CN102427829A - Hiv-1的脂肽抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括与疏水性部分偶合的短的分离的肽的亲脂性轭合物，该肽包括来源于HIV-1 gp41 N-末端七残基重复结构域的序列，所述肽在与疏水性部分轭合后具有高于轭合前的抗融合活性。该亲脂性轭合物适于治疗由人类和非人类逆转录病毒，尤其是HIV引起的感染。

Description

HIV-1的脂肽抑制剂
技术领域
本发明涉及亲脂性轭合物，该亲脂性轭合物包括与来源于HIV-1 gp41N-末端七残基重复结构域的肽偶合的疏水性部分，本发明涉及包括该亲脂性轭合物的药物组合物，及该药物组合物作为人类和非人类逆转录病毒尤其是HIV向未感染的细胞的传播的抑制剂的用途。
背景技术
HIV-1，如其它有包膜病毒一样，利用在其膜中嵌有的称作“包膜蛋白”的蛋白促进融合过程。包膜蛋白包括两种非共价连接的亚基：gp120和gp41，它们以三聚体构成。gp120负责宿主嗜性(Clapham，P.R.和McKnigh，A.2002，J.Gen.Virol.，83；1809-29)，而跨膜亚基gp41负责实际融合事件(Chan，D.C.和Kim，P.S.，1998，Cell，93；681-4)。gp41的胞外部分包括几个功能区，包括融合肽(FP)、N-末端七残基重复序列(NHR)和C-末端七残基重复序列(CHR)。病毒将其自身的膜与宿主细胞的膜融合的能力取决于三种已鉴定的包膜构象之间的转换：天然、亚稳定构象，前发夹构象(Pre-Hairpin conformation)，和折叠为发夹构象。gp120亚基与宿主受体和共受体的结合导致了驱动天然构象转换为前发夹构象的重要构象改变。在该构象中，gp41亚基伸展导致了FP区域插入到宿主细胞膜中。代表发夹的复合体被命名为“六螺旋束”(SHB)或“核心”结构，且其包括三个CHR区，该三个CHR区以反向平行的方式堆积(pack)到三聚内部NHR卷曲螺旋上产生的疏水沟中(Weissenhorn，W.等人.，1997，Nature，387；426-30)。在核心结构中，NHR三聚体的表面上的每个沟都具有称为“口袋”的深腔，该深腔与CHR区的三个保守疏水性残基相互作用。这些相互作用对于维持SHB的稳定性是重要的，表明该结构域是抗病毒化合物的有吸引力的靶标。
折叠为发夹构象被认为是融合反应的限速步骤，且其能够抑制融合进程。这通过体外测定和体内临床研究中，分别来源于HIV gp41的CHR区域或NHR区域的不同的C-肽(“C-肽”)或N-肽(“N-肽”)抑制HIV向宿主细胞传播的能力来证明。已显示这些肽结合其内源性负体(counterpart)从而阻止成为发夹构象的进程并抑制融合(Root M.J.等人.，2001，Science，291；884-8)。
例如，C-肽，如通过DP178(也称作T20，恩夫韦肽(enfuvirtide)和Fuzeon
Figure BDA0000108158430000021
)、T651和T649所示例的，分别以0.5ng/ml(EC50抗HIV-1LAI)、5ng/ml(IC50；HIV-1 IIIB)和2ng/ml(IC50；HIV-1 IIIB)的效力阻止了靶细胞的感染。目前证明DP178抑制融合所通过的主要途径之一是通过在细胞膜内与gp41一起装配，在中途抑制了融合进程(Kliger，Y.，等人.，2001，J.Biol.Chem.276：1391-1397)。其它大量出版物已公开了DP178、其片段、类似物和同系物具有抗逆转录病毒活性，所述出版物包括：美国专利第5,464,933号；第5,656,480号；第6,093,794号；第6,133,418号；第6,258,782号；第6,333,395号；第6,348568号；第6,479,055号；第6,750,008号；第7,122,190号、第7,273,614号和第7,456,251号。
与C-肽相比，N-肽表现出较低的抑制活性，这通常由于它们倾向于聚集所造成(Eckert，D.M.和Kim，P.S.，2001，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，98；11187-92)。然而深入研究的两种有效的N-肽抑制剂为N36(36个氨基酸)和DP107(37个氨基酸)。已通过两种主要的策略对提高这些N-肽的效力作出了尝试：(i)通过添加半胱氨酸残基来稳定特异的卷曲螺旋NHR，将该肽与已知的卷曲螺旋蛋白(与HIV无关的)融合并通过导入重复的NHR序列或(ii)导入NHR肽自身的突变(Bewley，C.A.等人.，2002，J.Biol.Chem.277，14238-45)。虽然这些尝试中的一些得到了改良的融合抑制剂(发现一些与恩夫韦肽一样有效)，但其制备需要复杂的操作。这些改良的N-肽中的大多数是长的，并倾向于聚集，并且较短和较简单的肽对于治疗目的而言仍被认为太长(＞30个氨基酸)。此外，这些N-肽包括N36肽的高度疏水的C-末端区段，主要因为其在融合过程“口袋”的形成中的已知作用。
已描述了改良HIV gp41来源的肽的效力的大量尝试：美国专利第7,090,851号涉及抗病毒肽-白蛋白轭合物，其中抗病毒肽来源于DP178和DP107，并还含有含马来酰亚胺的基团，通过该基团肽与白蛋白共价结合。
美国专利申请第2008/0199483号涉及选自DP178、DP107和其相关的肽和类似物，表现出经修饰以在体内提供更高的稳定性和提高的半衰期的抗病毒和抗融合活性。经修饰的肽具有诸如琥珀酰亚胺基或马来酰亚氨基的反应基，其能够与一种或多种血液成分，优选地与流动的血液成分形成共价键。
美国专利申请第2008/0096809号涉及来源于DP178肽和DP107肽的非对映体肽，其中非对映体肽中的至少两种氨基酸残基为D-异构体构型，经修饰的肽表现出增高的溶解性。
在提高HIV来源的C-肽的生物活性的另一个尝试中，本发明的发明人已发现脂肪酸可替代DP178的完整的C-末端区，已知该C-末端区在肽的活性中具有重要作用。抑制活性与脂肪酸的长度相关，并与脂肪酸连接的方向(N-末端或C-末端)相关(Wexler-Cohen Y.和Shai Y.，2007，FASEBJ.，21；3677-84)。并且发现脂肪酸提高了细胞膜上的肽的局部浓度，从而提高其抑制能力。
虽然现有技术的C-肽和N-肽已显示在抑制病毒向未感染的细胞传播中是有用的，但其每一个作为治疗物均具有显著缺点。生产肽的成本随其增加的长度呈指数提高。它们的潜在的免疫原性也随其长度而增加。与合成的肽有关的另一个缺点与在基于水的药学上可接受的载体中的溶解性和稳定性有关，诸如与生产HIV融合抑制剂肽的可注射溶液制剂的工艺有关。例如，获得浓度大于100mg/ml的含有具有DP178的氨基酸序列的合成肽的可注射水溶液而不遇到溶解性问题(其中剂型类似于凝胶，而不是溶液，或在预定时间段内肽从溶液中沉淀出来)和稳定性问题(在预定时间段内肽开始降解)是困难的。
因此，需要有效的逆转录病毒融合抑制肽，尤其是HIV融合抑制肽。
本发明满足了这些需要。
发明概述
本发明提供了逆转录病毒融合抑制剂肽和脂肽，当其以有效的量来添加时，可干扰HIV gp41介导的病毒融合过程，并且更优选地，干扰实现融合所需的gp41的构象改变，从而抑制HIV gp41与靶细胞膜的融合。本发明的肽和脂肽表现出有利的药理学性质，并且根据一些实施方案，将包括具有这些有利性质的可能的最短的肽。
本发明提供了有效作为人类和非人类逆转录病毒尤其是HIV细胞融合的抑制剂的来源于HIV gp41 N-末端七残基重复(NHR)结构域的短脂肽。本发明还首次公开了与N36肽和其变体轭合的疏水性部分，轭合物具有改良的细胞融合抑制活性。
本发明部分地基于如下发现：疏水性部分(例如，脂肪酸、甾醇、脂溶性维生素)与来源于HIV gp41 NHR分子的某一方面较弱活性或无活性的短肽的N-末端或C-末端的轭合能够出乎意料地赋予肽较高的细胞融合抑制活性。
由于HIV gp41 NHR来源的肽具有降低的活性和聚集倾向性而从未被看作是潜在的治疗剂。令人惊奇地是，当其与疏水性部分轭合后，它们的抑制活性提高了。
根据一方面，本发明提供了一种亲脂轭合物，其包括与疏水性部分偶合的分离的肽；该分离的肽包括式(I)的序列(SEQ ID NO：1)：
X1-X2-X3-X4-Ser-Gly-Ile-X5-Gln-X6-Gln-Asn-Asn-Leu-X7-Arg-X8-Ile-Glu-Ala-Gln-X9-His  (I)
其中：
X1选自由精氨酸和赖氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸氨基酸残基组成的组；
X3和X4各自独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸氨基酸残基组成的组；
X6选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸氨基酸残基组成的组；
X7选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述疏水性部分与所述分离的肽的N-末端或C-末端轭合，且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合。
根据一些目前优选的实施方案，疏水性部分与包括式I的序列的肽的N-末端轭合。
根据一些实施方案，疏水性部分可通过沿着肽链的任何其它游离官能团与肽偶合，例如，与赖氨酸的ε-氨基偶合。根据另外的实施方案，超过一个疏水性部分可通过N-末端、C-末端或通过沿着肽链的任何其它官能团与肽偶合。每一种可能性代表了本发明的一个独立的实施方案。
根据一些实施方案，肽包括式(I)的序列，其中X1是精氨酸，X2是谷氨酰胺、X3是亮氨酸且X4是亮氨酸。根据一些实施方案，X5是缬氨酸。根据其它的实施方案，X6是谷氨酰胺。根据另一些其它的实施方案，X7是亮氨酸。根据另一些其它的实施方案，X8是丙氨酸。根据一些实施方案，肽包括式(I)的序列，其中X5是缬氨酸、X6是谷氨酰胺、X7是亮氨酸且X8是丙氨酸。根据一些实施方案，肽包括式(I)的序列，其中X1是精氨酸、X2是谷氨酰胺、X3是亮氨酸、X4是亮氨酸、X5是缬氨酸、X6是谷氨酰胺、X7是亮氨酸且X8是丙氨酸。
根据本发明的某些实施方案，式(I)的分离的肽包括高达40个氨基酸残基。根据一些实施方案，肽包括高达36个氨基酸残基。根据一些实施方案，肽包括高达30个氨基酸残基。根据一些其它的实施方案，肽包括高达27个氨基酸残基。根据另一些其它的实施方案，肽包括高达25个氨基酸残基。根据另一些实施方案，肽包括23个氨基酸残基。
