CN111574633A

CN111574633A - 一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用

Info

Publication number: CN111574633A
Application number: CN202010411253.3A
Authority: CN
Inventors: 程功; 余茜; 童良琴; 张礼铭; 肖小平; 朱毅斌
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN111574633B

Abstract

本发明公开了一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用。蛋白质CbAE从N端至C端依次包括区段1‑区段12；区段1—区段12的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位、第98至107位、第109至114位、第184至190位、第218至224位、第232至238位、第273至283位、第315至319位、第339至344位、第389至393位、第419至423位和第425至429位所示。实验证明，融合蛋白CbAE‑1和融合蛋白CbAE‑2均可以显著抑制新型冠状病毒假病毒、新型冠状病毒、HIV假病毒、DENV‑2、ZIKV和HSV‑1。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用。

背景技术

冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，因电镜下病毒颗粒形似皇冠而得名。冠状病毒的宿主范围主要包括鸟类和哺乳类，迄今为止，已鉴定出七种可感染人类的冠状病毒，其中SARS病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的出现给世界经济卫生造成了极大威胁。新型冠状病毒属于冠状病毒科、冠状病毒属病毒，感染人后可引起不同程度的症状，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状病毒的主要传播方式是飞沫传播和接触传播。目前，针对新型冠状病毒的尚无特效药及疫苗，对症支持性治疗是主要的治疗手段。因此，针对新型冠状病毒的药物研究及新药研发迫在眉睫。

艾滋病毒(HIV)是一种有包膜的RNA病毒，属逆转录病毒，感染人类会引起免疫缺陷综合征，目前尚无特效疫苗。登革病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)均属于黄病毒属病毒，主要由蚊虫传播。登革病毒感染人类会引起出血热等症状，寨卡病毒感染人类后可引起头疼发热、小头症等。单纯疱疹病毒(HSV)感染会造成口腔疱疹和生殖器疱疹。

目前针对病毒的治疗方法，主要通过抗病毒药物(如干扰素和核苷类药物)进行治疗，干扰素治疗副作用较大，而核苷类药物较容易发生耐药性；对于没有合适治疗药物的病毒性疾病，一般采用对症治疗。由于病毒较易发生突变，目前大多数病毒没有特效疫苗。鉴于病毒性疾病为世界经济卫生带来的巨大威胁，开发出有广谱抗病毒功能的药物将对各种病毒性疾病的治疗有重要意义。

色素细菌(Chromobacterium sp.)是一类蚊子肠道菌，可有效杀灭蚊虫。

发明内容

本发明的目的是抑制病毒，如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、新型冠状病毒假病毒、登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒1型。

本发明首先保护蛋白质CbAE，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)从N端至C端依次包括区段1-区段12；

区段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位所示；

区段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第98至107位所示；

区段3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第109至114位所示；

区段4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第184至190位所示；

区段5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第218至224位所示；

区段6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第232至238位所示；

区段7的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第273至283位所示；

区段8的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第315至319位所示；

区段9的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第339至344位所示；

区段10的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第389至393位所示；

区段11的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第419至423位所示；

区段12的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第425至429位所示；

a2)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

具体的，所述蛋白质CbAE可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

b2)氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

b3)氨基酸序列是SEQ ID NO：6所示的蛋白质；

b4)氨基酸序列是SEQ ID NO：8所示的蛋白质；

b5)在b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b6)将b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

b7)与b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

SEQ ID NO：2所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-1。SEQ ID NO：2由452个氨基酸残基组成。

SEQ ID NO：6所示的蛋白质命名为蛋白质CbAE-2。SEQ ID NO：6由444个氨基酸残基组成。

SEQ ID NO：4所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-1。SEQ ID NO：4由501个氨基酸残基组成。

SEQ ID NO：8所示的蛋白质命名为融合蛋白CbAE-2。SEQ ID NO：8由493个氨基酸残基组成。

为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-1或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质CbAE可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质CbAE的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列或SEQ ID NO：5所示的DNA序列在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质CbAE的核酸分子也属于本发明的保护范围。

具体的，编码所述蛋白质CbAE的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7)或c8)：

c1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c2)编码区是SEQ ID NO：5所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c4)核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示的DNA分子；

c5)核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的DNA分子；

c6)核苷酸序列是SEQ ID NO：7所示的DNA分子；

c7)与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质CbAE的DNA分子；

c8)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质CbAE的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由1359个核苷酸组成，SEQ ID NO：1所示的核苷酸编码SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：3由1506个核苷酸组成，SEQ ID NO：3所示的核苷酸编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：5由1335个核苷酸组成，SEQ IDNO：5所示的核苷酸编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：7由1482个核苷酸组成，SEQ IDNO：7所示的核苷酸编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质CbAE的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质CbAE的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质CbAE，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-1或编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质CbAE-2的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

编码所述蛋白质CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-1的基因，命名为CbAE-1基因。CbAE-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码所述融合蛋白CbAE-1的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-1的基因，命名为CbAE-1融合基因。CbAE-1融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

编码所述蛋白质CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CbAE-2的基因，命名为CbAE-2基因。CbAE-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

编码所述融合蛋白CbAE-2的核酸分子具体可为编码所述融合蛋白CbAE-2的基因，命名为CbAE-2融合基因。CbAE-2融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为将所述蛋白质CbAE的编码基因插入出发质粒，得到的重组质粒。所述出发质粒可为表达载体或克隆载体。

具体的，含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入所述蛋白质CbAE的编码基因，得到的重组质粒。

含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1或重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2。

所述重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1可为将载体pET-28a(+)的限制性内切酶EcoRI和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1356位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1中，SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1356位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：3所示的融合基因CbAE-1，表达SEQ ID NO：4所示的具有His-tag标签的融合蛋白CbAE-1。

所述重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2可为将载体pET-28a(+)的限制性内切酶EcoRI和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：5自5’末端起第1至1332位所示的双链DNA分子，得到重组质粒。重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2中，SEQ ID NO：5自5’末端起第1至1332位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：7所示的融合基因CbAE-2，表达SEQ ID NO：8所示的具有His-tag标签的融合蛋白CbAE-2。

含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将上述任一所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为大肠杆菌BL21(DE3)。

含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为BL21(DE3)－CbAE-1或BL21(DE3)－CbAE-2。

所述BL21(DE3)－CbAE-1可为将重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。

所述BL21(DE3)－CbAE-2可为将重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。

本发明还保护上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分子的应用，可为d1)-d4)中的至少一种：

d1)抑制病毒；

d2)制备用于抑制病毒的产品；

d3)抑制病毒假病毒；

d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。

上述应用中，所述产品可为药物或病毒抑制剂。

本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述蛋白质CbAE或上述任一所述核酸分子；所述产品的功能可为d1)-d4)中的至少一种：

d1)抑制病毒；

d2)制备用于抑制病毒的产品；

d3)抑制病毒假病毒；

d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。

所述产品可为药物或病毒抑制剂。

本发明还保护一种抑制病毒或病毒假病毒的方法，为采用上述任一所述蛋白质CbAE处理病毒或病毒假病毒。

上述任一所述病毒可为冠状病毒、HIV、DENV、ZIKV和HSV中的至少一种。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒假病毒可为：将冠状病毒假病毒溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养24-48h(如24-36h、36-48h、24h、36h或48h)。细胞可为HEK-293T细胞。具体的，HEK-293T细胞可为稳定表达ACE2蛋白的HEK-293T细胞。结果表明，冠状病毒假病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒假病毒。

