KR20220088530A - 인플루엔자 바이러스 백본 - Google Patents

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KR20220088530A
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야스코 하타
마이클 제이. 모저
파묵 빌셀
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플루젠, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 Vero 세포에서 향상된 성장을 나타내는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 인플루엔자 바이러스는 선택된 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 PB1, PB2, PA, NP 및 NS 유전자 절편을 포함한다. 선택적으로, PB1, PB2 및 PA 유전자 절편 중 적어도 하나는 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스를 함유하는 약학적 제제, 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스를 포유동물에 투여함으로써 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법, 및 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.

Description

인플루엔자 바이러스 백본
관련 출원에 대한 상호 참조
이 특허 출원은 2019년 6월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 62/858,737에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 여기에 참조로서 통합된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조로서의 통합
본 문서와 함께 제출되고, 2020년 6월 2일자로 제작된 "749488SequenceListing_ST25.txt,"라는 제목의 73,600 Byte ASCII (Text) 파일로 식별되는 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.
인플루엔자, 즉 "독감(flu)"은 매년 전 세계적으로 수십만 명의 생명을 앗아가는 전염성이 높은 바이러스 감염이다. 인플루엔자 바이러스 코어 단백질에 기초하여 분류되는 4가지 유형(즉, A, B, C, D)의 인플루엔자 바이러스가 존재하지만, 계절 유행병은 대부분 유행하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 의해 발생한다.
백신이 인플루엔자를 예방하는 가장 좋은 방법이지만 인플루엔자 바이러스는 항원 소변이(antigenic drift) 및 항원 대변이(antigenic shift)가 일어나기 때문에 인플루엔자 백신을 자주 재제제화(re-formulate)해야 한다. 더욱이 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 A는 일반적으로 돌연변이와 진화의 비율이 높기 때문에 인플루엔자 백신 균주는 유행하는 균주와 일치하지 않아 백신 효과가 최소화될 수 있다. 그러나 유행하는 독감 바이러스가 독감 백신과 잘 일치할 경우 백신접종은 전체 인구 중 독감 관련 질병의 위험을 40~60% 줄일 수 있다. 이에 연구자들은 상이한 인플루엔자 아형(subtype) 간에 교차 방어 면역을 유도할 수 있는 백신을 연구해오고 있다. 그러한 예는 기능적 M2 단백질을 발현하지 않는 약독화된 생 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신(예를 들어, M2SR 백신)이다.
인플루엔자 백신은 바람직하게는 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포 및 아프리카 녹색 원숭이(Vero) 세포에서 증식되는데, 이는 포유동물 세포 배양이 계란 기반(egg-based) 생산에 비해 이점을 제공하기 때문이다. 이러한 이점에는 비용 절감, 생산 시간 단축, 및 바이러스의 항원 돌연변이 위험의 감소가 포함된다. 예를 들어, M2SR 백신은 M2 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포에서 증식된다. 그러나 세포 배양에서 백신 생산은 종종 바람직하지 않은 수율을 초래했다. 더욱이, MDCK 세포는 일반적으로 Vero 세포보다 더 감수성(permissive)이므로 Vero 세포에서 백신 생산은 비교적 비효율적이다.
바이러스 백본, 즉 PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS로 구성된 6개의 내부 유전자 절편(segment)에 대한 변형은 백신 생산을 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, Ping et al., Nature Communications, 6: 8148 (2015)에서 개발 및 설명된 고수율 백신 백본 "PR8-HY"는 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS1 단백질에서 특정 아미노산 돌연변이를 포함하고, 세포 및 계란 배양 시스템 모두에서 유행성 및 계절성 인플루엔자 백신의 역가를 향상시킬 것으로 예상되었다. 그러나, 상기 문헌에 기재된 이러한 변형은 특히 바람직한 제조 조건하 Vero 세포에서의 바이러스 성장을 증가시키는 데 효과가 없었다. 따라서 M2SR 백신과 같은 백신이 보다 효율적이고 효과적으로 생산될 수 있도록 Vero 세포에서 바이러스 성장을 향상시킬 필요가 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 Vero 세포에서 증가된 성장을 갖는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 인플루엔자 바이러스는 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 예를 들어 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS1 단백질을 코딩하는 유전자 절편을 포함한다. 예를 들어, PB1 단백질은 위치 40에 류신, 위치 180에 트립토판, 및 위치 464에 아스파라긴 또는 위치 607에 세린 중 적어도 하나를 포함한다. PB2 단백질은 위치 504에 발린을 포함하고, 선택적으로 위치 467에 이소류신 및 위치 529에 발린을 포함한다. PA 단백질은 위치 401에 라이신을 포함한다. NP 단백질은 위치 116에 류신, 및 위치 294에 라이신 또는 위치 311에 아르기닌 중 적어도 하나를 포함한다. NS1 단백질은 30번 위치에 프롤린과 118번 위치에 라이신을 포함한다. 또한, PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편 중 적어도 하나는 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스를 포함하는 약학적 제제, 포유동물에 인플루엔자 바이러스를 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서의 면역 반응을 유도하는 방법, 및 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.
도 1a는 Vero 세포에서 UW-PR8("HG") 및 PR8-HY("HY") 백본을 포함하는 Vero-적응된 HA 단백질을 포함하는 A/Massachusetts/15/2013 M2SR 바이러스(즉, M2SR-MA15V 바이러스)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 1b는 Vero 세포에서 HG 및 HY 백본을 포함하는 A/Brisbane/10/2007 M2SR 바이러스(즉, Bris10 M2SR)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 1c는 Vero 세포에서 Bris10 M2SR-HG 및 Bris10 M2SR-HY 바이러스에 대한 HA 역가(HA/50μl) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 2는 HY-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-CA07 바이러스의 성장 곡선과 비교하여 Vero 세포에서 FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07 바이러스에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 3은 HG-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-MA15V 바이러스의 성장 곡선과 비교하여 Vero 세포에서 FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-MA15V 바이러스에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 4a는 HY-M2SR-Bris10 및 HG-M2SR-Bris10 바이러스에 대한 성장 곡선과 비교하여 Vero 세포에서 FGHY1-M2SR-Bris10 및 FGHY2-M2SR-Bris10 바이러스에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 4b는 HY-M2SR-Bris10 및 HG-M2SR-Bris10 바이러스와 비교한 Vero 세포의 FGHY1-M2SR-Bris10 및 FGHY2-M2SR-Bris10 바이러스에 대한 HA 역가(HA/50μl) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 5a는 FGHY1-M2SR-MI45, HY-M2SR-MI45, 및 HG-M2SR-MI45 바이러스에 대한 성장 곡선과 비교하여 Vero 세포에서 Vero-적응된 HA 단백질 및 FGHY1 백본을 포함하는 A/Michigan/45/2015 M2SR 바이러스(즉, FGHY1-M2SR-MI45V 바이러스)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 5b는 HY-M2SR-HK4801 및 HG-M2SR-HK4801 바이러스에 대한 성장 곡선과 비교한 Vero 세포에서 FGHY1 백본을 포함하는 A/Hong Kong/4801/2014 M2SR 바이러스(즉, FGHY1-M2SR-HK4801 바이러스)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 5c는 HY-M2SR-avVN1203 및 HG-M2SR-avVN1203 바이러스의 성장 곡선과 비교하여 Vero 세포에서 FGHY1 백본을 포함하는 A/Vietnam/1203/04 M2SR 바이러스(즉, FGHY1-M2SR-avVN1203 바이러스)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 6은 M2CK 세포 및 M2VeroA 세포에서 HG(즉, UW-PR8), HY(즉, PR8-HY), 및 FGHY1 백본을 포함하는 계절성 및 유행성 독감 아형 M2SR 바이러스의 바이러스 역가(log TCID50/ml)를 도시하는 그래프이다.
도 7a는 Vero-적응된 H1N1 바이러스에서 HA 돌연변이를 보여주는 표이다.
도 7B는 Vero-적응된 H3N2 바이러스에서 HA 돌연변이를 보여주는 표이다.
도 7c는 상이한 Vero-적응된 HA 돌연변이를 포함하는 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 M2SR 바이러스(즉, M2SR Sing2016 바이러스)에 대한 성장 곡선을 도시하는 바이러스 역가(log10 M2CK TCID50/ml) 대 시간(감염 후 일수)의 그래프이다.
도 8a는 감염 후 1일 및 2일에 인간 세포주, 즉 A549, MRC-5 및 CALU에서 상이한 백본(즉, FGHY1, UW-PR8("HG") 및 IVR-147)을 갖고 A/Brisbane/10/2007(즉, Bris10 바이러스)를 포함하는 바이러스에 대한 NP 항원 생산(즉 NP 발현 수준)을 도시한다.
도 8b는 감염 후 1일 및 2일에 인간 세포주, 즉 A549, MRC-5 및 CALU에서 상이한 백본(즉, FGHY1, UW-PR8("HG"))을 갖고 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(즉, Sing2016 바이러스)를 포함하는 바이러스에 대한 NP 항원 생산(즉 NP 발현 수준)을 도시한다.
도 9a는 감염 후 1일에 상이한 백본(즉, FGHY1, UW-PR8("HG"), 및 IVR-147)을 갖는 Bris10 바이러스로 감염시킨 후 상이한 세포주에서 낮은 NP 수준을 발현하는 세포에 대한 높은 NP 수준을 발현하는 세포의 비율을 도시한다.
도 9b는 감염 후 1일에 상이한 백본(즉, FGHY1, UW-PR8("HG"))을 갖는 Sing10 바이러스로 감염 후 상이한 세포주에서 낮은 NP 수준을 발현하는 세포에 대한 높은 NP 수준을 발현하는 세포의 비율을 도시한다.
도 10은 FGHY1-M2SR 돌연변이체 접종 후 마우스 체중 변화 백분율 대 시간(감염 후 일수)을 나타내는 그래프이다. 평균의 표준 오차가 있는 군의 평균 % 체중이 표시된다.
도 11은 연구 14일, 30일, 및 49일에 1 x 108 TCID50 H3N2 FGHY1-M2SR, 1 x 109 H3N2 FGHY1-M2SR, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 흰담비의 혈청에서 항-H3 HA ELISA IgG 역가를 도시하는 그래프이다.
도 12는 연구 14일, 30일, 및 49일에 1 x 108 TCID50 H3N2 FGHY1-M2SR, 1 x 109 H3N2 FGHY1-M2SR, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 흰담비의 혈청에서 항-H3 HAI 역가를 도시하는 그래프이다.
도 13은 연구 14일, 30일, 및 49일에 1 x 108 TCID50 H3N2 FGHY1-M2SR, 1 x 109 H3N2 FGHY1-M2SR, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 흰담비의 혈청에서 항-H3 PRNT50 역가를 도시하는 그래프이다.
도 14a는 1가 H1N1 FGHY1-M2SR, 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 2가 FGHY1-M2SR, 3가 FGHY1-M2SR + BM2SR-Vic, 3가 FGHY1-M2SR + BM2SR-Yam, 4가, 또는 SPG (대조군)으로 면역화된 마우스의 혈청 내 항-H1 HA 역가 대 시간(접종 후 일수)을 도시하는 그래프이다.
도 14b는 1가 H1N1 FGHY1-M2SR, 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 2가 FGHY1-M2SR, 3가 FGHY1-M2SR + BM2SR-Vic, 3가 FGHY1-M2SR + BM2SR-Yam, 4가, 또는 SPG (대조군)으로 면역화된 마우스의 혈청 내 항-H3 HA 역가 대 시간(접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 15는 1가 H1N1 FGHY1-M2SR, 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, 또는 SPG(대조군)으로 면역화된 마우스의 인플루엔자 A/California/07/2009 (H1N1) 바이러스로 공격(chanllenge) 후의 마우스 체중 변화 백분율 대 시간(공격 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 16은 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)으로 면역화한 후 마우스 체중 변화 백분율 대 시간(백신접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 17a는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 혈청에서 항인플루엔자 A/H1 HA 혈청 IgG ELISA 역가 대 시간(백신접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 17b는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 혈청에서 항인플루엔자 A/H3 HA 혈청 IgG ELISA 역가 대 시간(백신접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 17c는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 혈청에서 항인플루엔자 B/Yam HA 혈청 IgG ELISA 역가 대 시간(백신접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 17d는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 혈청에서 항인플루엔자 B/Vic HA 혈청 IgG ELISA 역가 대 시간(백신접종 후 일수)를 도시하는 그래프이다.
도 18a는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 기관-폐 세척에서 IgG ELISA 역가 대 HA1 시험 항원(A/H1, A/H3, B/Yam, 또는 B/Vic)을 도시하는 그래프이다.
도 18b는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 기관-폐 세척에서 항인플루엔자 HA1 IgA ELISA 역가 대 HA1 시험 항원(MI45, SingEgg, Phuket 또는 CO/06)을 도시하는 그래프이다.
도 19는 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, FluMist 4가, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG(대조군)로 면역화된 마우스의 인플루엔자 A/H1N1로의 공격 후 마우스 체중 변화 백분율 대 시간(공격 후 일수)을 도시하는 그래프이다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스는 임의의 유형의 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A의 아형일 수 있다. 일부 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 범유행(pandemic) 인플루엔자 A 바이러스(예를 들어, H5N1)일 수 있다. 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 계절성 인플루엔자 A 바이러스(예를 들어, H1N1 또는 H3N2)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 재조합 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 재배열체 인플루엔자 바이러스)는 유전적으로 구별되는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 이종 유전자 절편)로부터 유래된 유전 물질(예를 들어, 유전자 절편)을 포함하는 인플루엔자 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 또한 분리된 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자 절편(gene segment)"은 바이러스 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 유전자 절편은 바이러스 단백질을 코딩하는 바이러스 RNA(vRNA), 즉 서열번호 1-5, 11, 14, 16, 18로 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "백본"은 PB1, PB2, PA, NP, NS1 및/또는 NS2, 및 M 단백질을 코딩하는 인플루엔자 유전자 절편을 지칭한다. 본 발명의 유전자 절편은 선택된 아미노산을 갖는 단백질을 코딩한다.
본원에 사용된 용어 "선택된 아미노산"은 아미노산 서열의 특정 위치에 있는 특이적 아미노산을 지칭한다. 일부 구체예에서, 선택된 아미노산은 모(parent) 아미노산 서열에 대한 유전적 돌연변이의 결과이다. 모 아미노산 서열은 선택된 아미노산에 상응하는 위치를 제외하고는 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 동일할 수 있다.
인플루엔자 바이러스
(A) 백본 단백질
본 발명의 PB1(폴리메라제 염기 단백질 1) 유전자 절편은 적어도 하나의 선택된 아미노산을 포함하는 단백질, 즉 PB1 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택된 아미노산은 위치 40에 류신 및 위치 180에 트립토판을 포함한다. PB1 단백질의 선택된 아미노산은 위치 464에 아스파라긴 또는 위치 607에 세린 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. PB1 유전자 절편은 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실 프로모터로의 돌연변이를 포함할 수 있다.
선택된 아미노산은 모 PB1 서열, 예를 들어 선택된 아미노산에 상응하는 위치를 제외하고는 본 발명의 PB1 아미노산 서열과 동일한 서열에 대한 유전적 돌연변이에 의해 획득될 수 있다. PB1 단백질의 아미노산 위치 464는 인플루엔자 PB1 단백질의 손바닥(palm) 영역에 위치하며 RNA 의존성 RNA 폴리메라제 활성 도메인을 연결한다. 일반적으로 위치 464의 아스파라긴산은 난자 및 MDCK 세포에서 분리된 인플루엔자 바이러스 중에 고도로 보존되어 있다. 이 아미노산의 역할은 확인되지 않았지만 이 위치에서 관찰된 아스파라긴(N)으로의 아미노산 변화는 PB1 단백질 구조에 영향을 미칠 수 있고 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 따라서 Vero 세포에서 폴리메라제 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, PB1 단백질의 위치 465에 있는 히스티딘이 PA 단백질의 위치 243에 있는 글루타민산과 상호작용하기 때문에, PB1의 위치 464에서 아미노산 변화는 PB1과 PA 사이의 상호작용을 변경할 수 있다. PB1 단백질의 위치 607에 있는 아미노산의 기능도 알려져 있지 않다. 그러나 이 아미노산은 RNA-의존성 RNA 폴리메라제 영역과 PB2 결합 영역 사이에 위치하여 PB1과 PB2 사이의 상호작용을 변경하여 Vero 세포내에서의 폴리메라제 활성에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.
본 발명의 PB2(폴리메라제 염기 단백질 2) 유전자 절편은 또한 적어도 하나의 선택된 아미노산을 포함하는 단백질, 즉, PB2 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택된 아미노산은 위치 504에 발린, 및 선택적으로 위치 467에 이소류신 및 위치 529에 발린을 포함한다. PB2 유전자 절편은 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실 프로모터로의 돌연변이를 포함할 수 있다. PB2 단백질의 위치 467 및 529에 있는 아미노산은 PB2-C 부분에 있다. 구체적으로, 위치 467의 아미노산은 PB2 단백질의 cap-결합 영역에 위치하고, 위치 529의 아미노산은 cap-627 링커 도메인에 위치한다. 일부 인플루엔자 바이러스에서 PB2 단백질은 숙주 캡핑된 RNA의 캡 구조에 결합하고 인플루엔자 mRNA를 만들기 위해 숙주 RNA의 캡을 활용한다. 이 프로세스를 "캡 스내칭"이라고 한다. 게다가 PB2의 위치 627에 있는 아미노산은 숙주 범위와 바이러스 병원성에 있어서 주요 결정자로 알려져 있다. 따라서 캡-결합 영역 근처의 아미노산 변화는 바이러스 mRNA 합성의 효율성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 PA(폴리메라제 산성 단백질) 유전자 절편은 또한 적어도 하나의 선택된 아미노산을 포함하는 단백질, 즉 PA 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택된 아미노산은 위치 401에 라이신을 포함한다. PA 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실 프로모터로의 돌연변이를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 NP(핵단백질) 유전자 절편은 또한 적어도 하나의 선택된 아미노산을 포함하는 단백질, 즉 NP 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택된 아미노산은 위치 116에 류신 및 위치 294에 리신 또는 위치 311에 아르기닌 중 적어도 하나를 포함한다. NP 단백질의 아미노산 위치 294과 311은 NP 단백질의 체내에 위치하므로 핵 국소화 신호나 핵 수출 신호로서 역할하지 않는다.