根据本发明的原理，分离的肽在与疏水性部分轭合之前是无活性的或弱活性的抗融合剂。与疏水性部分的轭合赋予肽抗融合活性，以致轭合后的活性显著高于轭合前。根据一些实施方案，疏水性部分与本发明的肽的轭合将抗融合活性增强了至少2倍。根据一些其它的实施方案，疏水性部分与本发明的肽的轭合将抗融合活性增强了至少10倍。根据一些其它的实施方案，疏水性部分与本发明的肽的轭合将抗融合活性增强了至少20倍。
根据一些实施方案，疏水性部分包括含至少6个碳原子的脂族基，和反应基，该脂族基通过该反应基可与肽连接。根据一些实施方案，疏水性部分包括含至少8个碳原子的脂族基。所述反应基的非限制性实例包括：羧基、羰基、胺基和硫醇基、马来酰亚胺、亚氨酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、卤代烷、和芳基叠氮化物。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。根据一些目前优选的实施方案，疏水性部分是脂肪酸。根据一些其它的实施方案，疏水性部分是甾醇。根据一些实施方案，疏水性部分是胆固醇。根据另一些其它的实施方案，疏水性部分是脂溶性维生素。根据另一些实施方案，脂溶性维生素是维生素E。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据某些示例性实施方案，分离的肽具有如下SEQ ID NO：2-9中任一个所列的氨基酸序列：
Figure BDA0000108158430000061
Figure BDA0000108158430000071
每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据另一方面，本发明提供了亲脂性轭合物，该亲脂性轭合物包括与疏水性部分偶合的分离的肽，该分离的肽包括式(II)的序列SEQ ID NO：10：Ser-Gly-Ile-X1-Gln-X2-Gln-Asn-Asn-Leu-X3-Asn-X4-Ile-Glu-Ala-Gln-X5-His-X6-Leu-Gln-Leu-Thr-X7-Trp-X8-Ile-Lys-Gln-Leu-X9-Ala-Arg-Ile-Leu  (II)
其中：
X1选自由天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺氨基酸残基组成的组；
X3选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X4选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
X6选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸组成的组；
X7选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由赖氨酸、精氨酸和甘氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述脂肪酸与所述分离的肽的N-末端或C-末端轭合，且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合。
根据一个实施方案，肽包括式(II)的序列，其中X1选自缬氨酸和天冬氨酸。根据另一个实施方案，X2选自谷氨酰胺和谷氨酸。根据另一个实施方案，X3选自亮氨酸和苏氨酸。根据又一个实施方案，X4选自丙氨酸和亮氨酸。根据另一个实施方案，X5选自谷氨酰胺和异亮氨酸。根据另一个实施方案，X6选自亮氨酸和谷氨酸。根据另一个实施方案，X7选自缬氨酸和谷氨酰胺。根据另一个实施方案，X8选自甘氨酸和赖氨酸。根据另一个实施方案，X9选自谷氨酰胺和亮氨酸。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据本发明的某些实施方案，式(II)的分离的肽包括高达40个氨基酸残基。根据一些实施方案，肽包括36个氨基酸残基。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据某些示例性的实施方案，根据式(II)的分离的肽具有如下SEQ IDNO：11-12中任一个所列的氨基酸序列：
SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO：11)
SGIDQEQNNLTRLIEAQIHELQLTQWKIKQLLARIL(SEQ ID NO：12)
每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据本发明的某些实施方案，分离的肽在肽序列的羧基末端、在肽序列的氨基末端或在两个末端还包括至少一个带正电荷的氨基酸残基。优选地，在肽序列的羧基末端添加至少一个带正电荷的氨基酸残基。根据本发明的一些实施方案，带正电荷的氨基酸是赖氨酸。根据某些示例性的实施方案，分离的肽具有如下SEQ ID NO：13-22中任一个所列的氨基酸序列：
Figure BDA0000108158430000081
Figure BDA0000108158430000091
每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
具有氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19的肽是新型的并是以此所要求保护的。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据本发明的一些实施方案，分离的肽选自所有的L-氨基酸肽和非对映体肽。根据一些实施方案，肽包括至少90％的L-氨基酸。根据另外的实施方案，肽包括至少95％的L-氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，疏水性部分是选自由饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成的组的脂肪酸。根据一些实施方案，脂肪酸由至少6个碳原子组成。根据一些实施方案，脂肪酸由至少8个碳原子组成。可与本发明的肽偶合的脂肪酸的实例包括，但不限于，己酸、庚酸、辛酸、癸酸(DA)、十一烷酸(UA)、十二烷酸(DDA；月桂酸)、肉豆蔻酸(MA)、棕榈酸(PA)、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸，反式十六烷酸、反油酸、乳杆酸、结核硬脂酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸和羟脑脂酸。根据一些实施方案，脂肪酸选自癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸和棕榈酸。
在与肽偶合的脂族基的长度和观察到的抗融合活性之间观察到相关。脂族基越长(C8＜C12＜C16)，脂肽的融合抑制活性越高。根据一些目前优选的实施方案，与肽轭合的疏水性部分包括含至少16个碳原子(C16)的脂族基。根据一些目前优选的实施方案，疏水性部分是十六烷酸。根据一些示例性的实施方案，与肽轭合的十六烷酸是棕榈酸。
根据本发明的一些实施方案，疏水性部分是脂溶性维生素。根据另一个实施方案，脂溶性维生素选自由维生素D、维生素E、维生素A和维生素K组成的组。根据一个示例性的实施方案，脂溶性维生素是维生素E。根据另一个示例性的实施方案，分离的肽在SEQ IS NO：19中列出且疏水性部分是维生素E。每个可能性代表本发明的一个独立的实施方案。
根据本发明的一些实施方案，疏水性部分是甾醇。根据一些实施方案，甾醇选自动物甾醇和植物甾醇。根据一个示例性的实施方案，甾醇是胆固醇。
根据一些其它的实施方案，疏水性部分可以是本领域中已知的任何其它疏水性部分。
应理解地是，与根据本发明的实施方案的疏水性部分轭合的肽衍生物、其类似物或盐类在本发明的范围内，其中当所述衍生物、其类似物或盐类与疏水性部分轭合时表现出抗融合活性。
根据另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的亲脂性轭合物，该亲脂性轭合物包括与疏水性部分偶合的分离的肽，该分离的肽包括式(I)的序列：
X1-X2-X3-X4-Ser-Gly-Ile-X5-Gln-X6-Gln-Asn-Asn-Leu-X7-Arg-X8-Ile-Glu-Ala-Gln-X9-His  (I)
其中：
X1选自由精氨酸和赖氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
X3和X4各自独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸氨基酸残基组成的组；
X6选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸氨基酸残基组成的组；
X7选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述疏水性部分与所述分离的肽的N-末端或C-末端轭合，且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合，和药学上可接受的载体或稀释剂。
根据一些目前优选的实施方案，疏水性部分与包括式I的序列的肽的N-末端轭合。
根据一些实施方案，疏水性部分可通过沿肽链的任何其它游离官能团与肽偶合，例如，与赖氨酸的ε-氨基偶合。根据另外的实施方案，超过一个疏水性部分可通过N-末端、C-末端或通过沿肽链的任何其它官能团与肽偶合。
根据另一方面，本发明提供了包括作为活性成分的亲脂性轭合物，该亲脂性轭合物包括与疏水性部分偶合的分离的肽，该肽包括式(II)的序列：
Ser-Gly-Ile-X1-Gln-X2-Gln-Asn-Asn-Leu-X3-Arg-X4-Ile-Glu-Ala-Gln-X5-His-X6-Leu-Gln-Leu-Thr-X7-Trp-X8-Ile-Lys-Gln-Leu-X9-Ala-Arg-Ile-Leu  (II)
其中：
X1选自由天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺氨基酸残基组成的组；
X3选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X4选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
X6选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸组成的组；
X7选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由赖氨酸、精氨酸和甘氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述疏水性部分与所述分离的肽的N-末端或C-末端轭合，且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合，和药学上可接受的载体或稀释剂。
