JP2024501984A - フラビウイルス属ウイルスの弱毒化ウイルス及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列を含むフラビウイルス属ウイルスの弱毒化ウイルス及びその使用であって、前記フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部が前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換され、前記フラビウイルス属ウイルスのヌクレオチド配列一部が置換されてから得られた前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）においては、少なくとも３’末端ステムループ領域（３’ＳＬ）が保留されているフラビウイルス属ウイルスの弱毒化ウイルス及びその使用を提供する。当該弱毒化ウイルスは、安全で効果的な弱毒化ワクチン株の調製に用いられる。
Description
本発明は、生物技術分野に属し、具体的に、フラビウイルス属ウイルスの弱毒化ウイルス及びその使用に関する。
フラビウイルス属は、フラビウイルス科に属し、７０種以上のウイルスを含み、多くのウイルスは、蚊やダニによって拡散される。そのうち、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルス（ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，ＴＢＥＶ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＹＦＶ）、西ナイルウィルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ、ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＭＶＥＶ）、デングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）、及び、ジカウイルス（ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ、ＺＩＫＶ）は、世界中で高い罹患率と死亡率を引き起こす重要なヒト病原体である。重篤なフラビウイルス感染疾病は、出血熱（ＹＦＶとＤＥＮＶ）、脳炎及び神経後遺症（ＪＥＶ、ＴＢＥＶ、ＷＮＶ、ＳＬＥＶ及びＭＶＥＶ）を含み、死に至る可能性があり、ＪＥＶ、ＹＦＶ、ＴＢＥＶ及びＤＥＮＶによる死亡率は、５％以上３０％以下に達する可能性がある。
世界保健機関のデータによると、現在、ＤＥＮＶは１００以上の国で流行し、年ごとに２０，０００人が死亡し、ＪＥＶは東南アジアと西太平洋で流行し、年ごとに６８，０００例が報告されており、１９９９年にニューヨークでＷＮＶは、大規模で発生し、９，８６２件の感染が発生し、死者２６４人（ＣＤＣ統計）であり、北米から中米州、最後、南米州へ急速に広がり、現在も流行地域は拡大し、ＺＩＫＶは２００７年にヤップ諸島、ミクロネシア、ガボン諸島で小規模な流行が発生した後、２０１６年にラテンアメリカで意外に大規模な爆発が発生し、このＺＩＫＶ感染は重度の神経系疾患（ギランバレー症候群）と新生児頭奇形に関連していたため、「国際的に注目されている公衆衛生上の緊急事態」と宣言されていた。２０１６年には、米国だけで約４００万件のＺＩＫＶ感染が記録された。その後、ＺＩＫＶはフランス領ポリネシア、南アメリカ、アフリカ、アジアなどの地域に急速に広がった。従って、フラビウイルス感染は、世界の直面する重要な公衆衛生問題の１つになっている。
現在、フラビウイルス感染に対する効果的な抗ウイルス薬や特異的な治療法はなく、ヒトの予防のためのフラビウイルスワクチンは、３種類しかないため、より効果的な新しいフラビウイルスワクチンの開発は、我が国、ひいて世界範囲に亘ってフラビウイルス感染への予防に対して重要の戦略意味がある。多くの種類のワクチンの中で、弱毒化生ワクチンは、強力な免疫原性を備え、１回の免疫で体液及び細胞の免疫応答を引き起こし、より完全かつ長期的な免疫保護を誘発する可能性があるため、ワクチン開発において注目されている。
フラビウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ、５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ、３’ＵＴＲ）、及び、中央の長いオープンリーディングフレームからなる全長約１１，０００塩基の一本鎖プラス鎖ＲＮＡである。ゲノム５’末端は、ｍＲＮＡと類似する７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＡｍｐ Ｃａｐ）構造を有するものの、ゲノム３’末端は、ポリアデニル酸テールｐｏｌｙ（Ａ）を有せず、１つの保存的な５’－ＣＵＯＨ－３’配列を含む。フラビウイルスゲノムの非翻訳領域（ＵＴＲ）には、非常に複雑な二次及び三次構造を形成している保存的なＲＮＡ配列が含まれており、ウイルスの複製、翻訳、伝播、及び病原性において多面的な役割を果たす（Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１４ Ｊａｎ ２７；６（２）：４０４－２７）。
５’ＵＴＲは、長さが約１００塩基であり、ｉ）ＳＬ－ＡがＮＳ５－ＲｄＲｐに結合し（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００６ Ａｕｇ １５；２０（１６）：２２３８－４９）、負鎖ＲＮＡの合成を開始する保存的なステムループ構造（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐｓ、ＳＬ）、ｉｉ）長距離ＲＮＡ－ＲＮＡの相互作用を媒介し、開始コドンＡＵＧ上流に位置する環状化配列（５’ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＡＵＧ ｒｅｇｉｏｎ（５’ＵＡＲ）、５’ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５’ＣＳ）及び５’ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＡＵＧ ｒｅｇｉｏｎ（５’ＤＡＲ））（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２００９ Ｆｅｂ；１３９（２）：２３０－９）を含む。３’ＵＴＲは、比較的に長く、約４００～７００塩基を有し、複数の保存的なＲＮＡ二次構造を形成し、ウイルスの複製、病原性及び伝播の面で重要な役割を果たす。３’ＵＴＲは、構造的にはｉ）ステムループ領域（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ、ＳＬ）、ｉｉ）ダンベル領域（ｄｕｍｂｂｅｌｌ、ＤＢ）、ｉｉｉ）短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ３’ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ、ｓＨＰ－３’ＳＬ）に分けられる。そのうち、ｓＨＰ－３’ＳＬは、フラビウイルスの中で最も保存的なＲＮＡ二次構造であり、それに含まれている相補的環状化配列３’ＣＳ、３’ＵＡＲ及び３’ＤＡＲは、対応する５’ＣＳ、５’ＵＡＲ及び５’ＤＡＲに相補的に対合して引き起こされるゲノム環状化は、ＲＮＡ複製において複製を開始するための不可欠なシス作用である。ステムループ領域（ＳＬ）とダンベル領域（ＤＢ）は、ゲノム複製過程中のエンハンサーとしてフラビウイルス属にあまり保存されておらず、そのサイズと構造は、ウイルスによって異なる。ステムループ領域（ＳＬ）とダンベル領域（ＤＢ）は、ゲノム複製において不可欠ではない役割を果たすが、ＳＬとＤＢ領域の異なる程度の欠失又は点突然変異による毒力の減衰又は増強に基づく複数の研究により、ステムループ領域（ＳＬ）とダンベル領域（ＤＢ）は、ウイルス毒力、宿主免疫反応及び宿主適応性の調節等の面で重要な役割を果たすことが示されているため、ステムループ領域（ＳＬ）とダンベル領域（ＤＢ）領域は、弱毒化ワクチンを設計するための２つの重要な標的になる。
これらの要因を合わせて考慮すると、有効性と安全性プロファイルが改善された取り代わりの弱毒化フラビウイルスワクチン候補が必要である。
本開示は、フラビウイルス属ウイルスの感染性クローンに基づいて、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の５’末端ステムループ領域（ＳＬ）のヌクレオチド配列の全部又は一部、環状化配列領域（ＣＳ）のヌクレオチド配列の全部又は一部及び／又はダンベル領域（ＤＢ）のヌクレオチド配列の全部又は一部をｐｏｌｙ（Ａ）配列に置換し、フラビウイルス属ウイルスの弱毒化ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス株を構築し、広範なインビボでの研究により、弱毒化ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス株は、野生型ウイルスの弱毒化ワクチン候補株として用いられることが十分に実証されている。このようなウイルスは、安全なワクチンの基礎を提供する。
本開示の１つの目的は、弱毒化の特性を備えると共に、依然として良好な免疫原性を有する弱毒化フラビウイルス属ウイルスを提供することにある。前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列を含み、そのうち、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列は、前記フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部を置換し、前記フラビウイルス属ウイルスのヌクレオチド配列の一部が置換された後、得られた前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’末端ステムループ領域（３’ＳＬ）が保留されている。
本開示のもう１つの目的は、転写され、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスＲＮＡゲノムを産生することができる、ＤＮＡを提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス又はＤＮＡを含む細胞を提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ及び／又は細胞を含むワクチンを提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞及び／又はワクチン、及び、薬学的に許容される担体を含む、薬物組成物を提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、野生型ウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）ヌクレオチド配列又はそのヌクレオチド配列の一部をポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列に置換することを含む、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスを調製する方法を提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ及び／又は細胞の、弱毒化生フラビウイルス属ウイルスワクチンの調製における使用を提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞、ワクチン及び／又は薬物組成物の、フラビウイルス属ウイルスに引き起こされた疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供することにある。
本開示のもう１つの目的は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞、ワクチン及び／又は薬物組成物を免疫方式で投与することを含む、フラビウイルス属ウイルスに対する免疫応答を刺激するための方法を提供することにある。
Ｉ．定義
本開示では、特に断らない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語及び実験室の操作手順は、対応する分野で広く使用される用語及び日常手順である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
本開示では、特に断らない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語及び実験室の操作手順は、対応する分野で広く使用される用語及び日常手順である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
本明細書で使用されている「約」又は「おおよそ」という用語は、特に断らない限り、所定値又は範囲の±１０％以内である。整数であると要求されている場合、当該用語は、所定値又は範囲の±１０％以内で最も近い整数に切り上げ又は切り捨てなるものである。
本明細書に使用されているフラビウイルス属ウイルスは、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＪＥＶ）、西ナイルウィルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ、ＷＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルス（ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、ＴＢＥＶ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）、ジカウイルス（ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ、ＺＩＫＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＭＶＥＶ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、及び、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）、或いは、それらのいずれかに関連するフラビウイルスを含むが、これらに限られない。
本明細書に使用されているフラビウイルス３’非翻訳領域の５’末端ステムループ領域（ＳＬ）、ダンベル領域（ＤＢ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）、及び、環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）は、いずれも対応分野の用語である。他の研究では、ステムループ領域（ＳＬ）は、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＶＲ）と称される場合もある。
本明細書に使用されている「弱毒生ワクチン」又は「弱毒化ワクチン」という用語は、宿主に感染する能力、宿主内で複製する能力、パッケージングする能力、宿主に再感染する能力、又は、それらを組み合わせる能力が減弱されるように当初の親ウイルス又は野生型ウイルスから変化したウイルスを指す。一般的に、このような弱毒化は、ウイルスの宿主の一部又はすべてで発生し、又は、ウイルスの１種又はいくつかの宿主だけで発生する場合もある。従って、弱毒生ウイルスの減衰（即ち、宿主に感染する能力、宿主内で複製する能力、パッケージングする能力、宿主に再感染する能力、又は、それらを組み合わせる能力の低減）は、通常、ウイルスの１種又は複数種の宿主に関連し、ウイルスの１種又は複数種の他の宿主には弱毒生ウイルスにおいて、顕著に減衰しない、又は、測定可能な程度に減衰しない。本明細書に開示される弱毒生ウイルスは、通常、遺伝的に改変され、又は、変異、変異体、遺伝子工程による改変、組換え体又は組み合わせと呼ばれる場合がある。
本明細書に使用されている「弱毒生ワクチン」又は「弱毒化ワクチン」という用語は、弱毒生病原体、例えば、ウイルスを含む薬物組成物を意味する。薬物組成物は、被験者において、ウイルスに免疫反応を誘導して被験者をウイルスによる死亡や死亡の可能性又はその両方から保護する少なくとも１種の免疫活性成分、及び、任意に１種又は複数種の活性成分の免疫活性を強化する他の成分を含む。ワクチンは、医薬組成物に典型的な他の成分をさらに含んでもよい。少なくとも１種の免疫活性成分は、１種又は複数種の本明細書に記載の弱毒生ウイルスである。
