BR122020023372B1 - Vírus da dengue do tipo 3 (den3) atenuado e composição imunogênica - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a um vírus da dengue ou vírus da dengue quimérico que contém uma mutação na região não transcrita 3? (3?-utr) compreendendo uma mutação delta30 que remove a estrutura homóloga tl-2 em cada um dos sorotipos de vírus da dengue 1, 2, 3, ou 4 e nucleotídeos adicionais à mutação delta30 deletados da 3?-utr que remove a sequência na direção 5? até o limite 5? da estrutura homóloga tl-3 em cada um dos sorotipos de vírus da dengue 1, 2, 3, ou 4, ou uma recolocação da 3?-utr de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo com a 3?-utr de um vírus da dengue de um segundo sorotipo, opcionalmente contendo a mutação delta30 e nucleotídeos adicionais à mutação delta30 deletados da 3?-utr; e composições imunogênicas, métodos de induzir uma resposta imunogênica e métodos de produzir um vírus da dengue ou vírus da dengue quimérico.

Description

[001] Dividido do PI 0716455-6, depositado em 15.08.2007.

Pedidos Relacionados.

[002]Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. n° 60/837,723 depositado em 15 de agosto de 2006, a descrição do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

[003]A invenção refere-se a mutações na região não transcrita 3’ do genoma de sorotipos do vírus da dengue 1, 2, 3 e 4 que são úteis na atenuação do crescimento das características de vacinas do vírus da dengue.

Descrição da Técnica Relacionada

[004]Existem quatro tipos de vírus da dengue (tipo 1 do vírus da dengue [DEN1], [DEN2], [DEN3], e [DEN4] que anualmente causam uma estimativa de 50 a 100 milhões de casos de febre de dengue e 5000,00 casos da forma mais severa da infecção da dengue conhecida como síndrome de choque de dengue / febre hemorrágica de dengue Gubler, D. J. and M. Meltzer 1999 Adv Virus Res 53:35-70). O vírus da dengue é amplamente distribuído pelas regiões tropicais e semitropicais do mundo, e o número de infecções pelo vírus da dengue continua a aumentar devido a área de expansão de seu vetor do mosquito Aedes Aegypti. A vacina não está disponível para o controle da doença da dengue apesar de sua importância como uma doença de reincidência. O objetivo da imunização é proteger contra a doença do vírus da dengue pela indução de uma resposta ao anticorpo de neutralização de longa vida contra cada um dos quatro tipos. A proteção simultânea contra todos os quatro sorotipos é requerida, uma vez que um aumento na severidade da doença pode ocorrer em pessoas com anticorpos preexistentes a um vírus da dengue heterotipo. Tal imunização pode ser alcançada economicamente com uma vacina de vírus ate- nuado, vivo.

[005]Os vírus da dengue são vírus de RNA de senso positivo pertencentes ao gênero Flavivírus. O genoma de base de aproximadamente 11.000 contém um único quadro de leitura aberto que codifica uma poliproteína que é processada por proteases de origem viral e celular em três proteínas estruturais (C, prM, e E) e pelo menos sete proteínas não estruturais (NP). Ambas as extremidades do genoma do vírus da dengue contêm uma região não transcrita (UTR), e a organização do geno- ma geral é 5’-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR- 3'. O 3’UTR é aproximadamente 400 bases em comprimento e é previsto como contendo muitas estruturas em stem-loop conservadas entre os sorotipos do vírus da dengue (Brinton, M. A. et al. 1986 Virology 153: 1 13-121 , Hahn, C. S. et al. 1987 J MoI Biol 198:33-41, Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-1202, Rauscher, S. et al. 1997 RNA 3:779-791, Shurtleff, A. et al. 2001 Virology 281 :75-87). Uma tal estrutura em stem-loop, identificadas como TL-2 na segunda estrutura proposta do 3’- UTR (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1 194- 1202), foi anteriormente removida por deleção de 30 nucleotídeos do genoma DEN4 (3'nucleotídeos 172 para 143) (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-3937) e tem sido subsequentemente designado como a mutação Δ30 (Durbin, A. P. et al. 2001 Am JTrop MedHyg 65:405- 413). O vírus resultante, rDEN4Δ30, mostrou-se ser atenuado macaco rhesus comparados com vírus parenterais contendo uma sequência de TL-2 intacta e é atenuado em humanos (Durbin, A. P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-413).

Sumário da Invenção

[006]A invenção refere-se a um vírus da dengue ou a um vírus da degue quimérico compreendendo mutação na região não transcrita 3' (3'-UTR) selecionada do grupo consistindo em:

[007](a) uma mutação Δ30 que remove a estrutura homóloga TL-2 de cada um dos sorotipos do vírus da dengue 1, 2, 3, e 4, e nucleotídeos adicionais para a mutação Δ30 deletada do 3'-UTR que remove a sequência na direção 5'até o limite 5'da estrutura homóloga TL-3 em cada um dos sorotipos do vírus da dengue 1, 2, 3, e 4; e

[008](b) uma recolocação do 3'-UTR de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo com o 3 '-UTR de um vírus da dengue de um segundo sorotipo, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleotídeos adicionais para a mutação Δ30 dele- tada do 3'-UTR; e composições imunogênicas, métodos de indução de uma resposta imune, e métodos de produção de um vírus da dengue ou vírus da dengue quimérico.

Breve Descrição dos Desenhos

[009]Figura 1. Duas abordagens para atenuar o vírus da dengue. A) (a-c) Deleção de nucleotídeos adicionais do 3'-UTR (DEN3 wt Sleman/78, SEQ ID NO: 1). B) Recolocação do 3'-UTR de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo com o 3’- UTR de um vírus da dengue de um segundo sorotipo.

[0010]Figuras 2 - 5. Estrutura secundária prevista da região TL-I, TL-2 e TL-3 do 3'-UTR de cada sorotipo DEN. O número de acesso GenBank da sequência usada para construção de cada modelo de estrutura secundário é indicado. Apenas os último nucleotídeos 278, 281 , 276 e 281 de DENl, DEN2, DEN3, e DEN4, respectivamente, que compreendem TL-1, TL-2 e TL-3, são usados para evitar circulação da estrutura e desdobramento de elementos verificados experimentalmente e conhecidos. O conteúdo do programa de desdobramento específico para cada modelo de estruturas é indicado. Nucleotídeos que delimitam os princípios de deleção são cir-culados e numerados, com nucleotídeos começando a numeração na extremidade do genoma 3” (sistema de numeração de direção reversa).

[0011]Figura 2 - SEQ ID NO: 2; Figura 3 - SEQ ID NO: 3; Figura 4 - SEQ ID NO: 4; Figura 5 - SEQ ID NO: 5.

[0012]Figuras 6 - 9. mutação de deleção Δ30 mostrada para cada um dos sorotipos do vírus da dengue DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4. A mutação Δ30 deleta nucleotídeos 174 a 145 de DEN1, nucleotídeos 173 a 144 de DEN 2, nucleotídeos 173 a 143 de DEN3, e nucleotídeos 172 a 143 de DEN4, com sistema de numeração de direção reversa. A região deletada é indicada pelo símbolo Δ. Figura 6 - SEQ ID NO: 6; Figura 7 - SEQ ID NO: 7; Figura 8 - SEQ ID NO: 8; Figura 9 - SEQ ID NO: 9.

[0013]Figuras 10 - 13. mutação de deleção Δ30/31 mostrada para cada um dos sorotipos do vírus da dengue DEN1, DEN2. DEN3 e DEN4. Além da deleção dos nucleotídeos compreendendo a mutação Δ30, a mutaçao Δ31 deleta nucleotí- deos 258 a 228 de DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4, com sistema de numeração de direção reversa. A região deletada é indicada pelo símbolo Δ. Figura 10 - SEQ ID NO: 10; Figura 11 - SEQ ID NO: 11; Figura 12 SEQ ID NO: 12; Figura 13 - SEQ ID NO: 13.

[0014]Figuras 14 - 17. mutação de deleção Δ86 mostrada para cada um dos sorotipos do vírus da dengue DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4. A mutação Δ86 deleta nucleotídeos 228 a 145 de DEN1, nucleotídeos 228 a 144 de DEN 2, nucleotídeos 228 a 143 de DEN3, e nucleotídeos 228 a 143 de DEN4, com sistema de numeração de direção reversa. A região deletada é indicada pelo símbolo Δ. Figura 14 - SEQ ID NO: 14; Figura 15 - SEQ ID NO: 15; Figura 16 - SEQ ID NO: 16; Figura 17 - SEQ ID NO: 17.