根据另一方面，本发明提供了包括作为活性成分的根据本发明的实施方案的亲脂性轭合物的药物组合物用于抑制病毒对细胞的感染。根据一些实施方案，病毒选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒。
根据另一方面，本发明提供了包括作为活性成分的如SEQ ID NO：19中所列出的肽的药物组合物用于抑制病毒对细胞的感染。根据一些实施方案，病毒选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒。
可配制用于任何施用途径的药物组合物，所述途径包括但不限于，静脉内的、肌内的、腹膜内的、鼻的、损伤内的和局部的。
根据又一个方面，本发明提供了用于抑制蛋白诱导的膜融合的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本发明的亲脂性轭合物接触，从而抑制蛋白诱导的膜融合。根据一些实施方案，诱导膜融合的蛋白是包膜表面糖蛋白，其选自HIV的包膜表面糖蛋白和猿猴免疫缺陷病毒的包膜表面糖蛋白。根据一些实施方案，病毒是HIV。根据其它的实施方案，病毒是HIV-1且HIV的包膜表面糖蛋白是HIV-1 gp41。
根据另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中膜蛋白装配的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本发明的亲脂性轭合物接触，从而抑制膜蛋白装配。
根据另一方面，本发明提供了用于抑制病毒对细胞感染的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本发明的亲脂性轭合物相接触，从而抑制细胞的病毒感染。
根据另一方面，本发明提供了用于在受试者中抑制病毒复制或传播的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物，从而抑制病毒复制或传播。根据一个实施方案，受试者是人类受试者且病毒是HIV。根据另一个实施方案，受试者是动物受试者且病毒是猿猴免疫缺陷病毒。
本发明的药物组合物包括根据本发明的至少一种亲脂性轭合物，且本发明的方法包括根据本发明的至少一种亲脂性轭合物的施用。
本发明的这些和其它实施方案联合以下的附图、描述、实施例和权利要求，将更好地被理解。
附图说明
图1：gp41的发夹构象中的NHR区和CHR区之间形成的键的图示。N36、DP107、DP和DP178是本领域中已知的肽，N26是本发明的肽之一。
图2：N36肽和其脂肪酸轭合物的细胞-细胞融合抑制测定。融合抑制由肽诱导。呈现了不同的肽的50％融合抑制浓度(IC50)值。对于每个肽，进行了至少4个独立的实验，所述4个独立的实验包括在标准偏差的计算之中。
图3A-D：通过细胞-细胞融合测定所确定的肽的抑制能力。(A)每个N-末端轭合的肽的抑制能力的图示；(A)N36；(B)C8-N36；(C)C12-N36；和(D)C16-N36。肽浓度以对数标度来表示以强调观察到的现象。
图4：N36轭合的肽的抑制性低聚态。呈现了不同的肽的希尔系数(Hill’s coefficient)参数。对每个肽进行了至少4个独立的实验，所述4个独立的实验包括在标准偏差的计算之中。
图5：细胞上的肽的相对浓度；将NBD-标记的肽分配给细胞。NBDN36、C16-N36MNBD、和NBDN36M-C16分别由实心方形、实心三角和空心三角代表。非结合肽阴性对照，NBDGCN4，由空心圆表示，而强力结合肽阳性对照，C16-NBDGCN4，由实心圆表示。
图6：利用圆二色谱(CD spectroscopy)分析在溶液中和在膜模拟环境中肽的结构，以及其与C34形成核心结构的能力。在5mM Hepes或含1％LPC(膜模拟环境)的ddH2O中测量10μM的肽及其复合体。在左列图中，空心圆代表溶液中的肽信号，而实心圆代表LPC中的肽信号。在中列图中，空心三角代表将N-肽与C34组合(combine)的计算的非相互作用信号，而实心三角代表将两种肽一起孵育后获得的实际实验信号。在右列图中，在LPC中进行同样的实验，而所计算的非相互作用信号和实验信号分别由空心方形和实心方形所代表。
图7A-B：通过细胞-细胞融合测定所确定的N36突变体及其脂肪酸轭合物的细胞-细胞融合抑制测定。(A)由N36MUTe，g肽诱导的融合抑制。提供了不同的肽的IC50值。对每个肽进行了至少4个独立的实验，所述4个独立的实验包括在标准偏差的计算之中。(B)由计算的N36MUTe，g肽和其N和C末端轭合脂肪酸的希尔系数参数表示的肽的抑制性低聚态。对每个肽进行了至少4个独立的实验，所述4个独立的实验包括在标准偏差的计算之中。
图8A-D：特异细胞群上肽的相对浓度。在每个图中，Y轴代表靶细胞(具有受体)中标记的肽的百分比，而X轴代表效应器细胞(具有包膜糖蛋白)中标记的肽的百分比。(A)C16-N36；(B)N36-C16；(C)NBDGCN4用作非结合肽对照和(D)C16-NBDGCN4用作强力非特异结合肽对照。每个图中绘出的线强调了当不同的群体之间不存在偏好时所预期的表现。不同的数据点代表增高的肽浓度。
图9：通过细胞-细胞融合测定所确定的肽C8-N26M、C12-N26M、C16-N26M、C16-N25和C16-N23的融合抑制(由IC50值来代表)。
图10：通过细胞-细胞融合测定所确定的N26肽(圆形)、C12-N26肽(方形)和C16-N26肽(三角)的融合抑制曲线。抑制曲线拟合于抑制的竞争性模型；拟合曲线(fits)由连续线来代表。
发明详述
本发明提供了亲脂性轭合物或脂肽，所述亲脂性轭合物或脂肽包括与疏水性部分偶合的分离的肽，该肽对应于跨膜蛋白HIV-1 gp41 N-末端七残基重复序列(NHR)的片段。本发明的脂肽能够与跨膜蛋白结合，从而抑制所述跨膜蛋白的功能性装配。本发明的脂肽表现出抗融合活性和抗病毒活性，且因此用于抑制与膜蛋白装配有关的多种生物学事件，尤其是HIV向未感染的细胞的传播。
因为本发明的脂肽的提高的抑制活性和增高的稳定性，其在所有具有同样氨基酸序列的肽之中是十分有利的。这些特性赋予脂肽比包括同样氨基酸序列的那些肽更高的效力和更高的生物利用度。并且，本发明提供了包括短至23个氨基酸的肽序列的脂肽，其是有利的，这不仅因为它们的细胞融合抑制能力，还因为它们较低的生产成本。
如本文所用的术语“脂肽”和“亲脂性轭合物”指与疏水性部分共价偶合的肽。术语脂肽和亲脂性轭合物在说明书和权利要求书中可互换使用。
应理解，本发明的亲脂性轭合物或脂肽的肽不需要与天然存在的膜蛋白的氨基酸序列相同，只要其包括使其与膜蛋白结合并从而能够抑制膜蛋白装配所需的序列。
术语“膜结合”亲脂性轭合物指能够与膜脂相互作用或结合的肽。
本文中使用的术语跨膜蛋白的“膜蛋白装配”或“功能性装配”指跨膜蛋白之间的复合体形成或非共价相互作用，其导致膜融合事件和/或由膜蛋白复合体形成或膜蛋白相互作用起始的细胞内进程。本文所用的术语“膜蛋白”指人类或非人类细胞的细胞膜蛋白以及病毒包膜蛋白。应理解地是，蛋白的功能性装配包括均二聚作用和异源二聚作用(heterodimerization)，即，蛋白可与相同的蛋白相互作用或其可与不同的蛋白相互作用。因此，功能性装配包括，但不限于，相互邻接的两个蛋白之间的相互作用以在同一细胞膜内形成非共价复合体，和不同细胞中存在的不同膜蛋白之间的相互作用。术语“膜蛋白的功能性装配”和“膜蛋白装配”互换使用。术语“跨膜蛋白”指跨越膜的脂双层的膜蛋白。
本发明包含脂肽衍生物和具有氨基酸取代的类似物，和/或延伸物(extension)。
本文所用的术语“类似物”指根据本发明的实施方案的肽，其包括通过氨基酸取代或化学修饰改变的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。保守的氨基酸取代包括将本发明的所有L-氨基酸或非对映体肽中的一个或多个氨基酸用具有相似电荷、大小和/或疏水特性的氨基酸来替换。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可被具有相似极性的用作功能等价物的另一个氨基酸取代，导致沉默改变。序列中氨基酸的取代物可选自该氨基酸所属类型中的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这样的取代被称为保守取代。非保守取代包括将所有的L-氨基酸或非对映体肽中的一个或多个氨基酸用具有不相似的电荷、大小和/或疏水性特性的氨基酸来替换，例如，谷氨酸(E)对缬氨酸(V)的取代。氨基酸取代还可包括非天然氨基酸。
氨基酸延伸物可由单一的氨基酸残基或一段残基组成。延伸物可在根据式(I)和式(II)的本发明的肽的羧基末端或氨基末端产生。所述延伸物一般在2至17个氨基酸长度范围内。优选地，肽总共包括不超过40个氨基酸残基。可将一个或多个所述延伸物导入到肽中，只要所述延伸物产生的肽通过其自身或当与疏水性部分轭合时仍表现出抗融合活性。根据一些优选的实施方案，本发明的肽的延伸物在肽的氨基末端、羧基末端或两个末端包括至少一个带正电荷的氨基酸。可添加至本发明的肽的带正电荷的氨基酸包括，但不限于，赖氨酸、精氨酸、组氨酸或任何其它不带电的氨基酸衍生以产生的带正电荷的氨基酸。
通常，本发明包含脂肽的衍生物。术语“衍生物”包括肽的任何化学衍生物，其具有一个或多个通过侧链或官能团的反应而化学衍生的残基。这样衍生的分子包括，例如，其中游离氨基已被衍生形成胺盐酸盐、对-甲苯磺酰基基团、苄氧羰基基团、叔-丁氧羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的那些分子。游离的羰基基团可被衍生形成盐类、甲酯和乙酯或其它类型的酯或肼类。游离的羟基可被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-咪唑-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。含有20个标准氨基酸残基的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也作为化学衍生物包括在内。例如：5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；且鸟氨酸可取代赖氨酸。术语“衍生物”还可包括脂肪酸部分的化学衍生物。
本发明提供了包括肽的脂肽，所述肽包括对应于跨膜蛋白的片段的从约23个到40个氨基酸残基。根据一些实施方案，肽包括膜蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列。
