CN110520155A

CN110520155A - 预防和治疗寨卡病毒感染的rna药物制剂

Info

Publication number: CN110520155A
Application number: CN201880013887.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡以滨; 唐盛高; 陆阳; 关键; 路阳
Original assignee: Guangzhou Nanotides Pharmaceuticals Co ltd
Current assignee: Guangzhou Nanotides Pharmaceuticals Co ltd
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-11-29
Also published as: WO2018160690A1

Abstract

本发明提供了预防和治疗寨卡病毒感染的药物组合物，所述组合物包括siRNA或mRNA分子，以及这些分子的组合物用于治疗和预防寨卡病毒感染的方法。

Description

预防和治疗寨卡病毒感染的RNA药物制剂

相关专利申请的交叉引用

本申请旨在获得美国专利申请号62/465096的权益和优先权，该专利申请日期为2017年2月28日，其全文以引用方式并入本文中。

发明领域

本发明提供了一种新型的预防和治疗Zika病毒(ZIKV)感染的制剂，及其使用方法。

背景

寨卡病毒感染：生物学和病理学

最早于1947年在乌干达发现的寨卡病毒(包括西尼罗河病毒、登革热和基孔肯雅病毒在内的黄病毒科成员)最近引起了人们的极大兴趣，因为孕妇感染该病毒与婴儿流产或出生缺陷之间存在联系。寨卡病毒是通过被感染的伊蚊叮咬传播的。自2014年底以来，巴西观察到的传染迅速增加，2015年向巴西卫生部报告的婴儿小头畸形病例明显增加[1,2]。截至2016年11月，共报告了4100多例疑似小头畸形病例，其中许多发生在居住于寨卡病毒传播的地区或到访过被发现寨卡病毒的地区的妇女所生婴儿身上[3]。现在有证据表明，在怀孕早期感染寨卡病毒与小头畸形的发生有关。病毒感染通常只会导致患者出现轻度发烧、皮疹、结膜炎和关节痛的症状[4]。在巴西暴发的疫情中，通过逆转录-聚合酶链反应从8例患者血清中检测到寨卡病毒(ZIKV)，并通过DNA测序证实了这一结果。系统发育分析表明，该地区鉴定的ZIKV属于亚洲支系[4]。寨卡病毒感染现在已经在美国大陆佛罗里达和墨西哥湾沿岸各州被确认和证实，急需合适的预防或治疗方案。

ZIKV是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒属中的黄病毒科。ZIKV的基因组由大约10万个核苷酸组成，编码至少三种结构蛋白(衣壳(C)、膜(prM；加工成M)和包膜(E))以及七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在ZIKV中，单个ORF(开放阅读框)的两侧分别为5’-和3’-非翻译区域(UTR)(图1)。5’-和3’-UTR内都有若干个额外的RNA元件，这些元件在调节mRNA翻译中发挥重要作用，是病毒RNA复制以及与病毒和细胞蛋白相互作用所必需的。3’-UTR的RNA元件极大地增强了病毒RNA的合成。ZIKV感染起始于ZIKV病毒粒子表面的包膜(E)糖蛋白与宿主细胞受体如AXL的结合，多种中和抗体都可以靶向该E蛋白区域[5]。ZIKV通过内吞作用进入宿主细胞，在融合环驱动下病毒-宿主膜融合后，其基因组从内吞体逃逸到细胞质中。在细胞质中，病毒基因组首先被转化为一个大的多聚蛋白体，然后被宿主信号肽酶和病毒丝氨酸蛋白酶(在翻译过程中和翻译后)切割，生成各种病毒。同样也是在细胞质中，正链RNA基因组产生负链RNA模板以生成新的病毒基因组拷贝。

AXL是受体酪氨酸激酶亚家族的成员，已被鉴定为ZIKV结合的主要受体。研究表明，阻断或沉默AXL可显着降低成纤维细胞和肺泡上皮细胞中ZIKV的复制[6]。AXL的功能包括通过结合生长因子如维生素K依赖的蛋白质生长停滞特异性基因6(GAS6)将信号从细胞外基质传递到细胞质，同时还参与刺激细胞增殖。AXL广泛分布于人类不同类型的细胞中。

寨卡病毒株及同源性分析

对于具有活性的预防性或治疗性药物来说，重要的是确保它能够针对广泛的(如果不是所有的)病毒株发挥作用。我们使用生物信息学来识别大量毒株的序列同一性的区域，这些区域将被用作疫苗的表位或治疗性siRNA开发的靶点。

ZIKV从20世纪50年代已经开始在非洲和亚洲传播。Haddow等人测定了1947年至2010年收集的来自柬埔寨、马来西亚、尼日利亚、乌干达和塞内加尔的五个分离物的开放阅读框的核苷酸序列。利用这些(和以前发表的)ZIKV序列进行系统发育分析，作者确定了两个主要病毒谱系(非洲和亚洲)的存在[7]。2013年，Baronti等人获得了属于亚洲血统的寨卡病毒株的完整编码序列，该毒株是从法属波利尼西亚的一名感染患者中分离出来的。根据核苷酸和氨基酸序列组成，非洲和亚洲菌株的差异最大，而同一地理区域内的菌株差异最小[8]。目前已经对38个以上的菌株进行了测序，均可以将其归入非洲或亚洲的谱系。

mRNA疫苗的优势

作为指定编码蛋白质氨基酸序列的遗传信息的载体，mRNA是一种无毒分子，允许在几乎所有可转导的细胞类型中瞬时表达所需的蛋白质产品。与传统的质粒和基于病毒的方法相比，这种方法允许设计患者个性化的mRNA，也因不需要穿过细胞核膜(而DNA需要穿过核膜进入细胞和)而受益，因此几乎没有基因组整合的风险。mRNA疫苗也被证明在非常年轻和非常年老的小鼠中都显示非常高的免疫原性。如果转化为人类，那么这将是有益的，因为这些人群通常不会对疫苗产生强大的免疫反应。

最近，自我扩增的mRNA疫苗已被证明对其他病毒(如流感)是安全有效的。如何在婴儿和老年人中产生强大的免疫反应一直是流感疫苗的一个问题。然而，mRNA疫苗可能在这方面具有显著优势，因为它们已经被证明可以诱导对甲型流感病毒感染的平衡、长时间的保护性免疫，即使是非常年轻和非常老的小鼠也是如此。基于mRNA或RNA复制子的疫苗也被证明在多种动物模型中具有免疫原性，包括非人灵长类动物[10]。