[0015]Figura 18. Quimerização de rDEN3 com o rDEN4 ou rDEN4Δ30 3’- UTR. A) Vírus da dengue quimérico 3'-UTR recombinante foram construídos recolocando o 3'-UTR de rDEN3 com regiões derivadas de rDEN4 ou rDEN4Δ30. A localização relativa da mutação Δ30 no 3’-UTR é indicada por uma seta. As junções entre o ORF e UTR para rDEN3 e rDEN4 são indicados como junções 1 e 2, respectivamente.Junção intertípica 3 é também indicada para vírus quiméricos resultantes. B) Sequência de nucleotídeos e aminoácidos das regiões de junção são mostradas. Para a junção 3, as substituições de nucleotídeo usadas para introduzir um sítio de reconhecimento de enzima de restrição HpaJ exclusivo são mostradas no caso abaixo.Junção 1 - SEQ ID NOs: 18 (nucleotídeo) e 19 (aminoácido); Junção 2 - SEQ ID NOs: 20 (nucleotídeo) e 21 (aminoácido): Junção 3 - SEQ ID NOs: 22 (nucleotídeo) e 23 (aminoácido).

[0016]Figura 19. Replicação em células Vero e células C6/36. Quatro vírus mutantes foram comparados com tipo selvagem de rDEN3 para replicação em células Vero e células C6/36. Um frasco de 75 cm2 de células confluentes foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0.01. Alíquotas de 0.5 ml foram removidas dos frascos diariamente sete dias. Após adição de SPG em uma concentração de amostras IX, foram congeladas em gelo seco e armazenadas a -80°C. Tiragem de vírus foi determinada por ensaio de plaquetas sobre células Vero para todas as amostras. O limite de detecção é 1,0 log10PFU/ml.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas Definições

[0017]A menos que definido de outra maneira, termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como normalmente entendido por um versado na técnica a qual essa invenção pertence. Ver, por exemplo, Singleton P and Sainsbury D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons, Chichester, New York, 2001 , and Fields Virology 4th ed., Knipe D.M. and Howley P.M. eds, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2001.

[0018]O termo “cerca de” significa 1, 2, ou 3 nucleotídeos.

Vírus da dengue Mutante e Vírus da dengue Hemorrágica

[0019]Um objetivo da invenção é desenvolver um conjunto de componentes de vacina da dengue atenuados, vivos, do tipo específico que podem ser formulados em uma vacina contra a dengue tetravalente econômica e segura. A mutação Δ30 atenua DEN4 em macaco rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-3937)). A mutaçãoΔ30 remove uma estrutura homóloga (TL-2) em cada um dos sorotipos de dengue 1, 2, 3, e 4 (Figura 2 - 5). Entretanto, a mutação Δ30 foi percebida como não atenuando DEN 3 em macacos rhesus.

[0020]Uma modalidade da invenção provê vírus da dengue e vírus da dengue quimérica tendo uma ou mais mutações que resultam em atenuação, métodos de preparar tais vírus de dengue, e métodos para uso dessesvírus da dengue para prevenir ou tratar infecção por vírus da dengue. A mutação (ou mutações) no vírus da dengue está presente na região 3’ não trascrita (3'-UTR) formada por aproximadamente 384 nucleotídeos mais a jusante do RNA viral, que têm sido mostrados ter um papel na determinação da atenuação. Os vírus e métodos da invenção são descritos adicionalmente como segue.

[0021]Um exemplo de um vírus da dengue que pode ser usado na invenção é o sorotipo 3, cepa Sleman/78. A aplicabilidade da invenção para todos os membros do grupo taxonômico de vírus da dengue é concluída pela observação que as propriedades de outras cepas do vírus da dengue são similares aquelas de uma cepa do vírus da dengue. Vírus da dengue têm sido agrupados em quatro sorotipod (DEN1 DEN2. DEN3 e DEN4). Várias cepas têm sido identificadas para cada um dos quatro sorotipos. A sequência genômica completa de várias cepas de vírus da dengue é provida como número de acesso GenBank na tabela A. Tabela A. Exemplos de Cepas de Vírus da Dengue

[0022]As mutações podem ser feitas no 3'-UTR de um clone de infecção do tipo selvagem, por exemplo, sorotipo 3 de vírus, cepa Sleman/78 ou um clone infeccioso de outro vírus da dengue virulento tipo selvagem, e os mutantes podem ser testados em um modelo animal (por exemplo, sistemas de modelo de camundongos e/ou macacos) para identificar sítios que causam atenuação. Atenuação é julgada por, por exemplo, detecção de viremia diminuída. Uma ou mais mutações adicionais encontradas para atenuar o vírus tipo selvagem são opcionalmente introduzidas em um vírus da dengue do tipo selvagem, e esses mutantes são testados em um sistema de modelo animal (por exemplo, em um sistema de modelo de camundongo e/ou macaco) para determinar se os mutantes resultantes são atenuados. Mutantes que são encontrados como sendo atenuados podem em seguida serem usados como novas cepas de vacina que têm segurança aumentada, devido a atenuação.

[0023]Em adição aos vírus listados acima, os vírus da dengue incluindo vírus da dengue hemorrágica que incluem uma ou mais mutações são incluídos na invenção. Estas quimeras podem consistir em um vírus da dengue de um primeiro soroti- po (isto é, um vírus da dengue de fundo) em que uma proteína estrutural (ou proteínas) tem sido recolocada com uma proteína estrutural correspondente (ou proteínas) de um vírus da dengue de um segundo sorotipo. Por exemplo, a quimera pode consistir em um vírus da dengue de fundo em que as proteína prM e E do vírus da dengue do primeiro sorotipo têm sido recolocadas com as proteínas prM e E do vírus da dengue do segundo sorotipo. Os vírus quiméricos pode ser preparados de qualquer combinação de vírus da dengue de sorotipos diferentes. O vírus da dengue contra qual imunidade é liberado é a fonte das proteínas estruturais inseridas.

[0024]Como é notado acima, mutações que são incluídas nos vírus da presente invenção são atenuadas. Estas mutações estão presentes nos vírus da dengue de estrutura 3’-UTR usando métodos padrão, tais como mutagênese sítio dirigida. Um exemplo do tipo de mutação presente nos vírus da invenção é substituições, mas outros tipos de mutações, tais como deleções e inserções, podem ser usados também. Além disso, como é notado acima, as mutações podem estar presentes unicamente ou no contexto de uma ou mais mutações.

[0025]Com referência à figura 1, duas abordagens foram tomadas para atenuar o vírus da dengue. Em um aspecto, nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 foram deletados do 3’-UTR. Em outro aspectos, o 3’-UTR de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo foi recolocado com o 3’-UTR de um vírus da dengue de um segundo sorotipo (opcionalmente contendo a mutação Δ30 e os nucleotídeos adicionais 'mutação Δ30 deletados do 3’-UTR).

Deleção de Nucleotídeos Adicionais à Mutação Δ30 a partir do 3’-UTR

[0026]Com referência às figuras 2 - 5, usando a primeira abordagem, o 3’- UTR de vírus da dengue contém vários motivos de sequência conservados. A sequência de 3’-UTR DEN4 é ilustrada na figura 5. O genoma de da cepa DEN4 814669 contém 10, 646 nucleotídeos, dos quais os últimos 384 nt na extremidade 3’ são não transcritos (não codificados). As localizações de vários componentes de sequência nesta região são designadas com o sistema de numeração de direção reversa. Essas sequências incluem a estrutura secundária distam 3’ (NT 1 a 93) prevista para formas stem loop 1 (SL-1), que contém o loop terminal 1 (TL-1). Nucleotí- deos 117 - 183 formam stem loop 2 (Sl-2) que contém TL-2. Nucleotídeos 201 - 277 formam um par de stem loops (SL-3) que em parte contém TL-3. Embora a sequência primária de stem loop 1 difira levemente entre os sorotipos da dengue, a estrutura secundária é estritamente conservada (comparar figuras 2 - 5). Embora o nucleo- tídeo espace entre SL-2 e o vizinho SL-1 e SL-3, difere entre os sorotipos do vírus da dengue, a estrutura geral de SL-2 é bem conservada. Além disso, os 9 nucleotí- deos expostos que compreendem TL-2 são idênticos dentro de todos os 4 sorotipos de dengue. É o TL-2 e sua estrutura stem de suporte que são removidos pela mutação Δ30 (cerca de 143 - 172 nucleotídeos). Remoção desses 30 nucleotídeos resulta na formação de um novo elemento estrutural previsto (SL-2Δ30) que tem uma sequência primária e estrutura secundária que é idêntica para cada um dos sorotipos de vírus da dengue(comparar figuras 6 - 9).