上述任一所述冠状病毒假病毒可为SARS-CoV-2假病毒。

所述SARS-CoV-2假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有SARS-CoV-2刺突蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到SARS-CoV-2假病毒。构建方法参考如下文献：Characterization of anti-viralimmunity in recovered individuals infected by SARS-CoV-2.MedRxiv，2020。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2假病毒，IC₅₀为0.7344μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS-CoV-2假病毒，IC₅₀为1.041μg/mL。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理冠状病毒可为：将冠状病毒溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，冠状病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制冠状病毒。

上述任一所述冠状病毒可为SARS-CoV-2。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制SARS-CoV-2，IC₅₀为

2.991μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制SARS-CoV-2，IC₅₀为2.490μg/mL。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理DENV可为：将DENV溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，DENV感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制DENV。

上述任一所述DENV可为DENV-2。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制DENV-2，IC₅₀为0.0022μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制DENV-2，IC₅₀为3.898μg/mL。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理ZIKV可为：将ZIKV溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，ZIKV感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制ZIKV。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制ZIKV，IC₅₀为0.0035μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制ZIKV，IC₅₀为1.080μg/mL。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HIV假病毒可为：将HIV假病毒溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到病毒-蛋白混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用病毒-蛋白混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养60-84h(如60-72h、72-84h、60h、72h或84h)。细胞可为GHOST细胞。结果表明，HIV假病毒感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HIV假病毒。

所述HIV假病毒的构建方法可如下：以HIV-1病毒为骨架，将含有HIV Env蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到HIV假病毒；构建方法参考如下文献：Broadly resistant HIV-1 against CD4-binding siteneutralizing antibodies.PLoS Pathogens，2019，15，e1007819。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HIV假病毒，IC₅₀为0.0111μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HIV假病毒，IC₅₀为0.0863μg/mL。

上述方法中，采用上述任一所述蛋白质CbAE处理HSV可为：将HSV溶液和蛋白质CbAE溶液混合，孵育，得到混合液。所述孵育可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)孵育0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。用混合液感染细胞。感染条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO₂培养0.5-1.5h(如0.5-1.0h、1.0-1.5h、0.5h、1.0h或1.5h)。细胞可为Vero细胞。结果表明，HSV感染率显著下降。由此可见，蛋白质CbAE可以显著抑制HSV。

上述任一所述HSV可为HSV-1。

在本发明的一个实施例中，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制HSV-1，IC₅₀为1.027μg/mL。在本发明的另一个实施例中，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制HSV-1，IC₅₀为0.4408μg/mL。

实验证明，融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2均可以显著抑制病毒假病毒和病毒(如新型冠状病毒、新型冠状病毒假病毒、登革病毒2型、人类免疫缺陷病毒假病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒1型)。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为融合蛋白CbAE-1溶液的SDS-PAGE。

图2为融合蛋白CbAE-2溶液的SDS-PAGE。

图3为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。

图4为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒假病毒的抑制作用。

图5为不同浓度融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒的抑制作用。

图6为不同浓度融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒的抑制作用。

图7为不同浓度融合蛋白CbAE-1对登革病毒2型的抑制作用。

图8为不同浓度融合蛋白CbAE-2对登革病毒2型的抑制作用。

图9为不同浓度融合蛋白CbAE-1对寨卡病毒的抑制作用。

图10为不同浓度融合蛋白CbAE-2对寨卡病毒的抑制作用。

图11为不同浓度融合蛋白CbAE-1对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。

图12为不同浓度融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用。

图13为不同浓度融合蛋白CbAE-1对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。

图14为不同浓度融合蛋白CbAE-2对单纯疱疹病毒1型的抑制作用。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

下述实施例中新型冠状病毒(即SARS-CoV-2)假病毒的构建方法为：以HIV-1病毒为骨架，将含有新型冠状病毒刺突蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到新型冠状病毒假病毒；构建方法参考如下文献：Characterization of anti-viral immunity in recovered individuals infected bySARS-CoV-2.MedRxiv，2020。

新型冠状病毒(记载于如下文献中：An artificial intelligence systemreveals liquiritin inhibits SARS-CoV-2 by mimicking type Iinterferon.BioRxiv，2020。)由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院提供。

登革病毒2型(即DENV-2)，记载于如下文献中：Flavivirus NS1 protein ininfected host sera enhances viral acquisition by mosquitoes.NatureMicrobiology，2016，1(9):16087。

寨卡病毒(即ZIKV)，记载于如下文献中：Evolutionary enhancement of Zikavirus infectivity in Aedes aegypti mosquitoes.Nature，2016，545，482–486。

人类免疫缺陷病毒(即HIV)假病毒的构建方法为：以HIV-1病毒为骨架，将含有HIVEnv蛋白的编码基因的质粒和包含荧光素酶报告基因的pNL43Luci质粒共转染293T细胞，得到人类免疫缺陷病毒假病毒；构建方法参考如下文献：Broadly resistant HIV-1against CD4-binding site neutralizing antibodies.PLoS Pathogens，2019，15，e1007819。

单纯疱疹病毒(即HSV-1)，HSV-1毒株由苏州大学生物与医学研究院提供，“BGM细胞，Hela细胞，HEL细胞与A549细胞对HSV-1敏感性的比较.湖南医科大学学报，1997，05.”中公开过。

GHOST细胞，记载于如下文献中：Quantitative evaluation of HIV and SIV co-receptor use with GHOST(3)cell assay.Methods in Molecular Biology，2005，304:333-342。

Vero细胞即非洲绿猴肾细胞，记载于如下文献中：Flavivirus NS1 protein ininfected host sera enhances viral acquisition by mosquitoes.NatureMicrobiology，2016，1(9):16087。

稳定表达ACE2蛋白的HEK-293T细胞即可稳定表达ACE2蛋白的人肾脏细胞系，记载于如下文献中：Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Triggers Apoptosisvia Protein Kinase R but Is Resistant to Its Antiviral Activity.Journal ofVirology，2009，83(5):2298-2309。

载体pET-28a(+)为Solarbio公司的产品，货号为P3110。

ToxinEraser^TM内毒素去除试剂盒为Genescript公司的产品，产品目录号为L00338。

实施例1、融合蛋白CbAE-1的获得

一、重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1的构建

将载体pET-28a(+)的限制性内切酶EcoRI和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1356位所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1。

重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1中，SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1356位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ IDNO：3所示的融合基因CbAE-1，表达SEQ ID NO：4所示的具有His-tag标签的融合蛋白CbAE-1。

二、融合蛋白CbAE-1的表达和纯化

细菌裂解液：含100mMNaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)。

平衡缓冲液：将2.340g NaH₂PO₄、4.330g Na₂HPO₄和17.532g NaCl溶于1L水，调节pH值至7.35。

1、将重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21(DE3)－CbAE-1。

2、完成步骤1后，取BL21(DE3)－CbAE-1单克隆，接种至10mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养12-16h，得到培养菌液1。

3、完成步骤2后，取培养菌液1，按体积比为1:100接种至200mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值为0.4～0.8，得到培养菌液2。