本明細書に使用されている「ウイルスレスキュー」という用語は、ウイルス配列を含む体外構築物を適切な細胞に導入して伝染性又は感染性を有するウイルスを産生する過程を意味する。「組換えウイルス」という用語は、組換えＤＮＡ技術に産生された遺伝子操作されたウイルスを指し、ウイルス配列に対して任意の欠失、挿入、反転、及び、置換などの遺伝子操作を人為的に施すことができるという点で天然に存在するウイルスと区別することができる。
本明細書に使用されている「組換えＲＮＡウイルス」という用語は、異種ＲＮＡを含む本願に係るウイルスを意味する。
本明細書に使用されている、ウイルスの場合、「野生型」という用語は、流行し、自然的に伝播し、典型的な病気の爆発が発生するウイルスのタイプを意味する。他の実施形態において、ウイルスの場合、「野生型」という用語は、親ウイルスを指す。
本明細書に使用されている「感染効率」又は「ＭＯＩ」という用語は、感染された各細胞の感染性ウイルス粒子の平均数を意味する。添加された感染性ウイルス粒子の数（添加のｍｌ×ＰＦＵ／ｍｌ）を添加された細胞の数（添加のｍｌ×細胞／ｍｌ）で割ることでＭＯＩを計算する。
ＩＩ．発明を実施するための形態
一の態様において、本開示は、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列を含む弱毒化フラビウイルス属ウイルスであって、前記フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部は、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換され、前記フラビウイルス属ウイルスのヌクレオチド配列の一部が置換された後、得られた前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’末端ステムループ領域（３’ＳＬ）が保留されている、弱毒化フラビウイルス属ウイルスを提供する。
一の態様において、本開示は、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列を含む弱毒化フラビウイルス属ウイルスであって、前記フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部は、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換され、前記フラビウイルス属ウイルスのヌクレオチド配列の一部が置換された後、得られた前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’末端ステムループ領域（３’ＳＬ）が保留されている、弱毒化フラビウイルス属ウイルスを提供する。
前記態様に係る弱毒化フラビウイルス属ウイルスによれば、前記のヌクレオチド配列の一部は、３’非コード領域（３’ＵＴＲ）中の５’末端ステムループ領域（５’ＳＬ）の全部又は一部、環状化配列領域（ＣＳ）の全部又は一部、及び／又は、ダンベル領域（ＤＢ）のヌクレオチド配列の全部又は一部を含む。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記のヌクレオチド配列の一部は、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記３’非コード領域（３’ＵＴＲ）における５’末端ステムループ領域（５’ＳＬ）は、ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）及びステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）から選ばれるものである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記環状化配列領域（ＣＳ）は、環状化配列領域１（ＣＳ１）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、及び、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）から選ばれるものである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記ダンベル領域（ＤＢ）は、ダンベル領域１（ＤＢ１）及びダンベル領域２（ＤＢ２）から選ばれるものである。
前記いずれかの態様に係る弱毒化フラビウイルス属ウイルスによれば、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列は、１０～２００個のアデニル酸を含む。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列は、５０～１８０個、１００～１６０個のアデニル酸、より好ましくは１３０～１５０個のアデニル酸、好ましくは１３０又は１５０個のアデニル酸を含む。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記フラビウイルス属ウイルスは、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＪＥＶ）、西ナイルウィルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ、ＷＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルス（ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、ＴＢＥＶ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）、ジカウイルス（ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ、ＺＩＫＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＭＶＥＶ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）及びキャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）から選ばれるものである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、プラーク力価が５×１０４～５×１０６ＰＦＵ／ｍｌである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、親野生型ウイルスに比べて、毒力が１０～１００倍低下する。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞ＢＨＫ－２１にレスキューされ、及び／又は、前記アフリカミドリザル腎臓細胞Ｖｅｒｏ細胞で増幅して得られたものである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記デング熱ウイルスは、デング熱ウイルス１型、２型、３型及び４型から選ばれるものである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化西ナイルウィルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化西ナイルウィルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化西ナイルウィルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １である。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化日本脳炎ウイルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化日本脳炎ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化日本脳炎ウイルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２である。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化デング熱ウイルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化デング熱ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化デング熱ウイルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３である。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化黄熱ウイルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化黄熱ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化黄熱ウイルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４である。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化ジカウイルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化ジカウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化ジカウイルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５である。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本開示の１つの具体的な実施形態において、前記弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスは、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６である。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）を含み、前記のヌクレオチド配列の部分がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では３’非翻訳領域のダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記のヌクレオチド配列の一部は、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では３’非翻訳領域における５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）及び短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記的ヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記ヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ダンベル領域（ＤＢ）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記ヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では、３’非翻訳領域の５’末端ステムループ領域（ＳＬ）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている。
一の態様において、本開示は、転写され、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスのＲＮＡゲノムを産生することができる、ＤＮＡを提供する。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記ＤＮＡは、フラビウイルス属ウイルス弱毒化株の感染性クローンである。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記感染性クローンは、プラスミドである。
一の態様において、本開示は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス又は前記ＤＮＡを含む、細胞を提供する。
一の態様において、本開示は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ及び／又は細胞を含む、ワクチンを提供する。
一の態様において、本開示は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞及び／又はワクチン、及び、薬学的に許容する担体を含む、薬物組成物を提供する。
一の態様において、本開示は、野生型ウイルス３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列又はそのヌクレオチド配列の一部をポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列に置換することを含む、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスを調製する方法を提供する。
本開示のいくつかの好ましい実施形態において、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞ＢＨＫ－２１でレスキューされ、及び／又は、前記アフリカミドリザル腎臓細胞Ｖｅｒｏ細胞で増幅され得されたものである。
一の態様において、本開示は、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞の、弱毒生フラビウイルス属ウイルスワクチンの調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化西ナイルウィルスの弱毒生西ナイルウィルスワクチンの調製における使用である。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化日本脳炎ウイルスの弱毒生日本脳炎ウイルスワクチンの調製における使用である。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化デング熱ウイルスの弱毒生デング熱ウイルスワクチンの使用における使用である。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化黄熱ウイルスの弱毒生黄熱ウイルスワクチンの調製における使用である。
本開示の１つの好ましい実施形態において、弱毒生ジカウイルスワクチンの調製における前記弱毒化ジカウイルスの使用である。
一の態様において、本開示は、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞、ワクチン及び／又は薬物組成物の、フラビウイルス属ウイルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化西ナイルウィルスの、西ナイルウィルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化日本脳炎ウイルスの、日本脳炎ウイルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化デング熱ウイルスの、デング熱ウイルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化黄熱ウイルスの、黄熱ウイルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
本開示の１つの好ましい実施形態において、前記使用は、前記弱毒化ジカウイルスの、ジカウイルスによる疾病を治療又は予防するための薬物の調製における使用を提供する。
一の態様において、本開示は、免疫方式で前記弱毒化フラビウイルス属ウイルス、ＤＮＡ、細胞、ワクチン及び／又は薬物組成物を投与することを含む、フラビウイルス属ウイルスに対する免疫応答を刺激するための方法を提供する。