[0027]As figuras 10 - 13 ilustram a abordagem onde nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 são deletados do 3’-UTR. A mutação Δ30 remove a estrutura homóloga TL-2 em cada um dos sorotipos de vírus da dengue 1, 2, 3, e 4. A abordagem onde os nucleotídeos adicionais á mutação Δ30 são deletados do 3’-UTR remove a estrutura homóloga TL-2 e sequência até e opcionalmente incluindo a estrutura homóloga TL-3 de modo que a deleção se estenda até o limite 5’ da estrutura homóloga TL-3 em cada um dos sorotipos de vírus da dengue 1, 2, 3, e 4.Na abordagem ilustrada nas figuras 10 - 14, uma deleção adicional de cerca de 31 nucleotídeos do TL-3 resulta em formação de um novo elemento estrutural previsto (SL-3 Δ31).

[0028]Com referência às figuras 14 - 17, a mutação Δ86 remove a estrutura homóloga TL-2 e remove sequência até a estrutura homóloga TL-3 em cada um dos sorotipos de vírus da dengue DEN1, DEN2, DEN3, E DEN4. Esta deleção resulta na formação de um novo elemento estrutural previsto (SL-2 Δ86).

[0029]Em algumas modalidades que envolvem deleção de nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 deleções de ácidos nucléicos são feitas na estrutura 3'- UTRdo genoma do vírus da dengue para atenuar o vírus enquanto mantém sua imunogenicidade. As deleções incluem deleção Δ30 (173-143 nucleotídeos do soro- tipo 3 de cepa Sleman/78 em uma maneira exemplar ou correspondente a mesma em ouras cepas de DEN1, DEN2, DEN3, ou DEN4; numeração é da extremidade 3' do genoma viral) em adição à deleção da sequência 3’UTR que e contígua ou não contígua à deleção Δ30. A deleção Δ30 corresponde à estrutura TL-2 do 3'-UTR. Um tipo de modalidade, chamados rDEN1Δ30/31, rDEN2Δ30/31, rDEN3Δ30/31, our rDEN4Δ30/31 inclui a deleção original Δ30 e uma deleção de 31 nucleotídeos não contíguos que remove ambas as estruturas TL-2 e TL-3 originais. Outro tipo de modalidade, chamada rDEN1Δ61, rDEN2Δ61, rDEN3Δ61, ou rDEN4Δ61 inclui a dele- ção Δ30 e deleção de 31 nucleotídeos contíguos se estendendo 3' a partir da dele- ção Δ30. Outro tipo de modalidade, chamda DEN1lΔ86, rDEN2Δ86, rDEN3Δ86, or rDEN4Δ86, inclui a deleção 30 e deleção de 56 nucleotídeos contíguos se estendendo 5’ a partir da deleção Δ30. Para DEN3, uma lista completa de vírus mutantes construídos para conter mutações de deleção 3’-UTR está presente abaixo na tabela 2.

[0030]Recolocação de 3'-UTR de um Vírus da Dengue de um Primeiro Soro- tipo como 3'-UTR a partir de um Vírus da Dengue de um Segundo Sorotipo

[0031]Usando a segunda abordagem, o 3'-UTR de rDEN3 pode ser recolocado com o 3'-UTR de rDEN4, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleotí- deos adicionais à mutação Δ30 deletados do 3'-UTR. Outros exemplos incluem reco- locação de 3’-UTR de rDEN3 com o 3'-UTR dos sorotipos do vírus da dengue 1 e 2, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 deletados do 3'-UTR. Outros exemplos incluem: recolocação do 3'-UTR de rDEN1 com o 3'-UTR de sorotipos do vírus da dengue 2, 3, e 4, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 deletados do 3'-UTR; recolo- camento do 3'-UTR de rDEN2 com o 3'-UTR de sorotipos do vírus da dengue 1, 3, e 4, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleotídeos adicionais à mutação Δ30 deletados do 3'-UTR; e, recolocação do 3'-UTR de rDEN4 com o 3'-UTR de soroti- pos do vírus da dengue 1, 2, e 3, opcionalmente contendo a mutação Δ30 e nucleo- tídeos adicionais à mutação Δ30 deletados do 3'-UTR.

[0032]Modalidades que envolvem recolocação do 3'-UTR de um vírus da dengue de um primeiro sorotipo 3’-UTR de vírus da dengue de um segundo sorotipo incluem: a) rDEN1-3'D2, rDEN1-3'D2x, rDEN1-3'D3, rDEN1-3'D3x, rDEN1-3'D4, rDEN1- 3’D4x; rDEN1/2-3’D1 , rDEN1/2-3'D1x, rDEN1/2-3'D3, rDEN1/2-3’D3x, rDEN1/2- 3'D4, rDEN1/2-3’D4x; rDEN1/3-3'D1, rDEN1/3-3’D1x, rDEN1/3-3'D2, rDEN1/3-3'D2x, rDEN1/3- 3'D4, rDEN1/3-3D4x; rDEN1/4-3’D1, rDEN1/4-3'D1x, rDEN1/4-3'D2, rDEN1/4-3’D2x, rDEN1/4- 3'D3, rDEN1/4-3'D3x; b) rDEN2-3'D1, rDEN2-3’D1x, rDEN2-3'D3, rDEN2-3'D3x, rDEN2-3’D4, rDEN2-D4x; rDEN2/1-3’D2, rDEN2/1-3’D2x, rDEN2/1-3'D3, rDEN2/1-3'D3x, rDEN2/1- 3’D4, rDEN2/1- 3’D4x; rDEN2/3-3’D1, rDEN2/3-3’D1x, rDEN2/3-3’D2, rDEN2/3-3'D2x, rDEN2/3- 3'D4, rDEN2/3-3’D4x; rDEN2/4-3'D1, rDEN2/4-3'D1x, rDEN2/4-3'D2, rDEN2/4-3'D2x, rDEN2/4- 3'D3, rDEN2/4-3’D3x; c) rDEN3-3'D1 , rDEN3-3D1x, rDEN3-3’D2, rDEN3-3’D2x, rDEN3-3’D4, rDEN3-3’D4x; rDEN3/1-3'D2, rDEN3/1-3’D2x, rDEN3/1-3’D3, rDEN3/1-3'D3x, rDEN3/1- 3’D4, rDEN3/1- 3'D4x; rDEN3/2-3’D1, rDEN3/2-3’D1x. rDEN3/2-3'D3, rDEN3/2-3'D3x, rDEN3/2- 3’D4, rDEN3/2-3’D4x; rDEN3/4-3'D1, rDEN3/4-3-D1x, rDEN3/4-3’D2, rDEN3/4-3'D2x, rDEN3/4- 3’D3, rDEN3/4-3'D3x; e d) rDEN4-3'D1, rDEN4-3'D1x, rDEN4-3’D2, rDEN4-3'D2x, rDEN4-3'D3, rDEN4-3'D3x; rDEN4/1-3'D2, rDEN4/1-3’D2x, rDEN4/1-3'D3, rDEN4/1-3'D3x, rDEN4/1- 3'D4, rDEN4/1-3’D4x; rDEN4/2-3'D1 , rDEN4/2-3’D1x, rDEN4/2-3’D3, rDEN4/2-3'D3x, rDEN4/2- 3'D4, rDEN4/2-3’D4x; rDEN4/3-3D1, rDEN4/3-3'D1x. rDEN4/3-3'D2, rDEN4/3-3'D2x, rDEN4/3-3'D4, rDEN4/3- 3'D4x; onde x é uma mutação listada na Tabela 2.

Método de Preparar e Usar Vírus da Dengue Quimérica ou Dengue

[0033]Os vírus da presente invenção (incluindo vírus quimérico) da presente invenção podem ser preparados usando métodos padrão na técnica. Por exemplo, Uma molécula de RNA correspondendo ao genoma de um vírus pode ser introduzida em células hospedeiro, por exemplo, células Vero, a partir das quais (ou sobrena- dantes das quais) vírus progênico pode ser em seguida purificado. Neste método, uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, uma molécula de RNA) correspondendo ao genoma de um vírus é introduzida nas células hospedeiro, o vírus é colhido a partir de um meio no qual as células foram cultivadas, e o vírus é formulado para finalidades de vacinação.