4、完成步骤3后，将培养菌液2冷却到室温，预冷摇床到16℃。向培养菌液2中加入终浓度为0.2mM的IPTG，然后置于16℃恒温摇床中150rpm震荡培养16h。

5、完成步骤4后，取所述菌液，室温、1000g离心5min，弃上清液，收集菌体；之后用PBS洗涤，室温、1000g离心5min，收集菌体。

6、完成步骤5后，取所述菌体，加入15mL细菌裂解液重悬，之后加入蛋白酶抑制剂。

7、完成步骤6后，取所述重悬液，冰上超声(功率35％，2s ON，2s OFF，总时间为40min)破碎菌体。

8、完成步骤7后，取所述菌体破碎液，4℃、12000g离心20min，收集上清；然后用0.22μm滤膜过滤除菌，得到蛋白溶液。

9、用平衡缓冲液平衡Ni-NTA beads(Novagen，70666-3)树脂。

10、将步骤9平衡后的树脂加入步骤8得到的蛋白溶液中(比例为5-10mg蛋白：1mL树脂)，4℃混合2h(目的为使蛋白和树脂结合)。

11、完成步骤10后，将含有树脂的蛋白上清流过手动过滤柱，含有6×His标签的蛋白及杂蛋白被结合在过滤柱上。依次用30mL浓度为10mM的咪唑溶液、5mL浓度为20mM的咪唑溶液、5mL浓度为30mM的咪唑溶液、5mL浓度为50mM的咪唑溶液、5mL浓度为100mM的咪唑溶液和5mL浓度为250mM咪唑溶液洗涤柱子，并收集洗脱液。

采用SDS-PAGE鉴定融合蛋白CbAE-1在哪部分洗脱液中较多且纯，收集该部分洗脱液进行后续实验。

三、融合蛋白CbAE-1的获得

进行该步骤的步骤为去除步骤二中11收集的洗脱液中的内毒素。

1、将树脂预装柱(ToxinEraser^TM内毒素去除试剂盒中的组件)置于铁架台上，打开流速控制器(流速保持在10滴/min)；待树脂预装柱中的保护液流干后，关闭流速控制器；之后再生两次。

每次再生的步骤为：向树脂预装柱中加入5mL再生缓冲液(ToxinEraser^TM内毒素去除试剂盒中的组件)，打开流速控制器(流速保持在10滴/min)。

2、待步骤1中再生缓冲液流干后，关闭流速控制器；之后平衡两次。

每次平衡的步骤为：向树脂预装柱中加入6mL平衡缓冲液，打开流速控制器(流速保持在20滴/min)。

3、待步骤2中平衡缓冲液流干后，关闭流速控制器；然后沿树脂预装柱的柱壁加入步骤二中11收集的洗脱液(融合蛋白CbAE-1在该部分洗脱液中较多且纯)，打开流速控制器(流速保持在10滴/min)；等流出液体积达到1.5mL后，开始收集流出液1；等融合蛋白CbAE-1流干后，加入4mL平衡缓冲液，继续收集流出液2。将流出液1和流出液2合并，得到流出液。

4、将步骤3收集的流出液加入3KD规格的50mL超滤管(Millipore，UFC500396)中，4℃、4000g离心80min，观察超滤管中留下的体积是否小于250μL：如果体积为250μL以上，继续离心；如果体积不足250μL，则加入50mL PBS缓冲液再次离心至250μL。收集超滤管中的融合蛋白CbAE-1溶液，通过Bradford法测蛋白浓度，融合蛋白CbAE-1溶液分装后于-80℃保存备用。

将融合蛋白CbAE-1溶液进行SDS-PAGE。实验结果见图1(M为高分子量标准蛋白质，CbAE-1为融合蛋白CbAE-1溶液)。

实施例2、融合蛋白CbAE-2的获得

一、重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2的构建

将载体pET-28a(+)的限制性内切酶EcoRI和HindIII识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列为SEQ ID NO：5自5’末端起第1至1332位所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2。

重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2中，SEQ ID NO：5自5’末端起第1至1332位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ IDNO：7所示的融合基因CbAE-2，表达SEQ ID NO：8所示的具有His-tag标签的融合蛋白CbAE-2。

二、融合蛋白CbAE-2的表达、纯化、复性和内毒素的去除

按照实施例1步骤二和三的方法，将重组质粒pET-28a(+)-CbAE-1替换为重组质粒pET-28a(+)-CbAE-2，其它步骤均不变，得到融合蛋白CbAE-2溶液。

将融合蛋白CbAE-2溶液进行SDS-PAGE。实验结果见图2(M为高分子量标准蛋白质，CbAE-2为融合蛋白CbAE-2溶液)。

实施例3、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒假病毒的抑制作用

混合试剂由1vial Luciferase Assay Substrate(lyophilized)和10mLLuciferase Assay Buffer混合而成。1vial Luciferase Assay Substrate(lyophilized)和Luciferase Assay Buffer均为Luciferase Assay System(Promega，E1500)中的组件。

1×lysis buffer由1体积份5×lysis buffer(Promega公司的产品，货号为E1500)和4体积份水混合而成。

一、融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒假病毒的抑制作用

1、用不含EDTA的0.25％胰酶消化稳定表达ACE2蛋白的HEK-293T细胞，之后用含10％(v/v)FBS、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM培养基重悬，得到浓度为1.3×10⁶个/mL的细胞悬浮液。

2、取96孔板，每孔加入100μL细胞悬浮液，37℃、5％CO₂培养24h。

3、用DMEM完全培养基将新型冠状病毒假病毒稀释至50μL病毒稀释液得到的luciferase值为10000左右。将50μL病毒稀释液和50μL PBS稀释的蛋白溶液(浓度分别为0.064μg/mL、0.32μg/mL、1.6μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、200μg/mL、1000μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)混合，37℃孵育1h，得到病毒-蛋白混合液。

4、完成步骤2后，取所述96孔板，弃上清，之后每孔加入100μL病毒-蛋白混合液，混匀，37℃、5％CO₂培养36h。

5、完成步骤4后，小心去除培养基，然后用PBS缓冲液冲洗细胞。

6、完成步骤5后，每孔加入20μL1×lysis buffer(已平衡至室温)，摇动几次，以确保1×lysisbuffer完全覆盖细胞；之后转移至预冷的微量离心管。

7、完成步骤6后，取所述微量离心管，先涡旋10-15s，之后室温、12000g离心15s，收集上清液。

8、取96孔板，每孔20μL步骤7得到的上清液。将4mL混合试剂加入VARIOSKAN FLASH多功能读数仪中，每次读数前仪器会自动往孔中加入100μL混合试剂。然后将96孔板放入上述仪器中读数，获得荧光素酶活性，即样品组的发光强度值。

按照上述步骤4-8，将病毒-蛋白混合液替换为混合液1，其它步骤均不变，获得细胞对照组发光强度值。混合液1由50μLPBS和50μL DMEM完全培养基混合而成。

按照上述步骤4-8，将病毒-蛋白混合液替换为混合液2，其它步骤均不变，获得病毒对照组发光强度值。混合液2由50μLPBS和50μL病毒稀释液混合而成。

9、根据荧光素酶活性读值计算融合蛋白CbAE-1对新冠病毒假病毒的抑制率和IC₅₀。

抑制率＝[1－(样品组的发光强度值－细胞对照组发光强度值)/(病毒对照组的发光强度值－细胞对照组发光强度值)]×100％

实验重复两次。

检测结果见图3(两次结果的平均值)和表2。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制新型冠状病毒假病毒，IC₅₀为0.7344μg/mL。

表2

二、融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒假病毒的抑制作用

按照上述步骤一的方法，将融合蛋白CbAE-1替换为融合蛋白CbAE-2，浓度为0.048μg/mL、0.24μg/mL、1.2μg/mL、6μg/mL、30μg/mL、150μg/mL、750μg/mL，其它步骤均不变，得到相应的荧光素酶活性，根据荧光素酶活性读值计算融合蛋白CbAE-2对新冠病毒假病毒的抑制率和IC₅₀。

