CN106574253A - 用于快速制备减活rna病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用诱变的力量在非常短期内制备减活RNA病毒，即只要靶标病毒的完整序列已知且可以制备感染性基因组。

Description

用于快速制备减活RNA病毒的方法

技术领域

本发明涉及用于快速制备可用作疫苗来保护不受病毒感染和疾病的减活RNA病毒的方法。

背景技术

很多新发传染病由单链RNA病毒引起。近几十年发生的登革热、西尼罗河脑炎、基孔肯雅热和裂谷热的主要爆发对人体健康均有显著影响，其突出了理解允许这些病毒入侵新领地或适应新宿主或载体物种的因素的迫切需要。

这些事件通常被视为潜在的流行病的警示标志。在流行病的情况下，理解形成这些快速进化的感染因子的适应性的因素和我们快速开发疫苗的能力将是控制疾病扩散的关键步骤。

实际上，至今为止，疫苗仍然是减少由这些病毒引起的人的发病率和死亡率的最好方法。具体地，活的减活疫苗由于刺激宿主免疫反应的不同臂而高度成功。这些活的减活疫苗是通过在异常宿主中传代病毒衍生的天然病毒的变体。然而，制备活的减活疫苗具有很多缺点，尤其是其制备依赖于凭经验和耗时的方法。因此，目前开发可以向人施用的有用疫苗需要很长时间。

因此，需要用于制备减活病毒的方法，所述减活病毒不可能恢复，且提供快速、有效、节约成本且安全的制备疫苗候选物的方法。

本发明通过提供用于设计基本上不可能恢复的未来疫苗候选物的系统性方法满足了这种需要。该方法可广泛应用于各种病毒，且提供了用于制备各种抗病毒疫苗的有效方法。

发明简述

本发明利用诱变的力量在短期内制备减活RNA病毒，即只要靶标病毒的完整序列已知且可以制备感染性基因组。

因为密码子多于氨基酸，遗传密码必然是冗余的。已知编码相同氨基酸的不同密码子是同义密码子。在两个同义密码子之间蛋白质的DNA序列的变化一般认为没有影响，因此成为同义突变。然而，尽管同义密码子编码相同氨基酸，发明人表明，在病毒基因组的较大区域内的同义替换造成病毒的有效减活(Nougairede等，Random Codon Re-encodingInduces Stable Reduction of Replicative Fitness of Chikungunya Virus inprimate and Mosquito Cells，PLOS Pathogens，2013)。更确切地，发明人发现，用同义核苷酸密码子替换RNA病毒基因组中的天然核苷酸密码子降低了病毒的复制适应性(replicativefitness)，从而使该病毒减活。

发明人还开发了用于制备RNA病毒的新方法，其不需要将全长cDNA克隆和繁殖入细菌。该技术基于以下观察：各自覆盖病毒基因组的一部分的重叠双链DNA片段在转染后能够自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。

通过结合这两种方法，发明人开发了用于直接制备减活病毒的方法，其对于疫苗候选物的开发具有几个优势，包括一旦已知靶标病原体的完整序列并能够产生感染性基因组，尽快在非常短期内获得潜在疫苗菌株的可能性。因此本发明的方法对于在几天内制备针对新的病原体(没有可用的治疗或疫苗)的活的减活疫苗非常有用。

因此，在第一个方面，本发明涉及用于制备减活RNA病毒的方法，包括以下步骤：

步骤I)通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码所述感染性RNA病毒的病毒基因组，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。

步骤II)通过以下制备减活RNA病毒：

子步骤II.a)在步骤I)所得的重编码的病毒基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，和任选地在3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.b)在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增子步骤a)制备的重编码的病毒基因组，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

子步骤II.d)孵育子步骤c)的所述宿主细胞；和

子步骤II.e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

在第二个方面，本发明涉及包含根据本文公开的方法获得的减活RNA病毒的药物组合物。

在第三个方面，本发明涉及本文公开的方法用于开发活的减活疫苗的用途，或根据本文公开的方法获得的减活RNA病毒用作活的减活疫苗的用途。

在第四个方面，本发明涉及如本发明的方法公开所获得的重叠cDNA片段用作疫苗。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及用于制备减活RNA病毒的方法，包括以下步骤：

步骤I)通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码所述感染性RNA病毒的病毒基因组，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。

步骤II)通过以下制备减活RNA病毒：

子步骤II.a)在步骤I)所得的重编码的病毒基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，和任选地在3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.b)在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增子步骤a)制备的重编码的病毒基因组，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

子步骤II.d)孵育子步骤c)的所述宿主细胞；和

子步骤II.e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

根据他们的深入研究，发明人开发了通过大规模重编码直接制备减活病毒的非常有前途的策略。

因此，本发明提供减活病毒，其包含在基因组中的多个位点工程化的含有核苷酸替换的改变的病毒基因组，其中所述替换将多个同义密码子引入基因组。如本文所用，术语“减活病毒”是指在意欲接受者，例如人或动物接受者毒性降低的病毒。更具体地，在保留与野生型病毒相似的刺激免疫反应能力的同时，减活病毒产生疾病的能力降低或减弱。

这个新策略代表疫苗开发的显著改善的路径。实际上，与氨基酸序列不变有关的定点重编码减少新的表型性质的可能性，因此为活的减活疫苗的基因开发提供益处，包括减少成本和单剂量诱导长期免疫。

大规模重编码步骤

本发明的方法包括第一个步骤I)突变，下文也称为“大规模重编码”。如本文所用，表述“重编码方法”或“大规模重编码方法”是指通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码RNA病毒的病毒基因组(优选所述病毒基因组的区域)的步骤，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。

优选的，步骤I)是通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换感染性RNA病毒的整个病毒基因组的约1％至约20％，优选约1％至约17％，优选约1％至约15％，优选约1％至约10％，优选约3％至约8％，优选约3％至约5％的核苷酸密码子来重编码感染性RNA病毒的病毒基因组的步骤，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。

因此，重编码方法通过引入大量同义突变来改变RNA病毒的病毒基因组的较大编码区的核酸组成而不改变编码的蛋白质。

步骤I)的起始材料优选是感染性RNA病毒。优选的，病毒的基因组被重编码，从而约1％至约20％的核苷酸密码子被编码相同氨基酸的不同核苷酸密码子替换。这由于密码子使用偏好是可能的。

如本文所用，表述“同义核苷酸密码子”或“同义密码子”是指编码相同氨基酸的两个或多个核苷酸密码子。实际上，大多数氨基酸由超过一个密码子编码。同义密码子是编码相同氨基酸的密码子。

如本文所用，表述“同义突变”或“同义替换”是指一个核苷酸密码子被编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子(即同义密码子)替换。发明人表明，同义替换降低病毒的复制适应性。此外，将同义密码子引入病毒基因组限制其突变或使用重组变成有毒的能力。值得注意的是，为获得仍然可用作活的减活疫苗的减活RNA病毒，病毒基因组的仅1％-20％，优选1％-10％的核苷酸密码子被随机重编码。在本发明的上下文中，同义突变通过定点诱变引入。优选的，所述突变通过盒式诱变插入。

尽管大多数氨基酸可以由几个不同密码子编码，不是所有密码子均以相同频率使用，一些密码子是“稀有”密码子。如本文所用，“稀有”密码子是编码特定氨基酸的至少两个同义密码子之一，其在mRNA中以显著低于该氨基酸最常用的密码子的频率存在。通常，所述稀有密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG。

发明人设计的方法基于以下观察：所述稀有密码子必须保持不变以有效控制病毒减活。

此外，发明人总结，涉及RNA二级结构的病毒基因组的区域必须不变以有效控制病毒减活。因此，所述区域不会被重编码。

如本文所用，表述“涉及RNA二级结构的病毒基因组的区域”是指病毒基因组的保守区域，其包含功能活性的RNA结构，也称为“RNA二级结构”。已经证明所述RNA结构在病毒生命周期的各个阶段非常重要。本领域技术人员将容易确定涉及明显RNA二级结构的区域，其在进化和系统发生中通常很好地被保留。

基本上，重编码感染性RNA病毒的基因组的步骤I)包括以下步骤：

-鉴定在病毒基因组的非调控部分的多个位点中可以被同义密码子替换的密码子，所述密码子不是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；

-为约1％至约20％的鉴定的核苷酸密码子选择待替换的同义密码子；和

-优选基于下表1，用同义密码子替换各个鉴定的密码子。

优选的，步骤I)按以下进行：

-确定感染性RNA病毒的整个病毒基因组编码的氨基酸序列，并确定编码各氨基酸的各核苷酸密码子；

-用如表1所示的编码相同氨基酸的不同核苷酸密码子替换编码表1的氨基酸的病毒基因组的约1％至约20％，优选约1％至约17％，优选约1％至约15％，优选约1％至约10％，优选约3％至约8％，优选约3％至约5％的核苷酸密码子：

氨基酸	核苷酸密码子
		Ala，A	GCU，GCC，GCA
Arg/R	AGA，AGG
		Asn/N	AAU，AAC
Asp/D	GAU，GAC
		Cys/C	UGU，UGC
Gln/Q	CAA，CAG
		Glu/E	GAA，GAG
Gly/G	GGU，GGC，GGA
		His/H	CAU，CAC
Ile/I	AUU，AUC，AUA
		Leu/L	UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG
Lys/K	AAA，AAG
		Phe/F	UUU，UUC
Pro/P	CCU，CCC，CCA
		Ser/S	UCU，UCC，UCA，AGU，AGC
Thr/T	ACU，ACC，ACA
		Tyr/Y	UAU，UAC
Val/V	GUU，GUC，GUA，GUG

表1：根据本发明的同义突变

根据本发明获得的减活病毒具有在蛋白质水平不被修饰的显著性质。实际上，所述减活病毒对应于仅在核酸水平通过同义替换进行遗传修饰的病毒。

病毒减活可通过本领域技术人员熟知的方式来确认。非限制性的实例包括菌斑试验、生长测量和测试动物中降低的发病率或致死率。

更具体地，发明人已经表明，大规模重编码影响靶标RNA病毒的复制适应性，从而使所述病毒减活。

“复制适应性”定义为生物在给定环境下复制的能力/适应力。可以在细胞中，例如通过涉及组织培养中两个或多个病毒菌株之间的竞争的方式来测量病毒，或根据本文公开的方法获得的减活病毒的复制适应性。通常，一旦回收病毒，可在各种细胞类型，如非人灵长类动物细胞或蚊虫细胞(虫媒病毒的情况下)中测定复制适应性。通常，在各种细胞类型，如非人灵长类动物细胞(Vero)或蚊虫细胞(C6/36)中传代待评估的重编码的病毒和野生型病毒。基于TCID50值的分析，用已知技术如分析病毒的生长率来测定各传代病毒的复制动力学。

发明人已经表明，随机重编码步骤降低灵长类动物(和虫媒病毒的情况下是节肢动物细胞)两者中病毒的复制适应性。复制适应性的降低与重编码的程度直接相关。这些结果证实，密码子重编码极大降低了释放病毒的感染性滴度，而病毒颗粒的数量保持稳定。

优选的，该方法意欲制备的减活RNA病毒(本文也称为“靶标病毒”)是单链正链RNA病毒的减活版本。更优选的，所述病毒选自黄病毒、甲病毒和肠道病毒。

黄病毒的非限制性列表包括登革病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)、圣路易斯型脑炎(SLEV)、日本脑炎病毒(JEV)、墨累谷脑炎(MVEV)、西尼罗河病毒(WNV)、Rocio(ROCV)、蜱传播脑炎病毒(TBEV)、鄂木斯克出血热(OMSKV)、Kyasanr Forrest病(KFDV)、Powassan(POWV)。优选的，所述黄病毒选自：

-日本脑炎病毒(JEV)，例如基因型I菌株(JEV I)或基因型III菌株(JEV III)，

-西尼罗河病毒(WNV)，例如基因型2菌株；

-登革病毒(DENV)，例如血清型4菌株；

-黄热病病毒(YFV)，例如南美野生型菌株；和

-蜱传播脑炎病毒(TBEV)，例如远东亚型菌株。

更优选的，所述黄病毒是蜱传播脑炎病毒。

甲病毒的非限制性列表包括基孔肯雅病毒(CHIK)、东方马脑炎(EEE)、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、马亚罗病毒(MAY)、O′nyong′nyong病毒(ONN)、辛德华斯病毒、西门利克森林病毒、巴马森林病毒、罗斯河病毒、乌纳病毒、托纳特病毒。优选的，所述甲病毒是基孔肯雅病毒。