本明細書の実施形態において、薬物の生体内投与に適した生体適合性形態で被験者に投与する組成物を提供する。「生体内投与に適した生体適合性形態」とは、投与される活性成分（例えば、実施形態の薬剤）の形態を意味し、その活性剤の治療効果は、いかなる毒力作用を超える。治療有效量の治療組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量と定義される。例えば、化合物の治療活性量は、例えば、個体の疾患状態、年齢、性別、及び、体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因によって変化してもよい。最適な治療応答を提供するために用量レジメンを調整してもよい。
１つの実施形態において、化合物（例えば、実施形態の弱毒生ウイルス）は、例えば、皮下、静脈内、経口投与、吸入、皮内、経皮応用、膣内応用、局所投与、鼻腔内又は直腸投与などの都合の良い方法で投与されてもよい。投与経路によって、活性化合物は、保護性緩衝液（例えば、アルブミンとトレハロース、ポロキサマー４０７／トレハロース／アルブミン（ＦＴＡ））に含まれていてもよい。１つの実施形態において、組成物は、経口投与されてもよい。もう１つの実施形態において、組成物は、静脈内に投与されもよい。１つの実施形態において、組成物は、例えば、吸入によって鼻腔内に投与されてもよい。もう１つの実施形態において、組成物は、無針システム（例えば、Ｐｈａｒｍａｊｅｔ（登録商標））又は他の皮内投与システムにより皮内に投与されてもよい。
いくつかの実施形態において、弱毒生ウイルスワクチン（例えば、西ナイルウィルスワクチン）は、安定化製剤（例えば、アルブミンとトレハロース、ＦＴＡ、又は弱毒生ウイルスを安定させるための他の製剤）として小児又は若者に投与され得る。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、さらに希釈剤、例えば、生理食塩水と水性緩衝液を含んでもよい。弱毒生ウイルス製剤を、その不活化を防ぐ材料と組み合わせたり、化合物をその不活化を防ぐ材料と同時に投与したりすることが必要な場合がある。いくつかの実施形態において、弱毒生西ナイルウィルスの１種又は複数種の製剤は、初期用量で被験者に投与され、続いて強化剤で皮下又は皮内に投与され得る。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物、及び、オイルに分散剤として調製し得る。通常の保管及び使用条件では、これら製剤には、微生物の増殖を防止するための防腐剤又は他の安定化配合（例えば、弱毒生フラビウイルスを安定化させるためのもの又は他の安定化製剤）が含んでもよい。
注射可能な使用に適する薬物組成物は、本分野に既知の手段によって投与することができる。例えば、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散体及び注射可能な無菌溶液又は分散液を即座に調製するための無菌粉末を用いてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、無菌で、注射しやすい流体であってもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であってもよい。分散体の場合、例えば、レシチンなどのコーティング材料で必要な粒子サイズを維持し、並びに界面活性剤で適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤又は抗真菌剤又は他の製剤を添加して微生物を予防することができる。
いくつかの実施形態において、調製する時、溶液は、剤形の製剤に適合する形態で治療有効量で投与されてもよい。これらの実施形態によれば、製剤は、例えば、上記の注射可能な溶液タイプのような様々な剤形で容易に投与することができる。
いくつかの実施形態において、弱毒化フラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）製剤の単回又は複数回用量を被験者に投与してもよい。いくつかの実施形態において、単回用量の製剤で被験者を治療することができる。他の実施形態において、少なくとも２回用量の弱毒生西ナイルウィルス製剤で被験者を治療してもよい。いくつかの実施形態において、被験者に０日目に弱毒化西ナイルウィルス組成物を投与し、１回目の用量を投与した後、約３ヶ月内に追加投与量を投与する。いくつかの実施形態において、被験者は、西ナイルウィルスに一度も曝露されず、免疫のない被験者（血清陰性）である。他の実施形態において、被験者は、以前に西ナイルウィルスに曝露され、及び／又は、西ナイルウィルスに感染（血清陽性）されたことがある。これらの実施形態によれば、血清陰性被験者は、０日目に治療され、そして西ナイルウイルスに強化された免疫応答をもたらすために、初回投与から６ヶ月以内、５ヶ月以内、４ヶ月以内、３ヶ月以内、又はより短い期間内に追加免疫を受けることができる。いくつかの実施形態において、小児は、約２歳から約１７歳までの小児であってもよい。他の実施形態において、小児は、２歳から１７歳までである。
他の実施形態において、経鼻液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤は、弱毒生フラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）のウィルス製剤を被験者に送達することができる。いくつかの製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の賦形剤を含んでもよい。
担体を用いて薬物組成物を調製することができ、前記担体は、例えば、持続放出製剤又はコーティング材料などの活性成分を生体からの急速な除去から保護する。このような担体は、放出制御製剤、例えば、マイクロカプセル化送達システム及び生分解性生体適合性ポリマーを含むが、これらに限られず、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒｓ）、ポリ乳酸及び既知の他の物質を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、弱毒生フラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）の用量範囲として、最初に約１０２～約１０６ＰＦＵを投与し、その後、任意に必要に応じて３０日以内又はその後の１２ヶ月内に少なくとも２回目の投与を実施してもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている薬物組成物は、被験者に１回の用量又は複数回の用量を投与してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている免疫原性組成物は、約６ヶ月以内、約１２０日以内、約９０日以内、約８０日以内、約７０日以内、約６０日以内、約５０日以内、約４０日以内、約３０日以内、約２０日以内、約１０日以内、約５日以内又はより短い期間、或いは、同じ日の数時間又は数分間以内などの予めに決められた期間に１回の用量、２回の用量、又は、より多い用量を被験者に投与し、或いは、同一又は異なる解剖部位で同時に投与する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている薬物組成物は、互いに約９０日以内、互いに約６０日以内、互いに約３０日以内、及び、互いに約３０日未満の期間に投与してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている組成物は、皮下又は皮内に被験者に投与してもよい。２つ又はそれ以上の解剖部位への投与は、２つ又はより多い解剖部位への同じ様式での投与、又は、２つの別々の解剖部位への２つの異なる様式での投与を含む投与の任意の組み合わせを含んでもよい。これらの実施形態によれば、２つ又はより多い解剖部位は、異なる手足や体の異なる領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、例えば、すべてのフラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）の血清型（例えば、交差保護）に対する保護を提供するために、０日目に同一又は複数の解剖部位に２回の用量のワクチン組成物を連続して被験者に導入してもよい。他の実施形態において、薬物組成物は、弱毒生西ナイルウィルスと他のフラビウイルス（例えば、ジカウイルス、日本脳炎、西ナイルウィルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病、又は、他のウイルス）に対する他の免疫原性試薬の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている西ナイルウィルスに対するワクチンは、関連する他のウイルス感染、例えば、ジカウイルス感染の低減に用いられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている薬物組成物を用いて被験者の標的製剤に対する免疫応答を増加してもよく、これは、このようなフラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）ウイルスに対する薬物組成物を受ける小児又は若者にフラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）ウイルスに対する免疫原性組成物とＣＤ８＋Ｔ細胞応答又は西ナイルウィルスに対する他の免疫応答を強化するための試薬を組み合わせることで実施する。
治療有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を含むクリーム、ゼリー、リンス等の局所的な適用により局所投与を完成する。セリンプロテアーゼ阻害剤を皮膚に浸透させて血流に入るクリーム、ゼリー、リンス等の投与により経皮投与を完成する。また、浸透圧ポンプは、投与に用いられる。必要な用量は、治療の具体的な状况、投与方法及び身体から分子を除去する速率によって変化する。
他の実施形態は、弱毒生ウイルスの不活化を減少させる方法に関し、１種又は複数種の弱毒生ウイルスと弱毒生ウイルス（例えば、フラビウイルス）の不活化を低減することができる組成物を組み合わせることを含むが、これらに限られない。これらの組成物は、１種又は複数種のタンパク質試薬、１種又は複数種の糖又はポリオール試薬、及び、任意の１種又は複数種のＥＯ－ＰＯブロック共重合体を含むが、これらに限られず、前記組成物は、弱毒生ウイルスの不活化を減少し、又は、弱毒生ウイルスを安定化させることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る組成物は、部分的に又は完全に脱水又は水和されたものであってもよい。他の実施形態において、本明細書に係る薬物又は非薬物組成物に用いる安定タンパク質試薬は、ホエイプロテイン、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、他の血清アルブミン又はアルブミン遺伝子ファミリーのメンバーを含むが、これらに限られない。糖又はポリオール試薬は、単糖、二糖、糖アルコール、トレハロース、ショ糖、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリボース（ｌａｍｉｎａｒｉｂｏｓｅ）、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、キシリトール、エリスリトール、ラフィノース、アミラーゼ、シクロデキストリン、キトサン又はセルロースを含むが、これらに限られない。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ノニオン界面活性剤、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）との共重合体（ＥＯ－ＰＯブロック共重合体）、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド（例えば、モノステアリン酸スクロース、ラウリルジグルコシド又はモノラウリン酸ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、オクチルグルコシド及びデシルマルトシド）、脂肪アルコール（セチルアルコール又はオレイルアルコール（ｏｌｅｌｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ））又はコカミド（ｃｏｃａｍｉｄｅｓ）（コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、及びコカミドＴＥＡ）を含むが、これらに限られない。
他の実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマー４０７（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標））、置換ポロキサマー４０７又はポロキサマー４０７以外のポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８又はポロキサマー２３８、或いは、Ｆ１２７（登録商標）と類似する特性を備える他のＥＯ－ＰＯブロック共重合体を含むが、これらに限られない。
いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、血清アルブミンである１種又は複数種のタンパク質試薬、１種又は複数種のトレハロース糖類、及び、１種又は複数種の界面活性剤重合体試薬、例えば、ＥＯ－ＰＯブロック共重合体、ポロキサマー４０７、又は、より具体的にＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）を含むが、これらに限られない。
他の実施形態において、生ウイルスを安定化させるための製剤は、１種又は複数種の生フラビウイルス、１種又は複数種の炭水化物試薬及び１種又は複数種のアミノ酸又はその塩、エステル又はアミド誘導体を含んでもよい。他の実施形態において、本明細書に用いられる製剤で安定化された弱毒生フラビウイルスは、ビジネス用途に用いられる。いくつかの実施形態において、組成物は、さらに緩衝剤を含む。これらの実施形態によれば、緩衝液は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含むが、これらに限られない。これらの実施形態によれば、緩衝剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム及び／又はリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）及びリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）のうちの少なくとも１種を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物の緩衝剤は、濃度２５ｍＭ～２００ｍＭの塩化ナトリウムを含んでもよい。他の実施形態において、本明細書に開示されている組成物は、尿素及び／又はＭＳＧなどの他の適切な試薬を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、弱毒生フラビウイルス、例えば、西ナイルウィルスを製剤に安定化させることができ、前記製剤は、濃度０．１％～０．２％（ｗ／ｖ）の組換えＨＡＳ、及び／又は、濃度約４．０％～約６．０％（ｗ／ｖ）のショ糖、及び／又は、濃度約２％～４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、及び／又は、濃度約８．０ｍＭ～約２２．０ｍＭのアラニン、及び／又は、濃度約１．０ｍＭ～約５．０ｍＭのメチオニン、及び／又は、濃度約８．０ｍＭ～１２．０ｍＭのＭＳＧ、及び／又は、濃度約０．１％～約０．３％（ｗ／ｖ）の尿素を含むが、これらに限られない。いくつかの実施形態において、組成物は、組換えＨＳＡ、トレハロース、マンニトール、アラニン、メチオニン、ＭＳＧ、及び、尿素を含んでもよい。他の実施形態において、安定化組成物は、濃度約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）のＨＡＳ、濃度約４％～約６％（ｗ／ｖ）のトレハロース；濃度約２％～約４％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含み得、アラニン濃度は、８ｍＭ～２２ｍＭであり、メチオニン濃度は、１ｍＭ～５ｍＭであり、ＭＳＧ濃度は、８ｍＭ～１２ｍＭであり、尿素濃度は、０．１％～０．３％（ｗ／ｖ）である。弱毒生ウイルスを安定化させるためのいくつかの製剤は、組換えＨＳＡ、ショ糖、アラニン及び尿素を含むが、これらに限られない。これらの実施形態によれば、ＨＳＡ濃度は、約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）であってもよく、ショ糖濃度は、約４％～約６％（ｗ／ｖ）であってもよく、アラニン濃度は、約８．０ｍＭ～約２２ｍＭであってもよく、尿素濃度は、約０．１％～約０．３％（ｗ／ｖ）であってもよく。他の安定化製剤は、組換えＨＳＡ、ショ糖、メチオニン及び尿素を含んでもよい。組換えＨＳＡ濃度は、約０．１％～０．２％（ｗ／ｖ）であってもよく、ショ糖濃度は、約４．０％～約６．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、メチオニン濃度は、約１．０ｍＭ～約５．０ｍＭであってもよく、尿素濃度は、約０．１％～約０．３％（ｗ／ｖ）であってもよい。他の実施形態において、安定化製剤は、組換えＨＳＡ、ショ糖、アルギニン及び尿素を含んでもよく、組換えＨＳＡ濃度は、０．１％～０．２％（ｗ／ｖ）であってもよく、ショ糖濃度は、４％～６％（ｗ／ｖ）であってもよく、アルギニン濃度は、１０ｍＭ～５０ｍＭであってもよく、尿素濃度は、０．１％～０．３％（ｗ／ｖ）であってもよい。他の安定化製剤は、組換えＨＳＡ、トレハロース、アルギニン及び尿素を含んでもよく、組換えＨＳＡ濃度は、約０．１％～０．２％（ｗ／ｖ）であり、トレハロース濃度は、約４％～６％（ｗ／ｖ）であり、アルギニン濃度は、約１０ｍＭ～５０ｍＭであり、尿素濃度は、約０．１％～０．３％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において、安定化組成物は、組換えＨＳＡ、トレハロース、ＭＳＧ及び尿素を含んでもよい。これらの実施形態によれば、組換えＨＳＡ濃度は、約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）であってもよく、トレハロース濃度は、約４．０％～約６．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、ＭＳＧ濃度は、８ｍＭ～１２ｍＭであり、尿素濃度は、０．１％～０．３％（ｗ／ｖ）である。