实验重复两次。

检测结果见图4(两次结果的平均值)和表3。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制新型冠状病毒假病毒，IC₅₀为1.041μg/mL。

表3

实施例4、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒的抑制作用

本实施例委托中国人民解放军军事科学院军事医学研究院进行实验。

营养琼盖由1体积份5％(m/v)低熔点琼脂糖水溶液和预热的4体积份含2％(v/v)FBS的DMEM培养基混合而成。

一、融合蛋白CbAE-1对新型冠状病毒的抑制作用

1、将新型冠状病毒溶液和PBS稀释的CbAE-1蛋白溶液(浓度分别为0.064μg/mL、0.32μg/mL、1.6μg/mL、8μg/mL、200μg/mL、1000μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)等体积混合，37℃孵育1h，得到混合液。

2、取24孔板，每孔加入1×10⁵个Vero细胞和500μL含10％(v/v)FBS、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM完全培养基，37℃、5％CO₂培养过夜。

3、完成步骤2后，取所述24孔板，每孔加入200μL步骤1得到的混合液(含50-60PFU新型冠状病毒)，混匀，37℃、5％CO₂培养1-1.5h。培养期间，轻轻摇动数次。

4、完成步骤3后，取所述24孔板，弃液相，每孔加入适量预热的营养琼盖，室温放置凝固后，37℃、5％CO₂培养2天。

5、完成步骤4后，取所述24孔板，每孔加入适量4％(v/v)甲醛水溶液，室温固定1h。

6、完成步骤5后，取所述24孔板，弃液相和营养琼盖，之后用去离子水清洗2次，再加入适量1％(m/v)结晶紫水溶液，室温染色1h。

7、完成步骤6后，取所述24孔板，弃液相，之后用去离子水清洗2次，计算出斑数，即实验组出斑数。

按照上述步骤1-7，将PBS稀释的蛋白溶液替换为PBS，其它步骤均比变，得到对照组出斑数。

8、计算对新型冠状病毒的抑制率。抑制率＝(1-实验组出斑数/对照组出斑数)×100％

实验重复两次。

部分检测结果见表4。检测结果见图5(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制新型冠状病毒感染，IC₅₀为2.991μg/mL。

表4

二、融合蛋白CbAE-2对新型冠状病毒的抑制作用

按照上述步骤一的方法，将融合蛋白CbAE-1替换为融合蛋白CbAE-2，浓度为0.0128μg/mL、0.064μg/mL、0.32μg/mL、1.6μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、200μg/mL、1000μg/mL，其它步骤均不变，得到相应的抑制率和IC₅₀。

部分检测结果见表5。检测结果见图6(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制新型冠状病毒感染，IC₅₀为2.490μg/mL。

表5

实施例5、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对登革病毒2型的抑制作用

一、融合蛋白CbAE-1对登革病毒2型的抑制作用

1、将登革病毒2型溶液和PBS稀释的CbAE-1蛋白溶液(浓度分别为0.0000256μg/mL、0.000128μg/mL、0.00064μg/mL、0.0032μg/mL、0.016μg/mL、0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)等体积混合，37℃孵育1h，得到混合液。

2、取6孔板，每孔加入4×10⁵个Vero细胞和2mL含10％(v/v)FBS、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM完全培养基，37℃、5％CO₂培养过夜。

3、完成步骤2后，取所述6孔板，每孔加入1mL步骤1得到的混合液(含50-60PFU登革病毒2型)，混匀，37℃、5％CO₂培养1-1.5h。培养期间，轻轻摇动数次。

4、完成步骤3后，取所述6孔板，弃液相，每孔加入适量预热的营养琼盖，室温放置凝固后，37℃、5％CO₂培养6天。

5、完成步骤4后，取所述6孔板，每孔加入适量4％(v/v)甲醛水溶液，室温固定1h。

6、完成步骤5后，取所述6孔板，弃液相和营养琼盖，之后用去离子水清洗2次，再加入适量1％(m/v)结晶紫水溶液，室温染色1h。

7、完成步骤6后，取所述6孔板，弃液相，之后用去离子水清洗2次，计算出斑数，即实验组出斑数。

按照上述步骤1-7，将PBS稀释的蛋白溶液替换为PBS，其它步骤均不变，得到对照组出斑数。

8、计算对登革病毒2型的抑制率。抑制率＝(1-实验组出斑数/对照组出斑数)×100％

实验重复两次。

部分检测结果见表6。检测结果见图7(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制登革病毒2型感染，IC₅₀为0.0022μg/mL。

表6

二、融合蛋白CbAE-2对登革病毒2型的抑制作用

按照上述步骤一的方法，将融合蛋白CbAE-1替换为融合蛋白CbAE-2，浓度为0.00064μg/mL、0.0032μg/mL、0.016μg/mL、0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL，其它步骤均不变，得到相应的抑制率和IC₅₀。

部分检测结果见表7。检测结果见图8(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制登革病毒2型感染，IC₅₀为3.898μg/mL。

表7

实施例6、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对寨卡病毒的抑制作用

一、融合蛋白CbAE-1对寨卡病毒的抑制作用

1、将寨卡病毒溶液和PBS稀释的CbAE-1蛋白溶液(浓度分别为0.0000256μg/mL、0.000128μg/mL、0.00064μg/mL、0.0032μg/mL、0.016μg/mL、0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)等体积混合，37℃孵育1h，得到混合液。

3、完成步骤2后，取所述6孔板，每孔加入1mL步骤1得到的混合液(含50-60PFU寨卡病毒)，混匀，37℃、5％CO₂培养1-1.5h。培养期间，轻轻摇动数次。

4、完成步骤3后，取所述6孔板，弃液相，每孔加入适量预热的营养琼盖，室温放置凝固后，37℃、5％CO₂培养5天。

8、计算对寨卡病毒的抑制率。抑制率＝(1-实验组出斑数/对照组出斑数)×100％

实验重复两次。

部分检测结果见表8。检测结果见图9(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制寨卡病毒感染，IC₅₀为0.0035μg/mL。

表8

二、融合蛋白CbAE-2对寨卡病毒的抑制作用

部分检测结果见表9。检测结果见图10(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制寨卡病毒感染，IC₅₀为1.080μg/mL。

表9

实施例7、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用

一、融合蛋白CbAE-1对人类免疫缺陷病病毒假病毒的抑制作用

1、用DMEM完全培养基将人类免疫缺陷病毒假病毒稀释至50μL病毒稀释液得到的luciferase值为10000左右。将50μL病毒稀释液和100μL PBS稀释的蛋白溶液(浓度分别为0.0015μg/mL、0.0046μg/mL、0.0137μg/mL、0.041μg/mL、0.123μg/mL、0.37μg/mL、1.11μg/mL、3.33μg/mL、10μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)混合，37℃孵育1h，得到病毒-蛋白混合液。

2、用不含EDTA的0.25％胰酶消化GHOST细胞，之后用含10％(v/v)FBS、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM培养基重悬，得到浓度为2×105个/mL的细胞悬浮液。

3、取96孔板，每孔加入100μL细胞悬浮液。

4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入100μL病毒-蛋白混合液，混匀，37℃、5％CO₂培养72h。

按照上述步骤4-8，将病毒-蛋白混合液替换为混合液1，其它步骤均不变，获得细胞对照组发光强度值。混合液1由50μL PBS和50μL DMEM完全培养基混合而成。