본 발명의 NS(비-구조) 유전자 절편은 또한 적어도 하나의 선택된 아미노산을 포함하는 단백질, 즉 NS1 및/또는 NS2 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택된 아미노산은 위치 30에 프롤린(NS1 단백질) 및 위치 118에 리신(NS1 단백질)을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 위치 40, 180 및 464에 선택된 아미노산, 즉 위치 40에 류신, 위치 180에 트립토판, 및 위치 464에 아스파라긴을 갖는 단백질, 즉, PB1 단백질을 코딩하는 PB1 유전자 절편을 포함한다. PB1 유전자 절편은 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PB1 유전자 절편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PB1 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 또 다른 양상에서 인플루엔자 바이러스는 위치 504에 선택된 아미노산, 즉 위치 504에 발린을 갖는 단백질, 즉, PB2 단백질을 코딩하는 PB2 유전자 절편을 포함할 수 있다. PB2 유전자 절편은 서열번호 14로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PB2 유전자 절편은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PB2 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 NP 유전자 절편은 위치 116 및 294에서 선택된 아미노산, 즉 위치 116에서 류신 및 위치 294에서 라이신을 갖는 단백질, 즉, NP 단백질을 코딩할 수 있다. NP 유전자 절편은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. NP 유전자 절편은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NP 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 PA 및 NS 유전자 절편은 또한 위치 401(PA 단백질), 위치 30(NS1 단백질) 및 위치 118(NS1 단백질)에 선택된 아미노산, 즉 위치 401에 라이신(PA 단백질), 위치 30에 프롤린(NS1 단백질), 및 위치 118에 라이신(NS1 단백질)을 포함하는 단백질, 즉 PA 단백질 및 NS1 및/또는 NS2 단백질을 코딩할 수 있다. PA 유전자 절편은 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PA 유전자 절편은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PA 단백질을 코딩할 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 18로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NS1 단백질을 코딩할 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NS2 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편은 또한 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 위치 40, 180, 및 607에 선택된 아미노산, 즉 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 및 위치 607에서 세린을 갖는 단백질, 즉, PB1 단백질을 코딩하는 PB1 유전자 절편을 포함할 수 있다. PB1 유전자 절편은 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PB1 유전자 절편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PB1 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 또 다른 양상에서, 인플루엔자 바이러스는 위치 504, 467, 및 529에 선택된 아미노산, 즉 위치 504에서 발린, 위치 467에서 이소류신, 및 위치 529에서 발린을 갖는 단백질, 즉 PB2 단백질을 코딩하는 PB2 유전자 절편을 포함할 수 있다. PB2 유전자 절편은 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PB2 유전자 절편은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PB2 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 NP 유전자 절편은 위치 116 및 311에 선택된 아미노산, 즉 위치 116에 류신 및 위치 311에 아르기닌을 갖는 단백질, 즉 NP 단백질을 코딩할 수 있다. NP 유전자 절편은 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. NP 유전자 절편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NP 단백질을 코딩할 수 있다. PA 및 NS 유전자 절편은 또한 위치 401(PA 단백질), 위치 30(NS1 단백질), 및 위치 118(NS1 단백질)에서 선택된 아미노산, 즉 위치 401에서 리신(PA 단백질), 위치 30에서 프롤린(NS1 단백질), 및 위치 118에서 라이신(NS1 단백질)을 포함하는 단백질, 즉 PA 단백질 및 NS1 및/또는 NS2 단백질을 코딩할 수 있다. PA 유전자 절편은 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. PA 유전자 절편은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 PA 단백질을 코딩할 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 18로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NS1 단백질을 코딩할 수 있다. NS 유전자 절편은 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 즉 NS2 단백질을 코딩할 수 있다. 구체예의 PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편은 또한 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함할 수 있다.
구체예의 선택된 아미노산, 특히 백본의 대부분의 단백질에서, 동일한 조건 하에 선택된 아미노산이 없는 것을 제외하고 동일한 인플루엔자 바이러스와 비교하여 인플루엔자 바이러스에 향상된 성장 특성을 부여한다. 예를 들어, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 Vero 세포에서 향상된 성장을 나타낸다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스는 또한 M(막 단백질) 유전자 절편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, M 유전자 절편은 바이러스가 기능성 M2 단백질의 발현을 결여하도록 하는 인플루엔자 A로부터의 돌연변이 유전자 절편일 수 있다. 이러한 바이러스는 본원에서 "M2SR" 바이러스로 지칭된다. M2SR 바이러스는 단일 복제 인플루엔자 바이러스이다. M2SR 바이러스의 M 유전자 절편은 서열번호 11로 표시될 수 있다. M 유전자 절편은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 예를 들어 절단된(truncated) M2 단백질을 코딩할 수 있다. M2SR 바이러스는 M2 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포(즉, M2VeroA 세포)에서 증식되어 다중주기 복제를 허용할 수 있다. Vero 세포의 높은 수율은 M 유전자 절편의 돌연변이에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 기능적 M2 단백질을 코딩하는 M 유전자 절편을 포함할 수 있다.
(B) 표면 단백질
본 발명의 추가 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 NA(뉴라미니다제) 및 HA(헤마글루티닌) 유전자 절편을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, HA 유전자 절편은 단백질의 HA1 서브유닛에 적어도 하나의 선택된 아미노산(예를 들어, 아미노산 돌연변이) 및/또는 단백질의 HA2 서브유닛에 적어도 하나의 선택된 아미노산(예를 들어, 아미노산 돌연변이)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, HA2 서브유닛의 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 위치 107에서 아스파라긴일 수 있다. 이러한 돌연변이는 또한 생산 중 바이러스의 향상된 성장에 기여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편은 단일 인플루엔자 균주로부터 유래된다. HA 유전자 절편은 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래될 수 있다. 유사하게, NA 유전자 절편은 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 유행성 인플루엔자 바이러스(예를 들어, H5N1, H7N9) 또는 계절성 인플루엔자 바이러스(예를 들어, H1N1, H3N2, 인플루엔자 B)일 수 있다.
(C) 인플루엔자 바이러스의 속성
본 발명의 인플루엔자 바이러스의 백본은 인플루엔자 바이러스의 유형(예: 계절성 또는 판데믹성 인플루엔자 바이러스)에 관계없이 특히 Vero 세포에서 인플루엔자 바이러스에 높은 성장 특성을 부여한다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 낮은 감염다중도(multiplicity of infection (MOI))(예: 0.001)를 이용한 제조공정에서도 높은 수율을 나타낸다. MOI는 감염 대상(예: 세포)당 제제(예: 바이러스)의 평균 수를 나타낸다. 더 낮은 MOI는 여러 주기의 감염이 필요한 경우 사용된다(예: 바이러스 백신 생산). 현재의 Good Manufacturing Practice 규정은 FDA에 의해 시행되며 일반적으로 여전히 높은 수율의 바이러스를 생산하는 가장 낮은 MOI를 사용해야 한다. 이는 마스터 종자 스톡이 비싸고 비감염성 입자 및 과도한 세포 단백질로 인한 독성이 바이러스 생산을 감소시킬 수 있기 때문이다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 유전적으로 안정하여, 백본 단백질, 특히 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS1 단백질의 선택된 아미노산이 낮은 MOI에서 증식되는 경우에도 고도로 보존된다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예에서, 선택된 아미노산은 Vero 세포주에서 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 또는 10회 이상의 연속 계대이후에도 PB1, PB2, 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존된다. 일 구체예에서, Vero 세포주는 인플루엔자 A 바이러스의 M2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포(즉, M2VeroA 세포)를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, Vero 세포주는 인플루엔자 B 바이러스의 BM2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포(즉, BM2Vero 세포)를 포함할 수 있다. BM2는 인플루엔자 A 바이러스 M2의 기능적 대응물로 간주된다. 이러한 구체예에서, 선택된 아미노산은 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스인 경우에도 보존될 수 있다.
유전적으로 변형된 Vero 세포(즉, 인플루엔자 M2 또는 BM2 단백질을 발현하는 세포)는 정상 Vero 세포처럼 행동하며 정상 Vero 세포에 필적하는 인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 성장을 지원한다. M2VeroA 세포에서 M2SR 바이러스에 대한 바이러스 역가는 변형되지 않은 Vero 세포주에서 기능적 M2를 발현하는 복제 인플루엔자 바이러스와 유사하다. 또한, BM2Vero 세포에서 BM2SR 바이러스(즉, 인플루엔자 B의 돌연변이 M 유전자 절편을 포함하고 결과적으로 기능성 BM2 단백질을 발현하지 않는 인플루엔자 바이러스)에 대한 바이러스 역가는 변형되지 않은 Vero 세포주에서 기능성 BM2를 발현하는 복제 인플루엔자 바이러스와 유사하다. 따라서 M2SR 및 BM2SR 바이러스는 M2VeroA 및 BM2Vero 세포주에서 복제 인플루엔자 바이러스처럼 행동한다.
본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인간 세포 내에서 복제할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 생성 방법
또한, 여기에서는 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법이 제공되며, 생성된 인플루엔자 바이러스는 선택된 아미노산을 갖는 단백질, 즉, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스를 발현하는 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편을 포함한다.
본 발명의 방법의 일 구체예에서, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법은 Vero 세포에서 재조합 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 제1 인플루엔자 바이러스)를 연속적으로 계대하여 생성된 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 제2 인플루엔자 바이러스)를 생성하는 것을 포함한다. 제1 인플루엔자 바이러스는 본 발명의 인플루엔자 바이러스와 관련하여 기재된 바와 같이, 단백질, 즉, 선택된 아미노산을 갖는 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS1 단백질을 발현하는 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 인플루엔자 바이러스는 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 위치 464에서 아스파르트산, 및 위치 607에서 프롤린을 포함하는 단백질, 즉, PB1 단백질을 코딩하는 PB1 유전자 절편을 포함할 수 있다. 제1 인플루엔자 바이러스의 PB2 유전자 절편은 위치 467에 메티오닌, 위치 504에 발린, 및 위치 529에 이소류신을 포함하는 단백질, 즉, PB2 단백질을 코딩할 수 있다. 제1 인플루엔자 바이러스의 PA 유전자 절편은 위치 401에 라이신을 포함하는 단백질, 즉 PA 단백질을 코딩할 수 있다. 제1 인플루엔자 바이러스의 NP 유전자 절편은 위치 116에 류신, 위치 294에 글루타민산, 및 위치 311에 글루타민을 포함하는 단백질, 즉 NP 단백질을 코딩할 수 있다. 제1 인플루엔자 바이러스의 NS 유전자 절편은 위치 30에 프롤린 및 위치 118에 리신을 포함하는 단백질, 즉 NS1 단백질을 코딩할 수 있다. 제1 인플루엔자 바이러스의 PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편은 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에 우라실을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 제2 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생성된 인플루엔자 바이러스)는 Vero 세포에서 제1 인플루엔자 바이러스의 적어도 4개 또는 적어도 5개의 연속 계대 후에 생성된다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스는 또한 표준 바이러스 구제 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예에서, 8개의 바이러스 유전자 절편(즉, PB1, PB2, PA, NP, M, NS, HA, 및 NA) 각각에 대한 cDNA가 클로닝된 하나 이상의 플라스미드는 각각의 cDNA 서열이 RNA 폴리메라제 I 프로모터 및 RNA 폴리메라제 I 종결자에 의해 플랭킹되는 진핵 숙주 세포에 형질감염(transfect)될 수 있다(즉, pPolI 플라스미드). PB1, PB2, PA, NP, 및 NS1 및/또는 NS2 단백질을 코딩하는 유전자 절편은 본 발명의 선택된 아미노산을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. M2 또는 BM2 단백질을 코딩하는 유전자 절편은 돌연변이 M2 또는 BM2 유전자 절편을 포함할 수 있어, 유전자 절편은 기능적 M2 또는 BM2를 코딩하지 않는다. 숙주 세포는 또한 바이러스 단백질(예를 들어, PA, PB1, PB2, 및 NP 단백질 중 하나 이상, 또는 PB1, PB2, PA, NP, M, NS1 및/또는 NS2, HA 및 NA 단백질 중 하나 이상)을 코딩하는 하나 이상의 발현 플라스미드로 형질감염될 수 있다. 8개의 인플루엔자 vRNA(즉, 유전자 절편)는 이후 적어도 하나 이상의 플라스미드를 숙주 세포에 형질감염시킨 후 합성된다. 공동-형질감염된 바이러스 폴리메라제 및 핵단백질은 vRNA를 복제 및 전사되는 기능성 vRNP(즉, 바이러스 리보핵단백질 복합체)로 조립하여 궁극적으로 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스를 형성한다. 이 플라스미드 기반 역유전학 시스템은 Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 9345-9350 (1999)에 더 상세하게 설명되어 있다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 관련업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 미국 특허 제9,284,533호에 기재된 리보핵단백질(RNP) 형질감염을 사용하여도 생성할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
약학적 제제
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 약학적 제제(예를 들어, 백신 또는 다른 면역원성 조성물)을 제공한다.
상기 약학적 제제는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"는 본 발명의 인플루엔자 바이러스 이외의 약학적 제제의 임의의 구성요소를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 본 발명의 인플루엔자 바이러스를 유의하게 불활성화시키지 않으면서 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 효능을 향상시키거나 약학적 제제의 안정성을 유지할 수 있다.
하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 임의의 적합한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제일 수 있으며, 이들 중 다수는 관련 업계에 공지되어 있다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 pH를 유지하고(예를 들어, 완충액), 긴장성(tonicity)을 조정하고(예를 들어, 무기 염과 같은 긴장성 변형제), 단백질(예를 들어, 바이러스) 안정성 및/또는 면역원성을 개선하고, 점막부착을 개선하고, 단백질 응집 방지하고, 및/또는 약학적 제제를 보존(예: 방부제)하는 성분을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 무기 염, 계면활성제, 아미노산, 중합체 또는 중합체 화합물(예를 들어, 단백질, 다당류, 또는 하이드로겔), 킬레이트제, 당, 폴리올, 및/또는 아주반트(예를 들어, 특정 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질) 중 적어도 하나를 포함할 수 있는데, 이들 중 다수는 관련 업계에 공지되어 있다. 특정 담체 또는 부형제는 약학적 제제에서 하나 이상의 목적을 제공할 수 있으며, 따라서 하기 구체예는 본원에 인용된 설명으로 제한되지 않는다.
임의의 적합한 버퍼가 약학적 제제에 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 버퍼는 이미다졸 버퍼, 인산칼륨 버퍼, 인산완충식염수(PBS), 둘베코 인산완충식염수(DPBS)(예를 들어, 1 X DPBS), 히스티딘 버퍼, 시트르산 나트륨 버퍼, 및 수크로오스 인산 글루타메이트 버퍼(SPG) 중 적어도 하나를 포함한다. PBS 및/또는 DPBS 제제는 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 일염기성 인산칼륨, 및 이염기성 인산나트륨을 포함할 수 있고, 선택적으로 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBS 및/또는 DPBS 제제는 136.9 mM 염화나트륨, 2.67 mM 염화칼륨, 1.47 mM 일염기성 인산칼륨, 및 8.1 mM 이염기성 인산나트륨을 포함하지만, 이들 중 다수가 관련업계에 공지된 임의의 적합한 PBS 및/또는 DPBS 제제가 약학적 제제에서 버퍼로서 사용될 수 있다.
버퍼는 임의의 적합한 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 버퍼는 0.1mM 이상, 1mM 이상, 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 40mM 이상, 50mM 이상, 60mM 이상, 70mM 이상, 80mM 이상, 90mM 이상, 100mM 이상, 120mM 이상, 140mM 이상, 160mM 이상, 180mM 이상, 200mM 이상, 250mM 이상, 300mM 이상, 350mM 이상, 400mM 이상, 450mM 이상, 또는 500mM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 버퍼는 1000mM 이하, 500mM 이하, 450mM 이하, 400mM 이하, 350mM 이하, 300mM 이하, 250mM 이하, 200mM 이하, 180mM 이하, 160mM 이하, 140mM 이하, 120mM 이하, 100mM 이하, 90mM 이하, 80mM 이하, 70mM 이하, 60 mM 이하, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 10mM 이하, 또는 1mM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 버퍼는 임의의 전술한 종점에 의해 경계가 정해진 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 완충액은 0.1mM 내지 1000mM, 0.1mM 내지 500mM, 0.1mM 내지 100mM, 1mM 내지 1000mM, 1mM 내지 500mM, 1mM 내지 100mM, 100mM 내지 1000mM, 100mM 내지 500mM 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
추가적인 구체예에서, 버퍼는 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v), 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/ w))로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 버퍼는 0.1% 이상, 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 버퍼는 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 버퍼는 임의의 상기 종점에 의해 경계가 정해진 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 제약적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 완충액은 0.1% 내지 60%, 1% 내지 60%, 10% 내지 60%, 0.1% 내지 50%, 1% 내지 50%, 10% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50% 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. .
버퍼는 임의의 적합한 pH에서 약학적 제제의 pH를 유지할 수 있다. 버퍼는 약학적 제제의 pH를, 예를 들어, 4 이상, 4.5 이상, 5 이상, 5.5 이상, 6 이상, 6.5 이상, 7 이상, 또는 7.5 이상의 pH로 유지할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 버퍼는 약학적 제형의 pH를 예를 들어, 8 이하, 7.5 이하, 7 이하, 6.5 이하, 6 이하, 5.5 이하, 5 이하, 또는 4.5 이하로 유지할 수 있다. 완충액은 임의의 상기 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 pH에서 약학적 제제의 pH를 유지할 수 있다. 예를 들어, 버퍼는 약학적 제제의 pH를 4 내지 8, 4.5 내지 8, 5 내지 8, 5.5 내지 8, 6 내지 8, 6.5 내지 8, 7 내지 8, 7.5 내지 8, 4 내지 7.5, 5 내지 7.5, 6 내지 7.5, 7 내지 7.5, 4 내지 7, 5 내지 7, 6 내지 7 등의 pH로 유지할 수 있다. .