本明細書のいくつかの実施形態は、輸送又はその他の理由で部分的又は完全に脱水された弱毒生ウイルス組成物に関する。これらの実施形態によれば、組成物は、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は、９０％以上の部分が脱水されたものである。これらの実施形態によれば、薬学的に許容される組成物は、被験者に投与される前に、ウイルスワクチン組成物は、脱水され、任意の既知の安定化組成物中で再水和されてもよい。
いくつかの実施形態において、被験者は、哺乳動物、例えば、ヒト又は獣医師、及び／又は、ペット又は家畜又は野生動物であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示に係る免疫原性組成物は、例えば、２０歳又はより若い小児などのティーンエイジャーである被験者を効果的に免疫することができる。小児に用いられる現在のデング熱ウイルスワクチン／免疫原性組成物（例えば、デング熱と黄熱病のキメリズム）に関する従来技術には９歳又はより若い小児に対する低い効力及び／又は免疫原性がレポートされているが、本明細書に開示されている免疫原性組成物は、約１歳～約１７歳、又は、約１歳～約９歳、又は、より大きな小児に効果的な免疫応答を生じる。従来技術に比べて、本明細書に開示されている免疫原性組成物は、優れた有効性と免疫原性を示す。
いくつかの実施形態において、フラビウイルス（例えば、西ナイルウィルス）に対する免疫原性組成物は、濃度約１．０×１０３～約５×１０５ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルス、濃度約１．０×１０３～約５×１０５ＰＦＵの生の西ナイルウィルス、濃度約５．０×１０３～約５×１０５ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルス、及び／又は濃度約１．０×１０４～約５×１０６ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルスの１種又は複数種を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている組成物及び方法で治療される被験者は、年あたり２回、年ごとに、１８ヶ月ごと、又は、類似するスケジュールで治療されてもよく、例えば、被験者の所在地及び旅行計画に応じて決定する。いくつかの実施形態において、西ナイルウィルスに対する免疫原性組成物は、濃度約２．０×１０４ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルス、濃度約５．０×１０３ＰＦＵの弱毒生西ナイルウィルス、濃度約１×１０５ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルス、及び／又は、濃度約３．０×１０５ＰＦＵの弱毒化西ナイルウィルスの１種又は複数種を含んでもよい。
従来技術に比べて、本開示は、次のような利点と効果を有する。
１．本開示に係る弱毒化フラビウイルス属ウイルス（例えば、西ナイルウィルス弱毒化株ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ））の構築に採用される逆遺伝学技術は、先進的で成熟、便利で簡単、位置制御可能等の利点を有する。
２．本開示に提供される弱毒化フラビウイルス属ウイルス（例えば、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ））は、Ｖｅｒｏにおいて培養及び増幅して高力価ウイルスを得ることができ、その取得方法は、簡単であり、その後のワクチンの生産を容易にし、コストを節約する。
３．本開示に提供される弱毒化フラビウイルス属ウイルス（例えば、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ））は、連続継代過程中、３’ＵＴＲが依然としてＳＬとＤＢ領域配列の欠失及び－ｐｏｌｙ（Ａ）配列の安定した存在を維持し、良好な遺伝的安定性を備える。
４．本開示に提供される弱毒化フラビウイルス属ウイルス（例えば、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ））は、高用量でＣ５７ＢＬ／６マウスを感染しても、病症を引き起こせず、マウスに十分に弱毒化されるため、安全性が高いと証明されている。１０４～１０７ＰＦＵ ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）による１回の免疫化により、マウスは、高レベルのＷＮＶ特異的ＩｇＧ抗体及び中和抗体を産生することができ、高致死量のＷＴ ＷＮＶのチャレンジを受けたマウスに完全な免疫保護を提供することができる。
５．本開示に提供される弱毒化フラビウイルス属ウイルス（例えば、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ））Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて、低用量（１０４ＰＦＵ）又は高用量（１０７ＰＦＵ）での免疫化後、いずれもマウスの体において高い体液免疫反応を長期間維持し、中和抗体のレベルは安定したまま、高用量のＷＴ ＷＮＶによりチャレンジした後でもマウスに完全な免疫保護を提供する。
上記の結果は、本開示に提供される弱毒化フラビウイルス株の一般的な調製方法が、安全で有効な弱毒化ワクチン株を調製することができ、これは、我が国及び世界範囲でフラビウイルスの潜在的な脅威に対処する上で良好な適用及び重要な戦略的意味を有することを示した。
本部分に係るプラスミド線状化、ＲＮＡインビトロ転写、トランスフェクション、ウイルス力価アッセイなどの試験方法は、特に断らない場合、当該技術分野における従来のものである。以下に挙げられたものは、本開示のいくつかの特定の実施形態に過ぎない。明らかに、本開示は、以下の実施形態に限定されるものではなく、多くの変形が可能である。従って、本開示に基づいて当業者になされるあらゆる修正又は改良は、本開示に請求される保護の範囲に含まれるものとする。
●実施例１：フラビウイルス弱毒化株クローンの構築及びウイルスレスキュー
１．フラビウイルス弱毒化株クローンの構築
フラビウイルス弱毒化株クローンの構築概略図を図１に示した。
野生型（ＷＴ）の西ナイルウィルス（ＷＮＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＷＮＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ２までの配列（５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２））を削除し、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ２までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドが得られ、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示した。
１．フラビウイルス弱毒化株クローンの構築
フラビウイルス弱毒化株クローンの構築概略図を図１に示した。
野生型（ＷＴ）の西ナイルウィルス（ＷＮＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＷＮＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ２までの配列（５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２））を削除し、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ２までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドが得られ、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示した。
野生型（ＷＴ）の日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＪＥＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ２までの配列（ＳＬＩ、ＳＬＩＩ、ＲＣＳ３、ＳＬＩＩＩ、ＳＬＩＶ、ＣＳ３、ＤＢ１、ＲＣＳ２、ＤＢ２、ＣＳ２を含む）を削除し、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ２までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１５０個アデニル酸）を挿入し、ＪＥＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドが得られ、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示した。
野生型（ＷＴ）のデング熱ウイルス２型ニューギニア島株（ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ））毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ２までの配列（ＳＬＩＩ、ＲＣＳ３、ＳＬＩＶ、ＣＳ３、ＤＢ１、ＲＣＳ２、ＤＢ２、ＣＳ２を含む）を削除し、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ２までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１４０個アデニル酸）を挿入し、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドが得られ、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示した。
野生型（ＷＴ）の黄熱ウイルス（ＹＦＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＹＦＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ２までの配列（ＳＬＩＩ、ＲＣＳ３、ＤＢを含む）を削除し、３’非翻訳領域のステムループ領域（ＳＬ）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ２までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドが得られ、そのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示した。
前記毒株プラスミドは、いずれも３’ＵＴＲ領域における５’末端ステムループ領域（ＳＬ）配列の全部又は一部及びＤＢ配列の全部をｐｏｌｙ（Ａ）配列に置換し、少なくとも３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留して得られた対応するｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドであった。
２．ｐｏｌｙ（Ａ）でインビトロ転写したＲＮＡ
ステップ１で得られたｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドを線状化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で完全な線状化を確認した後、フェノール－クロロホルム抽出を行い、最後にＲＮＡａｓｅを含有しない水１１μＬを添加し溶解し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００でＤＮＡの濃度を測定し、電気泳動によりＤＮＡの質量を検出した。フェノール－クロロホルム抽出後のＤＮＡ １μｇを鋳型として、インビトロ転写キットＴ７ ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）により、キット取扱説明書に従い、インビトロ転写して組換えｐｏｌｙ（Ａ） ＲＮＡ、即ち、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株のゲノムＲＮＡが得られた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００によりＲＮＡの濃度を測定し、新たに調製された０．８％アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡの質量を検出し、－８０℃で保存して使用に備える。
ステップ１で得られたｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株プラスミドを線状化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で完全な線状化を確認した後、フェノール－クロロホルム抽出を行い、最後にＲＮＡａｓｅを含有しない水１１μＬを添加し溶解し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００でＤＮＡの濃度を測定し、電気泳動によりＤＮＡの質量を検出した。フェノール－クロロホルム抽出後のＤＮＡ １μｇを鋳型として、インビトロ転写キットＴ７ ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）により、キット取扱説明書に従い、インビトロ転写して組換えｐｏｌｙ（Ａ） ＲＮＡ、即ち、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス弱毒化株のゲノムＲＮＡが得られた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００によりＲＮＡの濃度を測定し、新たに調製された０．８％アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡの質量を検出し、－８０℃で保存して使用に備える。
