ES2585553T3

ES2585553T3 - Desarrollo de componentes de vacunas del virus del dengue

Info

Publication number: ES2585553T3
Application number: ES12182319.9T
Authority: ES
Inventors: Stephen S. Whitehead; Joseph E. Blaney; Brian R. Murphy; Ching-Juh Lai
Original assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Current assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Priority date: 2006-08-15
Filing date: 2007-08-15
Publication date: 2016-10-06
Anticipated expiration: 2027-08-15
Also published as: BRPI0716455A8; PT2589602T; WO2008022196A2; BR122020023372B1; CN101657463B; US20100104598A1; EP2589602B1; CY1118003T1; LT2589602T; HUE029333T2; EP2054428B9; EP2054428A2; US20130089567A1; USRE46042E1; US10724007B2; BRPI0716455A2; CN101657463A; US20200318083A1; US10160957B2; DK2054428T3

Abstract

Un ácido nucleico que codifica un virus del dengue atenuado o un virus del dengue quimérico que comprende una mutación Δ30 que retira la estructura homóloga TL-2 en los serotipos 1, 2, 3, o 4 del virus del dengue, y los nucleótidos adicionales de la mutación Δ30 delecionados de la UTR-3' que retira al menos 19 nucleótidos en la dirección 5' justo en el límite de la región 5' de la estructura homóloga TL-3 en cada uno de los serotipos 1, 2, 3 y 4 del virus del dengue y en el que los al menos 19 nucleótidos se encuentran entre los nucleótidos 113 y 258.

Description

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Se han identificado numerosas cepas para cada uno de los cuatro serotipos. Las secuencias genómicas completas de diversas cepas del virus del dengue se proporcionan como números de registro del Genbank en la Tabla A.