임의의 적합한 긴장성 변형제가 약학적 제제에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 무기 염이 긴장성 변형제로서 약학적 제제에 존재한다. 상기 무기염은 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4) 및 염화마그네슘(MgCl2) 중 적어도 하나일 수 있다. 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 임의의 적합한 양으로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.4mM 이상, 0.6mM 이상, 0.8mM 이상, 1 mM 이상, 1.2 mM 이상, 1.4 mM 이상 1.6 mM 이상, 1.8 mM 이상, 2 mM 이상, 3 mM 이상, 4 mM 이상, 5 mM 이상, 6 mM 이상, 7 mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상, 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 40mM 이상, 50mM 이상, 100mM 이상, 200mM 이상, 300mM 이상, 400mM 이상, 500mM 이상, 600mM 이상, 700mM 이상, 800mM 이상, 900mM 이상, 1000mM 이상, 또는 1500mM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 2000mM 이하, 1500mM 이하, 1000mM 이하, 900mM 이하, 800mM 이하, 700mM 이하, 600mM 이하, 500mM 이하, 450mM 이하, 400mM 이하, 350mM 이하, 300mM 이하, 250mM 이하, 200mM 이하, 150mM 이하, 100mM 이하, 50mM 이하, 45mM 이하, 40mM 이하, 35mM 이하, 30mM 이하, 25mM 이하, 20mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하, 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1.8mM 이하, 1.6mM 이하, 1.4mM 이하, 1.2mM 이하, 1mM 이하, 0.8mM 이하, 0.6mM 이하, 0.4mM 이하, 또는 0.2mM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 임의의 상기 언급된 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 0.1mM 내지 2000mM, 0.1mM 내지 1500mM, 0.1mM 내지 1000mM, 0.1mM 내지 500mM, 0.1mM 내지 250mM, 0.1mM 내지 100mM, 0.1mM 내지 50mM, 0.1mM 내지 10mM, 1mM 내지 2000mM, 1mM 내지 1500mM, 1mM 내지 1000mM, 1mM 내지 500mM, 1mM 내지 250mM, 1mM 내지 100mM, 1mM 내지 50mM, 1mM 내지 10mM, 10mM 내지 2000mM, 10mM 내지 1500mM, 10mM 내지 1000mM, 10mM 내지 500mM, 10mM 내지 250 mM, 10mM 내지 100mM, 10mM 내지 50mM, 100mM 내지 2000mM, 100mM 내지 1500mM, 100mM 내지 1000mM, 100mM 내지 500mM, 100mM 내지 250mM, 500mM 내지 2000mM, 500mM 내지 1500mM, 500mM 내지 1000mM., 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
추가적인 구체예에서, 무기 염은 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v), 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/w))로 약학적 제제에 존재한다. 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 0.1% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 또는 10% 이상의 농도로 약학적 제제에 존재한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 긴장성 변형제, 예를 들어 무기 염(들)은 0.1% 내지 1%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 10%, %, 1% 내지 2%, 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 2% 내지 10%, 3% 내지 10%, 4% 내지 10%, 5% 내지 10% 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 계면활성제가 약학적 제제에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소듐 데옥시콜레이트, 및 폴록사머 188 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 계면활성제는 임의의 적합한 양으로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v), 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/w))로 약학적 제제에 존재한다. 계면활성제는 0.01% 이상, 0.02% 이상, 0.03% 이상, 0.04% 이상, 0.05% 이상, 0.06% 이상, 0.07% 이상, 0.08%, % 이상, 0.09% 이상, 0.1% 이상, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상, 0.5% 이상, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.9 % 이상, 또는 1% 이상의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 계면활성제는 1% 이하, 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 또는 0.1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 계면활성제는 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 계면활성제는 0.01% 내지 1%, 0.01% 내지 0.1%, 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 0.1%, 0.1% 내지 1%, 0.1% 내지 0.5%, 0.2% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 아미노산이 약학적 제제에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산은 아르기닌, 글루탐산 또는 글루타메이트, 아스파라긴, 히스티딘, 및 글리신 중 하나 이상일 수 있다. 아미노산(들)은 임의의 적합한 양으로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 아미노산(들)은 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 또는 이상, 9mM 이상, 또는 10mM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 아미노산(들)은 약 100mM 이하, 90mM 이하, 80mM 이하, 70mM 이하, 60mM 이하, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 또는 10mM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 아미노산(들)은 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 아미노산(들)은 1mM 내지 10mM, 1mM 내지 50mM, 1mM 내지 100mM, 5mM 내지 50mM, 10mM 내지 50mM, 20mM 내지 50mM, 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 아미노산(들)은 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v); 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/w))로 약학적 제제에 존재한다. 아미노산(들)은 0.1% 이상, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상, 0.5% 이상, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.9% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 아미노산(들)은 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 아미노산(들)은 임의의 상기 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 아미노산(들)은 0.1% 내지 10%, 0.2% 내지 10%, 0.5% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 2%, 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 1%, 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 중합체 또는 중합체 화합물이 약학적 제제에 존재할 수 있다. 중합체 또는 중합체 화합물은 예를 들어 단백질, 다당류, 히드로겔, 또는 많은 것이 관련 업계에 공지된 임의의 다른 적합한 중합체 또는 중합체 화합물일 수 있다. 예를 들어, 중합체 또는 중합체 화합물은 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA), 혈청 알부민(SA), 젤라틴, 히드록시에틸 전분(HES), 키토산, 덱스트란(DEX70K, DEX40K) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP40K)일 수 있다.
중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 임의의 적합한 양으로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v); 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/w))로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 0.1% 이상, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상, 0.5% 이상, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.9% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 중합체(들) 또는 중합체 화합물(들)은 0.1% 내지 10%, 0.2% 내지 10%, 0.5% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 2%, 0.2% 내지 2%, 0.5 내지 2%, 0.1% 내지 1%, 0.2% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 킬레이트제가 약학적 제제에 존재할 수 있다. 킬레이트제는 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 아미드옥심 화합물(AOX) 및/또는 디티오트레이톨(DTT)일 수 있다. 킬레이트제는 임의의 적합한 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 킬레이트제는 10μM 이상, 20μM 이상, 30μM 이상, 40μM 이상, 50μM 이상, 60μM 이상, 70μM 이상, 80μM 이상, 90 μM 이상, 100 μM 이상, 120 μM 이상, 또는 150 μM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 킬레이트제는 500 μM 이하, 400 μM 이하, 300 μM 이하, 200 μM 이하, 150 μM 이하, 140 μM 이하, 130μM 이하, 120μM 이하, 110μM 이하, 100μM 이하, 80μM 이하, 70μM 이하, 60μM 이하, 또는 50μM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 킬레이트제는 임의의 전술한 종말점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 킬레이트제는 10μM 내지 500μM, 10μM 내지 200μM, 10μM 내지 150μM, 10μM 내지 100μM, 50μM 내지 500μM, 50μM 내지 200μM, 50μM 내지 150μM, 50μM 내지 100μM, 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 당이 약학적 제제에 존재할 수 있다. 당은 예를 들어 수크로스, 트레할로스, 만노스, 및 락토스 중 하나 이상일 수 있다. 당(들)은 임의의 적합한 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 당(들)은 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.4mM 이상, 0.6mM 이상, 0.8mM 이상, 1mM 이상, 1.2mM 이상, 1.4mM 이상 1.6mM 이상 1.8mM 이상, 2mM 이상 3mM 이상 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상, 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 40mM 이상, 50mM 이상, 60mM 이상, 70mM 이상, 80mM 이상, 90mM 이상, 또는 100mM 또는 이상, 200mM 이상, 300mM 이상, 400mM 이상, 500mM 이상, 600mM 이상, 700mM 이상, 800mM 이상, 900mM 이상, 1000mM 이상, 또는 1500mM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 당(들)은 2000mM 이하, 1500mM 이하, 1000mM 이하, 900mM 이하, 800mM 이하, 700mM 또는 이하, 600mM 이하, 500mM 이하, 450mM 이하, 400mM 이하, 350mM 이하, 300mM 이하, 250mM 이하, 200mM 이하, 150mM 이하, 100mM 이하, 50mM 이하, 45mM 이하, 40mM 이하, 35mM 이하, 30mM 이하, 25mM 이하, 20mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하, 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1.8mM 이하, 1.6mM 이하, 1.4mM 이하, 1.2mM 이하, 1mM 이하, 0.8mM 이하, 0.6mM 이하, 0.4mM 이하, 또는 0.2mM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 당(들)은 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 당(들)은 0.1mM 내지 2000mM, 0.1mM 내지 1500mM, 0.1mM 내지 1000mM, 0.1mM 내지 500mM, 0.1mM 내지 250mM, 0.1mM 내지 100mM, 0.1 내지 50mM, 0.1mM 내지 10mM, 1mM 내지 2000mM, 1mM 내지 1500mM, 1mM 내지 1000mM, 1mM 내지 500mM, 1mM 내지 250mM, 1mM 내지 100 mM, 1mM 내지 50mM, 1mM 내지 10mM, 10mM 내지 2000mM, 10mM 내지 1500mM, 10mM 내지 1000mM, 10mM 내지 500mM, 10mM 내지 250mM, 10mM 내지 100mM, 10 mM 내지 50mM, 100mM 내지 2000mM, 100mM 내지 1500mM, 100mM 내지 1000mM, 100mM 내지 500mM, 100mM 내지 250mM, 500mM 내지 2000mM, 500mM 내지 1500mM, 500mM 내지 1000mM, 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
다른 구체예에서, 당(들)은 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v), 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트( % W w))의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재한다. 당(들)은 0.1% 이상, 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 또는 이상, 40% 이상의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 당(들)은 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 당(들)은 임의의 상기 종점에 의해 제한되는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 당(들)은 0.1% 내지 50%, 1% 내지 50%, 10% 내지 50%, 0.1% 내지 20%, 1% 내지 20%, 10% 내지 20%, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 폴리올이 약학적 제제에 존재할 수 있다. 폴리올은 예를 들어 소르비톨 및/또는 만니톨일 수 있다. 폴리올은 임의의 적합한 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 폴리올은 0.1mM 이상, 1mM 이상, 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 40mM 이상, 50mM 이상, 60mM 이상, 70mM 이상, 80mM 이상, 90mM 이상, 100mM 이상, 120mM 이상, 140mM 이상, 160mM 이상, 180mM 이상, 200mM 이상, 250mM 이상, 300mM 이상, 350mM 이상, 400mM 이상, 450mM 이상, 또는 500mM 이상의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 폴리올은 1000mM 이하, 500mM 이하, 450mM 이하, 400mM 이하, 350mM 이하, 300mM 이하, 250mM 이하, 250mM 이하, 200mM 이하, 180mM 이하, 160mM 이하, 140mM 이하, 120mM 이하, 100mM 이하, 90mM 이하, 80mM 이하, 70mM 이하, 60 mM 이하, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 10mM 이하, 또는 1mM 이하의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 폴리올은 임의의 상기 종점에 의해 경계가 정해진 범위 내의 임의의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리올은 0.1mM 내지 1000mM, 0.1mM 내지 500mM, 0.1mM 내지 100mM, 1mM 내지 1000mM, 1mM 내지 500mM, 1mM 내지 100mM, 100mM 내지 1000mM, 100mM 내지 500mM, 등의 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리올은 퍼센트 농도(예를 들어, 부피/부피 퍼센트(% v/v), 중량/부피 퍼센트(% w/v), 또는 중량/중량 퍼센트(% w/v))로 약학적 제제에 존재한다. 폴리올은 0.1% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 폴리올은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 폴리올은 임의의 전술한 종점에 의해 경계를 이루는 범위 내의 임의의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리올은 0.1% 내지 50%, 1% 내지 50%, 5% 내지 50%, 10% 내지 50%, 15% 내지 50%, 0.1% 내지 25%, 1% 내지 25%, 5% 내지 25%, 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 0.1% 내지 15%, 1% 내지 15%, 5% 내지 15%, 10% 내지 15%, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 5% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 5%, 등의 퍼센트 농도로 약학적 제제에 존재할 수 있다.
일 구체예에서, 약학적 제제는 본 발명의 인플루엔자 바이러스, 0.5 M 수크로스, 0.1 M 또는 0.5 M 만노스, 0.3 M 또는 0.5 M 트레할로스, 50% SPG, 및 0.05% 폴리소르베이트-20을 포함한다. 또다른 구체예에서, 약학적 제제는 본 발명의 인플루엔자 바이러스, 0.5M 수크로스, 0.3M 트레할로스, 및 0.05% 폴리소르베이트-20을 포함한다.
적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 구성요소를 결합시키는 역할을 하는 성분일 수 있다(예를 들어, 결합제). 결합제는 단백질(예를 들어, 젤라틴), 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈), 및/또는 다당류 또는 이들의 유도체(예를 들어, 전분 및 셀룰로오스)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 부피를 증가시키는 성분(예를 들어, 증량제, 희석제, 및/또는 충전제)일 수 있다. 이러한 증량제는 다당류 또는 이의 유도체, 당, 및/또는 무기 화합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 맛 및/또는 외관을 향상시키는 성분일 수 있다(예를 들어, 향미제, 감미료 및/또는 착색제). 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 액체 또는 가스(예를 들어, 흡착제)를 흡수 또는 흡착함으로써 약학적 제제를 방습하는 성분일 수 있다. 흡착제는 전분, 인산칼슘 및/또는 콜로이드성 이산화규소를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 용해를 촉진하는 성분(예: 붕해제), 예를 들어 전분, 셀룰로오스 및/또는 관련 업계에 공지된 임의의 다른 중합체, 또는 이의 유도체(예: 가교결합된 폴리비닐피롤리돈 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스)일 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 입자간 접착을 감소시키고/시키거나 약학적 제제의 제조시에 및 제조 중에 생성물 흐름을 최적화하는 성분이다(예를 들어, 활택제). 활택제의 예는 활석, 콜로이드성 이산화규소, 및 옥수수 전분을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 약학적 제제의 제조시에 및 제조 중에 성분 및 예를 들어 펀치 면 또는 윤활제 사이의 접착을 감소시키는 것과 같은 비-점착 특성을 제공하는 성분(예를 들어, 부착 방지제)일 수 있는데, 특히 약학적 제제가 경구 제제로 제형화되는 경우에 그러하다. 예를 들어, 부착 방지제는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 성분의 덩어리를 감소시키고/시키거나, 예를 들어 약학적 제제, 즉 경구 제제로서 제제화된 약학적 제제의 표면과 제조 동안 다이 벽 사이의 마찰을 감소시키는 성분일 수 있다(예를 들어, 윤활제). 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 식물성 오일, 광유, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 소듐 라우릴 설페이트와 같은 수용성 또는 수불용성 윤활제 둘 모두가 특정 구체예에 따라 사용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 코팅제로서 작용하는 성분일 수 있다. 코팅제는 젤라틴 및/또는 셀룰로스계 코팅제(예를 들어, 히드록시프로필 메틸셀룰로스)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 적합한 결합제, 향미제, 감미료, 착색제, 붕해제, 활택제, 부착방지제, 윤활제, 및 코팅제는 관련 업계에 잘 알려져 있고 쉽게 식별할 수 있다.
약학적 제제는 치료제(예를 들어, 화학요법제 또는 항염증제)를 추가로 포함할 수 있다. 약학적 제제는 또한 인플루엔자 바이러스와 별개로 면역 반응을 유발하는 약물을 포함할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스 이외의 이러한 추가 성분은 임의의 적합한 양(들)으로 존재할 수 있다.
추가 성분은 면역계에 제시되기 전에 다른 성분과 혼합되어 약학적 제제를 형성할 수 있다. 추가 성분은 또한 약학적 제제와 별도로 면역계에 제공될 수 있다. 예를 들어, 추가 성분 및 약학적 제제는 면역계에 별도로 제시될 수 있다(예를 들어, 유기체에 투여됨). 추가 성분 및 약학적 제제가 별도로 투여되는 경우, 추가 성분 및 약학적 제제는 면역화되는 유기체의 동일한 부위에 투여될 수 있다.
약학적 제제의 일 구체예에서, 약학적 제제는 바이러스 백신이다. 바이러스 백신은 생, 약독화 바이러스 백신 또는 불활성화 바이러스 백신(예: 전체 바이러스 백신, 분할 바이러스 백신 또는 서브유닛 백신)일 수 있다. 바이러스 백신은 1가 백신, 2가 백신, 3가 백신, 또는 4가 백신으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 백신은 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 다중 구체예를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 백신은 본 발명의 인플루엔자 바이러스와 상이한 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스를 추가로 포함할 수 있다.
바이러스 백신은 임의의 적절한 투여 수단을 위한 조성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 백신은 경구 제제(예: 캡슐, 정제, 또는 경구 필름), 스프레이(예: 비강 스프레이), 또는 비강내 투여, 또는 비경구 투여(예: 정맥내 투여, 근육내, 또는 피하 투여, 예컨대 수성 또는 비수성 에멀젼, 용액, 또는 현탁액)에 적합한 임의의 조성물로 제제화될 수 있다.
면역 반응을 유도하는 방법
본 발명은 본 발명의 인플루엔자 바이러스를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 단백질, 즉, 선택된 아미노산, 즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 PB1 단백질, PB2 단백질, PA 단백질, NP 단백질, 및 NS1 단백질을 각각 코딩하는 PB1 유전자 절편, PB2 유전자 절편, PA 유전자 절편, NP 유전자 절편, 및 NS 유전자 절편을 포함한다.
포유동물은, 예를 들어, 인간 또는 영장류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 제제 (예를 들어, 백신 또는 다른 면역원성 조성물)로 투여된다. 약학적 제제는 비강내 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 약학적 제제는 근육내 투여된다. 약학적 제제는 또한 피하 또는 경구 투여될 수 있다.
약학적 제제, 예를 들어, 바이러스 백신의 투여 요법은 포유동물의 연령, 체중, 성별, 및 병력에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 인간에 대한 약독화된 바이러스 백신의 단일 용량은 약 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012, 또는 상기 값 중 2개 사이의 임의의 범위의 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 입자 형성 단위(PFU), 초점 형성 단위(FFU), 또는 TCID50를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 인플루엔자 바이러스를 예방 또는 치료하기 위한 요법은 단일 치료로서 약학적 제제를 투여하는 것을 포함한다. 약학적 제제는 또한 1회 이상 투여될 수 있으며, 예를 들어, 투여 요법은 부스터 용량을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 제제의 추가 용량은 초기 투여 후 7일 이상, 예를 들어, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 3주 이상, 4주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상, 4년 이상, 또는 5년 이상 범위의 주기로 투여할 수 있다.
구체예
본 발명은 다음의 구체예를 제공한다:
(1) PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편을 포함하는 인플루엔자 바이러스로서,
(a) PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신 및 위치 180에서 트립토판, 및 위치 464에서 아스파라긴 또는 위치 607에서 세린 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 PB1 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(b) PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린, 및 선택적으로 위치 467에서 이소류신 및 위치 529에서 발린을 포함하고, 여기서 PB2 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(c) PA 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PA 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 401에서 라이신을 포함하고, PA 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(d) NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신을 포함하고, 및 위치 294에서 라이신 또는 위치 311에서 아르기닌 중 적어도 하나를 포함하고; 및
(e) NS 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 30에 프롤린 및 위치 118에 리신을 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(2) 구체예 (1)에 있어서,
(a) PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 및 위치 464에서 아스파라긴이고, 여기서 PB1 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(b) PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린이고, PB2 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(c) NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신 및 위치 294에서 라이신인 것인 인플루엔자 바이러스.
(3) 구체예 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 인플루엔자 바이러스.
(4) 구체예 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 인플루엔자 바이러스.
(5) 구체예 (1) 내지 (4) 중 어느 하나한 항에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(6) 구체예 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(7) 구체예 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
(8) 구체예 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스의 M2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
(9) 구체예 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스이고, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 B 바이러스의 BM2 이온채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
(10) 구체예 (1)에 있어서,
(a) PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 및 위치 607에서 세린이고, 여기서 PB1 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
(b) PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린, 위치 467에서 이소류신 및 위치 529에서 발린이고, 여기서 PB2 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고; 및
(c) NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신 및 위치 311에서 아르기닌인 것인 인플루엔자 바이러스.