[0034]Os vírus da invenção podem ser administrados como agentes profiláticosprimários em adultos ou crianças com risco de infecção, ou podem ser usados como agentes secundários para tratar pacientes infectados Por exemplo, no caso de vírus DEN e vírus DEN quiméricos, as vacinas podem ser usadas em adultos ou crianças com risco de infecção por vírus DEN, ou podem ser usadas como agentes secundários para tratar pacientes infectados por vírus DEN. Exemplos de pacientes que podem ser tratados usando vacinas relacionadas com vírus DEN e métodos da invenção incluem (i) crianças em áreas em que o vírus DEN é endêmico, (ii) viajantes estrangeiros, (iii) pessoal militar, e (iv) pacientes em áreas de uma epidemia de vírus DEN. Além do mais, habitantes de regiões nas quais a doença foi observada como se expandindo (por exemplo, Sri Lanka, África Oriental e América Latina), ou regiões nas quais ela pode ser observada como se expandido no futuro pode ser tratada de acordo com a invenção.

[0035]A formulação dos vírus da invenção pode ser realizada usando métodos que são padronizados na técnica. Várias soluções farmaceuticamente aceitáveis para uso na preparação de vacinas são bem conhecidas e podem prontamente ser adaptadas para uso na presente invenção por aqueles versados na técnica (ver, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Os vírus podem ser diluídos em um solução fisiologi- camente aceitável, tal como salina estéril, salina tamponada estéril, ou meio L-15. Em outro exemplo, os vírus podem sr administrados e formulados, por exemplo, como um fluido colhido de culturas celulares com vírus da dengue ou vírus da dengue quimérico.

[0036]As vacinas da invenção podem ser administradas usando métodos que são bem conhecidos na técnica, e quantidades apropriadas das vacinas administradas podem prontamente ser determinadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os vírus da invenção podem ser formulados como soluções aquosas estéreis contendo entre 102e 107unidades infecciosas (por exemplo, unidades de formação de plaquetas ou doses infecciosas de cultura de tecido) em um volume de dose de 0,1 a 1,0 ml, a ser administrado por, por exemplo, rotas intramuscular, subcutânea,ou intradermal. Adicionalmente, as vacinas da invenção podem ser administradas em uma dose única ou, opcionalmente a administração pode envolver o uso de uma primeira dose seguida por uma dose de reforço que é administrada, por exemplo, 2 - 6 meses depois, como determinado como sendo apropriada por aqueles versados na técnica.

[0037]Opcionalmente, coadjuvantes que são conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados na administração dos vírus da invenção. Coadjuvantes que podem ser usados para melhorar a imunogenicidade dos vírus incluem, por exemplo, formulações lipossomais, coadjuvantes sintéticos, tais como (por exemplo, QS21), muramil dipeptídeo, monofosforil lipídio A, ou polifosfazina. Embora esses coadjuvantes sejam tipicamente usados para melhorar resposta imune a vacinas inativadas, eles podem também ser usados com vacina vivas.

Sequências de Ácido Nucléico

[0038]Sequências de ácido nucléicos de vírus DEN são úteis para projetar sondas de ácido nucléico e iniciadores para a detecção de deleção ou 3’-UTR quimérico em uma amostra ou espécime com alta sensibilidade de especificidade. Son- das e iniciadores correspondentes a deleção ou 3’-UTR quimérico podem ser usados para detectar a presença de deleção ou 3’-UTRs em geral na amostra, para quantificar a quantidade de deleção ou 3’-UTR quimérico na amostra, ou para monitorar o progresso de terapias para tratar infecção de vírus DEN. As sequências de ácido nucléico e aminoácidos são úteis como ferramentas laboratoriais para estudar organismos e doenças e desenvolver terapias e tratamentos para as doenças.

[0039]Sondas e iniciadores de ácido nucléico seletivamente se hibridizam com moléculas de ácido nucléico que codifica deleção ou 3’-UTR quimérico ou sequências complementares dos mesmos. Por “seletivo” ou “seletivamente” significa uma sequência que não se hibridiza com outros ácidos nucléicos para prevenir detecção adequada ou 3’-UTRs quiméricos. Portanto, no projeto de hibridizar ácidos nucléicos, seletivamente dependerá de outros componentes presentes na amostra. Os ácidos nucléicos de hibridização devem ter pelo menos 70% de complementaridade com o segmento do ácido nucléico para o qual ele hibridiza. Como usado aqui para descrever ácidos nucléicos, o termo “seletivamente hibridiza” exclui ácidos nu- cléicos de hibridização aleatoriamente ocasional, e assim tem o mesmo significado como “especificamente hibridizando”. As sondas e os iniciadores de ácido nucléico de hibridização seletiva desta invenção podem ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% e 99% de complementaridade com o segmento da sequência para a qual ele hibridiza, preferivelmente 85% ou mais.

[0040]A presente invenção também complementa sequências, sondas e iniciadores que seletivamente hibridizam para o ácido nucléico ou o filamento complementar, ou oposto do ácido nucléico. Hibridização específica com ácido nucléico pode ocorrer com menores modificações ou substituições no ácido nucléico, tão longa quanto a capacidade de hibridização de espécie-espécie é mantida. Por “sonda” ou “iniciador” significa sequências de ácido nucléico que podem ser usadas como sondas ou iniciadores para hibridização seletiva com sequências de ácido nucléico complementares para sua detecção ou amplificação, tais sondas ou iniciadores podem variar em comprimento de 5 a 100 nucleotídeos, ou preferivelmente de cerca de 10 a 50 nucleotídeos, ou mais preferivelmente cerca de 18 a 24 nucleotídeos. Ácidos nucléicos isolados são providos aqui que seletivamente hibridizam com os ácidos nucléicos específicos de espécie sob condições limitadas e devem ter pelo menos cinco nucleotídeos complementares à sequência de interesse como descrito em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

[0041]Se usado como iniciadores, a composição preferivelmente inclui pelo menos duas moléculas de ácidos nucléicos que hibridizam para diferentes regiões da molécula alvo de modo a amplificar uma região desejada. Dependendo do comprimento da sonda ou iniciador, a região alvo pode variar entre 70% de base complementar e complementar completa e ainda hibridizam sob condições severas. Por exemplo, para a finalidade de detectar a presença de deleção ou 3’-UTR quimérico, o grau de complementaridade entre o ácido nucléico de hibridização (sonda ou iniciador) e a sequência para a qual ele hibridiza é pelo menos suficiente para distinguir hibridização com uma forma de acido nucléico proveniente de outros organismos.

[0042]As sequências de ácido nucléico da invenção incluem uma sonda diagnósticaque serve para reportar a detecção de um amplicom de cDNA amplificado a partir do modelo de RNA genômico viral usando uma reação de cadeia de polime- rase / transcrição reversa (RT-PCR), assim como amplimers reversos que são designados para amplificar o amplicon de cDNA. Em certos casos, um dos amplimers é designado para conter uma mutação específica de vírus de vacina na extremidade terminal 3’ do amplimer, que efetivamente torna o teste ainda mais específico para a cepa de vacina porque extensão do iniciador no sítio alvo e consequentemente amplificação, ocorrerá apenas se o modelo de RNA viral contiver aquela mutação específica.

[0043]Sistemas de detecção de sequência de acido nucléico com base em PCR automatizado têm sido recentemente desenvolvidos. Ensaio TaqMan (Biossis- temas Aplicados) é amplamente usado. Uma estratégia mais recentemente desenvolvida para testes de genética diagnóstica faz uso de sinalizadores moleculares (Tyagi and Kramer 1996 Nature Biotechnology 14:303-308). Ensaios de sinalizadores moleculares empregam arrefecedores e corantes repórter que diferem daqueles usados no ensaio TaqMan. Estes e outros sistemas de detecção podem ser usados por aqueles versados na técnica.

Componentes de vacina de vírus da dengue tipo 3 (DEN3) gerados por introdução de deleções na região não transcrita (UTR) 3’ ou troca do DEN3 3’-UTR com aquele do DEN4

[0044]Existem quatro sorotipos de vírus da dengue (DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4) que circulam em regiões tropicais e semitropicais do mundo habitadas por mais de 2,5 bilhões de pessoas (Gubler DJ 1998 Clin Microbiol Rev 11 :480-496). Os vírus DEN são endêmicos em pelo menos 100 países e causam mais doenças hu- mansa do que qualquer outro arbovirus. Anualmente, existe uma estimativa de 50 - 100 milhões de infecções de dengue e milhares de casos de síndrome de choque / febre hemorrágica da dengue (DHF / DSS), com crianças portando muito desse ônus da doença (Gubler DJ and Meltzer M 1999 Adv Virus Res 53:35-70). DHF/DSS causam hospitalização e morte de crianças em pelo menos oito países do sudeste da Ásia (World Health Organization 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment. Prevention and Control, 2ndedition, WHO, Geneva). O aumento dramáti-co em ambas incidência e severidade da doença causada pelos quatro sorotipos DEN sobre as últimas duas décadas é devido em grande parte a expansão geográfica dos vetores de mosquito, Aedes aegypti, e Aedes albopictus, e a prevalência aumentada dos quatro sorotipos DEN (Gubler DJ 1998 Clin Microbiol Rev 11:480-496). Os vírus da dengue são mantidos em um ciclo de vida de transmissão para humano para mosquito sem nenhum outro recipiente viral aparente participando deste ciclo de vida em estabelecimentos urbanos (Rice CM, 1996 in Flaviviridae: The viruses and their replication. Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Chanock RM, Melnick JL, Monath TP. Roizman B, Straus SE, eds. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott- Raven Publishers, pp. 931 -959).