肠道病毒的非限制性列表包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒和鼻病毒。优选的，所述肠道病毒是柯萨奇病毒，更优选柯萨奇B病毒。

在一个优选的实施方案中，靶标病毒是基孔肯雅病毒。在该具体的实施方案中，重编码步骤在病毒基因组的三个区域进行，即：

-编码非结构蛋白nsP1的区域；

-编码非结构蛋白nsP4的区域；和

-与结构蛋白E2和E1重叠的区域。

通常，借助盒式诱变(也称为“重编码盒”)引入突变。通常，各区域使用约1300bp至约1500bp的重编码盒。

在该实施方案中，如下修饰基孔肯雅病毒的病毒基因组：

-用SEQ ID NO：63所示的1302nt的重编码盒突变完整基因组的242-1543(nt)位的编码非结构蛋白nsP1的区域；

-用SEQ ID NO：64所示的1410nt的重编码盒突变完整基因组的6026-7435(nt)位的编码非结构蛋白nsP4的区域；和

-用SEQ ID NO：65所示的1500nt的重编码盒突变完整基因组的9526-11022(nt)位的与结构蛋白E2和E1重叠的区域。

通常，各个重编码盒引入200-400个同义突变，优选约250至约320个，优选约266至约320个。优选的，如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示的重编码盒分别引入264个、298个和320个同义突变。

在另一个实施方案中，靶标病毒是蜱传播脑炎病毒(TBEV)。在该具体的实施方案中，重编码步骤在病毒中编码非结构蛋白NS5的NS5基因组区域中进行。通常使用约1400bp的重编码盒。在该实施方案中，修饰TBEV的病毒基因组以引入约200至约350个同义突变，优选约200至约300个，优选约225至约300个，优选约225至约275个，优选约225个。

优选的，用SEQ ID NO：66所示的1412nt的重编码盒突变蜱传播脑炎病毒的病毒基因组。所述重编码盒引入273个突变。

还在另一个实施方案中，靶标病毒是日本脑炎病毒(JEV)，优选基因型I菌株。在该具体的实施方案中，重编码步骤在病毒基因组的大区域进行，通常在从PrM开始至NS5基因组区域结束的几乎所有的完整开放阅读框(ORF)中进行。

优选的，修饰JEV的病毒基因组以引入约163-658个，优选约163-658个突变。

优选的，用至少一个选自以下的重编码盒突变日本脑炎病毒的病毒基因组：

-SEQ ID NO：67所示的重编码盒Ia；

-SEQ ID NO：68所示的重编码盒Ib；

-SEQ ID NO：69所示的重编码盒IIa；

-SEQ ID NO：70所示的重编码盒IIb；

-SEQ ID NO：71所示的重编码盒IIIa；和

-SEQ ID NO：72所示的重编码盒IIIb。

更优选的，用如下的重编码盒的组合突变日本脑炎病毒的病毒基因组：

-重编码盒Ia和IIa的组合；或

-重编码盒Ia和IIIa的组合；或

-重编码盒IIa和IIIa的组合。

或者，所述病毒是单链负链RNA病毒。更优选的，所述病毒是副粘病毒、沙粒病毒、线状病毒、棒状病毒、本雅病毒或流感病毒。

减活RNA病毒的直接制备

本发明的方法包括直接制备减活RNA病毒的第二个步骤II)。

发明人开发了一种直接制备减活RNA病毒的新方法，其从所述病毒的随机重编码的病毒基因组开始。发明人证实，各自覆盖RNA病毒基因组的一部分的重叠cDNA片段能够产生病毒，而不需要使用全长cDNA或含有这种全长cDNA的质粒或载体。因此，发明人表明，各自覆盖减活病毒基因组的一部分的重叠双链DNA片段能够在细胞中自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。

所述方法是高度有利的，尤其是因为它避免了：

-构建覆盖整个重编码病毒基因组的全长cDNA；和/或

-使用包含这种全长cDNA的质粒或载体；和/或

-在转染入宿主细胞前重构建全长cDNA或整个减活病毒基因组的需要；和/或

-修饰减活病毒基因组，例如引入非天然存在的重组或限制性酶切位点；和/或

-使用帮助病毒或其他病毒蛋白。

因此，本发明的具体步骤II)，也称为“感染性亚基因组扩增子”或“ISA”是能够在几天内加快制备减活RNA病毒的非常简单的方法，其完美控制病毒序列，并从重编码的病毒基因组开始。

该策略依赖各自覆盖重编码病毒基因组的片段的几个cDNA片段的制备。构建体的组装不是在转染前在体外通过Gibson组装或环形聚合物延伸克隆来进行，而是通过直接在细胞内发生的重组过程来进行。

如本文所用，表述“制备减活RNA病毒”是指以遗传修饰的形式，例如以根据本发明方法的重编码形式产生RNA病毒。

如本文所用，表述“非天然存在的重组位点”是指允许位点特异性重组(例如Cre-Lox或FLP-FRT重组系统)的序列。限制性酶切位点是指允许限制性酶(例如NotI或AluI内切酶)位点特异性切割双链DNA的序列。

本发明方法的步骤II)包括在RNA病毒的整个基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子的子步骤II.a)。任选地，所述子步骤II.a)进一步包括在RNA病毒的整个基因组的3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列。

值得注意的是，当靶标病毒是聚腺苷酸化的病毒(例如黄病毒)时，子步骤II.a)是在RNA病毒的整个基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，并在RNA病毒的整个基因组的3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列的步骤。

通过在5’末端包括第一cDNA片段(DNA依赖性RNA聚合酶的启动子)和在3’末端包括最后的cDNA片段(核酶序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列)，将cDNA片段转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA减活基因组。

优选的，所述在5’位的DNA依赖性RNA聚合酶的启动子是SEQ ID NO：1所示的人巨细胞病毒启动子(pCMV)。优选的，所述终止子和RNA聚腺苷酸序列分别是丁型肝炎核酶和猿猴病毒40聚腺苷酸信号(HDR/SV40pA)。HDR/SV40pA的序列如SEQ ID NO：2所示。

因此，子步骤a)提供RNA病毒的完整重编码病毒基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)(SEQ IDNO：1)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(SEQ ID NO：2)。

本发明方法的步骤II)包括在几个重叠cDNA片段中扩增整个重编码的病毒基因组的子步骤II.b)。在子步骤II.b)中，整个病毒基因组对应于步骤a)中制备的整个病毒基因组，即，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列。

如本文所用，表述“重叠cDNA片段”、“cDNA片段”，也称为“扩增子”或“DNA亚基因组片段”或“亚基因组扩增子”是仅覆盖RNA病毒的重编码病毒基因组的一部分的双链DNA片段。

这种片段对应于“亚基因组片段”。

本发明人发现，当将这种片段转染入细胞，它们出乎意料地在细胞中自发重组以重构整个重编码的病毒基因组。即使病毒基因组没有经过基因修饰以引入额外的且非天然存在的重组位点，所述重组也发生。

根据本发明的cDNA片段包含：

-通过扩增，例如通过PCR获得的DNA片段；以及

-从头合成获得的DNA片段。

优选的，所述cDNA片段是非感染性的。

如本文所用，表述“全长cDNA”是指在单段中包含病毒的整个病毒基因组，优选整个重编码的病毒基因组的DNA。

如本文所用，表述“覆盖整个重编码的病毒基因组的一部分的cDNA片段”是指包含整个重编码的病毒基因组的一部分的DNA片段。通常，根据本发明的cDNA片段在细胞中转染后自发重组以构成整个重编码的病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。该构建体通过细胞机制转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA重编码的基因组。与此相反，“覆盖整个病毒基因组的全长cDNA”是编码病毒基因组整体，优选重编码病毒基因组整体的单个cDNA。

优选的，本发明方法的步骤II.b)允许产生2-15个重叠的cDNA片段，优选3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段。通常，所述cDNA片段为约2kb至约6kb，优选为约4kb且各cDNA片段具有约70至约100bp的重叠区。

优选的，步骤II.b)的所述重叠cDNA片段是：

-不是通过PCR扩增的感染性克隆的片段；

-通过PCR扩增的感染性克隆的片段；

-不是通过PCR扩增的非感染性克隆的片段；

-通过PCR扩增的非感染性克隆的片段；

-不是通过PCR扩增的从头合成的片段；

-通过PCR扩增的从头合成的片段；和

-通过从病毒基因组的反转录PCR获得的片段。

本发明方法的步骤II)包括将所述cDNA片段转染入宿主细胞的子步骤II.c)。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸(DNA或RNA)引入真核或原核细胞或生物。摄取外源核酸的细胞称为“宿主细胞”或“转染细胞”。可以通过本领域已知的各种方式完成转染，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪。

优选的，子步骤c)的宿主细胞是能够回收感染性病毒的易感细胞。通常，本发明方法中使用的易感细胞是当用cDNA片段转染时，能够实现病毒的完整复制周期(包括产生病毒颗粒)的细胞。优选的，所述宿主细胞选自SW13、BHK-21、HEK 293和Vero细胞系。

在一个优选的实施方案中，子步骤II.c)是直接转染子步骤II.b)获得的cDNA片段的步骤，且子步骤II.c)在子步骤II.b)之后直接进行。在该具体的实施方案中，将cDNA片段转染入宿主细胞。所述片段在细胞中自发重组为整个重编码病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。如上所述，本发明的方法克服了技术偏见，因为它不需要转染覆盖整个病毒基因组的全长cDNA。此外，该方法不需要使用含有所述全长cDNA的质粒或载体和/或在转染入宿主细胞前重构全长cDNA或整个病毒基因组。

与此相反，该方法是基于转染各自包含重编码的病毒基因组的一部分的重叠cDNA片段。将覆盖RNA病毒的整个基因组的重叠双链DNA片段转染入易感细胞能够在细胞中重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。

在另一个实施方案中，子步骤II.c)是转染各自含有子步骤II.b)获得的cDNA片段的质粒的步骤，其中将各cDNA片段引入单独且分开的质粒或载体。

在该实施方案中，将各cDNA片段引入单独且分开的质粒或载体。各质粒或载体包含cDNA的单个片段。在该实施方案中，整个重编码病毒基因组在转染后重构。

在一个实施方案中，本发明的方法在子步骤b)之后且在子步骤c)之前进一步包含纯化重叠cDNA片段的步骤II.b’)。所述纯化可以通过任何已知技术进行，优选通过色谱柱。

本发明方法的步骤II)包括孵育宿主细胞的子步骤II.d)，其优选持续3-9天。在该孵育步骤期间，转染的cDNA片段在宿主细胞中自发重组以构成整个重编码病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。该构建体通过细胞机制转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA基因组。

因此，在子步骤II.d)中拯救的产物是减活RNA病毒。

药物组合物

在第二个方面，本发明涉及包含根据本文公开的方法获得的减活RNA病毒的药物组合物。

所有之前公开的技术数据均适用于此。

所述包含减活病毒的药物组合物适用于免疫。

优选的，可以通过各种肠胃外途径施用本发明的这种药物组合物，例如皮下、静脉、皮内、肌内、腹腔内、鼻内、经口或透皮途径。可以通过快速推注或随时间的逐渐灌注来完成肠胃外施用。

用于肠胃外施用的制剂包括可含有本领域已知的助剂或赋形剂的无菌的水性或非水性溶液、悬浮液、和/或乳剂。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以使用载体或封闭敷料来增加皮肤渗透性并提高抗原吸收。用于口服施用的液体剂型可以包含含有液体剂型的脂质体溶液。用于悬浮脂质体的合适的形式包括乳剂、悬浮液、溶液、糖浆和含有本领域常用的惰性稀释剂(例如纯水)的酏剂。除了惰性稀释剂，这种组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂，或甜味剂、调味剂或芳香剂。