(11) 구체예 (1) 또는 (10)에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 것인인플루엔자 바이러스.
(12) 구체예 (1), (10), 및 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB2 유전자 절편은 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 플루엔자 바이러스.
(13) 구체예 (1) 및 (10) 내지 (12) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가지는 것인 인플루엔자 바이러스.
(14) 구체예 (1) 및 구체예 10 내지 구체예 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(15) 구체예 (1) 및 (10) 내지 (14) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB2 유전자 절편은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(16) 구체예 (1) 및 (10) 내지 (15) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(17) 구체예 (1) 및 (10) 내지 (16) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 Vero 세포주에서 바이러스의 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1, PB2, 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
(18) 구체예 (1) 및 (10) 내지 (17) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스의 M2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 적어도 PB1, PB2, 및 NP 단백질에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
(19) 구체예 (1) 내지 (18) 중 어느 한 항에 있어서, PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(20) 구체예 (1) 내지 (19) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 재조합 인플루엔자 바이러스인 것인 인플루엔자 바이러스.
(21) 구체예 (1) 내지 (20) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 NA 유전자 절편 및 HA 유전자 절편을 더 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(22) 구체예 (21)에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 HA1에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(23) 구체예 (21) 또는 (22)에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 HA2에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(24) 구체예 (23)에 있어서, HA2의 적어도 하나의 아미노산 돌연변이가 위치 107에서의 아스파라긴인 것인 인플루엔자 바이러스.
(25) 구체예 (21) 내지 (24) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 단일 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
(26) 구체예 (25)에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
(27) 구체예 (25) 또는 (26)에 있어서, 상기 NA 유전자 절편이 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
(28) 구체예 (1) 내지 (27) 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 M 유전자 절편을 더 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
(29) 구체예 (28)에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 기능성 M2 단백질을 코딩하지 않는 것인 인플루엔자 바이러스.
(30) 구체예 (1) 내지 (29) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 세포에서 복제할 수 있는 것인 인플루엔자 바이러스.
(31) 구체예 (1) 내지 (30) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 동일한 조건 하에 Vero 세포에서 선택된 아미노산이 없는 것을 제외하고는 동일한 인플루엔자 바이러스와 비교하여 성장이 증진된 것인 인플루엔자 바이러스.
(32) 구체예 (1) 내지 (32) 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 약학적 제제.
(33) 구체예 (32)에 있어서, 약학적 제제가 백신인 것인 약학적 제제.
(34) 구체예 (33)에 있어서, 상기 백신이 1가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
(39) 구체예 (33)에 있어서, 상기 백신이 2가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
(40) 구체예 (33)에 있어서, 상기 백신이 3가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
(41) 구체예 (33)에 있어서, 제33항에 있어서, 백신이 4가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
(42) 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 구체예 (1) 내지 (31) 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스 또는 구체예 (32) 내지 (41) 중 어느 한 항의 약학적 제제를 포유동물에게 투여하여 그 포유동물 내에서 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 방법.
(43) 구체예 (42)에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 것인 방법.
(44) 구체예 (1) 내지 (31) 중 어느 한 항에 있어서, Vero 세포주에서 인플루엔자 바이러스를 연속적으로 계대하는 것을 포함하는 것인 방법.
실 시 예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 그 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실 시 예 1
이 실시예는 Vero 세포에서 서로 다른 백본을 가진 바이러스의 성장을 비교한다.
인플루엔자 A 균주 A/Puerto Rico/8/1934("PR8")로부터 유도된 돌연변이된 백본 유전자 절편을 포함하는 것으로서 Ping et al., Nature Communications, 6: 8148 (2015)에 기술되어 있는, 고수율 PR8 ("PR8-HY")백본을 사용하여, 계절성 백신에 있는 2개의 인플루엔자 A 아형을 나타내는 2개의 다른 인플루엔자 바이러스: A/Massachusetts/15/2013(MA15, H1N1) 및 A/Brisbane/10/2007(Bris10, H3N2)로부터 HA 및 NA를 코딩하는 M2SR 바이러스를 생성하였었다.
구체적으로, 이들 바이러스로부터의 HA 및 NA 유전자 절편을 코딩하는 cDNA를 PR8-HY 백본 유전자 절편 및 M2SR M 유전자 절편(서열번호 11)을 코딩하는 cDNA와 함께 형질감염시켰다. MA15로부터 유래된 HA는 실시예 8에 기재된 바와 같이 Vero-adapted(MA15V)였다. 생성된 2개의 바이러스는 HY-M2SR-MA15V 및 Bris10 M2SR-HY였다. 바이러스는 본원에 기술된 바와 같이 표준 바이러스 구조 기술에 의해 생성되었고, M2를 안정적으로 발현하는 MDCK 세포(즉, M2CK 세포)에서 증폭되었다.
인플루엔자 PR8-HY 백본으로부터에서 인플루엔자 A 바이러스 RNA(vRNA) 절편, 즉 PB1, PB2, PA, NP, NS vRNA 절편, 및 전체 M2 오픈 리딩 프레임(ORF)이 없는 M vRNA 절편, 뿐만 아니라 인플루엔자 A/Brisbane/10/2007(Bris10, H3N2) 또는 A/Massachusetts/15/2013(MA15V)의 HA 및 NA vRNA 절편을 RNA 폴리메라제 I 발현 카세트에 클로닝하였다(Sarawar et al., Vaccine, 34:5090-5098(2016) 및 Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9345-9350 (1999)). 생성된 플라스미드를 바이러스 폴리메라제 서브유닛 및 NP 발현 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질감염시키고, 상청액으로 방출된 바이러스를 M2CK 세포에서 증폭시켰다.
Ping et al., Nature Communications, 6: 8148(2015)에도 기술된 PR8-HY 백본 및 원래의 고성장("HG") M2SR 백본(즉, "UW-PR8 백본")을 갖는 인플루엔자 바이러스의 성장을 M2 Vero 세포에서 비교하였다. 비교를 위한 이들 바이러스의 성장을 조사하기 위해 6cm 접시에 있는 M2VeroA 세포 단층을 표준 절차를 사용하여 MOI 0.001에서 각 바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포를 35℃에서 5일 동안 인큐베이트하였다. 매일 상청액에서 분취액을 채취하고 Reed and Muench 방법(Reed & Muench, Am. J. Hygiene, 27: 493-497 (1938))을 사용하여 바이러스 역가(virus titer)를 TCID50으로 결정하였다.
그 결과를 도 1a 및 도1b에 성장 곡선으로 나타내었다. 이들 결과는 HY-M2SR-MA15V나 Bris10 M2SR-HY가 M2VeroA 세포에서 UW-PR8 백본보다 더 잘 성장하지 않았음을 보여주며, 이는 PR8-HY 백본이 Vero 세포에서 바이러스 성장을 향상시키지 않는다는 것을 나타낸다.
H3N2 바이러스(즉, Bris10 M2SR-HY 및 Bris10 M2SR-HG)가 H1N1 바이러스(즉, HY-M2SR-MA15V 및 HG-M2SR-MA15)보다 더 높은 역가로 성장하는 것으로 관찰되었기 때문에, PR8-HY 및 UW-PR8 백본이 HA 역가의 차이를 나타내는지를 결정하기 위해 H3N2 바이러스의 상청액이 혈구응집(HA) 어세이에 의해 평가되었다. 도 1c에 도시된 바와 같이, Bris10 M2SR-HY의 HA 역가는 Bris10 M2SR-HG의 역가보다 낮았으며, 이는 PR8-HY 백본이 Vero 세포에서 바이러스 성장을 향상시키지 않는다는 것을 추가로 시사하는 것이다.
HY-M2SR-MA15V 및 Bris10 M2SR-HY가 특이치가 아니라 H1N1 및 H3N2 아형을 갖는 다른 바이러스를 대표한다는 것을 확인하기 위해 추가 균주를 사용하여 PR8-HY 및 UW-PR8 백본을 갖는 M2SR 바이러스를 생성했다. 그런 다음, 이들 바이러스는 본원에 기술된 HY-M2SR-MA15V 및 Bris10 M2SR-HY 바이러스의 성장을 조사하기 위한 동일한 방법을 사용하여 성장에 대해 테스트하였다. 표 1은 테스트한 모든 균주의 요약을 인용한다.
표 1. HG(UW-PR8) 백본 대 HY(PR8-HY) 백본
Figure pct00001
표 1에 제시된 결과에서 명백한 바와 같이, PR8-HY 백본은 H1N1, H3N2, 및 H5N1 바이러스 균주에 대한 UW-PR8 백본과 비교하여 Vero 세포에서 바이러스 성장을 향상시키지 않는다. 이러한 결과는 또한 PR8-HY 백본이 인플루엔자 백신 생산에 적합한 백본이 아님을 보여준다.
실 시 예 2
이 실시예는 Vero 세포에서 성장을 강화할 수 있는 바이러스의 생성을 보여준다. 이러한 바이러스를 생성하기 위해 A/Massachusetts/15/2013에서 파생된 NA 및 Vero-적응된 HA(즉, MA15V M2SR 바이러스) 또는 A/California/07/2009에서 파생된 NA 및 HA(즉, CA07 M2SR 바이러스)을 포함하고 PR8-HY 백본을 포함하는(즉, HY-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-CA07) 두가지 M2SR 바이러스를 M2VeroA 세포에서 연속적으로 계대하였다.
바이러스를 10배 연속 희석하고 표준 인플루엔자 바이러스 기술을 사용하여 TC-6 플레이트의 M2VeroA 세포에 흡착시켰다. 그러나 바이러스 감염 전에 세포 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. 35℃에서 60분 동안 흡착시킨 후, 트립신/TPCK를 함유하는 바이러스 성장 배지를 첨가하였다. 배양물을 35℃에서 4-7일 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액은 세포변성(cytopathic) 효과 및 HA 활성을 나타내는 최고 희석 웰에서 수확되었다. 세포변성 효과(CPE)는 라운딩(rounding) 또는 기타 구조적 변화를 감지하기 위해 광학 현미경의 저배율에서 단층의 육안 검사에 의해 결정되었다. HA 활성은 WHO 매뉴얼(인플루엔자의 실험실 진단 및 바이러스학적 감시를 위한 매뉴얼, 2011)에 설명된 대로 표준 혈구응집 어세이에 의해 결정되었다. 50 μL의 0.5% 칠면조 적혈구 현탁액(Innovative Research, Novi, MN)을 배양 상청액의 연속 2배 희석액에 첨가한 다음 실온에서 30분 인큐베이션 후 혈구 응집을 평가했다. 적혈구를 응집시킨 배양 상청액의 최고 희석액의 역수를 해당 샘플에 대한 HA 역가로서 기록했다.
수확 상청액을 다시 연속 희석하여 신선한 M2VeroA 단층을 감염시키는 데 사용했다. 계대 이력은 표 2에 나와 있다.
표 2. FGHY-1 및 FGHY-2를 생성하기 위한 HY-M2SR-MA15 및 HY-M2SR-CA07의 계대 이력
Figure pct00002
계대 수가 증가함에 따라 바이러스는 더 높은 희석도로 수확되었으며, 이는 바이러스가 Vero 세포에서 더 높은 역가로 성장하고 있음을 나타낸다. 따라서, 계대 5(p5) 바이러스가 실제로 시작(p0) 바이러스보다 더 높은 역가로 성장했는지 여부를 성장 곡선 연구에서 평가하기 위해 계대 5에서 프로세스를 중단했다.
p0 바이러스 및 (p5) 바이러스는 M2VeroA 세포의 성장 곡선에서 평가되었다. (p0) 바이러스는 HY-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-CA07 바이러스였다. (p5) 바이러스는 FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07 바이러스로 명명되었다. FGHY1 및 FGHY2는 구체적으로 p5 바이러스의 백본을 나타낸다.
성장 곡선을 평가하기 위해 세포 단층을 MOI=0.001에서 감염시키고 35℃ CO2 인큐베이터에서 6일 동안 인큐베이션했다. TCID50 어세이를 사용한 바이러스 역가 결정을 위해 분취량을 매일 취했다. 결과적인 성장 곡선은 도 2에 도시되어 있다. 도 2에 점선으로 도시된 바와 같이, 계대 5(p5) 바이러스는 출발(p0) 바이러스보다 더 높은 바이러스 역가 및 더 빠른 성장 속도론(kinetics)을 보여주었다.
실 시 예 3
이 실시예는 실시예 2의 M2VeroA 세포에서 계대 5 바이러스(즉, FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07)와 관련된 증가된 성장 특성을 초래한 돌연변이를 확인한다.
HY-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-CA07을 실시예 2의 방법에 따라 연속 계대하였으며, 계대 6(p6) 바이러스, 즉 FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07에 대한 전체 바이러스 게놈 서열을 결정하였다. 구체적으로, 바이러스 감염 세포의 상청액에서 Macherey-Nagel, NucleoSpin® RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하고, 다중-절편 역전사 반응으로 바이러스 게놈의 8개 절편 모두를 증폭하는 12개 염기쌍 범용 프라이머로 cDNA를 생성했으며, 이후 Hoffmann et al., Arch. Virol., 146: 2275-2289 (2001)에 개시된 프라이머를 이용하여 인플루엔자 유전자를 증폭시켰다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 벌크 cDNA 서열을 얻었다. 얻은 cDNA 서열은, 동일하지 않은 잔기를 강조하기 위해 지정된 프로그램 매개변수를 사용하여 서열 비교 알고리즘을 사용하여 참조 서열의 역할을 하는 시작 플라스미드 서열에 정렬되었다. 표 3은 UW-PR8 백본 및 PR8-HY 백본과 비교하여 각 유전자에서 관찰된 아미노산 변화를 나타낸다.
표 3에서 보는 바와 같이 FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07 바이러스의 백본은 FGHY1 및 FGHY2 백본이 구별되도록 서로 다른 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, FGHY1은 PR8-HY 백본과 비교하여 아미노산 위치 464에서 PB1 단백질, 및 아미노산 위치 294에서 NP 단백질의 돌연변이를 포함하는 반면, FGHY2는 PR8-HY 백본과 비교하여 아미노산 부분 607에서 PB1 단백질, 아미노산 위치 467 및 529에서 PB2 단백질, 및 아미노산 위치 311에서 NP 단백질의 돌연변이를 포함한다.
표 3. 뉴클레오티드 및 아미노산 변화
Figure pct00003
FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07은 HA2에 Vero-적응된 돌연변이(Vero-adapted mutations)를 추가로 포함했다. 구체적으로, 실시예 8에 기재된 바와 같이, FGHY1-M2SR-MA15V는 HA2의 위치 107에 Vero-적응된 돌연변이를 포함하였고, 여기서 트레오닌은 아스파라긴으로 변경되었다. Vero-적응 HA-MA15V의 아미노산 서열은 서열번호 13이다. 연속 계대 후, FGHY2-M2SR-CA07은 표 6에 나타낸 바와 같이 HA의 위치 496에서 돌연변이를 발생시켰다.
FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-CA07 바이러스에서 관찰된 아미노산 변화가 고수율 특성을 부여하는지 확인하기 위해, FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-MA15V 바이러스를 본 명세서에 기재된 바이러스 구제 기술을 사용하여 재창조하였다.
구체적으로, 개별 백본 유전자는 관련 업계에 공지된 표준 분자 기술을 사용하여 pPolI 플라스미드 내로 클로닝되었다. 이들 유전자는 각각 서열번호 2 및 서열번호 1로 식별되는 HY-M2SR-MA15V p6의 PB1 및 NP 유전자(즉, FGHY-PB1 및 FGHY1-NP) 및 각각 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 3으로 식별되는 HY-M2SR-CA07의 PB1, PB2, 및 NP 유전자(즉, FGHY2-PB1, FGHY2-PB2 및 FGHY2-NP)를 포함하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 방법과 유사한 플라스미드-기반 인플루엔자 바이러스 구제 방법을 사용하여 M2SR 바이러스를 생성하였다. 바이러스는 HA-MA15V 및 NA-MA15를 추가로 포함하였다.
생성된 M2SR 바이러스(즉, FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-MA15V)는 M2VeroA 세포에서 성장 속도론(growth kinetics)에 대해 평가하였다. 비교 대상으로 표준 M2SR 백본(UW-PR8) 및 PR8-HY 바이러스(각각 HG-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-MA15V)를 사용했다. 6cm 접시에서 성장한 M2VeroA 세포는 0.001의 감염 다중도(MOI)에서 감염되었다. 트립신/TPCK(1㎍/mL)를 함유하는 바이러스 성장 배지를 첨가하고, 세포를 35℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 분취량을 매일 취하여 바이러스 역가가 결정될 때까지 -80℃에서 보관했다.
결과적인 성장 곡선은 도 3에 도시되어 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-MA15V는 HG-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-MA15V보다 빠르게 성장했다. FGHY1-M2SR-MA15V 및 FGHY2-M2SR-MA15V도 HG-M2SR-MA15V 및 HY-M2SR-MA15V보다 더 빨리 피크 역가에 도달하고 2-3일 앞서서 안정 상태에 도달했다. 이러한 결과는 계대된 바이러스(즉, FGHY1 및 FGHY2 백본을 가진 바이러스)에서 발견되는 아미노산 돌연변이가 높은 수율 특성을 부여하고 낮은 감염 다중도에서 M2VeroA 세포의 감염을 촉진한다는 것을 나타내는데, 이는 백신 제조에서 매우 바람직한 특성이다.
실 시 예 4
이 실시예는 FGHY1에 대한 PB1 및 NP 단백질과 FGHY2에 대한 PB1, PB2, 및 NP 단백질의 돌연변이가 HA 및 NA 아형과 무관하게 인플루엔자 바이러스의 높은 성장 특성을 부여하는 데 책임이 있음을 보여준다. 따라서 이 예는 FGHY1 및 FGHY2 백본이 계절성 및 판대믹성 인플루엔자 백신 생산을 위해 다른 인플루엔자 HA 및 NA로 업데이트될 수 있음을 보여준다.
계절성 인플루엔자 H3N2 HA 및 NA가 있는 M2SR 바이러스(A/Brisbane/10/2007)는 본원에 기술된 표준 인플루엔자 바이러스 구조 기술에 의해 생성되었다. 4개의 M2SR 바이러스, 즉 FGHY1-M2SR-Bris10 및 FGHY2-M2SR-Bris10 외에 비교자인 HY-M2SR-Bris10(PR8-HY 백본) 및 HG-M2SR-Bris10(UW-PR8 백본)이 생성되었다. 모든 바이러스는 H3N2 HA 및 NA 단백질을 발현했다. HA 및 NA 단백질은 Vero-adapted 돌연변이를 포함하지 않았다.