[0045]Os vírus DEN, membros da família Flaviviridae, têm virais esféricos de aproximadamente 40 a 60 nm que contêm um genoma de RNA de senso positivo de único filamento. Um polipeptídio é processado co-translacionalmente por proteases viral e celular gerando três proteínas estruturais (capsídeo C, membrana M, e enve-lope E) e pelo menos sete proteínas não estruturais (NS). A organização do genoma de vírus DEN é 5'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'(região UTR não transcrita, precursor de membrana prM) (Rice CM, 1996 in Flavi- viridae: The viruses and their replication. Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Chanock RM, Melnick JL, Monath TP, Roizman B, Straus SE, eds. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, pp. 931 -959).

[0046]Em resposta ao aumento de incidência e severidade de infecção DEN, o desenvolvimento de vacinas está sendo persuadido para prevenir doença de vírus DEN. Uma vacina econômica que previne a doença causada pelo vírus DEN tem se tornado uma prioridade de saúde pública global. A eficácia a longo prazo, segura e de custo benefício associada com a vacina atenuada viva contra o vírus da febre amarela (YF) outro flavivírus proveniente de mosquito, serve como um modelo para a viabilidade de desenvolvimento de uma vacina de vírus DEn atenuado vivo (Mo- nath TP, 1999 in Yellow fever, Plotkin SA, Orenstein WA, eds. Vaccines, Philadelphia: W.B. Saunders Co., 815-879). Adicionalmente, uma vacina de vírus de encefa- lite japonesa (JE) atenuado vivo eficaz é usada na Ásia, e vacinas de vírus inativos estão disponíveis para JE e vírus de encefalite proveniente de tique. A necessidade por uma vacina contra os vírus DEN é aumentada cada vez mais, e, apesar de mui- tos esforços, o objetivo de desenvolver uma vacina de vírus DEN eficaz e segura tem ainda que ser conquistada. Uma vacina de vírus DEN eficaz deve conferir proteção de cada sorotipo porque todos os quatro sorotipos normalmente circulam em regiões endêmicas e infecção secundária com um sorotipo heterólogo é associada com severidade de doença aumentada.

[0047]Tem-se empregado duas estratégias para gerar componentes de vacina atenuada contra cada sorotipo que pode então ser combinada em formulações tetravalentes (Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol. 19:10-32). Primeiro, genéticas reversas têm sido usadas para introduzir uma mutação de deleção de 30 nucleotí- deos de atenuação (Δ30) para o 3’-UTR de clones de cDNA de cada sorotipo DEN (Durbin, AP et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-413; Whitehead SS et al. 2003 J Virol 77: 1653-1657: Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71:811-821 ; Blaney JE et al 2004 BMC lnfDis 4:39). Inicialmente, o componente de vacina rDEN4Δ30 foi encontrado como sendo atenuado em macacos rhesus (Tabela 1) e triagens clínicas de fase I/II em humanos demonstraram que infecção de vírus resulta em baixa viremia, é fortemente imunogênica, e exibe reatogenicidade mínima sem nenhuma observação de eventos adversos sérios (Durbin, A. P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-413; Durbin et al. 2005 J lnfDis 191:710-718). Recentemente, o componente de vacina rDEN1Δ30, que foi também atenuado em macacos rhesus (Tabela 1), tem sido encontrado para compartilhar um fenótipo similar em triagens clínicas como aquelas observadas para rDEN4Δ30; baixa viremia, imunogenicidade forte, e reatogenicidade mínima em 20 voluntários (Whitehead SS et al. 2003 J Virol 77:16531657;Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol. 19:10-32). Infelizmente, os componentes de vacina rDEN2Δ30 e rDEN3Δ30 não parecem como sendo satisfatoriamente ate-nuados em macacos rhesus durante testes pré-clínicos e não existe nenhum plano para testar estes em humanos(tabela 1) (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71 :811 -821 ; Blaney JE et al. 2004 BMC InfOis 4:39). Consequentemente, uma es tratégia alternativa para desenvolvimento da vacina tem sido gerada de vírus quiméricos antigênicos recolocando proteínas estruturais do componente de vacina rDEN4Δ30 atenuado com aqueles do DEN2 ou DEN3 fornecendo os componentes de vacina rDEN2/4Δ30 e rDEN3/4Δ30, respectivamente (Whitehead SS et al. 2003 Vaccine 23 :4307-4316; Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71 :81 1 -821). O vírus de vacina rDEN2/4Δ30 tem sido testado em humanos e parece seguro e fortemente imunogênicos, enquanto avaliação clínica do vírus rDEN3/4Δ30 é atualmente planejada. Tabela 1. Efeitos da mutação Δ30 nos quatros sorotipos DEN em macacos rhesus

agupos de macaco rhesus foram inoculados subcutaneamente com 5,0 log10 PFU do vírus indicado em uma dose de 1 ml. Soro foi coletado diariamente por 10 dias. Titragem de vírus em sror foi determinada pelo ensaio de plaqueta em células Vero. bRedução de plaquetas (60%) que neutralizam titragens de anticorpo determinou no dia 28 soro usando vírus do tipo selvagem indicado. Diluição recíproca da média geométrica é indicada.

[0048]Aqui, descreve-se novos componentes de vacina para o sorotipo DEN3 gerado por modificação genética do 3’-UTR do clone cDNA DEN3 (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71:81 1-821). O desenvolvimento dessas vacinas DEN3, que possuem o complemento completo de proteínas DEN3 do tipo selvagem, e importante por duas razões. Primeira o componente presente para DEN3, rDEN3/4Δ30 pode ser encontrada como estando sob ou sobreatenuadas em triagens clínicas. Segunda, Uma vacina ideal para conferir proteção de doença causada por DEn3 pode requerer indução de respostas de célula T contra o conjunto completo de proteínas DEN3, em vez de apenas a M e E que são somente sequências de DEN3 presentes no vírus quimérico rDEN3/4Δ30. Para gerar componentes de vacina DEN3 adicionais, novas deleções que englobam ou delimitam a deleção Δ30 no 3’- UTR foram introduzidas no clone cDNA rDEN3. Aternativamente, o 3’-UTR do clone cDNA rDEN3 foi recolocado com aquele de rDEN4 ou rDEN4Δ30. Vírus viáveis foram analisados para fenótipos de atenuação em cultura de tecido, camundongos SID transplantados com células HuH-7, e macacos rhesus. Três vírus mutantes (rDEN3Δ30/31, rDEN3Δ86, e rDEN3-3’D4Δ30) têm fenótipos pré-clínicos que sugerem que eles possam ser seguros em imunogênicos em humanos.

Geração de mutantes de deleção de rDEN3

[0049]Procurou-se gerar mutações de deleções expandidas que incluem a mutação Δ30 (173-143 nt) original. A tabela 2 lista sete mutações de deleção que englobam mutação Δ30 original incluindo Δ50, Δ61, Δ80, Δ86, Δ116A, Δ116B, e Δ146. Além disso, a mutação Δ30/31 inclui a mutação Δ30 original e uma deleção de 31 nucleotídeos não contíguos. A mutação Δ31 foi também gerada sozinha para discernir a contribuição de Δ30 ou Δ31 na mutação de deleção Δ30/31 combinada. A localização de limites de nucleotídeos de deleções na estrutura secundária prevista do DEN3 3'-UTR é indicada na figura 4. Além disso, a estrutura secundária prevista do DEN3 3'-UTR para DEN3Δ30, rDEN3Δ30/31, e rDEN3Δ86 são indicados na figu- ra 8, 12, e 16, respectivamente. Tabela 2. Mutações de deleção criadas no 3'-UTR de DEN3 Sleman/78

a Numeração é da extremidade 3’ de genoma viral.