当本发明的组合物用于向个体施用时，它可以进一步包含盐、缓冲液、佐剂或用于提高组合物功效的其他物质。对于疫苗，可以使用佐剂，其是可以增强特定免疫反应的物质。通常，佐剂和组合物在向免疫系统呈递前混合，或单独呈递但进入被免疫生物的同一位点。

施用组合物可以是为了“预防性”或“治疗性”的目的。当预防性提供时，本发明的组合物(即，疫苗)在病原体感染的任何症状或临床体征变得明显前提供。组合物的预防性施用用于预防或减缓任何随后的感染。在该实施方案中，本发明涉及用于预防受试者的RNA病毒感染的本文所公开的药物组合物。

当治疗性提供时，在检测到实际感染的症状或临床体征时提供减活病毒疫苗。治疗性施用用于减缓任何实际的感染。在该实施方案中，本发明涉及用于治疗受试者的RNA病毒感染的本文所公开的药物组合物。

因此，可以在感染发作之前(从而预防或减缓预期的感染)或在实际感染发生之后提供本发明的减活疫苗组合物。

设计未来的疫苗候选物

在第三个方面，本发明涉及本文公开的方法用于开发活的减活疫苗的用途，或根据本文公开的方法获得的减活RNA病毒用作活的减活疫苗的用途。

所有之前公开的技术数据均适用于此。

已经表明，本发明的大规模密码子重编码步骤表明是一种减活的有力方法，其对于疫苗开发具有一些优势，包括一旦已知靶标病原体的完整序列并能够产生感染性基因组，尽快在非常短期内获得潜在疫苗菌株的可能性。因此，本发明的方法对于在几天内制备针对新的病原体(没有可用的治疗或疫苗)的活的减活疫苗非常有用

此外，发明人已经表明，在设计未来的疫苗候选物时，本发明的方法在几个方面具有优势，即：

(i)鉴于产生的大量突变，恢复到野生型本质上更加困难；

(ii)由于复制适应性的降低随重编码的程度而减少，该方法为通过调控重编码区的长度和引入的同义突变的数量来微调适应性降低打开了大门；

(iii)由于WT和重编码病毒之间的重组，使用位于整个病毒基因组的几个重编码区的组合防止完全的表型逆转：大规模序列修饰使重组本质上更加困难，且在重组的情况下，表示重编码菌株的基因组的部分可能仍然携带与适应性降低有关的一些突变。

cDNA片段的使用

发明人在将本发明的方法直接用于体内时遇到压力。通过这样做，发明人开发了用于直接在需要的患者体内产生活的减活疫苗的方法。所述方法基于施用从根据本文公开的方法重编码的感染性RNA病毒获得的重叠cDNA片段。

因此，在第四个方面，本发明还涉及用作疫苗，优选用作活的减活疫苗的cDNA片段，其中所述cDNA片段是通过以下获得的重叠cDNA片段：

-在重编码的病毒基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，任选地在3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列；和

-在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增所述重编码的病毒基因组；

其中所述重编码的病毒基因组通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换所述感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码所述感染性RNA病毒的病毒基因组，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。

所有之前公开的技术数据均适用于此。

以下实施例是为说明本发明的各种实施方案的目的，并不以任何方式限制本发明。

附图说明

图1：拯救单链正链RNA病毒的通用策略。

如示意图所示(黄病毒基因组)，通过PCR扩增在3个重叠cDNA片段中的整个病毒基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)。将PCR产物转染入易感细胞后3-9天允许回收病毒。水平的蓝色箭头表示用于制备3个重叠cDNA片段的引物。

图2：CHIKV重编码病毒的示意图。

从上至下：核苷酸比例尺；具有编码区(灰色方框)、非编码区(黑色方框)和聚A尾的CHIKV完整基因组的示意图。重编码区用深灰色表示。

图3：用ISA方法获得的9个不同的重编码JEV的示意图。

各方框表示一个片段。当没有引入突变时(WT)，使用紫色方框。重编码片段用蓝色(重编码水平低)和绿色(重编码水平高)方框(数值表示同义突变的数量)。

图4：WT和重编码JEV的复制适应性。

用人细胞测量重编码JEV在细胞中的复制适应性。结果表明根据重编码水平、重编码区的大小和重编码片段的基因组位置的复制适应性的降低。

具体实施方式

实施例1：在几天内制备RNA病毒

实施例1阐述允许在几天内产生RNA病毒的ISA方法。

以下对ISA的说明基于之前没有修饰的病毒基因组，即没有经过重编码步骤的病毒基因组。

方法

细胞、病毒、感染性克隆和抗体

在含有7％热灭活胎牛血清(FBS；Life Technologies)和1％青霉素/链霉素(PS；5000U/mL和5000μg/ml；Life Technologies)的最小必需培养基(Life Technologies)中，于37℃、5％CO₂下生长幼仓鼠肾(BHK-21)细胞。在补充有1％非必须氨基酸的与BHK-21细胞相同的培养基(Life Technologies)中，于37℃、5％CO₂下生长人胚肾293(HEK-293)细胞和非洲绿猴肾(VeroE6)细胞。在含有10％FBS和1％PS的RPMI 1640培养基(LifeTechnologies)中，于37℃、5％CO₂下生长人肾上腺癌(SW13)细胞。

JEV基因型I菌株JEV_CNS769_Laos_2009(KC196115)于2009年六月分离自老挝患者的脑脊液；于2009年分离自人血清的YFV菌株BOL 88/1999(KF907504)由国家热带疾病中心(CENETROP)，Santa-Cruz，Bolivia友好提供；分离自人血清的DENV-4菌株DakHD 34 460(KF907503)由Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases-SealyCenter for Vaccine Development(University of TexasMedical Branch，Galveston，Texas，USA)的Robert B Tesh友好提供；衍生自菌株rp9(DQ648597)的JEV基因型III的感染性克隆由Institute of Biomedical Sciences，Academia Sinica，Taipei，Taiwan的Yi-Ling Lin友好提供；WNV的感染性克隆衍生自菌株Ouganda 1937(M12294)；TBEV的感染性克隆衍生自菌株Oshima 5.10(AB062063)；CV-B3的感染性克隆衍生自菌株2679(KJ489414)。使用JEV-特异性免疫血清(接种JEV后获得)和单克隆DENV-特异性抗体17进行直接的免疫荧光分析。

制备cDNA片段

通过PCR扩增在约为4.8kb、3.0kb和4.3kb(CHIKV为4.8kb、2.9kb和5.2kb，TBEV为4.8kb、4.1kb和3.4kb，CV-B3为2.9kb、2.8kb和2.7kb)的3个重叠cDNA片段中的完整基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)(SEQ ID NO：1)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(SEQID NO：2)(参见下表1)。

对于WNV、TBEV、JEV III和CHIKV，使用感染性克隆通过PCR获得DNA片段(对于JEVIII，用融合PCR纠正了一个突变)。

对于JEV I(所有DNA片段)、DENV-4(第一和第三片段)和YFV(第一和第三片段)，从头合成(Genscript)DNA片段并通过PCR扩增。使用Platinum PCR SuperMix High Fidelity试剂盒(Life Technologies)制备扩增子。

混合物(最终体积：50μL)由以下组成：45μL的supermix，1ng/μL的2μL DNA模板(感染性克隆或合成的DNA片段)和200nM的各个引物。对于DENV-4和YFV，第二DNA片段通过澄清的细胞上清液的RT-PCR获得。根据制造商的说明，使用EZ1 Virus Mini Kit v2在EZ1Biorobot(两者均来自Qiagen)上提取核酸，并用Superscript IIIOne-Step RT-PCRPlatinum Taq Hifi试剂盒(Life Technologies)扩增。混合物(最终体积：50μL)包含25μL反应混合物、2μL核酸提取物、100nM各引物、1μL酶混合物和20μL不含核酶的水。在BiometraT-professional Standard Gradient热循环仪上用以下条件进行分析：94℃下2min，然后是40个循环的94℃下15s，64℃下30s，68℃下5min，以及RT-PCR的初步步骤50℃下30min。用凝胶电泳确认PCR产物大小，并根据制造商的说明用Amicon Ultra-0.5mL试剂盒(Millipore)纯化。当使用质粒DNA作为模板时，转染前用限制性酶Dpn1(New EnglandBiolabs)的消化步骤来确保完全除去模板。为了控制该额外步骤的效率，本发明人仅转染了两个cDNA片段(第一和第二，最终1μg)作为对照(参见以下)。这些对照不产生任何感染性病毒。

表2：用于获得cDNA片段的引物。

细胞转染

在600μL Opti-MEM培养基(Life Technologies)中，用12μL Lipofectamine 2000(Life Technologies)孵育最终为1μg的通过PCR扩增的所有cDNA片段的等摩尔混合物或1μg CV-B3的感染性克隆。根据制造商的说明，将混合物加入12.5cm²的亚融汇细胞的培养瓶中，所述培养瓶包括不含抗生素的1mL培养基。孵育4小时后，除去细胞上清液，将细胞洗涤2次(HBSS；Life Technologies)，加入3mL新鲜培养基。当观察到毛细胞病变效应(CPE)(取决于细胞类型和病毒生长速度，3-9天)或在转染后9天(对于非细胞病变的病毒)，收集细胞上清液，离心澄清、分样并储存于-80℃。然后，将各病毒用相同细胞类型传代4次，分别使用VeroE6和HEK-293的DENV-4和YFV除外。通过以下进行传代：将333μL澄清的细胞上清液接种至含有666μL培养基的12.5cm²培养瓶的细胞上：孵育2小时后，将细胞洗涤2次(HBSS)并加入3mL新鲜培养基。2-6天后收集细胞上清液，离心澄清，分样并储存于-80℃。澄清的细胞上清液(病毒母液)用于进行病毒RNA的定量、TCID50分析、直接免疫荧光分析和全基因组测序。

实时PCR和RT-PCR分析

为了评估感染性病毒的产生并确保阳性检测不是由cDNA污染造成，使用含有或不含逆转录酶的Access RT-PCR Core Reagent试剂盒(Promega)定量病毒RNA并与检测的cDNA的含量相比。根据制造商的说明，用EZ1 mini virus 2.0试剂盒和EZ1 Biorobot(均来自Qiagen)提取RNA。混合物(最终体积：25μL)包含标准量的AMV/Tfl 5X反应缓冲液、0.5μM各引物、0.5μL dNTP混合物、0.5mM MgSO4、0.5μL AMV逆转录酶(仅对于RT-PCR)、0.5μL TflDNA聚合酶、15.5μL不含核酶的水和2μL提取的核酸。使用CFX96 Touch^TM实时PCR检测系统(Biorad)在以下条件进行分析：50℃下15min，9，5℃下2min，然后是45个循环的95℃下15s，60℃下40s。在60℃步骤期间收集数据。实时PCR和实时RT-PCR分析获得的循环阈值(ct)之差用来评估病毒RNA的产量。此外，从标准曲线计算以剂量检测极限(任意单位，AU)表示的病毒RNA的量(用培养的病毒的细胞上清液的核酸作为标准，合并5个核酸提取物，将10μL分样储存于-80℃)。

组织培养感染剂量50(TCID50)分析

对于每次测定，用50μL 10倍梯度稀释的澄清细胞培养物上清液接种含有20,000个BHK-21细胞的96孔板培养物，每孔含有100μL培养基(就在接种前添加)：每行包括相同稀释的6个孔和2个阴性对照。将板孵育7天，并读取每个孔中CPE的不存在或存在。使用Reed和Muench18方法测定TCID50/mL。

直接免疫荧光分析(dIFA)

在使用澄清细胞上清液前2天和6天分别感染的SW细胞(用于JEV I和JEV III)和VeroE6细胞的12.5cm²培养瓶中进行直接IFA。除去上清液、将细胞洗涤两次(HBSS；Invitrogen)、用胰蛋白酶处理、收集并用新鲜培养基稀释(1/5)。将150μL的这种细胞悬浮液进行细胞离心(3min，900rpm；Cytospin，Thermo Scientific)后，将玻片干燥、浸入用于固定的冷丙酮中20min、干燥、用适当稀释的JEV特异性免疫血清(参见以上)或单克隆DENV特异性抗体于37℃孵育30min，用PBS洗涤两次、用蒸馏水洗涤一次、干燥、用适当稀释的FITC偶联的第二抗体和伊万斯蓝染液于37℃孵育30min、用PBS洗涤两次、用蒸馏水洗涤一次、干燥、安装(mount)并用荧光显微镜读取。