３．ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルスレスキュー
試験は、以下の２つの群に分けられた。
（１）試験群：ステップ２にインビトロ転写して得られた組換えｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを、リポソームトランスフェクションによりＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクトした。
（２）対照群：陽性対照として、野生型ウイルスＲＮＡをリポソームトランスフェクションによりＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクトした。
試験は、以下の２つの群に分けられた。
（１）試験群：ステップ２にインビトロ転写して得られた組換えｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを、リポソームトランスフェクションによりＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクトした。
（２）対照群：陽性対照として、野生型ウイルスＲＮＡをリポソームトランスフェクションによりＢＨＫ－２１細胞にトランスフェクトした。
具体的な試験手順は、次のとおりであった。トランスフェクションの日に細胞を約８０％に逹させるために、トランスフェクションの前日に、２×１０５個ＢＨＫ－２１細胞を３５ｍｍ細胞培養ディッシュに接種し、各ディッシュに３枚の１０ｍｍ×１０ｍｍのカバーガラスを置き、トランスフェクションの際、まず、培養ディッシュ内の培地を捨て、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １ｍｌで１回洗浄し、そして（細胞を浸潤状態になるように）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １ｍｌを添加し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １ｍｌを１．５ ｍｌ ＥＰチューブに加え、ＤＭＲＩＥ－Ｃ ４μｌ（ＤＭＲＩＥ－Ｃを使用する前によく混ぜる）をまず上下反転することで均一に混合し、そして試験群にそれぞれインビトロで転写された組換えｐｏｌｙ（Ａ） ＲＮＡ １μｇを加え、対照群に野生型ウイルスＲＮＡ １μｇを加え、上下逆さにすることで均一的に混合し、培養ディッシュ内のＯｐｔｉ－ＭＥＭを素早く捨て、混合物をディッシュに加え（細胞に対して息を吹きかけず、優しく動く）、３７℃でＣＯ２インキュベーター内に４ｈ培養した後、培養物を廃棄し、そしてそれぞれ２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地２ｍＬを添加した。試験群と対照群の細胞状態を顕微鏡で観察し、トランスフェクション後の２４ｈ、４８ｈ、７２ｈにそれぞれ１枚のスライドガラスを採取し、５％アセトン固定液（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入）で細胞を固定し、室温で１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、４℃で保存し、ＩＦＡ検出陽性率が高い時にそれぞれ上清を弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルスとして回収し、即ち、４種類のＰ０世代ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株が得られ、－８０℃で保存した。
４．間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）による組換えｐｏｌｙ（Ａ）のウイルスタンパク質発現の検出
上記のステップ３における４℃に保存されたスライドガラスにより室温で一次抗体をインキュベートし、フラビウイルス弱毒化株抗体は、４Ｇ２モノクローナル抗体（フラビウイルスＥタンパク質に対する万能抗体）を１：５００倍に希釈したものである。室温で一次抗体を１～２ｈインキュベートし、ＰＢＳで１０回リンスした後、二次抗体を室温で遮光してインキュベートし、抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス抗体を１：１２５倍に希釈したものである。二次抗体を１ｈインキュベートした後、ＰＢＳで１０回リンスし、スライドガラスを取り出し、マークし、各マークに９５％グリセロールを滴下し、カバーガラスの細胞側を下に向かって、グリセロール滴の上に置き、２００倍の放大倍率で蛍光顕微鏡で観察した（図１）。
上記のステップ３における４℃に保存されたスライドガラスにより室温で一次抗体をインキュベートし、フラビウイルス弱毒化株抗体は、４Ｇ２モノクローナル抗体（フラビウイルスＥタンパク質に対する万能抗体）を１：５００倍に希釈したものである。室温で一次抗体を１～２ｈインキュベートし、ＰＢＳで１０回リンスした後、二次抗体を室温で遮光してインキュベートし、抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス抗体を１：１２５倍に希釈したものである。二次抗体を１ｈインキュベートした後、ＰＢＳで１０回リンスし、スライドガラスを取り出し、マークし、各マークに９５％グリセロールを滴下し、カバーガラスの細胞側を下に向かって、グリセロール滴の上に置き、２００倍の放大倍率で蛍光顕微鏡で観察した（図１）。
図１の結果は、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、各時点での陽性率がすべてＷＴより低かったが、トランスフェクション後の培養時間が長くなると、陽性細胞数は、ＷＴと同じ傾向で徐々に増加し、ＷＮＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）は、いずれも感染性を持ったウイルス粒子をレスキューしたことを示している。
●実施例２ 他の西ナイルウィルス弱毒化株クローンの構築及びウイルスレスキュー
１．他の西ナイルウィルス弱毒化株クローンの構築
他の西ナイルウィルス弱毒化株クローンの構築概略図を図２に示した。
実施例１における野生型（ＷＴ）の西ナイルウィルス（ＷＮＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＷＮＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ３までの配列（ＳＬＩ、ＳＬＩＩ、ＲＣＳ３、ＳＬＩＩＩ、ＳＬＩＶ、ＣＳ３を含む）を削除し、３’非翻訳領域のダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ３までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ステムループ領域（ＳＬ）欠失の西ナイルウィルスＳＬ－ｄｅｌ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株プラスミドが得られた。
１．他の西ナイルウィルス弱毒化株クローンの構築
他の西ナイルウィルス弱毒化株クローンの構築概略図を図２に示した。
実施例１における野生型（ＷＴ）の西ナイルウィルス（ＷＮＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＷＮＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＳＬＩからＣＳ３までの配列（ＳＬＩ、ＳＬＩＩ、ＲＣＳ３、ＳＬＩＩＩ、ＳＬＩＶ、ＣＳ３を含む）を削除し、３’非翻訳領域のダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＳＬＩからＣＳ３までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ステムループ領域（ＳＬ）欠失の西ナイルウィルスＳＬ－ｄｅｌ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株プラスミドが得られた。
実施例１における野生型（ＷＴ）の西ナイルウィルス（ＷＮＶ）毒株の感染性クローンのプラスミドＤＮＡを骨格とし、ＷＮＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＤＢ１からＣＳ１までの配列（ＤＢ１、ＲＣＳ２、ＤＢ２、ＣＳ２、ＣＳ１を含む）を削除し、３’非翻訳領域における５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）及び短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）を保留し、ＤＢ１からＣＳ１までの配列の削除による欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列（１３０個アデニル酸）を挿入し、ダンベル領域（ＤＢ）欠失の西ナイルウィルスＤＢ－ｄｅｌ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株プラスミドが得られた。
２．ｐｏｌｙ（Ａ）でインビトロ転写したＲＮＡ
転写方法は、実施例１のステップ２に記載したとおりであった。
転写方法は、実施例１のステップ２に記載したとおりであった。
３．ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルスレスキュー
レスキュー方法は、実施例１のステップ３に記載したとおりであった。
レスキュー方法は、実施例１のステップ３に記載したとおりであった。
４．間接免疫蛍光（ＩＦＡ）による組換えｐｏｌｙ（Ａ）のウイルスタンパク質発現の検出
検出方法は、実施例１のステップ４に記載したとおりであった。
蛍光顕微鏡観察の結果を図２に示した。図２の結果から、フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部を削除し、５’ＳＬ及びＤＢ全体が欠失させず、欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入して得られたウイルスは、同様にウイルスを産生する。
検出方法は、実施例１のステップ４に記載したとおりであった。
蛍光顕微鏡観察の結果を図２に示した。図２の結果から、フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部を削除し、５’ＳＬ及びＤＢ全体が欠失させず、欠失部位にｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入して得られたウイルスは、同様にウイルスを産生する。
●実施例３：フラビウイルス弱毒化株と野生型ウイルスの増殖曲線の比較
１．ウイルス力価の測定
プラークアッセイ法でウイルスの力価を測定し、具体的なステップは、以下の通りであった。
２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ１×１０５個のＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時点でウェル内の培地を捨て、実施例１のステップ３で収集された弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルスを２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０倍に希釈したもの１００μｌを加え、３７℃で１ｈ吸着させ、１５分間ごとに１回十分に振った。吸着終了後、各ウェルからウイルス液を抽出し廃棄し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地及び２％メチルセルロースのコーティングを加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ ｍｉｎ処理した後、ウェル内の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗い、乾燥した後カウントし、ウイルス力価に換算した。
１．ウイルス力価の測定
プラークアッセイ法でウイルスの力価を測定し、具体的なステップは、以下の通りであった。
２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ１×１０５個のＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時点でウェル内の培地を捨て、実施例１のステップ３で収集された弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルスを２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０倍に希釈したもの１００μｌを加え、３７℃で１ｈ吸着させ、１５分間ごとに１回十分に振った。吸着終了後、各ウェルからウイルス液を抽出し廃棄し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地及び２％メチルセルロースのコーティングを加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ ｍｉｎ処理した後、ウェル内の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗い、乾燥した後カウントし、ウイルス力価に換算した。
２．ウイルス増殖曲線の測定
３５ｍｍ細胞培養ディッシュに２×１０５Ｖｅｒｏ細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２培養条件で細胞コンフルエンスが６０％に達した時、実施例１のステップ３で収集された弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルス及び対応する野生型（ＷＴ）ウイルスを、感染効率ＭＯＩ ０．１で各ディッシュに別々に添加した。３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに２ｈ吸着した後、ウイルス液を捨て、各ウェルに２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養条件で培養し、感染した後、１２ｈごとにウイルス上清４００μｌを採取し、２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地４００μｌを追加し、収集されたウイルスをｐｏｌｙ（Ａ）ウイルスと対応するＷＴウイルスの同一感染効率での異なる時間点のウイルスサンプルとし、－８０℃で保存した。前記プラークアッセイ法で異なる時間点で収集されたウイルスの力価を測定し、増殖曲線をプロットした（図３）。その結果、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、対応するＷＴと比べて、類似する増殖傾向を示したが、力価がいずれも野生型に比べて１０～１００倍低下することを示した。
３５ｍｍ細胞培養ディッシュに２×１０５Ｖｅｒｏ細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２培養条件で細胞コンフルエンスが６０％に達した時、実施例１のステップ３で収集された弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルス及び対応する野生型（ＷＴ）ウイルスを、感染効率ＭＯＩ ０．１で各ディッシュに別々に添加した。３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに２ｈ吸着した後、ウイルス液を捨て、各ウェルに２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養条件で培養し、感染した後、１２ｈごとにウイルス上清４００μｌを採取し、２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地４００μｌを追加し、収集されたウイルスをｐｏｌｙ（Ａ）ウイルスと対応するＷＴウイルスの同一感染効率での異なる時間点のウイルスサンプルとし、－８０℃で保存した。前記プラークアッセイ法で異なる時間点で収集されたウイルスの力価を測定し、増殖曲線をプロットした（図３）。その結果、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、対応するＷＴと比べて、類似する増殖傾向を示したが、力価がいずれも野生型に比べて１０～１００倍低下することを示した。