按照上述步骤4-8，将病毒-蛋白混合液替换为混合液2，其它步骤均不变，获得病毒对照组发光强度值。混合液2由50μL PBS和50μL病毒稀释液混合而成。

9、根据荧光素酶活性读值计算融合蛋白CbAE-1对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制率和IC₅₀。

实验重复两次。

部分检测结果见表10。检测结果见图11(两次结果的平均值。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制人类免疫缺陷病毒假病毒，IC₅₀为0.0111μg/mL。

表10

二、融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制作用

按照上述步骤一的方法，将融合蛋白CbAE-1替换为融合蛋白CbAE-2，浓度为0.0137μg/mL、0.041μg/mL、0.123μg/mL、0.37μg/mL、1.11μg/mL、3.33μg/mL、10μg/mL，其它步骤均不变，得到相应的荧光素酶活性，根据荧光素酶活性读值计算融合蛋白CbAE-2对人类免疫缺陷病毒假病毒的抑制率和IC₅₀。

实验重复两次。

部分检测结果见表11。检测结果见图12(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制人类免疫缺陷病毒假病毒，IC₅₀为0.0863μg/mL。

表11

实施例8、融合蛋白CbAE-1和融合蛋白CbAE-2对单纯疱疹病毒1型的抑制作用

一、融合蛋白CbAE-1对单纯疱疹病毒1型的抑制作用

1、将单纯疱疹病毒1型溶液和PBS稀释的CbAE-1蛋白溶液(浓度分别为0.00064μg/mL、0.0032μg/mL、0.016μg/mL、0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的融合蛋白CbAE-1溶液)等体积混合，37℃孵育1h，得到混合液。

3、完成步骤2后，取所述6孔板，每孔加入1mL步骤1得到的混合液(含30-50PFU单纯疱疹病毒)，混匀，37℃、5％CO₂培养1-1.5h。培养期间，轻轻摇动数次。

4、完成步骤3后，取所述6孔板，弃液相，每孔加入适量预热的营养琼盖，室温放置凝固后，37℃、5％CO₂培养4天。

8、计算对单纯疱疹病毒1型的抑制率。抑制率＝(1-实验组出斑数/对照组出斑数)×100％

实验重复两次。

部分检测结果见表12。检测结果见图13(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-1可以显著抑制单纯疱疹病毒感染，IC₅₀为1.027μg/mL。

表12

二、融合蛋白CbAE-2对单纯疱疹病毒1型的抑制作用

部分检测结果见表13。检测结果见图14(两次结果的平均值)。结果表明，融合蛋白CbAE-2可以显著抑制单纯疱疹病毒1型感染，IC₅₀为0.4408μg/mL。

表13

<110>清华大学

<120>一种具有广谱抗病毒功能的蛋白质CbAE的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgaaatcgc tgctattgct gggccttgcc ctgggcccct tggcccatgc cgccgccgcc 60

gaaccgattc aacccgatcc gcgctacagc catgtgctgt cctcgtccgg cccgctcagc 120

cgcgaacagc tgctgaagac ggctccgccg gcgccgatga gccgcgccgc gcgcggcgac 180

gccaatatcg agctgatgtc ggtgcccggc ccggccacct acacctattt gcgctgctat 240

taccgcaccg gcagcgacgc cgccaagccc accaccgact acgtgtgggg gctggacccc 300

agcagcggcg attactaccg cttgaacggc tactggtggt ccagcagcgc gctggactgg 360

aaaaacatgt attacaccga cgtggcgcag agcacgctgc aatcggtctg ccgcaacacc 420

ttgcagaaaa aaggcattca gcagaacccg gcgatggtgt tcgccgccga caaccagctg 480

tccttcaact acaccgtgtg gaccaacggc aaggccggcc agggcgccgc cgtcaacaag 540

atcgtcgcct tcggcgacag cctgtccgac aaccagaacg tctacaacgc ctcgatgtgg 600

acgctgccca accgcaacag ctggttccta ggccacttca gcaatggcca ggtgtgggtg 660

gaatacctgg ccggccgcct gcagctgccg gtgtacaact gggcgatagg cggcgccggc 720

gtggacacgc aaaaactggt gattcccggc gtgcagcagc aggtgcagtc gtggaaggat 780

tacatgaagc aggcccgcga ctacgatccg gccaccacct tgttcaccat gctgatcggc 840

ggcaacgatt tcgtgaacta caacaactcg gtggacaagg tgataggcgg ccagagccag 900

gcgctgacca gcctgatcga cgccggcgcg cgcaacatcc tagtgctcaa tctgcccgac 960

gtgtcgcggg cgccggtgtt ccagttcaaa tccggcgcgg cccaggtggc cgtccaggtg 1020

cgcgactaca accagcgtct gaacgccctg gccgaccagc tgcgcctcaa gtacggcagc 1080

ggcctgaatc tgcgcgtgtt cgacagctac gcgctgttca acaaggtgct gaacaacccc 1140

tccgcctacc agttcaacaa caccacccag tcctgcctca acatcaacgc ggactccagc 1200

accaactatc tgagttcgca gagcccgcgc gccaactgcg tcaatccgga cagcttcgtg 1260

ttctgggaca ccctgcaccc caccacccgc acgcataaag tgctagcgga cgaggtgtac 1320

gccttcctga acggctccgc cgccctggcc cgccgctga 1359

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Pro Leu Ala His

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ile Gln Pro Asp Pro Arg Tyr Ser His Val

20 25 30

Leu Ser Ser Ser Gly Pro Leu Ser Arg Glu Gln Leu Leu Lys Thr Ala

35 40 45

Pro Pro Ala Pro Met Ser Arg Ala Ala Arg Gly Asp Ala Asn Ile Glu

50 55 60

Leu Met Ser Val Pro Gly Pro Ala Thr Tyr Thr Tyr Leu Arg Cys Tyr

65 70 75 80

Tyr Arg Thr Gly Ser Asp Ala Ala Lys Pro Thr Thr Asp Tyr Val Trp

85 90 95

Gly Leu Asp Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Leu Asn Gly Tyr Trp

100 105 110

Trp Ser Ser Ser Ala Leu Asp Trp Lys Asn Met Tyr Tyr Thr Asp Val

115 120 125

Ala Gln Ser Thr Leu Gln Ser Val Cys Arg Asn Thr Leu Gln Lys Lys

130 135 140

Gly Ile Gln Gln Asn Pro Ala Met Val Phe Ala Ala Asp Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ser Phe Asn Tyr Thr Val Trp Thr Asn Gly Lys Ala Gly Gln Gly Ala

165 170 175

Ala Val Asn Lys Ile Val Ala Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Asn Gln