全长基因组的序列分析

用Ion PGM Sequencer19(Life Technologies)进行全基因组测序，并用CLCGenomics Workbench 6软件进行分析。首先将病毒上清液澄清，并用Benzonase核酶HC＞99％(Novagen)于37℃处理过夜。用EZ1 mini virus 2.0试剂盒和EZ1 Biorobot(两者均来自Qiagen)提取RNA后(不适用RNA载体，参见以上)，如上所述随机扩增核酸。根据制造商的说明，用Ion PGM测序仪分析扩增的DNA。整理获得的读段：授信使用质量分数，然后除去随机扩增期间所用的引物，最后在5’和3’端点系统性除去6个核苷酸。仅使用长度大于29个核苷酸的读段，并将其映射至作为参考的初始基因组序列。简单计算各位置的突变频率(具有突变的病毒基因组的比例)：与参考相比具有突变的读段数除以在该位点的读段总数。

结果

发明人开发了一种简单且多能的反向基因技术，其加快了从基因组DNA材料回收感染性RNA病毒而不需要克隆、将cDNA繁殖入细菌或体外RNA转录。他们的工作假设是，将覆盖RNA病毒的整个基因组的重叠双链DNA片段转染入易感细胞能够自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。通过在5’末端包括第一(5’)DNA片段(DNA依赖性RNA聚合酶的启动子)和在3’末端包括最后的(3’)DNA片段(核酶序列和用于RNA聚腺苷酸的信号序列)，发明人预期该基因组DNA拷贝将会转录为具有真正的5’和3’末端的全长RNA基因组，且会有效地转运出细胞核(在病毒在细胞质隔室中复制的情况下)。

发明人首先用代表主要的黄病毒进化谱系的6个黄病毒(即，在感染细胞的细胞质中复制的具有正极性的单链RNA基因组的节肢动物传播的包膜病毒)测试了该假设：2个日本脑炎病毒(JEV；基因型I(JEV I)和基因型III(JEV III))，1个基因型2西尼罗河病毒(WNV)、1个血清型4登革病毒(DENV-4)、1个黄热病病毒(YFV)的野生型菌株和1个远东亚型蜱传播脑炎病毒(TBEV)(表2)。

在具有70-100bp重叠区的约4kb的3个DNA片段中通过PCR扩增整个基因组。第一个和最后一个片段在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(图1)。用柱纯化PCR产物，并将1μg所有片段的等摩尔混合物转染入确保能有效回收黄病毒感染性基因组的SW13和/或BHK-21细胞系。将来自这些感染性培养物的细胞上清液介质用相同细胞类型连续传代4次，使其能够分离JEVI、JEV III、TBEV和WNV。对于更高要求的病毒，可以通过在其他易感细胞(例如DENV-4：VeroE6细胞；YFV：HEK-293细胞)中传代来实现分离。使用以下标准的组合来说明4次连续传代后的病毒复制：

(i)用实时RT-PCR方法测量细胞上清液介质中病毒基因组的产生，

(ii)用TCID50分析测量细胞上清液介质中感染性颗粒的产生，

(iii)检测细胞病变效应(CPE)，

(iv)用直接免疫荧光分析检测病毒抗原，和

(v)用下一代测序(NGS)方法测序完整的病毒基因组。

如下进一步挑战方法的稳健性、灵活性和多功能性。首先，发明人降低了组合用于转染的重叠片段的大小并增加了其数量。这在JEVI的情况中示出，其中当使用约2kb的多达6个重叠扩增子时，用ISA方法产生感染性病毒。其次，他们将ISA方法应用于属于不同科的具有正极性的单链RNA基因组的病毒：基孔肯雅病毒(CHIKV，包膜病毒，披膜病毒(Togaviridae)科)和柯萨奇病毒B3(CV-B3，非包膜病毒，小核糖核酸病毒(Picornaviridae)科)。再次，可以在转染以及在HEK-293细胞(CHIKV)或BGM细胞(CV-B3)中传代4次后分离感染性病毒(下表2)。

此外，发明人用转染质粒携带的感染性基因组后获得的CV-B3作为对照，他们在感染性和序列数据上获得相似的结果(表3)。

表3：回收病毒的特征

该研究中产生的不同病毒的总结：具体的菌株名称，用于产生第一(I)、第二(II)和第三(III)片段的用作模板的初始材料来源(DNS，从头合成；I.C.，感染性克隆；或病毒RNA)，用于转染和传代的细胞系，实时PCR和TCID50分析的在第四次传代时细胞上清液中病毒RNA和感染性滴度的含量的相对定量，细胞病变效应(CPE)的存在或不存在，以及通过直接免疫荧光分析(dIFA)的病毒抗原的研究。用NGS技术获得完整的病毒基因组序列。

dN和dS分别对应于每个非同义位点的非同义替换的数量和每个同义位点的同义替换的数量。

*转染6个重叠片段获得的结果。

直接转染CV-B3质粒携带的感染性克隆获得的结果。

N/A和AU分别是指不可获得和任意单位。

第三，发明人说明了ISA方法在几天内制备基因修饰的病毒的能力。这通过用基于PCR的对缺陷JEV III感染性克隆的一个片段中的移码突变(1915del)的校正和随后对应病毒的回收来示出(补充方法)。他们还能够通过交换基因型I和III JEV的第一个DNA片段(编码结构蛋白)来产生嵌合病毒。尽管在前两个片段的重叠区有11个错配，转染产生了基因型间JEV I/JEV III和JEV III/JEV I嵌合体。在第四次传代使用NGS建立的完整基因组序列分析表明，遗传漂变(序列改变的比率)是适度的(当考虑固定突变时，每个位点为1,45E-03至9,00E-05个替换)。基因组(具有热点和高度保守区两者)中大部分非同义突变、不同JEV菌株间共同突变的存在(7/85)和突变的非随机分布(频率大于10％)表明对细胞培养条件的适应。

突变率根据用于分离的细胞而不同，并且如预期的，来自低传代菌株的病毒高于来自适应培养的菌株的那些。总之，ISA方法是非常简单的方法，其在几天内加快产生感染性的基因修饰的RNA病毒，具有对病毒序列的完美控制，并且从各种初始来源(包括预先存在的感染性克隆、病毒RNA或从头合成的DNA基因组序列)开始。在之前没有被考虑的规模上，该技术未来具有用于制备设计大的RNA病毒反向基因组学实验的潜力。它也具有特别是调控从实验程序回收的病毒的特征的能力。此外，由于DNA亚基因组片段可通过PCR方便地获得，当从病毒RNA开始时，该方法具有保存病毒群的遗传多样性的潜力。也可以使用容易出错的PCR来产生人工病毒异质性，例如用于加快选择在各种实验选择条件下适应的病毒，且相反地，可以使用高保真聚合酶和克隆扩增模板来控制产生的病毒的克隆程度。

最后，本发明的方法通过室温下简单的非感染性的DNA亚基因组片段的单独运送，具有彻底改变科学研究所之间未来交换RNA病毒的安全与保障的潜力，然后接受的研究所可以组合并转染所述DNA亚基因组片段，确保感染性病毒菌株的快速、简单和安全的回收。

实施例2：基孔肯雅病毒的减活

材料和方法

细胞和抗体

在含有7％热灭活胎牛血清(FBS；Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(PS；5000U/mL和5000μg/ml；Invitrogen)的最小必需培养基(Invitrogen)中，于37℃、5％CO₂下生长非洲绿猴肾(Vero)细胞。在含有10％FBS和1％PS的达尔伯克改良伊格尔培养基(Invitrogen)中，于37℃、5％CO₂下生长人胚肾293(HEK-293)细胞。在含有10％热灭活FBS、1％PS和5％胰蛋白示磷酸盐肉汤(29.5g/L；Sigma-Aldrich)的L-15培养基(Invitrogen)中，于30℃生长白纹伊蚊(A.albopictus)C6/36细胞。

用CHIKV特异性免疫人血清进行ELISA分析(参见以下)。为了降低与HEK293细胞化合物反应的非特异性分子的浓度，将40μl血清与提取的HEK293细胞(细胞从一个150cm²玻璃瓶培养获得，用丙酮提取)在400μl的最终体积(稀释剂：1％BSA；KPL)中接触16小时。使用标准方法(兔快速28天免疫实验方案，Eurogentec)，用AFMB实验室(Architecture etFonction des Macromolécules Biologiques，UMR 6098，Marseille France)友好提供的重组蛋白(nsP2的C末端区域与nsP3的N末端区域之间的融合；文本S2)免疫两只兔。纯化的单克隆抗体(使用Sepharose基质的亲和纯化；Eurogentec)用来进行蛋白质免疫印迹分析。

电子(in silico)重编码方法

用计算机程序将CHIKV基因组的三个区域重编码，其根据对应的氨基酸序列将核苷酸密码子随机分布：例如，氨基酸缬氨酸随机用GTT、GTC、GTA或GTG替换。为了使稀有密码子在灵长类动物细胞系中的影响最小化，灵长类动物基因组中这种稀有密码子(即CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG、ACG)的数量和位置不变。此外，通过修正一些位点的同义突变保留特定的限制性位点。调整重编码盒的位置(首先基于特定限制性位点的可利用性)以避免与已知的RNA二级结构重叠。最后，使用该方法设计了分别位于nsP1、nsP4和E2/E1区域的1302个、1410个和1500个碱基的三个盒(所述盒的序列如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示)。

构建CHIKV感染性克隆(IC)

我们通过用修饰的pBR322起点和启动子CMV(pCMV)分别替换复制起点和原核启动子修饰了之前所述的LR2006菌株的IC(GenBank登录号EU224268)。使用标准分子学技术，用BamHI和XhoI独特限制性位点获得中间质粒，其包括新的复制起点(修饰的pBR322)、原核启动子CMV(pCMV)和部分的病毒基因组(从第一个碱基至XhoI)。合成部分病毒基因组(从XhoI至结束)、聚A尾和丁型肝炎核酶(HDR)接着猿猴病毒40(SV40)聚腺苷酸(Genscript)，并用XhoI和AvrII独特限制性位点将其引入中间构建体。最后，用独特限制性位点BamHI、AgeI和XhoI将同义突变引入基因组(通过融合PCR产物获得突变盒)。一共引入8个同义突变以制备需要的限制性位点或消除不需要的限制性位点。所得的感染性克隆(视作野生型WT)整合了四个新的独特限制性位点。

合成所有的重编码区(GenScript)，并通过消化将其插入IC(Φnsp1用BamHI/XmaI，Φnsp4用AgeI/ApaI，和Φenv用XhoI/AvrII；NewEngland Biolabs)，凝胶纯化消化产物(Qiagen)，连接(T4 DNA连接酶；Invitrogen)，并将其转化至电感受态的STBL4细胞(Invitrogen)。在转染前，纯化所有感染性克隆(0.22μm过滤)，并通过限制性图谱和使用一组特定引物对的完整测序来确认它们的完整性。

实时RT-PCR分析

使用位于nsP2区域的179nt片段(核苷酸位置2631-2809)来检测所有CHIKV的基因组RNA(正链)(通用检测)，无论是否重编码。使用位于nsP4区域的168nt的另一个片段(核苷酸位置6804-6971)来从竞争实验分析细胞上清液：两组引物和探针允许我们特异性检测在nsP4区域重编码的病毒或在相同区域没有修饰的病毒。