[0050]Mutagenese PCR foi usada para introduzir as nove novas mutações de deleção no plasmídeo DEN3 Sleman/78 cDNA, p3, que foi antriormente usado para gerar o componente de vacina DEN3Δ3O (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71:811-821). O subclone c DNA p3-frag.4 foi usado como o modelo para reações PCR com pares indicados de oligonucleotídeos mutagênicos listados na Tabela 3, exceto para a mutação de deleção Δ30/31 que usou subclone cDNA p3- frag.4Δ30 como um modelo. Produtos PCR foram ligados e usados para transformar células bacteriana competentes. O DNA de plasmídeo foi isolado de clones bacteria- nos e a presença de mutação de deleção apropriada foi confirmada por análise de sequência. Para gerar plasmídeos cDNA DEN3 intactos contendo as mutações de deleção, o fragmento KpnhPstl (963 nucleotídeos) provenientes de subclones cDNA p3-frag.4 cDNA foram introduzidos no plasmídeo cDNA p3-7164. O plasmídeo cDNA p3-7164 codifica a mutação de adaptação de célula Vero 7164 que tem sido anteriormente mostrada para aperfeiçoar o crescimento e a eficiência de transfecção em células Vero (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71 :811 - 821). Plasmideos p3 de comprimento completo contendo as mutações de deleção foram confirmados para conter sequência 3'-UTR correta. Mutações em adição às deleções montadas foram verificadas nos vírus rDEN3Δ30/31 e rDEN3Δ86 quando comparadas ao plasmídeo cDNA DN3 p3 (Genbank # AY656169) (Tabela 4). Tabela 3. Sequências de iniciador mutagênico para construção de deleções 3’-UTR

Tabela 4. Mutações em adição a deleções montadas que foram identificadas nos vírus rDEN3Δ30/31 e rDEN3Δ86 quando comparadas ao cDNA de plasmídio DEn3 p3. (Genbank # AY 656169)

aA mutação 7164 é uma mutação de adaptação de célula Vero que foi montada no construto de cDNA. bExiste uma população misturada nesta posição de nucleotídeos (A^A/U) que altera o códon de parada (UAA) na extremidade de NS5 para UAU que codifica Tyr. Isto serviria para estender NS5 por 2 aminoácidos (Tyr-Thr-End) devido ao có- don de parada permanecer nos nucleotídeos 10271-10273.

[0051]Para recuperação de vírus, transcrições de RNA capeado em 5’ foram sintetizadas in vitro a partir de plasmídeos de cDNA e transfectadas em células Vero ou células C6/36. Antes de transcrever e gerar vírus infecciosos, as sequências de ligante foram removidas dos plamídeos de cDNA por digestão de Spel. Plasmídeos foram então recirculados por ligação, linearizados com Acc651 (isosquizômero de Kpnl que cliva deixando apenas um único nucleotídeo 3’), e transcritos in vitro usando polimerase SP6. Transcrições purificadas foram então transfectadas em células Vero ou C6/36.

[0052]Vírus recominantes que codificam cada uma das nove mutações, Δ30/31, Δ31, Δ50, Δ61, Δ80, Δ86, Δ116A, Δ116B, e Δ146, foram recuperadas com sucesso em células C6/36, enquanto apenas rDENΔ31 foi recuperado em células Vero. Os vírus mutantes de deleção rDEN3 foram então passados uma vez em células Vero seguido por clonagem biológica por duas diluições terminais em células Ve-ro. Vírus clonados foram então passados duas das sete vezes em células Vero em uma tentativa de alcançar titragem de choque de pelo menos 6.0 log10PFU/ml que é considerada suficiente para permitir fabricação de custo-benefício. Três vírus recom-binates(rDEN3Δ50, rDEN3Δ116A, e rDEN3Δ146) foram encontrados como sendo excessivamente restritos para replicação em células Vero, apesar de serem viáveis. Portanto, estes três vírus não foram estudados adicionalmente. A sequência genética do 3'-UTR foi determinada para seis vírus mutantes de deleção restantes que al-cançaram o pico de titragem de vírus de pelo menos 6.0 log10PFU/ml. A sequência 3'-UTR correta com a deleção aprorpiada foi encontrada para rDEN3Δ61, rDEN3Δ80, rDEN3Δ86 and rDEN3Δ30/31. Entretanto, vírus mutantes foram encontrados como contendo deleções adicionais e foram considerados como potencialmente tendo genótipos instáveis. Primeiro, rDEN3Δ31 teve a deleção 3'-UTR correta de 258-228 nt, mas também conteve uma deleção de 25 nucleotídeos do nucleotí- deo 222-198. Segundo, rDEN3Δl 16B teve a deleção 3'-UTR correta do nt 258- 143, mas também conteve uma deleção de 8 nucleotídeos do nucleotídeo 430-423 e uma única substituição A->G no nucleotídeo 265. O potencial da instabilidade genética com esses vírus evita seu uso como componentes de vacina de modo que eles não foram estudados adicionalmente. Portanto, das nove deleções originais construidas, quatro vírus mutantes foram encontrados para replicar eficientemente em células Vero e foram estudados adicionalmente, rDEN3Δ61, rDEN3Δ80, rDEN3Δ86 e rDEN3Δ30/31. Geração de vírus quiméricos rDEN3 com o 3'-UTR derivado de rDEN4 ou rDEN4Δ30

[0053]Outra estratégia foi empregada para gerar novos componentes de vacina rDEN3, recolocação do 3'-UTR doclone cDNA rDEN3 cDNA com aquele do rDEN4 ou rDEN4Δ30 (Figura 18A). O vírus quimérico 3'-UTR, rDEN3-3'D4Δ30, foi projetado para ser um componente de vacina para inclusão em formulações tetravalentes que compartilham a mutação de deleção Δ30 entre todos os quatro tipos de sorotipos. O vírus rDEN3-3'D4 foi projetado para discernir a contribuição da quimeri- zação 3'-UTR e a mutação Δ30 para qualquer fenótipo observado.

[0054]O plasmídeo p3-3'D4Δ30 foi gerado como segue. Primeiro, mutagêne- se PCR foi usada para introduzir um sítio de restrição a Hpal no subclone cDNA p3- frag.4 cDNA (Figura 18B). Produtos PCR foram ligados e usados para transformar células bacterianas competentes. DNA de plasmídio foi isolado de clones bacteria- nos e a presença da mutação de deleção apropriada foi confirmada pela análise de sequência. Para introduzir rDEN4Δ30 3'-UTR no subclone cDNA p3- frag.4(Hpal), um fragmento de 364 nucleotídeos englobando o p4Δ30 3'-UTR foi amplificado por PCR usando um iniciador direto (5’-AACAACAACAAACACCAAAGGCTATTG-3", SEQ ID NO: 32) e iniciador reverso (5'-CCTACCGGTACCAGAACCTGTTG-3’, SEQ ID NO: 33). Para gerar o subclone p3- frag.4-3'D4Δ30 cDHA, o fragmento Hpal-Kpnl foi removido do p3- frag.4(Hpal) e recolocado com o the fragmento p4Δ30 3'-UTR PCR que foi clivado por Kpnl. O fragmento Pstl-Kpnl do p3-frag.4-3’D4Δ30 foi introduzido no plasmídeo p3 para fazer o clone de cDNA de comprimento completo, p3- 3'D4Δ30. A sequência de 3'-UTR e junção NS5 foi confirmada como sendo correta.

[0055]Para gerar p3-3'D4, os 30 nucleotídeos deletados da mutação de de- leção Δ30 foram introduzidos no subclone de cDNA p3 -frag.4-3'D4Δ30. Brevemente, o fragmento Mlul-Kpnl de p3- frag.4-3'D4Δ30, que engloba a região Δ30, foi recolocado com o fragmento correspondente de p4 para fazer o plasmídeo, p3-frag.4- 3TJ4. Para gerar um genoma p3 de comprimento completo, o fragmento Pstl-Kpnl de p3 foi recolocado com o fragmento correspondente de p3-frag.4-3'D4. A sequência 3'-UTR do plasmídeo p3-3'D4 foi determinado como sendo correto e conteve a perda de 30 nucleotídeos da mutaçãoΔ30.

[0056]Para recuperação desses vírus, transcrições de RNA capeadas em 5’ foram sintetizadas in vitro a partir de plasmídeos de cDNA e transfectadas em células Vero ou células C6/36. Antes da transcrição e geração de vírus infeccioso, o li- gante foi removido dos plasmídeos de cDNA por digestão com Spel. Plasmídeos foram então circulados por ligação, linearizados com Acc651 (isosquizômero de Kpnl que cliva levando apenas um único nucleotídeo 3’), transcritos in vitro usando poli- merase SP6. As transcrições purificadas foram então transfectadas em Vero ou célu-las C6/36.