바이러스 성장 평가는 MOI=0.001에서 감염된 M2VeroA 세포에서 수행되었다. 분취량을 매일 수확하고, 바이러스 역가를 TCID50 어세이에 의해 결정하였다. 상청액은 또한 HA 생산을 평가하기 위해 혈구응집 어세이에 의해 평가되었다. 결과적인 성장 곡선은 각각 바이러스 역가 및 HA 역가에 대해 도 4a 및 4b에 도시되어 있다. 도 4a에 도시된 바와 같이, FGHY1-M2SR-Bris10 및 FGHY2-M2SR-Bris10 모두 HY-M2SR-Bris10 및 HG-M2SR-Bris10보다 더 빨리 더 높은 바이러스 역가로 성장했다. 또한, 도 4b에 도시된 바와 같이, FGHY1-M2SR-Bris10 및 FGHY2-M2SR-Bris10 모두 다른 두 바이러스에 비해 빠른 HA 역가 속도론을 보여주었다.
이러한 결과는 FGHY1 및 FGHY2 백본을 포함하는 바이러스가 HA 및 NA 표면 단백질의 아형에 관계없이 UW-PR8 또는 PR8-HY 백본을 포함하는 바이러스보다 빠르게 성장한다는 것을 보여준다. FGHY1 및 FGHY2 백본은 계절성 인플루엔자 A 바이러스 HA 및 NA를 보유한 바이러스가 감염성 바이러스 생산 및 HA 생산(즉, 생백신 또는 불활성화 백신) 모두를 위해 Vero 세포에서 더 빠르게 성장할 수 있도록 한다. FGHY1 및 FGHY2 백본은 또한 판데믹성 HA 및 NA를 보유한 바이러스가 Vero 세포에서 더 빠르게 성장할 수 있도록 한다.
M2SR 바이러스는 FGHY1 백본뿐만 아니라 여러 인플루엔자 A 아형, 즉 계절성(H1N1, H3N2) 및 판데믹성(H5N1)의 HA 및 NA를 포함하면서 생성되었다. MOI=0.001에서 앞서서 설명한 바와 같이 M2VeroA 세포에서 성장 연구를 수행했는데, 이는 UW-PR8, PR8-HY 및 FGHY1 백본을 포함하는 M2SR 바이러스를 비교한 것이다. 결과적인 성장 곡선은 각각 H1N1(MI45), H3N2(HK4801), 및 H5N1(avVN1203) 바이러스에 대한 5a, 5b, 및 5c에 도시되어 있다.
제시된 데이터에서 명백한 바와 같이, FGHY1 백본은 더 빠른 성장 속도론과 더 높은 역가를 나타내어 FGHY1 백본이 성장 이점을 제공하고 백신 생산에 사용하기에 적합함을 추가로 나타내는 것이다.
도 5a는 FGHY1-M2SR-MI45 바이러스와 FGHY1-M2SR-MI45V 바이러스, 즉 HA2의 위치 107에서 Vero-적응된 돌연변이를 추가로 포함하는 바이러스(여기서, 트레오닌은 아스파라긴으로 변경됨) 간의 비교를 추가로 도시한다. 따라서, 도 5a에 도시된 결과도 또한 HA 단백질에서 Vero-적응된 돌연변이가 본원에 기재된 백본의 향상된 성장 효과를 추가로 제공할 수 있음을 보여주는 것이다.
실 시 예 5
이 실시예는 UW-PR8 및 HY-PR8 백본을 포함하는 바이러스가 MDCK 세포에서 성장하는 반면, 그러한 바이러스는 Vero 세포에서 더 낮은 성장을 나타낸다는 것을 보여준다. 한편, FGHY1 백본을 포함하는 바이러스는 Vero 세포에서 더 높은 수율을 나타낸다.
도 6은 4일 동안 M2CK 및 M2VeroA 세포에서 성장한 상이한 백본(즉, UW-PR8, HY-PR8, 및 FGHY1)을 포함하는 M2SR 바이러스(즉, Bris 10(H3N2), HK4801(H3N2), MA15V(H1N1), 및 avVN1203(H5N1))의 바이러스 역가를 도시한다. 바이러스는 표준 인플루엔자 바이러스 구조 기술을 사용하여 생성되었고 실시예 1-4에 설명된 방법과 유사한 방법을 사용하여 평가되었다. 도 6에 제시된 데이터는 FGHY1 백본이 MDCK 세포와 비교하여 Vero 세포에서 계절성 및 판데믹성 독감 아형 바이러스의 성장을 구체적으로 지원한다는 것을 나타낸다.
유사하게, 표 4에 제시된 데이터는 FGHY1이 Vero 세포에서 여러 아형 바이러스의 성장을 향상시켜 MDCK 세포에서 생산된 역가에 더 가까운 역가를 생성한다는 것을 보여준다.
표 4. Vero 세포에서 바이러스 아형의 성장
Figure pct00004
참고: 1.50 log TCID50/mL는 검출 한계(1.67 log TCID50/mL) 미만의 바이러스 역가를 나타낸다.
이러한 결과는 FGHY1 백본의 돌연변이가 Vero 세포의 숙주 제한을 극복하여 Vero 세포가 백신 생산을 위해 MDCK 세포와 더 유사하게 행동할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6A
이 실시예는 FGHY1 및 FGHY2 백본의 유전적 안정성을 평가한다.
본원에 기재된 바이러스 구제 기술에 의해 생성된 HY-M2SR-MA15 및 HY-M2SR-CA07 바이러스는 M2CK 세포에서 2회 계대배양된 다음, M2VeroA 세포에서 각각 20회 및 9회 계대배양되었다. 각 계대에서, 이전 계대에서의 수확된 조직 배양 상청액을 1:10 내지 1:10,000,000으로 10배 연속 희석하고 M2VeroA 세포의 신선한 단층을 감염시키는 데 사용했다. 감염 후, 배양 상청액을 CPE 및 HA 역가에 대해 조사하였다. 감염 후 3일에서 7일 사이의 어느 곳에서나 CPE 및 HA 역가를 나타내는 최고 희석액으로부터 상청액을 수확했다. FGHY1-M2SR-MA15 및 FGHY2-M2SR-CA07은 Vero 세포의 계대 4에서 생성되었다.
계대 종료 시 전체 바이러스 게놈에 대해 뉴클레오티드 서열을 결정하고 Vero 세포에서 계대 4의 시작 서열과 비교했다(즉, FGHY1-M2SR-MA15 및 FGHY2-M2SR-CA07). 결과는 표 5 및 6에 나와 있다.
표 5. HY-M2SR-MA15
Figure pct00005
표 6. HY-M2SR-CA07
Figure pct00006
표 5에서 제시된 결과에서 명백한 바와 같이, M2VeroA 세포에서 16번의 추가 계대 후, HY-M2SR-MA15는 PB1 및 NP 단백질에서 동일한 아미노산 변화를 유지했다. NP 단백질은 아미노산 위치 50에서 하나의 추가 돌연변이, 즉 세린에서 아스파라긴으로의 돌연변이를 획득했다. 표 6에 제시된 결과로부터 명백한 바와 같이, M2VeroA 세포에서 5번의 추가 계대 후, HY-M2SR-CA07은 또한 출발 바이러스로서 PB1, PB2, 및 NP 단백질에서 동일한 돌연변이를 유지하였다. 이러한 결과는 FGHY1-M2SR 및 FGHY2-M2SR 백본이 M2VeroA 세포에서 안정적이므로 백신 백본으로 사용하기에 적합함을 보여준다.
실 시 예 6B
FGHY1 백본의 안정성을 추가로 입증하기 위해 Influenza A/Hong Kong/4801/2014 FGHY1 M2SR(H3N2)을 BM2Vero 세포에서 연속적으로 계대했다. BM2Vero 세포는 인플루엔자 BM2 단백질, 즉 인플루엔자 B 혈청형의 이온 채널 단백질을 발현하는 Vero 세포이다. BM2 단백질과 상호작용하는 A 바이러스에 대한 강력한 선택 압력이 예상되었지만 13 계대 후 바이러스 게놈의 서열이 결정되었다. 놀랍게도, 침묵하는 아미노산 돌연변이만이 관찰되었다. 표 7에 제시된 결과는 FGHY1 백본의 안정성을 추가로 예시한다.
표 7. BM2 Vero 세포에서 FGHY1-M2SR-HK4801 바이러스의 안정성
Figure pct00007
실 시 예 7
이 실시예는 M2SR-FGHY1 바이러스가 인간 세포에서 복제할 수 있어 Vero 세포의 향상된 성장이 종 특이적이지 않음을 보여준다.
원래의(original) M2SR 백본(UW-PR8)은 인간 개체(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02822105)에서 테스트되었으며 인간 세포에서 기능적임을 나타내는 면역 반응을 이끌어내는 것으로 나타났다. 따라서 원래 백본을 비교자(comparator)로 사용하여 M2SR-FGHY1이 인간 세포에서 복제할 수 있고 더 나아가 임상 후보로 생존할 수 있는지 여부를 결정했다.
테스트한 두 바이러스는 H3N2 인플루엔자 바이러스 A/Hong Kong/4801/2014(HK4801)의 HA 및 NA에 대해 코딩되었다. 두 바이러스, M2SR-Original-HK4801(Lot # B17A12YH1) 및 M2SR-FGHY1-HK4801(Lot # B17A23YH1)은 인간 폐 상피 세포주인 A549 세포(ATCC CCL-185)에서의 감염에 대해 WHO 인플루엔자 매뉴얼에 설명된 대로 감염된 세포 NP-효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 프로토콜을 사용하는 96웰 플레이트에서 테스트되었다.
감염 후 2일째에 세포를 항-NP 모노클로날 항체로 세포내 인플루엔자 핵단백질(NP)에 대해 염색하고 ELISA로 처리하여 TCID50 역가를 결정하였다. A549 역가를 M2CK 역가로 정규화하기 위해 각 바이러스에 대한 바이러스 역가를 얻기 위해 M2CK 세포에서 표준 TCID50 어세이를 수행했다. 표 8은 각 세포주에서의 각 바이러스에 대한 바이러스 역가와 두 세포주의 비율을 나타낸다. 두 바이러스의 비율은 유사하여 M2SR-FGHY1-HK4801이 M2SR-Original-HK4801과 유사한 인간 세포주에서 성장함을 나타낸다.
표 8. A549 및 M2CK 세포에서 M2SR-HK4801 바이러스의 바이러스 역가
Figure pct00008
실 시 예 8
이 예는 Vero 세포에서 야생형 바이러스를 계대하는 것이 HA 유전자 절편(예: H1N1pdm의 HA2 영역)에서 돌연변이를 획득함으로써 더 나은 바이러스 성장을 허용할 수 있음을 보여준다.
Influenza A/Massachusetts/15/2013(H1N1)(MA15)(예: 모 바이러스)는 International Reagent Resource(IRR, Catalog # FR-1319, Lot # 62525202)에서 입수했으며, Vero 세포에서 계대되고 MDCK 세포에서 증폭되었다. 계대 8의 조직 배양 상청액에서 바이러스 RNA를 추출하고, HA 및 NA 절편의 뉴클레오티드 및 해당 아미노산 서열을 결정했다. 계대 8로부터의 HA 서열은 위치 451(서열 번호 13)(즉, HA2에서 위치 107)의 아미노산인 모 바이러스로부터의 하나의 아미노산 변화를 포함하였다. 구체적으로 트레오닌은 아스파라긴으로 바뀌었다. 독립적인 웰에서 2개의 별도의 독립적인 계대는 동일한 적응 돌연변이를 초래했다.
MA15(MA15V)(서열번호 13)로부터의 이 Vero-적응된 HA2 돌연변이(서열번호 13)는 MI45(MI45V)로부터 유래된 Vero-적응된 HA와 관련하여 실시예 4에 기재된 돌연변이와 유사하다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 그러한 돌연변이는 Vero 세포에서 바이러스 성장을 촉진한다.
Vero 계대된 인플루엔자 HA(예: H1N1pdm HA)의 HA(예: HA2)의 다른 아미노산 변화는 더 낮은 pH에서 HA 단백질을 안정화시켜 바이러스가 Vero 세포로 감염되도록 돕는 것으로 나타났다. 예를 들어, Jin, and Chen, PLoS Pathog, 10(1): e1003831 (2014); Maurer-Stroh et al., PLoS Curr, 2: RRN1162 (2010); 및 Russier et al., PNAS, 113(6): 1636-1641 (2016). 참조. 따라서, 본원에 기술된 HA 돌연변이는 또한 더 낮은 pH에서 HA 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
도 7a는 Vero 적응 동안 출현한 H1N1 바이러스의 HA 단백질 아미노산 서열의 돌연변이를 나타내는 표이다. 구체적으로, 도 7a는 본 명세서에 기재된 MA15V(2013 Mass 15) 및 M145V(2015 MI45)로부터의 Vero-적응된 돌연변이를 도시한다. 도 7a의 표는 Vero 세포에서 6회 계대된 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 Vero-적응된 HA, 즉 A/Slovenia/2903/2015(2015 Slovenia), A/Lisboa/32/2015(2015 Lisboa), A/ Scotland/P2/2015(2015 Scotland), 및 A/Montana/50/2016(2016 Montana 50)를 추가적으로 묘사한다.
도 7b는 H3N2 바이러스(즉, A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016)에서 유래된 Vero-적응된 HA의 핵산 서열의 돌연변이 및 그에 따른 아미노산 서열의 돌연변이를 나타내는 표이다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 거기에 제시된 각 HA에 대한 가능한 아미노산 돌연변이는 다음과 같다: T176K, L210P, T219I, S221P, D241G, P243H, K407E, D435N, E459K, 및/또는 R472G. "임상" HA는 야생형 HA와 상관관계가 있다. V1 내지 V8로 명명된 HA은 다양한 계대에서 얻은 다양한 HA 서열과 상관관계가 있다. 음영 처리된 상자는 아미노산 돌연변이를 일으키는 뉴클레오티드 돌연변이를 나타낸다. 소스 열은 시작 바이러스의 계대 이력을 설명한다.
도 7c는 도 7b(즉, M2SR Sing2016 V5, M2SR Sing2016 V5 R2, 및 M2SR Sing2016 V6)에 도시된 바와 같이, M2VeroA 세포에서 상이한 HA 돌연변이를 포함하는 M2SR Sing2016 바이러스의 성장 곡선을 도시한다. 이 바이러스는 또한 FGHY1 백본을 포함했다. M2VeroA 세포 단층은 0.005의 MOI에서 각 바이러스로 감염되었다. 감염성 상청액을 표시된 시점에 수집하고, M2CK 세포에서 TCID50 어세이에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. Vero-적응된 돌연변이가 가장 많은 M2SR Sing2016(즉, M2SR Sing2016 V6)이 가장 높은 성장을 보였다.
실 시 예 9
이 예는 FGHY1-M2SR 바이러스가 생체 내(in vivo)에서 약독화됨을 보여준다.
7주령 BALB/c, 암컷 마우스를 다음 바이러스 돌연변이체 중 하나로 비강내 면역화시켰다: H1N1 FGHY1-M2SR, H3N2 FGHY1-M2SR(둘 모두 서열번호 11에 기재된 돌연변이체 M 절편를 함유함). 이들 돌연변이체는 마우스당 1 x106 TCID50의 용량으로 투여되었다. 마우스의 대조군에는 SPG가 주어졌다. 면역화 후 14일 동안 마우스의 체중 및 감염 증상의 변화를 관찰했다.
14일 기간 동안 FGHY1-M2SR 돌연변이체 또는 SPG 대조군으로 면역화된 마우스에서 감염 또는 체중 감소의 임상 증상이 관찰되지 않았다. 도 10은 면역화 후 마우스 체중 퍼센트 변화를 도시한다. 또한, 군들 간의 체중 변화는 14일 동안 비슷했다. 이러한 결과는 FGHY1-M2SR 바이러스가 마우스에서 약독화되고 병원성이 없음을 나타낸다.
실 시 예 10
한 종의 세포에서 성장 이점을 제공하는 백본은 숙주 제한을 표시하고 표적 숙주에서 항원을 복제 및/또는 생성하지 않을 것으로 예상할 수 있다. 그러나 이 실시예는 FGHY1-M2SR 바이러스의 항원 생산이 인간 세포주에 제한되지 않음을 보여준다.
하기 인간 세포주가 시험되었다: A549(ATCC# CCL-185) 인간 폐 암종; Calu-3(ATCC# HTB-55) 인간 폐 선암종; 및 MRC-5(ATCC# CCL-171) 인간 폐 섬유아세포. 이 세포주는 인간 호흡기에서 유래하였고 인플루엔자 백신 바이러스의 표적 기질을 나타낸다. 인플루엔자 바이러스의 성장에 사용된 대조군 세포주는 MDCK(Sigma# 84121903) 세포 및 Vero(ATCC# CCL-81) 세포였다.
세포를 감염 하루 전에 60mm 접시에 접종하고 다음 바이러스의 대략 MOI = 0.5로 면역화했다: UW-PR8("HG") 백본을 나타내는 Ori, FGHY1, 및 IVR-147, A/Puerto Rico/8/1934로부터의 백본 유전자 절편을 포함하는 CDC로부터의 복제 백신 재조합체 바이러스. 이러한 모든 바이러스는 A/Brisbane/10/2007의 HA 및 NA를 발현했다. 세포의 하위 집합은 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016의 HA 및 NA를 발현하는 Ori 및 FGHY1을 포함하는 바이러스로 감염되었다. 배양 배지는 35℃에서 바이러스 감염 후 1일 또는 2일 동안 10% FCS로 보충되었다. 배양 배지 및 배양 표면의 세포를 수확하고 10% 완충 포르말린으로 고정하였다. 세포를 BD Cytofix/Cytoperm 용액(BD, Cat # 554714)에서 투과시키고 인플루엔자 NP 단백질을 FITC 표지된 항-인플루엔자 A NP 마우스 모노클로날 항체(D67J, Invitrogen, Cat # MA1-7322)로 염색했다. 형광 강도는 BD LSRII로 측정하고 FlowJo 소프트웨어로 분석했다.
단일 세포 집단은 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A) 상에 게이트되었고, FITC 양성 및 음성 세포는 측면 산란 영역(SSC-A) 대 FITC 상에서 분리되었다. FITC 양성 세포는 바이러스 감염된 세포로 간주되며 FITC 강도의 세기는 세포에서 NP 발현의 양을 반영한다.
생성된 NP 발현 수준 데이터는 도 8a, 8b, 9a, 및 9b에 제시되어 있다.
도 8a 및 8b는 FGHY1 바이러스가 IVR-147 또는 HG 바이러스와 비교하여 상이한 세포주에서 유사한 수준의 NP를 발현함을 보여준다.
도 9a 및 9b는 FGHY1-M2SR 바이러스가 다른 바이러스와 비교하여 인간 세포주에서 높은 NP 수준을 발현하는 세포의 비율이 유사하거나 더 높음을 보여준다. 이러한 결과는 FGHY1 바이러스가 인간 세포주를 감염시키고 인플루엔자 항원을 생성할 수 있음을 입증한다. 따라서, FGHY1-M2SR 바이러스는 인간 개체에 투여될 때 면역을 유도할 것으로 예상된다.