复制动力学

使用重复动力学研究的结果来测定各病毒的复制适应性，在Vero、HEK293或C6/36细胞中重复进行三次。为比较来自7个IC的7个病毒(WT病毒和6个重编码的病毒)，一个实验用所有病毒进行。分别用病毒母液或IC感染或转染细胞。为评估传代病毒的复制适应性，发明人用Vero中的第一次传代和各传代方案中的第12次、第25次、第37次和第50次传代(以三次重复测试的13个上清液)对各病毒(WT、Φnsp4和Φnsp1 Φnsp4 Φenv病毒)进行一个实验。对于单循环复制动力学，用估计MOI为5感染融汇的Vero、C6/36或HEK293细胞的75cm²玻璃瓶培养。感染30分钟后洗涤细胞两次(HBSS)，并加入20ml培养基。在洗涤前和感染后第2、8、14、20和28小时取样1ml细胞上清液。对于低估计MOI的复制动力学和传代病毒的复制适应性的评估，用估计MOI为0.01感染融汇的Vero、C6/36或HEK293细胞的25cm²玻璃瓶培养。感染2小时后洗涤细胞两次(HBSS)，并加入8ml培养基。在洗涤后(T0)和感染后第24、48和72小时取样1ml细胞上清液。对于使用感染性DNA克隆的复制动力学，根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用IC转染次融汇的HEK293细胞的75cm²玻璃瓶培养。转染4小时后洗涤细胞两次(HBSS)，并加入20ml培养基。在洗涤后(T0)和感染后第16、24和48小时取样1ml细胞上清液。

所有取样的细胞上清液通过离心澄清、分样并储存于-80℃.然后，用TCID50试验和实时RT-PCR试验分析它们(不是系统性进行，参见图例)。使用EZ1 Virus Mini Kit v2在EZ1 Biorobot(两者均来自Qiagen)上从澄清的细胞上清液中提取核酸。

病毒竞争实验

使用5个不同的PFU比例(WT/重编码病毒为1/99、20/80、50/50、80/20、99/1)，将WT病毒与四个重编码病毒(Φnsp4、Φnsp1 Φnsp4、Φnsp1 Φenv或Φnsp1 Φnsp4 Φenv)之一竞争生长。总体估计MOI为0.5用于第一次接种。对于各个实验，感染25cm²玻璃瓶培养的融汇细胞2小时，洗涤(HBSS)，加入7ml培养基后孵育48h。然后如下将来自各实验的病毒传代九次：用纯化的培养物上清液(离心)感染25cm²玻璃瓶培养的融汇细胞2小时，洗涤(HBSS)，加入7ml培养基后孵育48h。在每次传代，估计的MOI的瓶颈为约0.5。每个感染后，使用EZ1 Virus Mini Kit v2在EZ1 Biorobot(两者均来自Qiagen)上从澄清的培养物上清液中提取核酸。使用靶向ΦnsP4区域(参见以上)的两个特异性实时RT-PCR试验分析每个病毒的含量并计算两个值的比例(WT/重编码)。

细胞内RNA和病毒蛋白的定量

使用总体估计MOI为5，用病毒母液感染融汇的12孔板的HEK293细胞。感染30分钟后洗涤细胞一次(HBSS)，并加入2ml培养基。感染后8小时，检查不存在细胞病变效应，弃掉培养物上清液，并洗涤细胞一次(HBSS)。所有实验重复三次。对于蛋白质免疫印迹分析和细胞内病毒RNA定量，根据制造商(Macherey-Nagel)的说明，用Nucleospin RNA/蛋白质试剂盒分离相同孔中的总RNA和蛋白质。在含有SDS的10％聚丙酰胺凝胶上分解蛋白质提取物，并将其转移至PVDF膜。使用抗Nsp1/2兔pAb，抗-肌动蛋白C-2mAb(Santa CruzBiotechnology)和相应的HRP偶联的二级抗体。用Immobilon(Millipore)随后将印迹曝光至射线胶片来显示蛋白质条带。进行实时RT-PCR试验(参见以上)来评估病毒细胞内RNA(如之前所述，用肌动蛋白mRNA作为标准化子来说明细胞数的差异和/或提取RNA的质量)。对于通过ELISA来定量病毒蛋白质，用细胞刮棒机械收获细胞，重悬于800μL PBS，涡旋并通过超声破碎(20KHz 30秒，Misonix Sonicator XL)。使用预处理的CHIKV特异性的免疫人血清来检测病毒蛋白质。

细胞中病毒的实验性传代

根据以下三个方案将WT和两个重编码病毒(Φnsp4和Φnsp1 Φnsp4 Φenv)传代50次：在Vero或C6/36细胞中连续传代或在Vero和C6/36之间交替传代。对于每次传代，用稀释的澄清细胞上清液感染25cm²玻璃瓶培养的融汇细胞2小时，洗涤(HBSS)，加入7ml培养基后孵育48h。然后收集细胞上清液，离心澄清，分样并储存于-80℃。对于每次传代，估计MOI的瓶颈为约0.1。为避免污染，病毒传代在三个阶段进行：WT和Φnsp4病毒连续传代，相同病毒的交替传代和Φnsp1 Φnsp4 Φenv病毒的传代。同时传代的所有病毒按顺序并在不同的层流柜中操作。

噬菌斑测定

用1ml病毒母液感染12孔培养板上的单层Vero细胞(参见以上)。2小时后，洗涤细胞(HBSS)，并加入2ml含0.9％琼脂的培养基。孵育72小时后，用10％甲醛固定细胞4小时，并用0.1％萘黑溶液染色30分钟。

组织培养感染剂量50(TCID50)测定

对于每次测定，用150μL/孔的10倍连续稀释的离心澄清的细胞培养物上清液接种96孔板培养的融汇Vero细胞：每行包括稀释的6个孔和2个阴性对照。将板孵育7天，并读取每个孔中CPE的不存在或存在。使用Reed和Muench18方法测定TCID50/mL。当用样品获得的值小于该方法的检测阈值(101.82 TCID50/ml)，发明人用2倍、20倍和200倍稀释进行另一次测定(检测阈值：101.13 TCID50/ml)。低于该阈值的值在图表演示中视作等于101.13TCID50/ml，且在统计分析中不考虑。假设重编码和/或实验性传代能显著改变CPE的外观，发明人用qRT-PCR试验(参见以下)作为感染性病毒存在的灵敏的指标。对每个病毒进行该试验(第一次传代，如果可用，第25和50次传代)。对于所有病毒，CPE阳性孔在qRT-PCR中为阳性(阈值循环数小于16)，未能产生CPE的那些为阴性，或阈值循环＞35(稀释初始RNA产量后预期的值)的阳性。

血凝试验

使用估计MOI为5，用病毒母液(参见以上)感染25cm²玻璃瓶培养的融汇Vero或C6/36细胞。感染30分钟后洗涤细胞(HBSS)，加入8ml不含FBS的培养基。感染后16小时取样2ml细胞上清液。将取样的上清液离心澄清、分样并储存于-80℃。然后用TCID50测定分析它们(参见以上)，用标准方法进行实时RT-PCR分析和血凝滴定试验：在U形底微板上，在0.4％牛白蛋白/硼酸盐水PH9.0溶液中制备两倍连续稀释的细胞上清液(最终体积：35μl/孔)。加入35微升预稀释的鹅红血细胞(用最终pH6.0的调整稀释剂，1/150)，将混合物均质化，室温下孵育45分钟，然后用四种评分符号读取：完全血凝为++，部分血凝为+，痕量血凝为+/-，阴性血凝为-。血凝滴度是其中观察到+的最高稀释的倒数。

结果

发明人评估了对大规模重编码CHIKV(重新出现的旧世界的致病性虫媒病毒)的复制适应性和致细胞病变性的作用。通过大规模重编码制备减活病毒对于疫苗开发和理解病毒致病性的进化基础是令人激动的潜在重要途径。与不改变氨基酸序列有关的定点重编码允许我们通过改变密码子替换间隔的长度来调控适应性，并且还为活的减活疫苗的遗传开发提供益处，包括减少成本和单剂量诱导长期免疫。

一个关键的结果是观察到本文所述的随机重编码方法降低了CHIKV在灵长动物和节肢动物细胞中的复制适应性。CHIKV复制适应性的降低与重编码程度直接相关。发明人发现，在蚊虫细胞的一个复制周期中，密码子重编码极大地降低了释放病毒的感染滴度，而病毒颗粒的数量保持稳定。这意味着，当病毒被重编码时，成熟过程(即，形成核糖核蛋白及其插入含有HA的细胞膜)可能出错。

与此不同，在灵长类动物细胞中，这种病毒颗粒感染性的降低与病毒RNA和蛋白质的产生降低有关，这可能是由损坏的复制复合体造成。

这些结果表明，病毒基因组中的同义突变具有主要的适应性作用，并且不仅是在之前描述的少量顺式作用元件中(Gerardin等，2008)。

实际上，在该实验期间，产生了6个重编码病毒，其中最多重编码的病毒在编码不同蛋白的三个区域中被修饰(总体上引入了横跨4212nt的882个同义突变)。复制适应性降低这一观察结果强烈表明，一部分的同义突变在RNA病毒中不是中性的，这支持了之前表明重编码的脊髓灰质炎病毒和流感A病毒被减活的研究。实际上，一些同义突变在传代过程中被积极选择是可能的，巩固了同义位点对于病毒适应性至关重要这一观点。总之，与非同义突变的情况一样，同义突变也可能是中性的、有益的或有害的。

可以通过全基因组的突变过程来形成同义位点的进化模式，例如G+C％，密码子使用偏好和二核苷酸频率。之前在脊髓灰质炎病毒、流感A病毒和细菌病毒T7中的密码子重编码研究(其应用了密码子使用偏好、密码子配对偏好或CpG/UpA频率的特定修饰)分析了理论上产生有活力的基因组的子集的这些全局约束。

使用仅轻微修饰这些全局性质的大规模随机重编码方法，发明人仍然在灵长动物和节肢动物细胞中观察到复制适应性降低。这些结构表明，局部约束也可能为RNA病毒中的同义位点提供显著的选择压力，例如通过破坏RNA二级结构。因为大量功能性二级结构存在于RNA病毒的编码区从而包括同义位点(值得注意的实例是脊髓灰质炎病毒、蜱传播脑炎病毒、甲病毒和HIV-1)，可能相似结构在CHIKV中是普遍的。

近来表明，对脊髓灰质炎病毒的非衣壳区应用类似的重编码策略导致鉴定了两个新的功能性RNA元件。本文所述的大规模随机重编码的概念也被随机单个同义突变(其不改变基因组的遗传特征)对病毒复制适应性的负面影响的报道支持。

最后，这些结果表明，病毒复制适应性的降低是由各种因素驱动。

首先，所研究的病毒的本质是非常重要的参数：发明人发现，引入多达882个随机同义突变明显影响CHIKV的复制适应性，而两个之前的研究表明，对脊髓灰质炎病毒的衣壳前体(P1)区域应用相当的随机重编码方法没有显著影响复制适应性(分别引入934个和153个同义替换)。

重编码区的位置构成重要的第二个因素：在E2/E1区的重编码比在其他基因组区域造成更大的适应性损失。分析完整的野生型CHIKV基因组揭示了在该重编码区中天然的低水平的同义多样性，这表明该区域经历特定的局部进化约束，这部分解释在该区域的重编码的显著影响。

与具体方法相比，随机重编码中一个突变的平均影响明显可能不那么重要。这表明，当设计未来的疫苗候选物时，随机大规模重编码可能在几个方面具有优势：

(i)鉴于产生的大量突变，恢复到野生型本质上更加困难；

(ii)由于在本实验中复制适应性的降低随重编码的程度而减少，该方法为通过调控重编码区的长度和引入的同义突变的数量来微调适应性降低打开了大门；

(iii)由于WT和重编码病毒之间的重组，使用位于整个病毒基因组的几个重编码区的组合可以防止完全的表型逆转：大规模序列修饰使重组本质上更加困难，且在重组的情况下，表示重编码菌株的基因组的部分可能仍然携带与适应性降低有关的一些突变。

因此，这些重编码病毒非常稳定。为证实，发明人将野生型和两个重编码CHIKV在细胞中传代。在重编码病毒的连续传代期间，发明人观察到，对密码子重编码的反应和对培养条件的适应同时发生。然而，观察到的高水平的WT病毒和重编码病毒之间的趋同进化表明，由密码子重编码造成的选择可能弱于对培养条件的适应，和/或恢复重编码成本的有益突变比较不可能发生。因此，这种对逆转重编码效果难度的间接洞察进一步突出了这些重编码病毒的稳定性。

这些实验还证实，在一个宿主中获得突变可能在不同宿主类型中是有害的(灵长动物细胞中的连续传代增加了灵长动物细胞中的病毒复制适应性，而蚊虫细胞中的连续传代降低了灵长动物细胞中的病毒适应性)，除了最多重编码的病毒，其交替传代严重地(i)限制复制适应性的增强，和(ii)延迟突变的出现。