针对ZIKV的mRNA疫苗的靶标选择

在所有ZIKV蛋白中，E蛋白负责宿主细胞受体结合和病毒进入细胞。因此，E蛋白是研制中和抗体的主要靶点。ZIKV E蛋白包含三个不同的结构域(如图1C所示)：一个中心β–桶状结构域(结构域Ⅰ；aa.1-51、132-192和280-295)，一个扩展的二聚结构域(结构域Ⅱ；aa.52-131和193-279)和一个免疫球蛋白样结构域(结构域Ⅲ；aa.297-406)(图1C)[5]。融合环是位于结构域Ⅱ(a.98-109)中的疏水序列，负责病毒-宿主膜融合过程中pH依赖的构象变化。一些免疫学研究表明，E蛋白的结构域Ⅲ含有一些可被黄病毒特异性中和单抗(mAb)识别的决定簇[5]。针对融合环的交叉中和mAb(在结构域Ⅱ中)表现出较低的亲和力(表1)。这些类型特异性mAb的保护效率已在动物模型中得到证实。然而，ZIKV和登革热病毒(DENV)具有相似的特性，即针对病毒特定区域的抗体(例如，包膜蛋白结构域Ⅱ的融合环)可以刺激免疫反应的抗体依赖增强效应(当非中和抗病毒蛋白促进病毒进入宿主细胞后，增加了这些细胞被感染的几率，从而导致更高的病毒血症和更严重的症状)。有些人由于跨血清型免疫反应(ADE)而患上更严重的DENV感染或ADE。当这类病人被不同DENV血清型(总共4种血清型)的病毒感染时，旧毒株的抗体干扰了对新毒株的免疫反应，并导致更多的病毒进入细胞[11]。

siRNA：预防和治疗ZIKA病毒感染的灵活分子平台

RNA干扰(RNAi)是一种自然发生的、高度特异性的基因调控模式，在基础研究和治疗药物开发方面具有广泛的潜在应用。RNAi的机制既是精准的，也是高度特异性的。在开始时，短(19-21bp)双链RNA序列(称为短干扰RNA，siRNA)与细胞质内的RNA干扰沉默复合物(RISC)结合。然后，产生的核糖核蛋白复合体在细胞质中转录出来的信使RNA(mRNA)群体中搜索互补序列，最终导致这些转录本的降解(和/或减弱翻译)，从而有效地下调靶基因的表达。

科学家们已经采用了内源性RNAi机制来开展各种研究，包括基因功能分析、通路图谱、药物靶点验证和宿主-病原体相互作用研究。由于siRNA可以设计成几乎针对任何基因，并且可以通过多种方法导入细胞，因此RNAi代表了一个高度灵活的技术平台，研究人员和临床医生可以通过这个平台控制疾病，包括传染病。

RNA干扰曾被用于针对一系列人类致病病毒，包括HIV、肝炎、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、SARS冠状病毒、马尔堡、登革热、口蹄疫和流感。快速预测具有抗病毒效力的siRNA序列的优势以及相同长度的siRNA显示相似的分子量、电荷和疏水性的特性，与高效纳米颗粒输送系统相结合，这些纳米颗粒输送系统可携带与被靶向的序列无关的多种siRNA，使得RNAi成为应对新出现的病毒威胁的武库中有价值的工具，并且可以作为其他治疗策略例如疫苗和小分子治疗的中介选项，已经被开发和验证。此外，RNAi具有(1)在不依赖于宿主免疫功能的情况下有效地限制病毒复制的能力，以及(2)同时瞄准多个基因和/或序列，使其成为寨卡病毒(可能需要针对大量菌株，而目前没有其他治疗方法)或对抗其他基因组变异非常迅速的病毒(如流感)的理想治疗方法。

针对ZIKV的治疗性siRNA的靶点选择

通过对靶向28个已测序的寨卡病毒菌株(包括非洲和亚洲血统)的siRNA进行递归分析，我们确定了能够覆盖大量毒株的siRNA(表2)。此外，仔细筛选之后，可以确定多个完全覆盖我们预测中使用的所有毒株的siRNA(表3)。

结合2个siRNA序列可以提供100％的覆盖率，如结合siRNA#62和siRNA#62A(表3)。然而，在我们的流感研究中，我们发现针对病毒基因组不同区域的siRNA与针对同一基因的多个siRNA相比，可以产生协同抑制和抗病毒的功效。因此，虽然我们可以看到某些组合可以完全覆盖所有毒株，但针对病毒不同区域的组合(如13和62)对所选毒株的效力更高。通过比较表1所示的siRNA组合，我们可以确定每个组合的相对效力，并将其与62和62A或62A和63的组合进行比较(针对所有菌株)。如果我们看到效力的显著增加，2种siRNA的联合可以提供100％的覆盖率，如联合siRNA#62和siRNA#62a。然而，在我们的流感研究中，我们发现针对病毒基因组不同区域的siRNA与针对同一基因的多个siRNA相比，可以产生协同抑制效应和抗病毒功效。因此，虽然我们可以看到某些组合对所有毒株的完全覆盖，但我们可以看到针对病毒不同区域的组合(如13和62)对所选毒株的效力更高。通过比较表1所示的siRNA组合，我们可以确定每种组合的相对效力，并将其与62和62A或62A和63的组合进行比较(针对所有毒株，表3)。

图片简要说明

图1.开发预防和治疗寨卡病毒感染的RNA的分子基础和策略。ZIKV是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒属中的黄病毒科。ZIKV基因组含有约10K的核苷酸，编码至少三个结构蛋白(衣壳(C)、膜(prM；加工成M)和包膜(E))以及七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在ZIKV中，单个ORF(开放阅读框)的两侧分别为5’-和3’-非翻译区域(UTR)。在所有ZIKV蛋白中，E蛋白负责与宿主细胞受体结合以及病毒进入细胞，因此E蛋白是一个开发中和抗体的主要靶标。ZIKV E蛋白包含三个不同的结构域(如图1所示)：一个中心β–桶状结构域(结构域Ⅰ；aa.1-51、132-192和280-295)，一个扩展的二聚结构域(结构域Ⅱ；aa.52-131和193-279)和一个免疫球蛋白样结构域(结构域Ⅲ；aa.297-406)。

图2.组氨酸-赖氨酸共聚物增强siRNA在体内的局部和皮下导入。(A)HKP/siRNA能够自组装形成纳米颗粒(平均直径150nm)。(B)纳米颗粒可以溶解在水溶液中，可以冷冻形成干粉，也可以复溶并与甲基纤维素混合，或溶于无RNAse(RNA酶)的水中。(C)HKP/siRNA纳米颗粒导入小鼠呼吸道：上呼吸道、支气管、肺泡。

图3.比较HKP、DOTAP和D5W用于口腔呼吸管导入三个不同剂量的siRNA对肺内皮基因的敲低效果。20μg剂量的HKP显示最有效的siRNA介导的对靶标基因的敲低作用。

图4.腹腔注射导入PAA-siRNA制剂对H1N1病毒感染的小鼠(N＝15)显示治疗效力。在第1天(红色箭头)通过鼻内给予1×LD₅₀剂量的H1N1(A/California/04/2009)后分成病毒感染(未治疗)组、达菲组和siRNA治疗组。采用PAA-siRNA制剂(siRNA89-siRNA103以1:1混合)，以1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的剂量，第2-6天(黑色箭头)每天腹膜内给药，治疗H1N1感染的小鼠。达菲以25mg/kg的剂量采用相同的给药途径治疗H1N1感染小鼠。10mg/kg的PAA-siRNA治疗效果与25mg/kg的达菲相同。