180 185 190

Asn Val Tyr Asn Ala Ser Met Trp Thr Leu Pro Asn Arg Asn Ser Trp

195 200 205

Phe Leu Gly His Phe Ser Asn Gly Gln Val Trp Val Glu Tyr Leu Ala

210 215 220

Gly Arg Leu Gln Leu Pro Val Tyr Asn Trp Ala Ile Gly Gly Ala Gly

225 230 235 240

Val Asp Thr Gln Lys Leu Val Ile Pro Gly Val Gln Gln Gln Val Gln

245 250 255

Ser Trp Lys Asp Tyr Met Lys Gln Ala Arg Asp Tyr Asp Pro Ala Thr

260 265 270

Thr Leu Phe Thr Met Leu Ile Gly Gly Asn Asp Phe Val Asn Tyr Asn

275 280 285

Asn Ser Val Asp Lys Val Ile Gly Gly Gln Ser Gln Ala Leu Thr Ser

290 295 300

Leu Ile Asp Ala Gly Ala Arg Asn Ile Leu Val Leu Asn Leu Pro Asp

305 310 315 320

Val Ser Arg Ala Pro Val Phe Gln Phe Lys Ser Gly Ala Ala Gln Val

325 330 335

Ala Val Gln Val Arg Asp Tyr Asn Gln Arg Leu Asn Ala Leu Ala Asp

340 345 350

Gln Leu Arg Leu Lys Tyr Gly Ser Gly Leu Asn Leu Arg Val Phe Asp

355 360 365

Ser Tyr Ala Leu Phe Asn Lys Val Leu Asn Asn Pro Ser Ala Tyr Gln

370 375 380

Phe Asn Asn Thr Thr Gln Ser Cys Leu Asn Ile Asn Ala Asp Ser Ser

385 390 395 400

Thr Asn Tyr Leu Ser Ser Gln Ser Pro Arg Ala Asn Cys Val Asn Pro

405 410 415

Asp Ser Phe Val Phe Trp Asp Thr Leu His Pro Thr Thr Arg Thr His

420 425 430

Lys Val Leu Ala Asp Glu Val Tyr Ala Phe Leu Asn Gly Ser Ala Ala

435 440 445

Leu Ala Arg Arg

450

<210> 3

<211> 1506

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gaaatcgctg 120

ctattgctgg gccttgccct gggccccttg gcccatgccg ccgccgccga accgattcaa 180

cccgatccgc gctacagcca tgtgctgtcc tcgtccggcc cgctcagccg cgaacagctg 240

ctgaagacgg ctccgccggc gccgatgagc cgcgccgcgc gcggcgacgc caatatcgag 300

ctgatgtcgg tgcccggccc ggccacctac acctatttgc gctgctatta ccgcaccggc 360

agcgacgccg ccaagcccac caccgactac gtgtgggggc tggaccccag cagcggcgat 420

tactaccgct tgaacggcta ctggtggtcc agcagcgcgc tggactggaa aaacatgtat 480

tacaccgacg tggcgcagag cacgctgcaa tcggtctgcc gcaacacctt gcagaaaaaa 540

ggcattcagc agaacccggc gatggtgttc gccgccgaca accagctgtc cttcaactac 600

accgtgtgga ccaacggcaa ggccggccag ggcgccgccg tcaacaagat cgtcgccttc 660

ggcgacagcc tgtccgacaa ccagaacgtc tacaacgcct cgatgtggac gctgcccaac 720

cgcaacagct ggttcctagg ccacttcagc aatggccagg tgtgggtgga atacctggcc 780

ggccgcctgc agctgccggt gtacaactgg gcgataggcg gcgccggcgt ggacacgcaa 840

aaactggtga ttcccggcgt gcagcagcag gtgcagtcgt ggaaggatta catgaagcag 900

gcccgcgact acgatccggc caccaccttg ttcaccatgc tgatcggcgg caacgatttc 960

gtgaactaca acaactcggt ggacaaggtg ataggcggcc agagccaggc gctgaccagc 1020

ctgatcgacg ccggcgcgcg caacatccta gtgctcaatc tgcccgacgt gtcgcgggcg 1080

ccggtgttcc agttcaaatc cggcgcggcc caggtggccg tccaggtgcg cgactacaac 1140

cagcgtctga acgccctggc cgaccagctg cgcctcaagt acggcagcgg cctgaatctg 1200

cgcgtgttcg acagctacgc gctgttcaac aaggtgctga acaacccctc cgcctaccag 1260

ttcaacaaca ccacccagtc ctgcctcaac atcaacgcgg actccagcac caactatctg 1320

agttcgcaga gcccgcgcgc caactgcgtc aatccggaca gcttcgtgtt ctgggacacc 1380

ctgcacccca ccacccgcac gcataaagtg ctagcggacg aggtgtacgc cttcctgaac 1440

ggctccgccg ccctggcccg ccgcaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac 1500

cactga 1506

<210> 4

<211> 501

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly

35 40 45

Pro Leu Ala His Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ile Gln Pro Asp Pro Arg

50 55 60

Tyr Ser His Val Leu Ser Ser Ser Gly Pro Leu Ser Arg Glu Gln Leu

65 70 75 80

Leu Lys Thr Ala Pro Pro Ala Pro Met Ser Arg Ala Ala Arg Gly Asp

85 90 95

Ala Asn Ile Glu Leu Met Ser Val Pro Gly Pro Ala Thr Tyr Thr Tyr

100 105 110

Leu Arg Cys Tyr Tyr Arg Thr Gly Ser Asp Ala Ala Lys Pro Thr Thr

115 120 125

Asp Tyr Val Trp Gly Leu Asp Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Leu

130 135 140

Asn Gly Tyr Trp Trp Ser Ser Ser Ala Leu Asp Trp Lys Asn Met Tyr

145 150 155 160

Tyr Thr Asp Val Ala Gln Ser Thr Leu Gln Ser Val Cys Arg Asn Thr

165 170 175

Leu Gln Lys Lys Gly Ile Gln Gln Asn Pro Ala Met Val Phe Ala Ala

180 185 190

Asp Asn Gln Leu Ser Phe Asn Tyr Thr Val Trp Thr Asn Gly Lys Ala

195 200 205

Gly Gln Gly Ala Ala Val Asn Lys Ile Val Ala Phe Gly Asp Ser Leu

210 215 220

Ser Asp Asn Gln Asn Val Tyr Asn Ala Ser Met Trp Thr Leu Pro Asn

225 230 235 240

Arg Asn Ser Trp Phe Leu Gly His Phe Ser Asn Gly Gln Val Trp Val

245 250 255

Glu Tyr Leu Ala Gly Arg Leu Gln Leu Pro Val Tyr Asn Trp Ala Ile

260 265 270

Gly Gly Ala Gly Val Asp Thr Gln Lys Leu Val Ile Pro Gly Val Gln

275 280 285

Gln Gln Val Gln Ser Trp Lys Asp Tyr Met Lys Gln Ala Arg Asp Tyr

290 295 300

Asp Pro Ala Thr Thr Leu Phe Thr Met Leu Ile Gly Gly Asn Asp Phe

305 310 315 320

Val Asn Tyr Asn Asn Ser Val Asp Lys Val Ile Gly Gly Gln Ser Gln

325 330 335

Ala Leu Thr Ser Leu Ile Asp Ala Gly Ala Arg Asn Ile Leu Val Leu

340 345 350

Asn Leu Pro Asp Val Ser Arg Ala Pro Val Phe Gln Phe Lys Ser Gly

355 360 365

Ala Ala Gln Val Ala Val Gln Val Arg Asp Tyr Asn Gln Arg Leu Asn

370 375 380

Ala Leu Ala Asp Gln Leu Arg Leu Lys Tyr Gly Ser Gly Leu Asn Leu

385 390 395 400

Arg Val Phe Asp Ser Tyr Ala Leu Phe Asn Lys Val Leu Asn Asn Pro

405 410 415

Ser Ala Tyr Gln Phe Asn Asn Thr Thr Gln Ser Cys Leu Asn Ile Asn

420 425 430

Ala Asp Ser Ser Thr Asn Tyr Leu Ser Ser Gln Ser Pro Arg Ala Asn

435 440 445

Cys Val Asn Pro Asp Ser Phe Val Phe Trp Asp Thr Leu His Pro Thr

450 455 460

Thr Arg Thr His Lys Val Leu Ala Asp Glu Val Tyr Ala Phe Leu Asn

465 470 475 480

Gly Ser Ala Ala Leu Ala Arg Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His