●実施例４：フラビウイルス弱毒化株の遺伝的安定性の検証
１．実施例１のレスキューにより得られた弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）は、明らかであり、細胞上清（Ｐ１世代）を収集し、各世代で３株のウイルスを並行して感染させ、１０世代を連続して盲検継代した後、Ｐ１、Ｐ５、Ｐ１０世代から収集されたウイルスに感染された細胞サンプルからＴｒｉｚｏｌキットの取扱説明書に従い、ウイルスのＲＮＡを抽出し、－８０℃で保存して使用に備える。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ＫｉｔでＲＴ－ＰＣＲを行い、３’ＵＴＲの変化を検出し、シーケンスした。シーケンスの結果、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）は、１０世代を連続して継代してもｐｏｌｙＡ挿入位置及び約１３０～１５０Ａの挿入数がほぼ変化していなかった（図４）。
１．実施例１のレスキューにより得られた弱毒化フラビウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）Ｐ０世代ウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）は、明らかであり、細胞上清（Ｐ１世代）を収集し、各世代で３株のウイルスを並行して感染させ、１０世代を連続して盲検継代した後、Ｐ１、Ｐ５、Ｐ１０世代から収集されたウイルスに感染された細胞サンプルからＴｒｉｚｏｌキットの取扱説明書に従い、ウイルスのＲＮＡを抽出し、－８０℃で保存して使用に備える。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ＫｉｔでＲＴ－ＰＣＲを行い、３’ＵＴＲの変化を検出し、シーケンスした。シーケンスの結果、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）は、１０世代を連続して継代してもｐｏｌｙＡ挿入位置及び約１３０～１５０Ａの挿入数がほぼ変化していなかった（図４）。
２．Ｐ１、Ｐ１０世代で採取された上清ウイルス液を取り、感染効率ＭＯＩ０．１でＶｅｒｏ細胞における増殖曲線の比較を行い（方法は、実施例２と同様である）、その結果、図４におけるｐｏｌｙ（Ａ）－Ｐ１０に示されているように、１０世代を継代した前後、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＪＥＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）、ＤＥＮＶ－２（ＮＧＣ）－ｐｏｌｙ（Ａ）及びＹＦＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルス株は、それぞれのＰ１とＰ１０世代増殖曲線がいずれも類似し、前記ｐｏｌｙ（Ａ）ウイルスが良好な遺伝的安定性を有することをさらに示した。
●実施例５：弱毒化西ナイルウィルスの病原性
本実施例では、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）弱毒化株ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）のＣ５７ＢＬ／６における病原性を検証した。
本実施例では、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）弱毒化株ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）のＣ５７ＢＬ／６における病原性を検証した。
４週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス６群（５匹／群）を取り、それぞれ実施例３で得られたＰ１世代ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０４ＰＦＵ、１０５ＰＦＵ、１０６ＰＦＵ又は１０７ＰＦＵ及び対応する野生型西ナイルウイルス（ＷＴ ＷＮＶ）１０４ＰＦＵで腹腔内に感染させ、等体積のＰＢＳを注入したマウスをコントロールとした。感染後の１日目、２日目、３日目にマウス血清におけるウイルス力価を検出することでウイルス含有血液を測定し、具体な方法として、毎匹マウスの眼窩から血液約１００μｌを１．５ｍｌのＥＰチューブに採取し、４℃で３ｈ静置した後、５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して血清を回収し、ウイルス力価の測定に用いられ、測定方法は、実施例１のウイルス力価の測定と同様であった。同時に、感染した後、マウスの体重を連続して１４日間量り、２１日間のマウスの生存状況を観察した。
その結果、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株を接種したマウスは、いずれも生きており（図５のＡ）、１０７ＰＦＵ ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株を接種したマウスについて、１日目のみ低い病原性が検出された以外、他の用量で接種されたマウスは、いずれもウイルス血症を検出せず（図５のＢ）、体重がＰＢＳ免疫群マウスの変化と一致し（図５のＣ）、その他の発病状態が確認されなかった。しかしながら、ＷＴ ＷＮＶ１０４ＰＦＵを接種したマウスは、ウイルス血症を示し（図５のＢ）、体重が５日目から著しく低下し（図５のＣ）、８日目に全部死亡した（図５のＡ）。これは、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株の毒力が十分に低く、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに病原性がなく、高い安全性を有し、潜在的な弱毒生ワクチンとして使用できることを示している。
●実施例６：マウスモデルにおける弱毒化西ナイルウィルスの体液免疫及びチャレンジ保護效果
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおける体液免疫及びチャレンジ保護效果を考察するものであった。
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおける体液免疫及びチャレンジ保護效果を考察するものであった。
１．ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおける体液免疫
４週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス６群（５匹／群）を取り、それぞれ実施例３で得られたＰ１世代ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０４ＰＦＵ、１０５ＰＦＵ、１０６ＰＦＵ又は１０７ＰＦＵを腹腔内に免疫させ、等体積のＰＢＳで免疫したマウス及び何の処理もしなかったＭｏｃｋ群マウスをコントロールとして使用した。免疫後の１４日目及び２８日目に実施例４の眼窩採血方法で採血し、４℃で３ｈ静置した後、遠心分離し、血清を回収し、５６℃で３０ｍｉｎ不活化し、－２０℃で凍結保存して使用に備える。
４週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス６群（５匹／群）を取り、それぞれ実施例３で得られたＰ１世代ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０４ＰＦＵ、１０５ＰＦＵ、１０６ＰＦＵ又は１０７ＰＦＵを腹腔内に免疫させ、等体積のＰＢＳで免疫したマウス及び何の処理もしなかったＭｏｃｋ群マウスをコントロールとして使用した。免疫後の１４日目及び２８日目に実施例４の眼窩採血方法で採血し、４℃で３ｈ静置した後、遠心分離し、血清を回収し、５６℃で３０ｍｉｎ不活化し、－２０℃で凍結保存して使用に備える。
ＥＬＩＳＡでＩｇＧ抗体力価を検出し、ＰＲＮＴ５０で中和抗体力価を検出した。
１）ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体力価の検出
ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で９６ウェルプレートを被覆し、ＰＢＳで調製された５％スキムミルクでブロックし、血清を１：５０から４倍で段階希釈した後、被覆された９６ウェルプレートと３７℃で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、３７℃でＨＲＰヤギ抗マウス抗体を１ｈインキュベートし、２成分発色キット（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）で発色させ、１ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を終了させた後、多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を検出し、ＩｇＧ抗体力価は、免疫後のマウス血清の吸光度が非免疫マウス血清の吸光度の２倍となったときの最も高い希釈率であった。
１）ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体力価の検出
ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で９６ウェルプレートを被覆し、ＰＢＳで調製された５％スキムミルクでブロックし、血清を１：５０から４倍で段階希釈した後、被覆された９６ウェルプレートと３７℃で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、３７℃でＨＲＰヤギ抗マウス抗体を１ｈインキュベートし、２成分発色キット（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）で発色させ、１ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を終了させた後、多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を検出し、ＩｇＧ抗体力価は、免疫後のマウス血清の吸光度が非免疫マウス血清の吸光度の２倍となったときの最も高い希釈率であった。
２）ＰＲＮＴ５０による中和抗体力価の検出
１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ２×１０５個のＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時、まず、血清を２倍で段階希釈し、希釈された抗体１００ μｌをそれぞれ等体積の１００ ＰＦＵ ＷＴ－ＷＮＶと均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートし、ウェル内の培地を捨て、インキュベートした後の血清－ウイルス混合物を、対応するウェルに添加し、３７℃で１ｈ吸着し、１５分間ごとに１回十分に振り、吸着が終了した後、各ウェルのウイルス液を抽出し廃棄し、２％メチルセルロース含有コーティング１ｍＬを加え、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに７２ｈ培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ｍｉｎ処理した後、ウェル内の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗浄し、乾燥した後、各希釈度での血清中和後のウイルス力価をカウントし、血清の中和抗体力価（ＰＲＮＴ５０）は、ウイルス力価が５０％中和された時の血清の最も高い希釈度であった。
１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ２×１０５個のＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時、まず、血清を２倍で段階希釈し、希釈された抗体１００ μｌをそれぞれ等体積の１００ ＰＦＵ ＷＴ－ＷＮＶと均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートし、ウェル内の培地を捨て、インキュベートした後の血清－ウイルス混合物を、対応するウェルに添加し、３７℃で１ｈ吸着し、１５分間ごとに１回十分に振り、吸着が終了した後、各ウェルのウイルス液を抽出し廃棄し、２％メチルセルロース含有コーティング１ｍＬを加え、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに７２ｈ培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ｍｉｎ処理した後、ウェル内の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗浄し、乾燥した後、各希釈度での血清中和後のウイルス力価をカウントし、血清の中和抗体力価（ＰＲＮＴ５０）は、ウイルス力価が５０％中和された時の血清の最も高い希釈度であった。
その結果、異なる用量のＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で１回免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、１４日後、強い抗体反応を生じ、免疫後２８日目にＩｇＧ抗体力価と中和抗体力価が両方とも増加することが示された。異なる用量で免疫されたマウスに産生された特異的ＩｇＧ抗体力価は、有意な用量依存性がなく、免疫後２８日目のＩｇＧ抗体力価は、いずれも１：１２８００程度（図６のＡ）であった。中和抗体レベルは、免疫用量の増加とともに増加し、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０４ＰＦＵで免疫したマウスは、２８日目の中和抗体力価が１：４０～１：８０であるが、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０７ＰＦＵで免疫したマウスは、中和抗体力価が１：１６０～１：６４０であった（図６のＢ）。ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫化後、ＷＮＶに対して強力な抗体反応を生じることが証明された。
２．ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるチャレンジ保護效果
免疫後の３０日目、Ｍｏｃｋ群に対しては何の処理もせず、その他の５群のマウスに対してＷＴ ＷＮＶ１０７ＰＦＵでそれぞれ腹腔内にチャレンジした。毎日、マウスの生存状況を記録し、体重を量り、チャレンジ後の２日目に実施例４の方法に従い、ウイルス含有血液を測定した。その結果、ＰＢＳで免疫した対照群マウスは、チャレンジ後、５日目に顕著に体重を低減し始めたことを示し（図６のＤ）、チャレンジ後の２日目に比較的に高いウイルス含有血液レベルが検出され（図６のＥ）、毛髪の乱れ、後肢の麻痺などの発症症状が現れ、９日目に全部死亡した（図６のＣ）。ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫したマウスは、いずれも生存し、何の処理もしなかったＭｏｃｋ群のマウスと同様に、何の発症症状もなく、ウイルス含有血液が検出されなかった。上記試験には、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、弱毒化ワクチンとしてＣ５７ＢＬ／６マウスに対して良好な免疫保護を提供できることが示された。
免疫後の３０日目、Ｍｏｃｋ群に対しては何の処理もせず、その他の５群のマウスに対してＷＴ ＷＮＶ１０７ＰＦＵでそれぞれ腹腔内にチャレンジした。毎日、マウスの生存状況を記録し、体重を量り、チャレンジ後の２日目に実施例４の方法に従い、ウイルス含有血液を測定した。その結果、ＰＢＳで免疫した対照群マウスは、チャレンジ後、５日目に顕著に体重を低減し始めたことを示し（図６のＤ）、チャレンジ後の２日目に比較的に高いウイルス含有血液レベルが検出され（図６のＥ）、毛髪の乱れ、後肢の麻痺などの発症症状が現れ、９日目に全部死亡した（図６のＣ）。ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫したマウスは、いずれも生存し、何の処理もしなかったＭｏｃｋ群のマウスと同様に、何の発症症状もなく、ウイルス含有血液が検出されなかった。上記試験には、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、弱毒化ワクチンとしてＣ５７ＢＬ／６マウスに対して良好な免疫保護を提供できることが示された。