根据本发明，脂肽表现出膜蛋白的功能性装配的抑制活性。膜蛋白的功能性装配的抑制活性包括，但不限于，抗融合活性和抗病毒活性。
本文所用的术语“抗融合”和“抗膜融合”和“细胞融合抑制剂”指试剂抑制或降低两个或多个部分之间的膜融合事件的水平(相对于本发明的脂肽不存在时发生在这些部分之间的膜融合的水平)的能力。该部分可以是，例如，细胞膜或病毒结构，诸如病毒包膜或纤毛(pilus)。如本文所用的，术语“抗病毒”指化合物抑制经由例如细胞-细胞融合或游离病毒感染的细胞的病毒感染的能力。当在包膜病毒的情况下发生时，所述感染可包括膜融合，或涉及病毒结构和细胞结构的一些其他的融合事件(例如，诸如在细菌接合过程中病毒纤毛和细菌膜的融合)。如果存在脂肽时膜融合事件的水平低于不存在脂肽时膜融合事件的水平，则本发明的脂肽表现出抗融合活性和/或抗病毒活性。
细胞融合事件的测定是本领域中技术人员所熟知的。细胞融合测定一般在体外进行。所述测定包括培养细胞，所述细胞在不存在任何处理的情况下将经历可观察到的水平的合胞体形成。例如，可在诱导细胞融合的病毒长期感染的细胞存在下孵育未感染的细胞。诱导细胞融合的病毒包括，但不限于，HIV、SIV或呼吸道合胞体病毒。
对于细胞融合测定，在待测定的脂肽的存在下孵育细胞。对每个脂肽可检验一定范围内的脂肽浓度。该范围应该包括其中没有添加脂肽的对照培养物。
使用了本领域中一般技术人员熟知的用于培养细胞的标准条件。在孵育了适当时间后，用显微镜检查培养物中的多核巨细胞的存在，多核巨细胞指示细胞融合和合胞体形成。熟知的染色剂，比如结晶紫染色剂，可用来促进合胞体形成的显示。可选地或另外地，细胞融合可通过被标记的供体细胞和受体细胞之间荧光染料转移来检测，所述供体细胞诸如，例如，表达HIV-1 gp120-41的细胞，所述受体细胞诸如，例如，用不同荧光染料标记的小鼠成纤维细胞。本发明的脂肽的添加抑制了染料转移，这指示抑制细胞融合。另一个实例包括人类T-细胞的细胞系，比如Jurkat E6-1细胞和Jurkat HXBc2细胞。Jurkat HXBc2细胞表达HIV-1 HXBc2 Rev和ENV蛋白，而Jurkat E6-1是正常T-细胞。每个细胞类型分别用DiI或DiD亲脂性荧光探针来标记。在不同浓度的抑制性脂肽存在下共孵育两个细胞群体。在肽存在或不存在时融合细胞的百分比利用流式细胞仪采集，并用FAC SCalibur细胞分析仪优化(upgrade)。
评估脂肽在膜蛋白装配中的抑制活性的其它测定可使用ToxR系统，其为用于体内检测跨膜结构域的均二聚作用的强力方法。
检验脂肽的抗病毒活性的测定可基于测量作为病毒感染的函数的病毒的酶活性。以HIV为例，可利用逆转录酶(RT)测定来检验脂肽抑制无细胞HIV对CD-4+细胞的感染的能力。所述测定可包括在待检验的脂肽存在下培养适当浓度(即，TCID50)的病毒和CD-4+细胞。使用本领域技术人员熟知的培养条件。除其中未添加脂肽的对照之外，可使用一定范围的脂肽浓度。在培养孵育适当时间后，利用标准程序制备无细胞上清液，并检验作为成功感染的量度的RT活性的存在。RT活性可利用标准技术来检验(参见Goff，S.等人.，1981，J.Virol.38：239-248；Willey，R.等人.，1988，J.Virol.62：139-147)。检验脂肽的抗病毒活性的另一个测定可基于在脂肽存在下测量病毒感染的细胞中的萤光素酶活性。这些测定一般包括CD4+和共受体表达细胞，比如TZM-b1 Hela细胞。此外，这些细胞含有萤光素酶报道基因，其在感染的细胞中经病毒蛋白诱导后表达。当将抑制性脂肽与病毒-细胞混合物一起孵育时，细胞中的发光信号降低。
可利用本领域中技术人员熟知的标准方法测定非逆转录病毒活性。参见，例如，Pringle等人.(Pringle，C.R.等人.，1985，J.Medical Virology17：377-386)对呼吸合胞体病毒和副流感病毒活性测定技术的讨论。
还可利用体内测定来检验，例如，本发明的脂肽的抗病毒活性。例如，为检验抗HIV活性，可使用Barnett等人描述的体内模型(Barnett，S.W.等人.，1994，Science 266：642-646，其内容在此通过引用并入，视作在本文中完整列出)。
另外可利用本发明的脂肽的抗融合能力来抑制或治疗/改善由涉及膜融合事件的过程导致的症状。所述事件可包括，例如，通过细胞-细胞融合和精卵融合的病毒传播。并且，本发明的脂肽可用来抑制未感染的细胞的游离病毒感染或传播，其中所述病毒感染涉及细胞-细胞融合事件或涉及病毒结构与宿主细胞膜的融合。
其传播可通过本发明的脂肽来抑制的逆转录病毒包括，例如，人类逆转录病毒，尤其是HIV-1和HIV-2。
本发明的脂肽的抗病毒活性可显示显著的类型和亚型特异性，即，特异性脂肽可仅有效地抑制特异性病毒的活性。本发明的特征提供了许多优点。例如，一个这样的优点属于诊断领域，其中技术人员可利用本发明的脂肽的抗病毒特异性来查明病毒分离物的身份。
本发明的肽可利用本领域中熟知的方法来合成，所述方法包括化学合成和重组DNA技术。合成可通过由Merrifield所描述的固相肽合成法来进行(参见J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1964)。可选地，本发明的肽可利用标准溶液方法来合成(参见，例如，Bodanszky，M.，Principles of PeptideSynthesis(肽合成的原理)，Springer-Verlag，1984)。优选地，本发明的肽通过如本文以下所示出的(实施例1)固相肽合成法来合成。
本发明还涵盖了包括主要由所有的L-氨基酸或非对映体肽组成的肽的亲脂性轭合物。本文所用的术语“非对映体肽”指包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基的肽。在整个说明书和权利要求书中，氨基酸残基由IUPAC规定的三字母代码来代表。当没有指出时，氨基酸残基以L异构体构型存在。D异构体构型中存在的氨基酸残基由在残基缩写前的“D”来表示。
本文所用的带正电荷的氨基酸选自本领域中已知的带正电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸的实例是赖氨酸、精氨酸和组氨酸。本文所用的疏水性氨基酸选自本领域中已知的疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例是亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸。带负电荷的氨基酸选自本领域中已知的带负电荷的氨基酸，包括但不限于，谷氨酸和天冬氨酸。
疏水性部分
术语“疏水的”指具有非极性原子的化学部分彼此相互作用而非与水或其它极性原子相互作用的倾向。通常，“疏水的”材料在水中是不溶的。具有疏水性的天然产物的非限制性的实例包括脂质类、脂肪酸类、磷脂类、鞘脂类、酰基甘油类、蜡类、甾醇类、类固醇类、萜烯类、前列腺素类、血栓素类、白三烯类、类异戊二烯类、类视黄醇类、生物素和疏水性氨基酸，诸如色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。如果化学部分的物理性质通过非极性原子的存在来决定，则该化学部分也是疏水的或具有疏水性。该术语包括亲脂性基团。
在与肽连接的情况下，术语“亲脂性基团”指具有高烃含量从而赋予该基团对于脂质相高度亲合力的基团。亲脂性基团可以是，例如，具有约6至30个碳的相对长链的烷基或环烷基(优选地正烷基)基团。烷基可以羟基、伯胺或任何其它反应基封端。为进一步说明，亲脂性分子包括天然存在的和合成的芳族部分和非芳族部分，比如脂肪酸、酯类和醇类，其它的脂质分子，笼形结构，诸如金刚烷和芳香烃，所述芳香烃诸如苯、二萘嵌苯、菲、蒽、萘、芘、屈(chrysene)和并四苯。
根据本发明的一些实施方案，疏水性部分可与N-末端、C-末端或沿肽链的任何其它游离官能团偶合，例如，与赖氨酸的ε-氨基偶合。应理解地是疏水性部分与肽共价偶合。术语“偶合”和“轭合”在本文可互换使用，并指导致疏水性部分与肽共价连接以产生亲脂性轭合物的化学反应。肽合成过程中进行的疏水性部分与肽的偶合与氨基酸与肽的偶合相似。可选地，疏水性部分与肽的偶合可通过本领域中已知的任何偶合方法来进行。
根据一些实施方案，疏水性部分包括脂族基和反应基，通过该反应基可将脂族基与肽连接。这种反应基的非限制性实例包括：羧基、羰基、胺基、硫醇基、羟基、马来酰亚胺、亚氨酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、卤代烷和芳基叠氮化物。
如本文所用的，术语“脂族的”、“脂族基”或“脂族链”意为完全饱和的或含有一个或多个不饱和键的直链的(即，无支链的)或支链的、取代的或未被取代的烃链。除非另外指明，脂族基含有至少脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基含有6和30个之间的脂族碳原子。在其它的实施方案中，脂族基含有至少8个脂族碳原子。在其它的实施方案中，脂族基含有至少10个脂族碳原子。在另一些其它的实施方案中，脂族基含有至少12个脂族碳原子，且在又一些其它的实施方案中，脂族基含有至少16个脂族碳原子。适宜的脂族基包括，但不限于，直链的或支链的、取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基和杂烷基。
化学定义：
术语“烷基”指饱和的、直链的或支链的烃基部分，诸如-CH3-(CH2)4-CH2；-CH2-(CH2)5-CH2、CH3-(CH2)6-CH2、CH3-(CH2)7-CH2、CH3-(CH2)8-CH2、CH3-(CH2)9-CH2、CH3-(CH2)10-CH2、CH3-(CH2)11-CH2、CH3-(CH2)12-CH2；CH3-(CH2)13-CH2、CH3-(CH2)14-CH2。
如本文所用的“烯基”表示含有至少6个碳原子、具有至少一个碳-碳双键的从直链或支链的烃基部分衍生的二价基团。
术语“杂烷基”指具有至少一个杂原子(例如，N、O或S)的烷基或烯基部分。优选地是具有至少一个O的杂亚烷基。
本文所用的术语“不饱和的”意为具有一个或多个不饱和单元的部分。
根据一些目前优选的实施方案，疏水性部分是脂肪酸。