Tabla A. Ejemplos de cepas del virus del dengue

Serotipo: Cepa N.º de Registro

1: 02-20 AB178040

1: 16007 AF180817

1: 16007 PDK-13 AF180818

1: 259par00 AF514883

1: 280par00 A514878

1: 293arg00 AY206457

1: 295arg00 AF514885

1: 297arg00 AF514889

1: 301arg00 AF514876

1: 98901518 AB189120

1: 98901530 AB189121

1: A88 AB074761

1: Abiyán AF298807

1: ARG0028 AY277665

1: ARG0048 AY277666

1: ARG9920 AY277664

1: BR-90 AF226685

1: BR-01-MR AF513110

1: BR-97-111 AF311956

1: BR-97-233 AF311958

1: BR-97-409 AF311957

1: Camboya AF309641

1: FGA-89 AF226687

1: FGA-NA d1d AF226686

1: Fj231-04 DQ193572

1: GD05-99 AY376738

1: GD23-95 AY373427

1: GZ-80 AF350498

1: D1-hu-Yap-NIID27-2004 AB204803

1: D1-H-IMTSSA-98-606 AF298808

1: Mochizuki AB074760

1: D1.Myanmar.059-01 AY708047

1: D1.Myanmar.194-01 AY713474

1: D1. Myanmar.206-01 AY713475

1: D1.Myanmar.23819-96 AY722802

Serotipo: Cepa N.º de Registro

1: D1.Myanmar.305-01 AY713476

1: D1.Myanmar.31459-98 AY726555

1: D1.Myanmar.31987-98 AY726554

1: D1.Myanmar.32514-98 AY722803

1: D1.Myanmar.37726-01 AY726549

1: D1.Myanmar.38862-01 AY726550

1: D1.Myanmar.40553-71 AY713473

1: D1.Myanmar.40568-76 AY722801

1: D1.Myanmar.44168-01 AY726551

1: D1.Myanmar.44988-02 AY726552

1: D1.Myanmar.49440-02 AY726553

1: rPacífico Occidental-delt∆30 AY145123

1: Pacífico Occidental rDENImutF AY145122

1: S275-90 A75711

1: D1-hu-Seychelles-NND41-2003 AB195673

1: Singapur 8114-93 AY762084

1: Singapur S275-90 M87512

1: ThD1_0008_81 AY732483

1: ThD1_0049_01 AY732482

1: ThD1_0081_82 AY732481

1: ThD1_0097_94 AY732480

1: ThD1_0102_01 AY732479

1: ThD1_0323_91 AY732478

1: ThD1_0336_91 AY732477

1: ThD1_0442_80 AY732476

1: ThD1_0488_94 AY732475

1: ThD1_0673_80 A732474

1: Pacífico Occidental Recombinante A145121

1: Isla Nauru del Pacifico Occidental 45AZ5 NC 001477

1: Isla Nauru del Pacifico Occidental Bethesda U88535

1: Isla Nauru del Pacifico Occidental 45AZ5-PDK27 U88537

2: 131 AF100469

2: 16681-PDK53 M84728

2: 16681 Blok M84727

2: 16681 Kinney U87411

2: 43 AF204178

2: 44 AF204177

Serotipo: Cepa N.º de Registro

2: 98900663 AB189122

2: 98900665 AB189123

2: 98900666 AB189124

2: BA05i AY858035

2: Bangkok 1974 AJ487271

2: BR64022 AF489932

2: C0166 AF100463

2: C0167 AF100464

2: C0371 AF100461

2: C0390 AF100462

2: China 04 AF119661

2: Cuba115-97 AY702036

2: Cuba13-97 AY702034

2: Cuba165-97 AY702038

2: Cuba205-97 AY702039

2: Cuba58-97 AY702035

2: Cuba89-97 AY702037

2: DR23-01 AB122020

2: DR31-01 A122021

2: DR59-01 AB122022

2: FJ-10 AF276619

2: FJ11-99 AF359579

2: I348600 AY702040

2: IQT1797 AF100467

2: IQT2913 AF100468

2: Jamaica-N.1409 M20558

2: K0008 A100459

2: K0010 AF100460

2: Mara4 AF100466

2: DEN2-H-IMTSSA-MART-98-703 AF208496

2: Nueva Guinea C AF038403

2: Nueva Guinea C-PUO-218 híbrido AF038402

2: Nueva Guinea-C M29095

2: PDK-53 U87412

2: Vacuna S1 NC 001474

2: TB16i AY858036

2: ThD2_0017_98 DQ181799

2: ThD2_0026_88 DQ181802

Serotipo: Cepa N.º de Registro

2: ThD2_0038_74 DQ181806

2: ThD2_0055_99 DQ181798

2: ThD2_0078_01 DQ181797

2: ThD2_0168_79 DQ181805

2: ThD2_0263_95 DQ181800

2: ThD2_0284_90 DQ181801

2: ThD2_0433_85 DQ181803

2: ThD2_0498_84 DQ181804

2: ThNH-28-93 AF022435

2: ThNH29-93 AF169678

2: ThNH36-93 AF169679

2: ThNH45-93 AF169680

2: ThNH-52-93 AF022436

2: ThNH54-93 AF169682

2: ThNH55-93 AF169681

2: ThNH62-93 AF169683

2: ThNH63-93 AF169684

2: ThNH69-93 AF169685

2: ThNH73-93 AF169686

2: ThNH76-93 AF169687

2: ThNH81-93 AF169688

2: ThNH-p36-93 AF022441

2: ThNH-7-93 AF022434

2: ThNH-p11-93 AF022437

2: ThNH-p12-93 AF022438

2: ThNH-p14-93 AF022439

2: ThNH-p16-93 AF022440

2: Tonga-74 AY744147

2: TSV01 AY037116

2: Taiwán-1008FHD AY776328

2: Ven2 AF100465

3: D3-H-IMTSSA-MART-1999-1243 AY099337

3: D3-H-IMTSSA-SRI-2000-1266 AY099336

3: 80-2 AF317645

3: 98901403 AB189125

3: 98901437 AB189126

3: 98901517 AB189127AB1891 28

3: 98902890

Serotipo: Cepa N.º de Registro

3: BA51 AY858037

3: BDH02-1 AY496871

3: BDH02-3 AY496873

3: BDH02-4 AY496874

3: BDH02-7 AY496877

3: BR74886-02 AY679147

3: C0331-94 AY876494

3: C0360-94 AY923865

3: den3_88 AY858038

3: den3_98 AY858039

3: FW01 AY858040

3: FW06 AY858041

3: H87 NC 001475

3: D3-Hu-TL018NIID-2005 AB214879

3: D3-Hu-TL029NIID-2005 AB214880

3: D3-Hu-TL109NIID-2005 AB214881

3: D3-Hu-TL129NIID-2005 AB214882

3: InJ 16 82 DQ401690

3: KJ30i AY858042

3: KJ46 AY858043

3: KJ71 AY858044

3: Mutante BDH0_801 DQ401689

3: Mutante BDH02_03 DQ401691

3: Mutante BDH02_04 DQ401692

3: Mutante BDH02_07 DQ401693

3: Mutante InJ_16_82 DQ401694

3: Mutante PhMH_J1_97 DQ401695

3: PF89-27643 AY744677

