84/85/52의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-80/84/85/52b는 상기 LP-80/84/85/52a를 말단-보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-80/84/85/52a 및 LP-80/84/85/52b에서, 상기 P-80/84/85/52는 서열목록에서 서열번호: 1의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 스테아르산, 디히드로스핑고신, 또는 비타민 E이고;
    상기 LP-90/65는 LP-90/65a 또는 LP-90/65b이고, 상기 LP-90/65a는 P-90/65로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-90/65의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-90/65b는 상기 LP-90/65a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-90/65a 및 LP-90/65b에서, 상기 P-90/65는 서열목록에서 서열번호: 8의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이고;
    상기 LP-87/51은 LP-87/51a 또는 LP-87/51b이고, 상기 LP-87/51a는 P-87/51로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-87/51의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-87/51b는 상기 LP-87/51a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-87/51a 및 LP-87/51b에서, 상기 P-87/51은 서열목록에서 서열번호: 2의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 디히드로스핑고신 또는 팔미트산이고;
    상기 LP-88/62는 LP-88/62a 또는 LP-88/62b이고, 상기 LP-88/62a는 P-88/62로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-88/62의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-88/62b는 상기 LP-88/62a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-88/62a 및 LP-88/62b에서, 상기 P-88/62는 서열번호: 4의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이고;
    상기 LP-50은 LP-50a 또는 LP-50b이고, 상기 LP-50a은 P50으로 불리는 폴리펩티드를 상기 P50의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되며; LP-50b는 상기 LP-50a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-50a 및 LP-50b에서, 상기 P50은 서열목록에서 서열번호: 3의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 LP-83은 LP-83a 또는 LP-83b이고, 상기 LP-83a는 P83으로 불리는 폴리펩티드를 상기 P83의 카르복실-말단에 연결된 콜레스테롤에 연결하여 형성되며; LP-83b는 상기 LP-83a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-83a 및 LP-83b에서, 상기 P83은 서열목록에서 서열번호: 11의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 LP-91/55는 LP-91/55a 또는 LP-91/55b이고, 상기 LP-91/55a는 P-91/55로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-91/55의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-91/55b는 상기 LP-91/55a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-91/55a 및 LP-91/55b에서, 상기 P-91/55는 서열번호: 10의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이고;
    상기 LP-86은 LP-86a 또는 LP-86b이고, 상기 LP-86a는 P86으로 불리는 폴리펩티드를 상기 P86의 카르복실-말단에 연결된 콜레스테롤에 연결하여 형성되며; LP-86b는 상기 LP-86a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-86a 및 LP-86b에서, 상기 P86은 서열목록에서 서열번호: 12의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 LP-63은 LP-63a 또는 LP-63b이고, 상기 LP-63a는 P63으로 불리는 폴리펩티드를 상기 P63의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되며; LP-63b는 상기 LP-63a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-63a 및 LP-63b에서, 상기 P63은 서열목록에서 서열번호: 5의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 LP-89/64는 LP-89/64a 또는 LP-89/64b이고, 상기 LP-89/64a는 P-89/64로 불리는 폴리펩티드를 상기 P-89/64의 카르복실-말단에 연결된 친유성 화합물에 연결하여 형성되며; LP-89/64b는 상기 LP-89/64a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-89/64a 및 LP-89/64b에서, 상기 P-89/64는 서열목록에서 서열번호: 7의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며, 상기 친유성 화합물은 스테아르산 또는 팔미트산이고;
    상기 LP-60은 LP-60a 또는 LP-60b이고, 상기 LP-60a는 P60으로 불리는 폴리펩티드를 상기 P60의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되며; LP-60b는 상기 LP-60a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-60a 및 LP-60b에서, 상기 P60은 서열목록에서 서열번호: 6의 서열로 표시되는 폴리펩티드이며;
    상기 LP-61은 LP-61a 또는 LP-61b이고, 상기 LP-61a는 P61로 불리는 폴리펩티드를 상기 P61의 카르복실-말단에 연결된 팔미트산에 연결하여 형성되며; LP-61b는 상기 LP-61a를 말단 보호기에 연결하여 형성되고; 상기 LP-61a 및 LP-61b에서, 상기 P61은 서열목록에서 서열번호: 9의 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  8. 폴리펩티드가 청구항 1에 정의된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리펩티드의 유도체는 하기 1) 내지 5)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체:
    1) N-말단 보호기를 상기 폴리펩티드의 아미노-말단에 연결하고 및/또는 C-말단 보호기를 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
    2) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
    3) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 상기 폴리펩티드의 아미노-말단에 연결하여 수득되는 유도체;
    4) 올리고펩티드 또는 친유성 화합물을 상기 폴리펩티드의 카르복실-말단 및 아미노-말단 모두에 연결하여 수득되는 유도체; 및
    5) 상기 폴리펩티드를 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 또는 말레이미드로 변형시켜서 수득되는 유도체.