[0057]rDEN3-3'D4 foi recuperado em células C6/36 e células Vero, enquanto rDEN3-3'D4Δ30 podem apenas ter sido recuperadas em células Vero. Vírus mutan- tes foram então passados em uma vez em células Vero seguidos por clonagem biológica por duas diluições terminais em células Vero rDEN3-3’D4 e rDEN3-3'D4Δ30 foram então passados quatro ou seis vezes em células Vero, respectivamente. A sequência genética da junção NS5-3'-UTR e 3’-UTR foi encontrada como estando correta para rDEN3-3'D4 and rDEN3-3’D4Δ30. Portanto, ambos os vírus foram estudados adicionalmente.

[0058]As mutações foram também identificadas no vírus rDEN3-3’D4Δ30 comparadas ao clone de cDNA de plasmídeo DEN3 p3 (5’-UTR e genes) e clone cDNA DEN4 p4 (3'-UTR) (Tabela 5). Tabela 5. Mutações no vírus rDEN3-3’D4Δ30 comparadas ao ao clone de cDNA de plasmídeo DEN3 p3 (5’-UTR e genes) e clone cDNA DEN4 p4 (3'-UTR)

aA mutação 7164 é uma mutação de adaptação de célula Vero que foi montada no contruto de cDNA Replicação de vírus mutantes DEN3 em camundongos SCID-HuH-7

[0059]Os quatro vírus mutantes de deleção (rDEN3Δ30/31, rDEN3Δ61, rDEN3Δ80, e rDEN3Δ86) que foram encontrados para replicar para titragem elevada em células Vero e foram confirmados ter a sequência 3'-UTR correta e os vírus rDEN3-3’D4 e rDEN3-3'D4Δ30 foram primeiro avaliados em camundongos SCID- HuH-7. O rDEN3-3’D4 e rDEN3-3'D4Δ30 foram comparados para determinar o efeito na replicação da quimerização 3'-UTR e qualquer atenuação adicional conferida pela mutação Δ30. Camundongos SCID-HuH-7 contêm tumores sólidos da linhagem celular hepatomática em humanos HuH-7, e análise de replicação de vírus neste modelo de camundongo no fígado humano. Vários vírus mutantes de vírus DEN tem sido identificados pela avaliação em camundongos SCID-HuH-7 (Blaney JE et al. 2002 Virology 300:125-139; Hanley et al. 2004 Vaccine 22:3440-3448; Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol. 19:10-32). Este modelo de camundongo proveu a evidência original que o vírus rDEN3Δ3O não foi atenuado comparado ao vírus parente rDEN3, enquanto o vírus quimérico antigênico, rDEN3/4Δ30, foi aproximadamente 100- vezes restrito na replicação nos camundongos SCID-HuH-7 quando comparado a vírus parental do tipo selvagem (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71:811 - 821 ).

[0060]Para análise de replicação de vírus em camundongos SClD-HuH-7, quatro dos seis camundongos mais velhos (Tac:lcr:Ha(ICR)-Prkdcscid) (Fazendas Tacônicas) foram injetados com 0.1 mL de solução salina tamponada de fosfato contendo 107células HuH-7 que foram propagadas em cultura de tecido. Tumores foram detectados no peritônio cinco a seis semanas após transplantação, e os camundongos portando tumor foram infectados por inoculação direta no tumor com 104 PFU de vírus em 50 μl Opti-MEM I. O soro foi coletado de camundongos infectados no dia 7 após a infecção e congelados a -80°C. A tritagem de vírus foi determinada por ensaio de plaqueta em células Vero.

[0061]Como indicado na tabela 6, DEN3 Sleman/78 do tipo selvagem replicou para um pico de tritagem de vírus de aproximadamente 106.9 PFU/ml. Embora um nível diminuído de replicação foi observado para cadaum dos seis vírus mutan- tes, as diferenças na replicação foram não significantes estatisticamente. Entretanto, rDEN3Δ86 e rDEN3-3"D4Δ30 foram mais do que 10 vezes restritos em replicação comparados ao vírus DEN3 tipo selvagem, enquanto a replicação de rDEN3Δ30/31 foi levemente menor do que 10 vezes restritos. Na base deste corte arbitrário, estes três vírus foram selecionados para avaliação adicional. É importante notar que o vírus rDEN4Δ30 que tem uma atenuação bem caracterizada e um fenótipo não reato- gênico em humanos foi encontrado como sendo 6 vezes restrito em replicação em camundongos SCID-HuH-7 comparado ao vírus rDEN4 tipo sevagem (Hanley et al. 2004 Vaccine 22:3440-3448). Tabela 6. Replicação de vírus DEN3 mutantes em camundongos HuH-7- SCID.

1 Grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados no tumor com 4.0 logioPFU do vírus indicado. O soro foi coletado no dia 7 e a titragem de vírus foi determinada em células Vero.

[0062]Devido ao vírus rDEN3-3'D4Δ30 e aos vírus rDEN3Δ30/31 e rDEN3Δ86 codificarem o conjunto completo de proteínas não estruturais e estruturais DEN3, seria esperados que eles induzissem o complemento completo de imunidade celular e humoral. Esta indução imune mais completa seria vantajosa comparada aquela induzida pelo rDEN3-3'D4Δ30 quimérico, que codifica apenas as proteínas estruturas de DEN3.

Replicação de vírus mutantes DEN3 em cultura de tecido

[0063]O nível de replicação de vírus em células Vero e células C6/36 de mosquito acessada por vírus mutantes de deleção rDEN3Δ30/31 e rDEN3Δ86 e o vírus rDEN3-3’D4 com e sem Δ30. A replicação em células Vero foi analisada devido a essas celulas serem o substrato para fabricação, enquanto o crescimento em célu-las C6/36 foi acessado devido a fenótipos de atenuação nessas células de mosquito poderem ser asociadas a replicação restrita em mosquitos Aedes que servem como o vetor para a transmissão do vírus DEN (Hanley et al. 2003 Virology 312:222-232).

[0064]Crescimento cinético foi avaliado como segue. Monocamadas confluentes de células Vero e células C6/36 em frascos de 75 cm foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0.01. Alíquotas de sobrenadante de cultura de tecido de 0,5 ml foram removidas diariamente por sete dias, combinadas com estabi- lizante SPG, e congeladas a -80°C, a tritagem de vírus de todas as amostras foi determinada em ensaio de plaqueta em células Vero. O limite de detecção para o ensaio de plaqueta é 1.0 log10PFU/ml.

[0065]As cineticas de replicação de cada vírus em ambas as linhagens celularesé mostrada na figura 19. Em células Vero, rDEN3Δ30/31, rDEN3Δ86, e rDEIM3-3'D4Δ30 replicados para um nível de pico aproximado daquele rDEN3 do tipo selvagem e com cinéticas similares aquela rDEN3 tipo selvagem. Estes três componentes de vacina alcançaram titragens de pico de 6.5 a 6.7 log10PFU/ml que demonstra a possibilidade de fabricação de cada um desses vírus. Em células Vero o vírus rDEN3-3'D4 replicado para uma titragem de pico de 7.8 log10PFU/ml que aproximadamente 100 vezes maior do que aquela observada para rDEN3 do tipo selvagem que indica a inclusão do DEN4 3'-UTR pode aumentar replicação em células Vero. Isto também pode ser atribuído a adaptação de células Vero mais eficiente do vírus rDEN3-3'D4. rDEN4 replica para uma titragem de pico de aproximadamente 8.0log10PFU/ml que indica que o vírus quimérico alcança uma titragem de pico que não excede aquela de um de seus vírus parentes (Blaney JE et al. 2006 Viral Immunol . 19:10-32).

[0066]Análise de replicação de vírus em células C6/36 demonstrou que rDEN3Δ86 and rDEN3-3'D4Δ30 alcançou titragens de pico de aproximadamente 10 vezes menor do que a titragem do vírus rDEN3 tipo selvagem, 6.9 log10PFU/ml (Figura 39). O vírus rDEN3-3'D4 replicou para uma titragem de pico similar aquela observada por rDEN3 tipo selvagem. O resultado mais impressionante foi a falta de replicação observada em células C6/36 para o vírus rDEN3Δ3O/31. Após 1 dia, o vírus não foi detectado em meio de cultura de células C6/36 infectadas com vírus rDEN3Δ30/31 apesar da replicação eficiente observada em células Vero. Esses re- sultados foram confirmados em um segundo experimento de curva de crescimento independente e indica um fenótipo de atenuação de classificação de hospedeiro em cultura de tecido que é previsto como sendo acompanhado por um fenótipo de atenuação em mosquitos.