图5.精胺-脂类共轭物(SLiC)的结构。五个分子中每个的合成路线含有特定的脂质链，如R₁、R₂、R₃、R₄和R₅分别偶联到R₁H、R₂H、R₃H、R₄H和R₅H位置。五种SLiC的结构都含有一个精胺“头部”和两个脂质“腿部”。

图6.SLiC脂质体介导的siRNA体内导入实现基因沉默。采用TM4包裹的特异性靶向亲环素B(cyclophilin B)的siRNA在Balb/c小鼠模型中以呼吸道给药进行测试。除了空白对照和空TM4对照，HKP包裹的cyclophilin B siRNA作为阳性对照。测试三种不同剂量：25、40和50μg。40和50μg的siRNA都取得显著的靶标基因沉默效果(N＝3，*P<0.05)。

图7.评估HKP-siRNA纳米颗粒导入后小鼠肺部的细胞因子反应。不同剂量的HKP-siRNA通过气管内给药进入肺部，收集整个肺组织，分离蛋白并通过ELISA方法检测细胞因子含量。

图8.A.根据内部的SOP(Lowry法)建立检测IFN-α浓度的标准曲线。B.测定每个样品的IFN-α浓度并用总蛋白进行校正。

图9.采用DDS或Lipofectamine MessengerMAX试剂(Thermo Fisher)将GFP的mRNA导入Hela或HepG2细胞。细胞以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基稀释，将5×10⁴个细胞接种到24孔板的每个孔内。第二天按如下步骤准备转染复合物：25μl的Opti-MEM培养基稀释GFP mRNA(0.5μg)，然后加入25μl的Opti-MEM培养基稀释的DDS(2μg)或LipofectamineMessengerMAX。混合物放置30分钟(mGFP/DDS)或10分钟(mGFP/LipofectamineMessengerMAX)后加入到培养孔内。转染后24小时采用Zeiss Axiovert倒置荧光显微镜拍摄荧光照片。

发明详细描述

本发明提供了包含siRNA或mRNA序列的RNA药物制剂，用于预防和治疗寨卡病毒感染。一种制剂包含靶向病毒基因组RNA和mRNA的siRNA序列和载体，用于抑制病毒活性，例如组氨酸——赖氨酸共聚物(HKP)或精胺-脂质体共轭物(SLiC)。另一种制剂包含编码对寨卡病毒感染和复制关键性病毒蛋白的mRNA序列，和用作扩增宿主内针对寨卡病毒的免疫应答的佐剂的载体。本发明还提供了用于预防和治疗寨卡病毒感染的药物制剂的方法。

siRNA分子

如本文所用，“siRNA分子”或“siRNA双链”是双链寡核苷酸，其是短的双链多核苷酸，其在分子被导入细胞后干扰细胞中基因的表达或干扰病毒基因的表达。例如，它靶向并结合单链(ss)靶RNA分子中的互补核苷酸序列。通过本领域技术人员已知的技术化学合成或以其他方式构建siRNA分子。这些技术描述于美国专利(美国专利号5898031、6107094、6506559和7056704)和欧洲专利(欧洲专利号1214945和1230375)，其全部内容通过引用并入本文。按照惯例，当通过特定核苷酸序列鉴定siRNA分子时，该序列是指双链体分子的有义链。

包含该分子的一种或多种核糖核苷酸可以通过本领域已知的技术进行化学修饰。除了在其一个或多个单核苷酸的水平上进行修饰外，还可以修饰寡核苷酸的主链。另外的修饰包括使用小分子(例如糖分子)、氨基酸、肽、胆固醇和其他大分子结合到siRNA分子上。

本发明的siRNA分子靶向ZIKV基因组的保守区域。如本文所用，“靶”是指该分子与ZIKV基因中的互补核苷酸序列结合，该基因是RNA分子，或者它与该基因产生的mRNA结合。它抑制或沉默病毒基因的表达和/或其复制。如本文所用，ZIKV基因的“保守区域”是在多于一种病毒株中发现的核苷酸序列，在毒株中是相同的，很少突变，并且对于病毒感染和/或复制和/或从感染细胞中释放至关重要。

在一个实施方案中，基因组的靶向保守区包含编码包膜蛋白或非结构蛋白NS1、NS3、NS4B或NS5的序列。因此，siRNA分子可以靶向包膜基因表达，NS1基因表达，NS3基因表达，NS4B基因表达或NS5基因表达。

在另一个实施方案中，基因组的靶向保守区是病毒的3'非翻译区(3'-UTR)。因此，siRNA分子可以靶向3'-UTR。

在一个实施方案中，siRNA分子是双链寡核苷酸，其长度为约19至约29个碱基对。在该实施方案的一个方面中，该分子是长度为19至21个碱基对的双链寡核苷酸。在该实施方案的另一个方面中，它是具有25个碱基对长度的双链寡核苷酸。在所有这些方面，分子可以在两端具有平末端，或者在两端具有突出端的粘性末端(不成对的碱基延伸超过主链)，或者在一端具有平末端而在另一端具有粘性末端。在一个特定方面，它在两端具有平末端。在另一个特定方面，该分子具有25个碱基对(25聚体)的长度并且在两端具有平末端。在另一个特定方面，siRNA分子是表4中鉴定的其中之一。

本发明的siRNA分子还包括衍生自表4中列出的或本文公开的那些的siRNA分子。衍生的分子可以具有少于每个分子所示的25个碱基对，低至17个碱基对，只要保留“核心”连续碱基对即可。也就是说，一旦给出本文所示的特定序列，本领域技术人员可以合成分子，其实际上以任何顺序从一端或两端“去除”一个或多个碱基对，留下剩余的连续碱基对，产生如果以25个碱基对分子开始，则长度为24、23、22、21、20、19、18或17个碱基对的较短分子。例如，表4中公开的25聚体分子的衍生分子包括：a)任何一种或多种分子的24个连续碱基对；b)任何一种或多种分子的23个连续碱基对；c)任何一种或多种分子的22个连续碱基对；b)任何一种或多种分子的21个连续碱基对；d)任何一种或多种分子的20个连续碱基对；e)任何一种或多种分子的19个连续碱基对；f)任何一种或多种分子的18个连续碱基对；g)任何一个或多个分子的17个连续碱基对。不期望短于17个碱基对的分子具有足够的活性或足够低的脱靶效应而不具有药学上的用途；但是，如果有任何这样的构建体，它们将是本发明范围内的等同物。

或者，衍生的分子可以具有多于每个分子所示的25个碱基对，只要保留最初的25个连续碱基对即可。也就是说，一旦给出本文公开的特定序列，本领域技术人员可以合成分子，其实际上以任何顺序将一个或多个碱基对“添加”到任一或两个末端，产生26个或更多个碱基的分子，并包含原始的25个连续碱基对。

包含一种或多种siRNA分子的药物组合物

本发明包括药组合物，其包含靶向ZIKV基因组的保守区域的siRNA分子和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，载体使分子缩合以形成纳米颗粒。或者，可将组合物配制成纳米颗粒。可将组合物冻干成干粉。在一个具体实施方案中，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒。