总之，这些实验表明，随机密码子重编码显著降低CHIKV的复制适应性。尽管这些结果非常重要并且鼓舞人心，它们并不能轻易延伸至产生慢性感染的RNA病毒。因此，显然需要动物模型的研究来评估这些新一代减活方法在制备疫苗候选物中的潜力。然而，该方法可以协助开发未来的RNA病毒疫苗，包括对虫媒病毒的那些。引入大量轻微有害的同义突变将灵长动物和节肢动物细胞中的CHIKV的复制适应性降低了几个数量级。该策略造成病毒密集传代后限制的逆转和适应性恢复，如果与野生型病毒的重组发生，可能降低完全表型逆转的风险。我们的结果鼓励我们，这种修饰的病毒很难返回它们在真实世界中的天然虫媒病毒循环。此外，复制适应性的降低与重编码程度有关，这一观察结果在开发调控病毒减活的进一步策略中可能具有优势。

实施例3：进一步RNA病毒的减活

已经表明，本发明的大规模密码子重编码步骤是减活的强大方法，其对于疫苗开发具有几个优势，包括一旦已知靶标病原体的完整序列并能够产生感染性基因组，尽快在非常短期内获得潜在疫苗菌株的可能性。它还可能精确调控复制适应性损失的程度并制备以成本经济的方式赋予长期保护的安全的活的减活疫苗。

发明人将本文所述且在实施例2中例证的减活方法应用至2个其他虫媒病毒(两者均是黄病毒：包膜的单链正义RNA病毒)：蜱传播脑炎病毒(TBEV)和日本脑炎病毒(JEV)。

A)TBEV

根据之前向基孔肯雅病毒(CHIKV)应用的大规模密码子重编码方法，发明人修饰了TBEV(Oshima 5-10菌株)的NS5基因组区域(如SEQ ID NO：66所示的1412bp的盒)，插入了273个沉默突变(随机密码子重编码)。

于1995年在日本分离的TBEV菌株Oshima 5-10属于远东亚型，在小鼠中显示重要的毒力(如对于人一样，它引起脑炎)。用ISA方法和传统方法获得野生型(WT)和NS5随机重编码的病毒(获得感染性克隆)。在细胞中测量相应病毒的复制适应性，几乎相同。

病毒	盒大小(NS5基因组区域)	突变数量	完整开放阅读框的ENC	完整开放阅读框的％G+C
					WT	-	-	54.0	54.3
NS5重编码	1412nt	273	55.5	53.8

表4：研究的TBEV的遗传特征

使用密码子ENV的有效数来测量密码子使用，其给出20(对每氨基酸仅使用一个密码子)至61(每个氨基酸使用随机密码子)的值。

然后使用体内模型来测量该重编码TBEV的减活表型。腹膜内接种(使用2.10⁴、2.10⁵和2.10⁶个TCID50的病毒)后，在20天内每天监测小鼠的症状表现和体重。

结果表明，与用WT病毒感染的那些相比，用NS5随机重编码病毒感染的小鼠体重减轻和症状表现延迟。此外，WT感染的小鼠中，显示至少一个症状，体重减轻(≤94％)和脑中的病毒(通过实时RT-PCR检测病毒RNA)的小鼠数显著高于NS5随机重编码病毒感染的小鼠。在首次接种后30天，在用NS5随机重编码病毒感染的小鼠中观察到高水平的血清中和IgG抗体。最后，WT病毒的挑战实验(首次接种后30天挑战小鼠)表明，之前被重编码病毒感染的所有小鼠均被保护(基于症状表现和体重减轻)。

表5：不同WT、轻度或重度重编码片段的遗传特征

示出了片段数(第一、第二或第三)、长度、同义突变数和G+C％。500和1500意味着低水平和高水平的重编码。

使用反向基因组方法ISA和这些WT和重编码片段的组合，发明人制备了大量在基因组的不同部分携带渐进水平重编码的重组病毒。

B)JEV

发明人已经使用大规模随机密码子重编码方法修饰了JEV菌株“JEV_CNS769_Laos_2009”(基因型I)。

在此使用不同方法：使用两个不同水平的重编码：在整个开放阅读框插入585个或1717个同义突变的高水平和低水平重编码，发明人电子重编码了从PrM开始至NS5基因组区域结束的几乎所有完整开放阅读框(ORF)(图3)。

为此目的，发明人使用至少一个如SEQ ID No：67、SEQ ID No：68、SEQ ID No：69、SEQ ID No：70、SEQ ID No：71和SEQ ID No：72所示的重编码盒。

使用人细胞测量这些重编码JEV在细胞中的复制适应性：初步结果表明复制适应性根据重编码水平、重编码区的大小和重编码片段的基因组位置而降低(图4)。

实施例4：体内制备

使用本发明方法制备覆盖RNA病毒整个基因组的重叠片段，其在5’和3’的侧翼分别为DNA依赖性RNA聚合酶的启动子和终止子/RNA聚腺苷酸信号。

将这些DNA片段直接接种入活的动物，并允许从几个动物样品中回收感染性病毒。此外，动物的临床监测(症状表现和显著的体重减轻)允许观察感染的典型体征。

a)实验1：蜱传播脑炎病毒(TBEV；黄病毒)

发明人使用了蜱传播脑炎病毒的野生型菌株(菌株Oshima 5.10(GenBank登录号AB062063))。他们将本发明的方法用于DNA重叠片段。

用三个DNA重叠片段接种5周大的C57B1/6J雌性鼠。

通过跟踪以下监测病毒感染的临床进程：

(i)疾病的临床表现(发抖、驼背、脏眼(dirty eye)、轻偏瘫或四肢轻瘫、半身不遂或四肢瘫痪)；和

(ii)小鼠的体重，完全如Fabritus L等，2015，Attenuation of Tick-BorneEncephalitis Virus Using Large-Scale Random CodonRe-encoding.PLoS Pathog 11(3)所述。

接种14天后，从处死的小鼠收集脑和脾。将脑和脾研磨并离心。用所得的上清液来评估感染性病毒的存在。

用分子学(实时PCR)和经典的细胞培养方法(分离感染性病毒)来评估感染性病毒的存在。

使用初始量为2-5μg的DNA和两种不同的接种途径(腹膜内注射和皮内注射)，从脑和脾中均检测到感染性病毒。也观察到疾病的临床表现(明显的体重减轻和症状)。

b)实验2：乳鼠的脑内接种

发明人使用了蜱传播脑炎病毒的野生型菌株(菌株Oshima 5.10(GenBank登录号AB062063))和日本脑炎病毒(JEV_CNS769_Laos_2009(GenBank登录号KC196115))。他们用本发明的方法制备DNA重叠片段。

将DNA重叠片段稀释于PBS或与转染剂混合使用。

通过脑内注射DNA重叠片段接种OF1乳鼠。通过根据疾病的临床表现(发抖、昏睡)来监测病毒感染的临床进程。接种6-12天后从处死的小鼠收集脑。将脑研磨并离心。用所得的上清液来评估感染性病毒的存在。

用分子学(实时PCR)和经典的细胞培养方法(分离感染性病毒)来评估感染性病毒的存在。

使用2μg的DNA，在添加或不添加转染剂的两种病毒(TBEV和JEV)的脑中均检测到感染性病毒。也观察到疾病的临床表现。

结论

因此，发明人利用本文公开的方法的力量来在体内制备病毒。因此，该方法可高效用于在体内，即直接在受试者体内开发活的减活疫苗。

序列表

<110> Universite d'Aix-Marseille

<120> 用于快速制备减活RNA病毒的方法

<130> BCT150168 QT

<160> 72

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 781

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 1

gaataagggc gacacggaaa tgtcacccaa ctgatcttca gcatcttcaa tattggccat 60

tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 120

cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat 180

gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 240

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 300

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 360

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 420

atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 480

cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 540

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 600

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 660

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 720

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 780

g 781

<210> 2

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDR - SV40pA

<400> 2

ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacattccg aggggaccgt 60

cccctcggta atggcgaatg ggactcgcga cagacatgat aagatacatt gatgagtttg 120

gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt aagcgctggc 180

attgaccctg ag 192

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 3

Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys

1 5 10 15

Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr

20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 4

gaagaatgat tctgtaagtg tccag 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 5

cgttgccatg ccaatcttag cg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 6

ggtgcttgcg tccttccacc aa 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 7

caaatgagta tggaatgctg gaaaa 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 8

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 9

gcccaccgga aggagctgac 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 10

cagagagcaa atccctatga cga 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 11

cgtcaccatg ccagtcttag cg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 12

gcttggcaat ccagtcagtc ct 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 13

caaacgagta cggaatgcta gaaa 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 14

ctcatgtttg acagcttatc atcg 24

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 15

tcaatattgg ccattagcca tattat 26

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 16

tggattgaac actcctgtag acgc 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 17

tggttggagt tggaagcctc atc 23

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 18

gaccatgccg tggccggcc 19

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 19

tggacaagac caagaatgac attg 24

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

gttacaaata aagcaatagc atcaca 26

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cagggttatt gtctcatgag cgga 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gccacgccca ggaagagcat ga 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gggccctctg gaaatgggga ga 22

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

caacccaggc ttgtcaccat cttt 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gggtgaggtc gtggaccttg ga 22

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

cctaggaatt tcacaaataa agcatttt 28

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gcatggaagt gtcctttgag ttct 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

gacttgcaac gatgctcttt tgca 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gagagagcat cgtcacaatg cc 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gattccatcc agcaccgcac c 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gaataagggc gacacggaaa tgt 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tgaagacagc ttgtcctgca caa 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gatcatggct tggaggacca ttat 24

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

gctactgcat agagcgtcca tg 22

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tttaccaggt aaaaacagaa accac 25

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

catggaacca ttccctatgg act 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

actggattgt gaaccaagga gtg 23

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gaagaatgat tctgtaagtg tccag 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

cgttgccatg ccaatcttag cg 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

aatataaccc cgagcggcga tg 22

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

atgtcaccaa acagggtgcc caa 23

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ggtgcttgcg tccttccacc aa 22

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

caaatgagta tggaatgctg gaaaa 25

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcgccgtgct ccattgattc tg 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

ggctgtgggc acatttgtca cg 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ctgctcgggt gacctgtcct a 21