脂肪酸：可与本发明的肽偶合的脂肪酸选自饱和的、不饱和的、单不饱和的和多不饱和的脂肪酸。通常，脂肪酸由至少6个碳原子组成，优选地，由至少8个碳原子组成。根据一些实施方案，脂肪酸是必需脂肪酸。“必需脂肪酸”可指某些脂肪酸，尤其是不能从头合成特定的必需脂肪酸的生物体必须摄入以存活的多不饱和脂肪酸。实例包括必需脂肪酸C9，C12-亚油酸和其结构变体。必需脂肪酸可以是在自然界中发现的或合成产生的。根据本发明的一些实施方案的脂肪酸的非限制性实例包括：癸酸(DA)、十一烷酸(UA)、十二烷酸(月桂酸)、肉豆蔻酸(MA)、棕榈酸(PA)、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，反式十六烷酸、反油酸、乳杆酸、结核硬脂酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸和羟脑脂酸、轭合的亚麻酸、ω-3脂肪酸(例如：二十二碳六烯酸(DHA)、十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十二碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸和它们的甘油酯衍生物)、ω-6脂肪酸(例如：亚油酸、γ-亚麻酸、二十二碳二烯酸、二均-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸和十八碳三烯酸)、ω-9脂肪酸(例如：油酸、二十碳烯酸、蜂蜜酸、芥酸和神经酸)、多不饱和脂肪酸、长链多不饱和脂肪酸、花生四烯酸、单不饱和脂肪酸、脂肪酸的前体和脂肪酸的衍生物。
应强调地是，具有至少6个碳原子的任何脂肪酸可与本发明的肽偶合，只要增强了轭合物的抗融合活性。
维生素：在某些实施方案中，本发明涉及选自由维生素A、维生素D、维生素E和维生素K组成的组的维生素。根据其他的实施方案，本发明涉及本领域中已知的任何其它的维生素、其盐类和衍生物。根据其它的实施方案，维生素可来自本领域中已知的任何来源。根据某些实施方案，维生素D选自由维生素D2(麦角钙化醇)、维生素D3(胆钙化醇)和本领域中已知的任何其它维生素D或其衍生物组成的组。根据其它的实施方案，本发明涉及维生素D盐类和其衍生物。根据其它的实施方案，维生素E选自由α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ或δ-生育三烯酚和本领域中已知的任何其它维生素E组成的组。根据其它的实施方案，本发明涉及维生素E盐类(例如，磷酸维生素E)和衍生物(例如，山梨酸生育酚、醋酸生育酚、琥珀酸生育酚，和其它生育酚酯类)。根据另外的实施方案，维生素A选自由视黄醇、视黄醛、视黄酸和本领域中已知的任何其它维生素A组成的组。根据其它的实施方案，本发明涉及维生素A盐类和其衍生物。根据其他的实施方案，维生素K选自由维生素K1(植物甲萘醌)、维生素K2(甲基萘醌)、维生素K3(甲萘醌)、维生素K4、维生素K5、维生素K6、维生素K7和其盐类和衍生物组成的组。
甾醇类：根据一个实施方案，涉及在A-环的3位具有羟基的类固醇。根据另一个实施方案，术语指具有以下结构的类固醇：
Figure BDA0000108158430000231
在另一个实施方案中，甾醇是动物甾醇。在又一个实施方案中，甾醇是植物甾醇。根据一个实施方案，动物甾醇是胆固醇或其衍生物。植物甾醇的非限制性实例包括豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇(前维生素D2)、菜子甾醇、Δ-7-豆甾醇和Δ-7-燕麦甾醇。
不期望受任何作用机制束缚地，应理解地是，疏水性部分与肽偶合的目的在于提高肽的疏水性，任选地提高其在溶液中的低聚化，且因此赋予其抗融合活性。
药物组合物
本发明提供了包括本发明的亲脂性轭合物和化妆品上和/或药学上可接受的载体的药物组合物。术语“药学上可接受的载体”指向预期靶标递送活性成分的运载体，且其对人类或其它受体生物体不造成伤害。应理解本文所用的“药物”包含人类和动物药物。有用的载体包括，例如，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1，3-二醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或矿物油。用于配制药物组合物的方法和组分是熟知的，且可参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第十八版，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Co.Easton Pa.，1990。药物组合物可配制成任何适于施用模式的形式，例如，溶液、胶态分散体、乳液(水包油或油包水)、悬浮液、乳膏、洗剂、凝胶、泡沫、喷雾、气溶胶、软膏、片剂、栓剂和类似形式。
药物组合物还可包括其它任选的材料，所述材料可根据载体和/或组合物的使用目的来选择。另外的组分包括，但不限于，抗氧化剂、螯合剂、乳化稳定剂(例如，卡波姆)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯)、芳香剂、湿润剂(例如，甘油)、防水剂(如，PVP/二十碳烯共聚物(EicoseneCopolymer))、水溶性成膜剂(例如，羟丙基甲基纤维素)、油溶性成膜剂、阳离子聚合物或阴离子聚合物和类似剂。
本发明的实践中有用的药物组合物包括本发明的脂肽，其任选地以药学上可接受的盐形式被配制成药物组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，其是由无机酸或有机酸形成，所述无机酸诸如例如，盐酸或磷酸，有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸和类似酸。能够与本发明的脂肽形成盐的适宜的碱包括，但不限于，无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和类似无机碱；和有机碱，诸如单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺和芳胺(例如，三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺和类似胺)和任选地取代的乙醇胺类(例如，乙醇胺、二乙醇胺和类似乙醇胺)。
本发明的短脂肽的抗融合能力还可用来抑制或治疗/改善由涉及膜融合事件的过程引起的症状。所述事件可包括，例如，经细胞-细胞融合和精-卵融合的病毒传播。并且，本发明的短脂肽可用来抑制未感染的细胞的游离病毒感染和传播，其中所述病毒感染涉及细胞-细胞融合事件或涉及病毒结构与宿主细胞膜的融合。
其传播可被本发明的短脂肽抑制的逆转录病毒包括，例如，人类逆转录病毒，特别是HIV，更特别是HIV-1。
例如，一个所述优点在于诊断领域，其中可利用本发明的脂肽的抗融合特异性来查明病毒分离物的身份。
根据另一方面，本发明提供了药物组合物，其包括治疗有效量的根据本发明的原理的亲脂性轭合物和药学上可接受的载体、能够抑制跨膜蛋白的融合的亲脂性轭合物，不期望受理论或作用机制束缚地，本发明的脂肽的抗融合活性源于其干扰病毒跨膜蛋白的功能性装配的能力。
本发明的实践中有用的药物组合物通常含有以药学上可接受的盐形式被配制成药物组合物的本发明的脂肽。药学上可接受的盐可从药学上可接受的无毒性酸来制备，所述无毒性酸包括无机酸和有机酸。这样的酸包括醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和类似酸。
药学上可接受的盐可从药学上可接受的无毒性碱来制备，所述无毒性碱包括无机碱和有机碱。来源于无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐、锌盐和类似盐。来源于药学上可接受的有机无毒性碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺类包括天然存在的取代的胺类、环状胺类和碱性离子交换树脂，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇和类似胺类。
本发明的亲脂性轭合物的治疗有效量是当向患者施用时能够发挥对膜蛋白的功能性装配的抑制活性并进而抑制诸如病毒感染、细菌感染的膜融合事件和涉及蛋白质膜装配的细胞内过程的量。根据一些实施方案，本发明的药物组合物有用于在如本文进一步所描述的患者中抑制病毒疾病。根据这样的实施方案，治疗有效量是当向患者施用时足以抑制病毒疾病、优选地为根除病毒疾病的量。
本发明的药物组合物包括根据本发明的至少一个亲脂性轭合物，且本发明的方法包括根据本发明的至少一个亲脂性轭合物的施用。
应进一步理解地是，本发明的亲脂性轭合物可与靶向沿跨膜蛋白的不同序列的另外的肽和脂肽治疗性联合使用。例如，来源于HIV-1 gp41 NHR的N-末端的本发明的短脂肽可与来源于靶向口袋区的HIV-1 gp41 CHR序列的肽联合起作用。包括不能相互结合的序列的肽和脂肽可能被组合。这样的序列将不会抵消相互的作用而是使其增强。
因为迄今为止大多数研究已集中于靶向肽以干扰已知口袋区的形成(例如，DP178、DP107和甚至N36)，具有靶向沿HIV-1 gp41的不同的序列的短脂肽将是有利的。
含有作为活性成分的肽的药物组合物的制备是本领域中熟知的。通常，将所述组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液。然而，也可制备成可在注射之前悬浮或溶解的固体形式。还可将该制品乳化。将活性治疗成分与药学上可接受的且与活性成分相容的无机载体和/或有机载体混合。载体是药学上可接受的赋形剂(运载体)，其或多或少包括惰性物质，所述惰性物质被添加到药物组合物中以赋予组合物适宜的稠度或形式。适宜的载体是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇或类似载体及其组合。此外，如果需要的话，组合物可含有少量的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂和抗氧化剂，其增强了活性成分的效力。
药物组合物可通过多种方式来递送，包括静脉内、肌内、输注、鼻内、腹膜内、皮下、直肠、局部或施用到其它区域中，诸如施用到滑膜液中。然而，还涵盖了透皮递送组合物，诸如通过透皮贴剂来扩散。
根据另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中膜蛋白装配的方法，所述方法包括使细胞与有效量的根据本发明的原理的膜结合亲脂性轭合物接触，从而抑制膜蛋白装配。
根据另一方面，本发明提供了用于抑制病毒对细胞的感染的方法，所述方法包括使细胞与有效量的根据本发明的原理的膜结合亲脂性轭合物接触，从而抑制细胞的感染。
根据又一个方面，本发明提供了用于在受试者中抑制病毒复制和传播的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括分散于药学上可接受的载体或稀释剂的根据本发明的原理的亲脂性轭合物。
其中对病毒复制的抑制可能在临床上有用的患者包括，患有由多种病毒传播的疾病的患者，所述病毒包括，例如，人类逆转录病毒、尤其是HIV-1和HIV-2。