실 시 예 11
이 실시예는 FGHY1-M2SR 백신이 숙주에 대한 독성 없이 반복 투여시 증가하는 생체내(in vivo) 항체 반응을 유도한다는 것을 입증한다.
A. 요약
FGHY1-M2SR 백신 바이러스가 숙주에 독성을 일으키지 않으면서 구성 요소에 대한 면역 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해 15마리의 수컷과 15마리의 암컷 흰담비에게 1 x 108 TCID50(저용량) 또는 1 x 109 TCID50(고용량)의 용량 수준에서 FGHY1-M2SR 백신으로 비강내 면역화했다. 제3군의 흰담비는 위약 대조군으로서 SPG를 사용하여 비강내로 모의 면역화시켰다. 각 치료 군에 대해 3회 용량 백신 접종 요법을 사용했다. 흰담비에게 1차 면역(연구 1일차) 및 13일 및 27일 후(연구 14일 및 28일) 2회 추가 면역 접종을 실시했다. 각 면역 접종 후 흰담비는 체중, 체온 및 임상 징후를 매일 측정하여 7일 동안 폐사율을 관찰했다. 연구 전 및 연구 14, 16, 30 및 49일에 모든 생존 흰담비로부터 임상 병리학을 평가하기 위해 혈액을 수집했다. 혈청 샘플을 연구 전 수집하고 연구 14, 30 및 49일에 ELISA, 혈구응집 억제(HAI) 어세이, 및 바이러스 중화(VN) 어세이에 의해 시간 경과에 따른 항체 수준을 평가했다. 연구 3일, 30일, 및 49일에 군당 5마리의 수컷과 5마리의 암컷에 대해 신체의 외부 표면, 모든 구멍, 두개골, 흉부 및 복막강, 및 그 내용물의 검사를 포함하여 부검을 수행했다.
B. 재료 및 방법
백신 바이러스 면역화. 흰담비는 1 x 108 TCID50의 용량 또는 1 x 109 TCID50의 용량으로 3회 용량의 H3N2 FGHY1-M2SR 백신으로 비강내 면역화하였다. 냉동 백신 바이러스 스톡의 바이알을 실온에서 10분 이상 해동한 다음 사용할 때까지 냉장 보관하거나 젖은 얼음 위에 보관했다. 흰담비를 케타민/자일라진으로 마취하고 바이러스 용량을 500μL(콧구멍당 250μL)의 부피로 비강 투여했다.
H3N2 FGHY1-M2SR 백신 바이러스는 인플루엔자 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)의 HA 및 NA 유전자를 코딩하는 기능적 M2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 A 바이러스이다. 인플루엔자 A 바이러스의 M 유전자 절편은 서열번호 11로 표시된다.
실험적 설계. 연구 시작 당시 16-22주령인 90마리의 흰담비(Triple F Farms, Sayre PA), 수컷 45마리와 암컷 45마리를 연구에 사용했다. 모든 동물 절차는 IIT 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 동물 생물학적 안전성 레벨 2 시설에서 수행되었다. 면역화에 앞서, 기저선 체온(baseline body temperatures)을 설정하기 위해 흰담비를 4일 동안 모니터링했다. 온도 판독값은 각 흰담비에 피하 이식된 트랜스폰더(BioMedic data systems, Seaford, DE)를 통해 매일 기록되었다. 연구 시작 전에 혈액을 수집하고 인플루엔자 항체에 대해 혈청을 테스트했다. 면역화 전 혈청 샘플을 수용체 파괴 효소(RDE)(Denka Seiken, Tokyo, Japan)로 처리하여 비특이적 억제제를 제거한 다음 연속 희석하여 정의된 양의 인플루엔자 A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2), B/Phuket/3073/2013(Yamagata 계통) 및 B/Colorado/06/2017(Victoria 계통) 바이러스에 대해 테스트하고 0.5% 칠면조 적혈구와 혼합했다. 항체 역가는 적혈구 응집의 억제를 초래하는 가장 낮은 혈청 희석도로 정의되었다. HAI 역가가 40 미만인 흰담비만이 혈청 음성으로 간주되어 이 연구에 사용되었다. 연구 동물을 무작위화하여 3개의 군(수컷 15마리 및 암컷 흰담비/군)으로 나누었다.
백신의 효능과 독성을 평가하기 위해 연구 1일, 14일, 및 28일에 H3N2 FGHY1-M2SR의 1 x 108 TCID50의 3회 용량 또는 1 x 109 TCID50의 3회 용량으로 흰담비를 비강내 면역화했다. 대조군은 연구 1일, 14일, 및 28일에 SPG로 비강내로 모의 면역화시켰다. 흰담비 체온, 체중, 및 임상 증상을 면역화 후 7일 동안 매일 모니터링했다. 연구일 -5, 14, 16, 30, 및 49일에 모든 생존 흰담비에서 임상 병리를 평가하기 위해 혈액을 수집했다. 혈청 샘플을 연구일 -5, 14, 30, 및 49일에 수집하고 ELISA, 바이러스 중화 어세이 및 HAI 어세이에 의한 항체 역가 측정까지 약 -70℃에서 보관했다. 모든 연구 동물을 예정된 날짜(3일, 30일 또는 49일, 군당 수컷 5마리 및 암컷 5마리)에 안락사시키고 부검했다. 부검은 신체의 외부 표면, 모든 구멍, 두개골, 흉부 및 복막강과 그 내용물의 검사로 이루어졌다. 조직을 수집하고, 고정하고, 보드 인증 수의병리학자가 조직병리학적으로 평가했다.
C. 결과
빈사 상태/사망률 및 임상 관찰: 모든 흰담비는 예정된 희생 날짜까지 생존했다. H3N2 FGHY1-M2SR을 투여받은 군에서 관찰된 가장 흔한 임상 징후는 설사였다; 그러나 SPG 대조군의 동물도 설사를 나타냈다. 모든 흰담비는 1-49일 동안 측정된 모든 시점에 대해 "0"(경계하고 놀기좋아함)의 활동 수준 점수를 가졌고 단, 20일에 "1"(경계하지만 자극시에만 놀기좋아함)의 점수를 받은 SPG 대조군의 수컷 한마리와 암컷 한마리는 예외였다.
체중 및 체중 변화: SPG 대조군과 비교하여 평균 체중 변화에서 통계적으로 유의한 차이가 일부 군에서 발생했지만, 이러한 차이는 무작위로 분포된 것으로 보였고 현저하지는 않았다.
체온: 일부 군에서 SPG 대조군과 비교하여 평균 체온의 통계적으로 유의한 증가 및 감소가 발생했지만, 이러한 차이는 무작위로 분포하는 것으로 나타났으며 현저하지는 않았다.
효소 결합 면역흡착 어세이(ELISA): 혈청 샘플의 항-HA IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 결정했다. ELISA 플레이트를 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)(Immune Technology Corp., New York, NY)의 재조합 HA 단백질로 코팅하고, 탈지유로 차단하고, 샘플을 적용했다. 흰담비 IgG 항체는 양고추냉이(horseradish) 과산화효소로 표지된 항-흰담비 IgG 염소 항체(SeraCare Life Sciences, Milford, MA) 및 1-StepTM Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific Inc., Maltham, MA) 기질에 의해 검출되었다.
혈청 데이터에서 생성된 항-H3 HA ELISA IgG 역가를 도 11에 나타내었다. 면역화된 군 각각에서의 흰담비는 혈청에서 항-H3 HA 항체의 유의한 상승을 보인 반면, SPG만 받은 동물의 항체 수준은 기저선에서 변경되지 않았다. 항-H3 HA 항체 역가는 초회 용량(prime dose) 후 2주에 SPG 대조군보다 면역화된 군에서 더 높았다. 면역화된 군당 평균 항체 역가는 백신의 제1회 및 제2회 투여 후에 추가로 증가했다.
혈구응집 억제(HAI) 분석: ELISA에 의해 검출된 항체의 기능적 활성을 보이기 위해, 혈청 샘플을 HAI 어세이로 분석하였다. 혈청 샘플을 RDE로 처리하여 비특이적 혈구응집 억제제를 제거했다. RDE는 제조업체의 지침에 따라 재구성되었다. 혈청을 RDE에서 1:3으로 희석하고 37℃±2℃ 수조에서 18-20시간 동안 인큐베이션했다. 동일한 부피의 2.5%(v/v) 시트르산나트륨을 첨가한 후 샘플을 56±2℃ 수조에서 30±5분 동안 인큐베이션했다. 0.85% NaCl로 구성된 용액을 RDE 처리 후 1:10의 최종 혈청 희석도로 각 샘플에 첨가했다. 이어서, 샘플을 PBS에서 2배(1:10 내지 1:1280) 희석하고 인플루엔자 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2) 바이러스의 4개의 혈구응집 단위와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 0.5% 조류 적혈구를 각 샘플에 첨가하고 30±5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혈구응집의 유무를 점수화하였다.
혈청 데이터에서 생성된 항-H3 HAI 역가는 도 12에 도시되어 있다. 고용량(1 x 109 TCID50) 군은 저용량(1 x 108 TCID50) 군보다 더 높은 HAI 역가를 나타내는 경향이 있다. SPG(대조군) 군은 HAI 역가를 유발하지 않았다. 1 x 109 TCID50에서 수컷 한 마리를 제외한 모든 H3N2 FGHY1-M2SR 면역화된 흰담비는 테스트 바이러스에 대해 80 HAI 역가와 같거나 더 높은 것으로 나타났다. CDC는 40의 혈청 HAI 항체 역가가 집단에서 인플루엔자 감염 또는 질병의 위험을 50% 이상 감소시키는 것과 관련이 있다고 말한다. 따라서 이러한 결과는 FGHY1-M2SR 바이러스가 보호 면역 반응을 유발할 수 있음을 시사한다.
바이러스 중화 어세이: 사전 연구 및 치료 단계의 혈청 샘플(연구 3, 14, 30 및 49일)을 바이러스 중화 어세이에서 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2) 인플루엔자 바이러스에 대해 테스트했다. 혈청 샘플은 56℃에서 30분 동안 비활성화하였다. 그런 다음 혈청을 연속적으로 2배 희석하고 표준화된 바이러스(80-140 PFU 농도)와 함께 37±2℃, 5.0±1% CO2에서 60분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 각 혈청 및 바이러스 혼합물 100 마이크로리터(100μL)를 MDCK 세포 단층을 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 그런 다음 플레이트(샘플 포함)를 37±2℃, 5.0±1% CO2에서 18-22시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 파라포름알데히드로 고정하고 항-인플루엔자 A 핵단백질 단일클론 항체 풀(1부 MAB8257: 1부 MAB8258(Millipore; Billerica, MA))에 이어 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG로 염색했다. 반점은 TrueBlue Peroxidase Substrate(Kirkegaard and Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)를 사용하여 현상하였다. 플라크를 시각화하고 ELISPOT 기기(AID GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 계산했다. 50% 플라크 감소 중화 역가(PRNT50)는 플라크를 계수하고 역가를 마지막 혈청 희석액의 역수로 보고하여 대조군 플라크의 역적정에 기초하여 입력 대조군 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내도록 함으로써 계산했다.
혈청 데이터에서 생성된 항-H3 PRNT50 역가를 도 13에 나타내었다. SPG 군 내의 모든 흰담비는 연구 기간 동안 음성(역가 ≤100)을 유지했다. 1 x 108 TCID50의 용량으로 H3N2 FGHY1-M2SR로 면역화된 흰담비는 14일, 30일 및 49일에 각각 1916, 1838 및 1970년의 기하 평균 역가(GMT) VN 역가를 가졌다. 1 x 109 TCID50의 용량으로 H3N2 FGHY1-M2SR로 면역화된 흰담비는 14일, 30일 및 49일에 각각 4434, 5572 및 6400의 GMT VN 역가를 가졌다. 혈청이 1:6400까지 희석되었기 때문에 6400보다 높은 PRNT50 역가는 구체적으로 측정되지 않았다. 1 x 109 TCID50에서 3회 용량의 H3N2 FGHY1-M2SR로 면역화된 모든 흰담비는 6400 이상의 PRNT50 역가를 나타냈다.
임상 병리학: 모든 생존 흰담비에 대해 임상 화학, 혈액학 및 응고 매개변수 분석을 위한 혈액 샘플은 사전 연구와 3, 14, 16, 30, 및 49일에 경정맥 또는 대정맥에서 수집하였다. 동물을 혈액 수집 전에 4-6시간 동안 금식시켰다. EDTA는 혈액학 샘플의 항응고제로 사용하였으며, 시트르산나트륨은 응고 샘플에 사용하였다. 임상 화학을 위한 샘플은 항응고제 없이 수집하였다. 소변 샘플은 부검 시 각 흰담비의 방광에서 직접 수집하였다.
연구 기간 동안 평가된 임상 화학 또는 혈액학 매개변수에 대해 치료 관련 또는 독성학적으로 유의한 발견은 관찰되지 않았다. 백신-처리군에서 관찰된 피브리노겐의 증가는 면역원성 물질 처리 후 "예상된 염증 반응"으로 간주되었다. 피브리노겐은 14일 및 21일 회복 기간 후에 대조군 수준으로 돌아갔으며 이는 이 효과가 급성이고 가역적임을 시사한다. 프로트롬빈 시간(PT)의 감소는 투여 중단 후 가역적이었다; 따라서, 이 효과는 최소한의 독성학적 중요성을 갖는 것으로 간주되었다.
총 부검 및 조직병리학: 군당 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷에 대해 연구 3일, 30일 및 49일에 총 부검 및 조직병리학을 수행했다. 1 x 108 TCID50의 용량으로 흰담비에 대한 H3N2 FGHY1-M2SR의 비강내 면역화는 3일 및 30일에 폐(혼합 세포 침윤물)에서 관찰된 현미경 소견과 함께 육안적 소견을 나타내지 않았다. 1 x 109 TCID50의 용량에서 3일 및 30일에 폐에서 육안 소견이 관찰되었고(색소침착, 어둡거나 얼룩덜룩) 현미경 소견이 폐(혼합 세포 침윤물)에서 관찰되었다. 3주 회복 후, 연구 49일째에 시험 품목과 관련된 육안적 병변은 관찰되지 않았다.
따라서 이 예는 H3N2 FGHY1-M2SR 백신 바이러스의 비강내 면역이 백신 접종된 숙주에서 퍼지지 않고 백신 관련 부작용(예: 체온 상승, 체중 감소, 또는 임상 징후)과 관련이 없음을 보여준다. 이러한 결과는 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스가 단일 투여 후 상동성 시험 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하며 반복 투여로 추가 증가될 수 있고 비강내 인플루엔자 백신으로 유용함을 나타낸다.
실 시 예 12
이 실시예는 FGHY1-M2SR 바이러스가 다가 백신으로 제제화된 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
인플루엔자 A H1N1 또는 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스는 1가, 2가, 3가, 또는 4가 백신으로 제제화될 때 항체 반응을 유발한다.
7주령 BALB/c 암컷 마우스(N=8)는 1가 H1N1 FGHY1-M2SR, 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 2가 H1N1 및 H3N2 FGHY1-M2MR, 3가 H1N1 및 H3N2 FGHY1-M2SR 및 BM2SR Victoria 또는 Yamagata, 또는 4가 H1N1 및 H3N2 FGHY1-M2SR 및 BM2SR Victoria 빅토리아 또는 Yamagata 백신으로 비강내 면역화되었다. 마우스의 대조군은 SPG로 모의 면역화되었다. 백신 접종 28일 후, 1차 면역화를 위해 투여된 동일한 백신으로 구성된 부스트 면역화로 마우스를 비강내 면역화시켰다. 혈청 샘플은 1차 면역화 후 7, 14, 및 21일째 및 부스트 면역화(28일째) 후 35, 42 및 49일째에 채취되었다. 혈청 샘플로부터의 항-H1 HA 및 항-H3 HA 혈청 IgG 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다.
생성된 항-H1 HA 데이터를 도 14a에 나타내었다. 결과적인 항-H3 HA 데이터를 도 14b에 나타내었다. 결과는 모든 백신이 항-인플루엔자 바이러스 항체를 SPG 대조군 이상으로 증가시킬 수 있었고 이러한 증가는 백신 제제 전반에 걸쳐 유사하다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 다가 백신으로 제제화될 때 1가 성분 사이에 간섭이 없음을 나타낸다.
실 시 예 13
이 실시예는 비강 투여된 1가 또는 4가 FGHY1-M2SR 백신이 백신에 포함되지 않은 치명적인 인플루엔자 A 바이러스로부터 마우스를 보호한다는 것을 보여준다.
실시예 12에 기재된 BALB/c 암컷 마우스에 인플루엔자 A/California/07/2009(H1N1) 바이러스의 치사 용량(>10 마우스 50% 치사 용량(MLD50))을 1차 면역화 후 70일(부스트 면역화 후 6주)에 챌린지했다. 1가 H1N1(인플루엔자 A/Montana/50/2016) 또는 H3N2(인플루엔자 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016) FGHY1-M2SR 및 4가 FGHY1-M2SR 및 BM2SR 백신으로 면역화된 모든 마우스는 챌린지에서 생존했다. 1가 H1N1 FGHY1-M2SR 및 4가 FGHY1-M2SR 및 BM2SR 백신으로 면역화된 마우스는 체중 감소 없이 건강하게 유지되었다. 결과적인 체중 감소 데이터는 도 15에 도시되어 있다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR로 면역화된 마우스는 일시적인 체중이 감소했지만 완전히 회복되었다. SPG만으로 모의 면역화된 대조군 마우스는 체중이 감소하고 챌린지 후 5일 이내에 감염에 굴복하였다. 챌린지 후 3일째에, 군당 3마리의 마우스로부터 폐를 수득하고, MDCK 세포에서 플라크 분석을 통해 바이러스 부하를 측정하였다. 표 9에 나타난 바와 같이, 1가 H1N1 FGHY1-M2SR 및 4가 백신으로 면역화된 마우스의 폐에서 바이러스 역가는 검출 한계 미만이었다(폐당 76 플라크 형성 단위(PFU) 미만). 바이러스 부하가 H3N2 FGHY1-M2SR(6.60 log PFU/g)로 면역화된 마우스에서 검출되었다. 그러나, 3마리의 마우스로부터의 평균 바이러스 역가는 순진한 대조군 SPG 마우스보다 약 1 log 낮았다(7.52 log PFU/g). 이러한 결과는 M2SR 1가 및 4가 백신이 교차 보호를 제공하고 백신 성분과 일치하지 않는 챌린지 바이러스의 복제를 제한함을 나타낸다.