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

tgagatgttt ttcctattca gcaact 26

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

aacaatgtgt tgacgaacag agtta 25

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ctccctgctg gacttgatag ag 22

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

ccacacaaca tgcgtaccaa gca 23

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

caggcgctgg cgctccgaca 20

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

gtctatggtt atactctctg aaca 24

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

gacaggagga cacaagtcag at 22

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 63

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码序列

<400> 63

gatcctgatt ccactattct agatataggg tctgcgccag caaggagaat gatgtcggac 60

agaaaatacc attgtgtttg tccgatgcgc agtgcggaag accctgagag actagcaaat 120

tatgcgagaa agctagcctc cgccgcaggg aaagtactgg ataggaatat ctctgggaaa 180

attggagacc tacaagcagt gatggcagtc cctgacacgg agacgcccac cttctgtctc 240

cacactgacg tatcttgcag gcaaagagct gatgtcgcaa tctaccaaga tgtttatgca 300

gtgcatgcac ccacgtcgtt ataccaccaa gcgattaaag gtgtgcgagt agcgtactgg 360

gtagggttcg atactactcc gttcatgtat aatgccatgg cgggggcata tccaagctac 420

tcgacaaatt gggccgatga gcaggtgtta aaagccaaga atattggtct ttgcagcacc 480

gatttgacgg aaggtagacg aggaaaatta tctattatga ggggtaaaaa acttaaaccg 540

tgtgatcgtg ttctctttag tgtaggttca acgttgtacc cggagtcccg caagctcctt 600

aagagttggc atctgccctc ggtgttccac ttaaaaggta agctctcatt tacatgtcgc 660

tgtgacaccg tagtctcgtg cgaaggttat gttgtcaaaa ggataacgat gagccctggc 720

ctatacggaa aaacaaccgg atacgcggtc acccaccacg cagatggttt tctaatgtgc 780

aagaccacag atacggtaga cggagagagg atgtcctttt cggtatgtac ttacgtgccg 840

gcgaccattt gcgatcagat gaccggcata ttggctacag aggtcacgcc ggaggatgct 900

cagaagttac ttgtgggttt aaatcaaagg atcgttgtaa acgggagaac gcaacggaac 960

acgaatacaa tgaaaaatta cttactacca gtggtcgctc aagcattctc caagtgggca 1020

aaagagtgtc ggaaagatat ggaggacgaa aaattattag gcgtcaggga aagaacactc 1080

acctgttgct gcctctgggc tttcaagaag caaaaaacac acacggttta caaaaggccc 1140

gacacacaat ccattcagaa agtacaggcc gaattcgatt ccttcgttgt gccgtcattg 1200

tggtcgtccg gtttaagcat ccccctcaga acaaggatta agtggcttct ctccaaggtt 1260

ccaaaaacag atctcatacc atactccggg gacgcccgag ag 1302

<210> 64

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码序列

<400> 64

gccgtggccg cctgcaatga gttcttggca aggaactatc caacagtgtc cagttaccaa 60

attactgacg aatatgatgc ttatctagat atggtagacg ggtcggaatc atgcttagat 120

cgagcgacat ttaatccgtc taagttgagg tcttatccga aacaacatgc ataccacgcg 180

cctagcataa gaagcgctgt accgagtcct ttccagaata ctctgcagaa cgttttagcc 240

gccgccacga aaaggaactg caatgttaca cagatgaggg aactcccaac attagactcc 300

gctgtattta acgtcgaatg tttcaagaag tttgcatgca atcaagagta ttgggaagaa 360

tttgccgcct cccctatcag aataaccaca gaaaatttag ccacttacgt cactaaatta 420

aaaggcccta aggccgccgc gctgtttgct aaaactcata atttgcttcc cctgcaggaa 480

gttcccatgg ataggtttac tgtcgatatg aaaagggatg taaaagtgac tccaggtacc 540

aaacatactg aagaaaggcc aaaggtgcaa gtgatccaag cggcagagcc cttagcgaca 600

gcctacttat gtggaattca tagagaattg gtgagaagat taaacgcagt cctcttgcct 660

aacgtgcata ctcttttcga catgtccgct gaagacttcg atgccataat agcagctcat 720

tttaaacccg gagatactgt gttggaaacg gatattgcat cattcgacaa aagccaagat 780

gacagtttag cgttaacagc tttgatgttg ttggaagact taggggtcga tcactcctta 840

ctagacctaa tagaagctgc cttcggggag atatcatctt gccatctacc gacaggtacg 900

cgctttaaat ttggcgccat gatgaagagc ggcatgttct taacattatt cgtaaatacc 960

ttgttaaaca ttaccatcgc aagtcgagtg ctagaggacc gtttaactaa gagtgcgtgt 1020

gcggcattta taggtgacga taacataatc catggggttg tgagtgatga attaatggct 1080

gccaggtgtg ctacctggat gaacatggag gtgaaaataa tcgatgcagt ggtctccctg 1140

aaggccccat acttctgcgg gggttttatc ctccatgaca ctgttaccgg caccgcatgt 1200

agagtagctg acccgttaaa aaggttgttt aaactcggca agccgctagc ggctggggat 1260

gaacaggacg aggataggag gcgagcgtta gcagatgagg tgatcaggtg gcaacgaact 1320

ggattgatcg acgagctaga gaaagcggtt tactcaagat acgaggtgca ggggattagt 1380

gtggttgtga tgtcaatggc cactttcgcc 1410

<210> 65

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码序列

<400> 65

gttacgtggg gaaataatga gccgtacaaa tattggccgc agttgtccac caacggtaca 60

gctcatggtc atccgcatga gattatactc tactattatg aactatatcc aacaatgact 120

gtcgttgtcg ttagtgtggc aacgttcata ctactttcga tggtaggtat ggctgcgggg 180

atgtgcatgt gcgcacgacg cagatgcata actccgtatg aattaactcc cggcgcaaca 240

gtacccttcc tactaagctt aatctgctgc atcaggacag caaaggcggc cacttaccag 300

gaggccgcga tttacctgtg gaatgaacaa caacctctgt tttggttgca agcattaatc 360

ccgctagcag ctctcatagt tctgtgtaac tgtctgaggt tactcccctg ctgctgcaaa 420

acgttggcat tcctagcagt gatgtccgtg ggtgcccaca ctgtgtcagc gtatgaacac 480

gtgactgtca ttccgaatac ggtcggggtg ccgtataaaa ccttggtgaa tagacccgga 540

tactctccca tggttctgga aatggagctg ttgagcgtaa ctctggagcc tactctctcg 600

ctggattaca tcacgtgcga gtataagacc gtgataccga gcccgtacgt gaagtgttgt 660

ggaactgcag agtgcaaaga taagaacttg cccgactact cttgtaaagt tttcacaggc 720

gtttacccct tcatgtgggg tggggcatac tgtttttgtg acgcagaaaa tacgcagttg 780

tcagaagctc atgtagagaa gagcgagagc tgtaaaacag agttcgcttc cgcatacaga 840

gcccatactg catccgcttc cgcaaagcta cgcgttctat atcaaggcaa taatattact 900

gtgaccgcct acgccaacgg agatcatgca gttactgtta aagacgcaaa attcattgta 960

gggcctatga gcagcgcatg gacccccttt gacaacaaga tagtggttta taaaggagac 1020

gtatacaata tggattatcc gccctttggt gctggcagac ctgggcaatt tggtgatatc 1080

cagtcacgca cccctgaaag taaggatgtt tacgctaata cacagctcgt tctccagagg 1140

ccggcagtag gcacggtaca tgtaccctac tcacaggccc cttctggttt taaatactgg 1200

ctgaaggaac gcggtgcgtc gcttcaacat accgccccat tcggctgtca aattgccaca 1260

aacccggtta gggcggtcaa ctgcgctgta ggaaacatgc ctattagtat cgatatcccg 1320

gaggcggcat tcaccagggt ggtcgacgcg cctagtttaa cggatatgtc gtgcgaagtc 1380

cctgcttgta ctcacagtag tgattttggt ggcgtagcaa tcataaagta cgctgcctcc 1440

aaaaaaggaa aatgtgcggt gcactcgatg acaaatgcag ttactattcg ggaagccgag 1500

<210> 66

<211> 1412

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码盒

<400> 66

ccgcggcgag tttaattaac ggagttgtta agctcttatc atggccatgg aacgcgcggg 60

aggatgtcgt gcgaatggcc atgaccgata ctaccgcctt tgggcagcag cgagtattca 120

aagagaaggt agataccaag gcccaggagc cccagccagg gacgaaggtg atcatgaggg 180

ccgtcaatga ctggattctt gagcgacttg cccgaaagag taagcctcgg atgtgtagta 240

gggaggaatt catagcgaag gtgaagagta acgcggctct tggggcctgg agcgatgagc 300

aaaatagatg gtcatccgct aaagaggccg tcgaggaccc cgcattttgg caactggtgg 360

acgaggaaag ggaaagacat ctggctggaa ggtgcgcaca ttgtgtctat aacatgatgg 420

ggaaaaggga gaaaaagctt ggagagtttg gtgttgctaa ggggagtcgg gccatttggt 480

acatgtggct gggcagccgc ttccttgagt tcgaagcact tggatttcta aacgaggacc 540

actgggcttc cagggggtcc agtggatcag gagttgaagg tatctcccta aattatttag 600

gatggtacct aaagggtttg agcactcttg agggcggact tttttacgca gatgacacag 660

ccggatggga taccaaggtc actaatgcag acttggagga tgaagagcag ctcctacgtt 720

acatggaggg tgaacacaag caactggcgg ctacaataat gcagaaggca taccacgcca 780

aagtggtaaa agttgcccgg ccctcccgag atggaggctg catcatggat gtcatcacta 840

gaagagacca aagaggctct ggccaagtag tgacttatgc cctaaacacc ctcaccaata 900

ttaaagtaca actgatacga atgatggaag gcgagggtgt catcgaagca acggacgccc 960

ataacccaag actgtttcga gtggaacgat ggctcaggga tcacggggag gaacgtcttg 1020

ggagaatgtt agtttccgga gatgactgtg tagtcagacc tgtcgatgac aggttcagta 1080

gagcgctata ttttctgaac gatatggcca aaacaagaaa ggatgtaggc gagtgggaac 1140

actcggtggg tttctcgaat tgggaggagg ttcctttttg cagtcatcat tttcacgaat 1200

tagtgatgaa agatgggcgc gccttaatag tgccttgccg agaccaagat gaattggtgg 1260

gaagggcccg cgtctcccct gggtgcggct ggtcagttcg tgagacagcc tgtttgtcaa 1320

aggcatatgg ccaaatgtgg cttttatcct attttcatcg gcgcgatctc cgaacgttag 1380

gtttcgctat ctgttcggcg gtccccgtcg ac 1412

<210> 67

<211> 3569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码盒

<400> 67

ggagggaatg aaagctcgat aatgtggctt gcctcattgg caattgtaac agcttgtgca 60

ggagccatga aactatcaaa ctttcaagga aagttactga tgaccatcaa taacacggac 120

atagcggacg tcatcgttat ccccacctca aagggtgaaa acagatgctg ggtccgagca 180

atcgacgttg gatacatgtg tgaagacaca atcacgtatg aatgtccgaa gcttgccgtg 240

ggcaatgatc cggaagacgt cgactgctgg tgcgacaatc aggaagtcta cgtgcaatat 300

ggacgctgca cacggaccag gcattccaaa cgatccagaa gatccgtttc ggtccaaacg 360

catggggaaa gttcactagt taacaaaaaa gaggcttggc tggactcaac gaaggcaacg 420

cgatacctca tgaaaacgga aaactggatc ataaggaacc caggttatgc cttcttggcg 480

gcggcacttg gatggatgct tggctcaaac agtggacaac gtgtggtgtt caccatcctc 540

ttattgttgg tcgctccggc ttacagcttc aactgtctgg gaatggggaa tcgggatttt 600

atagaaggag ccagtggagc cacttgggtg gatctggtgt tggaaggaga ttcctgtctt 660

acaatcatgg caaacgacaa gccaacacta gatgtccgca tgatcaacat tgaagccagc 720

caacttgctg aagtcagaag ttactgctat cacgcatcag tcaccgacat ttcaacggta 780

gctcgatgcc ccacgactgg agaagcccac aacgagaaac gtgcagatag cagctacgtg 840

tgcaaacaag gctttactga tcgcggatgg ggtaatggat gtggactttt tgggaaagga 900

agcattgaca catgcgcaaa atttagctgt accaataagg ccattggaag aatgatccaa 960

ccagagaata tcaagtacga ggttggcata ttcgtgcacg gaaccaccac ctcggaaaac 1020

catggaaatt attcagcgca agtaggagcg tctcaagcag caaagtttac tgtaacccca 1080

aacgctcctt caataaccct caagttaggt gattatggag aggtcacact ggactgtgaa 1140

ccaaggagcg gattaaatac tgaagcgttc tatgtgatga cagtgggctc gaagtcattc 1200

ctagtccaca gggaatggtt ccatgatctt tctcttccct ggacgagccc aagcagcacg 1260

gcatggagaa acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cacatgccac aaaacaatct 1320

gtcgtagccc ttgggtcaca ggaaggtggc ctccatcaag cgctggctgg ggccattgtg 1380

gtggagtact cgagctcagt gaagttgaca agtggacact tgaaatgcag gctgaaaatg 1440

gacaaactgg ctttaaaggg cacgacttat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg 1500