3: PF89-320219 AY744678

3: PF90-3050 AY744679

3: PF90-3056 AY744680

3: PF90-6056 AY744681

3: PF92-2956 AY744682

3: PF92-2986 AY744683

3: PH86 AY858045

3: PhMH-J1-97 AY496879

3: PI64 AY858046

Serotipo: Cepa N.º de Registro

3: Singapur AY662691

3: Singapur 8120-95 AY766104

3: Sleman-78 AY648961

3: TB16 AY858047

3: TB55i AY858048

3: ThD3_0007_87 AY676353

3: ThD3_0010_87 AY676353

3: ThD3_0055_93 AY676351

3: ThD3_0104_93 AY676350

3: ThD3_1283_98 AY676349

3: ThD3_1687_98 AY676348

3: PF92-4190 AY744684

3: PF94-136116 AY744685

3: Taiwán-739079A AY776329

4: 2A AF375822

4: Clon recombinante rDEN4 AF326825

4: 2Adel30 AF326826

4: 814669 AF326573

4: B5 AF289029

4: rDEN4del30 AF326827

4: H241 AY947539

4: rDEN4 NC 002640

4: Singapur 8976-95 AY762085

4: SW38i AY858050

4: ThD4_0017_97 AY618989

4: ThD4_0087_77 AY618991

4: ThD4_0348_91 AY618990

4: ThD4_0476_97 AY618988

4: ThD4_0485_01 AY618992

4: ThD4_0734_00 AY618993

4: Taiwán-2K0713 AY776330

4: Desconocida M14931

En la UTR-3’ de un clon infeccioso de tipo silvestre, por ejemplo, en la cepa Sleman/78 del serotipo 3 del virus del dengue, o en un clon infeccioso de otro virus del dengue virulento, de tipo silvestre, pueden realizarse mutaciones, y los mutantes pueden después someterse a ensayo en un sistema de modelo animal (por ejemplo, en sistemas de 5 modelo de ratón y/o mono) para identificar sitios que causan atenuación. La atenuación se juzga, por ejemplo, por detección de viremia disminuida. Una o más mutaciones adicionales, que se descubrió que atenuaban el virus de tipo silvestre, se introdujeron opcionalmente en un virus del dengue del tipo silvestre, y estos mutantes se sometieron a ensayo en un sistema de modelo animal, (por ejemplo, en un sistema de modelo de ratón y/o un mono) para determinar si los mutantes resultantes estaban atenuados. Se descubrió que los mutantes que estaban atenuados

10 podían después usarse como nuevas cepas de vacunas que, debido a la atenuación, tenían seguridad aumentada.

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Mutación: Nucléotidos delecionadosa Unión de deleción

80: 192-113 -CACAUAAA

86: 228-143 -UAGCGACU

116(A): 228-113 -UAGCUAAA

116(B): 258-143 -CUGCGACU

146: 258-113 -CUGCUAAA

30/31: 173-143 -CCAAGACU

258-228: –CUGCGACU

a La numeración es desde el extremo 3’ del genoma vírico

Para introducir las nueve mutaciones de deleción nuevas en el plásmido de ADNc de la cepa Sleman/78 de DEN3, p3, que previamente se usó para generar el componente de vacuna rDEN330 (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg

71: 811-821) se usó mutagénesis dirigida por PCR. El subclón de ADNc p3-frag.4 se usó como molde para las reacciones de la PCR con los pares de oligonucleótidos mutagénicos indicados enumerados en la Tabla 3, excepto para la mutación por deleción 30/31 que como molde usó el subclón de ADNc p3-frag.430. Los productos de la PCR se ligaron y se usaron para transformar células bacterianas competentes. El ADN plasmídico se aisló de clones bacterianos y la presencia de la mutación de deleción apropiada se confirmó mediante análisis de secuencia. Para generar plásmidos de ADNc de DEN3 intactos que contenían las mutaciones de deleción, se introdujo el fragmento KpnI-PstI (963 nt) de los subclones del ADNc p3-frag.4 mutado en el plásmido de ADNc p3-7164. El plásmido p3-7164 codifica la mutación por adaptación de células Vero 7164 que previamente habían mostrado que potenciaban el crecimiento y la eficacia de transfección en células Vero (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71: 811-821). Se confirmó que los plásmidos p3 de longitud completa, que contenían las mutaciones de deleción, contenían la secuencia correcta de la UTR 3’. Además de las deleciones modificadas por ingeniería genética, se identificaron mutaciones en los virus rDEN330/31 y rDEN386, cuando se comparó con el ADNc plasmídico p3 de DEN3 (Genbank n.º AY656169) (Tabla 4).

Tabla 3. Secuencias cebadoras mutagénicas para la construcción de deleciones en la UTR 3’

Nombre del cebador: Secuencia (5’ 3’)

113F: TAAAAACAGCATATTGACGCTGGGAG (SEQ ID NO: 24)

143F: GACTAGAGGTTAGAGGAGAC (SEQ ID NO: 25)

228F: GACTAGCGGTTAGAGGAGACCCC (SEQ ID NO: 26)

173R: TCGGGCCCCGCTGCTGCGTTG (SEQ ID NO: 27)

173R (para 30): TTGGGCCCCGCTGCTGCGTTG (SEQ ID NO: 28)

192R: TGTGTCATGGGAGGGGTCTC (SEQ ID NO: 29)

228R: GCTACACCGTGCGTACAGCTTCC (SEQ ID NO: 30)

258R: GCAGCCTCCCAGGTTTTACGTCC (SEQ ID NO: 31)

Tabla 4. Mutaciones, además de las deleciones modificadas por ingeniería genética, que se identificaron en los virus rDEN330/31 y rDEN386 cuando se comparó con el ADNc plasmídico de p3 de DEN3 (Genbank n.º AY656169)