药物组合物以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量来施用。待施用的量取决于待治疗的受试者，和受试者的血液止血系统利用活性成分的能力。施用所需的活性成分的精确的量取决于医生的判断且对于每个个体是特有的。
根据本发明的治疗疾病的方法可包括将本发明的药物组合物作为单一活性剂来施用，或与另外的治疗方法组合施用。本发明的治疗方法可与另外的治疗方法平行进行、在另外的治疗方法之前进行或在另外的治疗方法之后进行。根据本发明的治疗疾病的方法可包括将本发明的药物组合物作为单一活性成分来施用，或与另外的治疗方法组合施用。本发明的治疗方法可与另外的治疗方法平行进行、在另外的治疗方法之前进行或在另外的治疗方法之后进行。
提供了以下的实施例以更全面地示出本发明的一些实施方案。然而，不应以任何方式将它们解释为对本发明的宽泛范围的限制。
实施例
材料-包括具有MTT侧链保护基的赖氨酸的F-Moc氨基酸和F-MocRink Amide MBHA树脂购自Nova-biochem AG(Laufelfinger，Switzerland)。其它肽合成试剂、脂肪酸，即，辛酸(C8)、十二烷酸(C12)和十六烷酸(C16)、LPC(溶血磷脂胆碱)和PBS购自Sigma Chemical Co.(Israel)。DiD(DiIC18(5)或1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚二碳菁(tetramethylindodicarbocyanine)4-氯苯磺酸盐)、DiI(1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′，0四甲基吲哚二碳菁(tetramethylinocarbocyanine)高氯酸盐)亲脂性荧光探针获自Biotium(California，USA)。缓冲液在双蒸馏水中制备。
细胞系和试剂-细胞培养试剂和培养基购自Biological IndustriesIsrael(Beit Haemek LTD)。所有细胞系通过NIH AIDS研究和对照试剂计划(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)，AIDS部门(Division of AIDS)，NIAID，NIH获得。Jurkat E6-1细胞来自Arthur Weiss博士(Weiss A等人.1984，J.Immunol.133；123-8)，且表达HIV-1 HXBc2 Rev和ENV蛋白的Jurkat HXBc2(4)细胞来自Joseph Sodroski博士(Cao，J.等人.1996，J.Virol.70；1340-54)。每3至4天培养细胞，并在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中将细胞维持在补充有适当抗生素的RPMI-1640中。为了ENV表达，在实验前三天将Jurkat HXBc2(4)细胞转移到不含四环素的培养基中。
肽合成，脂肪酸轭合-通过利用先前所描述的F-moc策略在RinkAmide MBHA树脂上合成肽(Merrifield，R.B.等人.1982，Biochemistry，21；5020-31)。C-末端轭合的N-肽在其C-末端含有具有MTT侧链保护基的赖氨酸残基，能够使需要特定的脱保护步骤的脂肪酸在温和的酸性条件(2x1分钟的含5％TFA的DCM和30分钟的含1％TFA的DCM)下轭合。利用标准F-moc化学将脂肪酸轭合到N-末端。所有肽用TFA∶DDW∶TES(93.1∶4.9∶2(v/v))混合物从树脂上切下，并通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化至＞95％均一性。通过平台LCA电喷射质谱确定肽的分子量。
细胞-细胞融合抑制测定-先前描述了利用Jurkat E6-1细胞和JurkatHXBc2细胞用于细胞-细胞融合测定的实验设计(Huerta L.等人.2002，Cytometry，47；100-6)。简言之，分别用DiI和DiD亲脂性荧光探针对JurkatE6-1细胞和Jurkat HXBc2细胞进行标记。在不同浓度的抑制性肽存在下，以1∶1的比例将两种细胞群共孵育6小时。将在肽不存在时共孵育的细胞用作最佳融合对照。将相似处理的未标记的细胞用作内部荧光对照。将分别用DiI或DiD标记的细胞用来补偿荧光信号的最佳分离。将用DiI标记的Jurkat HXBc2细胞与用DiD标记的Jurkat HXBc2细胞共孵育以为了从实验的测量中减去的融合背景。对原始实验设计应用以下的改变：(i)将5ul含1mg/ml DiI或DiD的二甲基亚砜(DMSO)溶液分别添加到1ml的5X106个细胞/ml的Jurkat E6-1细胞或Jurkat HXBc2细胞中。(ii)在FACSort收集每个样品150,000个事件的数据，在FACSCalibur细胞分析仪(BectonDickinson)上优化，并进一步分析。根据来源于希尔方程的等式对数据点进行拟合：
Y = B * [ [ A ] c X c + [ A ] c ]
在该等式中，B是最大值，因此其等于100％融合，A是IC50值，且c代表希尔系数，在该特定情况中代表：肽的抑制性低聚态。为了拟合，我们将原始数据的X值和Y值(减去背景之后)上载(upload)至非线性最小二乘回归(曲线拟合)程序中，该程序提供了IC50值(等式的A)，以及c值。
病毒感染性测定-完全感染的HIV-1 HXB2浓缩的病毒贮存液由AIDS Vaccine Program，SAIC惠赠。按照P3生物安全等级进行实验。利用TZM-b1细胞系作为报道体来测定HIV-1 HXB2的感染性。将细胞(2x104细胞/孔)添加到含补充有10％血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)的96-孔透明底微量滴定板中。将平板在37℃下孵育18-24小时以使细胞附着。然后从每个孔中吸出培养基并替换为含40mg/mLDEAE-葡聚糖的无血清DMEM。在DMSO中制备每种肽的贮存稀释物以利用1％稀释来达到每个终浓度。在加入肽之后，将病毒添加到稀释于含40mg/mL DEAE-葡聚糖的无血清DMEM中的细胞中。然后将平板在37℃下孵育18小时以使感染发生。利用Steady-Glo萤光素酶测定试剂盒(Promega，Madison WI)分析萤光素酶活性。所有感染性测定重复三次。与细胞-细胞融合测定相似，从拟合曲线中计算IC50值。
三重染色流式细胞术融合测定-对于三重染色，在NBD标记的肽存在下进行如上所述的相同细胞-细胞融合抑制测定。在NBD-标记的肽存在下使用DiI或DiD分别标记的细胞，和未标记的细胞补偿三个荧光信号的最佳分离。每个数据点采集500,000个事件。在分析软件中定义8个不同的可能的组合(三重、NBD、DiI、DiD、NBD+DiI、NBD+DiD、DiI+DiD、无标记)并计算每一个的百分比。计算系统中所有细胞类型上NBD标记(肽)相对于所有可获得的被标记的细胞的百分比。该分析为我们提供了细胞上的相对的肽浓度。
此外，进一步计算用DiD标记的细胞(效应器)或用DiI标记的细胞(靶标)中NBD标记(肽)的百分比。对数据的分析使我们能够将被标记的肽分配到不同的细胞群，即，靶细胞或效应器细胞。
Figure BDA0000108158430000302
Figure BDA0000108158430000303
圆二色性(CD)光谱-在Aviv 202分光偏振计上进行CD测量。利用1mm径长的恒温石英比色皿扫描光谱。在25℃下进行波长扫描，平均记录时间为15秒，步长1nm，波长范围为190-260nm。在5mM HEPES缓冲液和含1％LPC的ddH2O的膜模拟环境中扫描10μM浓度的肽。
实施例1：N36对膜的锚定提高了其抑制活性：
为仔细研究N36锚定到膜的作用，我们将辛酸、十二烷酸和棕榈酸轭合到N36的N-末端(表1)。在细胞-细胞融合抑制测定中检查所得的肽C8-N36、C12-N36和C16-N36(表1)，且结果显示于图1中。观察到了轭合的脂肪酸的长度和N-轭合的N36肽的抑制活性之间的关联。N36、C8-N36、C12-N36和C16-N36分别表现出488±119nM、222±56nM、190±21nM和72±27nM的IC50值。有趣地是，高达2000nM时AcN36没有活性；因此我们认为它是无活性的。这与表明N36的乙酰化形式和非乙酰化形式的16000±2000nM和584±46nM的IC50的先前研究相关(Bewley等人.，2002，J.Biol.Chem.277：14238-45)。总之，我们的数据显示了N36对膜的锚定显著提高了其抑制活性。
Figure BDA0000108158430000311
表1：细胞-细胞融合测定中肽和其亲脂性轭合物的序列、名称和IC50值。“无活性”指通过细胞-细胞融合测定确定其IC50高于2μM的肽或肽轭合物。
实施例2：锚定的N36向内源性CHR区的定向并不重要：
为检查与前融合构象有关的N36肽的合适的定向的重要性，我们还将辛酸、十二烷酸和棕榈酸轭合到经修饰的N36的C-末端，称为N36M(表1)。在细胞-细胞融合抑制测定中检查亲本肽和所得的脂肪酸轭合肽N36M、N36M-C8、N36M-C12和N36M-C16(表1)，且结果在图1中提供。同样地，观察到轭合的脂肪酸长度和C-轭合的N36肽之间的关联。N36M、N36M-C8、N36M-C12和N36M-C16分别表现出531±48nM、354±25nM、241±89nM和159±47nM的IC50值。因为乙酰化N36消除了其活性，我们将乙酰基添加到N36M-C12和N36M-C16上，得到AcN36M-C12和AcN36M-C16。在细胞-细胞融合抑制测定中检查了这两个脂肽，且所述两个脂肽分别显示出226±38nM和125±51nM的IC50值。因为这些值与N36M-C12和N36M-C16的值相似，我们可以不受任何理论或作用机制束缚地推断，与N36相比，它们N-末端中的电荷没有影响它们的抑制能力。
有趣地是，在具有相同脂肪酸的N-末端轭合的肽的活性和C-末端轭合的肽的活性之间仅有轻微的差异。这与用C-螺旋肽获得的结果相反，在C-螺旋肽中它们之间存在显著的差异(～30-倍)(Wexler-Cohen和Shai，2007，Faseb J.，21：3677-84)。因此，不受任何理论或作用机制地束缚，我们可以推断，脂肪酸的长度是重要的，且其与抑制活性相关联，而关键是肽的定位对于其活性类型并不重要。
实施例3：抑制曲线分析表明本发明的肽的不同的抑制模式：