485 490 495

His His His His His

500

<210> 5

<211> 1335

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgaaacctc aactgctacg cggcctgctg gccgcggccg gcctgttcgc cgccagccag 60

gttcacgccc agctggaccc gcaactggac tatctgtccc cgggcggccc gctcagcgaa 120

gcccaggtca aggccgcggc ggccaaaccg gccgtggcga tgggagccgc cacctacacc 180

tatctgcgct gctattaccg gctggacatg agccccggca agccgcaaac caattaccac 240

tgggcgctgg atcccagcag cggcgattac taccgcgtca acggctactg gtggtccggc 300

agcatcgtcg cgctgaagaa tatgttctac agcgacgtgg cccaggacac cctggccgcc 360

gtctgccaga agacgctggc ggccaagggc ctcagccgtc cggtggcact gtacgccgcc 420

gccaacaacc agatgtccta caaccacacc atctggagcc aggacagcgc cagccagccg 480

gccggcgtca acaagctgat cgtgttcggc gacagcctgt ccgacactca gaacatgtac 540

ggcgcctcgc aatggcggct gcccaacgcc aagagctggt tcatcggccg cttcagcaac 600

gaccgggtct gggtggaata tctggccgaa cagctgaagc tgccgatcta caactgggcg 660

ataggcggct ccgccggcga tcagcacctg gtggtgccgg gcttgctgca gcaggtggaa 720

tcatggtcgc aatacatgca gaaagccgcc aattaccggc cggaaaacac cctgttcacc 780

atgctgatag gcggcaacga cttgctcaac tacggtcgca ccgtggacca ggtgataagc 840

gatcagggca aggcgctgga acgcatcatc gccgccggcg cgcgtcacat cgtggtgctg 900

aacctgccca acctggcccg caccccggcg gcccaggcca gcggcaaggc cgccgcgctg 960

gcgccgcaag tgcgcgacta caacgccaag ctggcgctgc taatcacgca attgcagcag 1020

aagtacggca gcacgctgaa gctgaatctg ttcgacagca acaccttgtt cgacgacctg 1080

ctcgaccatc cggccaagta ccaggtcagc aacgccaccc agtcctgcct ggacatcgcc 1140

ggcaacgcca gcctgcccta tatctgggag cagaagccgc gcgcggaatg cggcaatccg 1200

gacgccttcg tgttctggga cgtgctgcac cccaccaccc acacgcataa gctgttgggc 1260

ggctacgtag ccaacttcgt caaggccgcg gatccggcgg tctccgccgc ggcggcgctg 1320

aaggcgcgcc gctaa 1335

<210> 6

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Lys Pro Gln Leu Leu Arg Gly Leu Leu Ala Ala Ala Gly Leu Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ser Gln Val His Ala Gln Leu Asp Pro Gln Leu Asp Tyr Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Gly Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Lys Ala Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Pro Ala Val Ala Met Gly Ala Ala Thr Tyr Thr Tyr Leu Arg Cys

50 55 60

Tyr Tyr Arg Leu Asp Met Ser Pro Gly Lys Pro Gln Thr Asn Tyr His

65 70 75 80

Trp Ala Leu Asp Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Val Asn Gly Tyr

85 90 95

Trp Trp Ser Gly Ser Ile Val Ala Leu Lys Asn Met Phe Tyr Ser Asp

100 105 110

Val Ala Gln Asp Thr Leu Ala Ala Val Cys Gln Lys Thr Leu Ala Ala

115 120 125

Lys Gly Leu Ser Arg Pro Val Ala Leu Tyr Ala Ala Ala Asn Asn Gln

130 135 140

Met Ser Tyr Asn His Thr Ile Trp Ser Gln Asp Ser Ala Ser Gln Pro

145 150 155 160

Ala Gly Val Asn Lys Leu Ile Val Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Thr