在一个实施方案中，组合物包含至少两种不同的siRNA分子，其靶向ZIKV基因组的一个或多个保守区域和药学上可接受的载体。此类组合物有时在本文中称为混合物(“鸡尾酒”)。在该实施方案的一个方面，ZIKV的保守区域中的基因序列对哺乳动物的病毒感染是关键的。在该实施方案的另一个方面，哺乳动物是人，啮齿动物(例如大鼠，小鼠或豚鼠)，雪貂或非人灵长类动物(例如猴)。在另一方面，哺乳动物为人类。

该组合物可包括一种或多种另外的siRNA分子，其靶向ZIKV基因组的其他保守区域。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的包膜蛋白(E蛋白)基因的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子选自：

ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU，

ZIKV14：CCUUGACAAGCAAUCAGACACUCAA，和

ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的NS1基因的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子包含ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的NS3基因的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子选自：

ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA，

ZIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU，

ZIKV62A：CCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAAU，和

ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的NS4B基因的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子包含ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的NS5基因的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子包含ZIKV103：GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA。

在一个实施方案中，组合物包含靶向ZIKV基因组的3'-UTR区的siRNA分子。在该实施方案的一个方面，分子包含：ZIKV105：CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

在另一个实施方案中，组合物包含混合物MSTZIKV13，其中第一siRNA分子包含ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU，第二siRNA分子包含ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA。

在另一个实施方案中，组合物包含混合物MSTZIKV62，其中第一siRNA分子包含ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA，第二siRNA分子包含ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU。

在另一个实施方案中，组合物包含混合物MSTZIKV62B，其中第一siRNA分子包含ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA，第二siRNA分子包含ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA。

在另一个实施方案中，组合物包含混合物MSTZIKV103，其中第一siRNA分子包含ZIKV103：GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA，第二siRNA分子包含KIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU，第三siRNA分子包含ZIKV105：CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

在所有这些实施方案的一个方面，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒。

在所有这些实施方案的一个方面，siRNA分子包含25体平末端siRNA分子，并且载体包含组氨酸-赖氨酸共聚物或精胺-脂质缀合物(SLiC)和胆固醇。

药学上可接受的siRNA分子的载体

药学上可接受的载体包括盐水、糖、多肽、聚合物、脂质、乳膏、凝胶、胶束材料和金属纳米颗粒。在一个实施方案中，载体包含以下中的至少一种：葡萄糖溶液、聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水性聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水性聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物、配体官能化-亲水性聚合物接枝聚合物和配体官能化脂质体。在另一个实施方案中，聚合物包含可生物降解的组氨酸-赖氨酸聚合物，可生物降解的聚酯，例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)、聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物、阳离子脂质或聚乙二醇化PEI。阳离子脂质包括DOTAP、DOPE、DC-Chol/DOPE、DOTMA和DOTMA/DOPE。

在一个实施方案中，载体是聚合物。在该实施方案的一个方面，聚合物包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。这种共聚物描述于美国专美国专利号7070807B2、7163695B2和7772201B2，其全部内容通过引用并入本文。在该实施方案的一个方面，HKP与siRNA分子形成纳米颗粒，其中纳米颗粒的直径为约100nm至约400nm。在该实施方案的另一个方面，HKP包含结构(R)K(R))-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，K＝赖氨酸，和H＝组氨酸。在另一个方面，HKP和siRNA分子自组装成纳米颗粒或可以配制成纳米颗粒。

在另一个实施方案中，载体是脂质体。在该实施方案的一个方面，脂质体包含与胆固醇缀合的阳离子脂质。在另一方面，阳离子脂质包含精胺头和一个或两个油醇尾。在另一方面，脂质体包含精胺-脂质体-缀合物(SLiC)和胆固醇。此类分子的实例在图5中公开。在另一方面，脂质体和siRNA分子自组装成纳米颗粒或可配制成纳米颗粒。

使用药物组合物的方法

本发明还包括使用siRNA分子和含有它们的药物组合物预防或治疗ZIKV疾病的方法。如本文所用，“治疗”或“治疗”是指降低ZIKV疾病的严重程度或治愈ZIKV疾病。将治疗有效量的本发明组合物给予哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人，啮齿动物(例如大鼠，小鼠或豚鼠)，雪貂或非人灵长类动物(例如猴)。在该实施方案的一个方面，哺乳动物是实验动物，例如啮齿动物。在该实施方案的另一个方面，哺乳动物是非人灵长类动物，例如猴子。在该实施方案的另一个方面，哺乳动物是人。如本文所用，“治疗有效量”是预防，降低ZIKV疾病的严重性或治愈ZIKV疾病的量。鉴于本文包含的教导，这些量可由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，给予人的治疗有效量的药物组合物包含每千克人体重约1mg的siRNA分子至每千克人体重约5mg的siRNA分子。

鉴于本文包含的给药，给药途径可由本领域技术人员确定。这些途径包括鼻内给药和气道滴注，例如通过使用气道雾化器。这些途径还包括注射滴注和腹膜内，静脉内，皮内，阴道内和皮下给药。

mRNA疫苗

本发明提供了一种疫苗，其包括由ZIKV基因组的保守区域编码的氨基酸序列所对应的mRNA分子和包括符合要学要求的聚合物或脂质体。如这里所述的，ZIKV基因的“保守区域”是在多个毒株中都有的病毒核苷酸序列，在毒株之间是相同的，很少突变，并且对于病毒感染和/或复制和/或从受感染细胞释放是关键的。在一个实施例中，ZIKV基因组的保守区域中的基因序列对于哺乳动物的病毒感染是关键的。在另一个实施例中，基因组的保守区域包括编码ZIKV的包膜蛋白的基因序列。在本实施例的一个方面，基因序列编码包膜蛋白的结构域Ⅱ内的氨基酸序列。

在一个实施例中，聚合物包括组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。在本实施例的一个方面，HKP和mRNA分子自组装成纳米颗粒，在本实施例的另一个方面，HKP和mRNA分子被配制成纳米颗粒。

在一个实施例中，脂质体包括精胺-脂质共轭物(SLiC)和胆固醇，在本实施例的一个方面中，SLiC和胆固醇以及siRNA自组装成纳米颗粒。在本实施例的另一个方面，SLiC和胆固醇和mRNA分子被配制成纳米颗粒，SLiC和胆固醇还充当用于放大免疫反应的佐剂。

mRNA疫苗的使用

本发明的mRNA疫苗用于防止ZIKV感染或降低其严重性，因此，本发明包括预防或降低哺乳动物中ZIKV感染的严重程度的方法，包括在感染之前给哺乳动物注射治疗有效量的疫苗。通过滴注或皮内注射、静脉注射、阴道内给药或皮下给药。在一个实施例中，哺乳动物是人类、啮齿动物(如大鼠、老鼠或豚鼠)、雪貂或非人灵长类动物(如猴子)。在本实施例的一个方面中，哺乳动物是实验动物，例如啮齿动物，在本实施例的另一个方面中，哺乳动物是非人灵长类动物，例如猴子，在本实施例的另一个方面中，哺乳动物是人类。