图3呈现了显示N36和其N-末端脂肪酸轭合的类似物的抑制活性曲线的代表性实验。图3显示了不同的肽的结合曲线从S形经过中间形状转向双曲线形的不同的形状。S形可由N36的低聚化倾向来解释。因此，不期望受理论或作用机制地束缚，我们推测不同的结合曲线可能归因于肽的不同的抑制性低聚态。因此，对于最佳拟合，我们应用了含有协同参数的等式，在该情况中指示肽的抑制性低聚态。因此，在实现拟合后，c值代表肽的低聚态。图4中呈现了不同的肽的低聚化参数的值。N-轭合的N36肽，即：N36、C8-N36、C12-N36和C16-N36的c值分别为2.67、2.61、1.77和1.47。C-轭合的N36肽，即：N36M、N36M-C8、N36M-C12和N36M-C16的c值分别为3.19、2.82、1.67和1.19。这些数据显示了低聚化倾向的有趣地转移。其表明对于天然的肽N36和N36M，倾向是三聚体形式。脂肪酸越长其低聚化值越低，直到其几乎达到C16-N36肽和N36M-C16肽的单体。
实施例4：细胞膜上肽的相对浓度：
我们通过利用掺入荧光标记的靶细胞、效应器细胞和抑制肽的三重染色流式细胞测定检验了脂肪酸与肽的结合是否允许它们锚定于细胞膜(Wexler-Cohen和Shai，2007，Faseb J.，21：3677-84)。该测定提供肽的IC50的测定，以及标记的肽到细胞的分配。我们分析了最大活性和最小活性的肽(表2)，即，NBDN36(其抑制活性与AcN36平行)、NBDN36M-C16和C16-N36NBD(图5)。NBDGCN4肽作为非结合肽的阴性对照，而C16-NBDGCN4作为强力结合肽的阳性对照。数据显示了N-螺旋肽的活性和其在细胞中的总浓度之间的直接相关。
Figure BDA0000108158430000331
表2：NBD标记的肽和其亲脂性轭合物的序列和名称
实施例5：溶液中和单独的膜模拟环境中和与C-螺旋C34组合的膜模拟环境中肽的结构：
我们测定了溶液中最具活性的肽和无活性的肽的二级结构以查明这种特征是否与它们的活性类型有关。N36和N36M在溶液中表现出α-螺旋结构，而AcN36、C16-N36和N36M-C16的结构是不明确的(图6)。还监测了肽在溶液中与C34一起形成核心结构的能力。测量了每个肽的CD信号，并假设他们彼此不相互作用而计算它们的组合的信号。将该信号与两个肽一起共孵育后监测的实际信号相对比。如果二者相互作用，我们预期可观察到两个信号之间的差异。AcN36和C16-N36不能形成核心结构，而N36和N36M-C16的确与C34相互作用(图6)(Wexler-Cohen等人.，J.Biol.Chem.，281：9005-10)。在膜模拟环境中还测量了单独的肽的结构，和其与C34形成核心结构的能力(图6)。在这些条件下，所有的肽表现出α-螺旋结构。然而，对于所有肽，非相互作用信号覆盖了实验信号。总之，这些数据表明肽的结构和其能够或不能够与C34形成核心结构(在溶液中或在肽模拟环境中)并非它们的活性类型的原因。
实施例6：利用已知的N36突变体来研究抑制机制：
为进一步研究抑制的机制，我们利用了已知的N36突变体(Bewley等人.，2002，J.Biol.Chem.，277：14238-45)。第一个是N36MUTe，g，其在其e位和g位含有突变。这些突变保留了其自装配成三聚体的能力，但其不能与CHR相互作用。第二个突变体是N36MUTa，d，其在其a位和d位中含有突变，所述突变敲除了其与自身相互作用的能力，因此导致其不能形成内部的卷曲螺旋(表3)。这些突变体表明可通过阻止病毒NHR卷曲螺旋(可能作为单体或二聚体)的形成，或通过与CHR结构域结合以阻止六螺旋束形成(可能作为三聚体)来抑制NHR(Bewley等人.，2002，J.Biol.Chem.，277：14238-45)。我们将棕榈酸与这两个突变体的N-末端或C-末端轭合并测定了它们的IC50抑制值。N36MUTa，d单独和当与棕榈酸轭合时是无活性的，且不期望受任何理论或作用机制地束缚，我们推测因为其不能与自身及CHR结构域结合，因此抑制的两种形式不能发生。然而，显著地，与可溶性肽相比，棕榈酸与N36MUTe，g的结合根据轭合的方向不同导致其IC50 7-倍到100-倍的提高。N36MUTe，g、C16-N36MUTe，g和N36MUTe，g-C16分别表现出936±36nM、162±4nM和8.8±4nM的IC50值(图7A)。保留与CHR区结合的野生型N36没有观察到这种偏好。并且，不期望受理论或作用机制地束缚，而数据分析分别表明了野生型N36及其棕榈酸轭合物的抑制的三聚体形式和单聚体形式(图7B)，暗示了可溶性N36MUTe，g和其棕榈酰化形式的抑制都主要是单体模式。
Figure BDA0000108158430000341
表3：N36突变的肽和其亲脂性轭合物的序列和名称。“无活性”指通过细胞-细胞融合测定确定其IC50大于2μM的肽或肽轭合物。
实施例7：特异细胞群中肽的相对浓度：
为在动态融合过程中检查肽是否具有结合具有受体的细胞(靶细胞)，或结合具有ENV糖蛋白的那些细胞(效应器细胞)的增强的倾向，我们利用了三重染色测定。精确根据细胞-细胞融合测定的实验设计，将荧光标记的肽与不同标记的效应器和靶细胞一起孵育。使融合发生，然后洗涤样品并通过FACS测量样品。进一步地分析，使我们对比了每个细胞群的肽结合的相对水平(图8)。NBDGCN4肽作为非结合肽的阴性对照，而C16-NBDGCN4作为强力结合肽的阳性对照，对于特异细胞群无偏好。在每个图中画线以强调在不同群体之间无偏好的情况下我们预期数据所在的地方。因为NBDGCN4肽不与膜结合，所有数据点集中于左下角。我们可推断(在与用于测定肽的抑制活性的实验相同的条件下)轭合的N36肽倾向于更多地存在于靶细胞上而非效应器细胞上。
实施例8：本发明的短肽的抑制活性：
我们合成了N-肽，命名为N26，其氨基酸序列相对于本领域中已知的N36肽发生改变(Yingying Le等人.2000，Clin.Immun.96；236-42)；本发明的肽起始于N36的N-末端上游的4个氨基酸，且终止于N36的C-末端上游的14个氨基酸(图1)。本发明的肽中删除的N36的C-末端序列包括六螺旋束结构的口袋。诸如具有增加的长度的脂肪酸、胆固醇或维生素E的疏水性部分与本发明的肽的N-末端的轭合导致了提高的抑制活性，如通过IC50值所表明的(利用细胞-细胞融合测定)：C8-N26M、C12-N26M、C16-N26M、胆固醇-N26M和维生素E-N26M分别为1075±90nM、473±74nM、148±4nM、150±20nM和400±60nM(表4和5)。利用病毒-细胞融合测定进一步证明了根据本发明的一些实施方案的肽和肽轭合物的抑制活性，其所得的N26M、C8-N26M、C12-N26M、C16-N26M、胆固醇-N26M和维生素E-N26M的IC50值分别为338±16nM、293±27nM、182±15nM、10±1nM、25±1nM和50±1nM(表5)。脂肪酸与肽的C-末端的轭合得到了无活性的肽。肽缩短2-4个氨基酸降低了轭合的肽的抑制活性；如通过细胞-细胞融合测定和病毒-细胞融合测定的，两个C-末端氨基酸的截短得到的C16-N25的IC50值分别为484±60nM和30±5nM，和如通过细胞-细胞融合测定和病毒-细胞融合测定的，另外两个C-末端的氨基酸的截短得到的C16-N23的IC50值分别为1931±187nM和100±24nM。通过将本发明的脂肽的抑制活性与同一系统中N36肽的抑制活性相比较(IC50值为488±119nM(IC50值由细胞-细胞融合测定所确定))，我们可推断本发明的脂肽表现出增强的抑制能力。
Figure BDA0000108158430000361
表4：本发明的肽和其亲脂性轭合物的序列和名称。“无活性”指通过细胞-细胞融合测定确定其IC50大于2μM的肽或肽轭合物。
Figure BDA0000108158430000371
表5：通过病毒-细胞融合测定确定的本发明的亲脂性轭合物的抑制浓度。“无活性”指通过病毒-细胞融合测定确定其IC50大于1μM的肽或肽轭合物。
Figure IDA0000108158470000011
Figure IDA0000108158470000021
Figure IDA0000108158470000031
Figure IDA0000108158470000051
Figure IDA0000108158470000061
Figure IDA0000108158470000071
Figure IDA0000108158470000081
Figure IDA0000108158470000091
Figure IDA0000108158470000101
Figure IDA0000108158470000111
Figure IDA0000108158470000121

Claims (56)

1.一种亲脂性轭合物，所述亲脂性轭合物包括与疏水性部分偶合的分离的肽，所述肽包括式(I)的序列：
X1-X2-X3-X4-Ser-Gly-Ile-X5-Gln-X6-Gln-Asn-Asn-Leu-X7-Arg-X8-Ile-Glu-Ala-Gln-X9-His(I)
其中：
X1选自由精氨酸和赖氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
X3和X4各自独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸氨基酸残基组成的组；
X6选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸氨基酸残基组成的组；
X7选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述疏水性部分被轭合到所述分离的肽的N-末端或C-末端；
且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合。
2.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分被轭合到所述分离的肽的N-末端。
3.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分包括含至少6个碳原子的脂族基。
4.根据权利要求3所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是脂肪酸。
5.根据权利要求4所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。
6.根据权利要求4所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸由至少6个碳原子组成。