Virus: Gen Posición de Sustitución de Posición de Cambio de

nucleótido
nucleótido: aminoácido aminoácido

rDEN330/31: NS4B 7164a U  C 115 Val → Ala

NS4B: 7398 C  U 193 Ala → Val

rDEN386: M 512 A  G 26 Lys → Glu

NS3: 6076 C  U 521 silencioso

NS4B: 7164a U  C Val → Ala

NS5: 8623 U  C 353 silencioso

NS5: 10267b A  U TERMINAL terminal  Tyr

UTR-3’: 10455 G  C - -

a La mutación 7164 es una mutación por adaptación de células Vero que se modificó por ingeniería genética en la

construcción de ADNc.

b Hay una población mixta en esta posición de nt (A  A/U) que cambia el codón de terminación (UAA) en el

extremo de NS5 por UAU que codifica Tyr. Esto serviría para extender NS5 en 2 aminoácidos (Tyr-Thr-Terminal) ya

que permanece un codón de terminación en los nucleótidos 10271-10273.

Para la recuperación de virus, se sintetizaron in vitro transcritos de ARN con caperuza (capped) en el extremo 5’ de plásmidos de ADNc y se transfectaron en células Vero o en células C6/36. Antes de la transcripción y generación de virus infecciosos, las secuencias enlazadoras se retiraron de los plásmidos de ADNc por digestión con Spel. Después los plásmidos se recircularizaron por ligamiento, se linealizaron con Acc651 (isoesquizómero de KpnI que escinde dejando únicamente un solo nucleótido en 3’) y se transcribieron in vitro usando polimerasa SP6. Después los transcritos purificados se transfectaron en células Vero o C6/36.

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Los virus recombinantes que codificaban cada una de las nueve mutaciones, 30/31, 31, 50, 61, 80, 86, 116A, 116B, y 146, se recuperaron satisfactoriamente en células C6/36, mientras que en células Vero solo se recuperó rDEN31. Después, los virus mutantes por deleción rDEN3 se pasaron una vez en células Vero seguido de clonación biológica mediante dos diluciones terminales en células Vero. Los virus clonados se pasaron de dos a siete veces en células Vero en un intento de alcanzar un título de choque de al menos 6,0 log10 UFP/ml que se considera que es suficiente para permitir una fabricación rentable. Se descubrió que tres virus recombinantes (rDEN350, rDEN3116A y rDEN3146) estaban excesivamente restringidos para la replicación en células Vero, a pesar de que eran viables. Por lo tanto, estos tres virus no se estudiaron posteriormente. La secuencia genética de la UTR 3’ se determinó para los seis virus mutantes por deleción restantes que alcanzaron títulos pico de virus de al menos 6,0 log10 UFP/ml. La secuencia UTR 3’ correcta con la deleción apropiada se descubrió para rDEN361, rDEN380, rDEN386 y rDEN330/31. Sin embargo, se descubrieron dos virus mutantes que contenían deleciones o mutaciones adicionales y que se consideró que posiblemente tenían genotipos inestables. En primer lugar, rDEN331 tenía la deleción UTR 3’ correcta de 258-228 nt pero también contenía una deleción de 25 nt del nt 222 al 198. En segundo lugar, rDEN3116B tenía la deleción UTR 3’ correcta de 258-143 nt pero también contenía una deleción de 8 nt del nt 430 al 423 y una sola sustitución A  G en el nt 265. El potencial de inestabilidad genética con estos virus imposibilita su uso como componentes de vacuna de manera que no estudiaron posteriormente. Por lo tanto, de las nueve deleciones originales construidas, se descubrió que cuatro virus mutantes se replicaban de un modo eficaz en células Vero y se estudiaron posteriormente; rDEN361, rDEN380, rDEN386 y rDEN330/31.

Generación de virus quiméricos rDEN3 con la UTR 3’ procedente de rDEN4 o rDEN430

Se empleó otra estrategia para generar nuevos componentes de vacuna rDEN3; el reemplazo de la UTR 3’ del clon de ADNc de rDEN3 con la de rDEN4 o rDEN430 (Figura 18A). El virus quimérico de UTR 3’, rDEN3-3’D430, se diseñó para ser un componente de vacuna para su inclusión en formulaciones tetravalentes que comparten la mutación por deleción Z30 entre los cuatro serotipos. Para diferenciar la contribución de la quimerización de la UTR 3’ y la mutación 30 en cualquiera de los fenotipos observados, se diseñó el virus rDEN3-3’D4.