●実施例７：弱毒化西ナイルウィルスのマウスモデルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を考察した。
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を考察した。
抗西ナイルウィルス（ＷＮＶ）感染において、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、重要な役割を果たす。ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株でマウスを免疫した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導できるかどうかを検出するために、２群の６～８周齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（３匹／群）を取り、１つの群には、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０７ＰＦＵを腹腔内に免疫し、もう１つの群にコントロールとして等体積のＰＢＳで免疫した。免疫した後、７日目にマウスの脾臓を摘出し、特異的ポリペプチド（ＷＮＶ Ｅタンパク質とＮＳ４Ｂタンパク質）でインビトロで刺激すると共に、陽性対照として、非特異的刺激剤であるホルボールミリスタートアセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ））及びイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ＩＯＮＯ））によりインビトロで刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴ法でＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞増殖状況を検出した。その結果を図７に示し、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫されたマウスは、ＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞が特異的ポリペプチド及び非特異的刺激剤の場合で有意な活性化を示したが、Ｍｏｃｋ群のマウスでは、特異的ポリペプチドの刺激でＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の活性化が示されなかった。上記の結果は、本開示にレスキューされたＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株でＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫した後、ＷＮＶ Ｅタンパク質及びＮＳ４Ｂエピトープ特性に対してより強力なＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞応答を生じることができることを示した。
●実施例８：弱毒化西ナイルウィルスのマウスモデルにおける長期的な免疫保護效果
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６における長期的な免疫保護效果を考察した。
本実施例では、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＣ５７ＢＬ／６における長期的な免疫保護效果を考察した。
４週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス３群（５匹／群）を取り、それぞれ１０４ＰＦＵと１０７ＰＦＵのＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で腹腔内に免疫し、ＰＢＳで免疫されたマウスをコントロールとした。免疫後の２８日目、５６日目、１１２日目及び１６８日目に眼窩から採血し、実施例５の方法で特異的ＩｇＧと中和抗体力価を検出した。免疫後の１７０日目にＷＴ ＷＮＶ１０７ ＰＦＵを腹腔内に感染させ、チャレンジ試験を行い、チャレンジ後、２日目に実施例４の方法でウイルス含有血液を測定し、マウスの生存率を測定した。その結果、１０４ＰＦＵと１０７ＰＦＵのＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫されたマウスに引き起こされた特異的ＩｇＧ抗体及び中和抗体力価は、１６８日以内に基本的に安定したままであり（図８のＡとＢ）、チャレンジ後、マウスの生存率は、１００％であり、チャレンジ後、２日目にウイルス含有血液が検出されなかった（図８のＣとＤ）。上記試験は、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株がマウスに長期的な免疫保護を提供できることを証明した。
●実施例９：弱毒化デング熱ウイルスの病原性
本実施例では、ＤＥＮＶ弱毒化株ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）のＡＧ１２９における病原性を考察した。
本実施例では、ＤＥＮＶ弱毒化株ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）のＡＧ１２９における病原性を考察した。
４週齢のメスＡＧ１２９マウス５群（５匹／群）を取り、それぞれ１０３ＰＦＵ、１０４ＰＦＵ又は１０５ＰＦＵのＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株及び１０４ＰＦＵ ＷＴのＤＥＮＶを腹腔内に感染させ、等体積ＰＢＳを注射したマウスをコントロールとした。感染後の２日目、３日目にマウス血清のウイルス力価を検出することでウイルス含有血液を測定し、具体的な方法として、各マウスから約１００μｌの眼窩血液を１．５ｍｌのＥＰチューブに採取し、４℃で３ｈ静置した後、５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、血清を回収し、ウイルス力価の測定に用いられ、測定方法は、実施例１のウイルス力価の測定と同様であった。同時に、感染後、７日間連続してマウスの体重を測定し、２７日以内のマウスの生存状況を観察した。
その結果、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株を接種したマウスは、いずれも生存し（図９のＡ）、各用量ではウイルス血症が検出されず（図９のＢ）、体重の変化は、ＰＢＳ免疫群のマウスの体重の変化と一致し（図９のＣ）、その他の発症状況が観察されなかった。ＷＴ ＤＥＮＶ １０４ＰＦＵを接種したマウスは、ウイルス血症を示し（図９のＢ）、体重が１０日目から著しく減少し始め（図９のＣ）、２１日目に全部死亡した（図９のＡ）。ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株の毒力は、十分に低下し、ＡＧ１２９マウスにおいて病原性がなく、高い安全性を有し、潜在的な弱毒生ワクチンとして使用できることを示した。
●実施例１０：弱毒化デング熱ウイルスのマウスモデルにおける体液免疫及びチャレンジ保護效果
本実施例は、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＡＧ１２９マウスモデルにおける体液免疫及びチャレンジ保護效果を考察した。
本実施例は、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＡＧ１２９マウスモデルにおける体液免疫及びチャレンジ保護效果を考察した。
１．ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＡＧ１２９マウスモデルにおける体液免疫
４週齢のメスＡＧ１２９マウス５群（５匹／群）を取り、それぞれ実施例３で得られたＰ１世代ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０３ＰＦＵ、１０４ＰＦＵ又は１０５ＰＦＵで腹腔内に免疫し、等体積のＰＢＳで免疫されたマウス及び何の処理もしなかったＭｏｃｋ群マウスをコントロールとして使用した。免疫後の２８日目に実施例４の眼窩採血方法で採血し、４℃で３ｈ静置した後、遠心分離し、血清を回収し、５６℃で３０ｍｉｎ不活化し、－２０℃で凍結保存して使用に備える。
４週齢のメスＡＧ１２９マウス５群（５匹／群）を取り、それぞれ実施例３で得られたＰ１世代ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０３ＰＦＵ、１０４ＰＦＵ又は１０５ＰＦＵで腹腔内に免疫し、等体積のＰＢＳで免疫されたマウス及び何の処理もしなかったＭｏｃｋ群マウスをコントロールとして使用した。免疫後の２８日目に実施例４の眼窩採血方法で採血し、４℃で３ｈ静置した後、遠心分離し、血清を回収し、５６℃で３０ｍｉｎ不活化し、－２０℃で凍結保存して使用に備える。
ＥＬＩＳＡでＩｇＧ抗体力価を検出し、ＰＲＮＴ５０で中和抗体力価を検出した。
１）ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体力価の検出
ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で９６ウェルプレートを被覆し、ＰＢＳで調製された５％スキムミルクでブロックし、血清を１：５０から４倍で段階希釈した後、被覆された９６ウェルプレートと３７℃で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄した後、３７℃でＨＲＰヤギ抗マウス抗体を１ｈインキュベートし、２成分発色キット（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）で発色させ、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を終了させた後、多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を検出し、ＩｇＧ抗体力価は、免疫後のマウスの血清の吸光度が非免疫マウス血清の吸光度の２倍となったときの最も高い希釈率であった。
１）ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体力価の検出
ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で９６ウェルプレートを被覆し、ＰＢＳで調製された５％スキムミルクでブロックし、血清を１：５０から４倍で段階希釈した後、被覆された９６ウェルプレートと３７℃で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄した後、３７℃でＨＲＰヤギ抗マウス抗体を１ｈインキュベートし、２成分発色キット（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）で発色させ、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を終了させた後、多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を検出し、ＩｇＧ抗体力価は、免疫後のマウスの血清の吸光度が非免疫マウス血清の吸光度の２倍となったときの最も高い希釈率であった。
２）ＰＲＮＴ５０による中和抗体力価の検出
１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ２×１０５個ＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時、まず、血清を２倍で段階希釈し、希釈された抗体１００μｌをそれぞれ等体積のＷＴ－ＤＥＮＶ １００ ＰＦＵと均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートし、ウェル内の培地を捨て、インキュベートした後の血清－ウイルス混合物を、対応するウェルに添加し、３７℃で１ｈ吸着し、１５分ごとに１回十分に振り、吸着が終了した後、各ウェルのウイルス液を抽出し廃棄し、２％メチルセルロース含有コーティング１ｍＬを加え、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに７２ｈ培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ｍｉｎ処理した後、ウェル中の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗い、乾燥した後、各希釈度での血清の中和後のウイルス力価をカウントし、血清の中和抗体力価（ＰＲＮＴ５０）は、ウイルス力価が５０％中和された時の血清の最も高い希釈度であった。
１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ２×１０５個ＢＨＫ－２１細胞を接種し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時、まず、血清を２倍で段階希釈し、希釈された抗体１００μｌをそれぞれ等体積のＷＴ－ＤＥＮＶ １００ ＰＦＵと均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートし、ウェル内の培地を捨て、インキュベートした後の血清－ウイルス混合物を、対応するウェルに添加し、３７℃で１ｈ吸着し、１５分ごとに１回十分に振り、吸着が終了した後、各ウェルのウイルス液を抽出し廃棄し、２％メチルセルロース含有コーティング１ｍＬを加え、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに７２ｈ培養し、プラークが形成した後、１％クリスタルバイオレット及び３．７％ホルムアルデヒドを含む染色液で染色し、室温で３０ｍｉｎ処理した後、ウェル中の染色液を抽出し、ウェルの底を流水で洗い、乾燥した後、各希釈度での血清の中和後のウイルス力価をカウントし、血清の中和抗体力価（ＰＲＮＴ５０）は、ウイルス力価が５０％中和された時の血清の最も高い希釈度であった。
その結果、異なる用量のＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で１回免疫されたＡＧ１２９マウスは、２８日後、強い抗体反応を生じた。ＩｇＧ抗体力価は、いずれも１：３２００～１：１２８００程度（図１０のＡ）であった。中和抗体レベルは、免疫用量の増加とともに増加し、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０３ＰＦＵで免疫されたマウスは、２８日目の中和抗体力価が１：４０～１：８０にあったが、ＷＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株１０５ＰＦＵで免疫されたマウスは、中和抗体力価が１：８０～１：１６０であった（図６のＢ）。上記試験では、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株は、ＡＧ１２９マウスを免疫した後、ＤＥＮＶに対して強力な抗体反応を生じることが証明された。
２．ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株のＡＧ１２９マウスモデルにおけるチャレンジ保護效果
免疫後、第３０日目に何も処置を受けなかったＭｏｃｋ群以外、他の４つの群のマウスは、それぞれＷＴ ＤＥＮＶ １０６ＰＦＵで腹腔内をチャレンジした。毎日、マウスの生存状況を記録し、体重を測定し、チャレンジ後の第３日目、実施例４の方法に従いウイルス含有血液を測定した。その結果、ＰＢＳで免疫された対照群マウスは、チャレンジ後の第４日目から体重の有意な減少を出始め（図１０のＤ）、チャレンジ後の第３日目に比較的にレベルの高いウイルス含有血液を検出し（図１０のＥ）、背中の毛が立ち上がる発病症状などが現れ、第１６日に全部死亡した（図１０のＣ）。ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫されたマウスは、全部生存し、何も処置を受けなかったＭｏｃｋ群のマウスと類似し、何の発病症状もなく、ウイルス含有血液も検出されなかった。上記の試験により、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株が弱毒化ワクチンとしてＡＧ１２９マウスに良好な免疫保護を提供できることが実証された。