aaaaatccag cggacacagg ccatggaaca gtggtcattg agctaacata ttctggaagt 1560

gatggtccct gtaaaattcc gattgtctca gtggcgagtt taaacgacat gaccccagtg 1620

ggtaggctgg taacagtaaa ccccttcgtc gccacatcta gctccaactc aaaggttctg 1680

gttgagatgg aacctccctt cggagacagc tatatcgtgg tcggtagagg ggataagcag 1740

attaaccatc actggcacaa agctggaagc acgctgggca aagctttctc aactaccttg 1800

aaaggggctc agagattagc agcgctaggt gacactgcct gggacttcgg ctccattgga 1860

ggggtattta attctatagg gaaagctgtt caccaagtat tcggcggtgc tttcagaacg 1920

ctctttggtg gaatgtcttg gatcactcaa ggactaatgg gggccctcct tttgtggatg 1980

ggtgttaacg cacgagatcg gtcaatagct ctggcttttt tggccacggg aggtgtgctc 2040

gtctttttag cgaccaacgt gcatgccgac actggctgcg ccattgacat aactagaaaa 2100

gagatgagat gcggaagtgg catctttgtg cacaacgacg tagaggcttg ggtggatagg 2160

tacaaatatc tgccagagac gcctagatcc ctagcgaaga tagttcacaa ggcacatcaa 2220

gagggagtgt gcggggtcag atccgttact agactcgaac atcagatgtg ggaatctgtt 2280

cgggacgaat taaatgtctt gctcaaagag aacgcggtcg atttgagcgt ggtcgtgaac 2340

aaacccgtgg ggagatatcg ctcagctccc aaacgcctat ccatgactca agaaaagttc 2400

gagatgggct ggaaggcatg gggaaaaagc attctcttcg cccctgaatt ggccaactcc 2460

acattcgtcg tggatggacc cgagacaaag gaatgccctg atgagcgcag agcttggaac 2520

agcatgcaaa ttgaagattt cggattcggc ataacatcaa ctcgagtgtg gctgaaaatt 2580

agagaggaga acaccgatga gtgtgatgga gcaatcatag ggacagcagt aaagggacat 2640

gtggccgttc actccgactt gtcttactgg attgagagcc gtttgaatga cacctggaaa 2700

ttggagaggg ctgttttcgg agaggtaaaa tcttgcactt ggcccgaaac acacactctt 2760

tggggtgacg gagttgagga gagcgagctt atcatcccac atactatagc tggaccgaga 2820

agtaagcaca accggagaga agggtacaaa acacaaaacc agggaccctg ggatgagaac 2880

ggcatcgtgc ttgactttga ttattgtcca ggaacaaagg tcacaatcac agaggactgt 2940

ggcaaaaggg gtccctcaat cagaaccact actgacagtg gaaagctgat caccgattgg 3000

tgctgtcgta gctgttctct accgccactc cggttccgga cagaaaatgg ttgctggtac 3060

gggatggaaa tcaggcctgt taggcatgac gaaacaacac tagttaggtc acaggttgac 3120

gctttcaacg gcgaaatgat tgacccattt cagctgggct tactggtgat gtttctcgca 3180

acccaggagg tccttcgcaa gaggtggacg gccagattaa cgattccagc ggttctaggg 3240

gctctacttg tgctgatgtt agggggcatc acttacactg acctggcaag atatgtcgtg 3300

ctagttgctg cggctttcgt ggaggccaac agtggtggag atgttctgca tctcgctctg 3360

atagccgttt tcaaaataca gccagctttt ctggttatga atatgcttag cgcgaggtgg 3420

acgaaccaag aaaacgtggt tctggtcctg ggggcggctt ttttccaact cgcttcagtg 3480

gatttacaga tcggagtcca cggaatcctc aatgccgctg ccatagcatg gatgatcgtt 3540

cgagcgatca catttcccac tacaagcac 3569

<210> 68

<211> 3569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码盒

<400> 68

ggtgggaatg aaagctcgat aatgtggctg gcctcactcg ctattgtaac agcttgtgca 60

ggagcaatga aacttagcaa ttttcaggga aaattattaa tgacaatcaa taacacggac 120

atagcggacg tgatcgttat acccacaagc aagggagaaa acagatgctg ggtccgagct 180

atcgatgtcg gatacatgtg tgaagacaca atcacgtatg agtgtccgaa gcttgccgtg 240

gggaatgatc cggaagatgt cgactgttgg tgtgacaacc aggaagttta cgtccaatac 300

ggacgctgca cccggaccag gcacagcaaa cgatccagaa ggagtgtttc ggttcaaacg 360

catggggaga gttcactagt taataagaag gaagcctggc tggactcaac gaaggcaacg 420

cgatacctca tgaaaacgga aaactggata ataaggaacc caggatacgc cttcttggcg 480

gcggctcttg gatggatgtt agggtcaaac agtggacaac gtgtggtctt taccatcctc 540

ttattgcttg tagcaccggc ttacagcttc aactgcctgg ggatgggaaa tcgggatttt 600

attgaaggtg ccagtggtgc tacctgggtc gaccttgttc tcgaggggga ctcctgtctt 660

accatcatgg ctaacgacaa gcctacactt gatgtccgca tgattaacat tgaagcctct 720

caactagctg aagtgaggag ctattgctat catgcatcag ttaccgatat cagtacggta 780

gcacgatgcc ccacgacagg cgaagcccac aatgagaaac gtgcagatag ctcttacgtg 840

tgcaagcaag gttttacaga ccgcggatgg ggtaatggat gcgggttgtt tggcaaggga 900

agcattgaca cctgcgcaaa attcagctgc accaacaagg ccattggaag aatgatccag 960

cccgagaata tcaagtacga ggtaggaata ttcgtgcatg gcaccactac atcggaaaat 1020

catggaaatt atagcgcgca agtaggcgcg agtcaagcag caaaatttac cgtaaccccc 1080

aacgctccct caataacctt aaagttaggt gattatggtg aggtcactct agactgtgaa 1140

cccaggagcg gtttaaatac tgaggcgttc tatgtgatga cagttggctc gaagtctttc 1200

ctagtgcaca gggaatggtt tcatgattta agccttccct ggacgagccc aagcagcacg 1260

gcttggagaa acagggagct cctcatggag tttgaagagg ctcacgccac taaacaatct 1320

gtcgtggccc tagggagtca ggaaggtgga ctgcaccaag cgttggctgg ggccattgtt 1380

gttgaatact cgagcagtgt caaattgacc agtggacact tgaaatgcag gctgaaaatg 1440

gataaactgg ctttaaaagg cacgacatat ggcatgtgca cagaaaaatt ctcgtttgcg 1500

aagaaccccg cggacacagg acatggtact gtggttatcg agctaaccta ctcagggagt 1560

gacggtcctt gtaaaattcc gattgtttct gtggcgagct tgaacgacat gaccccagtg 1620

ggtagactcg taacagtcaa cccattcgtc gccactagct caagtaactc caaagttctg 1680

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ggaatcgtgt tagactttga ttattgtccc ggaactaagg ttacaattac agaggattgt 2940

ggcaaaagag gtcctagcat cagaaccaca actgacagtg ggaagttaat aactgattgg 3000

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gacttacaaa ttggtgttca cggcatcctc aatgctgctg caattgcttg gatgatcgta 3540

cgagcgatca cttttcccac tacaagcac 3569

<210> 69

<211> 2853

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码盒

<400> 69

ttgtcatagg aatttgttcc ctgctgcaag agaggagaaa gaccatggcg aagaagaaag 60

gagccgtgct cttgggctta gcgctcacat ctaccggatg gttctcgccc accactatcg 120

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gttcggggaa aaccaggaag atccttcccc aaataataaa ggatgctata cagcagcgct 1200

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<220>

<223> 重编码盒

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<220>

<223> 重编码盒

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<210> 72

<211> 3409

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重编码盒

<400> 72

tggtctaacc ggccttccaa gcatggctct agacttgcgc ccagcaaccg cttgggcgtt 60

gtacgggggt agcactgtcg tactcactcc cctcttaaag cacctaatca cctcagaata 120

cgttactact tcgttagcaa gcataagttc ccaggcgggc tcgctgttcg tactcccgcg 180

cggcgtgccc ttcactgact tggatctaac tgtcggacta gtctttctcg gatgctgggg 240

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aactacacca ttgatgcaaa aaaaggtggg gcaagtgcta ttgataggtg tgagcgtcgc 480

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ggtagacgta ttctataagc cttcggagcc ttccgacacc ctgttttgtg acatcggaga 1140

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tgcattagga gccgtattcg ccgaacaaaa tcagtggagc acggcgcggg aagccgttgg 1980

tgaccccctg ttttgggaga tggtaaacga ggagagagag aatcatttgc gaggcgaatg 2040

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agaaaacgaa gccaaagtgc ttgagctcct tgatggtgaa caccgcatgc tcgcccgagc 2400

tatcattgaa ctaacgtaca ggcataaagt ggttaaagtt atgagacccg ccgcaggcgg 2460

aaagacagtg atggatgtaa tatcccgaga ggaccaaagg gggagtgggc aggtggtgac 2520

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Claims (13)

1.用于制备减活RNA病毒的方法，包括以下步骤：

步骤I)通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码所述感染性RNA病毒的病毒基因组，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变；

步骤II)通过以下制备减活RNA病毒：

子步骤II.a)在步骤I)所得的重编码的病毒基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，和任选地在3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.b)在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增子步骤a)制备的重编码的病毒基因组，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列；

子步骤II.c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

子步骤II.d)孵育子步骤c)的所述宿主细胞；和

子步骤II.e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

2.权利要求1所述的方法，其中在步骤I)中，所述感染性RNA病毒的整个病毒基因组的约1至约20％的核苷酸密码子被编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子替换。

3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤I)通过以下进行：

–确定感染性RNA病毒的整个病毒基因组编码的氨基酸序列，并确定编码各氨基酸的各核苷酸密码子；

–用下表所示的编码相同氨基酸的不同核苷酸密码子替换编码表1的氨基酸的病毒基因组的1-20％的核苷酸密码子：

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述病毒是单链正链RNA病毒，优选选自黄病毒、甲病毒和肠道病毒的病毒。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中在步骤II.a)中，

-所述在5’位的DNA依赖性RNA聚合酶的启动子是人巨细胞病毒启动子(pCMV)；和/或

-所述任选的终止子和RNA聚腺苷酸序列分别是丁型肝炎核酶和猿猴病毒40聚腺苷酸信号(HDR/SV40pA)。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中：

-子步骤II.c)是直接转染子步骤b)获得的cDNA片段的步骤，和

-所述子步骤II.c)在子步骤II.b)之后直接进行。

7.权利要求1-5任一项所述的方法，其中子步骤II.c)是转染含有子步骤II.b)获得的cDNA片段的质粒或载体的步骤，其中各cDNA片段在单独的且分开的质粒或载体中。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中子步骤II.c)的转染的cDNA片段在孵育子步骤II.d)期间在宿主细胞中自发重组。

9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述病毒是基孔肯雅病毒，且所述步骤I)的重编码是在以下区域进行：

–在编码非结构蛋白nsP1的区域中，用SEQ ID NO：63所示的重编码盒；

–在编码非结构蛋白nsP4的区域中，用SEQ ID NO：64所示的重编码盒；和

–在编码结构蛋白E2和E1的重叠区域的区域中，用SEQ ID NO：65所示的重编码盒。

10.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述病毒是蜱传播脑炎病毒，且所述步骤I)的重编码步骤是在NS5基因组区域，用SEQ ID NO：66所示的重编码盒进行。

11.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述病毒是日本脑炎病毒，且所述步骤I)的重编码步骤是在从PrM开始至NS5基因组区域结束的完整开放阅读框(ORF)中，用至少一个选自SEQ ID No:67、SEQ ID No:68、SEQ ID No:69、SEQ ID No:70、SEQ ID No:71和SEQ IDNo:72的重编码盒进行。

12.权利要求1-11所述的方法用于开发活的减活疫苗的用途。

13.用作疫苗的cDNA片段，其中所述cDNA片段是通过以下获得重叠cDNA片段：

-在重编码的病毒基因组的5’位引入DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，和任选地在3’位引入终止子和RNA聚腺苷酸序列；和-在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增所述重编码的病毒基因组；

其中所述重编码的病毒基因组通过用编码相同氨基酸的另一个核苷酸密码子随机替换所述感染性RNA病毒的整个病毒基因组的一部分核苷酸密码子来重编码所述感染性RNA病毒的病毒基因组，前提是：

i)所述病毒基因组中存在的稀有核苷酸密码子的数量和位置不变，所述稀有核苷酸密码子是CGU、CGC、CGA、CGG、UCG、CCG、GCG和ACG；和

ii)涉及RNA二级结构的所述病毒基因组的区域不变。