El plásmido p3-3’D430 se generó de la siguiente manera. En primer lugar, se usó mutagénesis por PCR para introducir un sitio de restricción Hpal en el subclón de ADNc p3-frag.4 (Figura 18B). Los productos de la PCR se ligaron y se usaron para transformar células bacterianas competentes. El ADN plasmídico se aisló de los clones bacterianos y la presencia de la mutación de deleción apropiada se confirmó mediante análisis de secuencia. Para introducir la UTR 3’ rDEN430 en el subclón de ADNc p3-frag.4 (Hpal), por PCR se amplificó un fragmento de 364 nt que abarcaba la UTR 3’ p430, usando un cebador directo (5’-AACAACAACAAACACCAAAGGCTATTG-3’, SEQ ID NO: 32) y un cebador inverso (5’-CCTACCGGTACCAGAACCTGTTG-3’, SEQ ID NO: 33). Para generar el subclón de ADNc p3-frag.4-3’D430, el fragmento HpaI-KpnI se retiró de p3-frag.4(Hpal) y se reemplazó con el fragmento de la PCR de la UTR 3’ p430 que se había escindido mediante KpnI. El fragmento Pstl-KpnI de p3-frag.4-3’D430 se introdujo en el plásmido p3 para crear el clon de ADNc de longitud completa, p3-3’D430. Se confirmó que la secuencia de la UTR 3’ y la unión de NS5 eran correctas.

Para generar p3-3’D4, se introdujeron los 30 nucleótidos delecionados de la mutación por deleción 30 en el subclón p3-frag.4-3’D430. Brevemente, el fragmento MluI-KpnI de p3-frag.4-3’D430, que abarca la región 30, se reemplazó con el fragmento correspondiente de p4 para crear el plásmido p3-frag.4-3’D4. Para generar un genoma p3 de longitud completa, el fragmento Pstl-KpnI de p3 se reemplazó con el fragmento correspondiente de p3-frag.4-3’D4. Se determinó que la secuencia de la UTR-3’ del plásmido p3-3’D4 era correcta y que contenía los 30 nt que faltaban de la mutación 30.

rDEN3-3’D4 se recuperó en células C6/36 y en células Vero, mientras que rDEN3-3’D430 solo pudo recuperarse en células Vero. Después, los virus mutantes se pasaron una vez en células Vero seguido de clonación biológica mediante dos diluciones terminales en células Vero. Después rDEN3-3’D4 y rDEN3-3’D430 se pasaron cuatro o seis veces en células Vero, respectivamente. Se descubrió que la secuencia genética de la unión NS5 -UTR-3’ y de la UTR-3’ eran correctas para rDEN3-3’D4 y rDEN3-3’D430. Por lo tanto, ambos virus se estudiaron posteriormente.

También se identificaron mutaciones en los virus rDEN3-3’D430 en comparación con el clon de ADNc plasmídico DEN3 p3 (UTR-5’ y genes) y con el clon de ADNc DEN4 p4 (UTR-3’) (Tabla 5).

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Replicación de virus mutantes DEN3 en cultivo tisular

El nivel de replicación de virus en células Vero y en células C6/36 de mosquito se evaluó para los virus mutantes por deleción DEN330/31 y rDEN386 y para los virus rDEN3-3’D4 con y sin 30. Se analizó la replicación en células Vero porque estas células son el sustrato para la fabricación, mientras que el crecimiento en células C6/36 se evaluó porque los fenotipos atenuantes en estas células de mosquito pueden asociarse con una replicación restringida en el mosquito Aedes que sirve como el vector para la transmisión del virus DEN (Hanley et al. 2003 Virology 312: 222-232).

Las cinéticas de crecimiento se evaluaron de la siguiente manera. Monocapas confluentes de células Vero y de células C6/36 en matraces de 75 cm2 se infectaron a una multiplicidad de infección de 0,01. Se retiraron partes alícuotas de 0,5 ml de sobrenadante de cultivo tisular diariamente durante siete días, se combinaron con estabilizador SPG, y se congelaron a -80 ºC. El título de los virus de todas las muestras se determinó mediante ensayo en placa en células Vero. El límite de detección para el ensayo en placa es de 1,0 log10 UFP/ml.

La cinética de replicación de cada virus en ambas líneas de células se muestra en la Figura 19. En células Vero, rDEN330/31, rDEN386 y rDEN3-3’D430 se replicaron a un nivel máximo que se aproximó al de rDEN3 de tipo silvestre y con cinéticas similares a las de rDEN3 de tipo silvestre. Estos tres componentes de vacuna alcanzaron títulos máximos de virus de 6,5 a 6,7 log10 UFP/ml, lo que demuestra la viabilidad de fabricar cada uno de estos virus. En células Vero, el virus rDEN3-3’D4 se replicó a un título máximo de 7,8 log10 UFP/ml que es casi 100 veces mayor que el observado para rDEN3 de tipo silvestre, lo que indica que la inclusión de la UTR-3’ de DEN4 puede aumentar la replicación en células Vero. Esto también podría atribuirse a una adaptación más eficaz en células Vero del virus rDEN3-3’D4. rDEN4 se replica a un título máximo de aproximadamente 8,0 log10 UPF/ml, lo que indica que el virus quimérico alcanza un título máximo que no supera el de cualquiera de sus virus parentales (Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol. 19: 10-32).

