CN114908091A - 一种抑制寨卡病毒的miRNA-1及其应用 - Google Patents

一种抑制寨卡病毒的miRNA-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于抑制寨卡病毒的miRNA，其能够显著的抑制寨卡病毒的复制和表达，治疗由于寨卡病毒感染所导致的疾病。

Description

一种抑制寨卡病毒的miRNA-1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抑制寨卡病毒的miRNA及其应用。
背景技术
寨卡病毒(ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属。寨卡病毒(ZIKV)是在西半球发现的一种新兴病毒，最初是在20世纪40年代从乌干达寨卡森林中发现的。2015年在巴西历史上爆发了最大规模的ZIKV感染，随后寨卡病毒感染迅速扩大到美洲许多国家。截至到2017年，美国等52个国家和地区陆续报告了超过2.2万例确诊病例和58万例疑似病例。ZIKV感染导致相关的新生儿小头症和格林巴利综合征，因此ZIKV受到了国际上的广泛关注。
ZIKV的外部结构呈球形，由一个二十面体外壳组成，由180个拷贝的E蛋白、糖蛋白(505个氨基酸)和M蛋白(75个氨基酸)组成，它们都通过跨膜区固定在脂质膜上，和单股正链RNA基因组共同构成一个二十面体对称的核衣壳，外层则是脂质包膜。E蛋白是参与受体结合、膜融合和宿主免疫识别的主要成分，M蛋白隐藏在E蛋白下面。异二聚体E-M蛋白呈二十面体对称，由60个重复单元组成。
ZIKV基因组是一个长约11kb的正向单链RNA，包含两个非翻译区(UTR)和一个由10个基因组成的开放阅读框架(ORF)，ORF的翻译产生一个3000多个氨基酸残基的组成的多蛋白复合体，然后在宿主蛋白和病毒蛋白的酶切割下，产生10个病毒蛋白，包括3个结构蛋白和7个非结构蛋白；3个结构蛋白分别为衣壳蛋白(C)、膜前蛋白(PRM)和包膜蛋白(E)，7个非结构蛋白分别为NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白主要参与病毒颗粒的组装、病毒对细胞的吸附和侵入，并含有病毒的主要表位。非结构蛋白主要负责病毒基因组的复制、翻译以及宿主免疫反应和代谢的调节。
ZIKV感染极大威胁了公众健康，但目前市场上还没有针对ZIKV感染的药物或疫苗。开发有效的抗ZIKV药物用于相关疾病的治疗和预防已迫在眉睫。
发明内容
本发明中，申请人发现了小干扰RNA(miRNA)，其能够显著的抑制寨卡病毒的复制和表达，治疗由于寨卡病毒感染所导致的疾病。
一方面，本发明提供了用于抑制寨卡病毒的miRNA，所述miRNA选自miRNA-1和miRNA-2中的任一种或两种。
所述miRNA-1的序列为：
正链5’-AACGAGAGUUUCUGGUCAUGA-3’；
负链：5’-UCAUGACCAGAAACUCUCGUU-3’。
所述miRNA-2的序列为：
正链：5’-GAUUCCGGAUUGUCAAUAUGCU-3’；
负链：5’-AGCAUAUUGACAAUCCGGAAUC-3’。
另一方面，本发明还提供了上述miRNA的模拟物(mimics)。
另一方面，本发明还提供了包含上述miRNA的载体。
在一个实施方式中，所述载体为病毒载体，例如，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、或慢病毒载体。
另一方面，本发明还提供了上述miRNA、模拟物或载体在抑制寨卡病毒中的应用，或者在制备用于抑制寨卡病毒的试剂/试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供了上述miRNA、模拟物或载体在治疗由于感染寨卡病毒所导致的疾病中的应用，或者在制备用于治疗由于感染寨卡病毒所导致的疾病的药物中的用途。
另一方面，本发明还提供了上述miRNA在抑制寨卡病毒E蛋白和/或NS5蛋白的表达中的用途。
另一方面，本发明还提供了一种抑制寨卡病毒的方法，所述方法包括利用上述miRNA、模拟物或载体对寨卡病毒进行抑制的步骤。
在一个实施方式中，所述寨卡病毒包括寨卡病毒株MR766、寨卡病毒株PRVABC.59等。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1.SK-N-BE(2)细胞中，miRNA-1抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5,E的RNA表达结果图。
图2.SK-N-BE(2)细胞中，miRNA-2抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5,E的RNA表达结果图。
图3.miRNA-1和miRNA-2后抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5，E的蛋白表达Western结果图。
图4.miRNA-1在SK-N-BE(2)细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达结果图。
图5.miRNA-2在SK-N-BE(2)细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达结果图。
图6.miRNA-1在NSC细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5,E的RNA表达结果图。
图7.miRNA-2在NSC细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5,E的RNA表达结果图。
图8.miRNA-1在NSC细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达结果图。
图9.miRNA-2在NSC细胞中抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本实施方式中，所采用的实验方法如下：
一、RT-PCR：
cDNA合成和实时PCR从实验细胞中提取总RNA，使用cDNA合成试剂盒(Takara)逆转录1μg RNA得到cDNA。然后使用SYBR Green Supermix试剂(Bio-Rad)对20μl cDNA进行定量PCR(RT-qPCR)分析。将基因表达水平标准化为GAPDH。相对mRNA表达通过循环阈值变化法计算为2-ΔΔC(t)。通过熔解曲线分析评估RT-qPCR扩增的特异性。
二、RNA提取：
1)直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.(离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理)
2)1ml Trizol Reagent，震荡混匀。
3)将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
4)可选步骤:4℃12 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
5)每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
6)4℃12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600ul，约为所用Trizol试剂的60％)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相)