以下实施例说明了本发明的某些方面，并且不应被解释为本发明的内容只限于这些实施例所述的内容。

具体实施例1：设计针对ZIKV包膜蛋白的mRNA

在所有ZIKV蛋白中，E蛋白是开发中和抗体的主要靶点。ZIKV的E蛋白包含三个不同的结构域(如图1所示)。我们选择病毒包膜的结构域Ⅱ区序列作为mRNA疫苗的免疫原性区域(表1)。我们使用BLAST搜索来识别结构域Ⅲ中的一个区域，该区域应该提供必要的免疫反应，而不会诱导抗体依赖增强效应(ADE)以响应其他黄病毒(例如DENV；附录1)。为了避免ADE，我们放弃了结构域Ⅱ，因为这个区域与DENV共有的区域具有很高的同源性(附录1)。

具体实施例2：mRNA体外转染细胞并测定mRNA表达

使用各种商用转染剂将含有ZIKV包膜结构域Ⅱ的mRNA的载体转染到人细胞中，用于这些研究的细胞包括HEK293T、Vero细胞、A549细胞等。我们还将检查电穿孔(使用MaxCyte技术)作为备用的转染方法。各种转染过程的目的是确定哪种导入方法可以将载体有效导入细胞内，并观察后续的蛋白表达情况。目的是确定每个结构的蛋白质产量，并确定产品是否从细胞分泌。这个过程不一定是临床上可行的导入过程。将使用SmartFlare探针(Millipore)或通过使用Q-RIT-PCR方法在活细胞中检测mRNA，以GFP mRNA作为阳性对照(图9)。

具体实施例3：使用SmartFlare技术检测mRNA进入细胞的情况

这些智能耀斑(SmartFlare)是带有序列的珠子，当识别细胞中的RNA序列时，会产生荧光增强信号。Smartflare将针对结构的几个特定区域进行设计，以防空间阻碍减少来自单独一个区域的信号。

具体实施例4：检测培养基中的蛋白质表达

mRNA表达载体所表达的蛋白质将通过RPHPLC使用分析柱C18(2S0 mm x 2.1mm；Phenomenex)进行鉴定和定量。蛋白质检测将使用双波长检测器。随时间调整0.1％的TFA/乙腈的梯度，以使蛋白质峰的充分分离。在初始实验中，收集样品进行质谱分析以确定预期序列是否存在。使用蛋白质测序进行比较分泌的产物和细胞内生成的产物。为了减轻样品的酶降解，我们将在培养基和多个孔的浓缩培养基中加入酶抑制剂，以便在HPLC上检测产物。

具体实施例5：采用CPE实验检测抗寨卡病毒siRNA的效力

待测的siRNA将提供给Immuquest(Frederick，MD)进行Zika CPE分析。我们首先通过比较多种商业和专有导入试剂(包括脂质体、寡聚体、精胺和PEG-PEI)优化siRNA输送到本研究使用的细胞(Vero细胞)的条件。这些实验将使用针对持家基因的siRNA，结合qRTPCR方法测量来显示每个配方的沉默效果。然后，优化的配方将用于在CPE试验中检查所设计的siRNA对寨卡病毒的效力。在这个实验中，对照和待测siRNA将在病毒感染之前的特定时间间隔进行转染，并通过检查CPE值的变化来监测对病毒的抑制效果。在同一导入系统中采用不同剂量的试验和控制siRNA，这些材料将以实验者不知情的单盲方式提供。

具体实施例6：确定导入效果最佳的纳米颗粒

我们已经开发了几种不同种类的纳米颗粒用于mRNA/siRNA的导入。这些包括支链多肽(例如组氨酸-赖氨酸聚合物或HKP)和各种衍生物，如HKP，为实现组织特异性导入而采用靶向配体进行了修饰，或进行聚乙二醇化(PEGylated)，以便通过阴道粘膜而吸收。我们已经使用这些制剂在开放性伤口实现良好的局部给药效果，并系统地给各种肿瘤以及肺和肝的特定靶向给药(避免被库普弗细胞摄取)。我们还开发了精胺/亚精胺共聚物载体和类似HKP的脂质体导入系统，以保护siRNA并向组织提供高效导入。评价mRNA/siRNA-纳米颗粒在细胞培养中的生物活性，同时评估各种肽/脂质制剂与单一siRNA或针对不同靶点的siRNA组合形成纳米颗粒的能力。与核酸的结合将通过凝胶电泳进行评估。为评估纳米颗粒特征，将通过使用DLS(动态光散射)测定其粒度，使用纳米颗粒大小/电荷仪器(马尔文仪器D9000)测量颗粒的电荷/尺寸分布。纳米颗粒的形态/尺寸分布将通过电子显微镜(TEM)进行确认。在实施体内研究之前，这些分子的生物活性将在细胞培养中进行评估。在不同的N/P(氮/磷比)比下形成的颗粒将在2种不同的细胞系中测试它们导入荧光标记的siRNA的能力。

我们将检查HKP和其他纳米颗粒将荧光标记的mRNA或siRNA输送到AG129小鼠组织中的能力。然后，我们将通过抑制这些局部细胞中的持家基因(如GAPDH)来证明疗效。这些实验将确定mRNA或siRNA渗透到周围组织的程度。表征导入载体特性的研究将包括1)生物物理性质；2)mRNA和siRNA的体外导入效率；3)小鼠的导入效率和毒性；4)siRNA介导的基因抑制在寨卡病毒感染小鼠中的有效性。

具体实施例7：SLiC/mRNA/siRNA纳米颗粒SLiC脂质体制备

首先尝试用新的SLiC分子合成方法进行常规的脂质体制备，如薄膜法、溶剂注射法等，但不太成功。Norbert Maurer等人报道了一种制备脂质体的方法，其中siRNA或寡核苷酸溶液将在旋涡震荡下缓慢地添加到脂质体的50％乙醇溶液(v/v)中，然后通过透析去除乙醇。由此得到的纳米颗粒粒径小且大小均匀。在这种方法中，mRNA和siRNA在形成脂质体的过程中被阳离子脂质直接包裹，而在大多数其他方法中，mRNA或siRNA则是被装载(或包裹)到预先形成的脂质体中，例如Lipofectamine 2000。

溶解在乙醇中的脂质体处于所谓的亚稳态状态，在这种状态下，脂质体不太稳定，容易聚集。为此，我们将使用改进的Norbert Maurer的方法制备未加载或预先形成的脂质体(Maurer N.A.,Mori,L,Palmer,M.A.,Monck,K.W.C.,Mok B.,Mui,Q.F.,Akhong和P.R.,Cullis.1999.基于脂质体的基因药物细胞内导入系统.分子膜生物学.16,129-140，在此全文引用作为参考)。我们发现，只要简单地将乙醇稀释到12.5％(v/v)的最终浓度，就可以得到稳定的脂质体溶液。将溶解于乙醇中的脂类(阳离子SLiC/胆固醇，50:50，mol％)添加到无菌水(dd-H₂O)中，制备脂质体。在快速混合条件下，将乙醇脂质溶液缓慢加入。