165 170 175

Gln Asn Met Tyr Gly Ala Ser Gln Trp Arg Leu Pro Asn Ala Lys Ser

180 185 190

Trp Phe Ile Gly Arg Phe Ser Asn Asp Arg Val Trp Val Glu Tyr Leu

195 200 205

Ala Glu Gln Leu Lys Leu Pro Ile Tyr Asn Trp Ala Ile Gly Gly Ser

210 215 220

Ala Gly Asp Gln His Leu Val Val Pro Gly Leu Leu Gln Gln Val Glu

225 230 235 240

Ser Trp Ser Gln Tyr Met Gln Lys Ala Ala Asn Tyr Arg Pro Glu Asn

245 250 255

Thr Leu Phe Thr Met Leu Ile Gly Gly Asn Asp Leu Leu Asn Tyr Gly

260 265 270

Arg Thr Val Asp Gln Val Ile Ser Asp Gln Gly Lys Ala Leu Glu Arg

275 280 285

Ile Ile Ala Ala Gly Ala Arg His Ile Val Val Leu Asn Leu Pro Asn

290 295 300

Leu Ala Arg Thr Pro Ala Ala Gln Ala Ser Gly Lys Ala Ala Ala Leu

305 310 315 320

Ala Pro Gln Val Arg Asp Tyr Asn Ala Lys Leu Ala Leu Leu Ile Thr

325 330 335

Gln Leu Gln Gln Lys Tyr Gly Ser Thr Leu Lys Leu Asn Leu Phe Asp

340 345 350

Ser Asn Thr Leu Phe Asp Asp Leu Leu Asp His Pro Ala Lys Tyr Gln

355 360 365

Val Ser Asn Ala Thr Gln Ser Cys Leu Asp Ile Ala Gly Asn Ala Ser

370 375 380

Leu Pro Tyr Ile Trp Glu Gln Lys Pro Arg Ala Glu Cys Gly Asn Pro

385 390 395 400

Asp Ala Phe Val Phe Trp Asp Val Leu His Pro Thr Thr His Thr His

405 410 415

Lys Leu Leu Gly Gly Tyr Val Ala Asn Phe Val Lys Ala Ala Asp Pro

420 425 430

Ala Val Ser Ala Ala Ala Ala Leu Lys Ala Arg Arg

435 440

<210> 7

<211> 1482

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gaaacctcaa 120

ctgctacgcg gcctgctggc cgcggccggc ctgttcgccg ccagccaggt tcacgcccag 180

ctggacccgc aactggacta tctgtccccg ggcggcccgc tcagcgaagc ccaggtcaag 240

gccgcggcgg ccaaaccggc cgtggcgatg ggagccgcca cctacaccta tctgcgctgc 300

tattaccggc tggacatgag ccccggcaag ccgcaaacca attaccactg ggcgctggat 360

cccagcagcg gcgattacta ccgcgtcaac ggctactggt ggtccggcag catcgtcgcg 420

ctgaagaata tgttctacag cgacgtggcc caggacaccc tggccgccgt ctgccagaag 480

acgctggcgg ccaagggcct cagccgtccg gtggcactgt acgccgccgc caacaaccag 540

atgtcctaca accacaccat ctggagccag gacagcgcca gccagccggc cggcgtcaac 600

aagctgatcg tgttcggcga cagcctgtcc gacactcaga acatgtacgg cgcctcgcaa 660

tggcggctgc ccaacgccaa gagctggttc atcggccgct tcagcaacga ccgggtctgg 720

gtggaatatc tggccgaaca gctgaagctg ccgatctaca actgggcgat aggcggctcc 780

gccggcgatc agcacctggt ggtgccgggc ttgctgcagc aggtggaatc atggtcgcaa 840

tacatgcaga aagccgccaa ttaccggccg gaaaacaccc tgttcaccat gctgataggc 900

ggcaacgact tgctcaacta cggtcgcacc gtggaccagg tgataagcga tcagggcaag 960

gcgctggaac gcatcatcgc cgccggcgcg cgtcacatcg tggtgctgaa cctgcccaac 1020

ctggcccgca ccccggcggc ccaggccagc ggcaaggccg ccgcgctggc gccgcaagtg 1080

cgcgactaca acgccaagct ggcgctgcta atcacgcaat tgcagcagaa gtacggcagc 1140

acgctgaagc tgaatctgtt cgacagcaac accttgttcg acgacctgct cgaccatccg 1200

gccaagtacc aggtcagcaa cgccacccag tcctgcctgg acatcgccgg caacgccagc 1260

ctgccctata tctgggagca gaagccgcgc gcggaatgcg gcaatccgga cgccttcgtg 1320

ttctgggacg tgctgcaccc caccacccac acgcataagc tgttgggcgg ctacgtagcc 1380

aacttcgtca aggccgcgga tccggcggtc tccgccgcgg cggcgctgaa ggcgcgccgc 1440

aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact ga 1482

<210> 8

<211> 493

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Lys Pro Gln Leu Leu Arg Gly Leu Leu Ala Ala

35 40 45

Ala Gly Leu Phe Ala Ala Ser Gln Val His Ala Gln Leu Asp Pro Gln

50 55 60

Leu Asp Tyr Leu Ser Pro Gly Gly Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Lys

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ala Lys Pro Ala Val Ala Met Gly Ala Ala Thr Tyr Thr

85 90 95

Tyr Leu Arg Cys Tyr Tyr Arg Leu Asp Met Ser Pro Gly Lys Pro Gln

100 105 110

Thr Asn Tyr His Trp Ala Leu Asp Pro Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg

115 120 125

Val Asn Gly Tyr Trp Trp Ser Gly Ser Ile Val Ala Leu Lys Asn Met

130 135 140

Phe Tyr Ser Asp Val Ala Gln Asp Thr Leu Ala Ala Val Cys Gln Lys

145 150 155 160

Thr Leu Ala Ala Lys Gly Leu Ser Arg Pro Val Ala Leu Tyr Ala Ala

165 170 175

Ala Asn Asn Gln Met Ser Tyr Asn His Thr Ile Trp Ser Gln Asp Ser

180 185 190

Ala Ser Gln Pro Ala Gly Val Asn Lys Leu Ile Val Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Leu Ser Asp Thr Gln Asn Met Tyr Gly Ala Ser Gln Trp Arg Leu Pro

210 215 220

Asn Ala Lys Ser Trp Phe Ile Gly Arg Phe Ser Asn Asp Arg Val Trp

225 230 235 240

Val Glu Tyr Leu Ala Glu Gln Leu Lys Leu Pro Ile Tyr Asn Trp Ala

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Ala Gly Asp Gln His Leu Val Val Pro Gly Leu Leu

260 265 270

Gln Gln Val Glu Ser Trp Ser Gln Tyr Met Gln Lys Ala Ala Asn Tyr

275 280 285

Arg Pro Glu Asn Thr Leu Phe Thr Met Leu Ile Gly Gly Asn Asp Leu

290 295 300

Leu Asn Tyr Gly Arg Thr Val Asp Gln Val Ile Ser Asp Gln Gly Lys

305 310 315 320

Ala Leu Glu Arg Ile Ile Ala Ala Gly Ala Arg His Ile Val Val Leu

325 330 335

Asn Leu Pro Asn Leu Ala Arg Thr Pro Ala Ala Gln Ala Ser Gly Lys

340 345 350

Ala Ala Ala Leu Ala Pro Gln Val Arg Asp Tyr Asn Ala Lys Leu Ala

355 360 365

Leu Leu Ile Thr Gln Leu Gln Gln Lys Tyr Gly Ser Thr Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Leu Phe Asp Ser Asn Thr Leu Phe Asp Asp Leu Leu Asp His Pro

385 390 395 400

Ala Lys Tyr Gln Val Ser Asn Ala Thr Gln Ser Cys Leu Asp Ile Ala

405 410 415

Gly Asn Ala Ser Leu Pro Tyr Ile Trp Glu Gln Lys Pro Arg Ala Glu

420 425 430

Cys Gly Asn Pro Asp Ala Phe Val Phe Trp Asp Val Leu His Pro Thr

435 440 445

Thr His Thr His Lys Leu Leu Gly Gly Tyr Val Ala Asn Phe Val Lys

450 455 460

Ala Ala Asp Pro Ala Val Ser Ala Ala Ala Ala Leu Lys Ala Arg Arg

465 470 475 480

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

485 490

Claims

1.蛋白质CbAE，为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)从N端至C端依次包括区段1-区段12；

区段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第72至82位所示；

区段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第98至107位所示；

区段3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第109至114位所示；

区段4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第184至190位所示；

区段5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第218至224位所示；

区段6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第232至238位所示；

区段7的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第273至283位所示；

区段8的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第315至319位所示；

区段9的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第339至344位所示；

区段10的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第389至393位所示；

区段11的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第419至423位所示；

区段12的氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第425至429位所示；

2.如权利要求1所述的蛋白质CbAE，其特征在于：所述蛋白质CbAE为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

b2)氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

b3)氨基酸序列是SEQ ID NO：6所示的蛋白质；

b4)氨基酸序列是SEQ ID NO：8所示的蛋白质；

3.编码权利要求1或2所述蛋白质CbAE的核酸分子。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7)或c8)：

c1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c2)编码区是SEQ ID NO：5所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c4)核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示的DNA分子；

c5)核苷酸序列是SEQ ID NO：3所示的DNA分子；

c6)核苷酸序列是SEQ ID NO：7所示的DNA分子；

c7)与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1或2所述蛋白质CbAE的DNA分子；

c8)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2所述蛋白质CbAE的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1或2所述蛋白质CbAE的编码基因插入出发质粒，得到的重组质粒。

7.如权利要求5所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为将权利要求6所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

8.权利要求1或2所述蛋白质CbAE、或、权利要求3或4所述核酸分子的应用；为d1)-d4)中的至少一种：

d1)抑制病毒；

d2)制备用于抑制病毒的产品；

d3)抑制病毒假病毒；

d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。

9.一种产品，其含有权利要求1或2所述蛋白质CbAE、或、权利要求3或4所述核酸分子；所述产品的功能为d1)-d4)中的至少一种：

d1)抑制病毒；

d2)制备用于抑制病毒的产品；

d3)抑制病毒假病毒；

d4)制备用于抑制病毒假病毒的产品。

10.一种抑制病毒或病毒假病毒的方法，为采用权利要求1或2所述蛋白质CbAE处理病毒或病毒假病毒。

11.如权利要求8所述的应用、权利要求9所述的产品或权利要求10所述的方法，其特征在于：所述病毒为冠状病毒、HIV、DENV、ZIKV和HSV中的至少一种。

12.如权利要求11所述的应用、权利要求12所述的产品或权利要求13所述的方法，其特征在于：所述冠状病毒为SARS-CoV-2；所述DENV为DENV-2；所述HSV为HSV-1。