免疫後、第３０日目に何も処置を受けなかったＭｏｃｋ群以外、他の４つの群のマウスは、それぞれＷＴ ＤＥＮＶ １０６ＰＦＵで腹腔内をチャレンジした。毎日、マウスの生存状況を記録し、体重を測定し、チャレンジ後の第３日目、実施例４の方法に従いウイルス含有血液を測定した。その結果、ＰＢＳで免疫された対照群マウスは、チャレンジ後の第４日目から体重の有意な減少を出始め（図１０のＤ）、チャレンジ後の第３日目に比較的にレベルの高いウイルス含有血液を検出し（図１０のＥ）、背中の毛が立ち上がる発病症状などが現れ、第１６日に全部死亡した（図１０のＣ）。ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株で免疫されたマウスは、全部生存し、何も処置を受けなかったＭｏｃｋ群のマウスと類似し、何の発病症状もなく、ウイルス含有血液も検出されなかった。上記の試験により、ＤＥＮＶ－ｐｏｌｙ（Ａ）弱毒化株が弱毒化ワクチンとしてＡＧ１２９マウスに良好な免疫保護を提供できることが実証された。
Claims (10)
- ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列を含む弱毒化フラビウイルス属ウイルスであって、前記フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部が前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換され、これにより、前記フラビウイルス属ウイルスのヌクレオチド配列の一部が置換された後、得られた前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’末端ステムループ領域（３’ＳＬ）が保留されている、弱毒化フラビウイルス属ウイルス。
- 前記ヌクレオチド配列の一部は、３’非コード領域（３’ＵＴＲ）における５’末端ステムループ領域（５’ＳＬ）のヌクレオチド配列の全部又は一部、環状化配列領域（ＣＳ）のヌクレオチド配列の全部又は一部、及び／又は、ダンベル領域（ＤＢ）のヌクレオチド配列の全部又は一部を含み、
好ましくは、前記ヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、少なくとも３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留され、
好ましくは、前記３’非コード領域（３’ＵＴＲ）における５’末端ステムループ領域（５’ＳＬ）は、ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）及びステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）から選ばれるものであり、
好ましくは、前記環状化配列領域（ＣＳ）は、環状化配列領域１（ＣＳ１）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）及び繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）から選ばれるものであり、
好ましくは、前記ダンベル領域（ＤＢ）は、ダンベル領域１（ＤＢ１）及びダンベル領域２（ＤＢ２）から選ばれるものである、
請求項１に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス。 - 前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列は、１０～２００個のアデニル酸を含み、
好ましくは、前記ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列は、５０～１８０個、１００～１６０個のアデニル酸を含み、より好ましくは１３０～１５０個のアデニル酸を含み、好ましくは１３０又は１５０個のアデニル酸を含み、
好ましくは、前記フラビウイルス属ウイルスは、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＪＥＶ）、西ナイルウィルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ、ＷＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルス（ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、ＴＢＥＶ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）、ジカウイルス（ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ、ＺＩＫＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＭＶＥＶ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）及びキャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）から選ばれるものであり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスのプラーク力価は５×１０４～５×１０６ ＰＦＵ／ｍｌであり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、親野生型ウイルスに比べて、毒力が１０～１００倍低下し、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞ＢＨＫ－２１にレスキューされ、及び／又は、前記のアフリカミドリザル腎臓細胞のＶｅｒｏ細胞で増幅されて得られ、
好ましくは、前記デング熱ウイルスは、デング熱ウイルス１型、２型、３型及び４型から選ばれるものであり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化西ナイルウィルスであり、好ましくは、前記弱毒化西ナイルウィルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化西ナイルウィルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １であり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化日本脳炎ウイルスであり、前記弱毒化日本脳炎ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化日本脳炎ウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２であり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化デング熱ウイルスであり、好ましくは、前記弱毒化デング熱ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化デング熱ウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化黄熱ウイルスであり、好ましくは、前記弱毒化黄熱ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ４に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化黄熱ウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４であり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化ジカウイルスであり、好ましくは、前記弱毒化ジカウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化ジカウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５であり、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスであり、好ましくは、前記弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示されるヌクレオチド配列と８０％又は８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記弱毒化ダニ媒介性脳炎ウイルスウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６であり、
好ましくは、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、３’非翻訳領域のダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留され、
好ましくは、前記のヌクレオチド配列の一部は、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域２（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）、環状化配列領域１（ＣＳ１）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、３’非翻訳領域における５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）及び短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留され、
好ましくは、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域Ｉ（ＳＬＩ）、ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＩＩ（ＳＬＩＩＩ）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留され、
好ましくは、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ステムループ領域ＩＶ（ＳＬＩＶ）、環状化配列領域３（ＣＳ３）、ダンベル領域１（ＤＢ１）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）では、３’非翻訳領域の環状化配列領域１（ＣＳ１）及び環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されており、
好ましくは、前記のヌクレオチド配列の一部は、５’末端ステムループ領域ＩＩ（ＳＬＩＩ）、繰り返し環状化配列領域３（ＲＣＳ３）、ダンベル領域（ＤＢ）、繰り返し環状化配列領域２（ＲＣＳ２）、ダンベル領域（ＤＢ２）、環状化配列領域２（ＣＳ２）を含み、前記のヌクレオチド配列の一部がポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列で置換された後、前記の弱毒化フラビウイルス属ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において、３’非翻訳領域の５’末端ステムループ領域（ＳＬ）、環状化配列領域１（ＣＳ１）、及び、環状化配列領域１に続く短いヘアピン－３’末端ステムループ領域（ｓＨＰ－３’ＳＬ）が保留されている、
請求項１又は２に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス。 - 転写され、請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルスのＲＮＡゲノムを生成することができるＤＮＡであって、
好ましくは、前記ＤＮＡは、フラビウイルス属ウイルス弱毒化株の感染性クローンであり、好ましくは、前記感染性クローンは、プラスミドである、ＤＮＡ。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、又は、請求項４に記載のＤＮＡを含む、細胞。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、請求項４に記載のＤＮＡ、及び／又は、請求項５に記載の細胞を含む、ワクチン。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、請求項４に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の細胞及び／又は請求項６に記載のワクチン、及び、薬学的に許容される担体を含む、薬物組成物。
- 野生型ウイルスの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のヌクレオチド配列の一部をポリアデニル酸（ｐｏｌｙ（Ａ））配列に置換することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルスを調製する方法であって、
好ましくは、前記弱毒化フラビウイルス属ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞ＢＨＫ－２１にレスキューされ、及び／又は、前記アフリカミドリザル腎臓細胞Ｖｅｒｏ細胞で増幅されて得られるものである、
方法。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、請求項４に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の細胞の、弱毒化生フラビウイルス属ウイルスワクチンの調製における使用であって、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化西ナイルウィルスの弱毒化生西ナイルウィルスワクチンの調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化日本脳炎ウイルスの弱毒化生日本脳炎ウイルスワクチンの調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化デング熱ウイルスの弱毒化生デング熱ウイルスワクチンの調製における使用；
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化黄熱ウイルスの弱毒化生黄熱ウイルスワクチンの調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化ジカウイルスの弱毒化生ジカウイルスワクチンの調製における使用である、使用。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載の弱毒化フラビウイルス属ウイルス、請求項４に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の細胞、請求項６に記載のワクチン及び／又は請求項７に記載の薬物組成物の、フラビウイルス属ウイルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用であって、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化西ナイルウィルスの西ナイルウィルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化日本脳炎ウイルスの日本脳炎ウイルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化デング熱ウイルスのデング熱ウイルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化黄熱ウイルスの黄熱ウイルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用であり、
好ましくは、前記使用は、前記弱毒化ジカウイルスのジカウイルスによる疾患を治療又は予防するための薬物の調製における使用である、使用。
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