缓慢添加乙醇和快速混合是成功制备SLiC脂质体的关键，因为该过程允许形成更小且更均匀的脂质体。与在脂质体制备过程中加载mRNA或siRNA并在制备结束时去除乙醇或其他溶剂的传统方法不同，我们的SLiC脂质体是在溶液中仍有剩余乙醇的情况下制备的，因此脂质体被认为仍处于亚稳态状态。当mRNA或siRNA溶液与阳离子脂质体溶液混合/装载时，脂质与阴离子siRNA相互作用并浓缩形成核心。SLiC脂质体的亚稳态有助于或促进脂质体结构转化为更有效地捕获mRNA或siRNA。由于mRNA/siIRNA进入脂质体，SLiC脂质体变得更加致密和均匀。

SLiC脂质体的理化表征

在脂质体形成后，我们开发了一系列的测定方法来表征SLiC脂质体的理化性质，包括粒径、表面电位、形态学研究、mRNA或siRNA的加载效率和生物活性等。用纳米ZS ZetaSizer(英国马尔文仪器公司)测定了SLiC脂质体的大小和电位。当乙醇含量从50％降低到25％甚至12.5％时，新合成的SLiC脂质体都要进行颗粒大小和zeta电位测定。数据来源于不同乙醇含量的配方。所有SLiC脂质体均按1mg/ml的浓度制备，再装载siRNA(2:1，w/w)。每种SLiC脂质体，例如TM2(12.5)，均由阳离子SLiC和胆固醇组成，溶解在12.5％的乙醇中。三次连续测量的平均粒径和三次连续测量的平均zeta电位如表5所示。

对SLiC脂质体理化参数的进一步分析表明，乙醇浓度与粒径成正比(乙醇浓度越低，粒径越小)，但与zeta电位呈负相关(乙醇浓度越低，zeta电位同时越高)。较高的表面电位将使颗粒在溶液中更稳定。除了在溶液中的稳定性，随后也有数据表明，乙醇浓度越低，毒性越低。因此，为了综合所有因素，选择12.5％(v/v)浓度的乙醇作为溶剂，将胆固醇和SLiC悬浮到主工作溶液中，然后再用于制备脂质体制剂。

与单独的脂质体配方相比，脂质体在2:1(w/w)下加载mRNA或siRNA后，其粒径变得更小，粒径在110-190nm范围内，PDI(多分散系数)值更低。之所以会如此，一般认为，脂质体的结构会使mRNA或siRNA通过静电力装载到脂质体或与脂质体相互作用，脂质体包裹mRNA或siRNA形成球形颗粒，以降低表面张力。结果，脂质体的粒径在加载mRNA或siRNA后变得更小。用mRNA或siRNA配制的脂质体也具有较低的表面电荷，这可能是一位内装载mRNA或siRNA后的中和效应来解释。

具体实施例8：mRNA疫苗的小鼠模型研究

为了研究mRNA疫苗在体内对ZIKV感染的保护作用，以AG129小鼠为动物模型。我们将在生物安全等级2级条件下进行所有小鼠研究。

在这项研究开始时，所有AG129小鼠都是五周龄大。预防组20只，尾静脉注射HKP-SLiC纳米颗粒系统包裹的mRNA组合物。对照组20只，注射PBS。14天后收集所有小鼠血清，预防组和对照组小鼠均静脉注射ZIKV。

所有小鼠每天称量体重，计算每组的存活率。感染后第1、3、5、7、9和14天分离血清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。感染后24和72小时收集包括睾丸、脾脏、肝脏、心脏、脑和肾脏等器官的组织，提取组织中的总RNA，并用一步法定量实时PCR和5’-RACE实验进行检测。血清和组织中的病毒效价采用Vero细胞进行系列稀释后测定。通过比较治疗组和对照组的结果，评估siRNA治疗药物的抗病毒效力。

具体实施例9：抗ZIKV感染的siRNA设计

通过对28个已测序的寨卡病毒株(包括非洲和亚洲株系)进行siRNA的递归分析，我们确定了能够覆盖大量毒株的siRNA(表2)。此外，仔细选择多个siRNA，则可以完全覆盖我们预测中使用的所有毒株(表3)。

进一步的序列分析表明，11条选定的抗ZIKV siRNA针对所有ZIKV株中的包膜(E)蛋白、非结构蛋白NS1、NS3、NS4B、NS5和3’-UTR的高度同源区(表4和图1)。如果ZIKV的mRNA翻译和基因组复制像DENV一样并发生在细胞质中，那么siRNA候选应该有效地降解ZIKV中病毒RNA的正链和负链。

具体实施例10：基于细胞培养的有效抗ZIKV siRNA寡核苷酸的筛选

siRNA将使用报告子实验来测试其对靶基因的抑制活性，将预期被抑制的ZIKV基因组区域整合到表达载体中。将一个合适的ZIKV基因片段克隆到psiCheck^TM-2(Promega)内。用报告质粒和siRNA共转染细胞，用萤火虫(Firefly)荧光素酶(转染效率对照)来校正海肾(Renilla)荧光素酶的表达。我们通过将含有报告子结构的质粒转染细胞，然后给予siRNA，并在24、48和72小时后监测报告子的输出量，使用RTPCR来检测siRNA(单独和组合)抑制其各自靶标序列的能力。具体地说，用20nM的单个siRNA转染Vero细胞，并用ZIKV毒株感染(转染后5小时)。在感染后24或48小时，将使用标准方案(RT-PCR)对病毒基因组进行全局表达谱分析和病毒滴度测定。高活性的siRNA将通过siRNA的剂量效应分析来进一步验证。

具体实施例11：鉴别siRNA的有效组合以提高毒株覆盖率

使用与实施例10中使用的那些相似的实验条件，我们通过CPE实验分析多种siRNA混合物的效力。根据siRNA的效力以及寨卡病毒毒株之间的重叠程度来选择要包含在混合物中的siRNA。基本上，我们认为，根据CPE实验和/或毒株覆盖分析(对于电位相等的组合物，菌株覆盖率将是唯一的选择标准)，表1所示的组合物适合后续通过体内测试来鉴别合适的组合物。我们将通过在沉默和抑制病毒基因方面表现出最大功效来确定单个siRNA或组合物，确保在CPE试验中对ZIKV产生最大的影响。

具体实施例12：体内导入的siRNA纳米颗粒的制备与表征

开发siRNA治疗药物最关键也最具挑战的是将siRNA导入到ZIKV感染的细胞内。由于ZIKV可以通过性传播，因此我们将阴道内给药作为最初的治疗手段。但对这一疾病发病原因深入了解后，可以对调整治疗这一疾病的给药策略。阴道适合局部或系统给予活性药物，目前市场上也有多种通过引导给药的药物，如避孕药、治疗酵母菌感染、激素替代治疗和女性生理用品。然而，也有许多生物学屏障和因子保护阴道免遭外来颗粒的侵害，例如很厚并具有弹性的黏膜层会结合并抑制这些制剂的进入。