표 9. 챌린지 후 3일, 폐에서 챌린지 바이러스 역가
Figure pct00009
실 시 예 14
이 실시예는 4가 FGHY1-M2SR이 허가된 비강내 인플루엔자 백신과 비교하여 유리한 안전성 프로파일을 제공할 뿐만 아니라 백신에 포함되지 않은 인플루엔자 바이러스에 대해 허가된 근육내 비활성화 인플루엔자 백신보다 우수한 보호를 제공함을 보여준다. 항원적으로 시프트된 1가 H3N2 FGHY1-M2SR 백신은 치명적인 인플루엔자 A 바이러스로부터 마우스를 보호하는 데 있어 항원적으로 일치한 허가 백신과 유사한 보호 기능을 제공한다.
7주령 BALB/c 암컷 마우스(N=13)를 다음 백신 중 하나로 면역화했다: 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY-M2SR, FluMist® 4가(AstraZeneca, Wilmington, DE), Fluzone® 4가(Sanofi, Bridgewater, NJ) 또는 Fluzone® High Dose(Sanofi). 각 백신에 대한 균주 성분은 표 10에 나와 있다. FGHY1-M2SR 및 FluMist는 비강 투여되는 반면 두 Fluzone 백신은 근육내 투여된다. 마우스의 대조군은 SPG로 비강내 모의 면역화되었다. 체중 변화에 대해 면역화 후 14일 동안 마우스를 관찰하였다.
표 10. 각 백신에 대한 균주 성분
Figure pct00010
결과적인 체중 감소 데이터는 도 16에 도시되어 있다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR, 4가 FGHY1-M2SR, Fluzone 4가, Fluzone 고용량, 또는 SPG 대조군으로 면역화된 마우스는 14일 동안 체중 감소를 경험하지 않았다. 그러나 FluMist로 면역화된 마우스는 백신 접종 후 3일째에 평균 7%의 체중을 잃었고 회복하는 데 14일이 걸렸습니다. 이 데이터는 FGHY1-M2SR 백신이 허가된 약독화 인플루엔자 생백신인 FluMist보다 더 나은 안전성 프로파일을 가지고 있음을 나타낸다.
초회 면역화(prime immunization) 후 28일째에 부스트 면역화로 마우스를 면역화시켰다. 부스트 면역화는 초회 면역화에서 마우스가 면역화된 동일한 백신으로 구성되었다. 초회 및 부스트 면역화 후 매주 혈청 샘플을 수집하고, 각각의 백신 성분에 대한 풀화된 혈청 IgG 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 결과적인 항-인플루엔자 A/H1 HA 혈청 IgG ELISA 역가 데이터를 도 17a에 나타내었다. 결과적인 항-인플루엔자 A/H3 HA 혈청 IgG ELISA 역가 데이터를 도 17b에 나타내었다. 결과적인 항-인플루엔자 B/Yam HA 혈청 IgG ELISA 역가 데이터를 도 17c에 나타내었다. 결과적인 항인플루엔자 B/Vic HA 혈청 IgG ELISA 역가 데이터를 도 17d에 나타내었다. 결과는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR을 제외한 모든 백신이 인플루엔자 A H1 및 H3 HA에 대한 혈청 IgG 역가를 SPG 대조군보다 높일 수 있었고 이러한 증가는 백신 제제 전반에 걸쳐 비슷했음을 보여준다. Fluzone 4가 및 Fluzone 고용량은 생백신에 비해 인플루엔자 B HA 항원에 대해 더 낮은 혈청 IgG 역가를 유도했다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR 백신은 예상대로 H3 HA 항원에 대해서만 혈청 IgG 상승을 유발했다.
기관-폐 세척은 초회 면역화 이후 49일째(부스트 이후 21일)에 군당 4마리의 마우스로부터 얻었고, IgG 및 IgA 역가는 점막 면역 반응을 평가하기 위해 ELISA에 의해 결정되었다. 결과적인 IgG 역가 데이터를 도 18a에 나타내었고 결과적인 IgA 역가 데이터를 도 18b에 나타내었다. 4가 FGHY1-M2SR 및 FluMist는 모든 테스트 항원에 대해 IgG 및 IgA 역가를 모두 유도했다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR로 면역화된 마우스는 H3 HA 항원에 대해 IgG 및 IgA 역가를 나타내었지만, H1 또는 인플루엔자 B HA 항원에 대해서는 그렇지 않았다. 4가지 항원 모두에 대한 IgG 역가는 Fluzone 4가 및 Fluzone 고용량 백신으로 면역된 군에서 상승했지만 어떤 항원에 대해서도 IgA 항체 역가가 검출되지 않았다. 이 데이터는 FGHY1-M2SR 백신이 허가된 약독화 인플루엔자 생백신인 FluMist에 필적하는 점막 면역 반응을 유발하는 반면 허가된 근육내 인플루엔자 백신은 점막 면역 반응을 전혀 유발하지 않음을 나타낸다.
부스트 면역화 6주 후에 쥐에게 인플루엔자 A/California/07/2009(H1N1pdm)의 치사량을 챌린지했다. SPG 대조군으로 모의 면역된 마우스는 챌린지 이후 5일까지 감염에 굴복한 반면, 모든 백신 군은 생존했다. 챌린지 후 결과적인 체중 변화를 도 19에 나타내었다. 4가 FGHY1-M2SR 및 FluMist 군은 체중이 전혀 감소하지 않았으며, 챌린지를 받은 바이러스는 표 11에서 보는 바와 같이 챌린지 이후 3일째에 폐 또는 비갑개에서 챌린지한 바이러스가 검출되지 않았는데, 이는 이들 비강 내 백신이 표류된 인플루엔자 바이러스로 치명적 감염에 대해 불임면역(sterilizing immunity)을 제공했다는 것을 시사한다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR(챌린지 바이러스에 대한 이형아형(heterosubtypic)), Fluzone 4가 및 Fluzone 고용량 군의 마우스는 챌린지 이후 3일 또는 4일에 평균 체중이 15% 이상 감소한 다음 챌린지 이후 21일까지 회복하였다. 1가 H3N2 FGHY1-M2SR 및 Fluzone 4가 백신을 접종한 마우스의 폐와 비갑개에서 감염성 바이러스가 검출되었다. Fluzone 고용량 백신으로 면역된 마우스는 1가 H3N2 FGHY1-M2SR 및 Fluzone 4가 백신으로 면역된 마우스와 유사한 체중 감소를 보였으나 폐 또는 비갑개에서 감염성 바이러스가 회수되지 않았다. 이러한 데이터는 비강 투여된 1가 이종아형 H3N2 FGHY1-M2SR(즉, H1N1 구성요소가 없음) 백신이 H1N1 구성요소를 함유하는 근육내로 투여된 허가된 비활성화 백신과 마찬가지로 마우스를 보호함을 나타낸다.
표 11. 인플루엔자 A/CA/07/2009(H1N1) 후 마우스 장기에서의 바이러스 역가
Figure pct00011
실 시 예 15
이 실시예는 FGHY1-M2SR 바이러스 제조가 M2VeroA 세포에서 규모 확대가 가능하고 숙주 세포 DNA 수준이 세포 기질에서 생산된 백신에 대한 WHO 및 FDA 지침에서 권장하는 수준으로 감소한다는 것을 보여준다.
M2VeroA 세포(인플루엔자 A M2 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포)는 OptiVero 배지(InVitria, Aurora, CO)를 사용하여 37℃, 5% CO2 분위기의 가습 인큐베이터에서 배양되었다. CellSTACK® - 5 Chamber(CS5; Corning, Corning, NY)의 약 2억 4,200만 세포, 로트당 3 또는 4개의 CellSTACK이 OptiVero 배지에서 Influenza A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016I(H3N2)의 HA 및 NA 유전자를 코딩하는 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스로 감염 다중도(MOI) 0.01로 감염되었다. 35℃, 5% CO2에서 2-3일 후, 상청액의 HA 역가가 32 HAU/50 μL 이상일 때 배양 배지를 수확하고 저속 원심분리에 의해 세포 및 세포 파편을 제거했다. 상층액을 0.2μM 공극 PES 막을 통한 진공 여과에 의해 추가로 깨끗하게 하고 멸균하였다. 그 다음, 깨끗해진 상청액을 37℃에서 2시간 동안 비특이적 RNA 및 DNA 뉴클레아제(벤조나아제, 5units/mL)로 처리하여 잔류 세포 RNA 및 DNA를 소화/가수분해했다. 그런 다음 벤조나아제 분해 물질을 235 cm2 300 kD MWCO Modified Polyethersulfone(mPES) MidiKros® 중공사 필터 모듈(Repligen, Waltham, MA)을 사용하여 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제했다. 물질을 10 내지 20배 농축하였다. 그런 다음 오염시키는 숙주 세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA 단편을 최소 15 컬럼 부피 SPG를 사용하여 여과작용(diafiltration)에 의해 제거했다. SPG 완충액에서 정제된 바이러스는 25% 수크로오스 PBS 쿠션을 통해 25,000 rpm에서 초원심분리에 의해 10 내지 100배 더 농축되었다. 결과적인 바이러스 펠릿을 SPG에 재현탁하고 분취한 다음 액체 N2에서 급속 동결한 다음 -80℃에서 보관했다.
농축 및 정제된 H3N2 FGHY1-M2SR 유전자의 서열 상동성을 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스 종자 스톡의 참조 서열에 대해 대비하였다. 정제된 바이러스에서 추출한 바이러스 RNA를 역전사효소-폴리메라제 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 cDNA를 생성한 후 Sanger sequencing을 수행했다. 8개의 바이러스 절편에 의해 코딩된 오픈 리딩 프레임(ORF)의 분석은 모든 절편이 참조에 대해 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 가졌다는 것을 나타내었다.
농축 및 정제된 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스의 감염 역가는 M2CK 세포(인플루엔자 A M2를 안정적으로 발현하는 MDCK 세포)를 사용하여 3회 이상의 독립적인 측정에 의해 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 어세이로 결정되었다. 상기 절차에서 백신 샘플의 연속 희석을 적용하여 96웰 플레이트에서 M2CK 세포를 복제하고 5% CO2 분위기에서 35℃에서 4일 동안 배양했다. 접종 이후 4일에 세포 단층을 육안으로 검사하고 CPE에 대해 점수를 매긴다. Reed 및 Muench 방법을 사용하여 바이러스의 역가를 계산하고 TCID50/mL로 표시했다. 또한, HA 활성은 CPE에 의해 결정된 바이러스 역가를 확인하기 위해 각 웰 상청액의 분취량에서 테스트되었다. 표 12에 나타난 바와 같이, 농축 및 정제 후 H3N2 FGHY1-M2SR 바이러스는 지속적으로 109.8 TCID50/mL 이상의 높은 역가에 도달하였다.
표 12. 농축 및 정제 후 바이러스 역가
Figure pct00012
H3N2 FGHY1-M2SR 백신 바이러스가 농축 및 정제 후에도 복제 결핍 표현형을 유지했는지 확인하기 위해, 야생형 인플루엔자 바이러스에 대해 허용되지만 M2SR 바이러스에 대해 허용되지 않는 MDCK 세포에서 테스트 품목의 3회의 연속 계대에 의해 복제하는 바이러스의 존재를 평가하였다. 1차 감염에서는 테스트 바이러스를 연속 희석하여 세포 단층에 접종하였다. 그런 다음 감염된 세포를 5% CO2 분위기에서 35℃에서 4일 동안 배양했다. 감염된 세포 배양 상청액을 새로운 MDCK 단층으로 옮기고 5% CO2 분위기에서 35℃로 4일 동안 인큐베이션했다. 제3회 및 최종회의 계대를 위해, 이 감염된 세포 배양 배지를 또 다른 새로운 MDCK 단층으로 옮기고 5% CO2 분위기에서 35℃로 추가 4일 동안 인큐베이션했다. 매 4일 35℃ 배양 후 CPE에 대해 MDCK 세포를 관찰하고 배양 상청액에서 HA 활성을 측정하여 자손 비리온의 존재를 확인했다. 감염의 각 회에 대해 복제-결함 참조 바이러스인 Bris10 M2SR을 양성 대조군으로 테스트했다. 음성 대조군 접종물은 배지만이었다. 결과는 대조군이 예상한 대로 수행되었으며 정상 세포에 4개의 테스트 품목 중 어느 것도 접종한 후에 감염성 자손이 검출되지 않았음을 나타내었다. 따라서, H3N2 FGHY1-M2SR 백신 바이러스 제제는 복제 능력이 없고 복제할 수 없는 것으로 입증되었다.
농축되고 정제된 FHGY1-M2SR에서 잔류 숙주 세포 DNA의 단편 크기는 2100 BioAnalyzer 기기(Agilent, Santa Clara, CA)에서 모세관 전기영동을 사용하여 측정되었다. Axygen® 자기 실리카 비드(Corning, Corning, NY)를 사용하여 전체 샘플 DNA를 추출했다. 시료에서 정제된 DNA를 DNA High Sensitivity Chip(Agilent)에 로딩하고 자동 모세관 전기영동을 수행하였다. 2100 Expert 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 단편을 검출하고, 단편 농도, 전체 DNA의 상대 퍼센트를 얻고, 추출된 잔류 DNA의 염기쌍(bp) 크기를 측정했다. 농축되고 정제된 FGHY1-M2SR 로트 3개를 4회 측정하여 얻은 결과는 2100 Expert에서 형광 신호 강도가 낮거나 없는 것으로 나타났는데 이는 정확한 크기 결정을 위한 잔류 DNA를 충분하게 포함하지 않았음을 나타낸다.
시판되는 ELISA 키트(Cygnus Technologies 부품 번호 F500, Southport, NC)는 농축되고 정제된 H3N2 FGHY1-M2SR 백신 로트에 존재하는 Vero 숙주 HCP의 정량에 사용되었다. 존재하는 HCP의 결과 데이터는 표 13에 나와 있다. 키트의 항체는 Vero 용해물을 사용하여 생성되고 친화도가 정제되었으며 바이러스 제품을 생산하는 데 사용된 많은 상업적으로 이용 가능한 Vero 세포주에서 HCP를 검출하는 것으로 나타났다. 따라서 이 키트는 Vero HCP 오염물 수준을 모니터링하는 도구로 사용할 수 있다. 상기 키트는 제조사 분석 프로토콜에 따라 사용되었다. 샘플 희석제(Cygnus Cat # I028)를 사용하여 각 샘플의 다중 희석을 준비하고 분석(중복)하여 샘플이 키트와 함께 제공된 표준 범위 내에서 희석 선형성을 표시하는지(즉, 고용량 후크 효과가 없음) 확인하였다. 4-매개변수 로지스틱 회귀를 사용하여 표준 곡선을 구성하였고 샘플 값을 보간하는 데 사용했다.
표 13. 농축 및 정제된 백신 바이러스의 숙주 세포 단백질(HCP) 함량.
Figure pct00013
테스트된 백신 제제에서 HCP의 평균 양은 1.4±1.0 μg/mL이었다. 이 값은 이전에 임상 시험 자료(Bris10 M2SR, lot#15100251)에서 검출된 HCP 수준과 일치한다. 세 가지 백신 제제에 대한 HCP는 99.98% 내지 99.99%로 감소했다.
백신 제제의 무균성은 의약품 제제에 대한 WHO 사양에 기초한 절차에 의해 확인되었다. 백신 제제를 무균 조건에서 3가지 유형의 액체 배지, Luria-Bertani 브로스(LB), 트립틱 대두 브로스(TSB), 및 티오글리콜레이트 배지(TGM)에 접종하였다. 배양물을 37℃(LB 및 TSB) 및 주변 온도(TGM)에서 성장시켰다. 배양물을 14일 동안 성장시킨 다음 미생물 성장에 대해 육안으로 조사하였다. 시험된 모든 제제는 모든 성장 조건에서 미생물 성장에 대해 음성이었다.
H3N2 FGHY1-M2SR 백신 로트의 삼투질농도 값은 Fiske Model 210 Micro-Osmometer(Fiske Associates, Norwood, MA)를 사용하여 측정되었다. 생성된 삼투질농도 데이터는 표 14에 나와 있다. 매일 사용하기 전에 3점(50, 850 및 2000mOsm/kg) 보정을 수행하고 5점 선형성 검사(100, 500, 900, 1500, 및 2000mOsm/kg)를 매주 평가하여 이들 기준이 제조업자가 특정한 예상 값 내에 떨어질 것을 보장하도록 하였다. 보정 및 측정은 Fiske 모델 210 마이크로 삼투압계 사용자 가이드에 따라 수행되었다. 테스트한 모든 백신 샘플은 604 내지 616 mOsm/kg 범위 내에 있는 것으로 보였으며, 이는 SPG 비히클 595 내지 626 mOsm/kg에서 보이는 것과 유사한 삼투질 농도 측정값이다. 이들 값은 임상 시험 재료(Bris10 M2SR, lot #15100251)에 대해 얻은 값과 유사하다.
표 14. 백신 제제 흰담비 백신 접종 분취량 유지분의 삼투질 농도
Figure pct00014
H3N2 FGHY1-M2SR 백신 로트는 의도된 임상 물질과 유사한 공정을 사용하여 M2VeroA 세포에서 제조되었으며 의도된 임상 물질로 SPG 완충액에서 제제화하였다. 특성화 테스트는 정제 과정이 숙주 세포 불순물(DNA 및 단백질)을 성공적으로 제거하고 임상 물질의 순도를 시뮬레이션했음을 보여주었지만 감염 역가는 높게 유지되었고 백신 바이러스 게놈 서열 및 복제-결함 표현형은 유지되었다.
본 명세서에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함한 모든 참고 문헌은 마치 각 참고 문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참고 문헌으로 포함되는 것으로 표시되고 그 전체가 여기에 기재된 것처럼 동일한 정도로 참고 문헌으로 포함된다.
용어 "하나" 및 "하나의" 및 "그" 및 "적어도 하나"의 사용 및 본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 유사한 지시 대상은 단수 및 복수가 여기에 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 두 가지 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "적어도 하나" 다음에 하나 이상의 항목의 목록(예: "A 및 B 중 적어도 하나")의 사용은 여기에 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 나열된 항목(A 또는 B ) 또는 나열된 항목 중 둘 이상의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는", "갖는", "내포하는" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 여기에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예: "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석해서는 안 된다.