  10. PM1 또는 PM2의 다량체 (multimer)로서,
    상기 PM1은 청구항 1에 따른 리포펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에 의해 형성되는 다량체이고;
    상기 PM2는 청구항 8에 따른 폴리펩티드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체에 의해 형성되는 다량체인 것인 PM1 또는 PM2의 다량체.
  11. 하기 C1) 및 C2)를 포함하는 조성물로서,
    상기 C1)은 C11), C12) 또는/및 C13)이고, 상기 C11)은 청구항 1에 따른 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이며; C12)는 청구항 8에 따른 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이고; C13)은 청구항 10에 따른 다량체이며;
    상기 C2)는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트이고;
    상기 조성물은 하기의 기능 F1)-F5) 중 적어도 하나의 기능을 갖는 것인 조성물:
    F1) 바이러스에 대한 활성을 가짐;
    F2) 바이러스 감염에 의해 유발된 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적으로 치료함;
    F3) 바이러스와 세포의 융합을 저해;
    F4) 바이러스의 세포로의 진입을 저해; 및
    F5) 바이러스의 복제를 저해;
    상기 F1)-F5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 바이러스이다:
    v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
    v2: HIV-1 및 HIV-2;
    v3: HIV-1 및 SIV;
    v4: HIV-2 및 SIV;
    v5: HIV-1;
    v6: HIV-2; 및
    v7: SIV.
  12. 하기 E1)-E5)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 제품의 제조에 있어서 C11), C12), C13) 및/또는 C14)의 용도로서,
    상기 C11)은 청구항 1에 따른 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이고; 상기 C12)는 청구항 8에 따른 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이며; 상기 C13)은 청구항 10에 따른 다량체이고; 상기 C14)는 청구항 11에 따른 조성물이며:
    상기 E1)은 바이러스에 대한 제품이고;
    상기 E2)는 바이러스 감염에 의해 유발된 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적 치료용 제품이며;
    상기 E3)은 바이러스와 세포의 융합 저해용 제품이고;
    상기 E4)는 바이러스의 세포로의 진입 저해용 제품이며;
    상기 E5)는 바이러스 복제 저해용 제품이고;
    상기 E1)-E5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 바이러스인 것인 용도:
    v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
    v2: HIV-1 및 HIV-2;
    v3: HIV-1 및 SIV;
    v4: HIV-2 및 SIV;
    v5: HIV-1;
    v6: HIV-2; 및
    v7: SIV.
  13. 약학적 화합물로서, 상기 약학적 화합물은 C11), C12) 또는 C13)이고,
    상기 C11)은 청구항 1에 따른 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이며; 상기 C12)는 청구항 8에 따른 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이고; 상기 C13)은 청구항 10에 따른 다량체인 것을 특징으로 하는 약학적 화합물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 약학적 화합물은 하기 용도 U1)-U5) 중 적어도 하나를 가지며:
    U1) 바이러스에 대항하는 용도;
    U2) 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 보조적으로 치료하는 용도;
    U3) 바이러스와 세포의 융합을 저해하는 용도;
    U4) 바이러스의 세포로의 진입을 저해하는 용도; 및
    U5) 바이러스의 복제를 저해하는 용도;
    상기 U1)-U5)에서, 상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하는 약학적 화합물:
    v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
    v2: HIV-1 및 HIV-2;
    v3: HIV-1 및 SIV;
    v4: HIV-2 및 SIV;
    v5: HIV-1;
    v6: HIV-2; 및
    v7: SIV.
  15. 동물에서 바이러스에 의해 유발되는 감염을 치료 또는/및 예방하는 방법으로서, 대상 동물에게 C11), C12), C13) 또는/및 C14)를 투여하여 동물에서 바이러스 감염을 저해하는 단계를 포함하며,
    상기 C11)은 청구항 1에 따른 리포펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이고; 상기 C12)는 청구항 8에 따른 폴리펩티드, 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이며; 상기 C13)은 청구항 10에 따른 다량체이고; 상기 C14)는 청구항 11에 따른 조성물이며:
    상기 바이러스는 하기 v1-v7로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 하나의 바이러스인 것인 방법:
    v1: HIV-1, HIV-2 및 SIV;
    v2: HIV-1 및 HIV-2;
    v3: HIV-1 및 SIV;
    v4: HIV-2 및 SIV;
    v5: HIV-1;
    v6: HIV-2; 및
    v7: SIV.
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