成功导入siRNA的最大障碍之一是黏膜层[12]，交叉的粘液素纤维限制了能够穿透它的制剂的大小和疏水性。纳米颗粒能够有效导入的最佳大小上限是0.5μm，下限是0.2μm[12，13]。然而，尽管有报道的这些限制，其他一些研究人员也采用其他载体将siRNA成功导入了阴道内[14，15]。我们也有若干种小于大小下限的导入载体，包括分支状组氨酸-赖氨酸共聚多肽(HKP)，在伤口局部给药和系统给药上都取得卓越的效果。这使得我们对这一HKP纳米颗粒进行其它修饰，如PLGA、PEG或PEG-PEI修饰，或者评估精氨/亚精氨共聚物作为导入系统是否具有合适的分子特征，如大小、电荷和疏水性。前期研究表明对已有纳米颗粒制剂进行PLGA、PEG和其它修饰成效显著，我们的研究也证实我们的纳米颗粒在加入这些官能团后可保持最佳大小并显示良好的功能，可携带并保护siRNA穿透黏膜层。此外，还有研究显示采用干粉喷雾的方式能够增强siRNA的阴道内导入[16]。我们的研究也表明，将HKP包裹的siRNA纳米颗粒制作成冻干粉制剂不会影响其大小和导入能力等特征。

具体实施例13：抗ZIKV siRNA研究的小鼠模型

为了分析siRNA组合物对ZIKV病毒感染的体内治疗效果，将以AG129小鼠作为模型进行研究，所有小鼠实验均在生物安全等级2级条件下进行。

实验起始阶段所有动物均为五周龄AG129小鼠，治疗组的20只通过尾静脉注射给予HKP-SLiC纳米导入系统包裹的siRNA组合物，另外20只对照组小鼠注射PBS。24小时后，治疗组和对照组小鼠均用ZIKV感染。感染后0、24、48和72小时，治疗组和对照组分别静脉注射siRNA或PBS。

所有小鼠每天称量体重，计算每组的存活率。感染后第1、3、5、7、9和14天分离血清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。预期ZIKV感染的细胞，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平将会升高。感染后24、28和72小时收集包括睾丸、脾脏、肝脏、心脏、脑和肾脏等器官的组织，提取组织中的总RNA，并用一步法定量实时PCR和5’-RACE实验进行检测。血清和组织中的病毒效价采用Vero细胞进行系列稀释后测定。通过比较治疗组和对照组的结果，评估siRNA治疗药物的抗病毒效力。

表1、ZIKV mRNA疫苗候选蛋白的特征

候选分子	靶标描述	核苷酸长度	氨基酸长度
				1	E蛋白完整的mRNA序列	1515	505
2	结构域Ⅱ(融合环)的部分序列	243	81
				3	结构域Ⅲ的完整mRNA序列	333	111

表2、用于siRNA预测和siRNA序列叠加的病毒株

表3、上述表格中两种siRNA联合对病毒株的覆盖率

序列1	序列2	#覆盖病毒株数量	％覆盖率
				62	62A	28	100
63	62A	28	100
				62	62B	27	96
13	17	22	79
				62A	104	26	93
62A	103	25	89
				14	17	22	79
13	30	23	82
				13	62	25	89

表4、抗ZIKV的候选siRNA的序列和靶标

表5、五个SLiC种类和五种SLiC-siRNA的特征参数：包括粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位

名称	粒径(nm)	PDI	Zeta电位(mV0)
				SLiC1	479.3±55.1	0.66±0.13	61.1±1.27
SLiC2	196.9±25.6	0.41±0.24	42.3±1.85
				SLiC3	213.8±20.4	0.25±0.14	43.1±1.72
SLiC4	341.2±33.8	0.71±0.08	46.1±1.35
				SLiC5	1091±34.2	087±0.09	61.5±1.14
SLiC1(siRNA)	174.1±11.1	0.39±0.03	42.3±1.15
				SLiC2(siRNA)	115.5±15.6	0.20±0.04	34.4±1.85
SLiC3(siRNA)	169.6±10.4	0.22±0.04	38.2±0.80
				SLiC4(siRNA)	154.7±13.8	0.35±0.07	40.6±1.21
SLiC5(siRNA)	182.6±14.1	0.38±0.09	44.4±1.23

附录1：ZIKV与所有四种DENV血清型的包膜蛋白氨基酸序列的比对结果

红色框内为高同源性序列，绿色框内为低同源性序列。

寨卡病毒与登革热病毒血清1型的比较

寨卡病毒与登革热病毒血清2型的比较

寨卡病毒与登革热病毒血清3型的比较

寨卡病毒与登革热病毒血清4型的比较

参考文献

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此处列出的所有出版物，包括已授权或已申请的专利，和所有可以通过链接地址或编码访问的数据库条目，都通过参考文献的形式在此处全部披露。

尽管本发明描述了特定的具体实施例，并且为了阐述清楚而列举了许多细节，显而易见的是对熟悉这一领域的技术人员来说，此发明容易受到额外的实施例的影响，并且在不违背本发明的基本原理下，本文中某些特定的细节可以有各种不同的描述形式。

Claims

1.一种包含至少两种不同的siRNA分子与一种符合药学要求的导入载体的药物组合物，所含siRNA分子靶向寨卡病毒(ZIKV)基因组的一个或更多保守区域，所含导入载体包含一种多聚物或脂质体，所述siRNA分子和导入系统形成纳米颗粒。

2.权利要求1所述的药物组合物，所述ZIKV保守区域的基因序列，是对病毒在哺乳动物体内感染非常关键的基因序列。

3.权利要求2所述的药物组合物，所述的哺乳动物包括人类、啮齿类(如大鼠、小鼠或豚鼠)、雪貂或非人类灵长类(如猴子)。

4.权利要求1-3中任意一条权利要求所述的药物组合物，siRNA所靶向的基因组保守区域包含3'-UTR(非翻译区)和编码ZIKV蛋白的基因序列，所述蛋白包括但不限于包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白NS1、NS3、NS4B和NS5。

5.权利要求4所述的药物组合物，所述的siRNA分子选自如下的序列：

ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU,

ZIKV14：CCUUGACAAGCAAUCAGACACUCAA,

ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA,

ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA,

ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA,

ZIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62A：CCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA,

ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU,

ZIKV103：GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA,

ZIKV105：CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

6.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向包膜E蛋白基因的siRNA分子选自如下的序列：

ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU,

ZIKV14：CCUUGACAAGCAAUCAGACACUCAA,

ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA。

7.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向非结构蛋白基因NS1的siRNA分子包含：

ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA。

8.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向非结构蛋白基因NS3的siRNA分子选自如下的序列：

ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA,

ZIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62A：CCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA。

9.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向非结构蛋白基因NS4B的siRNA分子包含：

ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU。

10.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向非结构蛋白基因NS5的siRNA分子包含：

ZIKV103:GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA。

11.权利要求4所述的药物组合物，所述的靶向3'-UTR的siRNA分子包含：

ZIKV105:CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

12.权利要求1所述的药物组合物，包含一种siRNA鸡尾酒模式MST^ZIKV13，其中第一种siRNA分子包含ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU，第二种siRNA分子包含ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA。

13.权利要求1所述的药物组合物，包含一种siRNA鸡尾酒模式MST^ZIKV62，其中第一种siRNA分子包含ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA，第二种siRNA分子包含ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU。

14.权利要求1所述的药物组合物，包含一种siRNA鸡尾酒模式MSTZIKV62B，其中第一种siRNA分子包含ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA，第二种siRNA分子包含ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA。