Replicação e imunogenicidade de vírus mutantes DEN3 em macacos rhesus

[0067]Com base na leve atenuação em camundongos SCID-HuH-7 e crescimento eficiente em células Vero, rDEN3Δ30/31, rDEN3Δ86, e rDEN3-3'D4Δ30 foram avaliados em macacos rhesus. Os vírus mutantes foram comparados com DEN3 tipo selvagem para nivel e duração de viremia, neutralizando indução de anticorpo, e a capacidade de conferir proteção a partir do desafio do vírus DEN3 tipo selvagem. O vírus rDEN3-3’D4 também foi avaliado para discernir a contribuição da quimera 3’-UTR ao atenuar com e sem a mutação Δ30. Um fenótipo de atenuação em macacos rhesus geralmente tem sido um forte preditor de segurança para com-ponentes de vacina em triagens clínicas incluindo rDEN4Δ30, rDEN1Δ30, e rDEN2/4Δ30 (Blaney JE et ai. 2006 Viral Immunol. 19:10-32).

[0068]Grupos de quatro macacos rhesus foram inoculados subcutaneamente com 105PFU dos vírus indicados (Tabela 7). Dois macacos foram simulados infectados com diluentes de vírus. Para a detecção de viremia, o soro foi coletado nos dia 0-8 e no dia 10 e congelados a -80°C. A tritagem de vírus em amostras de soro foi determinada por ensaio de plaqueta em células Vero. Soro foi coletado no dia 28 por detecção de anticorpos de neutralização direcionados contra DEN3. Níveis de anticorpos de neutralização foram determinados usando um ensaio de neutralização de redução de plaqueta em células Vero contra vírus DEN3 tipo selvagem. No dia 35 após infecção, todos os macacos foram provocados. O soro foi coletado nos dias 0-8 e no dia 10 e congelado a -80°C. A tritagem de vírus em amostras de soro foi determinada por ensaio de plaqueta em células Vero. Tabela 7. Replicação e imunogenicidade de vírus mutantes rDEN3 em ma- cacos rhesus.

Grupos de macacos rhesus foram inoculados subcutaneamente no dia 0 com 5,0 logiopfu do vírus indicado em uma dose de 1 ml. O soro foi coletado diaria mente nos dia 0 - 8 e 10 e uma vez no dia 28. 2 Titragem de vírus foi determinada por ensaio de plaqueta em células Vero. 3 Titragens de anticorpo de neutralização de redução de plaqueta (60%) foram determinadas usando DEN3 (Sleman/78). 4 Macacos foram provocados após 35 dias com DEN3 (sleman/78) administrado subcutaneamente em uma dose de 1 ml contendo 5,0 logwpfu. Soro foi coletado diariamente nos dias 0 - 8 e 10.

[0069]Vírus Sleman/78 DEN3 tipo selvagem replicados em macacos rhesus para uma titragem de vírus de pico médio de 1,8 log10PFU/ml de soro com todos os macacos desenvolvendo viremia (Tabela 7). Esses resultados paralelos a estudos anteriores de DEN3 em macacos rhesus (Blaney JE et al. 2004 Am J Trop Med Hyg 71:81 ] -821 ). Nenhuma viremia foi detectada em qualquer macaco infectado com qualquer um dos três componentes de vacina, DEN3Δ30/31, rDEN3Δ80, ou rDEN3- 3'D4Δ30 demonstrando um claro fenótipo de atenuação para cada um dos três vírus em macacos rhesus. Interessantemente, o vírus rDEN3-3'D4 foi detectado em 75% de macacos com uma titragem de vírus de pico médio de 1.3 log10PFU/ml de soro sugerindo que a presença da mutação Δ30 seja crítica para atenuação do vírus quimérico3'-UTR. Apesar da falta de viremia detectável, os níveis de anticorpo de neutralização médios em macacos infectados com rDEN3Δ30/31 e rDEN3Δ86 alcançaramníveis similares aqueles do vírus DEN3 tipo selvagem, 1:253 (Tabela 7). Em contraste, o vírus rDEN3-3’D4Δ30 induziu níveis de anticorpo de neutralização médio aproximadamente três vezes menor do que DEN3. Entretanto, 100% dos macacos imunizados com cada componente de vacina soroconvertido como definido por uma elevação maior ou quatro vezes nos níveis de anticorpo de neutralização de soro após infecção. Assim, todos os macacos foram considerados como sendo infectadas por cada um dos componentes de vacina apesar da falta de viremia detectá- vel. Determinação de titragem de vírus em soro após provocação com vírus DEN3 indicou que a imunização com cada um dos componentes de vacina induziram proteção completa a partir de viremia detectável como seria esperado dados os níveis de anticorpo de neutralização observados.

Replicação em mosquitos

[0070]Replicação de rDEN3 e rDEN3Δ30/31 foi estudada em mosquitos To- xorynchites amboinenesis. Inoculação intratoráxica de diluições dez vezes seriais de vírus de teste foi realizada como descrito anteriormente (Troyer J.M. e al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:414-9). Após incubação de 14 dias, as cabeças foram separadas e homogeneizadas em diluente. Titragem de vírus em homogenatos de cabeça foi determinada por ensaio de plaqueta em células Vero.

[0071]Com base na atenuação de rDEN3Δ30/31 em macacos rhesus e sua replicação restrita em células de mosquito C6/36, rDENΔ30/31 foi comparado a rDEN3 tipo selvagem e para infectividade e nível de replicação em mosquitos To- xorynchites amboinensis altamente sensitivos (Tabela 8). Diluições seriais de dez vezes de vírus foram inoculadas intratoraxicalmente, e a habilidade de infectar tecido de cabeça foi avaliada realizando um ensaio de plaqueta em homogenatos de cabeça de mosquito após 14 dias de incubação. A infectividade de rDEN3 e rDENΔ30/31 foi muito similar assim como a dose infecciosa de mosquito a 50% foi aproximadamente 101,3PFU para ambos os vírus (Tabela 8). Entretanto, o nível de replicação de rDENΔ30/31 em cabeças de mosquitos infectados foi reduzida cerca de 5- a 50 vezes. Esta redução foi significante nas doses 102,3and 101,3PFU testadas. Esta descoberta indica que embora rDENΔ30/31 tenha infectividade para Toxorynchites por infecção intratoráxica similar aquela rDEN3 tipo selavagem, exite uma restrição estatisticamente significante no nível de replicação em mosquitos concedida pela mutação Δ30/31. Tabela 8. Replicação de rDEN3 e rDENΔ30/31 em Toxorynchites amboinen- sis

atitragem de vírus administrada intratoraxicalmente em 0,2 μl inoculum. bPorcentagem de mosquitos com vírus detectáveis no dia 14 após inoculação foi determinada por ensaio de plaqueta em homogenatos de cabeça de mosquito em células Vero. ccalculado usando apenas valores de cabeças de vírus positivos. dpara 102’3PFU dose de rDEN3 e rDEN3Δ30/31, titragens de vírus média foram significativamente diferentes como determinado por um pós-teste Tukey- Kramer hoc (P < 0.001). ePara 101’3PFU dose de rDEN3 e rDEN3Δ30/31, titragens de vírus média foram significativamente diferentes como determinado por um pós-teste Tukey- Kramer hoc (P < 0.005).

[0072]Enquanto a presente invenção tiver sido descrita em alguns detalhes para finalidade de clareza e compreensão, um versado na técnica irá apreciar que várias mudanças na forma e detalhe podem ser feitas sem se afastar do verdadeiro escopo da invenção. Todas as figuras, tabelas, e apêndices, bem como patentes, aplicativos, e publicações, referidos acima, são pelo presente incorporados para referência.

Claims (3)

1. Vírus da dengue do tipo 3 (DEN3) atenuado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma mutação Δ30 que remove os nucleotídeos 173-143 na região não transcrita 3’ (3’-UTR) que remove a estrutura homologa em loop terminal 2 (TL-2), e (b) uma remoção de mutação na 3’-UTR, em que a remoção da mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em Δ31 que remove os nucleotídeos 258-228, Δ61 que remove os nucleotídeos 173113,Δ80 que remove os nucleotídeos 192-113, e Δ86 que remove os nucleotídeos 228-143, em que a numeração é designada com o sistema de numeração reversa..

2. Vírus da dengue atenuado (DEN), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a 3’-UTR é derivada do sorotipo DEN4 ou DEN4Δ30.

3. Composição imunogênica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus da dengue atenuado (DEN) conforme definido na reivindicação 1 ou 2.

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