본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 모드를 포함하여 본 발명의 바람직한 구체예가 여기에 설명되어 있다. 이러한 바람직한 구체예의 변형은 전술한 설명을 읽을 때 관련분야의 통상의 기술자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 그러한 변형을 적절하게 사용하기를 기대하며, 본 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 기술된 것과는 다르게 본 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률이 허용하는 바에 따라 여기에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 전술한 요소의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> FluGen, Inc. <120> INFLUENZA VIRUS BACKBONE <130> 749488 <150> 62/858,737 <151> 2019-06-07 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1565 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <223> NP gene segment (FGHY-1) <400> 1 agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtctcaaggc 60 accaaacgat cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120 agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc 180 gaactcaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240 atggtgctct ctgcttttga cgaaaggaga aataaatacc ttgaagaaca tcccagtgcg 300 gggaaagatc ctaagaaaac tggaggacct atatacagga gagtaaacgg aaagtggatg 360 agagaactca tcctttatga caaagaagaa ttaaggcgaa tctggcgcca agctaataat 420 ggtgacgatg caacggctgg tctgactcac atgatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480 gcaacttatc agaggacaag agctcttgtt cgcaccggaa tggatcccag gatgtgctct 540 ctgatgcaag gttcaactct ccctaggagg tctggagccg caggtgctgc agtcaaagga 600 gttggaacaa tggtgatgga attggtcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac 660 ttctggaggg gtgagaatgg acgaaaaaca agaattgctt atgaaagaat gtgcaacatt 720 ctcaaaggga aatttcaaac tgctgcacaa aaagcaatga tggatcaagt gagagagagc 780 cggaacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840 ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acctgccgta 900 gccagtgggt acgactttga aaggaaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960 ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020 agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattaagc 1080 ttcatcaaag ggacgaaggt gctcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140 gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200 tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260 atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccatt 1320 atggcagcat tcaatgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380 aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440 ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 2 <211> 2341 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <223> PB1 gene segment (FGHY-1) <400> 2 agcaaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ccttactttt cttaaaagtg 60 ccagcacaaa atgctataag cacaactttc ccttatactg gagatcctcc ttacagccat 120 gggacaggaa caggatacac cttggatact gtcaacagga cacatcagta ctcagaaaag 180 ggaagatgga caacaaacac cgaaactgga gcaccgcaac tcaacccgat tgatgggcca 240 ctgccagaag acaatgaacc aagtggttat gcccaaacag attgtgtatt ggaggcgatg 300 gctttccttg aggaatccca tcctggtatt tttgaaaact cgtgtattga aacgatggag 360 gttgttcagc aaacacgagt agacaagctg acacaaggcc gacagaccta tgactggact 420 ctaaatagaa accaacctgc tgcaacagca ttggccaaca caatagaagt gttcagatca 480 aatggcctca cggccaatga gtctggaagg ctcatagact tccttaagga tgtaatggag 540 tcaatgaaca aagaagaaat gtggatcaca actcattttc agagaaagag acgggtgaga 600 gacaatatga ctaagaaaat gataacacag agaacaatgg gtaaaaagaa gcagagattg 660 aacaaaagga gttatctaat tagagcattg accctgaaca caatgaccaa agatgctgag 720 agagggaagc taaaacggag agcaattgca accccaggga tgcaaataag ggggtttgta 780 tactttgttg agacactggc aaggagtata tgtgagaaac ttgaacaatc agggttgcca 840 gttggaggca atgagaagaa agcaaagttg gcaaatgttg taaggaagat gatgaccaat 900 tctcaggaca ccgaactttc tttcaccatc actggagata acaccaaatg gaacgaaaat 960 cagaatcctc ggatgttttt ggccatgatc acatatatga ccagaaatca gcccgaatgg 1020 ttcagaaatg ttctaagtat tgctccaata atgttctcaa acaaaatggc gagactggga 1080 aaagggtata tgtttgagag caagagtatg aaacttagaa ctcaaatacc tgcagaaatg 1140 ctagcaagca tcgatttgaa atatttcaat gattcaacaa gaaagaagat tgaaaaaatc 1200 cgaccgctct taatagaggg gactgcatca ttgagccctg gaatgatgat gggcatgttc 1260 aatatgttaa gcactgtatt aggcgtctcc atcctgaatc ttggacaaaa gagatacacc 1320 aagactactt actggtggga tggtcttcaa tcctctgacg attttgctct gattgtgaat 1380 gcacccaatc atgaagggat tcaagccgga gtcaacaggt tttatcgaac ctgtaagcta 1440 cttggaatca atatgagcaa gaaaaagtct tacataaaca gaacaggtac atttgaattc 1500 acaagttttt tctatcgtta tgggtttgtt gccaatttca gcatggagct tcccagtttt 1560 ggggtgtctg ggatcaacga gtcagcggac atgagtattg gagttactgt catcaaaaac 1620 aatatgataa acaatgatct tggtccagca acagctcaaa tggcccttca gttgttcatc 1680 aaagattaca ggtacacgta ccgatgccat ataggtgaca cacaaataca aacccgaaga 1740 tcatttgaaa taaagaaact gtgggagcaa acccgttcca aagctggact gctagtctcc 1800 gacggaggcc caaatttata caacattaga aatctccaca ttcctgaagt ctgcctaaaa 1860 tgggaattga tggatgagga ttaccagggg cgtttatgca acccactgaa cccatttgtc 1920 agccataaag aaattgaatc aatgaacaat gcagtgatga tgccagcaca tggtccagcc 1980 aaaaacatgg agtatgatgc tgttgcaaca acacactcct ggatccccaa aagaaatcga 2040 tccatcttga atacaagtca aagaggagta cttgaggatg aacaaatgta ccaaaggtgc 2100 tgcaatttat ttgaaaaatt cttccccagc agttcataca gaagaccagt cgggatatcc 2160 agtatggtgg aggctatggt ttccagagcc cgaattgatg cacggattga tttcgaatct 2220 ggaaggataa agaaagaaga gttcactgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagag 2280 ctcagacggc aaaaatagtg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340 t 2341 <210> 3 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gagagagagc 780 cggaacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840 ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acctgccgta 900 gccagtgggt acgactttga aagggaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960 ctgcttcaaa acagccgagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020 agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattaagc 1080 ttcatcaaag ggacgaaggt gctcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140 gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200 tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260 atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccatt 1320 atggcagcat tcaatgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380 aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440 ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 4 <211> 2341 <212> DNA <213> Influenza A <220> 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tgtgagaaac ttgaacaatc agggttgcca 840 gttggaggca atgagaagaa agcaaagttg gcaaatgttg taaggaagat gatgaccaat 900 tctcaggaca ccgaactttc tttcaccatc actggagata acaccaaatg gaacgaaaat 960 cagaatcctc ggatgttttt ggccatgatc acatatatga ccagaaatca gcccgaatgg 1020 ttcagaaatg ttctaagtat tgctccaata atgttctcaa acaaaatggc gagactggga 1080 aaagggtata tgtttgagag caagagtatg aaacttagaa ctcaaatacc tgcagaaatg 1140 ctagcaagca tcgatttgaa atatttcaat gattcaacaa gaaagaagat tgaaaaaatc 1200 cgaccgctct taatagaggg gactgcatca ttgagccctg gaatgatgat gggcatgttc 1260 aatatgttaa gcactgtatt aggcgtctcc atcctgaatc ttggacaaaa gagatacacc 1320 aagactactt actggtggga tggtcttcaa tcctctgacg attttgctct gattgtgaat 1380 gcacccaatc atgaagggat tcaagccgga gtcgacaggt tttatcgaac ctgtaagcta 1440 cttggaatca atatgagcaa gaaaaagtct tacataaaca gaacaggtac atttgaattc 1500 acaagttttt tctatcgtta tgggtttgtt gccaatttca gcatggagct tcccagtttt 1560 ggggtgtctg ggatcaacga gtcagcggac atgagtattg gagttactgt catcaaaaac 1620 aatatgataa acaatgatct tggtccagca acagctcaaa tggcccttca gttgttcatc 1680 aaagattaca ggtacacgta ccgatgccat ataggtgaca cacaaataca aacccgaaga 1740 tcatttgaaa taaagaaact gtgggagcaa acccgttcca aagctggact gctagtctcc 1800 gacggaggcc caaatttata caacattaga aatctccaca tttctgaagt ctgcctaaaa 1860 tgggaattga tggatgagga ttaccagggg cgtttatgca acccactgaa cccatttgtc 1920 agccataaag aaattgaatc aatgaacaat gcagtgatga tgccagcaca tggtccagcc 1980 aaaaacatgg agtatgatgc tgttgcaaca acacactcct ggatccccaa aagaaatcga 2040 tccatcttga atacaagtca aagaggagta cttgaggatg aacaaatgta ccaaaggtgc 2100 tgcaatttat ttgaaaaatt cttccccagc agttcataca gaagaccagt cgggatatcc 2160 agtatggtgg aggctatggt ttccagagcc cgaattgatg cacggattga tttcgaatct 2220 ggaaggataa agaaagaaga gttcactgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagag 2280 ctcagacggc aaaaatagtg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340 t 2341 <210> 5 <211> 2341 <212> DNA <213> Influenza A <220> <221> misc_feature <223> PB2 gene segment (FGHY-2) <400> 5 agcaaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg 60 tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc 120 aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg 180 gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat 240 gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta 300 tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat 360 ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420 cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat 480 gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540 gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600 gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660 gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720 ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780 aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840 gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900 attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960 aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag 1020 agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1080 ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca 1140 gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa 1200 cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata 1260 aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg 1320 catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380 gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacataac tccaagcatc 1440 gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500 gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagagtcc gggaccaacg aggaaatgta 1560 ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac agtaacttac 1620 tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa 1680 tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740 tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800 tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860 accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920 cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980 aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100 aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2160 gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220 gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280 aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340 t 2341 <210> 6 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza A <220> <221> misc_feature <223> NP amino acid sequence (FGHY-1) <400> 6 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly 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ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600 gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660 gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720 ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780 aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840 gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900 attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960 aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag 1020 agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1080 ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca 1140 gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa 1200 cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata 1260 aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg 1320 catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380 gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc 1440 gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500 gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagagtcc gggaccaacg aggaaatgta 1560 ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac 1620 tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa 1680 tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740 tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800 tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860 accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920 cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980 aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100 aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2160 gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220 gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280 aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340 t 2341 <210> 15 <211> 759 <212> PRT <213> Influenza A <220> <221> misc_feature <223> PB2 amino acid sequence (FGHY-1) <400> 15 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Ile Thr Asn Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp 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gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt 900 gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga 960 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca 1020 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag 1080 aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag 1140 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa 1200 tatgatagtg atgaaccaga attgaagtcg cttgcaagtt ggattcagaa tgagtttaac 1260 aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgtg 1320 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac 1380 tgcagagcca cagaatacat aatgaaggga gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca 1440 tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag 1500 gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg 1560 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620 gaaccacata aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tataagaagt 1680 gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa 1740 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt 1800 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860 gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc 1920 attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct 1980 ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt 2040 agggacaacc tggaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca 2160 catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220 ccttgtttct act 2233 <210> 17 <211> 716 <212> PRT <213> Influenza A <220> <221> misc_feature <223> PA amino acid sequence (FGHY-1 and FGHY-2) <400> 17 Met Glu Asp Phe Val Arg Gln Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu 1 5 10 15 Ala Glu Lys Thr Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Lys Ile Glu Thr 20 25 30 Asn Lys Phe Ala Ala Ile Cys Thr His Leu Glu Val Cys Phe Met Tyr 35 40 45 Ser Asp Phe His Phe Ile Asn Glu Gln Gly Glu Ser Ile Ile Val Glu 50 55 60 Leu Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu 65 70 75 80 Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn 85 90 95 Thr Thr Gly Ala Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His 115 120 125 Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His 130 135 140 Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp 145 150 155 160 Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg 180 185 190 Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Arg Phe Glu Ile Thr 195 200 205 Gly Thr Met Arg Lys Leu Ala Asp Gln Ser Leu Pro Pro Asn Phe Ser 210 215 220 Ser Leu Glu Asn Phe Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe Glu Pro Asn Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Glu Gly Lys Leu Ser Gln Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Arg 245 250 255 Ile Glu Pro Phe Leu Lys Thr Thr Pro Arg Pro Leu Arg Leu Pro Asn 260 265 270 Gly Pro Pro Cys Ser Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu 275 280 285 Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu 290 295 300 Tyr Asp Ala Ile Lys Cys Met Arg Thr Phe Phe Gly Trp Lys Glu Pro 305 310 315 320 Asn Val Val Lys Pro His Glu Lys Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Leu Leu 325 330 335 Ser Trp Lys Gln Val Leu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Glu Asn Glu Glu 340 345 350 Lys Ile Pro Lys Thr Lys Asn Met Lys Lys Thr Ser Gln Leu Lys Trp 355 360 365 Ala Leu Gly Glu Asn Met Ala Pro Glu Lys Val Asp Phe Asp Asp Cys 370 375 380 Lys Asp Val Gly Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Leu 385 390 395 400 Lys Ser Leu Ala Ser Trp Ile Gln Asn Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu 405 410 415 Leu Thr Asp Ser Ser Trp Ile Glu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Asp Val 420 425 430 Ala Pro Ile Glu His Ile Ala Ser Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ser 435 440 445 Glu Val Ser His Cys Arg Ala Thr Glu Tyr Ile Met Lys Gly Val Tyr 450 455 460 Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala Ser Cys Ala Ala Met Asp Asp Phe 465 470 475 480 Gln Leu Ile Pro Met Ile Ser Lys Cys Arg Thr Lys Glu Gly Arg Arg 485 490 495 Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe Ile Ile Lys Gly Arg Ser His Leu Arg 500 505 510 Asn Asp Thr Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr 515 520 525 Asp Pro Arg Leu Glu Pro His Lys Trp Glu Lys Tyr Cys Val Leu Glu 530 535 540 Ile Gly Asp Met Leu Ile Arg Ser Ala Ile Gly Gln Val Ser Arg Pro 545 550 555 560 Met Phe Leu Tyr Val Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys Ile Lys Met Lys 565 570 575 Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile 580 585 590 Glu Ser Met Ile Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys Asp Met Thr 595 600 605 Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro Ile Gly Glu Ser 610 615 620 Pro Lys Gly Val Glu Glu Ser Ser Ile Gly Lys Val Cys Arg Thr Leu 625 630 635 640 Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr Ala Ser Pro Gln Leu Glu 645 650 655 Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu Ile Val Gln Ala Leu 660 665 670 Arg Asp Asn Leu Glu Pro 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gataacacag 600 ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660 ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720 gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacaaactga agataacaga gaatagtttt 780 gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840 actttctcgt ttcagcttat ttagtactaa aaaacaccct tgtttctact 890 <210> 19 <211> 230 <212> PRT <213> Influenza A <220> <221> misc_feature <223> NS1 amino acid sequence <400> 19 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Pro Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Lys Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Cys 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Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln 85 90 95 Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile 115 120

Claims (34)

  1. PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편을 포함하는 인플루엔자 바이러스로서,
    (a) 상기 PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신 및 위치 180에서 트립토판, 및 위치 464에서 아스파라긴 또는 위치 607에서 세린 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 PB1 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
    (b) 상기 PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린, 및 선택적으로 위치 467에서 이소류신 및 위치 529에서 발린을 포함하고, 여기서 PB2 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
    (c) 상기 PA 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PA 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 401에서 라이신을 포함하고, PA 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
    (d) 상기 NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신을 포함하고, 및 위치 294에서 라이신 또는 위치 311에서 아르기닌 중 적어도 하나를 포함하고; 및
    (e) 상기 NS 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 30에 프롤린 및 위치 118에 리신을 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    (a) 상기 PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 및 위치 464에서 아스파라긴이고, PB1 유전자 절편은 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함하고;
    (b) 상기 PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린이고, PB2 유전자 절편은 선택적으로 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함하고;
    (c) 상기 NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신 및 위치 294에서 라이신인 것인 인플루엔자 바이러스.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 인플루엔자 바이러스.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 인플루엔자 바이러스.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스의 M2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스이고, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 B 바이러스의 BM2 이온채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 PB1 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
  10. 청구항 1에 있어서,
    (a) PB1 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 40에서 류신, 위치 180에서 트립토판, 및 위치 607에서 세린이고, 여기서 PB1 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고;
    (b) PB2 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 504에서 발린, 위치 467에서 이소류신 및 위치 529에서 발린이고, 여기서 PB2 유전자 절편은 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 선택적으로 포함하고; 및
    (c) NP 유전자 절편은 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하고, 여기서 선택된 아미노산은 위치 116에서 류신 및 위치 311에서 아르기닌인 것인 인플루엔자 바이러스.
  11. 청구항 1 또는 청구항 10에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 것인인플루엔자 바이러스.
  12. 청구항 1, 청구항 10 및 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB2 유전자 절편은 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 플루엔자 바이러스.
  13. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 것인 인플루엔자 바이러스.
  14. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB1 유전자 절편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 PB1 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  15. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB2 유전자 절편은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 PB2 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  16. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NP 유전자 절편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 NP 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  17. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, Vero 세포주에서 바이러스의 10회 이상의 연속 계대 후에 상기 선택된 아미노산이 PB1, PB2, 및 NP 단백질 중 적어도 하나에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
  18. 청구항 1 및 청구항 10 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스의 M2 이온 채널 단백질을 안정적으로 발현하는 Vero 세포주에서 10회 이상의 연속 계대 후에 적어도 PB1, PB2, 및 NP 단백질에서 보존되는 것인 인플루엔자 바이러스.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, PB1, PB2, 및 PA 유전자 절편 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 위치 4에서 시토신에서 우라실로의 프로모터 돌연변이를 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 재조합 인플루엔자 바이러스인 것인 인플루엔자 바이러스.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 NA 유전자 절편 및 HA 유전자 절편을 더 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 HA1에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 HA2에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 HA 단백질을 코딩하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  24. 청구항 23에 있어서, HA2의 적어도 하나의 아미노산 돌연변이가 위치 107에서의 아스파라긴인 것인 인플루엔자 바이러스.
  25. 청구항 21 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 단일 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 HA 유전자 절편이 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
  27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 NA 유전자 절편이 PB1, PB2, PA, NP, 및 NS 유전자 절편이 유래된 단일 인플루엔자 균주와 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래된 것인 인플루엔자 바이러스.
  28. 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 M 유전자 절편을 더 포함하는 것인 인플루엔자 바이러스.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 기능성 M2 단백질을 코딩하지 않는 것인 인플루엔자 바이러스.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 인간 세포에서 복제할 수 있는 것인 인플루엔자 바이러스.
  31. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 동일한 조건 하에 Vero 세포에서 선택된 아미노산이 없는 것을 제외하고는 동일한 인플루엔자 바이러스와 비교하여 증식이 증진된 것인 인플루엔자 바이러스.
  32. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 약학적 제제.
  33. 청구항 32에 있어서, 약학적 제제가 백신인 것인 약학적 제제.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 백신이 1가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
    [청구항 39]
    청구항 33에 있어서, 상기 백신이 2가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
    [청구항 40]
    청구항 33에 있어서, 상기 백신이 3가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
    [청구항 41]
    청구항 33에 있어서, 백신이 4가 백신으로서 제제화된 것인 약학적 제제.
    [청구항 42]
    포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스 또는 청구항 32 내지 청구항 41 중 어느 한 항의 약학적 제제를 포유동물에게 투여하여 그 포유동물 내에서 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 방법.
    [청구항 43]
    청구항 42에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 것인 방법.
    [청구항 44]
    청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, Vero 세포주에서 인플루엔자 바이러스를 연속적으로 계대하는 것을 포함하는 것인 방법.
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