15.权利要求1所述的药物组合物，包含一种siRNA鸡尾酒模式MSTZIKV103，其中第一种siRNA分子包含ZIKV103：GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA，第二种siRNA分子包含KIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU，第三种siRNA分子包含ZIKV105：CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

16.权利要求1-3中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中多聚物包括一种组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。

17.权利要求4所述的药物组合物，其中多聚物包括一种组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。

18.权利要求5-15中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中多聚物包括一种组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。

19.权利要求16-18中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中HKP结构为：(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，K代表赖氨酸，H代表组氨酸。

20.权利要求1-3中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中脂质体包括一种精胺-脂类共轭物(SLiC)和胆固醇。

21.权利要求4所述的药物组合物，其中脂质体包括一种精胺-脂类共轭物(SLiC)和胆固醇。

22.权利要求5-15中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中脂质体包括一种精胺-脂类共轭物(SLiC)和胆固醇。

23.权利要求20-22中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中SLiC包含如图5所示的TM1、TM2、TM3、TM4或TM5中的一种。

24.权利要求23所述的药物组合物，其中SLiC包含图5中所示的TM4结构。

25.权利要求1-24中任意一条权利要求所述的药物组合物，siRNA分子包含19-29个碱基对的寡聚核苷酸。

26.权利要求1-24中任意一条权利要求所述的药物组合物，siRNA分子包含19-21个碱基对的寡聚核苷酸。

27.权利要求1-24中任意一条权利要求所述的药物组合物，siRNA分子包含25个碱基对的寡聚核苷酸。

28.一种治疗ZIKV感染哺乳动物的方法，主要是给予哺乳动物有效剂量的权利要求1所述的药物组合物。

29.一种治疗ZIKV感染哺乳动物的方法，主要是给予哺乳动物有效剂量的权利要求2-27中任意一条权利要求所述的药物组合物。

30.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过滴注给药将药物送到哺乳动物体内。

31.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过鼻内给药将药物送到哺乳动物体内。

32.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过皮内给药将药物送到哺乳动物体内。

33.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过静脉注射给药将药物送到哺乳动物体内。

34.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过皮下给药将药物送到哺乳动物体内。

35.权利要求28或29所述的方法，所述药物组合物通过阴道内给药将药物送到哺乳动物体内。

36.权利要求28-35中任意一条权利要求所述的方法，所述的哺乳动物包括人类、啮齿类(如大鼠、小鼠或豚鼠)、雪貂或非人类灵长类(如猴子)。

37.权利要求36所述的方法，哺乳动物优选人类。

38.一种siRNA分子靶向ZIKV基因组的保守区域。

39.权利要求38所述的siRNA分子，所述的siRNA分子所靶向的基因组保守区域包含3'-UTR(非翻译区)和编码ZIKV蛋白的基因序列，所述蛋白包括但不限于包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白NS1、NS3、NS4B和NS5。

40.权利要求38所述的siRNA分子，所述的siRNA分子选自如下的序列：

ZIKV13：GGUGAAGCCUACCUUGACAAGCAAU,

ZIKV14：CCUUGACAAGCAAUCAGACACUCAA,

ZIKV17：CCGGAACUCCACACUGGAACAACAA,

ZIKV30：GCCAUGGCACAGUGAAGAGCUUGAA,

ZIKV62：GCCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAA,

ZIKV63：CCUAUCAGGUUGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62A：CCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAAU,

ZIKV62B：GCCUAUCAAGUAGCAUCUGCCGGAA,

ZIKV74：CCACUUCAUACAACAACUACUCCUU,

ZIKV103：GGUGCGCAGGAUCAUAGGUGAUGAA,

ZIKV105：CCGAGAACGCCAUGGCACGGAAGAA。

41.权利要求38-40中任意一条权利要求所述的siRNA分子，siRNA分子包含19-29个碱基对的寡聚核苷酸。

42.权利要求38-40中任意一条权利要求所述的siRNA分子，siRNA分子包含19-21个碱基对的寡聚核苷酸。

43.权利要求38-40中任意一条权利要求所述的siRNA分子，siRNA分子包含25个碱基对的寡聚核苷酸。

44.权利要求40所述的siRNA分子，还包含所鉴定siRNA分子的衍生物，这种衍生物含有已验证的原本25个碱基对中的连续17-24个核苷酸，或者在原本25个碱基对核苷酸基础上增加一个或多个核苷酸。

45.组合物包含权利要求38-44中任意一条权利要求所述的siRNA分子和一种符合要学要求的载体，所述符合要学要求的载体为多聚物或脂质体，siRNA分子和载体能够形成纳米颗粒。

46.一种治疗ZIKV感染哺乳动物的方法，主要是给予哺乳动物有效剂量的权利要求45所述的药物组合物。

47.权利要求46所述的方法，所述哺乳动物是人类。

48.一种药物组合物，包含编码氨基酸序列的mRNA分子和一种符合药学要求的载体，所述氨基酸序列由寨卡病毒(ZIKV)保守区域编码，所述载体为多聚物或脂质体。

49.权利要求48所述的药物组合物，所述ZIKV基因组保守区域的基因序列，是对病毒在哺乳动物体内感染非常关键的基因序列。

50.权利要求49所述的药物组合物，所述的哺乳动物包括人类、啮齿类(如大鼠、小鼠或豚鼠)、雪貂或非人类灵长类(如猴子)。

51.权利要求48所述的药物组合物，所述ZIKV基因组保守区域包含ZIKV包膜蛋白(E蛋白)基因序列。

52.权利要求51所述的药物组合物，编码氨基酸的基因序列在包膜蛋白区域Ⅲ(DomainⅢ)内。

53.利要求48-52中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中多聚物包括一种组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。

54.利要求48-52中任意一条权利要求所述的药物组合物，其中脂质体包括一种精胺-脂类共轭物(SLiC)和胆固醇。

55.权利要求48-53中任意一条权利要求所述的药物组合物，HKP和mRNA分子可以形成纳米颗粒制剂。

56.权利要求48-51中任意一条权利要求所述的药物组合物，SLiC和mRNA分子可以形成纳米颗粒制剂。

57.权利要求53所述的药物组合物，HKP和siRNA分子自组装成纳米颗粒。

58.权利要求54所述的药物组合物，SLiC、胆固醇和siRNA分子自组装成纳米颗粒。

59.一种阻止或减低ZIKV感染哺乳动物严重程度的方法，在感染前给予哺乳动物有效剂量的权利要求48所述的药物组合物。

60.一种阻止或减低ZIKV感染哺乳动物严重程度的方法，在感染前给予哺乳动物有效剂量的权利要求49-58中任意一条权利要求所述的药物组合物。

61.权利要求59或60所述的方法，组合物给予哺乳动物的方法包括滴注或皮内注射、静脉注射、阴道内给药或皮下给药。

62.权利要求59-61中任意一条权利要求所述的方法，所述的哺乳动物包括人类、啮齿类(如大鼠、小鼠或豚鼠)、雪貂或非人类灵长类(如猴子)。

63.权利要求62所述的方法，其中哺乳动物是人类。