7)在得到的水相溶液中加入等体积(500ul)的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置20-30min。
8)4℃12 000rpm离心10min，去上清。
9)加入1ml 75％乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来，每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
10)4℃12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
11)室温放置晾干(不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要，可加30-100ul水)或0.5％SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50度保温1小时。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺。溶解，-70℃保存。可以分装保存，防止污染，
12)取1ul+1ul buffer电泳检测RNA完整性，稀释一定倍数，分光光度计测定纯度和浓度。
三、蛋白质印迹实验
SK细胞(上海来源)和NSC细胞在RIPA缓冲液(50mM Tris–HCl，pH 7.5，1％TritonX-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，150mM NaCl)中裂解，补充蛋白酶抑制剂混合物(Roche)，在冰上裂解10或30分钟。将细胞提取物以12000g离心15分钟，然后将上清液与5X SDS-PAGE上样缓冲液一起孵育，并在100℃变性10分钟，然后加入10％SDS-PAGE凝胶中电泳用于分析蛋白质样品。之后使用Bio-Rad蛋白转印系统将凝胶转移到PVDF膜上，用PBS-0.05％Tween(PBST)和5％BSA在室温下搅拌封闭PVDF膜1小时，然后用一抗)4度孵育过夜。与一抗孵育后，用PBST洗涤PVDF膜4次。抗体抗兔HRP(CST)和抗小鼠HRP(CST)用作二抗，室温孵育1小时。在Bio-Rad ChemiDoc成像系统上使用ECL(Pierce)可视化蛋白质。抗
四、Confocal：
用多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS清洗3次，每次3分钟。0.5％Triton X-100室温通透20分钟，PBS清洗三次，每次3分钟。加入PBST-BSA封闭30分钟，PBS清洗，加入一抗四度过夜，PBS清洗三次后，加入二抗孵育1小时，共聚焦显微镜观察。
本实施方式中，申请人筛选出靶向抑制寨卡病毒复制的两个小RNA(miRNA)，可以有效抑制寨卡病毒蛋白NS5和E的表达，抑制寨卡病毒dsRNA的形成，抑制病毒空斑形成。
miRNA-1的序列为：
正链5’-AACGAGAGUUUCUGGUCAUGA-3’；
负链：5’-UCAUGACCAGAAACUCUCGUU-3’。
miRNA-2的序列为：
正链：5’-GAUUCCGGAUUGUCAAUAUGCU-3’；
负链：5’-AGCAUAUUGACAAUCCGGAAUC-3’。
本实施方式中所利用的细胞SK-N-BE(2)购于中国科学院上海细胞库。NSC神经干细胞购于深圳三启公司。
本实施方式中所利用的试剂：DEME培养基，NS5,E抗体(GeneTek)，lipo2000，RT，qPCR试剂(Takara-ROCHE)
基于上述miRNA-1和miRNA-2的序列分别合成小RNA mimics，RNA1-mimic和RNA2-mimic。
为了验证上述miRNA-1和miRNA-2的功能，申请人采用SK-N-BE(2)细胞分别感染寨卡病毒株MR766和PRVABC.59，同时采用NSC神经干细胞分别感染寨卡病毒株MR766和PRVABC.59。感染寨卡病毒24小时后，将20nM的miRNA-1和miRNA-2以及control对照组(对照miRNA mimics)分别转染到SK-N-BE(2)细胞和NSC神经干细胞中，转染48小时后收集细胞RNA，提取蛋白，分析寨卡病毒蛋白E和NS5的表达。Confocal实验检测对照组和miRNA处理组中，寨卡病毒蛋白E和双联RNA的形成。
结果显示，转入miRNA-1后，在SK-N-BE(2)细胞中能够显著的抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5和E基因的RNA的表达(如图1所示)。
转入miRNA-2后，在SK-N-BE(2)细胞中能够显著的抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5和E基因的RNA的表达(如图2所示)。
转入miRNA-1和miRNA-2后，能够显著的抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5和E基因的蛋白的表达(如图3所示)。
另外，通过共聚焦实验显示在细胞内寨卡病毒蛋白E的定位和表达；转入miRNA-1后，在SK-N-BE(2)细胞中可以显著的抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达(如图4所示)。转入miRNA-2后，在SK-N-BE(2)细胞中可以显著的抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达(如图5所示)。
此外，转入miRNA-1和miRNA-2后，在NSC细胞中均能抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒编码基因NS5，E的RNA表达(如图6-7所示)。转入miRNA-1和miRNA-2后，在NSC细胞中也能够抑制寨卡病毒株MR766和PRVABC.59的病毒蛋白和dsRNA表达(如图8-9所示)。
以上结果反映出，本申请中的miRNA-1和miRNA-2能够抑制寨卡病毒，可用于治疗由于寨卡病毒感染所导致的疾病。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于抑制寨卡病毒的miRNA，所述miRNA为miRNA-1，
所述miRNA-1的序列为：
正链5’-AACGAGAGUUUCUGGUCAUGA-3’；
负链：5’-UCAUGACCAGAAACUCUCGUU-3’。
2.包含权利要求1所述miRNA的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为病毒载体。
4.权利要求1所述的miRNA，或权利要求2-3任一所述的载体在抑制寨卡病毒中的应用，或者在制备用于抑制寨卡病毒的试剂/试剂盒中的应用。
5.权利要求1所述的miRNA，或权利要求2-3任一所述的载体在治疗由于感染寨卡病毒所导致的疾病中的应用，或者在制备用于治疗由于感染寨卡病毒所导致的疾病的药物中的用途。
6.权利要求1所述的miRNA在抑制寨卡病毒E蛋白和/或NS5蛋白的表达中的用途。
7.一种抑制寨卡病毒的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的miRNA或权利要求2-3任一所述的载体对寨卡病毒进行抑制的步骤。
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