El análisis de replicación de virus en células C6/36 demostró que rDEN386 y rDEN3-3’D430 alcanzaron títulos máximos aproximadamente 10 veces menores que el títulos de virus máximo del virus rDEN3 de tipo silvestre, 6,9 log10 UFP/ml (Figura 19). El virus rDEN3-3’D4 se replicó a un título máximo similar al observado para rDEN3 de tipo silvestre. El resultado más sorprendente fue la ausencia de replicación observada en células C6/36 para el virus rDEN330/31. Después del día 1, el virus no se detectó en el medio de cultivo de células c6/36 infectadas con virus rDEN330/31 a pesar de la replicación eficaz observada en células Vero. Estos resultados se confirmaron en un segundo experimento de curva de crecimiento independiente e indican un fenotipo atenuante en una gama de huéspedes en cultivo tisular que se contempla como que viene acompañada por un fenotipo atenuante también en mosquitos.

Replicación e inmunogenicidad de virus mutantes DEN3 en monos rhesus

Basándose en la ligera atenuación en ratones SCID-HuH-7 y en el crecimiento eficaz en células Vero, se evaluaron los virus rDEN330/31, rDEN386 y rDEN3-3’D430 en monos Rhesus. Los virus mutantes se compararon con DEN3 de tipo silvestre con respecto al nivel y a la duración de la viremia, a la inducción de anticuerpos neutralizantes, y a la capacidad de conferir protección frente a la exposición al virus DFN3 de tipo silvestre. El virus rDEN3-3’D4 también se evaluó para diferenciar la contribución de la quimerización de la UTR-3’ después la atenuación con y sin la mutación 30. Un fenotipo atenuante en monos Rhesus ha sido generalmente un fuerte indicador de seguridad para componentes de vacuna en ensayos clínicos incluyendo rDEN430, rDEN130 y rDEN2/430 (Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol. 19: 10-32).

Grupos de cuatro monos Rhesus se inocularon por vía subcutánea con 105 UFP de los virus indicados (Tabla 7). Dos monos se infectaron de manera simulada con diluyente de virus. Para la detección de la viremia, se recogió suero los días 0-8 y el día 10 y se congeló a -80 ºC. El título del virus de muestras de suero se determinó mediante ensayo en placa en células Vero. El suero se recogió el día 28 para la detección de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra DEN3. Los niveles de anticuerpos neutralizantes se determinaron usando un ensayo de neutralización de reducción de placas en células Vero frente al virus DEN3 de tipo silvestre. El día 35 después de la infección, todos los monos estaban expuestos por infección subcutánea con 105 UFC de virus de tipo silvestre DEN3. El suero se recogió los días 0-8 y el día 10 y se congeló a -80 ºC. El título del virus en las muestras de suero se determinó mediante ensayo en placa en células Vero.

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El virus de la cepa Sleman/78 de DEN3 de tipo silvestre se replicó en monos rhesus a un título de virus promedio máximo de 1,8 log10 UFP/ml de suero con todos los monos que desarrollaron viremia (Tabla 7). Estos resultados son paralelos a estudios previos de DEN3 en monos rhesus (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71: 811-821). No se detectó viremia en ningún mono infectado con cualquiera de los tres componentes de vacuna, rDEN330/31, rDEN386, o rDEN3-3’D430 lo que demuestra un claro fenotipo atenuante para cada uno de estos virus en monos rhesus. Cabe destacar que el virus rDFN3-3’D4 se detectó en el 75 % de los monos con un título de virus promedio máximo de 1,3 log10 UFP/ml de suero lo que sugiere que la presencia de la mutación 30 es crítica para la atenuación del virus quimérico UTR-3’. A pesar de la ausencia de viremia detectable, los niveles medios de anticuerpos neutralizantes en monos infectados con rDEN330/31 y rDEN386 alcanzaron niveles similares a los del virus DEN3 de tipo silvestre, 1:253 (Tabla 7). En cambio, el virus rDEN3-3’D430 indujo niveles medios de anticuerpos neutralizantes aproximadamente tres veces más bajos que DEN3. Sin embargo, después de la infección, el 100 % de los monos se inmunizó con cada componente de vacuna seroconvertido como se define por un aumento de cuatro veces o mayor en los niveles de anticuerpos neutralizantes en suero. Por tanto se consideró que todos los monos estaban infectados con cada uno de los componentes de la vacuna a pesar de la ausencia de viremia detectable. La determinación del título de virus en suero después de la exposición con virus DEN3 indica que la inmunización con cada uno de los componentes de la vacuna indujo una protección completa de viremia detectable como podría esperarse dados los niveles observados de anticuerpos neutralizantes.

Replicación en mosquitos

La replicación de rDEN3 y rDEN330/31 se estudió en mosquitos Toxorynchites amboinensis. Se realizó inoculación intratorácica de diluciones en serie con factor diez del virus de ensayo como se ha descrito anteriormente (Troyer J.M. e al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 414-9). Después de una incubación de 14 días, las cabezas se separaron y se homogeneizaron en diluyente. Se determinó el título de los virus en los homogeneizados de las cabezas mediante ensayo en placa en células Vero.