7.根据权利要求4所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸选自由癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，反式十六烷酸、反油酸、乳杆酸、结核硬脂酸和羟脑脂酸组成的组。
8.根据权利要求7所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸是棕榈酸。
9.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是甾醇。
10.根据权利要求9所述的亲脂性轭合物，其中所述甾醇是胆固醇。
11.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是选自由维生素A、维生素D、维生素E和维生素K组成的组的脂溶性维生素。
12.根据权利要求11所述的亲脂性轭合物，其中所述脂溶性维生素是维生素E。
13.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽包括高达30个氨基酸残基。
14.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中轭合后对蛋白诱导的膜融合的抑制高于轭合前。
15.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中诱导膜融合的蛋白是选自HIV的包膜表面糖蛋白和猿猴免疫缺陷病毒的包膜表面糖蛋白的包膜表面糖蛋白。
16.根据权利要求15所述的亲脂性轭合物，其中所述HIV的包膜表面糖蛋白是HIV-1 gp41。
17.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽在C-末端、N-末端或两个末端还包括至少一个带正电荷的氨基酸残基。
18.根据权利要求17所述的亲脂性轭合物，其中所述至少一个带正电荷的氨基酸残基被添加到所述C-末端。
19.根据权利要求1所述的亲脂性轭合物，其中X1是精氨酸、X2是谷氨酰胺、X3是亮氨酸且X4是亮氨酸。
20.根据权利要求1中的任一项所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽的序列如在SEQ ID NO：2、4、6、8、13、15、17和19中的任一个中所列出。
21.根据权利要求1中的任一项所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽的序列如在SEQ ID NO：3、5、7、9、14、16、18和20中的任一个中所列出。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1-21中任一项所述的亲脂性轭合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1-21中任一项所述的亲脂性轭合物，用于抑制病毒对细胞的感染。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，所述药物组合物用于抑制选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒的病毒对细胞的感染。
25.一种用于抑制细胞中膜蛋白装配的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的亲脂性轭合物接触，从而抑制所述膜蛋白装配。
26.一种用于抑制病毒对细胞的感染的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的亲脂性轭合物接触，从而抑制所述细胞的感染。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒。
28.一种用于在受试者中抑制病毒复制或传播的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求22所述的药物组合物，从而抑制所述病毒复制或传播。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者是人。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述病毒是HIV。
31.一种亲脂性轭合物，所述亲脂性轭合物包括与疏水性部分偶合的分离的肽，所述分离的肽包括式(II)的序列：
Ser-Gly-Ile-X1-Gln-X2-Gln-Asn-Asn-Leu-X3-Arg-X4-Ile-Glu-Ala-Gln-X5-His-X6-Leu-Gln-Leu-Thr-X7-Trp-X8-Ile-Lys-Gln-Leu-X9-Ala-Arg-Ile-Leu(II)
其中：
X1选自由天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸氨基酸残基组成的组；
X2选自由天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺氨基酸残基组成的组；
X3选自由苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X4选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的组；
X5选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
X6选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸组成的组；
X7选自由谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸氨基酸残基组成的组；
X8选自由赖氨酸、精氨酸和甘氨酸氨基酸残基组成的组；
X9选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺氨基酸残基组成的组；
其中所述疏水性部分被轭合到所述分离的肽的N-末端、C-末端或两个末端，且其中所述亲脂性轭合物能够抑制蛋白诱导的膜融合。
32.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽的氨基酸序列如在SEQ ID NO：11中所列出。
33.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽的氨基酸序列如在SEQ ID NO：12中所列出。
34.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽在羧基末端、氨基末端或两个末端还包括至少一个带正电荷的氨基酸残基。
35.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分包括含至少6个碳原子的脂族基。
36.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是脂肪酸。
37.根据权利要求36所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。
38.根据权利要求36所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸由至少6个碳原子组成。
39.根据权利要求36所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸选自由癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，反式十六烷酸、反油酸、乳杆酸、结核硬脂酸和羟脑脂酸组成的组。
40.根据权利要求39所述的亲脂性轭合物，其中所述脂肪酸是棕榈酸。
41.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是甾醇。
42.根据权利要求41所述的亲脂性轭合物，其中所述甾醇是胆固醇。
43.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述疏水性部分是选自由维生素A、维生素D、维生素E和维生素K组成的组的脂溶性维生素。
44.根据权利要求43所述的亲脂性轭合物，其中所述脂溶性维生素是维生素E。
45.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中所述分离的肽包括高达40个氨基酸残基。
46.根据权利要求31所述的亲脂性轭合物，其中诱导膜融合的蛋白是选自HIV的包膜表面糖蛋白和猿猴免疫缺陷病毒的包膜表面糖蛋白的包膜表面糖蛋白。
47.根据权利要求46所述的亲脂性轭合物，其中所述HIV的包膜表面糖蛋白是HIV-1 gp41。
48.一种药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求31所述的亲脂性轭合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
49.根据权利要求48所述的药物组合物和药学上可接受的载体或稀释剂用于抑制病毒对细胞的感染。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，所述药物组合物用于抑制选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒的病毒对细胞的感染。
51.一种用于抑制细胞中膜蛋白装配的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求31至46中任一项所述的亲脂性轭合物接触，从而抑制所述膜蛋白装配。
52.一种用于抑制病毒对细胞的感染的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求31至46中任一项所述的亲脂性轭合物接触，从而抑制所述细胞的感染。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述病毒选自HIV和猿猴免疫缺陷病毒。
54.一种用于在受试者中抑制病毒复制或传播的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求47所述的药物组合物，从而抑制所述病毒复制或传播。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试者是人。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述病毒是HIV。
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