Basándose en la atenuación de rDEN330/31 en monos rhesus y en su replicación restringida en células de mosquito C6/36, rDEN330/31 se comparó con rDEN3 de tipo silvestre con respecto a la infectividad y al nivel de replicación en mosquitos Toxorynchites amboinensis altamente sensibles (Tabla 8). Se inocularon diluciones en serie con factor diez por vía intratorácica y se evaluó la capacidad para infectar tejidos de la cabeza realizando un ensayo en placa en homogeneizados de cabezas de mosquito después de una incubación de 14 días. La infectividad de rDEN3 y de rDEN330/31 fue muy similar ya que la dosis infecciosa del mosquito al 50 % fue de aproximadamente 101,3 UPF en ambos virus (Tabla 8). Sin embargo, el nivel de replicación de rDEN330/31 en las cabezas de los mosquitos infectados se redujo de 5 a 50 veces aproximadamente. Esta reducción fue significativa a las dosis ensayadas de 102,3 y 101,3 UFP. Este hallazgo indica que aunque rDEN330/31 tiene infectividad por Toxorynchites mediante infección intratorácica similar a la de rDEN3 de tipo silvestre, hay una restricción estadísticamente significativa en el nivel de replicación en mosquitos permitida por la mutación 30/31.

Tabla 8. Replicación de rDEN3 y rDEN330/31 en Toxorynchites amboinensis

Virus rDEN3 ts: Dosisa (log10 UFP) 2,3 1,3 0,3 No ensayado 20 19 17 % infectadob 90 53 18 Título de virus promedioc (log10 UFP/cabeza) 4,2  0,1d 4,2  0,1e 4,3  0,3 Reducción (log10) en comparación con la misma dosis de virus ts

rDEN330/ 31: 2,3 12 83 2,7  0,3d 1,5

1,3 0,3: 16 8 44 13 3,1  0,3e 3,6  0,0 1,1 0,7

a Título de virus administrado por vía intratorácica en un inóculo de 0,2 l. b EL porcentaje de mosquitos con virus detectable el día 14 después de la inoculación se determinó mediante ensayo en placa en homogeneizados de cabeza de mosquito en células Vero.c Calculado usando solo valores de cabezas positivas a virus.d Para una dosis de 102,3 UFP de rDEN3 y de rDEN330/31, los títulos de virus promedio fueron significativamente diferentes determinado por un ensayo post-hoc de Tukey-Kramer (P < 0,001). e Para una dosis de 101,3 UFP de rDEN3 y de rDEN330/31, los títulos de virus promedio fueron significativamente diferentes determinado por un ensayo post-hoc de Tukey-Kramer (P < 0,005).

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ARTÍCULOS:

1. Un virus del dengue o virus quimérico del dengue que comprende una mutación en la región no traducida 3’ (UTR-3’) seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una mutación 30 que retira la estructura homóloga TL-2 en cada uno de los serotipos 1, 2, 3 y 4 del virus del dengue y nucleótidos adicionales a la mutación 30 delecionados de la UTR 3’ que retira la secuencia en la dirección 5’ hasta el límite 5’ de la estructura homóloga TL-3 en cada uno de los serotipos 1, 2, 3 y 4 del virus del dengue; y

(b): un reemplazo de la UTR-3’ de un virus del dengue de un primer serotipo con la UTR-3’ de un virus del dengue de un segundo serotipo, que opcionalmente contiene la mutación 30 y nucleótidos adicionales a la mutación 30 delecionados de la UTR-3’.

2.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 1 en el que la mutación es (a).

3.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 2 en el que la mutación retira la estructura homóloga TL-2 y retira la secuencia hasta e incluyendo la estructura homóloga TL-3 de una manera contigua a la mutación 30.

4.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 3 en el que la mutación es la mutación 86, de tal manera que la mutación 30 deleciona nt de aproximadamente 228 a aproximadamente 145 de DEN1, nt de aproximadamente 228 a aproximadamente 144 de DEN2, nt de aproximadamente 228 a aproximadamente 143 de DEN3 y nt de aproximadamente 228 a aproximadamente 143 de DEN4, designados con el sistema de numeración inverso.

5.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 4 en el que el serotipo es DEN3.

6.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 2 en el que la mutación retira tanto la estructura homóloga TL-2 como la estructura homóloga TL-3 de una manera no contigua a la mutación 30.

7.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 6 en el que la mutación es la mutación 30/31, de tal manera que la mutación 30 deleciona nt de aproximadamente 174 a aproximadamente 145 de DEN1, nt de aproximadamente 173 a aproximadamente 144 de DEN 2, nt de aproximadamente 173 a aproximadamente 143 de DEN3, y nt de aproximadamente 172 a aproximadamente 143 de DEN4, designados con el sistema de numeración inversa, y la mutación 31 deleciona nt de aproximadamente 258 a aproximadamente 228 de DEN1, nt de aproximadamente 258 a aproximadamente 228 de DEN 2, nt de aproximadamente 258 a aproximadamente 228 de DEN3, y nt de aproximadamente 258 a aproximadamente 228 de DEN4, designados con el sistema de numeración inversa.

8.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 7 en el que el serotipo es DEN3.

9.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 1 en el que la mutación es (b).

10.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 9 en el que la UTR-3’ de DEN1 se reemplaza con la UTR-3’ de los serotipos 2, 3 o 4 del virus del dengue, la UTR-3’ de DEN2 se reemplaza con la UTR-3’ de los serotipos 1, 2, 3 o 4 del virus del dengue, la UTR-3’ de DEN3 se reemplaza con la UTR-3’ de los serotipos 1, 2 o 4 del virus del dengue o la UTR-3’ de DEN4 se reemplaza con la UTR-3’ de los serotipos 1, 2 o 3 del virus del dengue.

11.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 10 que adicionalmente comprende la mutación 30.

12.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 10 que adicionalmente comprende la mutación 30 y nucleótidos adicionales en la mutación 30 delecionados de la UTR-3’.

13.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 9 en el que la UTR-3’ de DEN3 se reemplaza con la UTR-3’ de los serotipos 1, 2 o 4 del virus del dengue.

14.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 13 que adicionalmente comprende la mutación 30.

15.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 13 que adicionalmente comprende la mutación 30 y los nucleótidos adicionales en la mutación 30 delecionados de la UTR-3’.

16.: El virus del dengue o virus del dengue quimérico del artículo 9 seleccionado del grupo que consiste en:

a) rDEN1-3’D2, rDEN1-3’D2x, rDEN1-3’D3, rDEN1-3’D3x, rDEN1-3’D4, rDEN1-3’D4x; rDEN1/2-3’D1, rDEN1/2-3’D1x, rDEN1/2-3’D3, rDEN1/2-3’D3x, rDEN1/2-3’D4, rDEN1/2-3’D4x; rDEN1/3-3’D1, rDEN1/3-3’D1x, rDEN1/3-3’D2, rDEN1/3-3’D2x, rDEN1/3-3’D4, rDEN1/3-3’D4x; rDEN1/4-3’D1, rDEN1/4-3’D1x, rDEN1/4-3’D2, rDEN1/4-3’D2x, rDEN1/4-3’D3, rDFN1/4-3’D3x; b) rDEN2-3’D1, rDEN2-3’D1x, rDEN2-3’D3, rDEN2-3’D3x, rDEN2-3’D4, rDEN2-3’D4x; rDEN2/1-3’D2, rDEN2/1-3’D2x, rDEN2/1-3’D3, rDEN2/1-3’D3x, rDEN2/1-3’D4, rDEN2/1-3’D4x; rDEN2/3-3’D1, rDEN2/3-3’D1x, rDEN2/3-3’D2, rDEN2/3-3’D2x, rDEN2/3-3’D4, rDEN2/3-3’D4x; rDEN2/4-3’D1, rDEN2/4-3’D1x, rDEN2/4-3’D2, rDEN2/4-3’D2x, rDEN2/4-3’D3, rDEN2/4-3’D3x; c) rDEN3-3’D1, rDEN3-3’D1x, rDEN3-3’D2, rDEN3-3’D2x, rDEN3-3’D4, rDEN3-3’D4x; rDEN3/1-3’D2, rDEN3/1-3’D2x, rDEN3/1-3’D3, rDEN3/1-3’D3x, rDEN3/1-3’D4, rDEN3/1-3’D4x; rDEN3/2-3’D1, rDEN3/2-3’D1x, rDEN3/2-3’D3, rDEN3/2-3’D3x, rDEN3/2-3’D4, rDEN3/2-3’D4x; rDEN3/4-3’D1, rDEN3/4-3’D1x, rDEN3/4-3’D2, rDEN3/4-3’D2x, rDEN3/4-3’D3, rDEN3/4-3’D3x; y d) rDEN4-3’D1, rDEN4-3’D1x, rDEN4-3’D2, rDEN4-3’D2x, rDEN4-3’D3, rDEN4-3’D3x; rDEN4/1-3’D2, rDEN4/1-3’D2x, rDEN4/1-3’D3, rDEN4/1-3’D3x, rDEN4/1-3’D4, rDEN4/1-3’D4x; rDEN4/2-3’D1, rDEN4/2-3’D1x, rDEN4/2-3’D3, rDEN4/2-3’D3x, rDEN4/2-3’D4, rDEN4/2-3’D4x; rDEN4/3-3’D1, rDEN4/3-3’D1x, rDEN4/3-3’D2, rDEN4/3-3’D2x, rDEN4/3-3’D4, rDEN4/3-3’D4x;

Claims

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